JP2001099819A - 液体クロマトグラフィー用充填剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 液クロ充填剤としての性能のバラツキが少な
く、広範囲のｐＨで使用でき、カラム寿命の十分な液体
クロマトグラフィー用充填剤を提供する。 【解決手段】 １分子中にスルホン酸基を１個以上含む
単量体（Ａ）、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性
単量体（Ｂ）および架橋性単量体（Ｃ）を構成単位とす
る重合体からなる液体クロマトグラフィー用充填剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体クロマトグラ
フィー用充填剤、更に詳しくはカチオン交換液体クロマ
トグラフィー用充填剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】カチオン交換基としてカルボキシル基や
スルホン酸基を有する充填剤（カチオン交換基含有充填
剤）を用いた液体クロマトグラフィー分析法は、糖化ヘ
モグロビン類の分析をはじめとして、各種生体関連物質
の分析等に極めて有用な方法である。

【０００３】有機合成高分子からなるカチオン交換基含
有充填剤の従来の製造方法としては、以下の２つの方法
が開示されている。 （１）架橋性粒子に、カチオン交換基含有化合物を反応
させる方法。 すなわち、反応性官能基を有する無機系又は有機系粒子
に、該反応性官能基と反応する基及びカチオン交換基を
有する化合物を反応させることにより、上記無機系又は
有機系粒子に、カチオン交換基を導入する方法。具体的
には、例えば、特開平１−２６２４６８号公報には、粒
子中のエポキシ基にカルボキシル基含有化合物又はスル
ホン酸基含有化合物を反応させる方法が開示されてい
る。

【０００４】（２）カルボキシル基含有単量体を、架橋
性単量体と重合する方法。 例えば、特公昭６３−５９４６３号公報には、カルボキ
シル基含有単量体５〜９０重量％、架橋性単量体１０〜
９５重量％、非架橋性単量体０〜８５重量％を混合して
重合する方法が開示されている。また、特公平８−７１
９７号公報には、重合開始剤を含有する疎水性架橋重合
体粒子の表面に、カチオン交換基含有単量体を重合させ
る方法が開示されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記（１）、（２）の
方法で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤には、
以下の問題点が残っている。 上記（１）の方法による充填剤：後処理によりカチオン
交換基を導入する方法においては、カチオン交換基を有
する化合物を定量的に導入することは困難であることが
一般的に知られており、単量体由来のカチオン交換基導
入に比べ、製造の再現性の点で劣る（吉廻、細矢、木
全、田中：Chromatography,16(1)7-12(1995)）。従っ
て、液体クロマトグラフィー用充填剤としての分離性能
がばらつくという欠点がある。また後処理の方法が極め
て煩雑で長時間を要する。

【０００６】上記（２）の方法による充填剤：カルボキ
シル基含有単量体の添加量や重合条件を制御することに
より、充填剤に対して定量的にカルボキシル基を含有さ
せることができ、また操作も簡便であるが、カルボキシ
ル基を有する充填剤は、使用できるｐＨが約５．５以上
と限定されるため、低ｐＨ溶離液での分析が行えないと
いう欠点がある。また、スルホン酸基含有単量体を用い
て、スルホン酸基を有する液体クロマトグラフィー用充
填剤を調製した例は開示されていない。従って従来のス
ルホン酸基含有充填剤は上記（１）の方法による充填剤
のみであるが、該充填剤は吸着能が強く、測定条件によ
っては、試料中の妨害物質の非特異吸着を起こし、その
結果カラムの寿命が短いという欠点がある。

【０００７】一方、溶出位置が近接するピークを含む短
時間分析などの場合、特に溶出条件の変更だけでは分離
できない場合などでは、充填剤の選択が重要である。し
かし従来のカルボキシル基含有充填剤とスルホン酸基含
有充填剤とでは、カチオン交換能があまりにも違いす
ぎ、充填剤の微調整は困難であった。

