JP2001281256A - 点眼液等の眼分泌物汚染検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】点眼液の眼分泌液からの汚染を確実に検出し、
安心して点眼液の使用ができる、点眼液中の蛋白質の検
出方法を提供しようとするものである。 【解決手段】点眼液の眼分泌液からの汚染を確実に検出
するために、眼分泌液由来の蛋白質とくにラクトフェリ
ンを検出することで、汚染を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は眼科局所投与用の液剤の
眼分泌物検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】点眼液等の眼科用液剤は使用時において
浮遊物等の異物が検出されたり、色調の変化が起こりク
レームとして医薬品メーカーに寄せられる。医薬品メー
カーにとって消費者からのこれらクレームが消費者の使
用不備によるものか製剤配合の不備であるか大きな問題
である。消費者においても点眼液あるいはコンタクトレ
ンズ等の保存液、洗浄液に不純物あるいは目に見えない
眼分泌物からの汚染があることは安全性の観点から問題
があり、これを精度よく検出する方法が望まれている。
医療の現場でも眼感染症の要因として点眼液あるいはコ
ンタクトレンズ等からの汚染を心配しており、これらの
簡便な検査方法が望まれている。このような眼分泌液に
よる汚染の対象となるものに点眼液、コンタクトレンズ
用保存液および洗浄液があり、そのほかに眼科で使用さ
れる治療器具等がある。治療器具等が汚染されると患者
間の相互汚染の原因となり現実の医療の現場では重要な
問題である。

【０００３】このような問題を解決するため生産者では
ニンヒドリン反応等により蛋白質の検出をしようとして
いるが感度が悪く特異性が低いなどの問題があり、これ
ら欠陥のない簡便な解決法がのぞまれている。ニンヒド
リン反応にみられるように蛋白質の測定により涙液によ
る点眼液等の汚染状況を検査できると考えられるが、涙
液のなかの蛋白質としてリゾチーム、ラクトフェリンあ
るいはアルブミンなどがあり、臨床検査の場で種々利用
されている。

【０００４】特にラクトフェリンは炎症に関与する好中
球に由来し、臨床の場で大腸癌（特許第２７４７６４
３）、尿路感染症（特開平１０−４８２０９）の検出に
利用され又眼科領域ではドライアイの涙腺異常の検査に
使用されつつある（あたらしい眼科1997年14巻11号Ｐ１
６３１−１６３６）。これらの方法は涙液中のラクトフ
ェリン濃度を直接測定し病状をチェックするもので、感
染症の原因の一つである点眼液等の汚染チェックに利用
することは何等触れていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】以上のように点眼液等
（点眼液、コンタクトレンズ用保存液および洗浄液、そ
して眼科で使用される器具等の洗浄液）の汚染をすばや
く簡便に検出することは点眼薬メーカーでは苦情処理に
おける品質管理に、医療機関あるいは消費者にとっては
自ら使用する点眼液等の品質の確認には必要である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明はこのような観点
から、点眼液等の眼分泌液からの汚染を検出するための
手段を開発したものである。簡便な検査方法を求め免疫
学的、生化学的研究を重ねた結果、使用中に不溶物を有
する点眼液中にラクトフェリンが量的に有意に存在して
いることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわ
ち本発明は点眼液中のラクトフェリンを測定することに
より点眼液中の眼分泌液の汚染を検出する方法を提供す
るものである。免疫学的方法としてはいずれの方法を用
いてもよいが酵素免疫測定法、イムクロマトグラフィー
法などが好ましい。いずれの方法も例えばサンドイッチ
アッセイ型の場合、検体中のラクトフェリン抗体を支持
体に含有させた抗ラクトフェリンと反応せしめた後、上
記抗ラクトフェリンと反応する物質の標識化物を反応さ
せ、反応生成物の標識量を測定する工程を含む。酵素免
疫法は酵素標識化物を用いて、反応生成物の標識量を酵
素活性により測定する。イムノクロマトグラフィー法
は、着色粒子標識化物を用いて、反応生成物の標識量を
着色量により測定する。

