JP2001120291A - カルボン酸アミド類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物を用い、芳香族カルボン酸アミド類等
のカルボン酸アミド類を選択性よくかつ高収率に得るこ
とができ、しかも反応液の分離精製が容易となるカルボ
ン酸アミド類の製造方法を提供すること。 【解決手段】 カルボキシル基を有する化合物およびア
ミノ酸を含有する液相に、バシラス族に属する微生物を
作用させて当該化合物のカルボキシル基のアミド化反応
を行なう工程ならびに反応液からカルボン酸アミド類を
分離する工程を含んでなるカルボン酸アミド類の製造
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カルボン酸アミド
類の製造法に関する。特に本発明は、芳香族カルボン酸
アミド類の製造に有効である。芳香族カルボン酸アミド
類は液晶材料、酵素阻害剤の合成中間体として重要であ
り、また、芳香族カルボン酸アミド類は、酸触媒下室温
で脱水し芳香族ニトリルの原料になる。該芳香族ニトリ
ルは医薬品や農薬の合成中間体、分離分析用試薬等とし
て利用できる有用な物質である。

【０００２】

【従来の技術】カルボン酸アミド類、たとえば、芳香族
カルボン酸アミド類の化学的な製法としては、芳香族カ
ルボン酸類に、無水条件下で、酸塩化物と乾燥したアン
モニアガスを作用させる方法が知られている。しかし、
かかる方法は、酸塩化物とアンモニアガスを用いるため
設備の腐食等の問題点がある。さらに、無水条件で反応
を行わなくてはならないため製造条件が厳しく不経済で
もある。

【０００３】上記化学的な製法に対し、微生物、酵素を
用いた反応は、微生物、酵素があたかも触媒のように働
くため経済的に有利であり、微生物の種類を選択すれば
工業的に有用な手段になりうる。また、製造条件も水ま
たは微生物の培地水溶液を用い、室温で行われ、ガスも
発生しないため、製造装置の腐食もなく製造時の危険性
もきわめて少ない。しかし、現在、微生物、酵素を用い
て芳香族カルボン酸アミド類を製造する例は知られてい
ない。

【０００４】通常、微生物を用いた反応では、反応中、
該微生物を生存させるためにポリペプトン、魚肉エキス
などの栄養素を含む培地中で反応させることが望まれ
る。しかしながら、この場合、培地成分が反応液に残存
するため、反応液から目的物質の分離が困難となる。例
えば、これらの反応液を一例として酢酸エチルのような
有機溶媒で抽出を行うと培地中に含まれる各種有機物等
の不純物が同時に抽出されてしまうため、さらにシリカ
ゲルカラム等により分離精製する必要が生じるために、
工程数が増え、その結果製造時間が長くなる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、微生物を用
い、芳香族カルボン酸アミド類等のカルボン酸アミド類
を選択性よくかつ高収率に得ることができ、しかも反応
液の分離精製が容易となるカルボン酸アミド類の製造方
法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、カルボキシル基を
有する化合物に、アミノ酸を添加した液相において、バ
シラス属に属する微生物を作用させることにより前記目
的を達成できることを見出した。

【０００７】すなわち、本発明はカルボキシル基を有す
る化合物およびアミノ酸を含有する液相に、バシラス族
に属する微生物を作用させて当該化合物のカルボキシル
基のアミド化反応を行なう工程ならびに反応液からカル
ボン酸アミド類を分離する工程を含んでなるカルボン酸
アミド類の製造法に関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明において基質として用いら
れるカルボキシル基を有する化合物とはカルボキシル基
を少なくとも１つ有する化合物であれば特に制限され
ず、たとえば、脂肪族カルボン酸、芳香族カルボン酸、
脂環族カルボン酸等があげられる。なお、前記カルボキ
シル基を有する化合物は、脂肪族カルボン酸、芳香族カ
ルボン酸、脂環族カルボン酸の一部が、含酸素置換基、
含窒素置換基、含硫黄置換基、含ハロゲン置換基などの
各種置換基により置換されていてもよい。

