JP2001174706A - コンフォーカル顕微鏡及びその画像処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 画角を小さくすることなく、正確に輝度ムラ
を補正する。 【解決手段】 試料２２を走査する２つのスキャナミラ
ーの近傍に瞳が位置する近接瞳方式をいたコンフォーカ
ル顕微鏡１において、予め取得画像を構成する各ピクセ
ルの輝度ムラ補正値を求めてROM２８に記憶させ、CPU２
７が輝度ムラ補正値に従って、取得した画像に補正をか
ける。ROM２８に記憶させる輝度ムラ補正値は、対物レ
ンズ側の瞳３２におけるレーザ光強度分布の中心位置の
動きを考慮した光線追跡により求める。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、顕微鏡に関し、特
に、コンフォーカル顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術】図７は、従来の反射型コンフォーカル顕
微鏡１０の構成を示す図である。図７の例では、レーザ
光源１１から射出されたレーザ光は、試料２２を走査す
る走査ユニット１６によって、試料２２上にスポットを
結ぶ。試料２２からの反射光は、レーザ光の入射経路に
沿って元に戻り、偏光ビームスプリッタ１５によって集
光レンズ２３上に集光され、コンフォーカルピンホール
２４を通過する。コンフォーカルピンホール２４を通過
した反射光は、光検出器２５によって検出され、その後
信号処理されて取得画像としてディスプレイ３０上に表
示される。

【０００３】コンフォーカルピンホール２４は、合焦時
に試料２２上に形成されるレーザスポットと共役な位置
に配置され、コンフォーカル（共焦点）光学系を構成し
ている。これにより、試料２２上のフォーカス面以外の
信号を排除することができるため、必要な信号だけを抽
出することができる。また、試料２２の深さ方向に沿っ
てレーザ光の焦点位置を変化させることにより、試料２
２の３次元画像を生成することも可能になる。

【０００４】次に、レーザ光源１１から射出されるレー
ザ光の試料２２への入射経路及び反射経路について、図
７を参照しながら説明する。

【０００５】[レーザ光の入射経路]先ず、試料２２への
入射経路について説明する。レーザ光源１１から射出さ
れたレーザ光は、ND(Neutral Density)フィルタ１２で
調光される。調光されたレーザ光は、全反射ミラー１３
で反射され、ビームエキスパンダ１４に導かれる。ビー
ムエキスパンダ１４に導かれたレーザ光は拡大されて、
偏光ビームスプリッタ（PBS(Polarization Beam Splitt
er)）１５に入射する。偏光ビームスプリッタ１５に入
射したレーザ光は、Ｐ偏光のみの光となって、走査ユニ
ット１６に導かれる。

【０００６】走査ユニット１６は、試料２２上をＸ方向
及びＹ方向に２次元的に走査する２つのガルバノメータ
スキャナミラー（Ｘスキャナミラー及びＹスキャナミラ
ー）を有する。ＸスキャナミラーはＰ偏光のレーザ光を
試料２２のＸ方向に走査するためのものであり、Ｙスキ
ャナミラーはＰ偏光のレーザ光を試料２２のＹ方向に走
査するためのものである。

【０００７】ところで、反射型コンフォーカル顕微鏡１
０では、通常、対物レンズ側の瞳３２と共役な位置にス
キャナミラー側の瞳がくるように、レンズ系が配置され
る。従って、試料２２上を走査する場合、走査ユニット
１６のＸスキャナミラー及びＹスキャナミラーを、それ
ぞれ所定の振れ角で振っても、対物レンズ側の瞳３２に
おけるレーザ光強度分布の中心位置は動かない。このた
め、取得した画像において、輝度ムラ（シェーディン
グ）はほとんど発生しない。

【０００８】しかしながら、上述の反射型コンフォーカ
ル顕微鏡の場合、対物レンズ側の瞳３２と共役な位置に
スキャナミラー側の瞳がくるようにするため、多くのレ
ンズを使用しなければならず、顕微鏡をコンパクトにで
きないという問題があった。また、上述の反射型コンフ
ォーカル顕微鏡の場合、多くのレンズを使用しているた
め、レンズによるレーザ光の損失が大きいという問題が
あった。