【０００８】本発明は、上記問題点に鑑みてなされたも
のであり、その目的は、液クロ充填剤としての性能のバ
ラツキが少なく、広範囲のｐＨで使用でき、カラム寿命
の十分な液体クロマトグラフィー用充填剤を提供するこ
とである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、請求項１の本発明（以下、本発明１という）では、
１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）、
１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）お
よび架橋性単量体（Ｃ）を構成単位とする重合体からな
ることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤を
提供する。また、請求項２の本発明（以下、 本発明２と
いう）では、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単
量体（Ｂ）が、一般式（１）； Ｒ ¹（ＣＨ₂ ＯＣＯＣ
Ｒ ² ＝ＣＨ₂ ）₂ （式中Ｒ ¹は、直鎖部の炭素原子数が
１〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基
で置換されているアルキレン基、もしくは、直鎖部の炭
素原子数と酸素原子数の和が２〜１０の整数であって、
水素原子が１個以上の水酸基で置換されているオキサア
ルキレン基を表す。式中Ｒ² は、水素原子又は、メチル
基を表す。）で表されることを特徴とする請求項１記載
の液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。また、
請求項３の本発明（以下、本発明３という）では、１分
子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）１０〜
２００重量部、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性
単量体（Ｂ）５〜１００重量部、および架橋性単量体
（Ｃ）１００重量部を重合してなる請求項１又は、２記
載の液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。

【００１０】以下、本発明の詳細を説明する。 （１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体
（Ａ））本発明における上記１分子中にスルホン酸基を
１個以上含む単量体（Ａ）としては、例えば、１分子中
に１個以上のスルホン酸基と１個以上のビニル基を有す
る単量体が挙げられる。このような単量体としては、例
えば、スチレンスルホン酸、（メタ）アリルスルホン
酸、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパン
スルホン酸、（３−スルホプロピル）−イタコン酸、３
−スルホプロピル（メタ）アクリル酸、およびこれらの
誘導体や塩類などが挙げられる。単量体（Ａ）として
は、分子中にベンゼン骨格を有さない単量体がより好ま
しい。ベンゼン骨格は、特に生体関連物質の分析等で
は、タンパク質など試料中の物質の非特異吸着を誘発す
るので好ましくない。

【００１１】上記単量体（Ａ）の量は、少なくなると得
られる重合体のカチオン交換容量が小さすぎて、被測定
物質との十分なカチオン交換反応が行われにくくなり、
多くなると得られる重合体の親水性が大きくなりすぎ
て、重合中に凝集が発生しやすくなるので、重合時にお
いて架橋性単量体（Ｃ）１００重量部に対して１０〜２
００重量部添加することが好ましい。

【００１２】（１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性
単量体（Ｂ））本発明における１分子中に水酸基を１個
以上含む架橋性単量体（Ｂ）としては、一般式（１）；
Ｒ ¹（ＣＨ₂ ＯＣＯＣＲ² ＝ＣＨ₂ ）₂ で表されるも
のが用いられる。上記一般式中Ｒ ¹は、直鎖部の炭素原
子数が１〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の
水酸基で置換されているアルキレン基、もしくは、直鎖
部の炭素原子数と酸素原子数の和が２〜１０の整数であ
って、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているオ
キサアルキレン基を表す。式中Ｒ² は、水素原子及び、
メチル基を表す。上記アルキレン基は、直鎖パラフィン
炭化水素の両端の炭素原子から水素原子各１個を除いた
２価の基（一般式；−Ｃ_n Ｈ_2n−）を示す。また、上記
オキサアルキレン基は、上記アルキレン基の少なくとも
一つのメチレン基（−ＣＨ₂ −）をエーテル基（−Ｏ
−）に置換したものを示す。

【００１３】上記一般式（１）で表されるものとして、
例えば、１分子中に１個以上の水酸基と２個以上のビニ
ル基を有する単量体が挙げられ、このような単量体とし
ては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）ア
クリルロキシプロパン、１，１０−ジ（メタ）アクリロ
キシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、
１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，
７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ
（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデカン−
２，６，１０−トリオールなどが挙げられる。

【００１４】上記単量体（Ｂ）の量は、少なくなると試
料中の生体成分（タンパク質など）の非特異吸着を抑制
する効果が十分に得られにくくなり、多くなると、重合
体の親水性が増大し、重合中に凝集が発生しやすくなる
ため、重合時において架橋性重合体（Ｃ）１００重量部
に対して、５〜１００重量部添加することが好ましい。

