JP2001321176A - ゼブラフィッシュトランスグルタミナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞の増殖、分化、再生との関連及び肝疾患
等の診断への利用可能性が示唆されているゼブラフィッ
シュトランスグルタミナーゼの提供が望まれている。 【解決手段】 遺伝子工学的手法を用いて、良質なゼブ
ラフィッシュ由来のトランスグルタミナーゼを提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ゼブラフィッシュ
由来のトランスグルタミナーゼ（ＺＴＧａｓｅ）、ＺＴ
ＧａｓｅをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現
ベクター及び該発現ベクターを含有する形質転換体を提
供するものである。

【０００２】

【従来の技術】トランスグルタミナーゼはアシル転移反
応を触媒する酵素であり、ペプチド鎖中のグルタミン残
基のγ−カルボキシアミド基をアシル供与体とし、タン
パク質やペプチド鎖中のリジン残基のε−アミノ基を受
容体とする、タンパク質の翻訳後修飾酵素の一つであ
る。この酵素が触媒する反応には、アシル転移反応、グ
ルタミン残基へのアミン化合物の付加反応、タンパク質
間架橋反応及びアミン基質非存在下でのグルタミン残基
のグルタミン酸残基への脱アミド化反応が含まれる。ヒ
ト及びマウスにおいては、５種類のトランスグルタミナ
ーゼが同定されており、Ａ．フィブリンの架橋における
血液凝固、Ｂ．フィブロネクチン、コラーゲンの架橋に
よる創傷治癒、Ｃ．ケラチン、インボルクリン、ロリク
リンなどの架橋による角質層の安定化、Ｄ．Ｇタンパク
質としてのシグナル伝達、Ｅ．ヒト肝細胞における急性
期反応の仲介、Ｆ．ＴＧＦ−βの活性化、Ｇ．ＥＣＭタ
ンパク質の架橋による細胞接着、Ｈ．ポリグルタミン病
への関与、Ｉ．ヒストンの架橋による転写制御、Ｊ．Ｒ
ｂ、Ｓｐ１の不活性化によるアポトーシスの誘導、Ｋ．
角質化上皮の安定化、Ｌ．前立腺分泌タンパク質の架橋
などに関する生理機能が報告されている。最近、ゼブラ
フィッシュ（danio rerio）の尾鰭再生に関連して、ト
ランスグルタミナーゼが大量に発現していることが確認
されたことにより、生物の再生現象へのトランスグルタ
ミナーゼの関与が示唆されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記のようにゼブラフ
ィッシュトランスグルタミナーゼは細胞の増殖、分化、
再生との関連及び肝疾患等の診断への利用可能性が示唆
されている。そこで、ゼブラフィッシュトランスグルタ
ミナーゼの提供が望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】組織再生及び細胞分化に
関する本酵素の機能を解析するために、遺伝子工学的手
法を用いて、良質なゼブラフィッシュ由来のトランスグ
ルタミナーゼを提供する。

【０００５】本発明者は、ゼブラフィッシュを用いて、
その尾鰭細胞のトランスグルタミナーゼ（以下ＺＴＧａ
ｓｅと略称する）遺伝子のクローニングを行い、次いで
このクローニングした遺伝子の塩基配列を解明すること
に成功し、本発明に到達したものである。すなわち本発
明は、ゼブラフィッシュトランスグルタミナーゼ、ＺＴ
ＧａｓｅをコードするＤＮＡ、発現用ベクター内でＺＴ
Ｇａｓｅを発現させるように構築した組換えＤＮＡ及び
該組換えＤＮＡを保持する形質転換体を提供するもので
ある。

【０００６】ＺＴＧａｓｅのアミノ酸配列は、ヒトケラ
チノサイトトランスグルタミナーゼとは３２％以上の相
同性、ヒトファクターXIIIａとは４７％以上の相同性を
有するが、新規なアミノ酸配列であり、又塩基配列も当
然のことながら上記の既知のトランスグルタミナーゼと
は異なり、新規なものである。

【０００７】本発明で得られたＺＴＧａｓｅをコードす
るＤＮＡは新規なものであり、このＤＮＡでＤＮＡ感染
又は形質転換させた菌体又は細胞を用いれば、天然物か
らでは困難であった純粋な、汚染されていないＺＴＧａ
ｓｅ前駆体タンパク質や成熟タンパク質を大量に産生さ
せ、精製することができる。ＺＴＧａｓｅは、タンパク
質の生化学的研究はもとより、生体適合性に優れた人口
皮膚の開発及び人工臓器用のタンパク質材料の強化に利
用することができる。

【０００８】本発明において発現ベクターとは、ある特
定の遺伝子の情報を微生物、培養細胞などで発現するよ
うにプロモーターなどを組み込んだベクターをいう。ベ
クターとは、プラスミド、ファージ、ウイルスのよう
な、外来性ＤＮＡを組み込み宿主細胞中で増えることの
できるＤＮＡをいう。本発明におけるＺＴＧａｓｅをコ
ードするＤＮＡを含有する発現ベクターは、バイオ実験
イラストレイテッド（中山広樹、西方敬人、秀潤社）に
記載されている一般的な発現ベクターの作成方法に従っ
て製造することができる。ＺＴＧａｓｅをコードするＤ
ＮＡについては、全合成あるいは半合成によっても製造
することができる。ＺＴＧａｓｅのｃＤＮＡの制限酵素
による消化に当っては、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｂａ
ｍ ＨＩ等の制限酵素を用いることができる。