【０００９】本発明は、これらカルボキシル基を有する
化合物のなかでも特に芳香族カルボン酸類へ好ましく適
用できる。芳香族カルボン酸類とは、芳香族炭化水素基
およびカルボキシル基をそれぞれ少なくとも１つ有する
化合物をいい、かかる芳香族カルボン酸類のなかでも、
芳香族炭化水素基にカルボキシル基が直接または炭素原
子１つを介して結合した化合物に対しより好ましく適用
できる。特に、芳香族炭化水素基にカルボキシル基が直
接結合した化合物への適用が好ましい。芳香族カルボン
酸類の具体例としては、例えば、安息香酸、パラ−ｔ−
ブチル安息香酸、パラトルイル酸、１−ナフタレンカル
ボン酸、２−ナフタレンカルボン酸、４−ビフェニルカ
ルボン酸、Ｎ−フェニルアントラニル酸、ジフェニル酢
酸、４，４´−ビフェニルジカルボン酸、４´−ヒドロ
キシ−４−ビフェニルカルボン酸、５´−アミノ−４−
フェニルジカルボン酸、２´−スルフォニル−４−ビフ
ェニルカルボン酸、３´−クロロ−４−ビフェニルカル
ボン酸、９−フルオレン−２−カルボン酸などが挙げら
れる。

【００１０】芳香族カルボン酸類以外の、カルボキシル
基を有する化合物としては、たとえば、アクリル酸、メ
タクリル酸、コハク酸、グルタル酸、クエン酸、リンゴ
酸、等があげられる。

【００１１】本発明に使用されうる微生物は、バシラセ
アエ（Bacillaceae ）科のバシラス属に属するグラム陽
性の有芽胞桿菌であり、好ましくバシラス セレウス
（Bacillus cereus ）であり、特に好ましくは平成６年
３月７日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し
た、受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４２１０である。バシ
ラス セレウスは土壌常在の通性嫌気性菌で、耕地、河
川、公園、山林などあらゆる土壌中に芽胞の状態で分布
しており、周毛性べん毛を有し、運動性を示すグラム陽
性の有芽胞桿菌であって菌体の中央またはやや中央に楕
円形の芽胞が存在する。

【００１２】前記微生物の培養には、通常、微生物の培
養に用いられる栄養源を含む液体培地が使用されうる。
前記栄養源は、炭素源および窒素源として肉エキス、ペ
プトン等が、リン源、無機物質源としてリン酸緩衝液な
どが用いられる。さらに、たとえばリン、マグネシウ
ム、鉄、マンガン、塩化ナトリウムなどの無機物質およ
びビタミン類などが適宜混合されうる。そのような培地
の例としては、たとえば、蒸留水に魚（カツオ）肉エキ
ス、ポリペプトン、塩化ナトリウムを溶解した液体培地
（標準培地）があげられる。培地は滅菌することが必要
である。滅菌は通常の高圧蒸気滅菌などにより行なうこ
とができる。なお、前記液体培地の培地１０００ｍｌ中
に栄養源の含有量はたとえば魚肉（カツオ）エキス（和
光純薬社製、魚肉エキス（（カツオ製）、水分３０％含
有）１０ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製、総窒素１
２．５〜１４．５％、アミノ酸窒素５．０〜６．５％含
有）１０ｇ、塩化ナトリウム２ｇである。

【００１３】前記微生物は、本発明の製造法に用いる前
に、通常の条件、たとえば、ｐＨ５〜９程度（下限とし
てはｐＨ６．５、上限としてはｐＨ７．５が好まし
い。）にて、１５〜４５℃程度（下限としては２５℃、
上限としては４０℃が好ましい。）の温度で所望の濁度
となるまで、１２〜４８時間程度、前培養を行なっても
よい。前培養を行なった培養物の中に直接基質を加えて
反応を行なってもよいし、基質を入れた反応用の溶液中
に前記培養物を適量加えてもよいが、反応液の分離を容
易にするためには、前培養の後に遠心分離によって菌体
を集めて反応に用いることが好ましい。

【００１４】本カルボキシル基のアミド化液相反応の際
に用いられる液体の種類は特に限定されず、緩衝液、蒸
留水、生理食塩水などを使用することが可能であるが、
反応液相のｐＨの調節が容易ということから緩衝液を使
用することが好ましい。緩衝液は特に制限されず既存の
緩衝液を使用することが可能であるが、微生物の栄養源
ともなり得るリン酸緩衝液が好ましい。また、反応液相
にはアミド化反応を阻害しない、または分離精製に支障
を来たさない程度、各種培養液、添加物等を加えること
が可能である。