【０００９】そこで、上記２つの問題を解決するため、
走査ユニット１６では、スキャナミラー側の瞳を、対物
レンズ側の瞳３２と共役な位置からずらしてスキャナミ
ラーの近傍に配置している。これにより、使用するレン
ズの数を減らすことができ、上記２つの問題を解決する
ことができる。

【００１０】走査ユニット１６に導かれたＰ偏光のレー
ザ光は、試料２２上を２次元的に走査される。P偏光の
レーザ光は、リレーレンズ１７及び第２対物レンズ１８
を通過し、全反射ミラー１９で反射され、λ／４板２０
に導かれる。λ／４板２０に導かれたＰ偏光のレーザ光
は、π／４の位相差を与えられ、右回りの円偏光とな
る。円偏光になったレーザ光は、対物レンズ２１で集光
され、試料２２上の一点にスポットを結ぶ。

【００１１】[レーザ光の反射経路]次に、試料２２から
の反射経路について説明する。試料２２からの反射光
は、左回りの円偏光となり、対物レンズ２１を通過し、
λ／４板２０に導かれる。λ／４板２０に導かれた反射
光は、Ｓ偏光のレーザ光に変換される。Ｓ偏光のレーザ
光は、全反射ミラー１９で反射され、第２対物レンズ１
８及びリレーレンズ１７を通過し、走査ユニット１６に
導かれる。Ｓ偏光のレーザ光は、走査ユニット１６でデ
スキャンニングされ、偏光ビームスプリッタ１５に導か
れる。Ｓ偏光のレーザ光は、偏光ビームスプリッタ１５
で反射される。反射されたＳ偏光のレーザ光は、集光レ
ンズ２３で集光され、コンフォーカルピンホール２４を
通過する。コンフォーカルピンホール２４を通過したレ
ーザ光は、光検出器２５に入射する。

【００１２】光検出器２５は、入射されたレーザ光をア
ナログの輝度信号LSに変換する。光検出器２５で生成さ
れたアナログの輝度信号LSは、A/D(Analog/Digital)変
換器２６に供給される。A/D変換器２６は、供給された
アナログの輝度信号LSをデジタルデータに変換する。A/
D変換器２６で生成された輝度データは、CPU(CentralPr
ocessing Unit)２７に供給される。CPU２７は、試料２
２上の走査位置（ピクセル）に対応した所定のサンプリ
ングクロックで輝度データを受け取り、画像を構成する
ピクセルの輝度値とする。各ピクセルの輝度値は、１フ
レーム毎にフレームメモリ２９に格納され、画像として
ディスプレイ３０に表示されるか、若しくは画像記憶部
３１に格納される。

【００１３】しかしながら、上述の近接瞳方式を用いた
反射型コンフォーカル顕微鏡１０においては、対物レン
ズ側の瞳３２とスキャナミラー側の瞳とが共役な位置に
ないため、走査ユニット１６内のＸスキャナミラー及び
Ｙスキャナミラーをそれぞれ所定の振れ角で振ると、対
物レンズ側の瞳３２におけるレーザ光強度分布の中心位
置が動いてしまうという問題があった。その結果、取得
画像において、明るい所と暗い所（輝度ムラ）ができて
しまうという問題があった。

【００１４】図８は、取得画像における輝度分布の一例
を示している。図８（Ａ）は走査ユニット１６で試料２
２を走査したときに得られる取得画像領域４１を示して
いる。図８（Ａ）において、横軸はＸ軸方向を、縦軸は
Ｙ軸方向を示している。取得画像領域４１は、複数のピ
クセル４２から構成されている。

【００１５】図８（Ｂ）は、取得画像領域４１における
Ｘ軸方向の輝度分布曲線４３を示している。図８（Ｂ）
において、横軸はＸ軸方向を示しており、縦軸は画像を
構成するピクセルの輝度値を示している。輝度分布曲線
４３から分かるように、Ｘ軸方向に関して、取得画像領
域４１の中心付近はピクセルの輝度値が大きく、取得画
像領域４１の両端付近は輝度値が小さくなっている。即
ち、取得画像領域４１の中心付近は明るく、取得画像領
域４１の両端付近は暗くなっている。

