JP2001129082A - 補体の活性化の抑制方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血液中から手根管症候群の病因物質と考えら
れているβ₂−ミクログロブリンを吸着除去する吸着体
を用いた体外循環治療の際に、β₂−ミクログロブリン
吸着の高い選択性と吸着量を維持したうえで補体の活性
化を抑制する方法を提供する。 【解決手段】 多孔質水不溶性担体に炭素数４以上のア
ルキル基を有するリガンドを固定してなる体外循環治療
用β₂−ミクログロブリン吸着体において、該担体に対
するリガンド賦与量を担体１mlあたり８〜60μmolに調
整することにより、該吸着体と血液とが接触した際に起
こる、血中成分である補体の活性化を抑制する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、長期透析患者にみ
られる手根管症候群の病因物質と考えられているβ₂−
ミクログロブリンを吸着除去する吸着体を用いた体外循
環治療の際に、補体の活性化を抑制する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、長期にわたって人工透析をうけた患者に手根管症候
群と呼ばれる疾患が多発している。手根管症候群とは、
正中神経が手根管部で圧迫され、正中神経の麻痺症状を
呈する疾患である。かかる患者の患部にはアミロイド物
質と呼ばれるβ- フィブリル状の蛋白が沈着し、かかる
アミロイド物質に対応する前駆蛋白が、患者の血液中に
存在するアミノ酸からなる低分子量蛋白質であるβ₂−
ミクログロブリンであることが明らかにされている。

【０００３】そこでこれまでに、血液または血漿中の成
分をそのサイズに応じてある程度選択的に分離する膜を
用いることによってかかるβ₂−ミクログロブリンを分
離する試みがなされているが、β₂−ミクログロブリン
と同時に他の有用な蛋白質が除去されたり、β₂−ミク
ログロブリンの除去量が少ないなどの欠点があるため、
より選択的かつ効率よく大量にβ₂−ミクログロブリン
を除去しうる方法が望まれている。

【０００４】またβ₂−ミクログロブリンを除去する他
の方法としては、現在のところあまり試みられていない
が、たとえば抗β₂−ミクログロブリン抗体を担体に固
定した免疫吸着体を用いてβ₂−ミクログロブリンを吸
着除去する方法が考えられている。これらの吸着体はβ
₂−ミクログロブリンに対して高い選択性を示すが、抗
β₂−ミクログロブリン抗体などのリガンドは高価であ
り、また吸着体の保存安定性が悪く滅菌が困難であるな
どの欠点を有しており、治療用の吸着体としては実用的
ではない。

【０００５】さらにこれらの吸着体は血液あるいは血漿
成分と直接接触してβ₂−ミクログロブリンを血液ある
いは血漿中から吸着除去し、その後再び血液を患者体内
に戻すものであることから、他の有用な血中成分の吸着
以外に、白血球、血小板、補体などの活性化についても
考慮しなくてはならない。血中の成分は親水性の表面を
持つものには吸着しにくいといわれており、したがって
親水性の表面が有利である。また、白血球や血小板の活
性化についても親水性の表面が有利である。しかしなが
ら、親水性の硬質担体として血液あるいは血漿の体外循
環療法に最適なセルロース系の担体は補体系の活性化を
起こすことが知られている（ピー・ビー・シン（P. B.
Sin ）ら、バイオケミカル・ジャーナル（Biochem. J.
）、193巻、115 頁（1981年）参照）。

【０００６】補体は新鮮血清中に存在し、免疫複合体に
非特異的に反応する易熱性の因子で、第１成分、第２成
分…第９成分の９個の成分タンパク質からなる。各成分
は順に活性化されるが、第１成分から第５成分までの反
応ではポリペプチド鎖の切断が起こり、前駆体から活性
型へと変化する。このようにして生じたフラグメントの
中には、アナフィラトキシンといわれるＣ3aやＣ5aのよ
うに強い生物活性を持ったものがあるほか、補体の活性
化が手根管症候群の一因であるとの説もあることから、
補体の活性化はできるだけ避けなければならない。

