JP2001054394A - 組換え植物ウイルス核酸 - Google Patents

組換え植物ウイルス核酸

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、組み換え植物ウイルス核酸及びそ
れによって感染された宿主を提供する。 【解決手段】 組み換え植物ウイルス核酸は、天然の植
物ウイルスサブゲノムプロモーター、この少なくとも１
つは非天然植物ウイルスサブゲノムプロモーターであ
り、植物ウイルスコートタンパク質をコードする配列及
び場合によっては、感染された宿主植物において転写さ
れ又は発現される少なくとも１つの非天然核酸配列を含
んで成る。その組み換え植物ウイルス核酸は、非天然核
酸配列の植物宿主において安定し、全体的感染でき、そ
して安定転写又は発現できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、（ａ）自己複製性
であり；（ｂ）宿主の中で組織的感染(systemicifectio
n) を行うことができ；（ｃ）天然ウイルスに対して外
来であり、宿主植物の中で転写または発現される核酸配
列を含有するか、あるいは含有することができ；そして
（ｄ）ことに外来核酸配列の転写および発現について、
安定である植物ウイルスのベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】ウイルスは感染性因子の独特なクラスで
あり、それらの顕著な特徴は簡単な体制および複製のメ
カニズムである。事実、完全なウイルス粒子、またはヴ
ィリオンは、タンパク質の外殻によりおよび時には、例
えば、アルファウイルスの場合におけるように、追加の
膜のエンベロープにより取り囲まれた、自律的複製を行
うことができる遺伝学的物質(DNAまたはRNA)のブロック
として主として見なすことができる。外殻タンパク質は
ウイルスを環境から保護し、そして１つの宿主細胞から
他のへの伝達のためのベヒクルとして働く。
【０００３】細胞と異なり、ウイルスは大きさが成長せ
ず、次いで分割しない。なぜなら、ウイルスはそれらの
外殻内に生合成の酵素およびそれらの複製に要求される
機構をほとんど（あるいは全く）含有しないからであ
る。むしろ、ウイルスは細胞の中でそれらの別の成分の
合成により、次いでアセンブリーにより増殖する。こう
して、ウイルスの核酸は、その外殻を脱いだ後、適当な
細胞の機構と接触するようになり、ここでこの機構はウ
イルスの複製に要求されるタンパク質の合成を特定す
る。次いでウイルスの核酸は、ウイルスおよび細胞の両
者の酵素の使用により、それ自体複製する。ウイルスの
外殻の成分は形成され、そして核酸および外殻の成分は
最後に組み立てられる。あるウイルスでは、複製はヴィ
リオンの中に存在する酵素により開始される。
【０００４】所定の植物ウイルスは、一本鎖または二本
鎖であることができる DNAまたはRNA を含有することが
できる。ヴィリオンの中の核酸の比率は約１％〜約50％
の間で変化する。遺伝情報／ヴィリオンの量は約３kb〜
300kb ／鎖の間で変化する。したがって、ウイルス特異
的タンパク質の多様性は変化する。二本鎖 DNAを含有す
る植物ウイルスの１つの例は次のものを包含するが、こ
れらに限定されない：カウリモウイルス(caulimoviruse
s)、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)。
【０００５】一本鎖 DNAを含有する代表的な植物ウイル
スは、カッサバ潜在ウイルス、マメゴールデン(golden)
モザイクウイルス、およびクロリス・ストリエイト(Chl
orisstriate) モザイクウイルスである。イネの矮化ウ
イルスおよび創傷の腫瘍ウイルスは二本鎖 RNAの植物ウ
イルスの例である。一本鎖 RNAの植物ウイルスは、タバ
コモザイクウイルス(TMV) 、カブ黄斑モザイクウイルス
(TYMV)、イネ壊死ウイルス(RNV) およびスズメノチャヒ
キモザイクウイルス(BMV) を包含する。一本鎖RNAのウ
イルスの中の RNAは、プラス（＋）またはマイナス
（−）鎖であることができる。植物ウイルスに関する遺
伝情報については、次の文献を参照のこと；Grierson,
D. ら（１）；Gluzman,Y.ら（２）。
【０００６】植物ウイルスを分類する１つの手段は、ゲ
ノムの体制(organizat- ion)に基づく。多数の植物ウイ
ルスは RNAゲノムを有するが、遺伝情報の体制はグルー
プの間で異なる。大部分の１成分から成る植物 RNAウイ
ルスのゲノムは、（＋）−センスの一本鎖分子である。
この型のゲノムをもつウイルスの少なくとも１１の主要
なグループが存在する。この型のウイルスの例は TMVで
ある。植物 RNAウイルスの少なくとも６つの主要なグル
ープは２成分から成るゲノムを有する。
【０００７】これらにおいて、ゲノムは通常別々の粒子
の中に包膜された２つの明確な（＋）−センスの一本鎖
RNA分子から成る。両者のRNA は感染力のために要求さ
れる。ササゲモザイクウイルス(CPMW)は、２成分から成
る植物ウイルスの１つの例である。第３の主要なグルー
プは、少なくとも６つの主要な型の植物ウイルスを含有
し、３成分から成り、３つの（＋）−センスの一本鎖 R
NA分子をもつ。各鎖は別々に包膜されており、そしてす
べての３つは感染力のために要求される。３成分から成
る植物ウイルスの例はアルファルファモザイクウイルス
(AMV) である。
【０００８】多数の植物ウイルスは、また、特定の遺伝
子産生物を増幅するために合成される、より小さいサブ
ゲノムのmRNAを有する。一本鎖 DNAゲノムを有する植物
ウイルスの１つのグループは、ジェミニウイルス、例え
ば、カッサバ潜在ウイルス(CLV) およびトウモロコシ茎
ウイルス(MSV) である。いくつかの植物ウイルスは、植
物の形質転換ベクターとしてのそれらの使用を予測し
て、それらの核酸を研究するためにクローニングされて
きている。クローニングされたウイルスの例は、次のも
のを包含する；BMV, Ahlguist, P. およびJanda, M.
(３）；TMV, DawsonW.O.ら（４）；CaMV, Debeurier,
G. ら（５）；およびBGMV, Moringen, T.ら（６）。
【０００９】生物の多数の種を形質転換するために利用
される技術が開発されてきている。これらの技術により
形質転換することができる宿主は、細菌、酵母菌、真
菌、かび、動物細胞および植物の細胞または組織を包含
する。形質転換は、自己複製性でありかつ所望の宿主と
適合性であるベクターを使用することによって達成され
る。ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスに基づ
く。外来 DNAをベクターの中に挿入し、次いでこれを使
用して適当な宿主を形質転換する。次いで、形質転換さ
れた宿主を選択またはスクリーニングにより固定する。
これらの宿主の形質転換に関するそれ以上の情報につい
ては、次の文献を参照のこと：MoleeularCloning(７) D
NA Cloning （８):Grierson, D.ら（１）、およびMetho
ds in Enzymology 、（９）。
【００１０】植物宿主の形質転換のために有用であるこ
とが示されたウイルスは、CaV, TMVおよびBVを包含す
る。植物ウイルスを使用する植物の形質転換は、米国特
許第 4,855,237号(BGV) 、欧州特許出願公開（EP−Ａ）
第67,553号(TMV) 、日本国特許出願公開第63-14693号(T
MA) 、欧州特許出願公開(EPA) 第 194,809号（BV）、欧
州特許出願公開(EPA) 第 278,667号（BV）、Brisson,
N. ら（10)(CaV)、およびGuzmanら（２）に記載されて
いる。植物を包含する多数の宿主の中の外来 DNAの発現
のために使用する偽ウイルスは、WO 87／06261 に記載
されている。
【００１１】ウイルスが DNAウイルスであるとき、ウイ
ルスそれ自体に構成をなすことができる。あるいは、外
来 DNAを使用する所望のウイルスのベクターの構成を容
易とするために、ウイルスをまず細菌のプラスミドの中
にクローニングすることができる。次いで、ウイルスを
プラスミドから切取る。ウイルスが DNAウイルスである
場合、複製の細菌起源をウイルスの DNAに取り付け、次
いでこれを細菌により複製する。
【００１２】この DNAの転写および翻訳は外殻タンパク
質を生産し、この外殻タンパク質はウイルスの DNAを包
膜するであろう。ウイルスが RNAウイルスである場合、
このウイルスを一般にcDNAとしてクローニングし、そし
てプラスミドの中に挿入する。次いで、このプラスミド
を使用して構成体のすべてを作る。次いで、プラスミド
のウイルスの配列を転写し、そしてウイルスの遺伝子を
翻訳してウイルスの RNAを包膜する１種または２種以上
の外殻タンパク質を生産することによって、 RNAウイル
スを生産する。
【００１３】植物の中の非ウイルスの外来遺伝子の導入
および発現のための植物 RNAウイルスの構成は、前述の
文献ならびにDawson,W.O. ら（11);Takamatsu, N. ら
（12）；French, R.ら（13）；およびTakamatsu, N. ら
（14）により証明される。しかしながら、これらのウイ
ルスのベクターのいずれも、植物における組織的広がり
および全植物における植物細胞の大部分の中の非ウイル
スの外来遺伝子の発現を行うことができなかった。先行
技術のウイルスのベクターの多数の他の欠点は、非ウイ
ルスの外来遺伝子の維持のために安定ではないことであ
る。例えば、Dawson, W.O.ら（11）を参照のこと。こう
して、植物ウイルスのベクターおよびウイルスを開発す
るこの活動にかかわらず、宿主植物の中の組織的感染お
よび外来 DNAの安定な発現を行うことができる安定な組
み換え植物ウイルスがなお要求されている。
【００１４】〔発明の要約〕本発明は、非天然の（外
来）核酸配列の維持および転写または発現について安定
でありかつ宿主植物の中でこのような外来配列を組織的
に転写または発現することができる、組み換え植物ウイ
ルスの核酸および組み換えウイルスに関する。さらに詳
しくは、本発明による組み換え植物ウイルスの核酸は、
天然植物ウイルスのサブゲノムプロモーター、少なくと
も１つの非天然植物ウイルスのサブゲノムのプロモータ
ー、植物ウイルスの外殻タンパク質のコーディング配
列、および必要に応じて、少なくとも１つの非天然の核
酸配列からなる。
【００１５】１つの態様において、天然外殻タンパク質
がウイルスの核酸から欠失されており、植物宿主の中で
発現し、組み換え植物ウイルスの核酸をパッケージし、
そして組み換え植物ウイルスの核酸による宿主の組織的
感染を保証することができる、非天然植物ウイルスの外
殻タンパク質のコーディング配列および非天然プロモー
ター、好ましくは非天然外殻タンパク質のコーディング
配列のサブゲノムのプロモーターが挿入されている、植
物ウイルスの核酸が提供される。組み換え植物ウイルス
の核酸は、１または２以上の追加の非天然サブゲノムの
プロモーターを含有することができる。各非天然サブゲ
ノムのプロモーターは、植物宿主の中で隣接する遺伝子
または核酸配列を転写または発現することができ、そし
て互いとおよび天然サブゲノムのプロモーターと組み換
えを行うことができない。
【００１６】１より多い核酸配列が含まれている場合、
非天然（外来）核酸配列を天然植物ウイルスのサブゲノ
ムのプロモーターまたは天然および非天然植物ウイルス
のサブゲノムのプロモーターに隣接して挿入することが
できる。非天然核酸配列を宿主植物の中でサブゲノムの
プロモーターのコントロール下に転写または発現して、
所望の生産物を生産する。第２の態様において、組み換
え植物ウイルスの核酸を第１の態様におけるように提供
するが、ただし天然外殻タンパク質のコーディング配列
を非天然外殻タンパク質のコーディング配列の代わりに
非天然外殻タンパク質のサブゲノムのプロモーターの１
つに隣接して配置する。
【００１７】第３の態様において、天然外殻タンパク質
の遺伝子がそのサブゲノムのプロモーターに隣接して存
在しかつ１または２以上の非天然サブゲノムのプロモー
ターがウイルスの核酸の中に挿入されている組み換え植
物ウイルスの核酸が提供される。挿入された非天然サブ
ゲノムのプロモーターは植物宿主の中で隣接する遺伝子
を転写または発現することができ、そして互いとおよび
天然サブゲノムのプロモーターと組み換えることができ
ない。非天然の核酸配列を非天然サブゲノムの植物ウイ
ルスのプロモーターに隣接して挿入することができ、こ
うして前記配列は宿主植物の中でサブゲノムのプロモー
ターのコントロール下に転写または発現されて所望の生
産物を生産する。
【００１８】第４の態様において、組み換え植物ウイル
スの核酸は第３の態様におけるように提供されるが、た
だし天然外殻タンパク質のコーディング配列は非天然外
殻タンパク質のコーディング配列と置換される。ウイル
スのベクターは組み換え植物ウイルスの核酸によりエン
コードされた包膜されて、組み換え植物ウイルスを生産
する。組み換え植物ウイルスの核酸または組み換え植物
ウイルスを使用して宿主植物を感染させる。組み換え植
物ウイルスの核酸は宿主の中で複製し、宿主の中で組織
的広がりをし、そして宿主の中で１または２以上の外来
遺伝子を転写または発現して所望の生産物を生産するこ
とができる。このような生産物は治療用または他の有用
なポリペプチドまたはタンパク質、例えば、酵素、複雑
な生物分子、リボザイム、あるいはアンチセンス RNA発
現から生ずるポリペプチドまたはタンパク質生産物を包
含するが、これらに限定されない。
【００１９】〔発明の詳細な説明〕本発明は、非天然
（外来）核酸配列の維持および転写または発現について
安定でありかつ宿主植物の中でこのような外来配列を組
織的に転写または発現することができる。組み換え植物
ウイルスの核酸および組み換えウイルスに関する。さら
に詳しくは、本発明による組み換え植物ウイルスの核酸
は、天然植物ウイルスのサブゲノムのプロモーター、少
なくとも１つの非天然植物ウイルスのサブゲノムのプロ
モーター、植物ウイルスの外殻タンパク質のコーディン
グ配列、および必要に応じて、少なくとも１つの非天然
の核酸配列からなる。
【００２０】１つの態様において、天然外殻タンパク質
がウイルスの核酸から欠失されており、植物宿主の中で
発現し、組み換え植物ウイルスの核酸をパッケージし、
そして組み換え植物ウイルスの核酸による宿主の組織的
感染を保証することができる、非天然植物ウイルスの外
殻タンパク質のコーディング配列および非天然プロモー
ター、好ましくは非天然外殻タンパク質のコーディング
配列のサブゲノムのプロモーターが挿入されている、植
物ウイルスの核酸が提供される。あるいは、外殻タンパ
ク質の遺伝子は、融合タンパク質が生産されるように、
その中に非天然の核酸配列を挿入することによって不活
性化することができる。組み換え植物ウイルスの核酸
は、１または２以上の追加の非天然サブゲノムのプロモ
ーターを含有することができる。
【００２１】各非天然サブゲノムのプロモーターは、植
物宿主の中で隣接する遺伝子または核酸配列を転写また
は発現することができ、そして互いとおよび天然サブゲ
ノムのプロモーターと組み換えを行うことができない。
１より多い核酸配列が含まれている場合、非天然（外
来）核酸配列を天然植物ウイルスのサブゲノムのプロモ
ーターまたは天然および非天然植物ウイルスのサブゲノ
ムのプロモーターに隣接して挿入することができる。非
天然核酸配列を宿主植物の中でサブゲノムのプロモータ
ーのコントロール下に転写または発現して、所望の生産
物を生産する。
【００２２】第２の態様において、組み換え植物ウイル
スの核酸を第１の態様におけるように提供するが、ただ
し天然外殻タンパク質のコーディング配列を非天然外殻
タンパク質のコーディング配列の代わりに非天然外殻タ
ンパク質のサブゲノムのプロモーターの１つに隣接して
配置する。
【００２３】第３の態様において、天然外殻タンパク質
の遺伝子がそのサブゲノムのプロモーターに隣接して存
在しかつ１または２以上の非天然サブゲノムのプロモー
ターがウイルスの核酸の中に挿入されている組み換え植
物ウイルスの核酸が提供される。挿入された非天然サブ
ゲノムのプロモーターは植物宿主の中で隣接する遺伝子
を転写または発現することができ、そして互いとおよび
天然サブゲノムのプロモーターと組み換えることができ
ない。非天然の核酸配列を非天然サブゲノムの植物ウイ
ルスのプロモーターに隣接して挿入することができ、こ
うして前記配列は宿主植物の中でサブゲノムのプロモー
ターのコントロール下に転写または発現されて所望の生
産物を生産する。
【００２４】第４の態様において、組み換え植物ウイル
スの核酸は第３の態様におけるように提供されるが、た
だし天然外殻タンパク質のコーディング配列は非天然外
殻タンパク質のコーディング配列と置換される。ウイル
スのベクターは組み換え植物ウイルスの核酸によりエン
コードされた包膜されて、組み換え植物ウイルスを生産
する。組み換え植物ウイルスの核酸または組み換え植物
ウイルスを使用して宿主植物を感染させる。組み換え植
物ウイルスの核酸は宿主の中で複製し、宿主の中で組織
的広がりをし、そして宿主の中で１または２以上の外来
遺伝子を転写または発現して所望の生産物を生産するこ
とができる。
【００２５】明細書および請求の範囲（ここにおいてこ
のような用語に与えた範囲を包含する）の明瞭なかつ首
尾一貫した理解を提供するために、次の定義を提供す
る：隣接する ：規定した配列に対して直ぐに５′または３′
のヌクレオチド配列の中の位置。アンチセンスの機構 ：翻訳されているmRNAの少なくとも
一部分に対して相補的である RNA分子が細胞の中に存在
するために、タンパク質へのmRNAの翻訳速度をコントロ
ールすることに基づく遺伝子の調節の１つのタイプ。
【００２６】細胞培養物：未分化のまたは分化した状態
であることができる細胞の増殖する塊。キメラの配列または遺伝子 ：少なくとも２つの異種部分
から誘導化されたヌクレオチド配列。配列は DNAまたは
RNAからなることができる。コーディング配列 ：転写および翻訳されたとき、細胞の
ポリペプチドの形成を生ずるデオキシリボヌクレオチド
配列、あるいは翻訳されたとき、細胞のポリペプチドの
形成を生ずるリボヌクレオチド配列。
【００２７】適合性：ある系の他の成分を使用して作用
する能力。ある宿主と適合性であるベクターまたは植物
ウイルスの核酸は、その宿主の中で複製することができ
るものである。ウイルスのヌクレオチド配列と適合性で
ある外殻タンパク質は、そのウイルスの配列を包膜する
ことができるものである。遺伝子 ：明確な細胞生産物の原因となる明確な核酸配
列。宿主 ：ベクターまたは植物ウイルスの核酸を複製するこ
とができかつウイルスのベクターまたは植物ウイルスの
核酸を含有するウイルスにより感染されるすることがで
きる細胞、組織または生物。この用語は、適当ならば、
原核生物および真核生物の細胞、器官、組織または生物
を包含することを意図する。
【００２８】感染：ウイルスがその核酸を宿主の中に転
移するか、あるいは宿主の中に核酸を導入する能力、そ
の宿主の中でウイルスの核酸を複製され、ウイルスのタ
ンパク質は合成され、そして新しいウイルス粒子が組み
立てられる。これに関して、用語「伝達可能」および
「感染力」をここにおいて互換的に使用する。非天然 ：サブゲノムのmRNAの生産を促進する非天然 RNA
配列であって、これは次のものを包含するが、これらに
限定されない：１）植物ウイルスのプロモーター、例え
ば、ORSVおよびブローム(vrome) モザイクウイルス、
２）他の生物からのウイルスのプロモーター、例えば、
ヒトシンドビスウイルスのプロモーター、および３）合
成プロモーター、
【００２９】表現型の特性：遺伝子の発現から生ずる観
察可能な性質。植物細胞 ：原形質体および細胞壁から成る、植物の構造
的および生理学的単位。植物の器官 ：植物の明確なかつ可視の分化した部分、例
えば、根、茎、葉または胚。植物の組織 ：植物界または培養物の中の植物の組織。こ
の用語は全植物、植物細胞、原形質体、細胞培養物、ま
たは構造的または機能的単位に有機化された植物細胞の
グループを包含することを意図する。
【００３０】生産細胞：ベクターまたはウイルスのベク
ターを複製することができるが、必ずしもウイルスに対
する宿主であることは必要ではない、細胞、組織または
器官。この用語は原核生物および真核生物の細胞、器
