JP2001141729A - 免疫分析用有機−無機複合微粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗原抗体反応を利用する免疫分析において、
簡便、高定量性、高感度な分析を可能にする。 【解決手段】 無機コア部および有機被覆部から成り、
無機コア部が定量的に検出可能な物理量を発現する機能
を有する物質を担持しており、該物理量を粒子外部から
検出できることに特徴付けられる免疫分析用有機−無機
複合微粒子、その製法、抗体もしくは抗原を結合させた
該微粒子、および該微粒子を用いる免疫分析方法を提供
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗原抗体反応を応
用した微量物質の定量や観察に有用な、免疫分析用微粒
子、その製法および該粒子を用いた免疫分析方法を提供
する。

【０００２】

【従来の技術】生体内では非常に微量で生理活性を発現
する物質が多種存在し、臨床検査や診断においては、こ
の微量生理活性物質の種類、量を正確に把握することが
重要である。また、近年ダイオキシンやＰＣＢなど環境
下における微量汚染物質が問題となっており、環境中の
微量汚染物質の種類や量を正確に把握することもやはり
重要である。このような微量物質を測定する手法とし
て、きわめて特異的な反応である抗原−抗体反応を利用
した免疫分析がある。

【０００３】免疫分析には様々な方法が知られている
が、最も一般的なのは、酵素免疫分析法(以下ＥＩＡ
法）である。これは測定対象物質を抗原とする、これに
特異的な抗体に酵素を結合させた標識抗体を用いた抗原
−抗体反応を行い、抗原と結合したあるいは結合しない
抗体量を酵素活性を標識として測定する方法である。ま
たは、抗原に酵素を結合させた標識抗原を用いて抗原−
抗体反応を行い、抗体と結合した、あるいは結合しない
抗原量を測定する場合もある。ＥＩＡ法については日本
生化学会編「新生化学実験講座１２ 分子免疫学III
−抗原・抗体・補体−(１９９２年２月５日）東京化学
同人、p８８、石川榮治著「超高感度酵素免疫測定法」
(１９９３年１２月１９日)学会出版センターｐ４１など
に記載がある。

【０００４】かかる免疫分析法において抗体または抗原
を標識する方法としては、上記酵素のほか、放射性同位
元素、蛍光物質などが一般的である。放射性同位元素に
より標識した抗体または抗原を用いるラジオイムノアッ
セイ法（以下ＲＩＡ）については、日本生化学会編「新
生化学実験講座１２ 分子免疫学III −抗原・抗体・
補体−(１９９２年２月５日）東京化学同人、p７９に記
載されている。また、蛍光物質を共有結合的に結合させ
た標識抗体を用いて抗原−抗体反応を行い、抗原を検出
する蛍光抗体法（以下ＦＡ法）については日本生化学会
編「新生化学実験講座１２ 分子免疫学III −抗原・
抗体・補体−(１９９２年２月５日）東京化学同人、p１
０７に記載されている。また、上記のごとき方法におい
て、標識する放射性同位元素、蛍光物質、色素等をラテ
ックス粒子に封入したものを抗体または抗原に結合させ
て用いる方法も知られている。

【０００５】

【従来技術の問題点】しかしながら、ＥＩＡ法では抗体
または抗原を酵素で標識し、その酵素活性を測定するた
め、標識したものを直接測定するわけではない。即ち、
酵素に何らかの反応を惹起し、該反応によって生成する
物質により発現される物理量を測定することによって、
結合した標識抗体もしくは抗原量を測ることになる。従
って測定までに長い時間がかかり、反応条件の管理が煩
雑である、安定した定量性が無い、感度が低いという問
題点がある。

【０００６】一方、ＦＡ法ではイソチオシアネート基な
どの反応性の官能基を有する蛍光物質を抗体のアミノ基
などの官能基と反応させることにより、共有結合的に抗
体を修飾するものであるので、抗体一分子当たり蛍光物
質を数個しか結合させることができず、顕微鏡下での組
織観察には用いられていたものの、定量的な免疫分析に
用いるには蛍光強度が不十分であった。また、ラテック
ス粒子は粒径が数十ナノメートル以上の比較的大きな粒
子であり、検査溶液は外観上も濁った懸濁液となり、微
細な環境下での定量測定に好適であるとは言いがたい。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡便に、定
量性良く、高感度に微量物質を免疫分析することのでき
る免疫分析を可能とする、免疫分析用微粒子を提供する
ことを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は上記問題を解決
し、簡便に、定量性良く、高感度で微量物質を免疫分析
することのできる汎用性の高い測定用材料を開発するこ
とに成功し、本発明を完成させた。