【０００７】そこで本発明者らは、β₂−ミクログロブ
リンを大量に吸着除去でき、さらにβ₂−ミクログロブ
リンの吸着速度および吸着量が大きく、しかも吸着選択
性にすぐれる吸着体を用い、該吸着体と血液とを接触さ
せた際に起こる、血中成分、とくに補体の活性化を抑え
る方法をうるべく鋭意研究を重ねた結果、疎水性リガン
ドの量を一定範囲にして担体に固定することにより、β
₂−ミクログロブリンの吸着量および吸着速度、さらに
吸着選択性を高く保ちつつ、血中成分、とくに補体の活
性化を抑えることができる方法を見出だし、本発明を完
成するにいたった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は多孔
質水不溶性担体に炭素数４以上のアルキル基を有するリ
ガンドを固定してなる体外循環治療用β₂−ミクログロ
ブリン吸着体において、該担体に対するリガンド賦与量
を担体１mlあたり８〜60μmol に調整することにより、
該吸着体と血液とが接触した際に起こる、血中成分であ
る補体の活性化を大幅に抑制する方法に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明に用いられる体外循環治療
用β₂−ミクログロブリン吸着体は、多孔質水不溶性担
体に炭素数４以上のアルキル基を有するリガンドを固定
したものである。

【００１０】本発明に用いられる多孔質水不溶性担体と
しては、たとえばガラスビーズ、シリカゲルなどの無機
担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレー
ト、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの
合成高分子化合物や結晶性セルロース、架橋セルロー
ス、架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類か
らなる有機担体、さらにはこれらの組合せによってえら
れる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが代表
例としてあげられる。本発明に用いられる多孔質水不溶
性担体は親水性であっても疎水性であってもよいが、親
水性担体が非特異吸着が比較的少なくβ₂−ミクログロ
ブリンの吸着選択性が良好であるので好ましい。ここで
親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にした
ときの水との接触角が60度以下の担体をいう。このよう
な担体としてはたとえば、セルロース、セルロース誘導
体、架橋ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル
共重合体けん化物、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリ
アクリル酸、架橋ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸
メチル、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、
ガラスなどからなる担体が代表例としてあげられるが、
セルロースおよびセルロース誘導体は、 機械的強度が比較的大きく強靭であるため、撹拌など
の操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少
なく、カラムに充填したばあいに体液を高流速で流して
も圧密化や、目詰まりしないので高流速で流すことが可
能となり、また細孔構造が高圧蒸気滅菌などによって変
化を受けにくい 親水性であり、リガンドの結合に利用しうる水酸基が
多数存在し、非特異吸着も少ない 空孔容積を大きくしても比較的強度が大きいため軟質
ゲルに劣らない吸着容量がえられる 血液適合性が合成高分子に比べて高い などのすぐれた点を有しており、本発明に用いる最も適
した担体の１つである。

【００１１】前記セルロースとは、いわゆる天然セルロ
ースまたは再生セルロースのことであり、たとえば天然
セルロースには木綿繊維を脱脂したもの、麻類の繊維、
木材からリグニンやヘミセルロースなどを除去してえら
れるパルプ、該パルプをさらに精製してえられる精製セ
ルロースなどがその代表例としてあげられるが、これら
に限定されるものではない。なお前記再生セルロースと
は、セルロースをいったん成形しやすいセルロース誘導
体にして成形したのち、加水分解などによりセルロース
を再生させたセルロースのことである。

【００１２】また前記セルロース誘導体とは、たとえば
セルロースの水酸基の一部または全部がエステル化やエ
ーテル化などされたもの、セルロースの水酸基の一部が
エステル化され、一部がエーテル化されたものなど、セ
ルロースから誘導されたもののことである。

【００１３】前記セルロースの水酸基の一部または全部
がエステル化されたものの具体例としてはたとえば、酢
酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロー
ス、ニトロセルロース、硫酸セルロース、リン酸セルロ
ース、酢酸酪酸セルロース、硝酸セルロース、セルロー
スのジチオカルボン酸エステル（ビスコースレーヨン）
などがあげられるが、これらに限定されるものではな
い。

【００１４】前記セルロースの一部または全部がエーテ
ル化されたものの具体例としてはたとえば、メチルセル
ロース、エチルセルロース、ベンジルセルロース、トリ
エチルセルロース、シアンエチルセルロース、カルボキ
シメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、オ
キシエチルセルロースなどがあげられるが、これらに限
定されるものではない。

【００１５】前記セルロース系粒子を構成するセルロー
ス系材料の中では、精製セルロースが不純物が少なく、
溶解したときに未溶解物が少ないなどの点から好まし
く、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロースなどのセ
ルロースエステルが、多種の溶剤に溶解するため、粒子
製造時の種々の製造条件の選択範囲も広くなり、粒子の
分配係数やスキン層の厚さ、内部の網目状組織における
孔の大きさなどの調整が容易となり、所望のセルロース
系粒子を製造することができ、さらに加水分解すること
によって容易に再生セルロース粒子にすることもできる
などの点から一層好ましい。