官、組織または生物、例えば、細菌、酵母菌および植物
の組織を包含することを意図する。プロモーター ：コーディング配列の転写の開始に関係す
るコーディング配列に隣接する５′−フランキング非コ
ーディング配列。原形質体 ：細胞壁をもたず、細胞培養物または全植物に
再生する潜在的能力を有する、分離された植物細胞。
【００３１】組み換え植物ウイルスの核酸：非天然核酸
配列を含有するように修飾された植物ウイルスの核酸。組み換え植物ウイルス ：組み換え植物ウイルスの核酸を
含有する植物ウイルス。サブゲノムのプロモーター ：ウイルスの核酸のサブゲノ
ムのmRNAのプロモーター。実質的な配列の相同性 ：互いに実質的に機能的に同等で
あるヌクレオチド配列を意味する。実質的な配列の相同
性を有するこのような配列の間のヌクレオチドの差は、
遺伝子産生物またはこのような配列によりコードされる
RNAの機能に影響を与える小さすぎるであろう。
【００３２】転写： DNA配列の相補的コピーとしての R
NAポリメラーゼによる RNA分子の生産。ベクター ：細胞の間で DNAセグメントを転移する自己複
製性 DNA分子。ウイルス ：タンパク質の中に包膜された核酸から構成さ
れた感染性因子。ウイルスは、前述したように１成分か
ら成るウイルス、２成分から成るウイルス、３成分から
成るウイルスまたは多成分から成るウイルスであること
ができる。
【００３３】本発明は、組み換え植物ウイルスの核酸を
含有する組み換え植物ウイルスによるか、あるいは植物
宿主の感染した組織の中で転写または発現される１また
は２以上の非天然の核酸配列を含有する組み換え植物ウ
イルスの核酸による、植物宿主の感染を提供する。コー
ディング配列の生産物は植物から回収されることができ
るか、あるいは植物において表現型の特性、例えば、雄
性不捻性を引き起こすことができる。
【００３４】本発明は、ある数の利点を有し、それらの
１つは標的生物の形質転換および再生が不必要であるこ
とである。他の利点は、標的生物のゲノムの中に所望の
コーディング配列組み込むベクターを開発することが不
必要であることである。存在する生物は、胚細胞を通る
必要なしに、新しいコーディング配列で変更することが
できる。本発明は、また、所望の生物、組織、器官また
は細胞にコーディング配列を適用するというオプション
を提供する。組み換え植物ウイルスの核酸は、また、外
来コーディング配列に対して安定であり、そして組み換
え植物ウイルスまたは組み換え植物ウイルスの核酸は植
物宿主の中で組織的感染を行うことができる。
【００３５】本発明によるキメラの遺伝子およびベクタ
ーおよび組み換え植物ウイルスの核酸は、この分野にお
いてよく知られている技術を使用して構成される。適当
な技術は、Molecular Cloning （７）;Methodsin Enzym
ol.(９）; およびDNA Cloning （８）に記載された。媒
質の組成はMiller,J.H.(15) 、ならびに前述の参考文献
に記載された。 DNAの操作および酵素の処理は、製造業
者が推奨する手順により実施される。
【００３６】本発明の重要な特徴は、適合性植物宿主の
中で複製および組織的広がりを行うことができ、そして
植物宿主の中で隣接する核酸配列の転写または発現をす
ることができる、組み換え植物ウイルスの核酸(RPVNA)
の調製である。 RPVNAをさらに修飾して天然外殻タンパ
ク質のコーディング配列のすべてまたは一部分を欠失
し、そして天然サブゲノムのプロモーターまたは１つの
非天然サブゲノムのプロモーターコントロール下に非天
然外殻タンパク質のコーディング配列を含有するように
するか、あるいは天然外殻タンパク質のコーディング配
列を非天然植物ウイルスのサブゲノムのプロモーターの
コントロール下に置くことができる。適当なウイルスの
部分的リストは前述した。ヌクレオチド配列はRNA,DNA,
cDNAまたは化学的に合成した RNAまたは DNAであること
ができる。
【００３７】本発明の特徴のいずれかを達成する第１工
程は、植物ウイルスの核酸の生物学的機能を破壊しない
で、１または２以上の非天然サブゲノムのプロモーター
が植物ウイルスの核酸の中に挿入されるように、既知の
普通の技術により植物ウイルスの核酸のヌクレオチド配
列を修飾することである。サブゲノムのプロモーター
は、組み換え植物ウイルスの核酸または組み換え植物ウ
イルスにより感染した植物宿主の中で隣接する核酸配列
を転写または発現することができる。天然外殻タンパク
質のコーディング配列を２つの態様において欠失し、第
２の態様において非天然サブゲノムのプロモーターのコ
ントロール下に配置するか、あるいは他の態様において
保持することができる。
【００３８】それを欠失するか、あるいはそうでなけれ
ば不活性化する場合、非天然外殻タンパク質の遺伝子を
１つの非天然サブゲノムのプロモーターのコントロール
下に挿入するか、あるいは必要に応じて天然外殻タンパ
ク質の遺伝子のサブゲノムのプロモーターのコントロー
ル下に挿入する。この非天然外殻タンパク質は組み換え
植物ウイルスの核酸を包膜して、組み換え植物ウイルス
を生産することができる。こうして、組み換え植物ウイ
ルスの核酸は、天然または非天然の外殻タンパク質のコ
ーディング配列であることができる。外殻タンパク質の
コーディング配列を１つの天然または非天然のサブゲノ
ムのプロモーターのコントロール下に含有する。外殻タ
ンパク質は、植物宿主の組織的感染に関係する。
【００３９】この要件を満足し、したがって適当である
ウイルスのいくつかは、タバコモザイクウイルスのグル
ープからのウイルス、例えば、タバコモザイクウイルス
(TMV) 、ササゲモザイクウイルス(CMV) 、アルファルフ
ァモザイクウイルス(AMV) 、キュウリ緑斑点モザイクウ
イルスのスイカ株(CGMMV−W)およびカラスムギモザイク
ウイルス(OMV) およびスズメノチャヒキモザイクウイル
スのグループからのウイルス、例えば、スズメノチャヒ
キモザイクウイルス(MBV) 、ソラマメ斑点ウイルスおよ
びササゲ白化斑点ウイルスを包含する。追加の適当なウ
イルスは、イネ壊死ウイルス(RNV) 、およびジェミニウ
イルス、例えば、トマトゴールデン(golden)モザイクウ
イルス(TGMV)、カッサバ潜在ウイルス(CLV) およびトウ
モロコシ茎ウイルス(MSV) を包含する。適当なウイルス
のこれらのグループの各々は下で特徴づける。
【００４０】タバコモザイクウイルスのグループ タバコモザイクウイルス(TMV) はトバモウイルス(Tobam
oviruses) の１構成員である。 TMVヴィリオンは管状フ
ィラメントであり、そして単一の右巻きヘリックスで配
置された外殻タンパク質のサブユニットからなり、一本
鎖 RNAがヘリックスの旋回部分の間にはさまれている。
TMVはタバコならびに他の植物を感染する。 TMVは機械
的に伝達され、そして土または乾燥した葉組織の中に１
年またはそれ以上の間感染性に止まることができる。TM
Vヴィリオンは３より小さいか、あるいは８より大きいp
Hの環境に暴露するか、あるいはホルムアルデヒドまた
はヨウ素により不活性化することができる。TMVの調製
物は、植物の組織から(NH4)2SO4 沈澱および引き続く分
別遠心により得ることができる。
【００４１】TMV一本鎖 RNAゲノムは約6400ヌクレオチ
ドの長さであり、そして５′末端においてキャップされ
ているが、ポリアデニル化されていない。ゲノム RNA
は、約130,000 (130Ｋ) の分子量のタンパク質および分
子量約180,000 (180Ｋ）のリードスルーにより生産され
た他のタンパク質のmRNAとして働く。しかしながら、そ
れは外殻タンパク質の合成のためのメッセンジャーとし
て機能することができない。他の遺伝子は感染の間にモ
ノシストロン性３′−コタ−ミナルサブゲノムmRNAの形
成により発現され、このmRNAは17.5Ｋの外殻タンパク質
をエンコードするもの(LMC) および30Ｋのタンパク質を
エンコードするもの（Ｉ2 ）を包含する。30Ｋのタンパ
ク質は感染した原形質体において検出され（16）、そし
てそれは感染した植物の中のウイルスの細胞対細胞の輸
送に関係する（17）。２つの大きいタンパク質の機能は
未知である。
【００４２】ゲノムのＩ2 および LMCの RNAに相当する
二本鎖 RNAを包含する、いくつかの二本鎖 RNA分子は、
TMVで感染した植物の組織の中で検出された。これらの
RNA分子は、多分、異なるメカニズムにより起こるよう
に思われるゲノムの複製および／またはmRNA合成のプロ
セスにおける中間体である。TMVのアセンブリーは植物
細胞の細胞膜の中で明らかに起こるが、 TMVのアセンブ
リーは、 ctDNAの転写体が精製した TMVヴィリオンの中
で検出されたので、葉緑体の中で起こるうることが示唆
された。 TMVのアセンブリーは、外殻タンパク質のリン
グ形集合体（「ディスク」)(各ディスクは17サブユニッ
トの２層から成る）および RNAの中の独特の内部の核化
部位との間の相互作用により起こる；TMVの共通の株の
中の３′末端からの約 900ヌクレオチドのヘアビン領
域。
【００４３】この部位を含有するサブゲノムの RNAを含
む RNAはヴィリオンの中にパッケージされることができ
る。ディスクは RNAとの相互作用のとき明らかにらせん
の形態を取り、次いでアセンブリー（伸長）は両者の方
向に進行する（しかし核化部位から３′→５′方向にお
いて非常にいっそう急速に）。トバモウイルス(Tobamov
iruses) の他の構成員であるキュウリ緑斑点モザイクウ
イルスのスイカ株(CGMMV−W)は、キュウリのウイルスに
関係づけられる。Noru,Y. ら（18）。 CGMMV−W の外殻
タンパク質は、 TMVおよび CGMMVの両者の RNAと相互作
用して、in vitroでウイルス粒子をアセンブリングす
る。Kurisuら（19）。
【００４４】トバモウイルスのグループのいくつかの株
は、起源のアセンブリーの位置に基づいて、２つのサブ
グループに分割される。Fukuda,M. ら（20）。サブグル
ープＩは、ブルガレ(vulgare) 、OM、およびトマトの株
を包含し、 RNAゲノムの３′末端からの約800 〜1000ヌ
クレオチドのアセンブリーの起源を外殻タンパク質のシ
ストロンの外側に有する。Lebeurier, G. ら（21）：お
よびFukuda, M.ら（22）。サブグループIIは、CGMMV W
およびコーンピア(cornpea) 株(Cc)を包含し、RNAゲノ
ムの３′末端からの約 300〜500 ヌクレオチドのアセン
ブリーの起源を外殻タンパク質のシストロンの内側に有
する。Fukuda, M.ら（22）。 CGMMV−Wの外殻タンパク
質のシストロンは、３′末端からヌクレオチド 176−66
1 に位置する。３′非コーディング配列は 175ヌクレオ
チドの長さである。アセンブリー起源は、外殻タンパク
質のシストロン内に位置する。Moshi, T. ら（23）。
【００４５】スズメノチャヒキモザイクウイルスのグル
ープ スズメノチャヒキモザイクウイルス（BV）は、プロモウ
イルスと普通に呼ばれる、３成分から成る一本鎖 RNAを
含有する植物ウイルスのグループの１構成員である。ブ
ロモウイルスの各構成員は、狭い範囲の植物を感染す
る。ブロモウイルスの機械的伝達は容易に起こりそして
いくつかの構成員は甲虫により伝達される。BVに加え
て、他のプロモウイルスは、ソラマメ斑点ウイルスおよ
びササゲ白化斑点を包含する。
【００４６】典型的には、ブロモウイルスのヴィリオン
は二十面体であり、約26mmの直径をもち、単一種の外殻
タンパク質を含有する。ブロモウイルスのゲノムは、線
状の正のセンスの一本鎖 RNAの３つの分子を有し、そし
て外殻タンパク質のmRNAはまた包膜されている。 RNAの
各々はキャップド５′末端および３′末端にtRNA様構造
（チロシンを受容する）。ウイルスのアセンブリーは細
胞質の中で起こる。BMV の完全なヌクレオチド配列は、
Alquist ら（24）により同定され、そして特徴づけられ
た。
【００４７】イネ壊死ウイルス イネ壊死ウイルスは、ポティウイルス(Potyviruses) の
ジャガイモウイルスＹグループの１構成員である。イネ
壊死ウイルスのヴィリオンは、１タイプの外殻タンパク
質（分子量約32,000〜約36,000) および１分子の線状正
センスの一本鎖RNAからなる屈曲性のフィラメントであ
る。イネ壊死ウイルスはポルブムブクサ・アラミニス(P
olyvmxa araminis)(植物、藻類および真菌、かびの中に
見いだされる真核生物の寄生体により伝達される。
【００４８】ジェミニウイルス ジェミニウイルスは、ヴィリオンが独特の形態をもつ、
小さい一本鎖 DNA含有植物ウイルスのグループである。
各ヴィリオンは、単一のタイプnoタンパク質（約 2.7〜
3.4 ×104 の分子量をもつ）から構成された、１対の同
じ大きさの粒子（不完全な二十面体）から成る。各ジェ
ミニウイルスは、１分子の円形の正のセンスの一本鎖 D
NAを含有する。いくつかのジェミニウイルス（すなわ
ち、カッサバ潜在ウイルスおよびマメのゴールデンモザ
イクウイルス）において、ゲノムは２つの一本鎖 DNA分
子を含有する２成分から成るように思われる。
【００４９】任意の適当な植物ウイルスの核酸を利用し
て、本発明の組み換え植物ウイルスの核酸を調製するこ
とができる。植物ウイルスのヌクレオチド配列は、普通
の技術を利用して、１または２以上のサブゲノムのプロ
モーターを植物ウイルスの核酸の中に挿入することによ
って修飾される。サブゲノムのプロモーターは、特定の
宿主植物の中で機能することができる。例えば、宿主が
タバコである場合、TMV が利用されるであろう。挿入さ
れたサブゲノムのプロモーターはTMV 核酸と適合性でな
くてはならず、そしてタバコの中で隣接する核酸配列の
転写または発現を指令することができる。天然外殻タン
パク質の遺伝子は、また、保持されることができ、そし
て非天然の核酸配列は後述するように融合タンパク質を
つくるためにその中に挿入することができる。この例に
おいて、非天然外殻タンパク質の遺伝子も利用される。
【００５０】天然または非天然の外殻タンパク質の遺伝
子は、組み換え植物ウイルスの核酸の中で利用される。
どの遺伝子が利用されても、その天然サブゲノムのプロ
モーターに隣接するか、あるいは他の利用可能なサブゲ
ノムのプロモーターに隣接して位置することができる。
非天然外殻タンパク質は、天然外殻タンパク質について
の場合におけるように、組み換え植物ウイルスの核酸を
包膜し、そして宿主植物の中で組み換え植物ウイルスの
核酸の組織的広がりを提供することができる。外殻タン
パク質は、問題の植物宿主の中で組織的感染を提供する
ように選択される。例えば、 TMV−O 外殻タンパク質は
Ｎ．ベンタミアナ(benthamiana) の中で組織的感染を提
供するが、TMV U1外殻タンパク質はニコチアナ・タバク
ム(N.tabacum) の中で組織的感染を提供する。
【００５１】組み換え植物ウイルスの核酸は、ウイルス
の核酸を適当な生産細胞の中でクローニングすることに
よって調製される。ウイルスの核酸が DNAである場合、
それは普通の技術を使用して適当なベクターの中に直接
クローニングすることができる。１つの技術は、複製起
源を生産細胞と適合性のウイルス DNAに取り付けること
である。ウイルスの核酸が RNAである場合、ウイルスの
ゲノムの全長の DNAコピーをまずよく知られている手順
により調製する。例えば、ウイルス RNAを逆転写酵素を
使用して DNAの中に転写してサブゲノムの DNA片を生産
し、そして二本鎖 DNAを DNAポリメラーゼを使用して作
る。
【００５２】次いでこの DNAを適当なベクターの中にク
ローニングし、そして生産細胞の中にクローニングす
る。 DNA片をマッピングし、そして適切な配列の中で組
み合わせて、必要に応じて、ウイルス RNAゲノムの全長
の DNAコピーを生産する。次いで、外殻タンパク質の遺
伝子をもつか、あるいはもたないサブゲノムのプロモー
ターのための DNA配列を、利用する本発明の特定の態様
従い、核酸の中の非必須部位の中に挿入する。非必須部
位は、植物ウイルスの核酸の生物学的性質に影響を与え
ない部位である。 RNAゲノムは感染性因子であるので、
生産細胞の中で RNAが生産されるようにcDNAは適当なプ
ロモーターに隣接して位置する。キャップド RNAが感染
性因子である場合、 RNAは普通の技術を使用してキャッ
プされる。
【００５３】本発明の第２の特徴は、植物宿主の中で転
写されることができる１または２以上の非天然の核酸配
列をさらに含む組み換え植物ウイルスの核酸である。非
天然の核酸配列は、使用する特定の態様に依存して、非
天然ウイルスのサブゲノムのプロモーターおよび／また
は天然外殻タンパク質の遺伝子に隣接して配置される。
非天然の核酸配列は普通の技術により挿入されるか、あ
るいは融合タンパク質が生産されるように、非天然の核
酸配列は天然外殻タンパク質のコーディング配列の中に
あるいはそれに隣接して挿入することができる。転写さ
れる非天然の核酸配列は、アンチセンスメカニズムによ
り表現型の特性の発現を調節することができる RNAとし
て転写されることができる。
【００５４】あるいは、組み換え植物ウイルスの核酸の
中の非天然の核酸配列は、植物宿主の中で転写および翻
訳して、表現型の特性を生成することができる。１また
は２以上の非天然の核酸配列は、また、１より多い表現
型の特性の発現をコードすることができる。どのウイル
スのサブゲノムのプロモーターを使用しても、１または
２以上の非天然の核酸配列が適切な向きにあるように、
普通の技術を使用して、非天然の核酸配列を含有する組
み換え植物ウイルスの核酸は構成される。
【００５５】植物細胞の中の有用な表現型の特性は、次
のものを包含するが、これらに限定されない：除草剤に
対する改良された許容度、熱または冷たさ、乾燥、塩分
または浸透圧のストレスに対する改良された許容度；病
害虫（昆虫、線虫またはダニ）または病気（真菌、か
び、細菌またはウイルス）に対する改良された耐性；酵
素または二次的代謝物の生産；雄性または雌性の不捻
性；矮化；早い成熟；改良された収量、成長力、雑種強
勢、栄養の量、芳香または加工の性質など。他の例は、
商業的使用のために重要なタンパク質または生産物、例
えば、リパーゼ、メラニン、色素、抗体、ホルモン、製
剤、抗生物質などを包含する。他の有用な表現型の特性
は、分解または阻止酵素、例えば、モルトになるオオミ
ギの根の発育を防止または阻止するために利用されるよ
うなものの生産である。表現型の特性は、また、その生
産がバイオリアクターにおいて望まれるような二次代謝
物であることができる。
【００５６】組み換え植物ウイルスの核酸または組み換
え植物ウイルスの核酸の相補的コピーの二本鎖 DNAを、
生産細胞の中にクローニングする。ウイルスの核酸が R
NA分子である場合、生産細胞と適合性であるプロモータ
ーに核酸（cDNA）をまず取り付ける。次いで、生産細胞
と適合性である適当なベクターの中に、 RPVNAをクロー
ニングすることができる。この方法において、キメラの
ヌクレオチド配列の RNAコピーのみが生産細胞の中で生
産される。例えば、生産細胞が大腸菌(E.coli)である場
合、 Iacプロモーターを使用することができる。
【００５７】生産細胞が植物細胞である場合、CaMVプロ
モーターを使用することができる。ウイルス RNAが生物
学的活性のためにキャップしなくてはならない場合、生
産細胞は真核生物、例えば、酵母菌、植物または動物の
細胞であることができる。あるいは、生産細胞と適合性
であるプロモーター隣接するベクターの中に RPVNAを挿
入する。ウイルスの核酸が DNA分子である場合、生産細
胞と適合性である複製起源にそれを取り付けることによ
って、それを生産細胞の中に直接クローニングすること
ができる。この方法において、キメラのヌクレオチド配
列の DNAコピーが生産細胞の中で生産される。
【００５８】プロモーターは、 DNAに結合しかつ RNA合
成を開始するように RNAポリメラーゼを指令する DNA配
列である。強いプロモーターおよび弱いプロモーターが
存在する。強いプロモーターの中には、lacuv5, trp, t
ac, trp −lacuv5, λp1, ompF、および blaがある。大
腸菌(E.coli)の中で外来遺伝子を発現するために有用な
プロモーターは、強くかつ調節されるプロモーターであ
る。バクテリオファージλのλp1プロモーターは、強
く、よく調節されたプロモーターである。Hedgpeth,J.