【００１５】反応液中の微生物の菌体量は、菌体が基質
および反応液に適切に接触しうるように選択するとよ
く、１０〜２００ｍｇ菌体／ｍｌ反応液（下限としては
２０ｍｇ菌体／ｍｌ反応液、上限としては１００ｍｇ菌
体／ｍｌ反応液が好ましい。）で行なうとよい。菌体の
量が少ないと基質との接触の効率が低く、また菌体の量
が多すぎると菌体による反応の効率が低下する。

【００１６】本発明の製造法において、菌体は、各種の
形態で使用できるが、前記の前培養された菌体をそのま
ま用いるのが好ましい。また、反応方法も特に制限され
ないが、回分法（バッチ法）または半回分法を採用する
のが好ましい。

【００１７】また、基質であるカルボキシル基を有する
化合物に前記微生物を作用させる際、当該化合物を粉砕
したものをそのまま添加してもよいが、有機溶媒を少量
用いて（０．１〜２ｍｌ有機溶媒／１００ｍｌ反応液、
１〜５０ｍｇ基質／ｍｌ有機溶媒、好ましくは１０〜２
０ｍｇ基質／ｍｌ有機溶媒。）溶解した後に添加しても
よい。有機溶媒の種類は特に制限されず、たとえばアセ
トン、ジメチルスルホキシドなどが好ましい。基質は反
応初期に一括して添加しても、分割して添加してもよ
い。基質は反応液中５ｍｍｏｌ／ｌ以下程度（下限とし
ては０．０１ｍｍｏｌ／ｌ、上限としては４ｍｍｏｌ／
ｌが好ましい。）となるよう添加するとよい。加える基
質濃度が高すぎると反応率は低下する。反応はたとえば
Ｌ字管または坂口フラスコなどを用いて、通常１５〜４
５℃程度（下限としては２５℃、上限としては４０℃が
好ましい。）にて、反応産物量が一定値に達するまで５
〜３０時間程度（下限としては１２、上限としては２４
時間が好ましい。）行なう。

【００１８】反応時のｐＨは６〜９程度（下限としては
ｐＨ６．５、上限としては８が好ましい。）に調製する
とよい。６より低いｐＨでは反応が充分に行なわれず、
５より低いｐＨで行なうと反応の効率は著しく低下す
る。反応は通常、振とうまたは撹拌しながら行なう。

【００１９】また、反応は酸素雰囲気、空気等の含酸素
雰囲気で反応を行うことが好ましい。特に空気の雰囲気
中で反応を行うのが好ましい。

【００２０】本反応において添加するアミノ酸は、市販
の各種等級のものを用いることができる。アミノ酸とし
ては例えば、グリシン、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイ
シン、Ｌ−セリン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイ
ン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニ
ン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパ
ラギン酸、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−ヒドロキシプロ
リン等が挙げられる。なかでも、グリシン、Ｌ−アラニ
ン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ
−バリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プ
ロリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタ
ミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギ
ニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ
−ヒドロキシプロリンおよびＬ−チロシンを添加した場
合には選択性が良好で高収率となるため好ましい。な
お、上記アミノ酸は一種を単独で使用しても数種を併用
しても良い。

【００２１】アミノ酸の添加量は、０．０１ｍｍｏｌ／
ｌから１００ｍｍｏｌ／ｌが望ましく、さらに望ましく
は１ｍｍｏｌ／ｌから１０ｍｍｏｌ／ｌである。アミノ
酸の添加量が０．０１ｍｍｏｌ／ｌを下回ると反応の効
率の面で好ましくない。また、１００ｍｍｏｌ／ｌを上
回ると、反応液の分離の面で困難である。

【００２２】かくしてカルボキシル基を有する化合物か
ら、当該化合物のカルボキシル基をアミド基にしたカル
ボン酸アミド類が得られる。

【００２３】反応終了後、芳香族カルボン酸アミド類を
反応液から分離精製するには、一般的な単離方法が採用
されうる。すなわち、反応液を添加したアミノ酸が親水
性をもつｐＨに調整した後、エチルエーテルまたは酢酸
エチル等の有機溶媒を用いて２〜３回程度抽出し、乾
燥、減圧濃縮などを行う。得られた抽出物は、ＮＭＲ、
質量分析、元素分析およびＨＰＬＣなどの通常の分析方
法により分析されうる。また単離した産物の定量は、Ｈ
ＰＬＣなどを用いて行なうことができる。

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、カルボキシル基を有す
る化合物から、カルボン酸アミド類を選択性よく高収率
で製造することができる。また、反応の結果得られたカ
ルボン酸アミド類を容易に分離精製することが可能であ
る。

