JP2000511180A

JP2000511180A - ２，２′―（１―メチル―１，２―エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕の製造方法

Info

Publication number: JP2000511180A
Application number: JP09542567A
Authority: JP
Inventors: フィリオン，リチャード; ロバートグレイ，マーティン
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 1996-05-30
Filing date: 1997-05-19
Publication date: 2000-08-29
Also published as: BR9709766A; EP0782984A2; US5659083A; CA2252601A1; NO985550D0; NO985550L; WO1997045109A1; AU3068897A

Abstract

(57)【要約】ａ）重炭酸アミノグアニジンから不純物を除去し；ｂ）重炭酸アミノグアニジンを水性イソプロパノール媒質中でメチルグリオキサールジメチルアセタールと反応させ；そしてｃ）酸性水性イソプロパノール媒質からの再結晶により２，２’−（メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を精製することによる、２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕の製造方法発明の背景発明の分野本発明は、癌または進行した悪性疾患の治療方法において有用である、不純物が大幅に減少された２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシイミダミド〕の製造方法に関する。従来の技術化合物２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕は、１，１’−〔（メチルエタンジイリデン）ジニトリロ〕ジグアミジン、ピルブアルデヒドビス（アミジノヒドラゾン）、ミトグアゾンおよびメチルグリオキサルビスグアニルヒドラゾン、メチルＧＡＧまたはＭＧＢＧといった数種の名称で知られており、下式により表される。ＭＧＢＧおよびその塩は、下記の特許明細書と刊行物により例示されるように、1950年代からの従来技術において様々な病気に対する使用について開示されている。白血病L1210および腺癌755を有する齧歯類におけるＭＧＢＧの抗腫瘍活性がFr eelander他，18 Cancer Res．360（1958）により初めて報告された。特公昭51-044643号明細書は、感染、膵臓壊死および造血壊死を予防または治療するのに有効な魚類ウイルス病に対する薬剤としてのＭＧＢＧおよびその塩を開示している。特公昭50-029520号明細書は、インフルエンザウイルスに対して用いられるＭＧＢＧおよびその塩を開示している。米国特許第4,201,788号明細書は、非悪性増殖性皮膚病の治療のためのＭＧＢＧを開示している。ＭＧＢＧは、細胞のポリアミン枯渇を引き起こす、ポリアミン生合成の鍵酵素であるＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（ＳＡＭＤ）を阻害することが知られている。しかし、ＭＧＢＧに関する調査は、許容できない程度の毒性を明らかにした。観察されるＭＧＢＧの毒性作用（その一部は或る動物種に特有である）には、胃腸毒性、遅延型および致死的低血糖症、肝および腎障害、骨髄抑制、下痢および静脈炎が挙けられる。それらの作用はＭＧＢＧ治療を受けたヒト患者にも広く見られた。その上、ヒトに特有である幾つかの毒性作用も証明された。それらの毒性作用としては、食道炎、潰瘍性咽頭炎、喉頭炎、胃炎、陰唇粘膜腫大、結膜炎、粘膜炎、紅斑、水腫、落屑性皮膚炎、および体重減少を伴う著しい食欲不振が挙げられる。日程スケジュール通りにＭＧＢＧを投与した患者は、しばしば致命的となる副作用との危険な闘いの後でしか急性白血病に緩解を示さなかった。多くの患者では、何らかの有益な結果が認められる前に治療を中断せざるをえなかった。 Knight他はCan．Treat．Rep.，63，1933-1937(1979)において、毒性レベルが投薬スケジュールに関連しており且つ管理できることを見出した。