【００１５】（架橋性単量体（Ｃ））本発明における架
橋性単量体（Ｃ）は、上記（Ｂ）以外の、１分子中にビ
ニル基を２個以上有する単量体を言い、イオン交換基を
有さないか又は有していても微量である単量体であっ
て、単量体（Ａ）及び単量体（Ｂ）よりも疎水性である
ものが好ましい。このような、架橋性単量体（Ｃ）とし
ては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、
ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、ジビニル
ナフタレン等のスチレン誘導体；エチレングリコールジ
（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メ
タ）アクリレート、１，６−ヘキサングリコールジ（メ
タ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）
アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）ア
クリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリ
レート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレ
ート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレ
ート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレー
ト、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレー
ト等の（メタ）アクリル酸エステルの誘導体；１，３−
ブタジエン、イソプレン、１，４−ヘキサンジエン等の
脂肪族ジエン化合物；及び上記単量体の誘導体などが挙
げられる。これらは２種以上が混合されて用いられても
よい。

【００１６】本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤
に用いられる重合体には、必要に応じて、上記単量体
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）以外の非架橋性単量体（Ｄ）が
構成単位の一部として混合されていてもよい。上記非架
橋性単量体（Ｄ）としては、例えば、スチレン、α- メ
チルスチレン、p-メチルスチレン、クロロメチルスチレ
ンなどのスチレン誘導体類；塩化ビニルなどの脂肪族系
単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ステアリン
酸ビニル等のビニルエステル類；（メタ）アクリル酸メ
チル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸
ブチル、メタクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−
ヒドロキシエチル等の（メタ）アクリル酸エステル類；
（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミド、アクリロニトリルなど（メタ）アクリル酸誘導体
類が挙げられる。

【００１７】上記非架橋性単量体（Ｄ）の量は、上記単
量体（Ｂ）と（Ｃ）をあわせて１００重量部に対して１
００重量部以下であることが好ましい。上記非架橋性単
量体（Ｄ）の量が１００重量部より多くなると重合体粒
子内の空隙が大きくなるため、膨潤、収縮などがおこり
やすくなり、複数の溶離液を用いた場合などに溶離液へ
の平衡化に長時間を要するようになるためである。

【００１８】（充填剤の重合方法）本発明の液体クロマ
トグラフィー用充填剤に用いられる重合体の重合は、公
知の重合方法が用いられ、例えば、懸濁重合、乳化重
合、分散重合などにより製造され得る。さらに、例え
ば、上記単量体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を混合し、こ
れに重合開始剤を所定量添加した後、分散媒中に添加し
て昇温し重合する方法が挙げられる。また上記単量体
（Ｂ）及び（Ｃ）を用いて架橋性重合体粒子を調製した
後、該重合体粒子に重合開始剤を含浸させた後、上記単
量体（Ａ）を分散場媒中に添加して重合する方法も挙げ
られる。

【００１９】さらに、本発明の液体クロマトグラフィー
用充填剤に用いられる重合体の重合方法として、多段階
反応による微粒子の合成方法が用いられてもよい。すな
わち、あらかじめ重合された粒度分布の揃った重合体粒
子（Ｅ）に、上記単量体（Ａ）〜（Ｄ）、または、これ
らの一部が吸収されて製造されることにより、粒径がよ
り均一化される。

【００２０】上記重合体粒子（Ｅ）とは、粒度分布の揃
った重合体粒子のことを指し、例えば、上記非架橋性単
量体（Ｄ）などの単独重合体又は共重合体からなる非架
橋重合体粒子が挙げられ、例えば、スチレン重合体、
（メタ）アクリル酸メチル重合体、（メタ）アクリル酸
エチル重合体などが挙げられる。 また、上記重合体粒
子（Ｅ）として、上記非架橋性単量体（Ｄ）と上記架橋
性単量体（Ｂ）あるいは（Ｃ）との共重合体である架橋
共重合体粒子（例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共
重合体）も使用できるが、この場合は、架橋性単量体
（Ｂ）あるいは（Ｃ）の割合を１０重量％以下として共
重合して得られる低架橋重合体粒子が好ましい。