【０００９】消化されたＤＮＡ断片を組み込むプラスミ
ドとしては、例えば大腸菌由来のｐＡＣＹＣ１７７，ｐ
ＡＣＹＣ１８４，ｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＢＲ３２２，
ｐＩＮIIIＡ１，ｐＫＫ２３３−２などが挙げられる
が、その他のものであっても宿主内で複製増殖されるも
のであれば、いずれをも用いることができる。またＤＮ
Ａ断片を組み込むファージベクターとしては、例えばＭ
１３ファージｍｐ９，Ｍ１３ファージｍｐ８，ｇｔ１
１，ＥＭＢＬ３，Ｃｈａｒｏｎ４などが挙げられるが、
その他のものであっても宿主内で複製増殖できるもので
あれば用いることができる。

【００１０】ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド又はフ
ァージベクターは適当な宿主例えばEscherichia、Bacil
lus、Streptomyces、Saccharomyces属菌及び動物細胞で
あるサル由来のＣＯＳ細胞などに導入する。上記Escher
ichia属菌の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕ
ｅ株，ＵＴ４８１株，ＪＭ１０３株，ＪＭ８３株，ＪＭ
１０９株，ＮＭ５２２株，ＭＶ１３０４株、Bacillus属
菌の例としてはBacillus subtilis、Streptomyces属菌
の例としてはStreptomyces coelicolor、Saccharomyces
属菌の例としてはSaccharomyces cerevisiaeなどが挙げ
られる。このようにして得られた形質転換体から、目的
とするＤＮＡを含有するファージ又はプラスミド等のベ
クターを単離する方法としては、例えばＺＴＧａｓｅの
一部をコードするオリゴヌクレオチドをプローブとして
用いたコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイ
ブリダイゼーション等によるハイブリダイゼーションに
より行うことができる。単離されたファージあるいはプ
ラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、
ＺＴＧａｓｅをコードするＤＮＡの塩基配列を、適当な
制限サイトがある場合はそれを利用して、適当な制限サ
イトがない場合はＤＮａｓｅ Ｉを用いた欠損体を調製
しＭ１３ファージを用いたダイデオキシ法によるなどし
て、決定する。

【００１１】上記のようにしてクローン化されたＺＴＧ
ａｓｅをコードするＤＮＡは目的によって、そのまま、
又は所望により制限酵素で消化して使用することができ
る。クローン化されたＤＮＡから発現させたい領域を切
り出し、切り出されたＤＮＡを発現に適したビークル
（ベクター）中のプロモーターの下流に連結することに
よって発現ベクターを得ることができる。切り出された
ＤＮＡは、その５′末端に翻訳開始コドンであるＡＴＧ
及び／又は３′末端に翻訳終止コドンであるＴＡＡ，Ｔ
ＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始
コドンや翻訳終止コドンを、適当な合成ＤＮＡアダプタ
ーを用いて付加することもできる。更に、連結されたＤ
ＮＡを発現させるためには、その上流にプロモーターを
接続する。ベクターとしては、上記のEscherichia属菌
由来のプラスミド、例えば、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ
９、ｐＫＫ２３３−２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ
１８４、ｐＵＣ８、ｐＢＲ３２２、ｐＩＮIIIＡ１、Bac
illus属菌由来のプラスミド、例えばｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋ、Saccharomyces属菌由来のプラスミド、例えばｐＢ
ＴＩ−１、Streptomyces属菌のプラスミド、例えばＰＩ
Ｊ６１、ＣＯＳ細胞のプラスミドｐＳＶＬなどが挙げら
れる。

【００１２】本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ
ーターであればいかなるものでも用いることができる。
形質転換する際の宿主がEscherichia属菌である場合は
ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ等のプロモ
ーター、Bacillus属菌の場合はＳＰ０２，βアミラーゼ
等のプロモーター、Saccharomyces属菌の場合はＰＡＣ
Ｄ１（アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター）、Ｐ
ＣＹＣ１（チトクロームＣ プロモーター）、ＣＯＳ細
胞の場合はＳＶ４０アーリー及びレイトプロモーターな
どが、その例として挙げられる。このようにして構築さ
れたＺＴＧａｓｅをコードするＤＮＡを含有するベクタ
ーを用いて、形質転換体を製造する。