米国特許第4, 520,031号明細書は、毒性を減らすためのそのような投薬スケジュール関連管理の問題を扱っている。上記特許明細書に記載された投薬スケジュール管理は、ＭＧＢＧがポリアミン生合成に関して阻害作用を発揮するという仮定に基づいていた。生理学的に達成できるＭＧＢＧの効果は、ポリアミンであるスペルミジンの合成を触媒するＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ酵素の阻害に関連するのかもしれない。スペルミジンはＤＮＡ合成の開始に重要な役割を果たすと思われる。研究の結果、ＭＧＢＧが媒介するＤＮＡ合成の抑制がスペルミジン枯渇とプトレシン蓄積に関連づけられることが証明された。ポリアミンが重要な役割を果たすと思われる別の領域は、ＲＮＡ合成、特に転移（ｔ）ＲＮＡの合成である。ｔＲＮＡのメチル化はポリアミンにより直接刺激され得る。特に着目される発見は、腫瘍性（新形成）組織がメチル化ｔＲＮＡの程度の点で正常組織と異なるという報告である。ここでもまた、スペルミジンが重要な役割を果たすようである。ポリアミンの蓄積は、正常組織と腫瘍性組織の両方において、最適速度でのＤＮＡ合成に不可欠な要件であるらしい。よって、迅速な代謝回転を有する組織（皮膚、G.I.粘膜および骨髄）において観察されるＭＧＢＧの毒性は、ポリアミン合成の阻害および共に最終的に細胞複製を調節する物質であるＲＮＡやＤＮＡのその後の枯渇に直接関連するのかもしれない。しかしながら、(1)癌患者の大部分においてポリアミンが過剰に排出される；(2)効果的な化学療法中または後にポリアミン、特にスペルミジンが腫瘍細胞から放出されるが、この放出は排泄物および血清中濃度に初期ピークを有し、次いで正常値へと降下する；および(3) 骨髄（または他の正常組織）毒性のみを生じ且つ抗腫瘍効能を持たない化学療法は、ポリアミン排出の有意な増加を引き起こさない、という強力な証拠がある。後者の観察結果は、癌細胞が正常細胞よりも（より速いＤＮＡ合成速度を有するものでさえも）ずっと高レベルのポリアミンを有すること、または効果的な療法が癌細胞中のポリアミン合成に対してより一層特異的な効果を生じることを示唆するだろう。よって、スペルミジンの枯渇はＭＧＢＧの作用と関係がある。ヒトに対して行った実験において、臨床的に観察された毒物学的効果は、毎日の投薬の繰り返し蓄積作用のせいであるとされた。この毒性の蓄積または増加は、おそらくヒトではＭＧＢＧの尿排泄に極端に長い期間が必要であることによって説明されるだろう。Ｃ¹⁴−ＭＧＢＧを使ったヒトでの生物学的利用能（バイオアベイラビリティ）研究は、20分間に渡る１回の静脈内輸液後、放射能が血漿から迅速に消失したこと、および３週間の延長期間に渡り薬剤のほぼ60％が尿中に変わらずに排泄されたことを示した。これらのデータは、ＭＧＢＧが組織に蓄積しそして組織沈着物からゆっくりと浸出されて排泄に至ることを示唆する。様々な腫瘍の治療においてＭＧＢＧを使って相当多数の研究を行った後、特許権者は、許容できるレベルに毒性を減らしながら高い治療指数を達成するには週間投与スケジュールが最も効果的であると結論づけた。従って、一週間おきに投与する250mg／m²〜1000mg／m²のＭＧＢＧの用量範囲が様々な腫瘍の治療に対して立証された。上記用量範囲は毒性副作用を減らし且つ様々な腫瘍の治療法を与えるけれども、ＭＧＢＧの長期蓄積はまだ更なる研究および／または治療修正を必要とする問題である。本出願人は、毒性副作用を更に減らすという目的で広範囲に渡るＭＧＢＧの研究を行った。これらの研究の過程で、ＭＧＢＧが比較的多量の不純物を含み、それがＭＧＢＧの毒性副作用の原因となり得ることを発見した。従って、ＭＧＢＧおよひその塩の中に存在する不純物を同定しそしてその量を減らすために、多大な努力を費やした。本発明者らは、高度に精製された生成物を高収率で提供するＭＧＢＧ二塩酸塩の合成および精製方法を発見した。該生成物は癌および悪性疾患を含む他の疾患の治療に有用である。本発明の方法は、次の段階： a) 重炭酸アミノグアニジンを水に懸濁しそして懸濁液を濾過することにより重炭酸アミノグアニジンから１，３−ジアミノグアニジンや他の不純物を除去し； b) 濾過した重炭酸アミノグアニジンを、約19℃〜約40℃（好ましくは約28℃〜約35℃）の温度で、約０〜２（好ましくは０〜１）のｐＨにおいて、約２：３の比の水−イソプロパノールの２：３混合物中で、約１：３の比でメチルグリオキサールジメチルアセタールと反応させて結晶性ＭＧＢＧ二塩酸塩を生成せしめ；そして c) 酸性水−イソプロパノール媒質の溶液から結晶性ＭＧＢＧ二塩酸塩を精製するを含んで成る。