M. ら（25）;Bernard,H.M. ら（26）;Remaut,E.P.ら（2
7）。
【００５９】温度感受性λリプレッサーをエンコードす
る遺伝子、例えば、λclts 857をクローニングベクター
の中に含めることができる。Bernard ら（26）。低い温
度（31℃）において、ｐ1 プロモーターはcI−遺伝子産
生物により抑制された状態に維持される。温度を上昇さ
せると、リプレッサーの活性は破壊される。次いで、ｐ
1 プロモーターは大量のmRNAの合成を指令する。このよ
うにして、大腸菌(E.coli)生産細胞は、ベクター内でエ
ンコードされた生産物の生産前に、所望の濃度に成長す
ることができる。同様に、温度感受性プロモーターは所
望の時間に培養温度を調節することによって活性化され
る。
【００６０】非常に高いコピー数を条件的に獲得するこ
とができるプラスミドを組み立てることは有利であるこ
とがある。例えば、lac またはtac を含有するpAS2プラ
スミドは42℃において非常に高いコピー数を達成するで
あろう。次いで、pAS2プラスミドの中に存在する lacリ
プレッサーをイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド
により不活性化して、mRNAを合成させる。RPVNAをつく
るときの他の別法は、１より多い核酸を調製すること
（すなわち、多成分から成るウイルスのベクター構成体
に必要な核酸を調製すること）である。この場合におい
て、各核酸はそれ自身のアセンブリー起源を必要とする
であろう。各核酸はサブゲノムのプロモーターおよび非
天然の核酸配列を含有するように調製することができ
る。
【００６１】あるいは、１成分から成るウイルスの核酸
の中に非天然の核酸配列を挿入すると、２つの核酸（す
なわち、２成分から成るウイルスのベクターの発生に必
要な核酸）を生成することができる。天然核酸のコーデ
ィング配列のあるものの複製および翻訳から離れた非天
然の核酸配列の複製および転写または発現を保持しよう
とするとき、これは有利であろう。各核酸はそれ自身の
アセンブリー起源をもたなくてはならないであろう。本
発明の第３の特徴は、ウイルスまたはウイルス粒子であ
る。このウイルスは、包膜された前述のRPVNA からな
る。次いで、生ずる生産物は適当な植物宿主を感染する
ことができる。 RPVNA配列を植物宿主内で転写および／
または翻訳して、所望の生産物を生産する。
【００６２】本発明の１つの態様において、組み換え植
物ウイルスの核酸は異種キャプシドにより包膜される。
最も普通には、この態様は棒状キャプシドを使用する。
なぜなら、それはより幾何学的に構成された二十面体の
キャプシドまたは球形のキャプシドより長い RPVNAを包
膜する能力を有するからである。棒状キャプシドの使用
は、より大きい非天然の核酸配列の組み込みを可能とし
て RPVNAを形成する。このような棒状キャプシドは、 R
PVNAの中に１より多い非天然の核酸配列が存在すると
き、最も有利である。
【００６３】本発明の他の特徴は、前述の RPVNAを含有
するベクターである。RPVNA は、生産細胞のプロモータ
ーまたは生産細胞と適合性の複製起源から成る群より選
択されるヌクレオチド配列に隣接して存在する。このベ
クターを利用して生産細胞を形質転換し、次いでこの生
産細胞はある量で RPVNAを生産するであろう。生産細胞
はこのベクターと適合性の任意の細胞であることがで
き、そして原核生物または真核生物の細胞であることが
できる。しかしながら、ウイルスRNA(RPVNA)をキャップ
して活性としなくてはならない場合、生産細胞、例え
ば、真核生物の生産細胞はウイルス RNAをキャッピング
することができなくてはならない。
【００６４】本発明の他の特徴は、組み換え植物ウイル
スまたはウイルスの核酸が感染した宿主である。宿主の
中に導入後、宿主は自己複製性、包膜および組織的広が
りをすることができる RPVNAを含有する。宿主は普通の
技術により組み換え植物ウイルスで感染することができ
る。適当な技術は、次のものを包含するが、これらに限
定されない：葉の剥離、溶液の中の剥離、高い速度の水
の噴霧および宿主の他の損傷ならびに組み換え植物ウイ
ルスを含有する水を宿主の種子に吸収させる。さらに詳
しくは、適当な技術は次のものを包含する：
【００６５】（ａ）手による接種 包膜されたベクター
の手による接種は、中性のpHの低いモル濃度のリン酸塩
緩衝液を使用して、セリットまたはカーボランダム（通
常約１％）を添加して実施する。１〜４滴の調製物を葉
の上表面に置き、そしておだやかにこする。 （ｂ）植物ベッドの機械化した接種 植物ベッドの接種
は、葉を切断しながらトラクター駆動草刈機の中にベク
ター溶液を噴霧（CO2 噴射）することによって実施す
る。あるいは、植物ベッドを草刈りし、そして切断した
葉の上にベクター溶液を直ちに噴霧する。 （ｃ）単一の葉の高圧噴霧 単一の植物の接種は、ま
た、ほぼ１％のカーボランダムを緩衝化ベクター溶液の
中に含有する狭い方向づけられた噴霧（50psi 、葉から
６〜12インチ）で噴霧することによって実施する。
【００６６】RPVNAを植物宿主の中に導入する別の方法
は、Grimsley, N.ら（28）に記載されているアグロ感染
(agroinfeetion) または癌腫菌(Agrobacterium) 仲介形
質転換（時にはアグロー感染と呼ばれる）として知られ
ている技術である。この技術は、宿主細胞の中に癌腫菌
(Agrobacterium) の DNAの一部分を転移することによっ
て植物をコロニー化する癌腫菌(Agrobacterium) の普通
の特徴を使用し、ここでそれは核の DNAの中に組み込ま
れるようになる。 T−DNA は25塩基対の長さである境界
配列により定められ、そしてこれらの境界配列の間の D
NAは植物細胞の中に同様によく転移される。 T−DNA の
境界配列の間の RPVNAの挿入は RPVNAを植物細胞の中に
転移させ、ここで RPVNAは複製され、次いで植物を通し
て組織的に広がる。
【００６７】アグロー感染はジャガイモ紡錘体塊茎ウイ
ロイド(PSTV)(Gardner,R.C. ら（29)); CaV(Grimsley,
N.ら (30))：MSV(Grimsley, N.ら（28）前掲）およびLa
zarowitz,S.C.(31))、メヒシバ茎ウイルス(Donson,J.ら
（32))、コムギ矮化ウイルス(Hayes, R.J.ら(33)) およ
びトマトゴールデンモザイクウイルス(TGMV)(Elmer,J.
S.ら（34))およびGardner, W.E. ら(35)) を使用して達
成された。したがって、感受性植物のアグロー感染は、
上のウイルスの任意のもののヌクレオチド配列に基づく
RPVNA培養室ヴィリオンを使用して達成することができ
るであろう。
【００６８】本発明のなお他の特徴は、特定したポリペ
プチドまたはタンパク質の生産物を生産する方法であ
り、このような生産物は、例えば、酵素、複雑な生物分
子、リボザイム、またはアンチセンス RNAから生ずるポ
リペプチドまたはタンパク質の生産物であるが、これら
に限定されない。このような生産物は次のものを包含す
るが、これらに限定されない：IL−1,IL−2,IL−3,…IL
−12など；EPO: G−CSF,GM−CSF, hPG−CSF, M−CSF な
どを包含する CSF；因子VIII；因子IX；tPA ； hGH；受
容体および受容体のアンタゴニスト；抗体；ニューロー
ポリペプチド；メラニン；インスリン；ワクチンなど。
【００６９】RPVNAの非天然の核酸配列は、所望の生産
物の生産に導く転写可能な配列からなる。この方法は、
組み換えウイルスまたは組み換え植物ウイルスの核酸、
例えば、前述のもので適当な植物宿主を感染させ、感染
した宿主を成長させて所望の生産物を生産し、そして必
要に応じて、所望の生産物を単離することを包含する。
感染した宿主の成長は、生ずる生産の単離と同様に、普
通の技術に従う。
【００７０】例えば、タンパク質、例えば、ネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ(NPTII) 、α−トリコサン
シン、イネα−アミラーゼ、ヒトα−ヘモグロビンまた
はヒトβ−ヘモグロビンのためのコーディング配列を、
欠失されている TMV外殻タンパク質のコーディング配列
のプロモーターに隣接して挿入する。他の例において、
チロシナーゼのコーディング配列、例えば、ストレプト
ミマイセス・アンティバイオディカス(Streptomyces an
tibioticus) から単離されたものを、 TMV、カラスムギ
モザイクウイルス(OMV) またはイネ壊死ウイルス(RNV)
の同一のプロモーターに隣接して挿入する。
【００７１】組み換えウイルスは、前述したように、生
ずる組み換え植物ウイルスの核酸を使用して調製するこ
とができる。タバコまたは発芽するオオミギを組み換え
ウイルスまたは組み換え植物ウイルスの核酸で感染させ
る。ウイルスの核酸は植物の組織の中で自己複製して、
酵素のアミラーゼまたはチロシナーゼを生産する。この
チロシナーゼの活性はメラニンの生産に導く。例えば、
Huber, M. ら（36）を参照のこと。
【００７２】他の例において、シクロデキストリングル
カノトランスフェラーゼのコーディング配列、例えば、
バチルス(Bacillus)種No.17 −１から単離されたもの
（米国特許第 4,135,977号参照) を、OMV,RNV,PVY また
はPVX から誘導化されたヌクレオチド配列のウイルスの
外殻タンパク質のプロモーターに隣接して挿入し、ここ
で外殻タンパク質のコーディング配列は除去されてお
り、次いで非天然プロモーターおよび外殻タンパク質の
遺伝子を含有する。トウモロコシまたはジャガイモを適
当な組み換えウイルスまたは組み換え植物ウイルスの核
酸で感染させて、酵素のシクロデキストリングルコトラ
ンスフェラーゼを生産する。この酵素の活性は、香味剤
としてあるいは薬物放出に有用であるシクロデキストリ
ンの生産に導く。
【００７３】ある植物において、生産物としてアンチセ
ンス RNAの生産は、ある種の表現型の特性の発現を防止
するために有用である。とくに、薬物として乱用される
物質を生産する（例えば、コカインはコカ植物から誘導
化され、そしてテトラヒドロカンナビノール(THC）は大
麻またはマリファナ植物から誘導化された乱用の活性物
質である）。乱用可能な物質の生産に必要な植物 RNAに
対して相補的なアンチセンス RNAは、この物質の生産を
防止するであろう。これは法で禁じられた薬物の供給を
減少する有効な道具であることが証明することができる
であろう。
【００７４】本発明のなお他の特徴は、有機化合物の立
体特異的触媒作用に適当な酵素を生産する方法である。
非天然の核酸配列は、所望の生産物の生産に導く転写可
能な配列からなる。この方法は組み換えウイルスまたは
組み換え植物ウイルスの核酸、例えば、前述のもので適
当な宿主を感染させ、感染した宿主を成長させて所望の
生産物を生産させ、そして所望の生産物を単離すること
を包含する。感染した宿主の成長は、生ずる生産物の単
離と同様に、普通の技術従う。次いで、立体特異的酵素
を利用して所望の反応を触媒する。立体特異的酵素の１
つの使用はラセミ体混合物の分割である。
【００７５】１つの例において、適当なエステラーゼま
たはリパーゼのコーディング配列、例えば、適当な微生
物から単離されたものを TMV、カラスムギモザイクウイ
ルス(OMV) またはイネ壊死ウイルス(RNV) から誘導化さ
れたヌクレオチド配列のウイルスの外殻タンパク質のプ
ロモーターに隣接して挿入し、ここで外殻タンパク質の
コーディング配列は除去されており、次いで非天然プロ
モーターおよび外殻タンパク質の遺伝子を含有する。タ
バコまたは発芽するオオミギを組み換えウイルスまたは
組み換え植物ウイルスの核酸で感染させて、エステラー
ゼまたはリパーゼの酵素を生産する。この酵素を単離し
そして、欧州特許出願公開（EP−A)第 0233656号または
欧州特許出願公開（EP−A)第 0227078号に記載されてい
るように、ナプロキセンのような化合物の立体特異的調
製において使用する。
【００７６】エステラーゼのコーディング配列を適当な
微生物、例えば、次のものから単離する：枯草菌(Bacil
lus subtilis) 、バシラス・リヘニフォルミス(Bacillu
s licheniformis)（この種の試料はアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(American Type CultureCo
llection) 米国マリイランド州ロックビレ)(ATCC) に受
け入れ番号11945 で受託された) 、シュードモナス・フ
ルオレセンス(Pseud-omonas fluoreseens) 、シュード
モナス・プチダ(Pseudomonas put- ida)（この種の試料
は発酵研究所(IFO) 、大阪、に受け入れ番号12996 で受
託された) 、シュードモナス・リボフラビナ(Pseudomon
asriboflabina)（この種の試料はIFO に受け入れ番号13
584 で受託された) 、シュードモナス・オバリス(Pseud
omonas ovalis)（この種の試料は応用微生物学研究所(S
AM) 、東京大学、に受け入れ番号1049で受託された) 、
シュードモナス・アエルアニノサ(Pseudomonasaeruanin
osa)(IFO 13130) 、ムコル・アングリマクロオルス(Muc
orangulimacrosporus)(SAM6149)、アルスロバクター・
パラフィネウス(Arthrobacter paraffineus)(ATCC2121
8)、菌株は III−25(CBS 666.86)、菌株LK ３−４(CBS
667.86)、菌株Sp4(CBS 668.86) 、菌株 Thai III 18−
1(CBS 669.86) 、および菌株Thai VI 12(CBS670.86)で
ある。
【００７７】有利には、種枯草菌(Bacillus subtilis)
の培養物は、種バシラス(Bacillus)種 Thai １−８(CBS
679.85)、種バシラス(Bacillus)種 In IV−８(CBS 68
0.85)、種バシラス(Bacillus)種 Nap 10 −N(CBS 805.8
5) 、種バシラス(Bacillus)種Sp 111 4 (CBS 806.85)、
種枯草菌(Bacillus subtilis）１−85(Yuki,S.ら、Japa
n J.Gen.42：251(1967))、枯草菌(Bacillus subtilis)
１−85／ pNAPT−７(CBS 673.86)、枯草菌(Bacillus su
btilis) 1A−40／ pNAPT−８(CBS 674.86)、および枯草
菌(Bacillus subtilis) 1A−40／ pNAPT−７(CBS 675.8
6)の培養物を包含する。有利には、シュードモナス・フ
ルオレセンス(Pseudomonas fluoreseens) の培養物は、
シュードモナス(Pseudomonas) 種Kpr １−６(CBS 807.8
5)およびシュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas
fluoreseens) 種(IFO 3081)の培養物を包含する。
【００７８】リパーゼのコーディング配列は、適当な微
生物、例えば、カンジダ属(Candida) 、リゾプス属(Rhi
zopus)、ムコル属(Mucor) 、アスペルギルス属(Aspergi
lus)、ペニシリウム属(Penicillium) 、シュードモナス
属(Pseudomonas) 、クロモバクテリウム属(Chromobacte
- rium) 、およびゲトリキウム属(Getriehium)から単離
される。カンジダ・シリンドラセア(Candida cylindrac
ea) のリパーゼはとくに好ましい（Qu−Mingら、Tetrah
edron Letts,27、7(1986))。
【００７９】融合タンパク質は、非天然の核酸配列をウ
イルスの核酸の構造遺伝子、例えば、外殻タンパク質の
遺伝子の中に組み込むことによって形成することができ
る。ウイルスの構造遺伝子上の調節部位は機能的に止ま
っている。こうして、タンパク質合成は通常の方法で、
外来遺伝子上のメチオニンのための開始コドンから停止
コドンに起こって、融合タンパク質を生産することがで
きる。融合タンパク質はアミノ末端にウイルスの構造タ
ンパク質の一部分またはすべてを含有し、そしてカルボ
キシ末端に所望の材料、例えば、立体特異的酵素を含有
する。
【００８０】その引き続く使用のために、立体特異的酵
素をまずこの融合タンパク質からの特異的切断により処
理し、次いでさらに精製することができる。臭化シアン
との反応はペプチド配列をメチオニン残基のカルボキシ
末端において切断させる（5.0 、Needle- man,"Protein
Sequence Determination", Springer、1970、N.Y.)。
したがって、この目的に、第２配列はメチオニンのため
の追加のコドンを含有し、これによりメチオニン残基は
融合タンパク質のＮ−末端の天然タンパク質配列とＣ−
末端の外来タンパク質との間に配置されることが必要で
ある。しかしながら、他のメチオニン残基が所望のタン
パク質の中に存在する場合、この方法は失敗する。さら
に、臭化シアンを使用する切断は種々の他のアミノ酸に
おいて二次反応を引き起こすという欠点を有する。
【００８１】あるいは、「リンカー」と呼ぶオリゴヌク
レオチドのセグメントを第２配列とウイルスの配列との
間に配置することができる。このリンカーはタンパク質
分解酵素の伸長した特定の切断部位ならびに特定の切断
部位のアミノ酸配列をコードする（例えば、米国特許第
4,769,326号および米国特許第 4,543,329号を参照のこ
と) 。非天然タンパク質のアミノ末端における融合タン
パク質の中のリンカーの使用は、臭化シアンの切断にお
いて固有の選択的酵素の加水分解による二次反応を回避
する。
【００８２】このようなリンカーの１例は、一般式 Pro
−Xaa Gly−Pro(配列番号：１)(非天然タンパク質のア
ミノ末端）のテトラペプチドであり、ここで Xaaは任意
の所望のアミノ酸である。全体の切断は、まずXaa Gly
結合をコラゲナーゼ(E.C. 3,4,24.3.,クロストリジオペ
プチダーゼ）で選択的に切断し、次いでアミノアシル−
プロリンアミノペプチダーゼ（アミノペプチダーゼ−P,
E.C.3.4.11.9.)でグリシン残基を除去し、そしてプロリ
ンアミノペプチダーゼ(E.C.3.4.11.5.) でプロリン残基
を除去することによって実施する。別法において、アミ
ノペプチダーゼ酵素をポストプロリンジペプチジルアミ
ノペプチダーゼで置換することができる。他のリンカー
および適当な酵素は米国特許第 4,769,326号に記載され
ている。
【００８３】本発明のなお他の特徴は、植物における雄
性不捻性を誘発する方法である。雄性不捻性はいくつか
のメカニズムにより誘発することができ、これらのメカ
ニズムは次のものを包含するが、これらに限定されな
い：アンチセンス RNAのメカニズム、リボザイムのメカ
ニズム、あるいは雄性不捻性または自己不適合性を誘発
するか、あるいは正常の配偶体の発育を妨害することが
できるタンパク質のメカニズム。キメラのヌクレオチド
配列の第２のヌクレオチド配列は、雄性不捻性の誘発に
導く転写可能な配列からなる。この方法は適当な植物を
ウイルス、例えば、前述のもので感染させ、そして感染
した植物を成長させて所望の雄性不捻性を生成すること
を包含する。感染した植物の成長は、普通の技術に従
う。
【００８４】雄性不捻性は植物の中に多数のメカニズム
により誘発することができ、これらのメカニズム次のも
のを包含するが、これらに限定されない：（ａ）花粉の
形成の不存在、（ｂ）不育のおよび／または非機能的花
粉の形成、（ｃ）自己不適合性、（ｄ）自己適合性の阻
害、（ｅ）１または２以上のミトコンドリアの機能の混
乱、（ｆ）正常の配偶体の発育を妨害するホルモンまた
は他の生物分子の生産の変更、または（ｇ）正常雄性配
偶体組織に必要な発育遺伝子の阻害。
【００８５】これらのメカニズムは、アンチセンス RN
A、リボザイム、遺伝子またはタンパク質生産物を使用
することによって達成することができる。本発明の組み
換え植物ウイルスの核酸は、植物の中の雄性不捻性を誘
発するように機能する１または２以上のヌクレオチド配
列を含有する。この機能を達成するために、組み換え植
物ウイルスの核酸はヌクレオチド配列、単一の遺伝子ま
たは１系列の遺伝子を含有することができる。
【００８６】雄性不捻性の特性は、核エンコードされた
雄性不捻性の遺伝子を単離することによって形成するこ
とができるであろう。これらの遺伝子の多くは単一の遺
伝子であることが知られている。例えば、Tanksleyら
（37）は、緊密に連鎖した酵素コーディング遺伝子 Prx
−２の稀な対立遺伝子をもつCIS の中にms−10を配置し
た。 Prx−２対立遺伝子は相互優性であり、戻し交雑の
集団の中の劣性ms−10対立遺伝子を有するヘテロ接合性
植物についての選択を可能とし、そしてハイブリッドの
生産のために親の中に遺伝子を転移する間の子孫の試験
の必要性を排除する。
【００８７】雄性不捻性アントシアニン不含植物（ms−