【０００９】即ち本発明は、定量的に検出可能な物理量
を発現する機能を有する物質を担持する無機コア部およ
び有機被覆部から成り、該物理量が粒子外部から検出で
きることに特徴付けられる、免疫分析用有機−無機複合
微粒子を提供する。

【００１０】なお、本発明において「免疫分析」は、抗
原抗体反応を利用する生化学的分析であり、定量測定、
組織染色、細胞染色等のあらゆる分析を含む。また、
「免疫分析用微粒子」とは、抗体、または抗原を標識す
るためにこれらに結合させて、免疫分析に使用するため
の微粒子をいう。また物理量を「粒子外部から検出でき
る」とは、免疫分析用微粒子を破壊することなく、ある
いは検出可能な物理量を発現する能力を有する物質を測
定系に抽出などすることなく、粒子に担持されたままの
状態で測定することができることをいう。

【００１１】本発明はまた、該免疫分析用有機−無機複
合微粒子へ抗体もしくは抗原を結合させた、抗体もしく
は抗原結合免疫分析用有機−無機複合微粒子も提供す
る。

【００１２】本発明はさらに、本発明の抗体または抗原
結合免疫分析用微粒子を用いて免疫分析を行うことを特
徴とする免疫分析方法を提供する。

【００１３】本発明の免疫分析用微粒子は、無機物の塩
の溶液へ、定量的に検出可能な物理量を発現する機能を
有する物質を添加する；得られる混合物へ攪拌下でアル
カリ性水溶液を添加する；得られる無機物イオンゾル
に、陰イオン性有機界面活性剤を添加する；および析出
する微粒子を分取する工程を含む方法にて調製すること
ができる。本願発明にはかかる免疫分析用有機−無機複
合微粒子調製方法および該方法で調製された微粒子もま
た、含まれる。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明において、検出可能な物理
量を発現する能力を有する物質（以下、機能性物質とす
る）は、色素、蛍光、放射性標識等の生化学の分野で一
般的に測定のための標識として使用されるいかなる物質
でもよく、特に限定されない。例えばアゾ顔料、フタロ
シアニン顔料、アントラキノン顔料、キナクリドン顔
料、イソインドリノン顔料、イソインドリン顔料、ジオ
キサジン顔料、ペリレン顔料、ペリノン顔料、チオイン
ジゴ顔料、キノフタロン顔料、金属錯体顔料などの顔料
色素；アゾ染料、アントラキノン染料、インジゴイド染
料、トリフェニルメタン染料、ピラゾロン染料、スチル
ベン染料、ジフェニルメタン染料、キサンテン染料、ア
リザリン染料、アクリジン染料、アジン染料、オキサジ
ン染料、チアジン染料、チアゾール染料、ニトロ染料な
どの染料色素；ローダミン類、フルオレセイン類、アク
リジン誘導体、クマリン誘導体、アミノナフタレンスル
ホン酸誘導体、アントラセン誘導体、フェナントレン誘
導体、ベンゾジアゾール誘導体、ウンベリフェロン誘導
体、4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセ
ン誘導体などの蛍光剤；および¹⁴Ｃ、³Ｈ、³²Ｐ、
³⁵Ｓ、⁵⁹Ｆｅなどの放射性同位元素が例示される。

【００１５】本発明の免疫分析用有機−無機複合微粒子
は、機能性物質を担持した無機コア部と有機被覆部から
成る。本発明の複合微粒子は機能性物質を担持させなけ
れば実質的に透明である。従って、機能性物質を担持さ
せた場合には、その発現する物理量の測定を、該機能性
物質が粒子内に担持された状態のままで行うことができ
る。

【００１６】有機被覆部は、有機界面活性剤が無機コア
部の周りを取り囲むことによって、形成されている。本
発明の複合微粒子は、この有機被覆部の種類を適宜選択
することによって、分析に使用する溶媒への分散性、溶
解性を調節することができる。

【００１７】本発明の複合微粒子の粒径は、特に限定さ
れないが直径１ナノメートルから１００ナノメートル、
より好ましくは２ナノメートルから２０ナノメートルと
することができる。従来の免疫分析用ラテックス粒子が
数十ナノメートル以上の粒径を有するのに対し、本発明
の複合微粒子は所望により非常に小さな粒径とすること
ができ、分析溶媒への良好な分散性を達成することがで
きる。