【００１６】図８（Ｃ）は、取得画像領域４１における
Ｙ軸方向の輝度分布曲線４６を示している。図８（Ｃ）
において、縦軸はＹ軸方向を示しており、横軸は画像を
構成するピクセルの輝度値を示している。図８（Ｂ）で
説明したのと同様に、Ｙ軸方向に関して、取得画像領域
４１の中心付近はピクセルの輝度値が大きく、取得画像
領域４１の両端付近はピクセルの輝度値が小さくなって
いる。

【００１７】そこで、上記取得画像における輝度ムラの
問題を解決するため、従来の反射型コンフォーカル顕微
鏡１０では、第１の方法として、輝度ムラが比較的少な
い画像の中心付近のみを抽出し、表示していた。

【００１８】また、第２の方法として、本画像を取得す
る前に、予め既知の一様な輝度分布を持つ参照試料を用
いて参照画像を取得し、取得した参照画像の輝度値から
補正量を算出し、本画像に補正をかけていた。

【００１９】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記第
１の方法では、輝度ムラが比較的少ない画像の中心付近
のみを抽出し表示しているため、所望の倍率での画角が
小さくなるという課題があった。その結果、観察者が試
料全体を観察することができないという課題があった。

【００２０】また、上記第２の方法では、一様な輝度分
布を持つ参照試料を入手することが困難なため、正確に
輝度ムラを補正することができないという課題があっ
た。

【００２１】そこで、本発明の目的は、近接瞳方式を用
いたコンフォーカル顕微鏡において、画角を小さくする
ことなく、正確に輝度ムラを補正することができるよう
にしたコンフォーカル顕微鏡を提供することにある。

【００２２】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに、本発明の一つの側面は、試料を走査するスキャナ
ミラーの近傍に瞳が位置する近接瞳方式を用いたコンフ
ォーカル顕微鏡において、光線追跡により求められた対
物レンズ側の瞳におけるレーザ光強度分布の位置に応じ
て予め求められる各走査位置での画像の輝度値の補正値
を格納する格納手段と、前記補正値に従って、取得した
画像に補正をかける補正手段とを有することを特徴とす
る。

【００２３】上記の発明によれば、光線追跡により求め
られた対物レンズ側の瞳におけるレーザ光強度分布の位
置に応じて予め求められる各走査位置での画像の輝度値
の補正値に従って、取得した画像に補正をかけるように
したので、画角を小さくすることなく、正確に輝度ムラ
を補正することができる。

【００２４】

【発明の実施の形態】以下、図面を参照して本発明の実
施の形態例を説明する。しかしながら、かかる実施の形
態例が、本発明の技術的範囲を限定するものではない。

【００２５】図１は、本発明を適用した反射型コンフォ
ーカル顕微鏡１の一実施の形態の構成を示すブロック図
である。図１において、従来と異なり、本発明の特徴と
なるのは、予め取得画像を構成するピクセルの輝度ムラ
補正値を求めてROM２８に記憶させ、CPU２７がROM２８
に格納されている輝度ムラ補正値に従って、取得画像に
補正をかけるようにしたことにある。

【００２６】ここで、ROM２８に記憶させる輝度ムラ補
正値は、光線追跡により求められた対物レンズ側の瞳に
おけるレーザ光強度分布の位置に応じて予め求められ
る。

【００２７】図１の反射型コンフォーカル顕微鏡１にお
いて、上記CPU２７及びROM２８以外の構成については、
図７に示した従来の反射型コンフォーカル顕微鏡１０と
同じであるので説明は省略する。

【００２８】次に、走査ユニット１６が試料２２を走査
することにより得られる取得画像領域４１について、図
２を参照して説明する。図２（Ｃ）は、走査ユニット１
６が試料２２を走査することにより得られる取得画像領
域４１を示している。図２（Ｃ）において、横軸はＸ軸
方向を示しており、縦軸はＹ軸方向を示している。図２
（Ｃ）の例では、取得画像領域４１は、Ｘ軸方向及びＹ
軸方向それぞれ５１２ピクセルずつから構成されてい
る。

【００２９】図２（Ａ）は、CPU２７がA/D変換器２６か
らピクセルの輝度データを受け取るときのＸ軸方向のサ
ンプリングクロックを示しており、図２（Ｂ）は、その
ときのＹ軸方向のサンプリングクロックを示している。
Ｘ軸方向及びＹ軸方向のサンプリングクロックは、試料
２２上の走査位置に対応している。