10aa／ms−10aa）をヘテロ接合性の繁殖能力のある植物
に交雑させ、ここで稀なペルオキシダーゼの対立遺伝子
は劣性雄性不捻性対立遺伝子とシスの関係にあった（ms
−10 Prx−２′／＋Prx −２＋）。雄性不捻性植物を子
孫から選択した（ms−10 Prx−２′／ms−10aa）。いっ
たん雄性不捻性遺伝子が将来の親の系統の中に転移され
ると、不捻性植物を戻し交雑またはＦ2 種子のロットか
ら実生の段階で選択することができる。
【００８８】パールミレットにおいて、劣性雄性不捻性
遺伝子はvg 272およびIP 482の中に見いだされた。パー
ルミレットの系統Vg 272およびIP 482における雄性不捻
性は、単一の劣性遺伝子により本質的にコントロールさ
れる。Vg 272における雄性不捻性は劣性遺伝子、ms、の
ためであり、この劣性遺伝子は花粉母細胞の中で減数分
裂に対する作用をもたず、四分子から微小球の分離後で
あるが最初の有系分裂の分割の開始前に作用する。
【００８９】Dewey ら（39）は、TURF 243と表示する。
雄性不捻性(cms−T)トウモロコシのミトコンドリアから
3574bpの断片を単離しそして特徴づけた。TURF 243は、
12,961Mrおよび24,675Mrのポリペプチドをエンコードす
ることができる２つの長いオープンリーディングフレー
ムを含有する。TURF 243転写体は、核のレストーラー遺
伝子Rf1 およびRf2 により捻性に回復した cms−T 植物
の中で独特に変更されるように思われる。Ｔ細胞質から
のトウモロコシ mtDNAの断片を、ヌクレオチド配列の分
析により特徴づけた。核酸の単離を得るために、ミトコ
ンドリアのRNA(mtRNA)、および mtDNAを、普通の技術に
よりゼア・マイス(Zca Mays)の６〜７日間暗所で成長さ
せた実生から調製した。
【００９０】雄性不捻性の特性を形成することができる
他の手段は、ウイルスから雄性不捻性遺伝子を単離する
ことによる。植物の中で雄性不捻性を誘発するいくつか
のウイルスまたはウイルス様粒子が存在する。最近の研
究が示唆するように、雄性不捻性ビートの中にウイロイ
ド様因子が存在することができる。（40）。細胞質の雄
性不捻性は個々別々の粒子、例えば、プラスミドまたは
封人体により条件づけられることができる。ウイルスは
細胞不捻性組織的の調和をもって種子伝達されない。グ
ラフトユニオン(graft union) を横切るある種類の因子
の転移は、ペチュニア、ビート、ヒマワリ、およびアル
ファルファにおいて証明された。
【００９１】接穂の捻性の直接の効果は存在しないが、
接木した接穂上の維持による自殖または交雑は次の世代
において雄性不捻性植物を生産した。36℃６週、次いで
25℃で成長させた cmsビートは、多分「細胞質の球形の
物体」の排除のために、新しい苗条から捻性植物を生産
したが、これらの植物からの子孫は正常の成長条件にお
いて３世代後に不捻性に復帰した。ソラマメ植物(Vicia
fabal) における細胞質の雄性不捻性は、ウイルスまた
はウイルス様粒子により引き起こされることが発見され
た。多分 cms系に類似する場合がガーリックにおいて起
こる。芽胞体のcms植物に典型的な花粉の退化は葯の中
にリケッチア様封入体を示し、これは抗生物質で排除す
ることができ、花粉は捻性にさせることができるであろ
う（41）。
【００９２】雄性不捻性の特性は、変更したタンパク質
を導入する第３の方法により、トランシットペプチド配
列を使用して形成することができるので、それはミトコ
ンドリアの中に輸送され、そしてミトコンドリアの機能
を混乱させるであろう。このタンパク質は正常のミトコ
ンドリアの機能を圧倒するか、あるいはきわめて重大な
経路において要求される代謝を減少する。ミトコンドリ
アの中のわずかの混乱は雄性不捻性に導くことが広く信
じられている。Remyら（42）は、正常のおよび細胞質の
雄性不捻性Ｂ．ナプス(napus) 系統から葉緑体タンパク
質の２次元の分析を実施した。
【００９３】Ｂ．ナプス(napus) のＮおよび cms系統の
葉緑体およびミトコンドリアの DNAを、制限酵素分析に
より特徴づけそして比較した。同一の制限パターンは、
cmsＢ．ナプス(napus) 系統および cms特性をＢ．ナプ
ス(napus) の中に転移するために使用した日本ハツカダ
イコンの cms系統からの葉緑体について見いだされた。
Remyの研究において、Ｂ．ナプス(napus) のＮおよび c
ms系統のストロマおよびチラコイドからの葉緑体タンパ
ク質を、２−Ｄポリアクリルアミドゲルの分離により特
徴づけそして比較した。（１）２つの系統のストロマの
隔室は非常に類似し、そして（２）系統は ATPアーゼ複
合体からの、カップリング因子CPのβサブユニットに相
当するスポットにより区別することができることが示さ
れた。
【００９４】植物の中で雄性不捻性を誘発する第４の方
法は、正常の配偶体の発育を変更するホルモンを誘発ま
たは阻害する、例えば、花成段階の前またはそのときに
ジベレリン酸の生産を阻止して花粉の形成を混乱させる
か、あるいは花成段階の前またはそのときにエチレンの
生産を変更して花の形成および／または性の発現を変更
することによる。
【００９５】植物の中で雄性不捻性を誘発する第５の方
法は、正常の配偶体の組織のために要求される発育遺伝
子を、例えば、発育のシグナルRNA またはmRNAに対して
相補的であるアンチセンス RNAを使用して、阻害するこ
とによる。Padmaja ら（43）は、ペチュニアの近交系か
ら単離した自発的雄性不捻性突然変異体についての細胞
遺伝学の研究を論じている。雄性不捻性は芽胞嚢の非定
型の挙動に関連することが発見され、延長した核の分
割、および究極的に腺の型から周辺質の型への変換の結
果として退化により特徴づけられた。
【００９６】植物の中で雄性不捻性を誘発する第６の方
法は、自己不適合性遺伝子を単離し、そして本発明のベ
クターの中でその遺伝子を使用することである。異系交
配を促進する自己不適合性（Ｓ）遺伝子系は、被子植物
の族の50％より多くの中に存在する。いくつかの系にお
いて、豊富な花柱の糖タンパク質（Ｓ糖タンパク質）が
同定された。これらの糖タンパク質は多形性であり、そ
して同定されたＳ対立遺伝子と相関関係をもつことがで
きる。Ｎ．アラバ(alaba) およびＢ．オレラセアエ(ole
raceae) の花柱の糖タンパク質に相当するＳ遺伝子は、
クローニングされ、そして配列決定された。アミノ酸の
置換および欠失／挿入は、配列を通して存在するが、対
立遺伝子の特異性をエンコードするように思われる超変
動性の領域に集まる傾向がある。
【００９７】植物の中で雄性不捻性を誘発する第７の方
法は、自己不適合性をブロックし、適合性部位に結合し
かつそれを不活性化するタンパク質を操作するか、ある
いは自己適合性をターンオフし、mRNAと結合するアンチ
センス RNAを自己適合性タンパク質に操作することによ
る。雄性不捻性を生ずる特定の効果は、ちょうど胞子発
生細胞の形成の早い段階から生活可能な花粉を含有する
葯が裂開しない状態までの範囲であることができる。こ
の範囲内の発育段階のいくつかまたはすべては影響を受
けることがある。より明らかな特定の効果のいくつか
は、次の例を包含する：
【００９８】１）減数分裂は崩壊し、花粉の母細胞また
は早い小胞子の退化に導き、この場合において花粉は発
育中断しそして葯の発育は早い段階で阻止される。 ２）外膜の形成は崩壊し、そして小胞子は壁が薄くな
り、多分形状がゆがみ、そして生活不可能である。葯は
一般に外膜より発育するが、まだ正常ではない。 ３）小胞子の液胞は以上であり、でん粉の蓄積が減少
し、そして芽胞嚢の持続性が明らかである。花粉は生活
不可能であり、そして葯はまだ正常ではない。
【００９９】４）花粉は存在し、そして生活可能であ
り、そして葯は正常に見えるが、裂開しないか、あるい
は非常に遅延した裂開を示す。 ５）自己不適合性のメカニズムは花粉粒による花柱の酵
素的消化を崩壊または妨害する。 植物の中の雄性不捻性は、上に列挙したメカニズムによ
り花粉の落下の前の任意の段階において誘発することが
できる。選択した雄性不捻性のメカニズムは畑の中の
（または温室の中の）植物に実生発生後および植物の落
下前の任意の時に適用することができる。適用の正確な
時は、使用する雄性不捻性のメカニズムおよび雄性不捻
性植物を生産する最適な有効性に依存するであろう。
【０１００】
【実施例】以下の例では、相反する指示の無いかぎりメ
ーカーの推奨する手順に従って酵素反応が行なわれた。
相反する規定の無いかぎり、「分子クローニング」
（７）、「Meth in Enzymol.」（９）及び「 DNAクロー
ニング」（８）で記述されたもののような標準的な技術
が使用された。比較例 以下の比較例は、宿主植物の全身性感染の間の従来技術
に基づく組換え型ウイルス核酸の不安定性又は、植物を
全身性感染させ挿入された非天然遺伝子の産物を効果的
に産生することの不能、のいずれかを立証している。
【０１０１】比較例１．TVRの30Ｋ及び外皮タンパク質
の遺伝子の間に TMVサブゲノミック RNAプロモータの後
ろで融合されたクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ(CAT) を挿入することによって、組換え型植
物ウイルス核酸を調製した。pTWV−CAT−CPをDawson,
W.O et al, (11) に記述されているとおりに調製した。
簡単に言うと、pTWV−CAT −CPは、Nco Ｉ(nt.5460) で
TMV菌株Ｕ１（４）の完全ゲノムcDNAクローンである p
TMV204を切断し、 DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグ
メントで平滑末端化し、Pst Ｉリンカー（Boehrin-get-
Mannheim Biochemicals からのCCTGCACG）を付加し、Ps
t Ｉ及びNsi Ｉ(nt.6207) で切除し、外皮タンパク質 O
RF (45) にCATORFが置換した変更 TMVであるpTWV−S3−
CAT −28のNsi Ｉ部位(nt.6207) の中にこの 747−bpフ
ラグメントを連結させることによって構築された。 TMV
ヌクレオチドの番号付けは、Goelet et(46) のものであ
る。各々の構成体の正しい連結及び配向を、制限地図作
成及び配列決定によって検査した。
【０１０２】接種 プラスミド DNA構成体のインビトロ
転写及び接種の手順は、以前に記述された通り（３）で
あった。ウイルスは、Xanthitobacco (Nicotiana tabac
umL. ）及びNicothiana svlvestris 内で全身的に繁殖
した。局所的病巣宿主としてXanthi−nc tobaccoを用い
た。接種に先立ち植物を温室内で生育させ、次にひきつ
づき約2000lxの16時間の光同期で植物発育チャンバ内で
25°に維持した。CAT検定 CAT活性の量を、基本的に記述された手順（4
7）で検定し、検定緩衝液内で 200mgの葉組織を解離さ
せ、その後 0.5mMのアセチル CoA及び 0.1μCiの
〔14Ｃ〕−クロラムフェニコールを付加し、37°で45分
間インキュベートし、抽出してから薄層クロマトグラフ
ィで分離し、最後にオートラジオグラフィに付した。
【０１０３】RNA分析 接種から４日後に、感染した葉
からの全 RNAを、記述のとおり（47ａ）抽出させた。ブ
ロットハイブリダイゼーション分析のために、 RNAを
1.2％のアガロースゲル内で電気泳動させ、ニトロセル
ロースへトランスファし、CATORFを含むpUC119又はpCM1
(Pharmacia) 内で TMVのニックトランスレーションされ
たcDNA（nts.5080−6395）でハイブリッド形成させた。
感染した葉からの合計 RNAは同様に、基本的にAusubet
et al. (48) 内で記述されている通りに野生型配列につ
いてRNアーゼ保護検定によって分析された。
【０１０４】pTMV204の３′半部分（Bam H Ｉ：nt.3332
−Pst Ｉ：nt.6401)をpT７／T3−19(BRLから) にクロ
ーニングした。Eco R Ｉ消化(nt.4254) の後、３′ウイ
ルス配列に相補的な32Ｐで標識づけされた転写物を、T7
RNAポリメラーゼを用いて産生させた。余剰量のプロー
ブを RNA試料にハイブリッド形成し、40μｇ／mlのRNア
ーゼＡ(Sigma) 及び 300ＵのRNアーゼT1(BRL) で処理
し、抽出しDMSO及びグリオキサールで変性させ、 1.2％
のアガロースゲル内で電気泳動に付し、後にそれを乾燥
させてコダックのＸ線フィルムに露光させた。
【０１０５】ProgenYウイルスのcDNAクローンの構築 RNAを、精製されたビリオンから抽出し、cDNAを以前に
記述された通り（４）に調製した。２本鎖cDNAをBam H
Ｉ(nt.3332) 及びSac Ｉ(nt.6142) で消化し、Bam H Ｉ
−及びSac Ｉ消化を受けた pUC19へとクローニングさせ
た。 DNAのヌクレオチド配列決定は、ジデオキシヌクレ
オチド鎖終端手順（49）によるものであった。
【０１０６】結果 外皮タンパク質遺伝子の上流に挿入
された CATカートリッジを有するpTMC−CAT −CPのイン
ビトロ転写物は、長さ7452ヌクレオチドで遺伝子順序が
126Ｋ， 183Ｋ，30Ｋ， CAT及び外被タンパク質である
ハイブリッドウイルス CAT−CPを結果としてもたらし
た。N. tabacum L. 品種Xanthi及びXanthi−nc及びN. s
ylvestris の葉を接種するのに、インビトロ転写物を使
用した。効果的に複製されTMV204と同様に接種された葉
の中で細胞から細胞へ移動する外被タンパク質（45） C
AT−CPに対する置換物として CATを発現する遊離RNA ウ
イルス、S30CAT−28又は野生型ウイルス、TMV204での感
染を受けた植物からの結果と、これらの結果を比較し
た。
【０１０７】壊死性炎の病巣は、TMV204及びS3−CAT −
2Bによってひき起こされるものとほぼ同時にXanthi−nc
tobacco上で発達し、これと同じサイズのものであっ
た。 CAT−CPは、全身性宿主Xanthi tobacco及びN. syl
vestris の接種された葉の中にいかなる症状も誘発しな
かったが、TMV204により産生されたものに類似するモザ
イク症状を、発達しつつある葉の中に生み出した。ビリ
オン精製後に得られる収量及び接種された葉の薄い切片
の透過型電子顕微鏡検査により見積られた、 CAT−CPで
の感染を受けた細胞内のビリオンの濃度は、TMV204感染
からのものにほぼ等しいと思われた。
【０１０８】CAT−CPは、TMV204の6395ヌクレオチドに
比べて7452のヌクレオチドという長さをもち、その結
果、野生型 TMVの 300nmのビリオンに比べ長さ 350nmの
CAT−CPビリオンがもたらされることになる。ウイルス
は、 CAT−CPの感染を受けた植物の接種された葉から精
製され、透過型電子顕微鏡によって分析された。 CAT−
CP感染からのビリオンの大部分が、長さ 350nmのもので
あった。電子顕微鏡で見た TMVUIのビリオンの長さを評
価する上での１つの問題点は、調製物が通常、個々のゲ
ノム長ビリオンに加えて、断片化され末端−末端縮合さ
れたビリオンを含んでいるということにある。全く異な
る 350〜300nm のビリオンの割合を決定するため、各々
のサイズの個々のビリオンを計数した。
【０１０９】CAT−CPを接種された葉の中の 350／300nm
のウイルスの比率は、野生型感染からの12：253 に比
べて、 191：21であった。野生型の TMV感染における 3
50nmビリオンは、 TMVUIが末端−末端縮合する傾向をも
ち全ての長さのビリオンが発見可能であることから、恐
らくは断片化されたビリオンの末端−末端縮合の結果と
して得られたと思われる。これらのデータは、 CAT−CP
の追加遺伝子がこれらの接種された葉の中に維持され包
膜されていたことを示唆している。
【０１１０】インビトロ RNA転写物又はその後の第１又
は第２継代の局所的病巣を用いて、CAT−CPの接種を受
けた葉の中で CAT活性を検出した。検定した 100以上の
試料の中から異なる陽性試料の中で１つの変動範囲が見
い出された。外皮タンパク質の無い突然変異体S3−CAT
−2Bの感染を受けたものと類似の CATレベルが、 CAT−
CP感染を受けた葉の中に発見された。TMV204の感染を受
けた又は健康な葉では、表面に出ない量しか検出されな
かった。
【０１１１】TMVの複製を支持するものとして知られて
いる一連の宿主を接種し CAT活性についてスクリーニン
グすることにより野生型 TMVの宿主範囲に対し CAT−CP
の宿主範囲を比較した。 CAT活性は、Solanaceaeに加え
て３つの植物族を代表するZinnia eleaans Jacq., Luna
ria annua L., Beta vulaaris L., Calendula officin
alisL., 及びSpiracia oleracea L.,の接種された葉の
中に検出された。このことは、 TMVゲノムのこの変化が
宿主範囲を変えるとは思えないことを表わしていた。
【０１１２】挿入された配列の結果として付加的なサブ
ゲノミック RNAを CAT−CPが産生したか否かを見極める
ために、感染した葉からの全 RNAを抽出し、 TMV又はCA
TDNAプローブを用いてブロットハイブリダイゼーション
により野生型 TMVのものと比較した。Xanthi−nc tabac
co内で予め２度継代された CAT−CPの感染を受けたXant
hi tobaccoの葉が、野生型 TMVに比較されるべき欠失を
伴う CAT−CP及び後代ウイルスの個体群を含んでいたと
いうことを理由として選択された。
【０１１３】２つの全く異なるゲノミック RNAが検出さ
れた。最大のものは TMVとCAT の両プローブに対しハイ
ブリッド形成したが、一方小さい方のゲノミック RNA
は、 TMVプローブに対してのみハイブリッド形成し、野
生型Tvゲノミック RNAと同時移動した。TMV204感染を受
けた葉からは２つであったのに対し、 CAT−CP感染を受
けた葉からの RNA内には３つの全く異なる小さい RNAが
発見された。野生型 TMVの外皮及び30Ｋタンパク質のた
めのサブゲノミックメッセージと共に同時移動した小さ
い方のRNA は、Tv特異プローブに対してのみハイブリッ
ド形成した。
【０１１４】CAT−CP感染を受けた葉からの大きい方の
サブゲノミックRNA が、 CAT及び TMVの両プローブに対
しハイブリッド形成した。野生型 TMVのサブゲノミック
mRNAに関してはこの大きい方のサブゲノミック RNAがゲ
ノミック RNA（50）と３′同末端であると仮定すると、
これらの結果は、 CATの発現のために予測された余分の
CAT−CPmRNAと一貫性がある。30Ｋ, CAT 及び外皮タン
パク質の ORFを含む30Ｋタンパク質についての推定上の
CAT−CPサブゲノミック RNAは観察されなかったが、こ
れは恐らく 2.4kbと 4.4kbの間の領域内のバンドが、電
気泳動中に宿主rRNAに対し付着するウイルス RNAによっ
て不明確にされ、分解が困難であった（50, 51）からで
あると考えられる。
【０１１５】上部の全身的に感染を受けた葉における C
AT活性の量は可変的であり、接種された葉におけるより
もはるかに低く、数多くの場合においていずれも検出さ
れなかった。Tv及び CATプローブでのハイブリダイゼー
ションは、ウイルスを保持する CATの配列の割合が急速
に検出不可能なレベルにまで減少することを実証した。
CAT−CPから、挿入されたCATORFが欠失したウイルスの
個体群への遷移は、植物の全身性浸入の間そして時とし
て接種された葉の中で起こった。これとは対照的に、 C
AT配列及び CAT活性は往々にして、３〜４回単一の病巣
を通して継代されたウイルスの接種を受けた葉の中で検
出された。
【０１１６】接種から約30日後の全身的に感染を受けた
Xanthi tobaccoの葉からの CAT−CPビリオンを検査し
た。 CAT−CPの感染を受けた植物の最も上の葉からのビ
リオンの数量化は、78：716 という 350−／ 300−nmの
ビリオンの比率を生成した。これを、接種された葉内の
191：21の比率と比較すると、個体群の主要な構成要素
が全身性感染の間に 300−nmビリオンへと移行したこと
がわかった。 CAT−CPの連続的な複製後に回収した欠失
した後代ウイルスは、宿主範囲及び症候学の面で野生型
TMVと同一であった。
【０１１７】CAT挿入を包含していた領域（nts.3332−6
142）のcDNAを、ウイルス個体群の試料採取を目的とし
て全身性感染を受けたXanthiの葉からの後代 CAT−CPビ
リオン RNAからクローニングした。サイズ及び制限地図
作成による９つのcDNAクローンの特徴づけは、８つが野
生型 TMVと同一であることを示した。１つのcDNAクロー
ンは、 CAT−CP構成体について予測されたサイズである
と思われたが、制限地図は、 CAT−CPについて予測され
たものから変動していた。野生型としてサイズ及び制限
分析により評価された５つのクローンを、 CAT挿入の領
域を通してと同様に外皮タンパク質遺伝子の一部分を通
しても配列決定し、これが親の野生型ウイルスと同一で