【００１６】ところで、本発明に用いられる多孔質水不
溶性担体は硬質担体および軟質担体のいずれであっても
よいが、カラムに充填し、通液する際などに目詰まりを
生じないようにするためには充分な機械的強度が要求さ
れるので、硬質担体であることがより好ましい。ここで
いう硬質担体とは、たとえば粒状ゲルのばあい、ゲルを
円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流した際の圧
力損失ΔＰと流量の関係が0.3kg/cm²まで直線関係にあ
るものをいう。

【００１７】なお、吸着体の表面には、リガンドの固定
化反応に用いうる官能基が存在していると好都合であ
る。これらの官能基の代表例としてはたとえば、水酸
基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオー
ル基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロゲン
基、サクシニルイミド基、酸無水物基などがあげられ
る。

【００１８】本発明に用いられる多孔質水不溶性担体に
は、炭素数４以上のアルキル基を有するリガンドが固定
されるが、その固定化の方法としては公知の種々の方法
を特別な制限なしに用いることができる。しかしなが
ら、本発明において、吸着体は体外循環治療に供せられ
るため、滅菌時または治療時においてのリガンドの脱離
溶出を極力抑えることが安全上重要であり、そのために
は共有結合法により固定化することが最も好ましい。

【００１９】固定化の方法としてはたとえばつぎのよう
なものがあげられる。 1) 長鎖脂肪酸をエステル結合で導入する方法。 2) セルロースのアルコキシドにハロゲン化長鎖アルキ
ルを反応させエーテル結合で導入する方法。 3) エピクロロヒドリンで活性化したセルロースに長鎖
アルキルアミンを反応させ、アミノ結合で導入する方
法。

【００２０】本発明において炭素数４以上のアルキル基
を有するリガンドが用いられるのは、かかるリガンドを
用いたばあいにはβ₂−ミクログロブリンに対する吸着
能が大幅に向上するからである。炭素数４未満のアルキ
ル基を有するリガンドでは疎水性が小さくなり、満足し
うるβ₂−ミクログロブリンの吸着能が呈されなくな
る。

【００２１】前記アルキル基としては直鎖状、分岐鎖状
もしくは環状の脂肪族炭化水素のいずれであってもよ
く、これらは飽和炭化水素であっても１個以上の不飽和
結合を有するものであってもよい。

【００２２】該アルキル基の具体例としてはたとえば、
n-ブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基、n-オクチル
基、n-デシル基、n-ドデシル基、n-テトラデシル基、n-
ヘキサデシル基、n-オクタデシル基、i-ブチル基、シク
ロヘキシル基、オレイル基などがあげられ、これらの中
ではn-ドデシル基、n-テトラデシル基、n-ヘキサデシル
基、n-オクタデシル基が好ましく、さらにn-ヘキサデシ
ル基、n-オクタデシル基が最も好ましい。

【００２３】前記炭素数４以上のアルキル基を有するリ
ガンドの具体例としてはたとえば、前記のアルキル基を
有する飽和または不飽和炭化水素、アルコール、アミ
ン、チオール、カルボン酸およびその誘導体、ハロゲン
化物、アルデヒド、ヒドラジド、イソシアネート、グリ
シジルエーテルなどのオキシラン環含有化合物、ハロゲ
ン化シランなどがあげられるが、これら以外にもグリコ
ール類のモノアルキルエーテル、ジカルボン酸のモノア
ルキルエステルのごとき、化合物中のヘテロ原子に結合
したアルキル基を有する化合物を用いることができる。
なお、これらの化合物はそれぞれ単独で用いてもよく、
また任意の２種類以上を混合して用いてもよい。

【００２４】前記リガンドの多孔質水不溶性担体に対す
る賦与量は、多孔質水不溶性担体１mlあたり８〜60μmo
l 、とくに15〜35μmol の範囲内に調整することが好ま
しい。かかる賦与量が８μmol 未満であるばあい、β₂
−ミクログロブリンの吸着量が不充分であるばかりでな
く、血液との接触により補体の活性化が起こりＣ3a、Ｃ
5aが多量に発生する。そのため、かかる吸着体を利用し
て体外循環を行なうばあい、治療効果を向上せしめるた
めには多量の吸着体を使用しなければならず、体外循環
血液量または血漿量も増えるうえに補体の活性化による
アナフィラキシーショックの可能性も高くなる。また、
60μmol をこえるばあい、血小板の粘着および活性化が
起こりやすくなりカラム内での血液凝固の可能性が高く
なる。