【００３０】CPU２７は、Ｘ軸方向及びＹ軸方向それぞ
れ図２（Ａ）及び（Ｂ）のタイミングでピクセルの輝度
データを受け取り、画像を構成するピクセルの輝度値と
する。このとき、取得した画像において、図８で示した
通り、輝度ムラが発生している。即ち、取得画像の中心
付近は明るく、取得画像の両端付近は暗くなっている。
このような輝度ムラをなくすため、取得画像を構成する
ピクセルの輝度値を補正する必要がある。

【００３１】次に、CPU２７が取得画像を構成するピク
セルの輝度値を補正するときの処理動作について、図３
のフローチャートを参照しながら説明する。

【００３２】先ず、CPU２７は、A/D変換器２６から所定
のサンプリングクロックで画像を構成するピクセルの輝
度データを受け取る（ステップＳ１）。次に、CPU２７
は、ROM２８から各ピクセルの輝度ムラ補正値を読み出
す（ステップＳ２）。尚、各ピクセルの輝度ムラ補正値
は、予めROM２８に格納されており、輝度ムラ補正値の
求め方については後述する。

【００３３】図４は、取得画像における補正前と補正後
の輝度分布を示している。図４（Ａ）は走査ユニット１
６で試料２２を走査したときに得られる取得画像領域４
１を示している。図４（Ａ）において、横軸はＸ軸方向
を、縦軸はＹ軸方向を示している。取得画像領域４１
は、複数のピクセル４２から構成されている。図４
（Ｂ）は、Ｘ軸方向における補正前の輝度分布曲線４３
と補正後の輝度分布曲線４５を示している。図４（Ｃ）
は、Ｙ軸方向における補正前の輝度分布曲線４６と補正
後の輝度分布曲線４８を示している。

【００３４】図４の例からも分かるように、輝度ムラ補
正値４４及び４７に従って、各ピクセルの輝度データを
補正することにより、取得画像における輝度分布を一様
にすることができる。即ち、取得画像における輝度ムラ
をなくすことができる。

【００３５】図３のフローチャートに戻り、CPU２７
は、ROM２８から読み出した輝度ムラ補正値４４及び４
７に従って、各ピクセルの輝度データを補正する（ステ
ップＳ３）。補正が終了すると、CPU２７は、補正後の
各ピクセルの輝度データを、１フレーム毎にフレームメ
モリ２９に格納（ステップＳ４）し、補正後の画像をデ
ィスプレイ３０に表示させる（ステップＳ５）。また、
必要に応じて、補正後の画像を画像記憶部３１に記憶さ
せ、処理動作は終了される。

【００３６】このように、予めROM２８に格納されてい
る各ピクセルの輝度ムラ補正値に従って、取得した画像
に補正をかけるようにしたので、画角を小さくすること
なく、正確に輝度ムラを補正することができる。

【００３７】次に、ROM２８に格納される各ピクセルの
輝度ムラ補正値の求め方について、図５及び図６を参照
しながら説明する。ここでは、光線追跡を利用した輝度
ムラ補正値の求め方について説明する。

【００３８】図５は、走査ユニット１６の内部の構成例
を示している。図６は、対物レンズ側の瞳３２における
レーザ光強度分布を示している。図５に示すように、走
査ユニット１６は、試料２２上をＸ方向及びＹ方向に２
次元的に走査する２つのガルバノメータスキャナミラー
（Ｘスキャナミラー５１及びＹスキャナミラー５２）か
ら構成されている。

【００３９】前述したように、図５において、走査ユニ
ット１６をコンパクトにする目的から、スキャナミラー
側の瞳５４と対物レンズ側の瞳３２とは共役な位置に配
置されていない。このため、走査ユニット１６内のＸス
キャナミラー５１及びＹスキャナミラー５２をそれぞれ
所定の振れ角で振ると、図６に示される通り、対物レン
ズ側の瞳３２におけるレーザ光強度分布曲線６１の中心
位置が動いてしまう。その結果、取得画像において、明
るい所と暗い所ができ、輝度ムラが発生する。