【００１３】宿主としては、例えばEscherichia属菌、B
acillus属菌、Saccharomyces属菌、Saccharomyces属
菌、ＣＯＳ細胞などが挙げられる。上記Escherichia属
菌、Bacillus属菌、Saccharomyces属菌、Saccharomyces
属菌、ＣＯＳ細胞の具体例としては、前記したものと同
様のものが挙げられる。このようにして、ＺＴＧａｓｅ
をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換
された形質転換体が得られる。本発明において形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては、通常
のものでよいが、ＬＢ培地、Ｍ９培地、Ｔ培地などが挙
げられる。培地のpHは約６〜９、好ましくは７前後であ
る。培養時間、温度、培養方法等は適宜選択できるが、
振盪培養、培養温度２５℃前後、好ましくは２５℃より
若干低めがよく、特に好ましい組合せとしては、２５
℃、２４時間、１mMＩＰＴＧを含むＬＢ培地（pH７．
２）での振盪培養が挙げられる。例えば下記の方法によ
って、上記培養物からＺＴＧａｓｅを分離精製すること
ができる。菌体あるいは細胞を培養し、公知の方法によ
って菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸
濁し、超音波、オスモティックショック、リゾチーム及
び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊
したのち、遠心分離又はろ過によってＺＴＧａｓｅの前
駆体タンパク質や成熟タンパク質の粗抽出液を得ること
ができる。上記緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなど
のタンパク質変性剤又はトリトンＸ−１００などの界面
活性剤が含まれていてもよい。前駆体タンパク質や成熟
ペプチドが培養液中に分泌される場合には、培養終了
後、それ自体公知の方法で、菌体あるいは細胞と上清と
を分離し、上清を回収する。このようにして得られた培
養上清、あるいは抽出液中に含まれる前駆体タンパク質
や成熟タンパク質は、それ自体公知の分離・精製法を適
切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分
離・精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を
利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及び
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主と
して分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグ
ラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティ
ークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方
法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差
を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を
利用する方法及び抗体カラムクロマトグラフィーを利用
する方法などが挙げられる。

【００１４】本発明明細書において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合には、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Com
mision on Biochemical Nomenclatureによる略号あるい
は当該分野における慣用略号に基づき表示し、その例を
下記に示す。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る
場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。Ｄ
ＮＡ：デオキシリボ核酸、ｃＤＮＡ：相補的デオキシリ
ボ核酸、Ａ：アデニンＴ：チミン、Ｇ：グアニン、Ｃ：
シトシン、ＲＮＡ：リボ核酸、ｍＲＮＡ：メッセンジャ
ーリボ核酸、ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸、
ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸、ｄＧＴＰ：デオ
キシグアノシン三リン酸、ｄＣＴＰ：デオキシシチジン
三リン酸、ＡＴＰ：アデノシン三リン酸、Ｇｌｙ又は
Ｇ：グリシン、Ａｌａ又はＡ：アラニン、Ｖａｌ又は
Ｖ：バリン、Ｌｅｕ又はＬ：ロイシン、Ｉｌｅ又はＩ：
イソロイシン、Ｓｅｒ又はＳ：セリン、Ｔｈｒ又はＴ：
スレオニン、Ｃｙｓ又はＣ：システイン、Ｍｅｔ又は
Ｍ：メチオニン、Ｇｌｕ又はＥ：グルタミン酸、Ａｓｐ
又はＤ：アスパラギン酸、Ｌｙｓ又はＫ：リジン、Ａｒ
ｇ又はＲ：アルギニン、Ｈｉｓ又はＨ：ヒスチジン、Ｐ
ｈｅ又はＦ：フェニールアラニン、Ｔｙｒ又はＹ：チロ
シン、Ｔｒｐ又はＷ：トリプトファン、Ｐｒｏ又はＰ：
プロリン、Ａｓｎ又はＮ：アスパラギン、Ｇｌｎ又は
Ｑ：グルタミン

【００１５】

【実施例】以下の実施例により発明をより具体的に説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【００１６】ゼブラフィッシュ尾鰭由来のｃＤＮＡライ
ブラリーの作製 ゼブラフィッシュ尾鰭（virgin phase：バージン期）と
再生後７日目の尾鰭（regeneration phase：再生期）よ
り抽出された全ＲＮＡを材料にして、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ
合成キット（東洋紡）を用いて、ポリ（Ａ）セレクショ
ンを行った。ポリ（Ａ）セレクションによって精製され
たｍＲＮＡを鋳型にＭＭＬＶ−ＲＴａｓｅ（モロニーマ
ウス白血病ウイルス逆転写酵素）を用いて一本鎖ｃＤＮ
Ａを合成した。ＲＮａｓｅＨ（上記キット中の試薬）に
よりｍＲＮＡを消化した後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ（上記キット中の試薬）によって２本鎖ｃＤＮＡを合
成した。合成されたｃＤＮＡをＵｎｉ−ＺＡＰ Ａｒｍ
ｓ（上記キット中の試薬）にライゲーションしGigapack
III Gold packaging extract（上記キット中の試薬）
にパッケージングした。パッケージング産物を、ＸＬ
Ｉ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ′（上記キット中の試薬）との共
存培養によって増幅し、以下の実験で使用した。

【００１７】ディファレンシャルスクリーニング 再生尾鰭ｃＤＮＡライブラリーとＸＬ Ｉ−Ｂｌｕｅ
ＭＲＦ′を（３７℃、１５分間）共存培養し、その後ト
ップアガー（ＮＺＹ、バイオプロダクト）と共にプレー
ティングした。出現したプラークを２枚のニトロセルロ
ースメンブレンに移し、それぞれを、バージン期尾鰭と
再生期尾鰭のｃＤＮＡライブラリーからPCR DIG Probe
High Prime（ベーリンガー）を用いて作製したプローブ
とハイブリダイズさせた。オートラジオグラフィーによ
りコロニーのシグナルを検出し、バージン期尾鰭プロー
ブでのシグナルと再生期尾鰭プローブでのシグナルとを
比較することによって再生尾鰭に特異的なコロニーのシ
グナルを７４個検出した。７４個のシグナルに対応する
７４クローンについて、そのＤＮＡ配列を決定した。そ
の結果、２１クローンが新規なＤＮＡ配列であることが
分かった。