【００２１】上記重合体粒子（Ｅ）の製造方法は、公知
の重合方法でよく、例えば乳化重合、ソープフリー重
合、分散重合、懸濁重合などが挙げられる。

【００２２】上記重合体粒子（Ｅ）の平均粒径は、０．
１〜１０μｍが好ましく、粒径のばらつきは変動係数
（ＣＶ）（＝標準偏差÷平均粒径×１００）として４０
％以下が好ましい。

【００２３】上記重合体粒子（Ｅ）の量は、上記架橋性
単量体（Ｂ）と（Ｃ）あわせて１００重量部に対して
０．５〜１００重量部が好ましい。

【００２４】上記の重合体粒子（Ｅ）を用いる場合に
は、架橋性単量体（Ｂ）及び（Ｃ）（必要に応じて、非
架橋性単量体（Ｄ）も含む）と重合開始剤を、重合体粒
子（Ｅ）に吸収させて重合を進めることが好ましい。

【００２５】本発明の重合開始剤としては、特に限定さ
れず、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤が
用いられる。上記重合開始剤の具体的な例としては、過
硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム
などの過硫酸塩；クメンハイドロパーオキサイド、ベン
ゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オ
クタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパー
オキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイ
ドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテー
ト、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５
−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチル
パーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチ
ルパーオキサイドなどの有機過酸化物；２，２’−アゾ
ビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４
−ジメチルバレロニトリル）、４，４’−アゾビス（４
−シアノペンタン酸）、２，２’−アゾビス（２−メチ
ルブチロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニ
トリルなどのアゾ化合物などが挙げられる。

【００２６】上記重合開始剤の使用量は、上記架橋性単
量体（Ｂ）と（Ｃ）あわせて１００重量部に対し、０．
０５〜５重量部が好ましい。重合開始剤の使用量が０．
０５重量部未満になると、重合反応が不十分となった
り、重合に長時間を要することがあり、５重量部を越え
ると、急激な反応の進行により、凝集物が発生すること
がある。この重合開始剤は、上記単量体に溶解して用い
てもよい。

【００２７】本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤
に用いられる重合体は、その製造時に多孔質化剤が用い
られて製造されることにより、多孔質化されていてもよ
い。多孔質化された重合体を製造する場合は、多孔質化
剤として単量体を溶解するが、重合体を溶解しない有機
溶媒を重合反応系に添加して重合すればよい。このよう
な多孔質化剤としては公知のものでよく、例えば、トル
エン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン
等の芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、オクタ
ン、デカン等の飽和炭化水素；イソアミルアルコール、
ヘキシルアルコール、オクチルアルコール等のアルコー
ル類などが挙げられる。上記多孔質化剤の使用量は、多
くなると、得られる重合体の耐圧性が低下し、膨潤、収
縮し易くなり、また、重合中に凝集が発生し易くなるの
で、上記架橋性単量体（Ｂ）と（Ｃ）あわせて１００重
量部に対して、１００重量部以下が好ましい。

【００２８】（本発明の液体クロマトグラフィー用充填
剤の粒径）本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の
平均粒径は０．５〜１００μｍが好ましく、粒径のばら
つきは変動係数（ＣＶ）（＝標準偏差÷平均粒径×１０
０）として１５％以下が好ましい。このような、本発明
の液体クロマトグラフィー用充填剤は、重合によって得
られた重合体粒子を、必要に応じて分級することにより
得られる。分級には、乾式又は湿式など公知の方法が用
いられ得る。

【００２９】（本発明の液体クロマトグラフィー用充填
剤の使用）本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤
は、ステンレス製などのカラムに充填されてカチオン交
換液体クロマトグラフィーなどに用いられる。カラムへ
の充填に際しては、適宜の方法を用いることができる
が、充填剤を溶離液として用いる溶媒などの分散媒に所
定量分散し、カラム内にパッカーなどを経由して圧入す
る湿式法（スラリー法）が特に好ましい。