【００１８】本発明の免疫分析用有機−無機複合微粒子
の無機コア部材料としては、特に限定されないが酸化チ
タン、アルミナ、シリカ、酸化鉄、およびこれらの混合
物が好適に用いられる。有機被覆部材料としても、限定
されないが、後述する界面活性剤がいずれも好適に用い
られる。

【００１９】本発明の粒子において、機能性物質の担持
量は、その種類、要求される測定感度に応じて決定すれ
ばよい。本発明の有機−無機複合微粒子には所望により
比較的多量の機能性物質を担持させることが可能であ
る。典型的には機能性物質を微粒子重量に対して１〜２
０重量％、より好ましくは５〜１０重量％担持させる
が、かかる量に限定されるわけではない。小粒径の微粒
子に機能性物質を所望により多量に担持させることがで
きるため、従来感度が低くて定量測定に向かないとされ
てきた蛍光剤も、定量的な免疫測定の標識として用いる
ことが可能でなる。

【００２０】本発明の機能性物質を担持した免疫分析用
有機−無機複合微粒子は、無機物の塩の溶液へ、定量的
に検出可能な物理量を発現する機能を有する物質を添加
する；得られる混合物へ攪拌下でアルカリ性水溶液を添
加する；得られる無機物イオンゾルに、陰イオン性有機
界面活性剤を添加する；および析出する微粒子を分取す
る工程を含む方法で調製することができる。

【００２１】上記方法において、無機物の塩を形成する
無機物としては特に限定されないが、チタン、アルミニ
ウム、鉄などが金属が例示される。またケイ素などの金
属以外の無機物も好適に用いられる。これらの無機物
は、単独で用いても、２種類以上を適宜組み合わせて用
いてもよい。

【００２２】無機物の塩としては、ハロゲン化物、硫酸
塩、硝酸塩、酢酸塩などの無機塩、および酢酸塩、アル
コキシドなどの有機塩が例示されるが、これらに限定さ
れない。無機物の塩および定量的に検出可能な物理量を
発現する機能を有する物質の溶媒としては、水、メタノ
ール、エタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジ
オキサン、１,２−ジメトキシエタンなどが例示され、
特に水が好適に用いられるが、これらに限定されない。
これらの溶媒は単独で用いても２種類以上を適宜組み合
わせて用いてもよい。

【００２３】アルカリ性水溶液としては、炭酸ナトリウ
ム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリ
ウム、水酸化カリウム、酢酸ナトリウムの水溶液が例示
されるが、これらに限定されない。アルカリ性水溶液添
加後の反応液のｐＨは４から１０とするのが好ましい
が、この範囲に限定されない。

【００２４】アルカリ性水溶液添加後の反応液中の無機
物の塩の濃度は、１〜２０重量％、特に５〜１０重量％
とするのが好ましい。

【００２５】微粒子を調製する際に共存させる機能性物
質は、上に例示したごとき機能性物質のいずれであって
もよい。機能性物質の量はその種類によって所望の測定
感度が得られるよう適宜選択すればよいが、例えば蛍光
剤の場合には反応液中０.０１から２０ｗ／ｖ％、より
好ましくは０.１〜５ｗ／ｖ％とすればよい。

【００２６】反応は、攪拌下で１０〜４０℃の温度にて
行えばよい。無機物の塩を機能性物質の存在下、アルカ
リ性条件で攪拌することにより、機能性物質を内包し、
無機物が酸素原子を介して会合した無機イオン微粒子ゾ
ルが形成される。

【００２７】次いでこの形成された無機イオンゾルに対
して、有機陰イオン性界面活性剤を添加する。有機陰イ
オン性界面活性剤としては特に限定されないが、オクタ
ン酸ナトリウム、デカン酸ナトリウム、ドデカン酸ナト
リウム、テトラデカン酸ナトリウム、ヘキサデカン酸ナ
トリウム、オクタデカン酸ナトリウムなどのカルボン酸
系界面活性剤；オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム、デシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベ
ンゼンスルホン酸ナトリウム、テトラデシルベンゼンス
ルホン酸ナトリウム、オクタンスルホン酸ナトリウム、
デカンスルホン酸ナトリウム、ドデカンスルホン酸ナト
リウム、テトラデカンスルホン酸ナトリウムなどのスル
ホン酸系界面活性剤；およびオクチル硫酸ナトリウム、
デシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、テト
ラデシル硫酸ナトリウムなどの硫酸エステル系界面活性
剤が例示される。