あることがわかった。このことは挿入された配列を切除
して、野生型 TMVを生み出すことができるということを
示唆していた。
【０１１８】考えられるこの切除を確証するために、ブ
ロットハイブリダイゼーション分析において用いられた
全葉 RNAの試料を、接種を受けた葉の中で相補的なＴ７
産生の負鎖 RNAを用いたRNアーゼ保護検定によって分析
した。これとは対照的に、CAT 配列及び CAT活性は往々
にして、単一の病巣を通して３〜４回継代されたウイル
スの接種を受けた葉の中に検出された。
【０１１９】接種から約30日後に、全身性感染を受けた
Xanthi tobaccoの葉からの CAT−CPビリオンを検査し
た。 CAT−CPの感染を受けた植物の最も上部の葉からの
ビリオンの数量化は、78：716 という 350−／ 300−nm
のビリオンの比率を生み出した。これを接種された葉に
おける 191：21という比率に比較すると、それは個体群
の主要な構成要素が全身性感染中に 300−nmビリオンへ
と移行したことを表わしていた。 CAT−CPの連続した複
製の後に回収された欠失した後代ウイルスは、宿主範囲
及び症候学の面で野生型 TMVと同一であった。
【０１２０】CAT挿入を包含していた領域（nts.3332−6
142）のcDNAを、ウイルス個体群の試料採取を目的とし
て全身性感染を受けたXanthiの葉からの後代 CAT−CPビ
リオン RNAからクローニングした。サイズ及び制限地図
作成による９つのcDNAクローンの特徴づけは、８つが野
生型 TMVと同一であることを示した。
【０１２１】１つのcDNAクローンは、 CAT−CP構成体に
ついて予測されたサイズであると思われたが、制限地図
は、 CAT−CPについて予測されたものから変動してい
た。野生型としてサイズ及び制限分析により評価された
５つのクローンを、 CAT挿入の領域を通してと同様に外
皮タンパク質遺伝子の一部分を通しても配列決定し、こ
れが親の野生型ウイルスと同一であることがわかった。
このことは、挿入された配列を切除して、野生型 TMVを
生み出すことができるということを示唆していた。
【０１２２】考えられるこの切除を確証するために、ブ
ロットハイブリダイゼーション分析において用いられた
全葉 RNAの試料を、野生型 TMVのヌクレオチド4254−63
95に相補的なＴ７産生の負鎖 RNAを用いたRNアーゼ保護
検定によって分析した。この領域内に野生型の配列が存
在することにより、2140ヌクレオチドの保護された RNA
という結果がもたらされることになる。 CAT−CR RNAか
らのこのサイズのバンドは、プローブを保護するため野
生型 RNAを用いて生成された類似のバンドと同時移動し
た。
【０１２３】これらのデータは、 CAT−CPの挿入された
配列が精確に欠失され得ることを確認した。反復内での
位置の一範囲にわたって CAT−CPと野生型 TMVプローブ
RNAの間のハイブリッド内のバルジループが発生できる
ようにする CAT−CP RNA内の反復配列の存在を考慮に入
れると、 CAT−CP RNAによる野生型プローブのRNアーゼ
保護は、２つのヌクレオチドサイズ範囲すなわち 683−
935 及び1202−1458の中に入るバンドのセットを生み出
すはずである。目に見えるその他の２つの主要バンドは
これらのサイズのものであり、これらの試料内の CAT−
CP RNAの存在を確証している。
【０１２４】CAT−CPの挿入された配列の喪失は、２つ
の続発するプロセスによるものであると思われた。第１
のプロセスは、後代ウイルスのcDNAクローンの配列分析
により示されているような個々の分子内の挿入された配
列の喪失であった。欠失は反復配列の間で起こったた
め、これがその他のプラスセンスRNA ウイルスについて
記述されているように相同な組換えによって発生した可
能性もある（52−54）。第２のプロセスはウイルス個体
群の中の選択された移動という結果をもたらした。
【０１２５】ウイルス個体群が試料採取されたRNアーゼ
保護検定は、 CAT−CP及び野生型ウイルスの両方が、接
種された葉の中の個体群の構成要素でありうるというこ
とを立証した。全身性感染を受けた葉の中の CAT−CPの
欠如は、恐らくウイルス個体群の移動によるものであっ
た。これは、もとのハイブリッドが複製及び全身性の動
きに関して欠失した後代野生型ウイルスと効果的に競合
し得ないためであると考えられる。
【０１２６】比較例２．組換え型植物ウイルス核酸を、
TMVの未翻訳の３′領域と外皮タンパク質の遺伝子の間
に TMVサブゲノミック RNAプロモータの後ろで融合され
た CAT遺伝子を挿入することにより調製した。pTMV−CP
−CAT は、Dawson et al.(II) によって記述されている
通りに調製した。簡単に言うと、pTMV−CP−CAT は、Hi
n d III(nt.5081)でpTMV−S3−CAT −28を切断し、 DNA
ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑末端化
し、Pst Ｉ及びNsi Ｉ(nt.6207) を付加し、 pTMV204の
NsiＩ部位(nt.6207) 内でこの1434−bpフラグメントを
連結することによって構築された。各々の構成体の正し
い連結及び配向は制限地図作成及び配列決定によって検
査した。
【０１２７】比較例Ｉに記されているように、植物の接
種、 CAT検定、 RNA分析及び後代のcDNAクローンの構築
を行なった。大きい方のハイブリッドウイルス構成体で
あるpTMV−CP−CAT は、外皮タンパク質サブゲノミック
プロモータ及び組立ての起点を含む30Ｋ遺伝子の一部分
の 628ヌクレオチドの反復を含んでいた。この構成体
は、長さ7822ntで 126Ｋ， 183Ｋ，30Ｋ、外皮タンパク
質そして CATという遺伝子順序をもつウイルスCP−CAT
を産生するはずである。CP−CAT の複製レベルは低いも
のであった。これは、野生型ウイルスの病巣の直径の約
２分の１という小さい壊死性炎の病巣をXanthi−nc内に
生成し、その出現は２日遅れた。これらの病巣からのCP
−CAT の伝染性は、 CAT−CP又は野生型 TMVのものの約
100分の１のレベルであった。
【０１２８】Xanthi又は N. sylvestris植物の中でいか
なる全身性症状も現われず、ウイルス感染は、接種され
た葉からのみトランスファー可能であった。CP−CAT の
感染を受けた葉の中では、低いが再生可能なレベルの C
AT活性が見られた。このキメラウイルスの複製は、この
ように損なわれたことから、特徴づけはそれ以上進行し
なかった。 CAT−CPとは対照的に、全身性宿主内でさら
に長い期間CP−CAT が複製できるようにされた場合、植
物の上部葉の中にはいかなる野生型様ウイルスの症状も
全く見られず、これらの葉からウイルスが回収されたこ
とは全く無く、このことはすなわち、このハイブリッド
ウイルスが野生型ウイルスを生み出す形で挿入された配
列を欠失させなかったということを示唆している。
【０１２９】比較例３．TMVゲノムの全長 DNAコピーを
調製し、Dawson, W.O. et al.(t)によって記述されてい
るとおり、pBR322のPST Ｉ部位の中に挿入する。ウイル
ス外皮タンパク質遺伝子は30Ｋのタンパク質遺伝子に隣
接する TMVゲノムの位置5711にある。TMV ゲノムの DNA
コピーを含むベクターは、適切な制限酵素及びエキソヌ
クレアーゼで消化され、外皮タンパク質コーディング配
列を欠失させる。例えば、外皮タンパク質コーディング
配列は、cla Ｉ及びNsi Ｉでの部分的消化とそれに続く
ウイルスの teh３′−テイルを再度付着させるための再
連結によって、除去される。
【０１３０】あるいは、ベクターは、ウイルス核酸の
３′末端で切断される。ウイルス DNAは外皮タンパク質
コーディング配列の開始コドンを通して上方へBal 31又
はエキソヌクレアーゼIII での消化によって除去され
る。次にウイルス３′−テイルの配列を含む合成 DNA配
列を、残りの５′末端に連結させる。ウイルス外皮タン
パク質に対するコーディング配列の欠失は、 TMV RNAを
分離しそれをタバコ植物の感染に用いることによって確
認される。分離された TMV RNAは、自然の条件下では非
感染性であることがわかっている。
【０１３１】pNEOからの 314−bp Sau 3Aフラグメント
(Tn5 NPTII遺伝子の NH2末端）は、クレノウポリメラー
ゼの充てんを受け、Sal Ｉ（pd〔GGTCGACC〕）リンカー
に連結された。これを次に SalＩ及び PstＩで消化さ
せ、Pst Ｉ／Sal Ｉ消化されたpUC128 (55) の中に挿入
して、 pNU10を得た。pNEOプラスミドをAsu IIで消化
し、これにクレノウポリメラーゼを充てんし、Xho Ｉリ
ンカー（pd〔CCTCGAGG〕）に連結させてpNX1を得た。pN
X1をXho Ｉで消化し、クレノウポリメラーゼをこれに充
てんし、Pst Ｉでこれを消化し、Pst Ｉ／Sma Ｉ消化さ
れた pNU10内に連結させて、pNU116を得た。
【０１３２】pNU116(NPTII配列）からのXho Ｉ／Sal Ｉ
フラグメントを、外皮タンパク質プロモータに隣接して
連結させる。 NPTII遺伝子インサートを含む、結果とし
て得られた RFVNAを、 TMV耐性のためのＮ遺伝子を含む
よう戻し交雑された栽培品種である12のNicotiana taba
cum(cv. Xanthi−NC）及びＮ遺伝子を含まない栽培品種
である12のN. tabacum（cv. Xanthi）に適用した。両方
のタバコ栽培品種において、接種を受けたいずれの植物
の中にも全身性の拡散は全く観察されなかった。N. tab
acum(cv. Xanthi NC) は、ウイルスに対する耐性を表す
接種葉上の特徴的な斑点を示した。N. tabacum(cv.Xant
hi) は、いかなる斑点も全身性症状も示さなかった。
【０１３３】比較例４．比較例１及び３に記述されてい
る通りに、 NFTIIコーディング配列を含む組換え型植物
ウイルス核酸を調製した。 NFTII及び外皮タンパク質コ
ーディング配列は、各々「０」外皮タンパク質プロモー
タに隣接していた。外皮タンパク質遺伝子の存在は、ベ
クターを全身的に拡散し得るものにするはずである。NP
TII挿入された遺伝子を含む、結果として得られたRFVNA
を12のN. tabacum(cv. Xanthi NC) 上に接種し、12の
N.tabacum (cv. Xanthi NC) は、比較例１の場合の通
り、12の植物の各々において斑点を示した。N. tabacum
（cv. Xanthi)は、全ての12の植物の中でベクターの全
身的拡散を示した。
【０１３４】N. tabacum (cv. Xanthi) の葉からの葉盤
を、カナマイシンを含む培地上で培養した。組織は培養
内で全く生残せず、これは NFTII遺伝子の喪失又は機能
不良を表わしている。処理されたN. tabacum（cv. Xant
hi) 植物の葉から回収されたNFTII遺伝子を含む当該ベ
クターのその後の電子顕微鏡写真方法は、このベクター
が NPTII遺伝子に相応するベクターの１切片を喪失した
ことを示し、これは、ベクターの破断及び組換えを表わ
していた。
【０１３５】好ましい実施例 以下の例は、本発明をさらに明確に表わしている。これ
らの例は、本発明を例示するものにすぎず、制限的意味
のあるものとしてみなされるべきものではない。例１ ．細菌プラスミドの構築．カッコ内の数字は、 TMV
−U1配列を表わす（46）。 DNA操作は、基本的に（48）
に記述されているとおりに行なわれた。 pTBN62 (DH5
α；Gibco BRL ；及びH8101)を除いて、全てのプラスミ
ドは E. coli菌株 JM109内で繁殖させられた。
【０１３６】pTKU1(図１）． 7.3kbのpTMV204(４） Pst
Ｉフラグメント（pPMI（３）からのλファージプロモー
タ及び TMV−U1ゲノム）を pUC19へとサブクローニング
しpTP5を得た。pTMV204 Apa Ｉフラグメント（5455−63
89）をオリゴヌクレオチドpd〔CAGGTACCC 〕及び d〔 G
GGTACCTGGGCC〕に連結させ（SEQ ID No：２）、KpnＩ
（ヌクレオチド配列内で下線が付されているもの）及び
Nco Ｉ（5459）で消化し、Nco Ｉ／Kpn Ｉ消化されたpT
P5へと連結させてpTPK10を生成した。pTPK10からPst Ｉ
／Kpn Ｉ−消化されたpUC118へと 7.3kbのPst Ｉ／Kpn
Ｉをサブクローニングすることによって pTKU1を構築し
た。 pTKU1はpPM1のλファージプロモータの下流に完全
な TMV−UIゲノムの DNAコピーを含んでいた。
【０１３７】pTKUIのKpn Ｉ消化及びインビトロ転写
は、感染性 TMV RNAを与えた。オドントグロッサムリン
グスポットウイルス（ORSV、時として TMV−O と呼ばれ
る）外皮タンパク質、DHFR及び NFTII ORFのPst II部位
は、ハイブリッド構成体のプラスミド DNAを消化し感染
性インビトロ転写物を産生するためのこの制限酵素（pT
MV204, 4を線形化するのに利用されるもの）を使用を禁
じていたことを理由として、 pTKUIが構築された。
【０１３８】pTB2（図１）．pTMVS3−28（45）は、外皮
タンパク質開始コドンが ACGに突然変異させられXho Ｉ
部位が全外皮タンパク質コーディング配列に置換してい
る pTMV204の誘導体であった。pTMVS3−28からの 1.9kb
のNco Ｉ／Sal Ｉフラグメント（pBR322内の5459−SaI
１部位）を NcoＩ／ SalＩ消化されたpNEO（56）へと連
結させpNS283を得た。 pBabsＩは、 TMV−UI(nts4254−
6370) に対するヌクレオチド、 ORF及びアミノ酸配列の
類似性をもつORSVビリオン RNAからの 2.4kbのEco R Ｉ
cDNA であった。
【０１３９】680bpの pBabs1 HincII／Ear Ｉ（クレノ
ウポリメラーゼ充てん済み）フラグメント（その AUGの
下流にORSV外皮タンパク質 ORFと 203の塩基を含む）
を、pNS283のNst Ｉ部位（6202：T4 DNAポリメラーゼで
平滑末端化されたもの）に連結させてpB31を産生した。
次にpB31からのNco Ｉ／Sal Ｉフラグメントを（pBR322
内で対応する野生型フラグメント5459−SaI1部位に置換
する）Nco Ｉ／Sal Ｉ消化された pTMV204に連結させ、
pTB281を得た。pTB281からのBamHＩ／ SplＩフラグメン
トをBamHＩ／ SplＩ消化された pTKUI（対応する野生型
フラグメント3332−6245に置換するもの）に連結させる
ことによってpTB2を構築した。
【０１４０】pNC4X(57) ． pNC4Xは、 pUC8Xにクローニ
ングされたR67 OHFR遺伝子から成っていた。プラスミド
は、DHFR遺伝子のための開始コドンから８つの塩基分上
流にXho Ｉ部位を含んでいた。さらに、停止コドン及び
カルボキシ末端DHFR配列の５つの塩基を欠失させ、Sal
Ｉ部位によって置換した。
【０１４１】pNU116． 315bpの pNEO Sau 3S（クレノウ
ポリメラーゼ充てん済）フラグメント(Tn5 NPNII遺伝子
の NH2末端）をSal Ｉ(pd〔GGTCGACC〕）リンカーに連
結し、Sal Ｉ／Fst Ｉで消化し、Fst Ｉ／Sal Ｉ消化し
たpUC128 (55) 内に挿入してpNU10を得た。pNEOをAsu I
Iで消化し、クレノウポリメラーゼで充てんし、XhoＩリ
ンカー（pd〔CCTCGAGG〕）に連結させてpNX1を生成し
た。pNX1をXho Ｉで消化し、クレノウポリメラーゼで充
てんし、Pst Ｉで消化し、結果として得られた632bpフ
ラグメント(Tn5 NPTII遺伝子のCOOH末端）を PstＩ／ S
maＩ消化されたpNU10内へ連結させることによって、pNU
II6を構築した。 NFTII遺伝子のこの操作は、開始コド
ンより16塩基上流で、その存在が形質転換された植物細
胞（58）内の NFTII活性を減少させていた付加的な ATG
コドンを除去した。
【０１４２】pTBD4 及びpTBN62（図１）． pNC4X（DHFR
配列）及びpNU116(NPTII配列）からのXho Ｉ／Sal Ｉフ
ラグメントをそれぞれ、 TMVコーディング配列と同じ向
き（センス）でpTB2のXho Ｉ部位の中に連結した。インビトロ転写及び植物の接種 （45）の通りに育てた植物に、それぞれKpn Ｉ消化され
たpTBD2, pTBD4及びpTBN62からのインビトロ転写物TB２
（nt. 6602），T8D4(nt.6840) 及びTBN62 (nt.7434) を
接種した。インビトロ転写方法は、前述のとおりであっ
た。
【０１４３】後代ビリオン RNAの分析．ウイルス精製
は、ポリエチレングリコールでの１回の沈降（８％ PE
G、 0.1Ｍ NaCl 、０℃、１時間）及び１回の超遠心分
離（151000−235000×ｇ；90分）を伴って、基本的に G
ooding及びHebert（59）により記述されている通りであ
った。１時間37℃で10mMのトリス HCl、pH 7.5、１mMの
EDTA、 0.1％の SDS内の 0.2μｇのフロティナーゼＫで
１mgのウイルスを消化しその後フェノール／クロロホル
ム抽出を行なうことによって、ビリオン RNAを抽出し
た。
【０１４４】RNA試料を、DMSOで変性させ、グリオキサ
ール化し、１％のアガロースゲル内で電気泳動し、ニト
ロセルロース（気孔径0.45μｍ；Schleicher and Schul
l ；48）へとトランスファさせた。トランスファは、
〔α-35 Ｓ〕−dATP(New England Nuelear）で標識付け
された（50）制限フラグメントでプローブ探査した。RN
アーゼ保護検定は、（48）に記されている通りであっ
た。TBD4−38及びpTBN62−38は、BamHＩ／ KpnＩ消化さ
れたpBluescript SKI(Stratagene) 内にクローニングさ
れた、それぞれ pTBD4及びpTBN62からのBam H Ｉ／Kpn
Ｉフラグメント（nts.3332−6396）を含んでいた。
【０１４５】NPTIIの免疫学的検出．標本の調製及びウ
ェスタン分析は、以前に記述された通りであった（4
5）。葉の試料を液体Ｎ2 と抽出緩衝液（10％のグリセ
ロール、62.5mMのトリス HCl pH７、５％のメルカプト
エタノール、５mMのフェニルメチルスルフォニルフルオ
リド）の中で摩砕した。ウシ血清アルブミンを標準とし
てブラッドフォード検定(Stratagem；61）により、当量
タンパク質濃度を決定し、絶対濃度を見積った。ウェス
タントランスファを NPTIIに対する抗血清（１：500 ；
５Prime, ３Prime, Inc.)で、次にアルカリ性ホスファ
ターゼでコンジュゲートされたヤギ抗ウサギ IgG（１：
1000）でプローブ探査した。
【０１４６】NFIII活性検定． NPTII活性を、その硫酸
ネオマイシンリン酸化反応によって検出した。酵素検定
は、抽出緩衝液が上述のとおりであり健康な組織内の精
製された NPTII（５Prime,３Prime, Inc.)の一連の希釈
物が含まれていた点を除いて、（62）に記述されている
通りであった。硫酸カナマイシンに対する耐性についてスクリーニング
するための葉盤検定． NPTIIはアミノグリコシドカナマ
イシン（56）に対する耐性を付与する。接種後12日目の
若い全身性の葉を、表面殺菌し、約0.01％のTween 20
（５分）、0.25％の次亜塩素酸ナトリウム（２分）70％
のエタノール（30秒）、精製水（４×10秒）の中で洗浄
した。葉盤を葉から対を成して切断した；１つは、 Mur
ashige及び Skoog(MS)の培地単独の上に置き、もう１つ
は、硫酸カナマイシン補充したMS培地上に置いた。プレ
ートを、16時間の光周期で32℃でインキュベートした。
７日毎に、葉盤を調製したばかりの培地へトランスファ
させた。
【０１４７】それぞれ DNA構成体 pTB2, pTBD4及びpTBN
62から誘導されたインビトロ転写物を N.benthamiana植
物に機械的に接種した結果、標準的な TMV形状と収量
（1.５〜5.９mgのウイルス／組織１ｇ）のウイルス症候
性感染がもたらされた。症状はTMV−UIに感染した植物
に比べさほど重症ではなく、全身性葉の穏やかなクロロ
シス（白化）とゆがみを伴う植物の萎縮から成ってい
た。それぞれ TB2, TBD4及び TBN62の接種を受けた植物
の全身的に感染した組織からのビリオン RNAのサイズ
は、それぞれのプラスミドからインビトロで転写された
RNAの予想された長さと一貫していた。
【０１４８】これらの RNA種は、 TMV配列に加えてその
それぞれの細菌遺伝子インサートを含んでいた。それぞ
れのゲノムの操作された部分に対して相補的なプローブ
を、後代TBD4及び TBN62のウイルス RNAによるRNアーゼ
保護検定において保護した。これは、以前の構成体（1
1）では問題であった挿入された配列の精確でかつ迅速
な欠失がTBD4又は TBN62では起こらなかったということ
を表わしていた。以前に報告された構成体では、反復し