【００３０】本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤
を用いて分離測定する際の測定対象物質としては、従来
からカチオン交換液体クロマトグラフィー又はイオンク
ロマトグラフィーで分離されていたものの全てである。
特に、カテコールアミン誘導体類、ヌクレオチド類、ペ
プチド類、タンパク質類などの生体関連物質が好適であ
る。

【００３１】本発明の充填剤を適用できる液体クロマト
グラフは公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料
導入装置、カラム、検出器などから構成される。また、
これらに他の付属品（恒温槽や溶離液の脱気装置など）
が適宜付属されてもよい。

【００３２】本発明の充填剤を用いた液体クロマトグラ
フィー分析には、公知の溶離液が用いられる。例えば、
以下の物質などを含む各種緩衝液などが挙げられる。リ
ン酸、硝酸、塩酸、過塩素酸などの無機酸及びその塩；
酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸などの有
機酸及びその塩又はハロゲン化物；水酸化ナトリウム、
水酸化カリウムなどの塩基性物質。また、例えば、アセ
トン、アセトニトリル、ジオキサン、メタノール、エタ
ノールなどの有機溶媒も使用可能であり、また、水若し
くは上記緩衝液と有機溶媒の混合物も使用可能である。

【００３３】（作 用）本発明１では、１分子中にスル
ホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）、１分子中に水酸
基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）および架橋性単量
体（Ｃ）を構成単位とする重合体からなり、該スルホン
酸基は、スルホン酸基を１個以上含む単量体に由来する
ものであり、従来法の後処理によるスルホン酸基の導入
方法により得られた充填剤と異なり、液体クロマトグラ
フィー用充填剤としての性能にバラツキが少なく、広範
囲のｐＨで使用できる。さらに１分子中に水酸基を１個
以上含む単量体を構成単位に有しているため、タンパク
質などの非特異吸着が少なくなるため、従来の充填剤を
充填したカラムに比較してカラム寿命が長くなる。ま
た、本発明２では、上記一般式（１）で表される１分子
中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）を用いる
ので、さらに、液体クロマトグラフィー用充填剤として
の性能にバラツキが少なく、タンパク質などの非特異吸
着が少なくなるため、充填剤を充填したカラムに比較し
てカラム寿命が長くなる。また、本発明３では、１分子
中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）１０〜２
００重量部、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単
量体（Ｂ）５〜１００重量部、および架橋性単量体
（Ｃ）１００重量部を重合してなるので、このように単
量体を一定の比率で添加して重合させることにより、充
填剤のイオン交換能の微調整が可能となり、従来分離し
にくかった物質、又は従来分離に長時間かかっていた物
質を、短時間で簡便な溶出条件により、高精度に分離で
きる。

【００３４】

【実施例】以下に本発明の実施例を示す。 （実施例１）２−アクリルアミド−２−メチルプロパン
スルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００
ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパ
ン（単量体（Ｂ）：新中村化学社製）２００ｇ、ジエチ
レングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中
村化学社製）２００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド
（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合し、２．
５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成
化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌し
ながら昇温し、８０℃で８時間重合した。重合後、洗浄
し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。

【００３５】（実施例２）２−アクリルアミド−２−メ
チルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業
社製）２００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリ
ロキシプロパン（単量体（Ｂ）：新中村化学社製）５０
ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量体
（Ｃ）：新中村化学社製）４００ｇを用いた以外は、実
施例１と同様重合を行った。重合後、洗浄し分級して平
均粒径５μｍの充填剤を得た。

【００３６】（実施例３）１，１０−ジメタクリロキシ
−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール（単量体
（Ｂ）：共栄社化学社製）１００ｇ、トリエチレングリ
コールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社
製）３００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始
剤）１．５ｇを混合して溶解し、２．５リットルの４重
量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰
囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１時間重合し
た。重合後、反応系を３０℃に冷却した後、２−アクリ
ルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体
（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇを添加して３０℃
で１時間撹拌した後、８０℃で３時間重合した。重合
後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。