【０００７】本発明には反応生成物の標識量、すなわち
検体中のラクトフェリン量を容易に数値化できる酵素免
疫測定法が好適に用いられる。酵素免疫法には、検体中
のラクトフェリンを支持体に含有させた抗ラクトフェリ
ン抗体と反応せしめた後、上記ラクトフェリンと反応す
る物質好ましくは免疫グロブリン抗体、プロテインＡ、
プロテインＧ及びジャッカリンの中のいずれか１種の酵
素標識化物を反応させ、反応生成物の標識量を酵素活性
により測定する工程を含む方法が適している。この支持
体へ抗ラクトフェリンを含有させる方法は物理的吸着で
あってもよいし、化学的結合であってもよい。標識用酵
素としては、ペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダー
ゼ、アルカリホスファターゼが好適である。又、免疫測
定法としてサンドイッチアッセイ型の他に公知の競合ア
ッセイ型、凝集型を用いても測定は可能である。

【０００８】

【実施例】１ 点眼液中の眼分泌物由来ラクトフェリンの酵素酵素抗体
法による検出試験 １）抗ラクトフェリンを含有させた支持体の調製 リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したウサギ抗ヒ
トラクトフェリン抗体１０μＧ/ｍＬ（ＣＰＬ−５５０
４０）を９６穴マイクロプレート（コースター社）の各
々のウェルに０．２ｍＬずつ加え、４℃で１晩反応させ
た。反応後、各ウェルの液を除去した後、洗浄のためＰ
ＢＳを０．２５ｍＬずつ加え攪拌後、液を除去した。こ
の洗浄操作を３回繰り返した後、マスキング試薬として
０．１％牛血清アルブミン加ＰＢＳを０．２５ｍＬ加
え、３７℃１時間インキュベートした。マスキングの
後、各ウェル内の液を除去し、保存液として０．１％窒
化ナトリウム、０．１％牛血清アルブミン加ＰＢＳを各
ウェルに０．２５ｍＬずつ加え、４℃で保存した。

【０００９】２）検体中のラクトフェリンの測定 汚染の恐れがある点眼液中のラクトフェリンの測定はサ
ンドイッチ法を用いた。すなわち、先に作製した抗ラク
トフェリン固相化マイクロプレートの保存液を除去した
後、被検液をウェルに０．２ｍＬずつ加え、マイクロプ
レートミキサーにて約一分間攪拌の後、３７℃１時間反
応させた。各ウェルの液を除去した後、０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０加ＰＢＳ０．２５ｍＬで３回洗浄を行った。
次にペルオキシダーゼ標識抗ラクトフェリン抗体を至適
濃度に希釈し、各ウェルに０．２ｍＬずつ加え、再び３
７℃１時間反応させた。反応後、液を除去し再度洗浄を
行い、各ウェル中の液を完全に除去した後、基質液
（０．０１％過酸化水素加１．５ｍＧ/ｍＬ o-フェニ
レンジアミン水溶液）を0.2ｍＬ加え室温に１０分間反
応させた。３．５Ｎ硫酸を各ウェルに０．０５ｍＬ添加
することで反応を停止させた。反応停止したプレートは
マイクロプレート用比色計で吸光値（４９２nmの吸光値
―６３０nmの吸光値）を測定した。

【００１０】反応結果 汚染の可能性のあるサンプル６
個と出荷前の未開封品の測定結果を次に示す。 表１ サンプルと未開封品の測定結果 測定結果サンプル中のラクトフェリン濃度は未開封品の
平均ＯＤ値０．０１６に対して平均ＯＤ値０．０７９と
有意に高かった（ｔ（５、０．０５）２．５７１＜ｔ０
＝７．８９６）。さらにカットオフ値（未開封品の差Ｅ
＋２δ値）０．０４に比べて,サンプルのＯＤ値はいず
れも高いことから、ラクトフェリン様の微量物質の混入
が原因と確認された。

【００１１】

【発明の効果】本発明によれば、点眼液等のラクトフェ
リンが免疫学的に分析することができるので、点眼液等
の眼分泌液等からの汚染が確実に検出することができ
る。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 蛋白質を感度良く測定することを特徴と
   する、点眼液、眼手術用具、コンタクトレンズ、コンタ
   クトレンズの洗浄液あるいは保存液の眼分泌物検出方
   法。
2. 【請求項２】 蛋白質がリゾチーム、ラクトフェリン、
   涙液に特異的なプレアルブミンあるいはアルブミンであ
   る請求項１記載の検出方法。
3. 【請求項３】 蛋白質がラクトフェリンである請求項1
   記載の検出方法。