【００２５】本発明において、吸着体を治療に用いるに
は種々の方法がある。最も簡便な方法としてはたとえ
ば、患者の血液を体外に導出して血液バッグに貯め、こ
れに前記吸着体を混合してβ₂−ミクログロブリンを除
去したのちフィルターを通して吸着体を除去し、血液を
患者に戻す方法などがある。この方法は複雑な装置を必
要としないので好ましい。他の方法は吸着体をカラムに
充填し、体外循環回路に組込み、オンラインで吸着除去
を行なうものである。処理方法には、全血を直接灌流す
る方法と血液から血漿を分離したのち、血漿をカラムに
通す方法とがあり、前記吸着体はいずれの方法にも用い
ることができるが、前記のごとくオンライン処理に最も
適している。

【００２６】

【実施例】つぎに、β₂−ミクログロブリン吸着体によ
る、本発明の補体の活性化の抑制方法を具体的な実施例
によりさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例
のみに限定されるものではない。

【００２７】実施例１ セルロース系多孔質硬質ゲル（数平均粒径 540μm で、
±５％以内にすべての粒子径が入っており、表面の孔に
入らない最小の大きさの分子量が16000) 170mlに水を加
えて全量を340ml としたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム90
mlを加えて40℃とした。これにエピクロルヒドリン31ml
を加え、40℃で撹拌下に２時間反応させた。反応終了
後、充分に水洗し、エポキシ化ゲルをえた。

【００２８】このエポキシ化ゲル10mlにリガンドとして
n-デシルアミン10mgを加え、エタノール中で室温で静置
下８時間反応させた。反応終了後、エタノールおよび水
で充分に洗浄し、n-デシルアミン固定化ゲルをえた。

【００２９】えられたゲルのリガンド賦与量を下記の方
法で測定したところ、ゲル１mlに対して8.4 μmol であ
った。

【００３０】（リガンド賦与量）結合したアミンを塩酸
でイオン交換し、水酸化ナトリウム水溶液で逆滴定する
ことにより求める。

【００３１】（β₂−ミクログロブリンおよびアルブミ
ンの吸着量）このゲル0.4ml にβ₂−ミクログロブリン
濃度65μg/mlの透析患者血清2.4mlを加え、37℃で２時
間インキュベートした。上澄み液中のβ₂−ミクログロ
ブリンおよびアルブミンの濃度を測定し、吸着体１mlあ
たりのβ₂−ミクログロブリンの吸着量を求めたとこ
ろ、158 μg/mlゲルであった。

【００３２】つぎにこの吸着体の血液適合性試験の方法
および結果について述べる。

【００３３】（補体の活性化）まずこのゲルの補体の活
性化の測定方法および結果について述べる。なお、ここ
ではアナフィラキシーショックの原因であるＣ3a、Ｃ5a
に着目して補体の活性化について評価を行なった。

【００３４】オートクレーブで滅菌後（121 ℃、20
分）、0.4ml のゲルをポリスチレン製の遠沈管中で５U/
mlのヘパリンを加えた生理食塩水で３回洗浄したのち、
新鮮な人血４mlを加え、37℃で30分間、36回/minの速度
で振盪し、その後活性化された補体のフラグメントであ
るＣ3a、Ｃ5aの血漿中の濃度を測定したところ、それぞ
れ2083ng/ml 、17.8ng/ml であった。

【００３５】ブランクとしてゲルを入れずに新鮮な人血
４mlだけを加えたばあい、Ｃ3a、Ｃ5aはそれぞれ727ng/
ml、11.3ng/ml であり、またリガンドをつけていない担
体で補体の活性化を調べたところ、Ｃ3a、Ｃ5aはそれぞ
れ5905ng/ml 、63.1ng/mlであった。このように、リガ
ンド量が８〜15μmol/mlゲルの吸着体ではＣ3 は多少活
性化されたが、Ｃ5 はあまり活性化されていない。

【００３６】（血小板透過率）つぎに血小板透過率の測
定方法と結果を示す。吸着体１mlを内径８mmのカラムに
詰め、７U/mlのヘパリンを加えた生理食塩水を100ml 流
したのち、血液を流速0.5ml/min で30分間流し、血小板
の透過率を測定したところ、80〜93％であった。

【００３７】またリガンドを導入していないゲルについ
ては、90〜98％であった。

【００３８】実施例２ 実施例１の反応時間を４時間とした以外は同じ方法で吸
着体の合成を行なった。えられた吸着体について、実施
例１と同様の実験を行なった結果を以下に示す。

【００３９】 リガンド賦与量：3.1 μmol/mlゲル 補体の活性化：Ｃ3a濃度 3570ng/ml Ｃ5a濃度 34.2ng/ml このように、リガンド賦与量が８μmol/mlゲル以下の吸
着体ではＣ3 、Ｃ5 ともかなり活性化されている。

