JPH0528151B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は体液に含有されるβ₂−ミクログロブリ
ン（以下、β₂−ｍという）を除去するための体外
循環治療用吸着体に関する。 ［従来の技術および発明が解決しようとする問題
点］ 近年、長期にわたつて人工透析を受けた患者に
手根管症候群と呼ばれる疾患が多発している。手
根管症候群とは正中神経が手根管部で圧迫され正
中神経の麻痺症状を呈する疾患であるが、最近こ
の患部にアミロイド物質と呼ばれるβ−フイブリ
ル状の蛋白が沈着していることが明らかになつ
た。さらにこのアミロイド物質に対応する前駆蛋
白が患者血液中に存在するβ₂−ｍであることが明
らかにされている。しかしながら、これまでのと
ころこの疾患に対する有効な治療法、とりわけ薬
物療法は見出されていない。 β₂−ｍは分子量11800のアミノ酸100個よりなる
低分子量蛋白質であるが、これまでに血液あるい
は血漿中の成分をそのサイズによりある程度選択
的に分離する膜による分離方法が試みられてい
る。しかしながら、この方法はβ₂−ｍ以外の有用
蛋白質も除去されたり、β₂−ｍの除去量が少ない
などの欠点を有しており、より選択的かつ効率よ
く大量にβ₂−ｍを除去する方法が望まれていた。 また吸着体を用いたβ₂−ｍの除去方法は現在の
ところほとんど試みられていないが、その数少な
い例において用いられているβ₂−ｍ精製用の吸着
体としては、たとえば抗β₂−ｍ抗体を担体に固定
した免疫吸着体、β₂−ｍに親和性を示す化合物
（以下、リガンドという）としてコンカナバリン
Ａを担体に固定したいわゆるアフイニテイークロ
マトグラフの原理を用いた吸着体などが知られて
いる。これらの吸着体はβ₂−ｍに対し高い選択性
を示すが、抗β₂−ｍ抗体やコンカナバリンＡなど
のリガンドは高価であり、また吸着体の保存安定
性がわるく滅菌が困難であるなどの問題点を有し
ており、治療用の吸着体としては実用的でない。 本発明は叙上の問題点を解決し、β₂−ｍを大量
に吸着除去しうる安価な体外循環治療用吸着体を
提供することを目的とするものである。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明は多孔質水不溶性担体にlogP（Ｐはオク
タノール−水系での分配係数）値が2.50以上の化
合物を固定してなる体外循環治療用のβ₂−ｍ吸着
体に関する。 ［実施例］ 本発明の吸着体は、logP値が2.50以上の化合物
を多孔質水不溶性担体に固定してなる。 logP値は化合物の疎水性のパラメーターとな
り、代表的なオクタノール−水系での分配係数Ｐ
の求め方はつぎのとおりである。まず、化合物を
オクタノール（もしくは水）に溶解し、これに等
量の水（もしくはオクタノール）を加え、グリツ
フイン・フラスク・シエイカー（Griffin flask
Shaker）（グリツイン・アンド・ジヨージ・リミ
テツド（Griffin ＆ George Ltd.）製）で30分
間振盪する。その後2000rpmで１〜２時間遠心分
離しオクタノール層および水層中の化合物濃度を
分光学的またはGLCなどの種々の方法により測
定することにより次式で求められる。 Ｐ＝Coct／Cw Coct：オクタノール層中の化合物濃度 Cw：水層中の化合物濃度 これまでに多くの研究者らにより種々の化合物
のlogP値が実測されているが、それらの実測値
はシー・ハンシユ（C.Hansch）らによつて整理
されている（「パーテイシヨン・コーフイシエン
ツ・アンド・ゼア・ユージズ；ケミカル・レビユ
ーズ（PARTITION COEFFICIENTS AND
THEIR USES；Chemical Reviews）、71巻、
525頁、1971年」参照）。 また実測値の知られていない化合物については
アール・エフ・レツカー（R.F.Rekker）がその
著者（「ザ・ハイドロフオビツク・フラグメンタ
ル・コンスタント（THE HYDROPHOBIC
FRAGMENTAL CONSTANT）」、エルセビ
ア・サイエンテイフイツク・パブリツシング・カ
ンパニー・バムステルダム（Elsevier Sci.Pub.