【００２５】

【実施例】つぎに実施例により本発明をより詳細に説明
するが、これら実施例はもとより本発明の範囲を限定す
るものではない。なお、生成物の％は、基質に対するモ
ル％である。

【００２６】実施例１ 坂口フラスコ（５００ｍｌ）に、魚肉エキス（（カツオ
製）、和光純薬社製）１０ｇ、ポリペプトン１０ｇおよ
び塩化ナトリウム２ｇを蒸留水１０００ｍｌ中に溶解
し、ｐＨ７．０に調製して１２０℃で２０分高圧蒸気滅
菌した培地（標準培地）を２００ｍｌ入れ、バシラス
セレウス（平成６年３月７日に工業技術院生命工学工業
技術院研究所に寄託した。 受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−
１４２１０）を接種して充分に菌体を増殖させた培養液
（菌量２０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ添加した後３０℃にて
２４時間振とう前培養した。Ｌ字管（１００ｍｌ）にリ
ン酸緩衝液１０ｍｌ、遠心分離し、リン酸緩衝液で洗浄
した菌体を湿重量２００ｍｇ、４−ビフェニルカルボン
酸８０ｍｇ（０．４ミリモル）をアセトン１ｍｌに溶解
したものおよびグリシン３０ｍｇ（０．４ミリモル）を
添加後、空気雰囲気下で、３０℃にて２４時間振とう
し、アミド化反応を行った。反応終了後、酸性条件下、
酢酸エチルで、４−ビフェニルカルボン酸および４−ビ
フェニルカルボン酸アミドを抽出した。この一部をＨＰ
ＬＣ（カラム Ｃ−１８、４ｍｍ φ ×150ｍｍ、溶
媒：メタノール／水（４０／６０〜９５／５）グラジエ
ント法、流速１ｍｌ／分、検出波長２７０ｎｍ）を用
い、標準試料により同定するとともに内部標準法により
４−ビフェニルカルボン酸アミドの定量を行なった。そ
の結果、４−ビフェニルカルボン酸アミド５９．２ｍｇ
（０．３０ミリモル）、収率は（７５％）が得られてい
ることを確認した。

【００２７】実施例２〜１１ 実施例１において、アミノ酸の種類を表１に示すように
変えた他は実施例１と同様の操作を行い、また実施例１
と同様にして、基質の芳香族カルボン酸類に対応する芳
香族カルボン酸アミド類を確認した。芳香族カルボン酸
アミド類の収率を表１に示す。

【００２８】比較例１ 実施例１において、遠心分離した菌体を加えず、反応時
に菌体を存在させなかった他は実施例１と同様の操作を
行った。その結果、４−ビフェニルカルボン酸アミドは
確認できなかった。

【００２９】比較例２ 実施例１において、アミノ酸を加えず、反応時にアミノ
酸を存在させなかった他は実施例１と同様の操作を行っ
た。その結果、４−ビフェニルカルボン酸アミド４８．
９ｍｇ（０．２５ミリモル）、収率は（６２％）が得ら
れていることを確認した。

【００３０】

【表１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B064 AE02 CA02 CC03 CD07 CD13 DA16

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カルボキシル基を有する化合物およびア
   ミノ酸を含有する液相に、バシラス族に属する微生物を
   作用させて当該化合物のカルボキシル基のアミド化反応
   を行なう工程ならびに反応液からカルボン酸アミド類を
   分離する工程を含んでなるカルボン酸アミド類の製造
   法。
2. 【請求項２】 カルボキシル基を有する化合物が芳香族
   カルボン酸類である請求項１に記載の製造法。
3. 【請求項３】 前記微生物がバシラス セレウスである
   請求項１または２に記載の製造法。
4. 【請求項４】 前記アミド化反応を緩衝液中で行なう請
   求項１〜３のいずれかに記載の製造法。
5. 【請求項５】 前記アミド化反応を、含酸素雰囲気下で
   行なう請求項１〜４のいずれかに記載の製造法。
6. 【請求項６】 前記アミド化反応において反応系に添加
   するアミノ酸が、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシ
   ン、Ｌ−セリン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−バリン、Ｌ−
   グルタミン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒ
   スチジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ア
   スパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−フェ
   ニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒドロキシプ
   ロリンおよびＬ−チロシンからなる群より選ばれる少な
   くとも一種である請求項１〜５のいずれかに記載の製造
   法。