【００１８】in situハイブリダイゼーションスクリー
ニング 胚及び再生尾鰭におけるトランスグルタミナーゼの発現
部位を調べるために、得られた２１クローンについてin
situハイブリダイゼーションを行った。まず、胚又は
再生尾鰭を４％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、Ｐ
ＢＳで洗浄し、１００％メタノール内に浸した。次に、
メタノールをＰＢＳに置換し、胚又は再生尾鰭を６％過
酸化水素水で脱色し、１０μg/mlのプロテインキナーゼ
で消化した。再び４％パラホルムアルデヒドで固定し、
洗浄し、Ｈｂ４液（５０％ホルムアミド・５×ＳＳＣ・
５０μg/mlヘパリン・１０mg/ml全ＲＮＡ）を用いてプ
レハイブリダイズさせた。そして、ＲＮＡポリメラーゼ
により作製したＤＩＧアンチセンスプローブをＨｂ４液
に添加し、一晩ハイブリダイズさせた。その後、胚又は
再生尾鰭をＳＳＣで洗浄し、抗牛血清存在下で抗ＤＩＧ
−ＡＰ Ｆａｂフラグメント（ベーリンガー）と一晩反
応させた。得られた反応混合物をＰＢＳで洗浄し、ＰＢ
ＳをＡＰ反応バッファー（１M Tris−ＨＣｌ（pH９）
５．０ml、１MＭｇＣｌ₂ ２．５ml、５M ＮａＣｌ
１．０ml及び１０％Tween20 ５００μlをＨ₂Ｏで５０m
lにメスアップしたもの）と置換し、ＢＭ ｐｕｒｐｌ
ｅ ＡＰ基質（ベーリンガー）によって発色反応させ
た。

【００１９】上記のようにして、in situハイブリダイ
ゼーションを行った結果、クローンNo. ６４がゼブラフ
ィッシュにおける造血・血管形成組織、ＩＣＭ（Interm
ediate Cell Mass：内部細胞塊）及び心臓などに発現が
局在していることが明らかになった。

【００２０】全長遺伝子のクローニング ディファレンシャルハイブリダイゼーションによって単
離したクローンNo. ６４は約６００ｂｐのフラグメント
であり、全長遺伝子をクローニングするため、３′末端
側に対応するプライマーを設計し、このプライマーをＰ
ＣＲによりＤＩＧプローブを作製し、ハイブリダイゼー
ションによるスクリーニングを行った。２日目と７日目
の再生尾鰭由来のｃＤＮＡライブラリーを用い、両方の
ｃＤＮＡライブラリーから約２．５kbのクローンを得
た。kilo-sequence用Deletion kit（宝酒造）を用いて
欠失変異体を作製し、得られたクローンの配列を決定し
た。クローンのＤＮＡがコードするアミノ酸配列を解析
した結果、ヒトケラチノサイトトランスグルタミナーゼ
と３７％以上の、及びヒトファクターXIIIａと４２％以
上の相同性を示したため、クローンNo. ６４をゼブラフ
ィッシュトランスグルタミナーゼと命名した。クローン
No. ６４のｃＤＮＡ塩基配列を配列番号１に示した。

【００２１】得られたＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて連結し、ゼブラフィッシュトランスグルタミナー
ゼｃＤＮＡ発現プラスミドｐＩＬ６ＴＧ１を得た。公知
の方法によりｐＩＬ６ＴＧ１を大腸菌ＨＢ１０１に導入
し、形質転換体、すなわち大腸菌ＨＢ１０１／ｐＩＬ６
ＴＧ１（ＡＪ１２７３０）を得た。

【００２２】該形質転換体を寒天プレート上に播種し、
コロニーを形成させ、得られたコロニーをアンピシリン
２００μg/ml含有寒天プレート上に塗布し、３０℃で一
晩培養した後、このプレート上で増殖した菌体約２cm²
を採取し、アンピシリン２００μg/ml含有Ｍ９カザミノ
酸培地（Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ ６g/l、ＫＨ₂ＰＯ₄
３g/l、ＮａＣｌ ０．５g/l、ＮＨ₄Ｃｌ １g/l、カ
ザミノ酸２g/l、Ｌ−Ｌｅｕ ０．２g/l、Ｌ−Ｐｒｏ
０．２g/l、チアミン・ＨＣｌ ２mg/l、ＭｇＳＯ₄・７
Ｈ₂Ｏ ０．５g/l、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０．０１５g/
l、グルコース２g/l）１００mlを含む坂口フラスコへ接
種した。これを、３０℃で約１６時間培養し、その後菌
体を集菌した。

【００２３】集菌した菌体を、０．５M ＥＤＴＡ溶液
０．３ml、２０mM Tris−ＨＣｌ／３０mM ＮａＣｌ混液
３０mlに添加し、懸濁させた。さらに、４mg/mlリゾチ
ーム溶液１mlを添加し、撹拌後、０℃で１時間放置し
た。その後、菌体懸濁液を超音波で破砕し、これを遠心
（８０００rpm、１０分間）し、菌体破砕上清を調製し
た。また、トランスグルタミナーゼｃＤＮＡを有しない
プラスミドを保持する大腸菌（ＨＢ１０１／ＰＢＳＦ２
−ＳＤ７）からも、同様な方法を用いて菌体破砕物の遠
心上清液を調製した。この上清液中のトランスグルタミ
ナーゼの分子量を測定したところ約８３０００であっ
た。