Com.、Amsterdam）（1977）中に示されている
疎水性フラグメント定数ｆを用いて計算した値
（Σf）が参考となる。疎水性フラグメント定数は
数多くのlogP実測値をもとに、統計学的処理を
行ない決定された種々のフラグメントの疎水性を
示す値であり、化合物を構成するおのおののフラ
グメントのｆ値の和はlogP値とほぼ一致する。 β₂−ｍの吸着に有効な化合物の探索にあたり
種々のlogP値を有する化合物を固定し検討した
結果、logP値2.50以上の化合物がβ₂−ｍの吸着に
有効であり、logP値2.50未満の化合物は殆んどβ₂
−ｍ吸着能を示さないことがわかつた。たとえば
アルキルアミンを固定したばあい、アルキルアミ
ンをｎ−ヘキシルアミン（logP＝2.06）からｎ−
オクチルアミン（logP＝2.90）に変えると、この
間でβ₂−ｍ吸着能は飛躍的にに上昇することがわ
かつた。これらの結果より本発明の吸着体へのβ₂
−ｍの吸着は、logP値2.50以上の化合物の固定に
より担体上に導入された原子団とβ₂−ｍとの間の
疎水性相互作用によるものと考えられ、logP値
2.50未満の化合物では疎水性が小さ過ぎるために
β₂−ｍ吸着能を示さないと考えられる。 本発明において、多孔質水不溶性担体に固定さ
れる化合物としては、logP値が2.50以上の化合物
であれば特別な制限なしに用いることができる。
ただし、担体上に化合物を化学結合法によつて結
合するばあいには化合物の一部が脱離することが
多いが、この脱離基が化合物の疎水性に大きく寄
与しているばあい、すなわち脱離により担体上に
固定される原子団の疎水性がΣf＝2.50より小さく
なるようなばあいには本発明の主旨から考えて、
本発明に用いる化合物としては不適当である。こ
の代表例を１つあげると、安息香酸イソペンチル
エステル（Σf＝4.15）をエステル交換により水酸
基を有する担体上に固定するばあいがあげられ
る。このばあい実際に担体上に固定される原子団
はC₆H₅CO−であり、この原子団のΣfは１以下で
ある。このような化合物が本発明で用いる化合物
として適当かどうかは、脱離基の部分を水素に置
き換えた化合物のlogP値が2.50以上かどうかによ
り判断すればよい。 logP値が2.50以上の化合物のなかでも不飽和炭
化水素、アルコール、アミン、チオール、カルボ
ン酸およびその誘導体、ハロゲン化物、アルデヒ
ド、ヒドラジド、イソシアナート、グリシジルエ
ーテルなどのオキシラン環含有化合物、ハロゲン
化シランなどのように担体への結合に利用できる
官能基を有する化合物が好ましい。このような化
合物の代表例としてはｎ−ヘプチルアミン、ｎ−
オクチルアミン、デシルアミン、ドデシルアミ
ン、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、
２−アミノオクテン、ナフチルアミン、フエニル
−ｎ−プロピルアミン、ジフエニルメチルアミン
などのアミン類、ｎ−ヘプチルアルコール、ｎ−
オクチルアルコール、ドデシルアルコール、ヘキ
サデシルアルコール、１−オクテン−３−オー
ル、ナフトール、ジフエニルメタノール、４−フ
エニル−２−ブタノールなどのアルコール類なら
びにこれらのアルコールのグリシジルエーテル
類、ｎ−オクタン酸、ノナン酸、２−ノネン酸、
デカン酸、ドテカン酸、ステアリン酸、アラキド
ン酸、オレイン酸、ジフエニル酢酸、フエニルプ
ロピオン酸などのカルボン酸類ならびにこれらの
酸ハロゲン化物、エステル、アミドなどのカルボ
ン酸誘導体、塩化オクチル、臭化オクチル、塩化
デシル、塩化ドデシルなどのハロゲン化物、オク
タンチオール、ドデカンチオールなどのチオール
類、ｎ−オクチルトリクロロシラン、オクタデシ
ルトリクロロシランなどのハロゲン化シラン類、
ｎ−オクチルアルデヒド、ｎ−カプリンアルデヒ
ド、ドデシルアルデヒドなどのアルデヒド類など
があげられる。これらの他にも、叙上の例示化合
物の炭化水素部分の水素原子がハロゲン、チツ
素、酸素、イオウなどのヘテロ原子を含有する置
換基、他のアルキル基などで置換された化合物の
うちlogP値が2.50以上の化合物、前述のシー・ハ
ンシユ（C.Hansch）らの総説「パーテイシヨ
ン・コーフイシエンツ・アンド・ゼア・ユージ
ズ；ケミカル・レビユーズ（PARTITION
COEFFICIENTS AND THEIR USES；
Chemical Reviews）、71巻、525頁、1971年」中
の55ページから613ページの表に示されている
logPが2.50以上の化合物などを用いることができ
るが、本発明においてはこれらのみに限定される
ものではない。 なお、これらの化合物はそれぞれ単独で用いて