【００２８】界面活性剤は、反応液体積に対して０.０
１〜１０ｗ／ｖ％、好ましくは０.３〜５ｗ／ｖ％添加
する。界面活性剤を添加することによって、正荷電に帯
電している無機質ゾル粒子の周りを界面活性剤が覆い、
無機コア部と有機被覆部を有する有機−無機複合粒子が
水系の溶液から析出する。

【００２９】次いで析出した有機−無機複合微粒子を、
有機溶媒で水相から抽出する。抽出のための有機溶媒と
しては、トルエン、キシレン、ベンゼン、酢酸エチル、
エーテル、ジクロロメタン、クロロホルムが例示される
が、これらに限定されない。

【００３０】抽出した粒子は、必要に応じて乾燥する。
乾燥は、０〜６０℃、好ましくは２０〜３０℃の温度
で、１．３３〜１３３０Ｐａ、好ましくは１３．３〜１
３３Ｐａの減圧下で1〜24時間、好ましくは２〜5時間乾
燥する。こうして得られる有機−無機複合微粒子は、比
較的多量の機能性物質を粒子外部より定量的に測定可能
なように担持しており、本発明の免疫分析用有機−無機
複合微粒子として特に好適に用いることができる。

【００３１】上述の本発明の方法によって得られる本発
明の有機−無機複合微粒子は、粒度分布が非常にシャー
プであり、分級等の必要もない。微粒子の粒径は、調製
工程において無機物の塩の種類、無機物の塩の濃度、反
応液のｐＨ、界面活性剤の種類を変えることによって調
節することができる。

【００３２】本発明の免疫分析用有機−無機複合微粒子
には、抗体または抗原を結合させて使用する。抗体は被
検体を抗原として特異的に認識するものを適宜選択すれ
ばよい。被検体に特異的な抗体を得る方法は当業者によ
く知られており、例えば動物への免疫法やモノクローナ
ル抗体作製の通常の技術によって得ることができる。抗
体は分析の目的に応じてモノクローナル抗体であっても
ポリクローナル抗体であってもよい。また、被検体であ
る抗原と同一の抗原を、本発明の免疫分析用有機−無機
複合微粒子に結合させて、以下に述べるごとき競合的な
分析方法に用いてもよい。

【００３３】抗体または抗原を本発明の免疫分析用有機
−無機複合微粒子に結合させるには、従来技術の抗体、
抗原を固定化したり酵素で標識したりする方法のいずれ
を用いてもよい。具体的には例えばＥＩＡにおいて抗体
もしくは抗体を酵素標識するために確立されているグル
タルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリ
ジルジスルフィド法等が例示される。これらは、例えば
石川榮治著「超高感度酵素免疫測定法」(１９９３年１
２月１９日）学会出版センターｐ４１に記載されてい
る。

【００３４】１個の免疫分析用有機−無機複合微粒子に
対して結合させる抗体または抗原の数は、その力価、測
定の目的等に応じて適宜決定すればよいが、少なくとも
１個の微粒子に１個の抗体もしくは抗原が結合するよ
う、結合させる。

【００３５】こうして得られた抗体もしくは抗原結合免
疫分析用有機−無機複合微粒子は、従来の免疫分析方
法、例えばＥＩＡ、ＲＩＡやＦＡにおいて用いられる標
識抗体もしくは標識抗原に代えて用いることができる。
本発明の微粒子には、あらゆる種類の機能性物質を、比
較的多量に担持させることができ、また機能性物質の発
現する物理量は粒子外部から検出、測定することができ
る。従って、本発明の免疫分析用微粒子を用いることに
より、感度の高い定量測定が可能であり、また分析にあ
たって酵素反応等の煩雑で時間のかかる反応をする必要
がない、簡便な免疫測定が実現される。さらに免疫染色
法においても、従来使用されていた蛍光標識抗体等の標
識抗体の代わりに本発明の微粒子を用いれば、非常に高
い感度で、かつ検出が容易にできる態様にて組織もしく
は細胞染色を行うことが可能となる。