【００３７】（実施例４）アリルスルホン酸（単量体
（Ａ）：キシダ化学社製）１００ｇ、１，１０−ジメタ
クリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオー
ル（単量体（Ｂ）：共栄社化学社製）１００ｇ、ジビニ
ルベンゼン（単量体（Ｃ）：キシダ化学社製）３００
ｇ、スチレン（非架橋性単量体（Ｄ））２００ｇ、トル
エン（多孔質化剤）１００ｇ及びベンゾイルパーオキサ
イド１．５ｇを混合し、２．５リットルの６重量％ポリ
ビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散さ
せた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８
時間重合した。重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍ
の充填剤を得た。

【００３８】（比較例１）スルホン酸基を後処理により
導入して得られた充填剤の例：２−ヒドロキシエチルメ
タクリレート２００ｇ、エチレングリコールジメタクリ
レート（新中村化学社製）４０ｇ、メチルメタクリレー
ト（和光純薬社製）１５ｇ及びtert−ブチルパーピバレ
ート（重合開始剤：和光純薬社製）５ｇの混合溶液を硫
酸ナトリウム２０ｇを溶解した２．５リットルの４重量
％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰囲
気下で撹拌しながら昇温し、６０℃で１２時間重合し
た。重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの粒子を得
た。この粒子１００ｇを１００ｍｌの２０重量％水酸化
ナトリウム水溶液に分散し、エピクロルヒドリン４０ｇ
を添加し、室温で４時間反応させた。さらに得られた粒
子１００ｇを１００ｍｌの２０重量％硫酸ナトリウム水
溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られ
た粒子を洗浄し、充填剤を得た。

【００３９】（比較例２）単量体（Ｂ）を含有しないス
ルホン酸基含有充填剤の例：２−アクリルアミド−２−
メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工
業社製）２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレ
ート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）４００ｇ及びベ
ンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）
１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニ
ルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させ
た。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時
間重合した。重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの
充填剤を得た。

【００４０】（比較例３）単量体（Ｂ）含有量が少ない
スルホン酸基含有充填剤の例：２−アクリルアミド−２
−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成
工業社製）２００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタ
クリロキシプロパン（単量体（Ｂ）：新中村化学社製）
２０ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量
体（Ｃ）：新中村化学社製）４００ｇ及びベンゾイルパ
ーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを
混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコー
ル（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲
気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得
た。

【００４１】（性能評価）実施例及び比較例で得られた
充填剤について、以下のようにして性能評価をした。 （１）液体クロマトグラフィー用カラムの製造：充填剤
０．７ｇを採取し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく
撹拌した。全量をステンレス製空カラム（４．６φ×３
５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入し
た。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続
し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填して、液体クロ
マトグラフィー用カラムを製造した。

【００４２】（２）タンパク質混合物の測定：実施例
１、２及び比較例１で得られた充填剤を各々充填したカ
ラムを用いて、タンパク質標準物質の混合物を測定し
た。 （測定条件） システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製） オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製） 検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製） 溶離液：下記溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％へのリニアグラディエン ト法で溶出した。 溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７） 溶離液Ｂ：溶離液Ａ＋５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．７） 流速：１．５ｍｌ／分 検出波長：２５４ｎｍ 試料注入量：１０μｌ

【００４３】（測定試料） ミオグロビン、α−キモトリプシノーゲン、リボヌクレ
アーゼＡ、リゾチーム（以上、いずれもＳｉｇｍａ社
製）の混合物

【００４４】（測定結果）実施例１で得られた充填剤を
用いた場合のクロマトグラムを図１、比較例１で得られ
た充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図２に示す
（なお、実施例４で得られた充填剤を用いた場合のクロ
マトグラムは図１と同様であった）。図中、ピーク１は
ミオグロビン、ピーク２はα−キモトリプシノーゲン、
ピーク３はリボヌクレアーゼＡ、ピーク４はリゾチーム
を示す。図１は、図２に比べて短時間測定にもかかわら
ず、各ピークの分離がよいことがわかる。

【００４５】（３）ヒト血液中のヘモグロビン類の測定 実施例２、３及び比較例１で得られた充填剤を各々充填
したカラムを用いて、糖尿病診断の指標となる、ヒト血
液中の糖化ヘモグロビン（Ｈｂ）類を含むＨｂ類の測定
を行った。