もよいし、任意の２種類以上を組み合わせてもよ
く、さらにはlogP値が2.50未満の化合物との組み
合わせで用いてもよい。 本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラス
ビース、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビ
ニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポ
リアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成
高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架
橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類か
らなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせに
よつてえられる有機−有機、有機−無機などの複
合担体などが代表例としてあげられるが、ながで
も親水性担体が非特異吸着が比較的少なくβ₂−ｍ
吸着選択性が良好であるため好ましい。ここでい
う親水性担体とは担体を構成する化合物を平板状
にしたときの水との接触角が60度以下の担体を指
す。このような担体としてはセルロール、ポリビ
ニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体
けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル
酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチ
ル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポ
リアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラ
スなどからなる担体が代表例としてあげられる
が、多孔質セルロースゲルは、(1)機械的強度が比
較的高く、強じんであるため攪拌などの操作によ
り破壊されたり微粉を生じたりすることが少な
く、カラムに充填したばあい体液を高流速で流し
ても圧密化したり、目詰りしたりしないので高流
速で流すことが可能となり、また細孔構造が高圧
蒸気滅菌などによつて変化を受けにくい、(2)ゲル
がセルロールで構成されているため親水性であ
り、リガンドの結合に利用しうる水酸基が多数存
在し、非特異吸着も少ない、(3)空孔容積を大きく
しても比較的強度が高いため軟質ゲルに劣らない
吸着容量がえられる、(4)安全性が合成高分子ゲル
などに比べて高いなどの優れた点を有しており、
本発明に用いる最も適した担体の１つである。本
発明においてはこれらのみに限定されるものでは
ない。なお、上述の担体はそれぞれ単独で用いて
もよいし、任意の２種類以上を混合して用いても
よい。 本発明に用いる水不溶性担体にまず第１に要求
される性質は、適当な大きさの細孔を多数有す
る、すなわち多孔質であることである。本発明の
吸着体の吸着対象でβ₂−ｍは前述のごとく分子量
11800の蛋白質であり、この蛋白質を効率よく吸
着するためにはβ₂−ｍはある程度大きな確率で細
孔内に侵入できるが、他の蛋白質の侵入はできる
限りおこらないことが好ましい。細孔径の測定法
には種々あり、水銀圧入法が最もよく用いられて
いるが、本発明で用いる多孔質水不溶性担体のば
あいには適用できないことが多い。そのようなば
あいには細孔径の目安として排除限界分子量を用
いるのが適当である。排除限界分子量とは成書
（たとえば、波多野博行、花井俊彦著、実験高速
液体クロマトグラフ、化学同人）などに述べられ
ているごとく、ゲル浸透クロマトグラフイーにお
いて細孔内に侵入できない（排除される）分子の
うち最も小さい分子量をもつものの分子量をい
う。排除限界分子量は一般に球状蛋白質、デキス
トラン、ポリエチレングリコールなどについてよ
く調べられているが、本発明に用いる担体のばあ
い、球状蛋白質を用いてえられた値を用いるのが
適当である。 種々の排除限界分子量の担体を用いて検討した
結果、β₂−ｍの吸着に適当な細孔径の範囲は排除
限界分子量が１万以上60万以下であることが明ら
かとなつた。すなわち１万未満の排除限界分子量
をもつ担体を用いたばあいにはβ₂−ｍの吸着除去
量は小さくその実用性が低下し、また60万をこえ
るものでは、β₂−ｍ以外の蛋白（主としてアルブ
ミン）の吸着が大きくなり選択性の点でその実用