【００２４】各々の上清液のトランスグルタミナーゼ活
性を、モノダンシルカダベリンのメチル化カゼインへの
結合による蛍光強度（３５０nmの励起波長光による４８
０nmの蛍光強度）の変化を指標とした活性検出法によっ
て検定した。本活性検出法はNippon Suisan Gakkaishi
(1991年)の第57巻、1203〜1210頁に記載されている方法
を基に、若干の修正を加えたものである。即ち、メチル
化カゼイン１mg/ml、モノダンシルカダベリン１５M、Ｃ
ａＣｌ₂ ５mM, Tris−ＨＣｌ（pH７．５）５０mM, ＤＴ
Ｔ ３mMの組成よりなる溶液（サンプル添加後に２．５m
lになるよう調製）に各検定サンプル１５０μlを添加
し、撹拌後、３７℃で３０分間保温した。反応後、ＥＤ
ＴＡ溶液を最終濃度１０mMとなるように添加し、各反応
溶液の蛍光強度を蛍光強度計（ＭＴＰ−３２マイクロプ
レートリーダー，コロナ電気）により測定した。

【００２５】

【表１】

【００２６】その結果、表１に見られるように上記実施
例で得られたトランスグルタミナーゼｃＤＮＡを含む発
現プラスミドを保持する大腸菌の菌体抽出液には、明ら
かにトランスグルタミナーゼ活性が存在することが判明
した。このことより、我々の取得したｃＤＮＡが、トラ
ンスグルタミナーゼをコードしうるものであることが明
らかになった。