【００４６】（測定条件） システム：上記（２）タンパク質混合物の測定に用いた
システムと同様。 溶離液：リン酸塩及び過塩素酸塩を含む２種類の緩衝液
によるステップグラディエント法で溶出した。安定型ヘ
モグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）の保持時間が適
当となるように、溶離液Ｃの塩濃度及びｐＨを適宜調整
した。 溶離液Ｃ：塩濃度を１５〜１００ｍＭ、ｐＨ５．６〜
６．０の間で調節した。 溶離液Ｄ：塩濃度３００ｍＭ、ｐＨ７．２とした。 流速：１．５ｍｌ／分 検出波長：４１５ｎｍ

【００４７】（測定試料）健常人血を採血し、抗血液凝
固剤として、フッ化ナトリウム１０ｍｇ／ｍｌとなるよ
うに添加した。これにグルコースを５００ｍｇ／ｄｌと
なるように添加し、３７℃で５時間反応させ、次いで、
溶血試薬（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレン
グリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリ
トンＸ−１００）（東京化成社製）のリン酸緩衝液溶液
（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して測定試
料とした。

【００４８】（測定結果）実施例２、３で得られた充填
剤を用いた場合のクロマトグラムを図３、４、比較例１
で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図５
に示す。図中は、ピーク５はヘモグロビンＡ１ａ及びｂ
（ＨｂＡ１ａ及びｂ）；ピーク６はヘモグロビンＦ（Ｈ
ｂＦ）；ピーク７は不安定型ＨｂＡ１ｃ；ピーク８は安
定型ＨｂＡ１ｃ；ピーク９はヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ
０）を示す。ＨｂＦ（ピーク６）及び糖尿病診断の指標
となる安定型ＨｂＡ１ｃピーク（ピーク８）の良好な定
量性が確保されるためには、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１
ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０の順に溶出される必要
があるが、図３及び４ではこの順序通りに各ピークが溶
出し、しかも短時間の測定にもかかわらず、各ピークの
分離がよいことがわかる。図５では各ピークの分離が、
測定時間が長いにもかかわらず悪く、検出されないピー
クもあった。

【００４９】（４）充填剤のロット間差の評価：本発明
のスルホン酸基を有する充填剤（実施例３）及び後処理
によりスルホン酸基を導入する従来法による充填剤（比
較例１）のロット間差を以下のようにして確認した。各
々３０回重合して、得られた充填剤３０ロット間の性能
のバラツキをみた。上記評価（３）のヒト血液中のヘモ
グロビン類の測定を、それぞれの充填剤の各３０ロット
について行い、ピーク８の安定型ＨｂＡ１ｃの保持時間
を調べた。なお、溶離液Ｃは、ピーク８の保持時間が約
２分となるよう各充填剤毎に調製した。

【００５０】（測定結果）スルホン酸基を有する充填剤
（実施例３）の平均保持時間は、２．２分であり、標準
偏差は０．１５分であり、変動計数（ＣＶ（％）＝標準
偏差÷平均保持時間×１００）は、６．８２％であっ
た。一方、従来法による充填剤（比較例１）の平均保持
時間は、２．２分であり、標準偏差は０．９１分であ
り、変動計数（ＣＶ（％）＝標準偏差÷平均保持時間×
１００）は、４１．１％であった。以上より、本発明の
充填剤は、製造再現性に優れていることが判った。

【００５１】（５）カラムの寿命の評価：実施例２、３
及び比較例２、３の充填剤を充填したカラムを用いて、
上記評価（３）のヒト血液中のヘモグロビン類の測定を
繰り返し行い、以下の式で示されるピーク８の安定型Ｈ
ｂＡ１ｃの面積値の変化を調べた。 ピーク８の面積値（％）＝（ピーク８の面積）÷（全ピ
ークの面積）×１００

【００５２】（測定結果）測定結果を図６に示した。図
６において、横軸は繰り返し測定の回数であり、縦軸は
各回の安定型ＨｂＡ１ｃの面積値を、初回測定値を１０
０とした相対百分率で示した値（％）である。図６よ
り、実施例２及び３の充填剤は、３０００回測定後も良
好な測定値を示しているが、一方、比較例２及び３の充
填剤では、測定回数が増えると測定値が低下し、正確な
測定ができなくなってくることが判る。