【００４０】図５において、Ｘスキャナミラー５１とス
キャナミラー側の瞳５４との距離をＬ_x，Ｘスキャナミ
ラー５１の振れ角を±θ_x，光学系の拡大率をＭとする
と、一般に、対物レンズ側の瞳３２におけるレーザ光強
度分布の中心位置は±ＭＬ_xtanθ_xだけ動くことが知ら
れている。

【００４１】同様に、図５において、Ｙスキャナミラー
５２とスキャナミラー側の瞳５４との距離をＬ_y，Ｙス
キャナミラー５２の振れ角を±θ_y，光学系の拡大率を
Ｍとすると、対物レンズ側の瞳３２におけるレーザ光強
度分布の中心位置は±ＭＬ_ytanθ_yだけ動くことが知ら
れている。

【００４２】上記Ｘスキャナミラー５１の振れによるレ
ーザ光強度分布の中心位置の動き±ＭＬ_xtanθ_xと、Ｙ
スキャナミラー５２の振れによるレーザ光強度分布の中
心位置の動き±ＭＬ_ytanθ_yとを考慮した光線追跡によ
り、対物レンズ側の瞳３２におけるレーザ光強度分布の
位置を求め、それから光線の蹴られを計算する。そし
て、光線の蹴られから各ピクセルの輝度ムラ補正値を算
出する。このようにして算出された各ピクセルの輝度ム
ラ補正値はROM２８に格納され、CPU２７によって取得画
像に補正をかけるときに読み出される。

【００４３】尚、本発明の保護範囲は、上記の実施の形
態に限定されず、特許請求の範囲に記載された発明とそ
の均等物に及ぶものである。

【００４４】

【発明の効果】以上の如く、本発明によれば、取得画像
を構成する各ピクセルの輝度の補正値に従って、取得し
た画像に補正をかけるようにしたので、画角を小さくす
ることなく、正確に輝度ムラを補正することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明を適用した反射型コンフォーカル顕微鏡
１の一実施の形態の構成を示すブロック図である。

【図２】図１のCPU２７が輝度データを受け取る時のサ
ンプリングクロックを説明するための図である。

【図３】補正をかけるときのCPU２７の処理動作を説明
するためのフローチャートである。

【図４】取得画像における補正前と補正後の輝度分布を
説明するための図である。

【図５】輝度ムラ補正値の求め方を説明するための図で
ある。

【図６】対物レンズ側の瞳３２におけるレーザ光強度分
布の中心位置の動きを説明するためのイメージ図であ
る。

【図７】従来の反射型コンフォーカル顕微鏡１０の一例
を示す図である。

【図８】取得画像における補正前の輝度分布を説明する
ための図である。

【符号の説明】

１ 反射型コンフォーカル顕微鏡 １１ レーザ光源 １２ NDフィルタ １３，１９ 全反射ミラー １４ ビームエキスパンダ １５ 偏光ビームスプリッタ １６ 走査ユニット １７ リレーレンズ １８ 第２対物レンズ ２０ λ／４板 ２１ 対物レンズ ２２ 試料 ２３ 集光レンズ ２４ コンフォーカルピンホール ２５ 光検出器 ２６ A/D変換器 ２７ CPU ２８ ROM ２９ フレームメモリ ３０ ディスプレイ ３１ 画像記憶部 ３２ 対物レンズ側の瞳 ５１ Ｘスキャナミラー ５２ Ｙスキャナミラー ５４ スキャナミラー側の瞳

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料を走査するスキャナミラーの近傍に
   瞳が位置する近接瞳方式を用いたコンフォーカル顕微鏡
   において、 光線追跡により求められた対物レンズ側の瞳におけるレ
   ーザ光強度分布の位置に応じて予め求められる各走査位
   置での画像の輝度値の補正値を格納する格納手段と、 前記補正値に従って、取得した画像に補正をかける補正
   手段とを有することを特徴とするコンフォーカル顕微
   鏡。
2. 【請求項２】 試料を走査するスキャナミラーの近傍に
   瞳が位置する近接瞳方式を用いたコンフォーカル顕微鏡
   の画像処理方法において、 光線追跡により求められた対物レンズ側の瞳におけるレ
   ーザ光強度分布の位置に応じて予め求められる各走査位
   置での画像の輝度値の補正値に従って、取得した画像に
   補正をかける補正工程を有することを特徴とする画像処
   理方法。