【００２７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Bio Quest Research, Ltd. <120> Zebrafish transglutaminase <130> KP-9811 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2554 <212> DNA <213> Danio rerio <220> <221> CDS <222> (76)..(2298) <400> 1 tgatgtgatc ccagactcca ggatctgacg ccatttatca acccagtagt gttccaggat 60 cttcccttat ctatc atg gct gat caa gtg gct cca gag aac ccg acc cct 111 Met Ala Asp Gln Val Ala Pro Glu Asn Pro Thr Pro 1 5 10 gct gct gca ccc acc gtt cgg ccc aaa cag cgg gtg tcc cac cgt gga 159 Ala Ala Ala Pro Thr Val Arg Pro Lys Gln Arg Val Ser His Arg Gly 15 20 25 cgc agc gca gga ggc aga gcc agc tcc aat caa caa gag ggc aag gtg 207 Arg Ser Ala Gly Gly Arg Ala Ser Ser Asn Gln Gln Glu Gly Lys Val 30 35 40 gag gag ttt gag ccc ttc atg ctg atg ccc aga gga cct cca cca ctc 255 Glu Glu Phe Glu Pro Phe Met Leu Met Pro Arg Gly Pro Pro Pro Leu 45 50 55 60 act gag tat ctg gat atc ttt gat gtg gat gtg ctc aaa cag cct aat 303 Thr Glu Tyr Leu Asp Ile Phe Asp Val Asp Val Leu Lys Gln Pro Asn 65 70 75 gaa gtg aat aaa cag gct cat cac aca cac ctt tac tcc agc aac ttc 351 Glu Val Asn Lys Gln Ala His His Thr His Leu Tyr Ser Ser Asn Phe 80 85 90 ctc atc gtg cgc cga gct caa gag ttt cag atc aag atc acc ttc aat 399 Leu Ile Val Arg Arg Ala Gln Glu Phe Gln Ile Lys Ile Thr Phe Asn 95 100 105 cga ccc tac aaa ccg gct gaa gac aag ttt gcg gtt gag ttt gtt ata 447 Arg Pro Tyr Lys Pro Ala Glu Asp Lys Phe Ala Val Glu Phe Val Ile 110 115 120 gga ccg gtt cct cag tac agt aaa ggc acc tac att ccc gtc ttc ccc 495 Gly Pro Val Pro Gln Tyr Ser Lys Gly Thr Tyr Ile Pro Val Phe Pro 125 130 135 140 act gcg aac ggc aga gcg tct gga gcg gcc ggg tca tcg aaa gma gtg 543 Thr Ala Asn Gly Arg Ala Ser Gly Ala Ala Gly Ser Ser Lys Xaa Val 145 150 155 aaa tgt ggt cac gat ggg cat cac tcc ctc agc aga gtg cat tgt ggg 591 Lys Cys Gly His Asp Gly His His Ser Leu Ser Arg Val His Cys Gly 160 165 170 aaa ata cat gac cta cat cgg tgt gga gac acc gta cgg cat ccg cag 639 Lys Ile His Asp Leu His Arg Cys Gly Asp Thr Val Arg His Pro Gln 175 180 185 acc agg aga gac cca aac act gac atc tat atc ctt ttc aac ccg tgg 687 Thr Arg Arg Asp Pro Asn Thr Asp Ile Tyr Ile Leu Phe Asn Pro Trp 190 195 200 tca cca gct gat ccg gtg ttt ctg gat gac gag gag gag cgt gag gag 735 Ser Pro Ala Asp Pro Val Phe Leu Asp Asp Glu Glu Glu Arg Glu Glu 205 210 215 220 tgt gta atg aat gaa ctc ggg atc atc tat cat gga gca tat gat gat 783 Cys Val Met Asn Glu Leu Gly Ile Ile Tyr His Gly Ala Tyr Asp Asp 225 230 235 gtg tct gaa cgc gcc tgg aac tac gga cag ttt gag ttt gga gtt ctg 831 Val Ser Glu Arg Ala Trp Asn Tyr Gly Gln Phe Glu Phe Gly Val Leu 240 245 250 gat gca tgt ctg ttc gtc atg gat aaa gct gat atg ccg ctg tca aac 879 Asp Ala Cys Leu Phe Val Met Asp Lys Ala Asp Met Pro Leu Ser Asn 255 260 265 cga ggt gat gtc gtt aaa gtg act cgc gtc gct tca gca atg ctg aac 927 Arg Gly Asp Val Val Lys Val Thr Arg Val Ala Ser Ala Met Leu Asn 270 275 280 tct cgt gat gat gac gga gtg ttg gtg gga aac tgg agt ggg gat tac 975 Ser Arg Asp Asp Asp Gly Val Leu Val Gly Asn Trp Ser Gly Asp Tyr 285 290 295 300 atg tac gga gtg ccg ccg acg tcc tgg acg ggc agc gtt gag atc cta 1023 Met Tyr Gly Val Pro Pro Thr Ser Trp Thr Gly Ser Val Glu Ile Leu 305 310 315 ttg gac tac gcc aac agt agt gga act cca gtc tgc tat gct cag tgc 1071 Leu Asp Tyr Ala Asn Ser Ser Gly Thr Pro Val Cys Tyr Ala Gln Cys 320 325 330 tgg gtc tac gcc gct gtc ttc aac acc ttc ctg cga tgt ctc ggg atc 1119 Trp Val Tyr Ala Ala Val Phe Asn Thr Phe Leu Arg Cys Leu Gly Ile 335 340 345 ccc agc aga gtc gtg acc aac ttc ttt tct gct cac gac aat gac ggc 1167 Pro Ser Arg Val Val Thr Asn Phe Phe Ser Ala His Asp Asn Asp Gly 350 355 360 aac ctg aag atg gac ata atc ctg gat gaa aat ggg aaa ctg gac cgg 1215 Asn Leu Lys Met Asp Ile Ile Leu Asp Glu Asn Gly Lys Leu Asp Arg 365 370 375 380 aac cgc acc aaa gac tcc atc tgg aat tat cat tgc tgg aac gag tgc 1263 Asn Arg Thr Lys Asp Ser Ile Trp Asn Tyr His Cys Trp Asn Glu Cys 385 390 395 tac atg gcc agg cct gat ctg cct tca ggg ttt gga ggt tgg cag gtt 1311 Tyr Met Ala Arg Pro Asp Leu Pro Ser Gly Phe Gly Gly Trp Gln Val 400 405 410 gtg gac gca acg