【００３６】本発明の抗体もしくは抗原結合免疫分析用
有機−無機複合微粒子を用いる免疫分析方法としては、
定量的免疫測定、免疫組織染色および免疫細胞染色など
が例示される。定量的免疫測定は大きく分けると非競合
法および競合法の2つに分類される。本発明の免疫分析
用有機−無機複合微粒子は、非競合法および競合法のい
ずれにも適用でき、さらに抗原、抗体いずれについて
も、標識のために用いることができ、かかる本発明の微
粒子を用いて標識した抗体もしくは抗原を用いる免疫分
析方法もまた、本発明の範囲である。競合法として代表
的なものとしては、固相化抗原法、固相化抗体競合法
が、非競合法としては、非競合二点結合法などが知られ
ている。以下、定量的免疫測定方法のいくつかを簡単に
説明する。

【００３７】ある方法においては、被検液を用いて測定
対象である抗原を担体上に固相化しておき、この抗原に
特異的な抗体を本発明の抗体結合免疫分析用有機−無機
複合微粒子を抗原抗体反応させる。抗原抗体反応により
固相化された、もしくは固相化されなかった本発明の微
粒子の量を測定し、これにより被検液の抗原量を計算す
る。

【００３８】または、測定対象である抗原を担体上に固
相化しておき、ここへ同じ抗原を含む被検液、およびこ
の抗原に特異的な抗体を結合させた本発明の抗体結合免
疫分析用有機−無機複合微粒子を含む被検液を同時に、
あるいは順次加え、抗原抗体反応をさせる。抗原抗体反
応により固相化された、もしくは固相化されなかった本
発明の微粒子の量を測定し、これより被検液中の抗原量
を計算する。

【００３９】別の方法においては、測定対象である抗原
に特異的な抗体を担体に固定化させておき、ここへ測定
対象である抗原を含む被検液を加え、抗原抗体反応によ
り抗原を固相化させる。次いで、該抗原に特異的な抗体
を結合させた本発明の抗体結合免疫分析用有機−無機複
合微粒子を作用させる。なお、本発明の該微粒子は、被
検液添加時に同時に加えてもよい。抗原抗体反応により
固相化された、もしくは固相化されなかった微粒子の量
を測定し、これより被検液中の抗原量を計算する。

【００４０】さらに別の方法においては、測定対象であ
る抗原に特異的な抗体を担体に固相化しておき、ここへ
測定対象である抗原を含む被検液、および同抗原を結合
させた本発明の抗原結合免疫分析用有機−無機複合微粒
子を含む被検液を同時あるいは順次加えて、抗原抗体反
応させる。抗原抗体反応で固相化された、もしくは固相
化されなかった微粒子の量を測定し、これより被検液の
抗原量を計算する。

【００４１】本発明の抗体結合免疫分析用有機−無機複
合微粒子を用いる免疫組織／細胞染色方法においては、
例えば被検体が存在する可能性のある組織切片や細胞等
へ本発明の抗体結合微粒子を接触させ、次いで機能性物
質が発現する物理量を検出すればよい。

【００４２】上記各方法において、担体、緩衝液、反応
温度、抗原、抗体の濃度等の各種条件は、従来用いられ
ている条件をもとに、当業者であれば容易に最適化する
ことができる。また、物理量の検出手段は、用いた機能
性物質の種類に応じて適宜選択すればよい。

【００４３】上記各方法を改変した各種免疫分析方法、
および上記方法に限らず、現在知られている、または将
来開発されるいずれの免疫分析方法においても、本発明
の免疫分析用有機−無機複合微粒子は、抗原または抗体
の標識のために用いることができ、かかる方法もまた本
発明の範囲内である。

【００４４】本発明の免疫分析方法は、従来から免疫分
析方法により行われていた各種物質の分析、例えばこれ
らに限定されないが、大腸菌等のバクテリアの分析、ウ
イルス分析、サイトカイン類等の生理活性物質の分析の
ために用いることができる。

【００４５】

【実施例】以下実施例を挙げて本願をさらに詳しく説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。 （１）機能性物質を担持させた有機−無機複合微粒子の
調製 可溶性酢酸アルミニウム１０％水溶液１００ｇと蛍光物
質ローダミン６ＧＸの１％水溶液５０ｇとを混合し、室
温で攪拌しながら炭酸ナトリウム１０％水溶液８ｇを加
えた。さらに室温で攪拌しながらこの混合液に１２−ア
ミノドデカン酸ナトリウムの２.５％水溶液２ｇと、ド
デシルベンゼンスルホン酸ナトリウムの１０％水溶液１
０ｇを加えた。反応液を、トルエン１００ｍＬで抽出
し、抽出液を水で洗浄した。得られたトルエン相を減圧
濃縮し、次いで室温で真空乾燥して微粒子を０.８ｇ得
た。得られた微粒子の平均粒径は約15ナノメートルであ
り、図１に示すごとく、非常にシャープな粒度分布を示
した。