【００４０】また、血小板透過率については、82〜95％
と実施例１の吸着体よりはよくなっている。

【００４１】実施例３ 実施例１の反応時間を36時間とし、加えたn-デシルアミ
ンの量を40mgとした以外は同じ方法で吸着体の合成を行
なった。えられた吸着体について、実施例１と同様の実
験を行なった結果を以下に示す。

【００４２】 リガンド賦与量：56.3μmol/mlゲル 補体の活性化：Ｃ3a濃度 758 ng/ml Ｃ5a濃度 10.9ng/ml このように補体の活性化はほとんど起こっていないが、
血小板透過率は48〜63％とかなり落ちていることがわか
る。

【００４３】実施例４ 実施例１の反応時間を24時間とし、加えたn-デシルアミ
ンの量を20mgとした以外は同じ方法で吸着体の合成を行
なった。えられた吸着体について、実施例１と同様の実
験を行なった結果を以下に示す。

【００４４】 リガンド賦与量：23.3μmol/mlゲル β₂−ミクログロブリン吸着量：360 μg/mlゲル アルブミン吸着量：４mg/ml ゲル 補体の活性化：Ｃ3a濃度 1102ng/ml Ｃ5a濃度 12.9ng/ml 血小板透過率：65〜80％

【００４５】実施例５ 実施例１の反応時間を24時間とし、加えたn-デシルアミ
ンの量を30mgとした以外は同じ方法で吸着体の合成を行
なった。えられた吸着体について、実施例１と同様の実
験を行なった結果を以下に示す。

【００４６】 リガンド賦与量：34.8μmol/mlゲル 補体の活性化：Ｃ3a濃度 830 ng/ml Ｃ5a濃度 11.5ng/ml 血小板透過率：58〜76％ このように、リガンド量が担体１mlあたり15〜35μmol
の範囲にあるとβ₂−ミクログロブリン吸着量、吸着選
択性、血液適合性のいずれもよいレベルにはいった。

【００４７】以上の結果を表１、表２にまとめる。

【００４８】

【表１】

【００４９】

【表２】

【００５０】以上のようにリガンド賦与量が８μmol/ml
以下のばあいは補体の活性化が無視できず、56μmol/ml
以上になると血小板の透過率が悪くなっていることか
ら、リガンド賦与量の範囲が決定した。

【００５１】参考例１ 実施例４のデシルアミンをエチルアミンにした以外は同
様の方法で合成した。えられた吸着体について、実施例
１と同様の実験を行なった結果を以下に示す。

【００５２】リガンド賦与量：33.4μmol/mlゲル β₂−ミクログロブリン吸着量：25μg/mlゲル このように、リガンドのアルキル鎖長が４以下であると
β₂−ミクログロブリンの吸着量が極端に少なくなって
しまう。

【００５３】実施例６ 実施例４のデシルアミンをヘキシルアミンにした以外は
同様の方法で合成を行なった。えられた吸着体につい
て、実施例１と同様の実験を行なった結果を以下に示
す。

【００５４】 リガンド賦与量：30.8μmol/mlゲル β₂−ミクログロブリン吸着量：138 μg/mlゲル 補体の活性化：Ｃ3a濃度 1350ng/ml Ｃ5a濃度 13.1ng/ml 血小板透過率：67〜82％

【００５５】実施例７ 実施例４のデシルアミンをヘキサデシルアミンにした以
外は同様の方法で合成を行なった。えられた吸着体につ
いて、実施例１と同様の実験を行なった結果を以下に示
す。

【００５６】 リガンド賦与量：21.5μmol/mlゲル β₂−ミクログロブリン吸着量：380 μg/mlゲル 補体の活性化：Ｃ3a濃度 1078ng/ml Ｃ5a濃度 12.6ng/ml 血小板透過率：66〜80％

【００５７】

【発明の効果】本発明の方法によれば、特定量の疎水性
リガンドを有する吸着体を血液と接触させるため、体外
循環治療にて血液中からβ₂−ミクログロブリンを該吸
着体にて吸着除去する際に、高い選択性と吸着量を維持
したうえで、補体の活性化を抑制することができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 多孔質水不溶性担体に炭素数４以上のア
   ルキル基を有するリガンドを固定してなる体外循環治療
   用β₂−ミクログロブリン吸着体において、該担体に対
   するリガンド賦与量を担体１mlあたり８〜60μmolに調
   整することにより、該吸着体と血液とが接触した際に起
   こる、血中成分である補体の活性化を抑制する方法。
2. 【請求項２】 多孔質水不溶性担体がセルロースまたは
   セルロース誘導体からなる請求項１記載の方法。