たサブゲノミックプロモータ配列（11）間の組換えのた
めに外来性インサートが欠失したという仮説が立てられ
た。
【０１４９】TBD4及び TBN62では、非相同のサブゲノミ
ックmRNAプロモータを利用することによってこのような
反復配列は低減された。目に見えプローブよりも小さく
全長ウイルス RNAよりも小さい付加的なバンドは、TBN6
2 個体群の一部分の中の変化を表わしている可能性があ
るが、この場合、全長バンドと付加的なより小さなバン
ドの相補的割合は、それに続く継代の後変化が無かっ
た。
【０１５０】TBD4及び TBN62ビリオン RNAの配列安定性
は、 N.benthamianaを通しての連続継代において検査さ
れた。それぞれ pTBD4及びpTBN62からの２つ及び４つの
独立したインビトロ転写物イオン反応を用いて、植物に
接種を行ない、全身的に感染を受けた葉組織を11〜12日
毎に連続継代させた。48日間の全身性感染の後、ノーザ
ントランスファハイブリダイゼーションによりDHFR配列
を含むTBD4の全長ビリオン RNAがなおも検出され、RNア
ーゼ保護検定においてゲノムの操作された一部分に対し
て相補的なプローブをなおも保護していた。
【０１５１】N.tabacum Xanthi-nc上の局所的病巣の分
離により 170日間繁殖されたTBD4感染植物からビリオン
RNAのクローナル個体群が５つ誘導された（10継代が関
与する１シリーズ）。そのうち３つの個体群についての
コンセンサスDHFR配列は、コーディング配列のヌクレオ
チド72での翻訳的に沈黙した第３の塩基変化（Ｕ−＞
Ｃ）を除いて、公表されたDHFR配列と一致していた。DH
FRコーディング配列の位置72でのヌクレオチド変化は48
日間繁殖されたTBD4感染を受けた植物からの後代RNAに
おいては明らかでなかった。 TBN62による感染を連続的
に受けた植物からのビリオン RNAは、独立した一連の継
代の各々において NPTII配列の異なる部分が欠失してい
る状態で、比較的不安定であった。
【０１５２】これらの配列の喪失時間は、第１の継代後
（12〜24日）と第３の継代後（36〜＞47日）の間で変動
した。 TBN62の NPTII配列内で欠失が発生する理由はわ
かっていない。しかしながら、TBD4内のDHFR配列の安定
性に基づくと、挿入された外来性配列のこのような不安
定性は、発現ベクター TB2の内発的特長であるとは思わ
れない。これとは対照的に、このような欠失は、挿入さ
れた外来性配列自体のヌクレオチド組成によって要求さ
れるものである可能性がある。 DNA植物ウイルスベクタ
ーの間での類似の不安定さも見られてきた。
【０１５３】広範に使用されている選択可能なマーカー
NPTII(62)についての抗血清及び感受性酵素検定の市販
の供給源によって、 TBN62での感染を受けた組織をさら
に分析することが可能となった。ウェスタンブロット分
析、酵素活性及び葉盤検定は、 TBN62の全身性感染を受
けた植物繊維において機能的 NPTII、酵素が存在しその
表現型発現がみられるものの TB2感染を受けた植物又は
健康な植物においてはそれがみられないことを立証し
た。 NPTIIタンパク質及び酵素活性は、36日間繁殖させ
たいくつかの TBN62感染を受けた植物の中でさえ検出さ
れた。
【０１５４】抽出可能な NPTIIタンパク質のレベルが、
最も発現度の高い TMVタンパク質である外皮タンパク質
よりも著しく低いものであることは明らかであった。こ
のような低レベルは、植物細胞内のそれぞれのタンパク
質の相対的安定性又は分配を反映するものでもありうる
し、或いは又リポータ遺伝子の転写後の発現又はサブゲ
ノミックmRNAの合成に影響を及ぼすベクター又は外来性
遺伝子配列のもつ単数又は複数の様相によるものである
とも考えられる。ベクター構成体での感染を受けた植物
からのウイルスの比較的高い収量は、ウイルス複製の効
率の劇的な減少を妨げるように思われる。
【０１５５】しかしながら、低い発現のための１つの可
能性は、ゲノムの３′未端との関係におけるリポータ遺
伝子の位置にあるかもしれない。 TMVの異なる突然変異
体により産生される 30kDaのタンパク質の量は、ゲノム
の３′末端からの 30kDaのタンパク質 ORFの距離に反比
例することが示された。この関係は、French及びAhlqui
st(63)の観察事実すなわち、ブロムモザイクウイルスRN
A3からのサブゲノミック RNAのレベルは、プロモータが
３′末端に近く挿入されればされるほど漸進的に高くな
る、ということと一貫していた。
【０１５６】例２．例１の RPMは N.benthanianaの中で
全身的に拡散できるものの、 N.tabacum内で全身的に拡
散することはできない。この例は、 N.tabacum内での全
身的拡散が可能である RPMの合成について記述してい
る。pTB2内に含まれているＯ−外皮タンパク質コーディ
ング配列は、 Aha IIIでの消化によりpTB2から切断され
た。UI−外皮タンパク質コーディング配列は、 AhaIII
での消化により pTMV204から除去され、 Aha III消化さ
れたpTB2内に挿入されてベクターpT8U5(図Ｉ）を産生し
た。
【０１５７】それぞれpNC4X(DHFR配列) 及びpNU116(NPT
II配列) からの XhoＩ／ SalＩフラグメントを、 TMVコ
ーディング配列と同じ向き（センス）で pTBU4の XhoＩ
部位内に連結させる。例１に記載されている通りに N.t
abacum植物を接種し分析する。全身性感染を受けた植物
内には機能的酵素が見られるが、対照植物内には見られ
ない。
【０１５８】例３．この例は、天然の外皮タンパク質遺
伝子がその天然サブゲノミックプロモータの制御下にあ
り、非天然核酸の発現を駆動するため非天然サブゲノミ
ックプロモータが挿入されているRP VNAの合成について
記述する。TMV−O プロモータ及び TMV−UI外皮タンパ
ク質配列を、 XhoＩ及び KpnＩで消化することによって
pTB2から除去する。平滑末端化及び PstＩリンカーの付
加によって、 XhoＩ末端を PstＩ部位に変換する。この
PstＩ／ KphＩフラグメントをBluescriptベクター内へ
サブクローニングする。このBluescriptベクターの２つ
のサブクローンを、以下のような部位特異的突然変異誘
発により作り出す：
【０１５９】ATG(外皮タンパク質) の開始部位での突然
変異を強制し ATG部位の近くに XhoＩ部位を作り出すこ
とになる部位特異的フラグメントを作り出すため PCT技
術を用いてBluescript SubＩを調製する。Bluescript S
ub2 は、TAA(外皮タンパク質) 停止部位での突然変異を
強制し TAA部位の近くに XhoＩ部位を作り出すことにな
る部位特異的フラグメントを作り出すべく PCR技術を用
いて調製する。Bluescript SubＩの PstＩ／ XhoＩ切断
及びBluescript Sub2 の XhoＩ／ KpnＩ切断は、連結さ
れうる２つのフラグメントを与え、 TMV−O プロモータ
から下流にあるXhoＩクローニングインサート部位を有
する PstＩ／ KpnＩフラグメントを提供する。この Pst
Ｉ／ KpnＩフラグメントは、 NsiＩ／ KpnＩフラグメン
トを除去させたpTKUＩベクター内に挿入される。（ Pst
Ｉ末端は NsiＩに連結されうる)。結果として得られる
クローンは、３′側に TMV−O プロモータを伴う、 TMV
−O プロモータによって駆動されることになる選択され
た遺伝子を中に挿入できるXhoＩインサート部位を伴うp
TKU１−ａである。
【０１６０】それぞれpNC4X(DHFR配列) 及びpNU116(NPT
II配列) からの XhoＩ／ SalＩフラグメントは、 TMVコ
ーディング配列と同じ向きでpTBU１−ａの XhoＩ部位内
に連結される。 N.tabacum植物は、例１に記述されてい
る通りに接種及び分析を受ける。全身性感染を受けた植
物には、機能的酵素が見られるが、対照植物には見られ
ない。
【０１６１】例４．Ｏ−外皮タンパク質（例１）又はＵ
１−外皮タンパク質遺伝子（例２）のいずれかをもつ R
VPNA内への挿入のための付加的な DNAコーディング配列
を調製した。各々のケースにおいて、コーディング配列
と同じ向き（センス）でpTB2（例１）又はpTBU5(例２）
の XhoＩ部位を含むように、コーディング配列を合成し
た。
【０１６２】E.coliへとプラスミドを形質転換し一晩の
培養から DNAを分離させるためには、標準的手順を用い
た。プラスミド DNAの抽出の後、 DNA依存性 RNAポリメ
ラーゼを用いて（選択された遺伝子を伴って又は伴わな
い)TB2又はTBU5ベクターの RNAコピーを作製した。以前
に公表されたとおり、転写反応中m7GpppG4を付加するこ
とにより、反応の間 RNAをキャップ形成させた。この R
NAは次にタバコ植物に接種を行なうのに用いられた。多
数の植物の接種のため、幅広い濃度の過渡的ベクターを
精製するのに標準的なウイルス分離技術を使用すること
ができる。
【０１６３】XhoＩリンカーを含む中国産キュウリのα
−トリコサンチンについてのコーディング配列は、SEQ
ID NO:４として対応するタンパク質を伴ってSEQ ID NO:
３内に示されている。XhoＩリンカーを含むイネのα−
アミラーゼのためのコーディング配列は、SEQ ID NO:６
として対応するタンパク質を伴ってSEQ IDNO:5の中に示
されている。この配列は、以下のように調製された：
【０１６４】Hind IIIで酵母発現ベクターpEno／I0364
を消化し、一本鎖 DNA懸垂を除去するため緑豆エキソヌ
クレアーゼで処理した。完全なイネα−アミラーゼ cDN
A 05103 65 1990;Gen BanK受入れ番号M24286) を含む0.
16kbの Hind III （平滑末端）フラグメントを、 ScaＩ
で消化し、 XhoＩオリゴヌクレオチド(5′CCTCGAGG
３′）でリンカー形成させた。変更α−アミラーゼcDNA
フラグメントを、低溶融アガロースゲル電気泳動を用い
て分離させ、pBluescript KS+(Stratagene, La Jolla.
Calif.) 内でアルカリ性ホスファターゼで処理された X
hoＩ部位へとサブクローニングさせ、E.coli K−12菌株
C−600 の中で維持した。
【０１６５】短かい３′−未翻訳領域を含むイネα−ア
ミラーゼコーディング配列は、以下のとおりに調製され
た：E.coliベクター pVC18／13(64)を KpnＩ、 XhoＩで
消化させ、 Exo III及び緑豆エキソヌクレアーゼで処理
した。変更プラスミドを DNA poll, DNAリガーゼで処理
し、 C−600 に形質転換した。分離株、クローンpUC 18
／3 #8は、 05103の停止コドンに非常に近い３′欠失を
有していた。このプラスミドを EcoRIで消化し、緑豆エ
キソヌクレアーゼで処理し、 XhoＩオリゴヌクレオチド
(5′CCTCGAGG３′) でリンカー形成した。
【０１６６】結果として得られるプラスミド(pUC18／3
#8X)からの1.４kbの Hind III − XhoＩフラグメント
を、低溶融アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、pB
luescript KS-(Stratagene,La Jolla,Calif.) にサブク
ローニングし、E.coli K−12菌株 C−600 及び JM109内
に維持した。一本鎖鋳型を用いてジデオキシ終端により
欠失を配列決定した。欠失は、イネａ−アミラーゼ停止
コドンを通過して14bpのところにあることが見極められ
た。プラスミドpUC 18／3 #8X を Hind III で消化し、
緑豆エキソヌクレアーゼで処理し、 XhoＩオリゴヌクレ
オチド(5′CCTCGAGG３′）でリンカー形成した。トラフ
溶出によって1.４kbの XhoＩフラグメントを分離し、pB
lues- cript KS+ 内でアルカリ性ホスファターゼ処理さ
れた XhoＩ部位へとサブクローニングし、 JM109内に維
持した。
【０１６７】ヒトα−ヘモグロビン又はβ−ヘモグロビ
ンに対するコーディング配列及びペチュニアEFSPシンタ
ーゼのトランジットペプチドを含む配列決定は、SEQ ID
NO:７又はSEQ ID NO:８内に、又対応するタンパク質配
列はそれぞれSEQ ID NO:９及び SEQ ID NO:10 として示
されている。例１に従って調製されたα−トリコサンチ
ンに対する遺伝子を含む組換え型植物ウイルス核酸で処
理された N.benthamianaからの精製されたタンパク質抽
出物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離
し、ウェスタン分析のための標準的手順を用いてα−ト
リコサンチンに特異的な抗体でプローブ操査した。図２
は、α−トリコサンチンに対する遺伝子を含む組換え型
植物ウイルス核酸で処理された植物内での、処理済α−
トリコサンチンタンパク質の産生を実証するゲルのオー
トラジオグラフである。
【０１６８】例５．現場試験 屋外現場設計は２つの実験（１及び２）を含んでいた。
実験１は、全ての外周畦ならびに内部畦上にタバコの未
処理周縁畦（８）を含む典型的なロークロップ形態であ
った。さらに、４本の畦毎に、処理済み畦（Ｔ）のいず
れとも直接接触することなく畑に大型農業機器がアクセ
スできるようにするため（例えば農薬を噴霧するため）
植栽せずに残されたスペーサー畦（Ｓ）があった。各々
の接種は、個々の植物の単葉にベクターを手で直接塗布
することによって処理された。
【０１６９】実験２は、典型的な苗床構成であった。ト
ラクタの動力取出し装置にとりつけられた改造芝刈り機
を用いて苗床を頻繁に刈り取ることによって、均等な高
さで１平方フィートあたり高密度の植物が栽培された。
この実験は、ベクターの接種を受けていない苗床の完全
な周縁部を含んでいた。処理された苗床の接種は、改造
型芝刈機ブレードアセンブリを通して下方に向けられた
スプレーを用いて行なわれ、隣接する苗床に対する過剰
噴霧を防ぐように操作された。
【０１７０】実験１は、ランダム化されたブロック内の
主要な小区画としての７つの遺伝子型と４つの複製を伴
う畦栽培を用いた分割小区画設計であった。各小区画は
長さ13フィートで３本の畦から成り、試験のためには各
中心畦のまん中の３〜４本の植物のみが用いられた。畦
は中心で４フィートあり、畦の中で植物は20〜22インチ
の間隔がとられていた。実験２は、４つの遺伝子型と３
つの複製を伴う苗床栽培を用いた、ランダム化された完
全ブロック設計であった。各々の小区画は４フィート×
12フィートの苗床から成っていた。
【０１７１】遺伝子型． 実験１：（Nicotiana tabacu
m ）Ｋ−326, SpG−28，TI−560,Md−609, Gal pao, Wi
sc−503B及びNicotiana benthamiana ． 実験２：（Nicotiana tabacum ）Ｋ−326, TI−560,
Md−609, Gal pao.化学的施肥 ． 実験１：移植後800 １bs６−12−８；１
回目の収穫後100 １bs33−０−０；２回目の収穫後200
１bs 15−０−14。 実験２：苗床形成時点で2400 １abs 12−６−６；１
回目の収穫後300 １abs 33−０−０；２回目の収穫後；
670 １bs 15−０−14．
【０１７２】刈り取り． 実験２は、植物に対し均質性
を付与するため、１週間に２回の割合で２週間刈り込ま
れた。雑草、昆虫及び疾病の制御 ． 実験１：畦を形成するに
先立ち、Paarlan ６Ｂ（１qt／Ａ），Temik 15Ｇ（20
１ｂ／Ａ）及びRidomil （２ qts／Ａ）を散布し、円板
すきで耕すことによって取り込ませた。畦形成中、Telo
ne Ｃ−17（10.5 gal／Ａ）を適用した。移植の後、芽
を食う毛虫やイモムシを制御するためDipel （１／２
１ｂ／Ａ）を適用した。必要に応じてアリマキやイモム
シを制御すべくDrthene （２／３ １ｂ／Ａ）を適用し
た。
【０１７３】実験２：播種時点で、又播種後60〜70日目
から始めて一週間毎に（必要に応じて）Ridomil ２Ｇ
（１qt／Ａ；１oz／150 平方ヤード）を適用した。炭疽
病及び苗立枯れ病を制御するため初期苗床段階で必要に
応じて葉面散布としてカルバメート76wp（３ １ｂ／10
0galの水）も同様に使用された。正規の移植サイズで
は、Dipel （１／２lb／Ａ）が適用された。必要に応じ
てアリマキやイモムシを制御するためOrthene （２／３
lb／Ａ）が適用された。移植 ． 実験１は、実験２の苗床から引き抜いた実生を
用いて移植された。
【０１７４】接種． 実験１：NPT II，α−トリコサン
チン又はイネα−アミラーゼを含む選択された組換え型
植物ウイルス核酸を、各々の非対照植物の単葉に手で接
種した。個別の植物各々には単一のベクターを接種し
た。 実験２：植物が最後に刈り込まれている間に刈り込み用
芝刈り機のデッキを通して適用されるスプレーを用い
て、実験１で記述されたベクターを植物に接種した。各
々の非対照小区画は、単一のベクター構成体を受け入れ
た。対照植物は、どのベクターの接種も全く受けなかっ
た。
【０１７５】データ収集． 実験１：接種された植物及
び対照植物の両方の葉の試料採取は、植物が約30インチ
の丈になるまで第１の成長中に予定通り（ほぼ週１回）
行なわれた。次に植物を回転ブラシグレードで切断し
（収穫１）て、地面より上に露出した柄を６インチ残し
た。次に植物を、約30インチの高さまで成長し続けさせ
た（第２の生長)。収穫２の直前に、葉の試料を取った。
切断、成長及び試料採取のためのこの手順は、ベクター
内に挿入された検出可能な量の問題の遺伝子が見い出さ
れた場合、第３の成長及び第４の成長について繰返され
た。
【０１７６】実験２：各々の小区画からの10本の植物の
試料採取は、接種から収穫１まで及び収穫１から収穫２
まで予定通り（ほぼ一週間毎に）行なわれた。収穫２の
後、試料採取は収穫３においてのみ行なわれた。試料サイズ及び分析方法 植物の頂部近くの単葉から
1.6cmの盤を切除した。各々の葉盤を、無水エタノール
を含むネジキャップのついた25ml入りのガラス製バイア
ル内又は密封可能なプラスチック袋の中に入れた。葉盤
は、無水エタノール内に保存するか又は凍結乾燥した。
検出すべき特異的遺伝子産物に応じて、葉の試料を、ノ
ーザン又はウエスタンブロット分析又は特異的酵素活性
のための標準的技術に従って調製した。
【０１７７】最初の成長の間、ベクターシステムのあら
ゆる外部表現型発現を観察するべく、RPVNA で処理され
たpIantsの目による監視を行なった。いくつかのケース
において、表現型発現は、タバコモザイクウイルス感染
に典型的であった（葉内のより明るい及びより暗い「モ
ザイク」パターン）、その他のケースにおいては、見ら
れた唯一の症状は、直径約２mmの白又は褐色の斑及び／
又は葉上の中央葉脈の伸長の抑制を含め、接種された葉
上にあった。
【０１７８】例６．OMV ゲノムの全長DNA コピーを、Da
wson, W.O. etal. (4)により記述されているとおりに調
製する。OMV ゲノムのDNA コピーを含むベクターを適切
な制限酵素又は適切なエキソヌクレアーゼで消化して、
外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。ウイル
ス外皮タンパク質に対するコーディング配列の欠失は、
OMVを分離し、それを用いて発芽しつつある大麦植物を
感染させることによって、確認される。分離されたOMV
RNA は、自然条件下で病巣を超えて拡散することはでき
ない。OMV 配列を含むベクターは、例１〜３に記述され
ているとおりに調製される。
【０１７９】例７．ゲノムの全長DNA を、Dawson, W.O.
etal. (4)によって記述されているとおりに調製する。
ENV ゲノムのDNA コピーを含むベクターを、適切な制限
酵素又は適当なエキソヌクレアーゼを用いて消化して、
外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。ウイル
ス外皮タンパク質に対するコーディング配列の欠失は、
RNVRNA を分離しそれを用いて発芽しつつある大麦植物
を感染させることによって確認される。分離されたウイ
ルスは、自然条件下で病巣を超えて拡散できない。OMV
配列を含むベクターを、例１〜３に記述されている通り
に調製する。
【０１８０】例８．PVY 又はPVX ゲノムの全長DNA コピ
ーをDawson, W.O. etal. (4)によって記述されている通
りに調製する。PVY 又はPVX ゲノムのDNA コピーを含む
ベクターを、適切な制限酵素又は適当なエキソヌクレア
ーゼを用いて消化して、外皮タンパク質コーディング配
列を欠失させる。ウイルス外皮タンパク質に対するコー
ディング配列の欠失は、PVY 又はPVX ENA を分離しそれ
を用いてサツマイモ植物を感染させることによって確認
される。分離されたPVY 又はPVX RNA は、自然条件下で
病巣を超えて拡散できない。OMV 配列を含むベクター
を、例１〜３に記述されている通りに調製する。
【０１８１】例９．メイズ（トウモロコシ）条斑ウイル
ス（MSV)ゲノムの全長DNA コピーをDawson, W.O. etal.