cca cag gag acc agc gat ggt atg ttt agg tgt gga 1359 Val Asp Ala Thr Pro Gln Glu Thr Ser Asp Gly Met Phe Arg Cys Gly 415 420 425 cct gcg tct gta gct gcc ata aaa cat ggt cag atc tgc tac ccg ttt 1407 Pro Ala Ser Val Ala Ala Ile Lys His Gly Gln Ile Cys Tyr Pro Phe 430 435 440 gat gcc ccc ttt gtg ttt gca gag gtg aac agt gac gtg gtc ttt tat 1455 Asp Ala Pro Phe Val Phe Ala Glu Val Asn Ser Asp Val Val Phe Tyr 445 450 455 460 cgt aga cgt aaa gac ggt att ctg gaa gtc gtg aag gtc aat cag act 1503 Arg Arg Arg Lys Asp Gly Ile Leu Glu Val Val Lys Val Asn Gln Thr 465 470 475 cat gtg ggc cgg atg gtg ctg acc aaa gct gtg ctg cac agt gga cgt 1551 His Val Gly Arg Met Val Leu Thr Lys Ala Val Leu His Ser Gly Arg 480 485 490 cga gac att aca aac cag tac aag ttc cct gaa ggg agc ccg gag gag 1599 Arg Asp Ile Thr Asn Gln Tyr Lys Phe Pro Glu Gly Ser Pro Glu Glu 495 500 505 cgg cgt gtg ctg gag aaa gct gag gag ttc ggc tgt cag cgg gag aaa 1647 Arg Arg Val Leu Glu Lys Ala Glu Glu Phe Gly Cys Gln Arg Glu Lys 510 515 520 tcc tct cct gct ctg agc gat gtg gac gtg gag atc cac agt ctg gat 1695 Ser Ser Pro Ala Leu Ser Asp Val Asp Val Glu Ile His Ser Leu Asp 525 530 535 540 gtt aat gta ggg gaa aac ttt gat gtc act ctg cag ttc acc aac cgc 1743 Val Asn Val Gly Glu Asn Phe Asp Val Thr Leu Gln Phe Thr Asn Arg 545 550 555 agt gac cag cgc cgc acg gca gac gtc tac atc acc ggg aca gtg gtg 1791 Ser Asp Gln Arg Arg Thr Ala Asp Val Tyr Ile Thr Gly Thr Val Val 560 565 570 tat tat act gga gtc ccg agc gga gag gtc gtg ttt aag aca cct aaa 1839 Tyr Tyr Thr Gly Val Pro Ser Gly Glu Val Val Phe Lys Thr Pro Lys 575 580 585 gtc aaa cta gag cca atg cag agt aaa gag gag aaa gtg ctg gtc cgc 1887 Val Lys Leu Glu Pro Met Gln Ser Lys Glu Glu Lys Val Leu Val Arg 590 595 600 agc gag gac tac atg aac aaa ctg gtg gag cag aga aac atc cac ttc 1935 Ser Glu Asp Tyr Met Asn Lys Leu Val Glu Gln Arg Asn Ile His Phe 605 610 615 620 atc gct aca ggg aag att aaa gag acg gga cag atc atc aca gcc atg 1983 Ile Ala Thr Gly Lys Ile Lys Glu Thr Gly Gln Ile Ile Thr Ala Met 625 630 635 aaa gtc atc gca atg cac cat ccc aaa ctc acc gtc aag gtc aca ggc 2031 Lys Val Ile Ala Met His His Pro Lys Leu Thr Val Lys Val Thr Gly 640 645 650 tct ccg agg gtg agt gag gaa atg tac gtg tct gtt gag ttc aca aac 2079 Ser Pro Arg Val Ser Glu Glu Met Tyr Val Ser Val Glu Phe Thr Asn 655 660 665 cct ttc aag ttc agt ctg gag aac gtg gat ctg cgt gtg gag ggt ccc 2127 Pro Phe Lys Phe Ser Leu Glu Asn Val Asp Leu Arg Val Glu Gly Pro 670 675 680 gga gtc ctg ccc ttc aaa tac aag cag tac agt gtg att gct cca ggc 2175 Gly Val Leu Pro Phe Lys Tyr Lys Gln Tyr Ser Val Ile Ala Pro Gly 685 690 695 700 acc tct ata acg tgg act gag gcg ttc agc cct cga cgg gcc gga tct 2223 Thr Ser Ile Thr Trp Thr Glu Ala Phe Ser Pro Arg Arg Ala Gly Ser 705 710 715 act aaa gtg ttt gcc aaa ctg gac tgt gct gct ctc aga cag gtg tac 2271 Thr Lys Val Phe Ala Lys Leu Asp Cys Ala Ala Leu Arg Gln Val Tyr 720 725 730 gga gag acg gag ctc act gtc caa gaa tgaaaatggc agaacatgaa 2318 Gly Glu Thr Glu Leu Thr Val Gln Glu 735 740 gacaagaaac tggcgtctgt agtctatgac caaagagaat ttgcatgtga actcgagagt 2378 aatcaagaga aacatcatat tgctgcatgt taccagtgca tgatattatt gtgtgttcag 2438 ttaaatagtt atcacagtgt atattgtcat ttagccatcc ttgtccttta tgtaagaaga 2498 gtaatgctgt actgcataga aaataaacga ccaacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2554 <210> 2 <211> 741 <212> PRT <213> Danio rerio <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(59) <223> N-terminal peptide domain <220> <221> DOMAIN <222> (60)..(201) <223> beta-sandwich domain <220> <221> DOMAIN <222> (202)..(529) <223> catalytic core <220> <221> DOMAIN <222> (530)..(644) <223> beta-barrel domain 1 <220> <221> DOMAIN <222> (645)..