【００４６】上記操作において、水相中のローダミン６
ＧＸ，即ち、有機−無機複合微粒子に含有されなかった
ローダミン６ＧＸを定量することによって、微粒子中の
ローダミン量を測定した。この結果、ローダミン６ＧＸ
の微粒子への含有量は１０重量％であると算出された。

【００４７】（２）有機−無機複合微粒子の蛍光測定 （１）で合成したローダミン６ＧＸを１０重量％担持さ
せた有機−無機複合微粒子を、ローダミン濃度としてそ
れぞれ１.０４×１０^-5ｍｏｌ／Ｌ、１.０４×１０^-6ｍ
ｏｌ／Ｌ、１.０４×１０^-7ｍｏｌ／Ｌとなるよう、メ
タノールに分散させた。また、ローダミンそのものにつ
いても濃度がそれぞれ、１.０４×１０^{- 5}ｍｏｌ／Ｌ、
１.０４×１０^-6ｍｏｌ／Ｌ、１.０４×１０^-7ｍｏｌ／
Ｌとなるよう、メタノールに溶解させた。各溶液の蛍光
波長５５５ｎｍにおける蛍光強度を測定し、結果を表１
および図２に示した。微粒子に担持させたローダミン６
ＧＸは、ローダミン６ＧＸ単独の場合とほぼ同程度の蛍
光強度を示した。また、単独の場合と同様の濃度依存的
な蛍光強度の変化を示した。

【００４８】

【表１】

【００４９】（３）機能性物質担持微粒子と抗体の結合 （３）−１ マレイミド化有機−無機複合微粒子の調製 実施例（１）で合成したローダミン６ＧＸ担持有機−無
機複合微粒子２ｍｇを０.１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウ
ム緩衝液(ｐＨ７.０)０.５ｍＬに分散させ、５ｗ／ｖ％
６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジルＤＭＦ
溶液０.０６ｍＬを加えて３０℃で１時間静置した。反
応液の沈殿を遠心除去した後、セファデックスG-２５カ
ラム（１×３０ｃｍ）を用い、０.１ｍｏｌ／Ｌリン酸
ナトリウム緩衝液(ｐＨ６.０）、流速０.４〜０.６ｍＬ
/分で、１画分０.５から１.０ｍＬにてゲル濾過した。
ローダミン６ＧＸを含有する画分を目視および５５５ｎ
ｍの蛍光で確認し、３０００ｇ遠心分離により濃縮し
た。

【００５０】（３）−２ 抗体へのチオール基の導入 抗ｈＧＨ（ヒト成長ホルモン）ＩｇＧ５ｍｇを０.１ｍ
ｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７.５)０.５m
に溶解し、３ｗ／ｖ％Ｓ−アセチルメルカプト無水コハ
ク酸ＤＭＦ溶液０.０２ｍＬ、１.０ｍｏｌ／Ｌトリス−
塩酸緩衝液(ｐＨ７.０)０.１ｍＬ，１.０ｍｏｌヒドロ
キシルアミン塩酸塩（ｐＨ７.０)０.１ｍＬを加えて３
０℃で５分間反応させた。

【００５１】反応液をセファデックスＧ−２５カラム
（１×３０ｃｍ)にロードし、０.１ｍｏｌ／Ｌのリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０、５.０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｅ
ＤＴＡ含有）により、流速０.５〜０.７ｍＬ／分、１画
分１.０ｍＬとしてゲル濾過した。チオール基を導入し
た抗ｈＧＨＩｇＧの画分を２８０ｎｍの吸光度で確認
し、４℃、３０００gの遠心分離により濃縮した。