(4)によって記述されているとおりに調製する。MSV ゲ
ノムのDNAコピーを含むベクターを適切な制限酵素又は
適当なエキソヌクレアーゼで消化して、外皮タンパク質
コーディング配列を欠失させる。ウイルス外皮タンパク
質に対するコーディング配列の欠失は、MSV を分離しそ
れを用いてサツマイモ植物を感染させることによって確
認される。分離されたMSV は、自然条件下で病巣を超え
て拡散できない。OMV 配列を含むベクターを、例１〜３
に記述されているとおりに調製する。
【０１８２】例10．TGMVゲノムの全長DNA コピーを、Da
wson, W.O. etal. (4)によって記述されているとおりに
調製する。TGMVゲノムのDNA コピーを含むベクターを適
切な制限酵素又は適切なエキソヌクレアーゼで消化し
て、外皮タンパク質コーディング配列を欠失させる。ウ
イルス外皮タンパク質に対するコーディング配列の欠失
は、TGMV RNAを分離しそれを用いてサツマイモ植物を感
染させることによって確認される。分離されたTGMV RNA
は、自然条件下で病巣を超えて拡散できない。TGMA配列
を含むベクターを、例１〜３に記述されているとおりに
調製する。
【０１８３】例11．ベーターサイクロデキストリングル
コトランスフェラーゼに対するコーディング配列を以下
の要領でアルカリ親和性Bacillus sp.菌株No.38 −２か
ら分離する：菌種No.38 −２（66）の染色体DNA をSau
3AIで部分的に分割させ、フラグメントをBam HI 消化
されたpBR322内で連結させる。産生菌種のゲノムからの
3.2kbのDNA フラグメントを含む、形質転換体を支持す
るプラスミドpcs115は、CGT活性を有する。この形質転
換体により産生されるCGT は、オクタロニー２重拡散試
験によりNo.38 −２CGT に対するものと完全に融合する
１本の沈降ラインを与える。フラグメントのヌクレオチ
ド配列は、puc19 を用いたジデオキシ連鎖終端反応（チ
ュインターミネータ法）及びエキソヌクレアーゼ欠失方
法（67）によって発見される。
【０１８４】フラグメントのヌクレオチド配列は、CGT
遺伝子に対応する単一の読取り枠を示す。66kDalの分子
質量をもつタンパク質を1758bpのこの読取り枠から翻訳
することが可能である。詳しいヌクレオチド配列につい
ては、ハナモト、T. ex. al.(66）を参照のこと。
【０１８５】細胞外形状のCGT のＮ末端アミノ酸の配列
は、ペプチドシークエンサで発見される。NH2-Ala-Pro-
Asp-Thr-Ser-Val-Ser-A5n-Lys-Gln-Asn-Phe-Ser-Thr-As
p-Val-Ile(SEQ ID NO : 6)はDNA 配列（残基１〜17）か
ら演繹されたものと同一である。この結果は、27個のア
ミノ酸残基（残基−27〜−１）が、CGT の分泌中に除去
されるシグナルペプチドを表わしていることを示唆して
いる。DNA 配列から計算された成熟CGT の分子量は、6
3,318である。
【０１８６】サイクロデキストリングルカ／トランスフ
ェラーゼのアミノ酸配列の一部分に基づきプローブが調
製され、これはこの酵素に対するコーディング配列を分
離するために用いられる。代替的には、ベータサイクロ
デキストリングルコトランスフェラーゼコーディング配
列は、逆転写の後に分離される。コーディング配列を含
むフラグメントは、例６−10において調製されたベクタ
ー内の天然ウイルス外皮タンパク質遺伝子のサブゲノミ
ックプロモータに隣接して分離されクローニングされ
る。
【０１８７】例12．例11のRPVNA を用いて、コーン（ト
ウモロコシ）植物（OMV, RNV又はTGMVに基づくウイル
ス）又はサツマイモ植物（PVY 又はPVX に基づくウイル
ス）を感染させる。感染を受けた植物は、正規の成長条
件下で成長させられる。植物は、植物組織内のサイクロ
デキストリンへのでんぷんの変換の触媒として作用する
サイクロデキストラン・グルコトランスフェラーゼを産
生する。サイクロデキストリンは、従来の技術を用いて
分離される。
【０１８８】例13． Ａ．エステラーゼに対するコーディング配列を、Bacill
us subtilis Thai 1〜8 (CBS 679.85)から以下のとおり
に分離する。正の選択ベクターpUN121（68）を使用す
る。このベクターはアンピシリン耐性遺伝子、テトラサ
イクリン耐性遺伝子及びＣ1 −抑制遺伝子を支持してい
る。テトラサイクリン遺伝子の転写は、Ｃ 1 −抑制遺伝
子の遺伝子産物によって妨げられる。外来性DNA がＣ1
−抑制遺伝子のBcl I部位内に挿入されると、テトラサ
イクリン遺伝子の活性化という結果がもたらされる。こ
うして、アンピシリン／テトラサイクリン寒天平板上で
の組換え体の正の選択が可能となる。
【０１８９】部分的にSau 3aで消化されたBacillus sub
tillis Thai 1 −8 DNA は、Bcl I消化されたpUN121DNA
と混合される。ポリヌクレオチドリガーゼの使用によ
る再循環の後、Cacl2 形質転換手順を用いてE. coli DH
1 (ATCC No.33849)の中にDNA 混合物を導入する。アン
ピシリン及びテトラサイクリンに対する耐性をもつ1000
のE. coliコロニーが得られる。全ての形質転換体をGe
rgan et al. (69)に従って保存し、レプリカ平板法に付
す。複製されたコロニーを、エステラーゼ活性の検出の
ため以前に記述された手順に基づいて軟寒天オーバーレ
イ技術を用いてスクリーニングする。
【０１９０】基本的に、形質転換体全体にわたり、 0.5
％の低溶融アガロース、 0.5Ｍのリン酸カリウム(pH7.
5), 0.5mg／ｌのβ−酢酸ナフチル及び 0.5mg／mlのフ
ァストブルーを広げる。数分以内で、エステラーゼ又は
リパーゼ活性を伴うコロニーが紫色を発生させる。この
ようなコロニーを ZX YT（16ｇ／ｌのBactotryptone, 1
0 ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのNaCl）培地の中で一
晩成長させ、次にＳ−ナプロキセンエステルをＳ−ナプ
ロキセンに変換するその能力について検定する（EP-A02
33656 の例１の方法）。１つのE. coli 形質転換体は、
Ｓ−ナプロキセンエステルを変換することができる。こ
の形質転換体から、 pNAPT−２（CBS67186) と呼ばれる
プラスミドを分離する。そのサイズは 9.4kbである。
【０１９１】pNAPT−２のHind III制限酵素フラグメン
トを pPNE0／ori 内へ連結させる。これは、以下に記す
通りに行なう。pUC19 の 2.7kbの EcoRI／Sma Ｉ制限フ
ラグメントをpUB110の 2.5kbの EcoRI／Sna BI制限フラ
グメントに連結することにより、 pPNeo／ori を構築す
る。結果として得られたシャトルプラスミド pPNeo／or
i (5.2kb）は、pUC19 起点及びpUB110起点の存在のため
E.coliとBacillus種の両方において複製する能力をも
つ。さらに、 pPNeo／ori は、アンピシリン耐性をコー
ドする遺伝子及びネオマイシン耐性をコードする遺伝子
を支持する。
【０１９２】サブクローニングのためには、Hind III消
化された pNAPT−２をHind III消化された pPNeo／ori
と混合し、連結させる。この混合物を、記述されている
とおり（Maniatis et al.,前出）E. coliJM101 hsdsへ
と形質転換する。E. coli JM101 hsdsは、Phabagen収蔵
機関から入手する（受入れ番号No. PC2493, Utrecht、
オランダ）。酢酸β−ナフチルを加水分解することので
きるコロニーを、EPA0233656の例56に記されている通り
に選択する。２つの正のコロニー pNAPT−７及び pNAPT
−８から、プラスミドDNA を分離し、いくつかの制限酵
素認識位置を決定することにより詳細に特徴づけする。
【０１９３】Ｂ．E. coliエステラーゼに対するコーデ
ィング配列は、以下のように調製される：プラスミドpI
P1100(E. coli BM2195 から分離されたもの）及びpBR3
22を混合し、Ava Ｉで消化し、連結し、E. coliへと形
質転換し、クローンをEm(200／ｇ／ml）上で選択する。
Ap及びEmのみならずSmに対する耐性をもつ形質転換体
を、粗リゼイトのアガロースゲル電気泳動によって分析
する。最小のハイブリッドプラスミドを擁する形質転換
体を選択し、そのプラスミドDNA をAva Ｉで消化し、3.
5kb のpIP100インサートを精製し部分的にSau 3Aで消化
する。得られた制限フラグメントをpBR322のBam HI部位
内へクローニングし、Emで選択された形質転換体をSm上
でレプリカ平板法に付す。
【０１９４】Ap及びEmに対してのみ耐性をもつ突然変異
体のプラスミド含有量を、アガロースゲル電気泳動によ
り分析する。最小のハイブリッドpAT63 からのDNA を精
製し、Sau 3A，Eco RI，Pst Ｉ又はHind III−Bam HIエ
ンドヌクレアーゼ（図示せず）での消化の後にアガロー
スゲル電気泳動によって分析する。プラスミドpAT63
は、pBR322と1.66kbのpIP1100 DNA インサートから成
る。PAT63 の精製された E−Hind III (1750−bp）及び
Bam HI−Pst Ｉ(970−bp) フラグメントは PUC８内にサ
ブクローニングされ、Em耐性を付与しないことがわか
る。PAT63 の HpaII−BamHI フラグメントはSanger技術
によって配列決定される。完全な配列は、Ounissi, H.
et al.（71）内に示されている。Ｃ．アシラーゼからの
コーディング配列は、Arthrobacter viscosus 8895GU,A
TCC27277 から、以下のように分離される：pACY184 のE
co RI分割部位の中にEco RI分割されたA. viscosus染
色体DNA を挿入することによりA. viscosus8895GU の遺
伝子ライブラリを構築する。ベクターDNA 及びA. visco
sus DNA の両方をEco RIで消化する。ベクターDNA の
５′末端を、仔ウシ腸内アルカリ性ホスファターゼで脱
リンする。脱リンされたベクターのDNA 及び消化された
A. viscosus DNA をT4 DNAリガーゼでインキュベート
し、E. coli HB101 へと形質転換させる。
【０１９５】E. coliの形質転換されたコロニーをSerr
atia marcescensオーバーレイ技術によりスクリーニン
グした。培地にはペニシリンＧを付加した。S. marcesc
ensは、ペニシリンＧの脱アシル化産物、６−アミノペ
ニシラミン酸（６−APA)に対する感受性をもつ。形質転
換されたE. coli のコロニーは、一晩の培養内でS.marc
escens阻害の部域を生み出すことになる。形質転換され
たE. coliが支持するプラスミドを、pHYM−１と呼ぶ。
反対のDNA 配向を有するプラスミドは、pHYM−２（72）
と呼ばれる。
【０１９６】Ｄ．ヒト胃リパーゼmRNAに対するコーディ
ング配列を、凍結組織のイソチオシアン酸グアニジニウ
ムによって調製する。ポリアデニル化RNA を、オリゴ
（dt）−セルロースクロマトグラフィによって分離す
る。当該技術分野において周知の手順によりヒト胃mRNA
からcDNAを調製する。cDNAを、Pst Ｉ−切断したdGテイ
ルをもつpBR322にアニールする。ハイブリッドプラスミ
ドをE. coli DH1内に形質転換させる。ニトロセルロー
スフィルター上でのコロニーハイブリダイゼーションに
より形質転換体をスクリーニングする。使用するプロー
ブは、ラット舌側リパーゼ遺伝子から合成され、ニック
トランスレーションによって標識付けされる。正のコロ
ニーを成長させ、制限エンドヌクレアーゼ地図作製によ
りプラスミドを分析する。
【０１９７】上述のように調製されたエクステラーゼ、
アシラーゼ又はロパーゼ遺伝子を適切なベクターから除
去し、緑豆ヌクレアーゼ又はDNA ポリメラーゼＩを用い
て平滑末端化させ、Xho Ｉリンカーを付加する。Xho Ｉ
リンカーを伴うこのエステラーゼを、Xho Ｉで分割し、
例１−３又は６−10で記述されているベクターの中に挿
入する。例２に従って調製したRPVNA による適切な宿主
植物の感染は、植物組織内のエステラーゼ、アシラーゼ
又はリパーゼの合成という結果をもたらす。酵素は、従
来の技術により分離及び精製され、立体特異的化合物を
調製するのに用いられる。
【０１９８】例14．CMS−Ｔに対するコーディング配列
を、Dewey, R.E.et al.(73）により記述されている通り
にBam HIメイズ（トウモロコシ）mtDNA ライブラリから
分離する。ORF−13コーディング配列を制限エンドヌク
レアーゼ消化とそれに続く開始コドンに対する５′−エ
キソヌクレアーゼ消化によって、分離する。代替的に
は、部位特異的オリゴヌクレオチド突然変異誘発により
ORF−13コーディング配列の開始コドンに隣接して制限
部位を処理する。適切な制限酵素での消化が、 ORF−13
に対するコーディング配列を生み出す。 ORF−13コーデ
ィング配列を含むフラグメントを分離し、例６，７及び
10で調製されたベクター内で天然ウイルス外皮タンパク
質遺伝子のプロモータに隣接してクローニングする。
【０１９９】メイズ（トウモロコシ）植物を、例１に従
って調製されたRPVNA で感染させる。感染を受けた植物
を正規の成長条件下で成長させる。植物は、感染を受け
たメイズ植物内で雄性不稔を誘発する cms−Ｔを産生す
る。
【０２００】例15．Ｓ 2 −タンパク質のコーディング配
列（自家不和合性に対する）を、EP−A0222526内に記述
されている通りにNicotiana alata から分離する。Ｓ 2
−タンパク質のコーディング配列を制限エンドヌクレア
ーゼ消化とそれに続く開始コドンに対する５′エキソヌ
クレアーゼ消化によって分離する。代替的には、部位特
異的オリゴヌクレオチド突然変異誘発によりＳ2 −タン
パク質コーディング配列の開始コドンに隣接して制限部
位を処理する。適切な制限酵素での消化が、Ｓ 2 −タン
パク質に対するコーディング配列を生み出す。Ｓ 2 −タ
ンパク質コーディング配列を含むフラグメントを分離
し、例１〜３において調製されたベクター内でウイルス
外皮タンパク質遺伝子のプロモータに隣接してクローニ
ングする。
【０２０１】花粉形成に先立ち、例１に従って調製され
たRPVNA によってタバコ植物を感染させる。感染を受け
た植物は、正規の成長条件下で成長させられる。この植
物は、自家不和合性メカニズムを介して雄性不稔を誘発
するＳ−タンパク質を産生する。以下の例は、本発明の
植物RNA ウイルスベクターを用いて高レベルの治療的タ
ンパク質を発現させ得るということを立証している。
【０２０２】例16．新しいRNA ウイルスベクターを用い
た、トランスフェクションを受けた植物内での生物学的
活性をもつα−トリコサンチンの急速かつ高レベルの発
現 トリコサンチンは、中国薬草の根に見い出される真核性
リボソーム不活性化（失活）タンパク質である。Tricho
santhes Kirilowii Maximowiczの中では、α−トリコサ
ンチンは、28SrRNA 内のＮ−グリコシド結合の分割に触
媒作用する単量体タンパク質である（75，76）、この反
応は、延長因子と相互作用する60Ｓリボソームサブユニ
ットの能力に影響を及ぼすことによってタンパク質合成
を阻害する。成熟化合物は、27kDa というおおよその相
対分子質量をもち、当初プレタンパク質として産生され
る（77）、その生合成中に、推定される23アミノ酸分泌
シグナルペプチドが除去され、おそらく19アミノ酸ペプ
チドがカルボキシ末端から切除される。
【０２０３】精製されたT.kirilowii 誘導のα−トリコ
サンチンは、急性感染を受けた CD4 + リンパ系細胞内及
び慢性感染を受けたマクロファージ（78，79）内でHIV
複製の濃度依存性阻害をひき起こす。この化合物は、現
在、HIV 感染に対する治療における考えられる治療的薬
剤として臨床研究で評価されつつある。α−トリコサン
チンによる抗HIV 感染の正確なメカニズムはわかってい
ない。HIV 複製の触媒作用及び阻害に関与するアミノ酸
は、部位特異的突然変異誘発を用いて同定できる。
【０２０４】詳細な構造／機能分析には、組換え型タン
パク質の豊富な供給源ならびに突然変異体を生成し分析
する急速な方法が必要とされる。E.coliにおけるα−ト
リコサンチンの発現は以前に報告された（81，97）が、
合成される量は少なく（細胞タンパク質全体の約0.01
％）、カルボキシ末端延長部分は除去されず、化合物の
生物学的活性は見極められなかった。
【０２０５】約 6.4kbのプラス−センスRNA 鎖１本から
成るゲノムをもつトバモウイルス（Tobamoviruses)が非
相同タンパク質を産生するのに用いられた。ウイルスcD
NAクローンからのRNA 転写物は、RNA 複製、運動及び包
膜に関与するタンパク質をコードする感染性鋳型として
役立つ。伝令RNA 合成のためのサブゲノミックRNA を、
マイナス−センスRNA 鎖（83）上にある内部プロモータ
によって制御する。タバコ原形質体内のロイ−エンケフ
ァリン（84）及び接種を受けたタバコの葉の中の細菌性
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（8
5，86）を発現するために、以前はTMV RNA ウイルスを
使用していた。
【０２０６】外来性遺伝子を発現するためのこれらの以
前の試みは、不安定な構成体又は長距離ウイルス運動の
喪失といういずれかの結果をもたらした。最近になっ
て、タバコモザイクウイルス菌株Ｕ１(TMV−U1）とオド
ントグロッサム輪紋病ウイルス（ORSV）からの付加的な
RNA サブゲノミックプロモータで構成されたハイブリッ
ドウイルスでのトランスフェクションを受けたNicotian
a benthamiana 植物が、全身的かつ安定したネオマイシ
ンホスフォトランスフェラーゼの発現を生み出している
（87）。
【０２０７】pBGC152 の構築 プラスミド pSP６−Tku １は、オリゴヌクレオチド特異
的突然変異誘発によりSP６プロモータに融合され、 Xho
Ｉ／ KpnＩフラグメントとしてpUC118内に挿入された全
TMV−Ｕ１ゲノムを含んでいる。TMV ゲノムに対しSP６
プロモータ配列を付着させるのに用いられる突然変異誘
発プライマーの配列は次の通りである：5′ -GGGCTCGAG
ATTTAGGTGACACTATAGTATTTTTACAACAATTACCA -3′
【０２０８】なおここでXho Ｉ部位はイタリック体で記
され、SP６プロモータは肉太活字で示されTMV 配列には
下線が施こされている。プライマーは、pC48と呼ばれる
TMVサブクローンに付着された (Raffo et al., Virol
ogy 184 ： 277−289 (1991)) 。上述のプライマ及びT
MV 配列5673〜5692に相補的なプライマーを用いたPCR
により、プロモータを付着させた。この増幅は、ca. 61
4bp のフラグメントを産生し、このフラグメントを次に
Xho Ｉ及びEco RI（TMV270）で消化してca. 292bp フラ
グメントを産生し、次にこのca. 292bp フラグメントを
同様に切断されたPUC129内にサブクローニングして、結
果としてプラスミド pSP６−Ｔ１を得た。
【０２０９】pSP６−Ｔ１をXho Ｉ及びXma Ｉ（TMV256
で切断するSma Ｉアイソシゾマー）で切断し、結果とし
て得られたca. 278bp フラグメントを、ゲノムの５′末
端の唯一のPst Ｉ部位で切断しT4 DNAポリメラーゼで平
滑末端化しその後Xho Ｉリンカーを付加することによっ
て変更されていたpTku１（Dorson, et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 88 ：7204〜7208 (1991))の中に連
結させた。こうして感染性クローン pSP６−Tku １及び
消化されたX maＩという結果がもたらされた。
【０２１０】図９に示されているように、Eco RI，DNA
ポリメラーゼ（クレノウ）及びKpnＩリンカーを用い
て、pBR322内のEco RI部位をKpn Ｉ部位に突然変異誘発
させた。結果として得られたプラスミドpBSG121 のKpn
Ｉ＼Bam HIフラグメントをpTBzのKpn Ｉ＼Bam HIフラグ
メント（1992年７月24日に寄託された ATCC No.75280)
で置換した。結果として得られたプラスミドpBSG122 の
Sal Ｉ／Kpn Ｉフラグメントを pSP６−Tku Ｉの XhoＩ
／Kpn Ｉフラグメントで置換し（Ｔ１としても知られて
いる）、結果としてプラスミドpBGC150 を得た。
【０２１１】pBGC150 のBam HI／Kpn Ｉフラグメント
を、 pTB２／ＱのBam HI／Kpn Ｉフラグメントと置換
し、結果としてプラスミドpBGC152 を得た。本書中にそ
の内容が参考として内含されているPiatak, Jr.,et al
の米国特許第 5,128,460号の中に記述されているプラス
ミドpQ21D (ATCC No.67907) から始めて、 pTB２／Ｑを
構築した。pQ21D 内のTCS 配列のPCR 増幅された0.88kb
のXho Ｉフラグメントを含むプラスミド「クローン５
Ｂ」は、５′-CTCGAGGATG ATC - -- ---//--- --- ATT
TAG TAA CTCGAG- ３′（Xho Ｉ部位はイタリック体）と
いう配列が得られるようにpQ21D の開始及び停止コドン
でXho Ｉクローニング部位を導入するのにオリゴヌクレ
オチド突然変異誘発を用いて得られた。「クローンＢ」
からの0.88kbのXho Ｉフラグメントを、プラスミド pTB
２／Ｑを生み出すような向き（センスの方向）でプラス
ミド pTB２のXho Ｉ部位内にサブクローニングした。
【０２１２】トランスフェクションを受けた植物のイン
ビトロ転写、接種及び分析 以前に記述されたとおり（89）、N. benthamiana植物
に、 KpnＩ消化されたpBGC152 のインビトロ転写物を接
種した。BGC152転写物での感染を受けたN. benthamiana
の葉からビリオンを分離させ、２％の水性酢酸ウラニル
で染色し、ZeissCEM902計器を用いて透過型電子顕微鏡
写真を撮った。
【０２１３】α−トリコサンチンの精製、免疫学的検出
及びインビトロ検定 接種後２週間目に、接種を受けていない上部のN. benth
amianaの葉の組織 3.0グラムから合計可溶性タンパク質
を分離した。液体窒素中で葉を凍結させ、３mlの５％の
２−メルカプトエタノール、10mMのEDTA, 50mMのリン酸
カリウムpH6.0の中で摩砕した。懸濁液を遠心分離し、
組換え型α−トリコサンチンを含む上清を、20mMのNaC
l, 50mMのリン酸カリウムpH6.0 で平衡化されたSephade
x G−50カラムに装てんした。試料を次に、 Sepharose
−５ Fast Flowイオン交換カラムに結合させた。アルフ
ァ−トリコサンチンをpH6.0 の50mMのリン酸カリウム内
で 0.002−１Ｍ NaCl の線形勾配で溶出させた。
【０２１４】Centricon−20（Amicon）でα−トリコサ
ンチンを含む分画を濃縮させ、ダイアフィルトレーショ
ン(Centricon−10, 50mMのリン酸カリウム、pH6.0, 1.7
Ｍの硫酸アンモニウム）により緩衝液を交換した。次に
試料をHR５／５アルキルSuperose FPLC カラム（Pharma
coa)上に装てんし、線形硫酸アンモニウム勾配で（50mM
のリン酸カリウム中 1.7〜０Ｍの硫酸アンモニウム、pH