(741) <223> beta-barrel domain 2 <220> <221> VARIANT <222> (155) <223> Ala or Glu <400> 2 Met Ala Asp Gln Val Ala Pro Glu Asn Pro Thr Pro Ala Ala Ala Pro 1 5 10 15 Thr Val Arg Pro Lys Gln Arg Val Ser His Arg Gly Arg Ser Ala Gly 20 25 30 Gly Arg Ala Ser Ser Asn Gln Gln Glu Gly Lys Val Glu Glu Phe Glu 35 40 45 Pro Phe Met Leu Met Pro Arg Gly Pro Pro Pro Leu Thr Glu Tyr Leu 50 55 60 Asp Ile Phe Asp Val Asp Val Leu Lys Gln Pro Asn Glu Val Asn Lys 65 70 75 80 Gln Ala His His Thr His Leu Tyr Ser Ser Asn Phe Leu Ile Val Arg 85 90 95 Arg Ala Gln Glu Phe Gln Ile Lys Ile Thr Phe Asn Arg Pro Tyr Lys 100 105 110 Pro Ala Glu Asp Lys Phe Ala Val Glu Phe Val Ile Gly Pro Val Pro 115 120 125 Gln Tyr Ser Lys Gly Thr Tyr Ile Pro Val Phe Pro Thr Ala Asn Gly 130 135 140 Arg Ala Ser Gly Ala Ala Gly Ser Ser Lys Xaa Val Lys Cys Gly His 145 150 155 160 Asp Gly His His Ser Leu Ser Arg Val His Cys Gly Lys Ile His Asp 165 170 175 Leu His Arg Cys Gly Asp Thr Val Arg His Pro Gln Thr Arg Arg Asp 180 185 190 Pro Asn Thr Asp Ile Tyr Ile Leu Phe Asn Pro Trp Ser Pro Ala Asp 195 200 205 Pro Val Phe Leu Asp Asp Glu Glu Glu Arg Glu Glu Cys Val Met Asn 210 215 220 Glu Leu Gly Ile Ile Tyr His Gly Ala Tyr Asp Asp Val Ser Glu Arg 225 230 235 240 Ala Trp Asn Tyr Gly Gln Phe Glu Phe Gly Val Leu Asp Ala Cys Leu 245 250 255 Phe Val Met Asp Lys Ala Asp Met Pro Leu Ser Asn Arg Gly Asp Val 260 265 270 Val Lys Val Thr Arg Val Ala Ser Ala Met Leu Asn Ser Arg Asp Asp 275 280 285 Asp Gly Val Leu Val Gly Asn Trp Ser Gly Asp Tyr Met Tyr Gly Val 290 295 300 Pro Pro Thr Ser Trp Thr Gly Ser Val Glu Ile Leu Leu Asp Tyr Ala 305 310 315 320 Asn Ser Ser Gly Thr Pro Val Cys Tyr Ala Gln Cys Trp Val Tyr Ala 325 330 335 Ala Val Phe Asn Thr Phe Leu Arg Cys Leu Gly Ile Pro Ser Arg Val 340 345 350 Val Thr Asn Phe Phe Ser Ala His Asp Asn Asp Gly Asn Leu Lys Met 355 360 365 Asp Ile Ile Leu Asp Glu Asn Gly Lys Leu Asp Arg Asn Arg Thr Lys 370 375 380 Asp Ser Ile Trp Asn Tyr His Cys Trp Asn Glu Cys Tyr Met Ala Arg 385 390 395 400 Pro Asp Leu Pro Ser Gly Phe Gly Gly Trp Gln Val Val Asp Ala Thr 405 410 415 Pro Gln Glu Thr Ser Asp Gly Met Phe Arg Cys Gly Pro Ala Ser Val 420 425 430 Ala Ala Ile Lys His Gly Gln Ile Cys Tyr Pro Phe Asp Ala Pro Phe 435 440 445 Val Phe Ala Glu Val Asn Ser Asp Val Val Phe Tyr Arg Arg Arg Lys 450 455 460 Asp Gly Ile Leu Glu Val Val Lys Val Asn Gln Thr His Val Gly Arg 465 470 475 480 Met Val Leu Thr Lys Ala Val Leu His Ser Gly Arg Arg Asp Ile Thr 485 490 495 Asn Gln Tyr Lys Phe Pro Glu Gly Ser Pro Glu Glu Arg Arg Val Leu 500 505 510 Glu Lys Ala Glu Glu Phe Gly Cys Gln Arg Glu Lys Ser Ser Pro Ala 515 520 525 Leu Ser Asp Val Asp Val Glu Ile His Ser Leu Asp Val Asn Val Gly 530 535 540 Glu Asn Phe Asp Val Thr Leu Gln Phe Thr Asn Arg Ser Asp Gln Arg 545 550 555 560 Arg Thr Ala Asp Val Tyr Ile Thr Gly Thr Val Val Tyr Tyr Thr Gly 565 570 575 Val Pro Ser Gly Glu Val Val Phe Lys Thr Pro Lys Val Lys Leu Glu 580 585 590 Pro Met Gln Ser Lys Glu Glu Lys Val Leu Val Arg Ser Glu Asp Tyr 595 600 605 Met Asn Lys Leu Val Glu Gln Arg Asn Ile His Phe Ile Ala Thr Gly 610 615 620 Lys Ile Lys Glu Thr Gly Gln Ile Ile Thr Ala Met Lys Val Ile Ala 625 630 635 640 Met His His Pro Lys Leu Thr Val Lys Val Thr Gly Ser Pro Arg Val 645 650 655 Ser Glu Glu Met Tyr Val Ser Val Glu Phe Thr Asn Pro Phe Lys Phe 660 665 670 Ser Leu Glu Asn Val Asp Leu Arg Val Glu Gly Pro Gly Val Leu Pro 675 680 685 Phe Lys Tyr Lys Gln Tyr Ser Val Ile Ala Pro Gly Thr Ser Ile Thr 690 695 700 Trp Thr Glu Ala Phe Ser Pro Arg Arg Ala Gly Ser Thr Lys Val Phe 705 710 715 720 Ala Lys Leu Asp Cys Ala Ala Leu Arg Gln Val Tyr Gly Glu Thr Glu 725 730 735 Leu Thr Val Gln Glu 740

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA10 CA04 DA06 EA04 GA11 4B050 CC01 CC03 DD11 LL03 LL10 4B065 AA15X AA26X AA79X AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA29 CA44 CA46 CA60

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の理化学的性質、（１）モノダンシ
   ルカダベリンをメチル化カゼインへ結合させる、（２）
   ゼブラフィッシュに由来する、（３）ヒトケラチノサイ
   トトランスグルタミナーゼと３７％以上の、及びヒトフ
   ァクターXIIIａと４２％以上の相同性を有する、（４）
   ゼブラフィッシュ初期胚のＩＣＭ及び血島での局在した
   発現が認められる、（５）分子量が約８３０００であ
   る、（６）Ｎ末端ペプチドドメイン，βサンドウィッチ
   ドメイン，触媒コア，βバレルドメイン１，βバレルド
   メイン２の５個のドメインからなることを特徴とするタ
   ンパク質。
2. 【請求項２】 配列番号２に示されるアミノ酸配列を含
   む請求項１記載のタンパク質。
3. 【請求項３】 請求項１記載のタンパク質をコードする
   ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号１に示される配列からなる請求
   項３記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項３又は４記載のＤＮＡを含有する
   発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項５記載の発現ベクターを含有する
   形質転換体。