【００５２】（３）−３ マレイミド化微粒子とチオー
ル基導入抗体との反応 （３）−２で調製したチオール基導入抗体ｈＧＨＩｇＧ
２.３ｍｇを０.１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６.０、５.０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ含有）０.２
５ｍＬに溶解し、（３）−１で調製したマレイミド化ロ
ーダミン６ＧＸ含有無機微粒子１.８ｍｇを０.１ｍｏｌ
／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６.０)に溶解したも
のを添加し、３０℃で２０時間反応させた。ウルトロゲ
ルＡｃＡ３４カラム(１.５×４５cm)−０.１ｍｏｌ／Ｌ
リン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６.５)、流速０.３５ｍＬ
/ｍｉｎ、１画分１.０ｍＬとしてゲル濾過した。ローダ
ミン６ＧＸ担持微粒子に抗体ｈＧＨＩｇＧが結合したも
のを含む画分を、２８０ｎｍの吸光度の測定、および目
視または５５５ｎｍの蛍光で確認し、当該画分を４℃、
３０００ｇで遠心分離して濃縮した。

【００５３】（４）抗体結合免疫分析用有機−無機複合
微粒子を用いた蛍光免疫分析 抗ｈＧＨＩｇＧ不溶化ポリスチレンボール(直径３.２m
m)を、０.２〜６.６７ｐｇ／ｍＬまでの濃度のｈＧＨ標
準資料０.１５ｍＬと３７℃で６時間、振とうしながら
反応させた。反応液を除去した後、ポリスチレンボール
を０.１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムおよび１g/Lウシ血清
アルブミンを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩
衝液(ｐＨ７.０)０.１５ｍＬと４℃で１７時間静置し
た。反応液を除去した後、ポリスチレンボールを０.１
ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌの
リン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.０)２ｍＬにて２回洗
浄した。ポリスチレンボールを０.１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナ
トリウムを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝
液(ｐＨ７.０)１ｍＬに浸し、蛍光波長５５５ｎｍにお
ける蛍光強度を測定した。結果を図３に示す。蛍光強度
はｈＧＨ濃度依存的に強くなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１で得られた複合微粒子の粒度分布を
示す図である。

【図２】 ローダミンを担持させた本発明の免疫分析用
有機−無機複合微粒子と、ローダミン単独の蛍光強度を
比較するグラフである。

【図３】 本発明の微粒子を用いて、蛍光免疫測定し
た、検体に対する得られた蛍光強度を示すグラフであ
る。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 無機コア部および有機被覆部から成り、
   無機コア部が定量的に検出可能な物理量を発現する機能
   を有する物質を担持しており、該物理量を粒子外部から
   検出できることに特徴付けられる免疫分析用有機−無機
   複合微粒子。
2. 【請求項２】 無機物の塩の溶液へ、定量的に検出可能
   な物理量を発現する機能を有する物質を添加する；得ら
   れる混合物へ攪拌下でアルカリ性水溶液を添加する；得
   られる無機物イオンゾルに、陰イオン性有機界面活性剤
   を添加する；および析出する微粒子を分取する工程を含
   む方法で調製される、免疫分析用有機−無機複合微粒
   子。
3. 【請求項３】 微粒子の平均粒径が１ｎｍ〜１００ｎｍ
   である、請求項１または２記載の微粒子。
4. 【請求項４】 定量的に検出可能な物理量を発現する機
   能を有する物質が色素である、請求項１から３いずれか
   に記載の微粒子。
5. 【請求項５】 定量的に検出可能な物理量を発現する機
   能を有する物質が蛍光剤である、請求項１から３いずれ
   かに記載の微粒子。
6. 【請求項６】 定量的に検出可能な物理量を発現する機
   能を有する物質が放射性同位元素である、請求項１から
   ３いずれかに記載の微粒子。
7. 【請求項７】 請求項１から６いずれかに記載の微粒子
   に抗体を結合させた、抗体結合免疫分析用有機−無機複
   合微粒子。
8. 【請求項８】 請求項７記載の抗体結合免疫分析用有機
   −無機複合微粒子を用いて免疫分析を行うことを特徴と
   する、免疫分析方法。
9. 【請求項９】 請求項１から６いずれかに記載の微粒子
   に抗原を結合させた、抗原結合免疫分析用有機−無機複
   合微粒子。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の抗原結合免疫分析用
    有機−無機複合微粒子を用いて免疫分析を行うことを特
    徴とする、免疫分析方法。
11. 【請求項１１】 無機物の塩の溶液へ、定量的に検出可
    能な物理量を発現する機能を有する物質を添加する；得
    られる混合物へ攪拌下でアルカリ性水溶液を添加する；
    得られる無機物イオンゾルに、陰イオン性有機界面活性
    剤を添加する；および析出する微粒子を分取する工程を
    含む、免疫分析用有機−無機複合微粒子の製造方法。