本明細書において使用する時、２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を合成し且つ精製する方法は、その塩酸塩一水和物、二水和物および半水和物形態をはじめとする様々な形態の合成と精製にも関し、且つそれらを包含する。グアニルヒドラゾンの調製方法はBaiocchi他、J．Med．Chem.，6,431 (1963) および0liverio，Denham，J．Pharm．Sci.,52，202(1963)により記載されている。この方法は、アミノグアニジン塩を、水性媒質または水性アルコール媒質中で触媒量の酸の存在下で対応するカルボニル化合物と反応させることを含んで成る。この方法は市販の重炭酸アミノグアニジンを使用し、次のように説明される。グアニルヒドラゾンの一般的調製法 125mlの水に溶かした0.11モル（15ｇ）の重炭酸アミノグアニジンを含む溶液に、該溶液のｐＨが７より低くなるまで所望の酸をゆっくり添加した（発泡を防ぐために数滴のアミルアルコールを加えた）。その溶液を濾過して微量の不溶性固体を除去した。次いで適当なカルボニル化合物を約60℃で弱酸性濾液に添加した。使用したカルボニル化合物の量は、アミノグアミジン対カルボニル機能の比が１：１となるような量であった。カルボニル化合物が水性混合物中に溶けなかったら、反応混合物が均一になるまでエタノールを加えた。次いで該溶液を室温で16時間攪拌した。沈澱が生成したら、濾過により固体生成物を単離した。そうでなかったら、固体残渣が得られるまでメタノール、エタノールおよび溶媒混合物を使って反応混合物を蒸発せしめた。グアニルヒドラゾンの回収率は低かった。低収率に加えて、得られた生成物は比較的多量の不純物を含むことがわかった。より高い収率とより純粋な生成物を得るために、続いてこの方法を改良した。ＭＧＢＧ二塩酸塩の改良製造方法は、次の段階： a) 重炭酸アミノグアニジンをメチルグリオキサールアセテートと反応させて粗製ＭＧＢＧ二塩酸塩を得； b) 前記粗生成物を溶液から精製し、沈澱させそして乾燥させ；そして c) 精製した生成物を再結晶するを含んで成る。この改良方法の詳細を実施例１に記載する。実施例１１，１’−〔（メチルエタンジイリデン）ジニトリロ〕ジグアニジン二塩酸塩一水和物（メチルＧＡＧ），NSC-32,946の合成重炭酸アミノグアニジン（5.0kg，36.7モル）を50ｌフラスコに入ったイソプロパノール（ＩＰＡ；1.56ｌ）と水（1.56ｌ）中に溶かした。過剰な発泡を避けるために2.5時間かけてゆっくり濃塩酸（3.14ｌ，37.6モル）を前記溶液（22〜3 0℃）に添加した。得られた溶液を攪拌しながら一晩おいておいた。翌日、攪拌しながら（Ｔ＝22〜27℃）メチルグリオキサールジメチルアセタール（1.9kg，1 6モル）を３時間に渡りゆっくり添加した。添加が終了したら、攪拌を45分間続けた。ＩＰＡ（24.3 g，19ｌ）を加え、混合物を一晩攪拌した。翌日、混合物を約10℃に冷却し、そして２バッチにおいて濾過した。生じた固体をＩＰＡ（３× １ｌ）および低沸点石油エーテル（３×１ｌ）で洗浄し、40時間風乾して、粗製ＭＧＢＧ4.3kg（グリオキサールに基づいて４８％）を得た。上記操作を繰り返して追加の物質（4.26kg）を得た。精製，微量不純物の除去上記の粗ＭＧＢＧ（8.55kg）を温かい（45〜50℃）脱イオン水（17.1ｌ）に溶かし、次いで約35℃に冷却した。濃塩酸（48ml）を加えた。次いで攪拌しながら 20分間に渡りイソプロパノール（17ｌ）を加えた。該溶液を25℃に冷却し、その温度で１時間維持した。混合物を１インチ（2.54cm）のセライトパッドを通して濾過し、透明な淡黄色溶液を得た。該溶液に濃塩酸（191 ml）を加え、続いて激しく攪拌しながら、エーテル（25.6ｌ）とＩＰＡ（34.2ｌ）の混合物を徐々に添加した。この添加の中ほどに、相分離を避けるために、残りのエーテル／ＩＰＡ溶液の中に追加のＩＰＡ（5.7ｌ）を加えた。添加は２時間で終了した。混合物を更に30分間激しく攪拌し、次いで周囲温度で一晩放置しておいた。混合物を15℃に冷却し、その温度で60分間維持した。沈澱を収集し、冷たい（〜10℃）ＩＰＡ（３×３ｌ）で洗浄し、ＩＰＡとエーテルの混合物（２：１v/v,３×３ｌ）で洗浄し、そして風乾した。合計9.16kgの精製生成物が得られた。