性が低下する。したがつて本発明に用いる担体の
好ましい排除限界分子量は１万以上60万以下、さ
らに好ましくは２万以上30万以下である。 つぎに担体の多孔構造については、吸着体の単
位体積あたりの吸着能から考えて、表面多孔性よ
りも全多孔性が好ましく、空孔容積が20％以上で
あり、比表面積が３m²／ｇ以上であることが好ま
しい。 また担体の形状は粒状、繊維状、中空系状など
任意に形状をえらぶことができる。 さらに担体表面には、リガンドの固定化反応に
用いうる官能基が存在していると好都合である。
これらの官能基の代表例としては、水酸基、アミ
ノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール
基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロ
ゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基などが
あげられる。 つぎに本発明に用いる担体としては硬質担体、
軟質担体のいずれも用いることができるが、体外
循環治療用の吸着体として使用するためには、カ
ラムに充填し、通液する際などの目詰りを生じな
いことが重要であり、そのためには充分な機械的
強度が要求される。 したがつて本発明に用いる担体は硬質担体であ
ることがより好ましい。ここでいう硬質担体と
は、たとえば粒状ゲルのばあい、後記参考例に示
すごとく、ゲルを円筒状カラムに均一に充填し、
水性流体を流した際の圧力損失ΔPと流量の関係
が0.3Kg／cm²まで直線関係にあるものをいう。 本発明の吸着体はlogP値が2.50以上の化合物を
多孔質水不溶性担体に固定してえられるが、その
固定化方法としては公知の種々の方法を特別な制
限なしに用いることができる。しかしながら、本
発明の吸着体は体外循環治療に供せられるため、
滅菌時あるいは治療時においてのリガンドの脱離
溶出を極力抑えることが安全上重要であり、その
ためには共有結合法により固定化することが最も
好ましい。 本発明の吸着体を治療に用いるには種々の方法
がある。最も簡便な方法としては患者の血液を体
外に導出して血液バツクに貯め、これに本発明の
吸着体を混合してβ₂−ｍを除去後、フイルターを
通して吸着体を除去し、血液を患者に戻す方法が
ある。この方法は複雑な装置を必要としないが、
１回の処理量が少なく治療に時間を要し、操作が
煩雑になるという欠点を有する。 つぎの方法は吸着体をカラムに充填し、体外循
環回路に組み込みオンラインで吸着除去を行なう
ものである。処理方法には全血を直接潅流する方
法と血液から血漿を分離したのち、血漿をカラム
に通す方法がある。本発明の吸着体は、いずれの
方法にも用いることができるが、前述のごとくオ
ンライン処理に最も適している。 つぎに本発明に基づいて本発明の吸着体をさら
に詳細に説明するが、本発明はもとよりこれらに
限られるものではない。 参考例 両端に孔径15μｍのフイルターを装着したガラ
ス製円筒カラム（内径９mm、カラム長150mm）に
アガロースゲル（Biorado社製のBiogelA−5m、
粒径50〜100メツシユ）、ビニル系ポリマーゲル
（東洋曹達工業(株)のトヨパールHW−65、粒径50
〜100μｍ）およびセルロースゲル（チツソ(株)製
のセルロフアインGC−700m、粒径45〜105μｍ）
をそれぞれ均一に充填し、ペリスタテイツクポン
プにより水を流し、流量と圧力損失Δpとの関係
を求めた。その結果を第１図に示す。 第１図に示すごとく、トヨパールHW−65およ
びセルロフアインGC−700mが圧力の増加にほぼ
比例して流量が増加するのに対し、BiogelA−
5mは圧密化をひきおこし、圧力を増加させても
流量が増加しないことがわかる。本発明において
は前者のごとく、圧力損失Δpと流量の関係が0.3
Kg／cm²まで直線関係にあるものを硬質ゲルとい
う。 実施例 １ セルロース系多孔質硬質ゲるであるセルロフア
インGC−200m（チツソ(株)製、球状蛋白質の排除
限界分子量120000）170mlに水を加え全量を340ml
としたのち、2M水酸化ナトリウム90mlを加え40
℃とした。これにエピクロルヒドリン31mlを加
え、40℃で攪拌下２時間反応させた。反応終了
後、充分に水洗し、エポキシ化ゲルをえた。 このエポキシ化ゲル10mlにｎ−オクチルアミン
（logP＝2.90）200mgを加え、50％（ｖ／ｖ）エタ
ノール水溶液中、45℃で静置下６日間反応させ
た。反応終了後、50％（ｖ／ｖ）エタノール水溶
液、エタノール、50％（ｖ／ｖ）エタノール水溶
液、水の順に充分に洗浄し、ｎ−オクチルアミン