【００５３】

【発明の効果】本発明１では、１分子中にスルホン酸基
を１個以上含む単量体（Ａ）、１分子中に水酸基を１個
以上含む架橋性単量体（Ｂ）および架橋性単量体（Ｃ）
を構成単位とする重合体からなるため、液体クロマトグ
ラフィー用充填剤としての性能にバラツキが少なく、広
範囲のｐＨで使用でき、従来の充填剤を充填したカラム
に比較してカラム寿命が長くなる。また、本発明２で
は、上記一般式（１）で表される１分子中に水酸基を１
個以上含む架橋性単量体（Ｂ）を用いるので、さらに、
従来の充填剤を充填したカラムに比較してカラム寿命が
長くなる。また、本発明３では、１分子中に水酸基を１
個以上含む架橋性単量体（Ｂ）が、上記重合体１００重
量部に対して、５〜５０重量部であるので、従来分離し
にくかった物質、又は従来分離に長時間かかっていた物
質を、短時間で簡便な溶出条件により、高精度に分離で
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１により得られた充填剤を用いて、タン
パク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラ
ムを示す図。

【図２】比較例１により得られた充填剤を用いて、タン
パク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラ
ムを示す図。

【図３】実施例２により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ
類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す
図。

【図４】実施例３により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ
類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す
図。

【図５】比較例１により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ
類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す
図。

【図６】カラム寿命の評価の結果を示すグラフであり、
横軸は繰り返し測定の回数であり、縦軸は各回の安定型
ＨｂＡ１ｃの面積値を、初回測定値を１００とした相対
百分率で示した値（％）である。

【符号の説明】

１ ミオグロビンのピーク ２ α−キモトリプシノーゲンのピーク ３ リボヌクレアーゼＡのピーク ４ リゾチームのピーク ５ ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク ６ ＨｂＦのピーク ７ 不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク ８ 安定型ＨｂＡ１ｃのピーク ９ ＨｂＡ０のピーク

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０８Ｆ 220/58 Ｃ０８Ｆ 220/58 222/24 222/24 228/02 228/02 Ｇ０１Ｎ 30/02 Ｇ０１Ｎ 30/02 Ｂ Ｆターム(参考） 4D017 AA11 BA03 CA11 CA17 CB01 DA03 4J100 AB07P AB15R AB16R AL08P AL46P AL62R AL63R AL66Q AL66R AL67R AM14P AP01P AS02R AS03R AS11R BA03Q BA03R BA08R BA12Q BA56P CA05 CA06 CA23 DA28 JA16 JA17

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １分子中にスルホン酸基を１個以上含む
   単量体（Ａ）、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性
   単量体（Ｂ）および架橋性単量体（Ｃ）を構成単位とす
   る重合体からなることを特徴とする液体クロマトグラフ
   ィー用充填剤。
2. 【請求項２】 １分子中に水酸基を１個以上含む架橋性
   単量体（Ｂ）が、一般式（１）； Ｒ ¹（ＣＨ₂ ＯＣＯＣＲ² ＝ＣＨ₂ ）₂ （１） （式中Ｒ ¹は、直鎖部の炭素原子数が１〜１０の整数で
   あって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されている
   アルキレン基、もしくは、直鎖部の炭素原子数と酸素原
   子数の和が２〜１０の整数であって、水素原子が１個以
   上の水酸基で置換されているオキサアルキレン基を表
   す。式中Ｒ² は、水素原子又は、メチル基を表す。）で
   表されることを特徴とする請求項１記載の液体クロマト
   グラフィー用充填剤。
3. 【請求項３】 １分子中にスルホン酸基を１個以上含む
   単量体（Ａ）１０〜２００重量部、１分子中に水酸基を
   １個以上含む架橋性単量体（Ｂ）５〜１００重量部、お
   よび架橋性単量体（Ｃ）１００重量部を重合してなる請
   求項１又は、２記載の液体クロマトグラフィー用充填
   剤。