6.0)溶出した。標準としてBSA を用いて、合計可溶性植
物タンパク質濃度を決定した（90）。α−トリコサンチ
ンの濃度を、Ｅ280 ＝1.43のモル吸光係数を用いて決定
した。精製タンパク質を 0.1％の SDS，12.5％のポリア
クリルアミドゲル（91）上で分析し、一時間の電気ブロ
ッティング（吸収転移）によりニトロセルロース膜にト
ランスファした。
【０２１５】ブロットを受けた膜を、ヤギ抗−αトリコ
サンチン抗血清の2000倍希釈液を用いて１時間インキュ
ベートした。増強された化学発光ホースラディッシュ
（ワサビダイコン）ペルオキシダーゼ結合されたウサギ
抗ヤギIgG (Cappel)を、メーカー（Amersham）の仕様に
従って発達させた。１秒未満の時間、オートラジオグラ
ムを露出した。抽出した葉の試料中の全ての組換え型α
−トリコサンチンの量を、粗抽出液オートラジオグラム
シグナルを既知の量の精製されたGLQ223から得られたシ
グナルに比較することによって、決定した。ウサギの網
状赤血球のリゼイトシステム内でのタンパク質合成の阻
害を測定することにより、リボソーム不活性化活性を決
定した。
【０２１６】生物学的活性を有するα−トリコサンチン
の高レベル発現の確認 本発明の植物ウイルスベクターは、トランスフェクショ
ンを受けた植物におけるα−トリコサンチンの発現を誘
導する。ゲノミッククローンpQ21D (88)からのα−トリ
コサンチンのための読取り枠(ORF）は、タバコモザイク
ウイルス(TMV)外皮タンパク質サブゲノミックプロモー
タの制御下に置かれた。
【０２１７】SP６DNA 依存性RNA ポリメラーゼを用いた
インビトロ転写により、pBGC152 （図４）からの感染性
RNA を調製し、機械的にN. benthamianaに接種するのに
使用した。透過型電子顕微鏡写真（図５）、局所的病巣
感染性検定及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 増幅（20；
データは示さず）によって確認されるように、接種を受
けていない全ての上部葉にわたり、ハイブリッドウイル
スが広がっている。
【０２１８】上部葉（接種後14日目）の中で合計可溶性
タンパク質の少なくとも２％のレベルまで、27kDa のα
−トリコサンチンが蓄積し、標準として精製されたT.ki
rilowii 誘導のα−トリコサンチンであるGLQ223（78）
を用いて免疫グロッティングによってこれを分析した
（図６）、感染を受けていないN. benthamiana対照植物
抽出物の中には、検出可能な交叉反応タンパク質は全く
観察されなかった（図６，レーン５）。クーマシー染料
を用いて７μｇの葉の粗抽出液の中に、組換え型α−ト
リコサンチンが容易に検出された（図７，レーン３）。
【０２１９】従来の研究者は、合計可溶性タンパク質の
２％という遺伝子的に操作された植物における外来性タ
ンパク質の最大蓄積量を報告している。抗体及びヒト血
清アルブミンといった潜在的に貴重なタンパク質の発現
が以前に報告されたものの（94，95）、これらは、アグ
ロバクテリウムが媒介した遺伝子導入植物の中で産生さ
れた。この植物のウイルス発現システムと以前の方法の
間の主要な相異点は、産生されるタンパク質の量及び、
遺伝子的に操作された植物を得るのに必要とされる時間
にある。単一の遺伝子導入植物を作り出すのに数カ月か
かるのに対してα−トリコサンチンの全身性感染及び発
現は２週間未満で発生した。
【０２２０】トランスフェクションを受けたN. bentham
iana（接種後14日目）内の上部葉から産生され精製され
たα−トリコサンチンは、天然α−トリコサンチンと構
造的に同一であった。27kDa のタンパク質は抗−α−ト
リコサンチン抗体と交叉反応し、GLQ223標準と同一のFP
LC精製プロフィールを有していた。組換え型タンパク質
のＣ末端配列は分析されなかったが、GLQ223も精製され
た組換え型α−トリコサンチンも両方共、同一の電気泳
動移動度を有するように思われた（図７）。組換え型α
−トリコサンチンの精確なＣ末端アミノ酸は、今後決定
していくべきものである。Ｎ末端配列、Asp-Val-Ser-Ph
e-Arg-Leu-Ser は、自動化されたタンパク質シークエン
サー（96）を用いて精製タンパク質から得られた。
【０２２１】この結果は、調製物の推定上のシグナルペ
プチドが、図１に示されている部位で正しく処理されて
いることを示していた。この部位における推定上のシグ
ナルペプチドの除去は、von Heijne (97）の方法による
統計学的予測と一貫性あるものであった。α−トリコサ
ンチンシグナルペプチドが、タンパク質を細胞外空間内
にターゲッティングすることによってその高レベルの発
現に寄与した可能性がある。α−トリコサンチン開始コ
ドンをとり囲むヌクレオチド配列は同様に、翻訳の開始
の効率にも影響をもつ可能性がある。
【０２２２】高度に発現された TMV−U1（５′TTAAATAT
GTCT３′）及びORSV５′TGAAATATGTCT３′）外皮タンパ
ク質遺伝子の翻訳開始部位に隣接する（フランキング）
ヌクレオチドが、 pBGC152／α−トリコサンチン（５′
TCGAGGATGATC３′）内の相応する領域が非常にわずかの
類似性しか示さない間に保存される、という点に留意す
ると興味深い。α−トリコサンチンの翻訳開始部位近く
のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発がその発現を
増大することは可能である。
【０２２３】組換え型α−トリコサンチンは、細胞無し
のウサギ網状赤血球翻訳検定（図８）においてタンパク
質合成の濃度依存性阻害をひき起こした。ID50（50％の
阻害に必要とされる用量）は約 0.1ng／mlであり、これ
はT. kirilowii誘導のα−トリコサンチン（GLQ223）に
匹敵する値であった。ID50及び用量応答に基づいて、ト
ランスフェクションを受けた植物内で産生された酵素
は、天然タンパク質と同じ特異的活性を有していた。こ
の結果は、ウイルスの増幅中の外来性配列内の塩基対の
置換及び欠失が組換え型酵素の特異的活性を低下させる
ことから、ウイルスRNA 依存性RNA ポリメラーゼの適合
度が比較的高かったということを示唆している。
【０２２４】開示され請求されている発明が立証してい
るように、pBGC152 は、トランスフェクションを受けた
植物の中での生物学的活性をもつα−トリコサンチンの
非相同発現を誘導することができる。組換え型タンパク
質の大規模産生は、接種された植物のサイズ及び数を単
純に増大させることによりRNA ウイルスベースのシステ
ムを用いて容易に得られる。高濃度のα−トリコサンチ
ンを含む組織は接種後２週間目に収穫できることから、
このシステムは、部位特異的突然変異の効果を迅速にス
クリーニングするために使用できる。インビボでのHIV
複製の阻害に関与する重要なアミノ酸の同定は、可能性
あるエイズ治療用薬剤としてのα−トリコサンチンの効
力を改善する一助となるかもしれない。
【０２２５】以下のプラスミドは、特許手続き及びそれ
に基づく規制を目的とした微生物の寄託の国際的認知に
関するブダペスト条約（ブタペスト条約）の条項の下で
米国標準培養収蔵機構（ATCC），Rockuill, MD. USA に
寄託され、かくしてブダペスト条約の条項に従って維持
され利用可能な状態におかれている。このようなプラス
ミドの利用可能性は、いかなる政府であれその特許法に
従ったその権限の下で許可された権利を侵害して本発明
を実施する許可とみなされてはならない。
【０２２６】寄託された培養には、表示通りのATCC寄託
番号が割り当てられた： 本発明は本特許出願において、発明の好ましい実施態様
の詳細を参考にしながら開示されてきたが、当業者であ
れば発明の精神及び添付クレームの範囲内で容易に変更
を考えつくと思われることから、この開示は、制限的意
味をもたずむしろ例示的意味をもつものであると理解さ
れるべきである。
【０２２７】参 考 文 献 １．Grierson, D. et al., Plant Molecular Biology,
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【０２４０】
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【化１】
【化２】 ＜２１０＞ ４ ＜２１１＞ 289 ＜２１２＞ PRT ＜２１３＞ Chinese cucumber ＜２２０＞ ＜２２３＞ Amino acid sequence of alpha-tricosanthin ＜４００＞ ４
【化３】
【化４】 ＜２１０＞ ５ ＜２１１＞ 1452 ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Oryza Sativa ＜２２０＞ ＜２２１＞ CDS ＜２２２＞ (12)…(1316) ＜２２３＞ Nucleotide sequence encoding alpha-amylase ＜４００＞ ５
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】 ＜２１０＞ ６ ＜２１１＞ 434 ＜２１２＞ PRT ＜２１３＞ Oryza Sativa ＜２２０＞ ＜２２３＞ Amino acid sequence of alpha-amylase ＜４００＞ ６
【化９】
【化１０】 ＜２１０＞ ７ ＜２１１＞ 709 ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Homo Sapiens ＜２２０＞ ＜２２１＞ transit-peptide ＜２２２＞ (26)…(241) ＜２２１＞ CDS ＜２２２＞ (245) …(670) ＜２２３＞ Nucleotide sequence of cDNA encoding alpha-hemoglobin ＜４００＞ ７
【化１１】
【化１２】 ＜２１０＞ ８ ＜２１１＞ 141 ＜２１２＞ PRT ＜２１３＞ Homo Sapiens ＜２２０＞ ＜２２３＞ Amino acid suquence of alpha-amylase ＜４００＞ ８
【化１３】 ＜２１０＞ ９ ＜２１１＞ 743 ＜２１２＞ DNA ＜２１３＞ Homo Sapiens ＜２２０＞ ＜２２１＞ Transit-peptide ＜２２２＞ (26)…(241) ＜２２１＞ CDS ＜２２２＞ (245) …(685) ＜２２３＞ Nucleotide sequence of cDNA encoding beta-hemoglobin ＜４００＞ ９
【化１４】
【化１５】 ＜２１０＞ 10 ＜２１１＞ 146 ＜２１２＞ PRT ＜２１３＞ Homo Sapiens ＜２２０＞ ＜２２３＞ Amino acid suquence of beta-hemoglobin ＜４００＞ 10
【化１６】 ＜２１０＞ 11 ＜２１１＞ 17 ＜２１２＞ PRT ＜２１３＞ Alkarophilic Baccillus sp. ＜２２０＞ ＜２２３＞ N-terminal fragment ＜４００＞ 11 Ala Pro Asp Thr Ser Val Ser Asn Lys Gln Asn Phe Ser Thr Asp Val 1 5 10 15 Ile
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に従い調製されたいくつかのベ
クターおよび制限部位を図解する。Ｕ１は天然植物ウイ
ルスの核酸であり、Ｏは非天然植物ウイルスの核酸であ
り、そしてハッチングした区域は非天然植物ウイルスの
サブゲノムのプロモーターである。制限部位は次の通り
である： X−XhoI,N−NsiI,K−KpnI,S−SplI,B−BamHI,
No−NcoI,P−PstI。ハッチングしたボックス（例えば、
TB２において）はTMV−O のプロモーター、すなわち、
外殻タンパク質の開始コドンの203bp 上流を表し、そし
て点描ボックスはファージのプロモーターを表す。白抜
きボックスはオープンリーディングフレームを表し、そ
して充実ボックスはクローニングベクターの配列を表
す。ベクターは次の通りである：Ａ）およびＢ）pTKU1
、Ｃ）pTMVS3−28、Ｄ）pTB2、Ｅ）pTBN62およびＦ）p
TBU5 。
【図２】図２は、本発明に従い感染したＮ．ベンタミア
ナ(benthamiana) の中のα−トリコサンシン(trichosan
thin) の生産のウェスタン分析のオートラジオグラフで
ある。レーンａは分子サイズマーカーであり、レーンｂ
およびｃはα−トリコサンシンを生産するように操作し
た酵母菌からの抽出物であり、そしてレーンｄはＮ．ベ
ンタミアナ(benthamiana) からの抽出物である。
【図３】図３は、α−トリコサンシンの発現ベクターで
あるpBGC152 を図解する。このプラスミドはTMV U1の 1
26−、 183−、および30−kDa のオープンリーディング
フレーム(ORF) 、ORSVの外殻タンパク質の遺伝子(Ocp)
、SP６プロモーター、α−トリコサンシン遺伝子、お
よびpBR322プラスミドの一部分を含有する。30ＫのORF
の中のTAA 停止コドンには下線が引かれており、そして
バー（｜）は成熟ペプチドからの推定上のシグナルペプ
チドを分割する。30Ｋのオープンリーディングフレーム
のマイナス鎖内に位置するTMV U1のサブゲノムのプロモ
ーターは、α−トリコサンシンの発現をコントロールす
る。サブゲノムの RNAの推定上の転写開始点(tsp) はピ
リオド（．）で示す。
【図４】図４は、図３に示すプラスミドpBGC152 中のα
−トリコサチンをコードするDNA の開始コドン附近の配
列を示す。
【図５】図５は、in vivo の pBGC152転写体でトランス
フェクションされたＮ．ベンタミアナ(benthamiana) の
組織的に感染した葉からのヴィリオンの電子顕微鏡写真
を図解する。顕微鏡写真の下部の左隅に位置する黒色の
バーの長さは、ほぼ 140nmを表す。
【図６】図６は、接種後２週のトランスフェクションし
たＮ．ベンタミアナ(benthamiana) 植物のタンパク質の
分析である。ａ、ウェスタンブロット分析。レーン１：
200ng のGLQ223；２：50ngのGLQ223；３：pBGC152 転写
体で感染したＮ．ベンタミアナ(benthamiana) からの全
体の可溶性タンパク質の７μｇ；４：アルキルスパロー
スFPLCクロマトグラフィーからのピーク画分；５：非感
染のＮ．ベンタミアナ(benthamiana) からの全体の可溶
性タンパク質の７μｇ；６：非感染のＮ．ベンタミアナ
(benthamiana) からの全体の可溶性タンパク質の７μｇ
および 100ngのGLQ223。
【図７】図７は、組み換えα−トリコサンシンの精製の
プロフィルである。精製の間の種々の段階からの試料
を、12.5％ SDS−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に
より分析した。レーン１：アマーシャム(Amersham)の前
以て染色した高い範囲の分子量標準；２：精製したGLQ2
23；３：pBGC152 転写体で感染したＮ．ベンタミアナ(b
enth- amiana) からの全体の可溶性タンパク質；４：８
セファロースのクロマトグラフィーからのピーク画分；
５：アルキルスパロースFPLCクロマトグラフィーからの
ピーク画分。
【図８】図８は、細胞不含ウサギ網状赤血球翻訳アッセ
イにおけるタンパク質合成の阻止を図解する。50％の阻
止のために要求される投与量（ID50）。BGC 152 転写体
（黒色の円および三角形、反復１および２）、GLQ223
（黒色の正方形) 、およびシクロヘキシイミド（白抜き
の円）で感染したＮ．ベンタミアナ(benthamiana)から
の精製したα−トリコサンシンを、変化する濃度におい
て、in vitroタンパク質合成を阻止するそれらの能力に
ついて分析した。
【図９】図９は、 pBGC152プラスミドの合成を図解す
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:94） (72)発明者 ドーソン，ウィリアム オー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92507, リバーサイド，セレスト ドライブ 3184 (72)発明者 グランザム，ジョージ エル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92507, リバーサイド，ラ メシタ コート 1196 (72)発明者 ターペン，トーマス エイチ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95688, ベイカビル，ウッドクレスト ドライブ 319 (72)発明者 ターペン，アン マイアース アメリカ合衆国，カリフォルニア 95688, ベイカビル，ウッドクレスト ドライブ 319 (72)発明者 ガージャー，スティーブン ジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95688, ベイカビル，コットンウッド ストリート 593 (72)発明者 グリル，ローレンス ケー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95688, ベイカビル，キャンテロー ロード 3570

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生来のサブゲノムプロモーターを有す
    る、（＋）−センス一本鎖RNA 植物ウイルス由来の組換
    え植物ウイルス核酸であって、 植物ウイルスコートタンパク質をコードする第１の核酸
    配列に作用可能に連結されている第１のウイルス サブ
    ゲノム プロモーター、ここで前記第１の核酸配列の転
    写が前記第１のウイルス サブゲノム プロモーターに
    より調節される；及び前記（＋）−センスの一本鎖 RNA
    植物ウイルスと天然に関係しない第２の核酸配列に作用
    可能に連結された第２の植物ウイルス サブゲノム プ
    ロモーターを含んで成り；ここで前記第１のウイルス
    サブゲノム プロモーターが前記第２のウイルスサブゲ
    ノム プロモーターとは異種であり、それにより、前記
    組換え植物ウイルス核酸の宿主植物における前記第２核
    酸の組織的転写を可能にすることを特徴とする組換え植
    物ウイルス核酸。
  2. 【請求項２】 前記生来のサブゲノム プロモーターが
    前記第１の植物ウイルス サブゲノム プロモーターで
    ある請求の範囲第１項記載の組換え植物ウイルス核酸。
  3. 【請求項３】 植物ウイルス コートタンパク質をコー
    ドする前記核酸配列が、前記（＋）−センス一本鎖 RNA
    植物ウイルスと天然において関連する請求の範囲第２項
    記載の組換え植物ウイルス核酸。
  4. 【請求項４】 前記第２のウイルス サブゲノム プロ
    モーターが、前記（＋）−センス一本鎖 RNA植物ウイル
    スと天然において関連しない請求の範囲第２項記載の組
    換え植物ウイルス核酸。
  5. 【請求項５】 前記第１の植物ウイルス サブゲノム
    プロモーターが、前記（＋）−センス一本鎖 RNA植物ウ
    イルスと天然において関連しない請求の範囲第１項記載
    の組換え植物ウイルス核酸。
  6. 【請求項６】 植物ウイルスコートタンパク質をコード
    する前記核酸配列が、前記（＋）−センス一本鎖 RNA植
    物ウイルスと天然において関連する請求の範囲第５項記
    載の組換え植物ウイルス核酸。
  7. 【請求項７】 前記第２の植物ウイルス サブゲノム
    プロモーターが、前記（＋）−センス一本鎖 RNA植物ウ
    イルスと天然において関連する請求の範囲第５項記載の
    組換え植物ウイルス核酸。
  8. 【請求項８】 第３のウイルス サブゲノム プロモー
    ター及び第３の核酸配列をさらに含んで成り、ここで前
    記第３のウイルス サブゲノム プロモーターが前記第
    １及び第２のウイルス サブゲノム プロモーターのそ
    れぞれとは異種であり、それにより、前記組換え植物ウ
    イルス核酸の宿主植物における前記第３の核酸の組織的
    転写を可能にする請求の範囲第１項記載の組換え植物ウ
    イルス核酸。
  9. 【請求項９】 前記（＋）−センス一本鎖 RNA植物ウイ
    ルスが、トバモウイルス、スズメノチャヒキモザイクウ
    イルス、イネ壊死ウイルス及びジェミニウイルスから成
    る群から選択される請求の範囲第１項記載の組換え植物
    ウイルス核酸。
  10. 【請求項１０】 前記組換え植物ウイルス核酸がトバモ
    ウイルスである請求の範囲第９項記載の組換え植物ウイ
    ルス核酸。
  11. 【請求項１１】 前記トバモウイルスが TMVウイルスで
    ある請求の範囲第10項記載の組換え植物ウイルス核酸。
  12. 【請求項１２】 請求の範囲第１項〜第11項のいずれか
    記載の組換え植物ウイルス核酸のいづれかにより感染さ
    れた宿主植物。
  13. 【請求項１３】 宿主において核酸配列を組織的に転写
    するための方法であって： (a) 請求の範囲第１〜11のいづれか１項記載の組換え植
    物ウイルス核酸により宿主植物を感染せしめ； (b) 前記感染された植物を増殖し、ここで前記第２核酸
    配列が組織的に転写されることを特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】 前記転写された第２核酸配列を単離す
    ることをさらに含んで成る請求の範囲第13項記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】 前記第２の核酸配列によりコードされ
    るタンパク質を組織的に発現する追加の段階を含んで成
    る請求の範囲第13項記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記発現されたタンパク質を単離する
    ことをさらに含んで成る請求の範囲第15項記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記植物内で二次代謝物の生成を調節
    するタンパク質を組織的に発現する段階をさらに含んで
    成る請求の範囲第13項記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記二次代謝物を単離することをさら
    に含んで成る請求の範囲第17項記載の方法。
  19. 【請求項１９】 遺伝子生成物が第２核酸配列の組織的
    な転写から生成され、前記遺伝子生成物がIL−１，IL−
    ２，IL−３，IL−４，IL−５，IL−６，IL−７，IL−
    ８，IL−９，IL−10，IL−11，IL−12，EPO, G−CSF,GM
    −CSF, hPG−CSF, M−CSF,第VIII因子，第IX因子，TPA,
    hGH, レセプター，レセプターアンタゴニスト，抗体，
    神経ポリペプチド，メラニン，インスリン及びワクチン
    から成る群から選択される請求の範囲第13項記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】 遺伝子生成物が前記第２核酸配列の組
    織的な転写から生成され、前記生成物がアンチ−センス
    RNA発現に起因する生物学的に不活性なポリペプチド又
    はタンパク質である請求の範囲第13項記載の方法。
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