固定化ゲルをえた。 この吸着体0.5mlにβ₂−ｍ濃度65μｇ／mlの透析
患者血清２mlを加え、37℃で２時間インキユベー
トした。上澄液中のβ₂−ｍおよびアルブミンの濃
度を測定し、吸着体１ml当たりのβ₂−ｍの吸着量
および吸着率、およびアルブミンの吸着量を求め
た。その結果を第１表に示す。 実施例 ２ ｎ−オクチルアミンをドデシルアミン（Σf＝
5.10）に変えたほかは実施例１と同様にしてドデ
シルアミン固定化ゲルをえた。この吸着体を用い
て実施例１と全く同様にして吸着実験を行なつ
た。結果を第１表に示す。 実施例 ３ 担体をセルロース系多孔質硬質ゲルであるセル
ロフアインGC−700m（チツソ(株)製、球状蛋白質
の排除限界分子量400000）に変えたほかは実施例
１と同様にしてｎ−オクチルアミン固定化ゲルを
えた。この吸着体を用いて実施例１と全く同様に
して吸着実験を行なつた。結果を第１表に示す。 実施例 ４ ｎ−オクチルアミンをドデシルアミンに変えた
ほかは実施例３と同様にしてドデシルアミン固定
化ゲルをえた。この吸着体を用いて実施例１と全
く同様にして吸着実験を行なつた。結果を第１表
に示す。 実施例 ５ ｎ−オクチルアミンをセチルアミン（Σf＝
7.22）に、固定化時の溶媒をエタノールに変えた
ほかは実施例３と同様にしてセチルアミン固定化
ゲルをえた。この吸着体を用いて実施例１と全く
同様にして吸着実験を行なつた。結果を第１表に
示す。 比較例 １ ｎ−オクチルアミンをｎ−ヘキシルアミン
（logP＝2.06）に変えたほかは、実施例３と同様
にしてｎ−ヘキシルアミン固定化ゲルをえた。こ
の吸着体を用いて実施例１と全く同様にして吸着
実験を行なつた。結果を第１表に示す。 比較例 ２ ｎ−オクチルアミンをｎ−ブチルアミン
（logP＝0.97）に、固定化時の溶媒を水に変えた
ほかは実施例３と同様にしてｎ−ブチルアミン固
定化ゲルをえた。この吸着体を用いて実施例１と
全く同様にして吸着実験を行なつた。結果を第１
表に示す。 実施例 ６ 担体をセルロース系多孔質硬質ゲルであるセル
ロフアインGCレ−300m（チツソ(株)製、球状蛋白
質の排除限界分子量90000）に変えたほかは実施
例２と同様にしてドデシルアミン固定化ゲルをえ
た。この吸着体を用いて実施例１と全く同様にし
て吸着実験を行なつた。結果を第１表に示す。 実施例 ７ 担体をセルロース系多孔質硬質ゲルであるセル
ロフアインGC−100m（チツソ(株)製、球状蛋白質
の排除限界分子量60000）に変えたほかは実施例
１と同様にしてｎ−オクチルアミン固定化ゲルを
えた。この吸着体を用いて実施例１と全く同様に
して吸着実験を行なつた。結果を第１表に示す。 実施例 ８ 担体をセルロース系多孔質硬質ゲルであるセル
ロフアインGCレ−90m（チツソ(株)製、球状蛋白質
の排除限界分子量35000）に変えたほかは実施例
１と同様にしてｎ−オクチルアミン固定化ゲルを
えた。この吸着体を用いて実施例１と全く同様に
して吸着実験を行なつた。結果を第１表に示す。 実施例 ９ 担体をビニル系ポリマーの多孔質硬質ゲルであ
るトヨパールHW−50 coarse（東洋曹達工業(株)
製、球状蛋白質の排除限界分子量80000）に変え
たほかは実施例１と同様にしてｎ−オクチルアミ
ン固定化ゲルをえた。この吸着体を用いて実施例
１と全く同様にして吸着実験を行なつた。結果を
第１表に示す。

【表】 第１表の結果から、本発明の吸着体を用いると
β₂−ｍは効率よく吸着されるがアルブミンはほと
んど吸着されていないことがわかる。 ［発明の効果］ 本発明の吸着体は安価であり、かつ体液中に含
まれるβ₂−ｍを効率よく吸着除去するという効果
を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は３種類のゲルを用いて流速と圧力損失
との関係を調べた結果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 多孔質水不溶性担体にlogP（Ｐはオクタノー
   ル−水系での分配係数）値が2.50以上の化合物を
   固定してなる体外循環治療用のβ₂−ミクログロブ
   リン吸着体。 ２ 多孔質水不溶性担体の球状蛋白の排除限界分
   子量が１万以上60万以下である特許請求の範囲第
   １項記載の体外循環治療用のβ₂−ミクログロブリ
   ン吸着体。 ３ 多孔質水不溶性担体が親水性担体である特許
   請求の範囲第１項記載の体外循環治療用のβ₂−ミ
   クログロブリン吸着体。 ４ 多孔質水不溶性担体が硬質担体である特許請
   求の範囲第１項記載の体外循環治療用のβ₂−ミク
   ログロブリン吸着体。