この生成物を室温で48時間真空乾燥して、8. 95kg（回収率95％）を得た。最終再結晶上記の精製メチルＧＡＧ（8.9kg）を２部分に分けて（２×4.43kg）、攪拌しながら予熱した（50〜60℃）脱イオン水（２×4.4ｌ）に添加した。該溶液を濾過し（濾紙）、一緒にして、透明な淡黄色の濾液を得た。冷却した（25℃）溶液に攪拌下で濃塩酸（13.4ml）を添加した。次いで激しく攪拌した溶液にＩＰＡ（ 44.8ｌ）を15分間で素早く添加した。合計9.16kgの精製生成物が得られた。この物質を室温で48時間真空乾燥して、8.95kg（回収率95％）を得た。この改良方法はより高い収率を与えたけれども、生成物は除去が難しい不純物を含んでいた。従って、本発明者らは、不純物を同定しそしてＭＧＢＧから不純物を減らす／無くすために実験を行った。実験本発明者らは、不純物を同定および定量するのに様々な方法を使ってミトグアゾン二塩酸塩の分析方法を開発した。１つの分析方法は、高性能液体クロマトグラフィーを含んだ。クロマトグラフィー不純物レベルを測定する面から考えると、高度の特異性は着目の潜在種の全部が検出可能であるという信頼を提供する。プロセス不純物および分解産物を含むそれらの種がそのままクロマトグラフィー系に注入するには適さない場合、通常次の２つの広義カテゴリーのうちの１つに位置づけることができる１または複数の技術を使ってストレス付加試料に関して特異性試験が行われる： (a) 分析物ピークから更なる情報を引き出すための特殊検出系の使用。 (b) 第一が確実性のもとでの系であり、第二が、その異なる選択性により、第一の場合に同時溶出する種を分割するであろうと期待される系である、補足的分離技術間での比較の一形態。第一カテゴリーの技術の例としては、分析物ピーク全体の種々の位置からそれぞれＵＶ／可視スペクトルまたは質量スペクトルを得ることにより同時溶出する種の検出に潜在的に備える、ダイオード配置と質量分析検出器の使用が挙げられる。第二カテゴリーの技術としては、分析物ピークを異なる特異性の第二固定相上に向ける流れ切替え（フロースイッチ）装置の使用、または確証されている系からの結果と薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）のような第二のクロマトグラフィー技術からの結果との比較が挙げられる。装置および薬品ＨＰＬＣデータは、種々のKontron(Watford，Herts)とWaters（Watford，Hert s）社製のポンプ、オートサンプラー、カラムオーブンおよび検出器モデルを使って得られた。ＨＰＬＣデータはMultichrom（商標）V1.8-2（LabSystems，Altr ingham，Cheshire）を使って処理した。ＵＶ／可視吸収スペクトルはHP 1040ダイオード配置検出器（Hewlett Packard，Bracknell，Berks.）を使って捕捉した。光ストレス付加（キセノン源、窓ガラスを通したもの）は、Haraeus Suntest （商標）（Alplas Technology，Oxford）にて実施した。ＨＰＬＣ用アセトニトリルはRathburn Chemicals（Walkerburn，Scotland）から入手し、ＨＰＬＣ用ヘプタンスルホン酸（ナトリウム塩）、および無機化学薬品はBDH Limited（Poole ，Dorset）から入手した。ＡＣＶＡ〔４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸），ラジカル開始剤、酸化ストレスを模擬する暴露〕はAldrich (Gillingham，Dorset)から入手した。ミトグアゾン二塩酸塩と精製水は自社内で得た。ストレス試料調製ミトグアゾン二塩酸塩の試料（約370mg、塩基250mgと等価）を50mlのメスフラスコ中に正確に秤量し、下記に与える条件に従ってストレスを付加した。ストレス付加は、最高７日間または20〜50％分解に達するまで続けた。ストレス付加後、必要ならば試料を中和し、そして、精製水で容量希釈してＴＬＣ分析用の〜５ mg（塩基）／ml溶液を得た。この溶液のアリコートを精製水で希釈して、ＨＰＬＣによる不純物測定用の〜１mg（塩基）／ml溶液を得た。最後に、前記溶液のアリコートをＨＰＬＣ移動相中で希釈してＨＰＬＣアッセイ用の〜0.01mg（塩基）／ml溶液を得た。ストレス条件熱：試料を80℃で７日間維持した。酸性：試料に10mlの0.1Ｍ塩酸を加え、該溶液を70℃で７日間維持した。塩基性：試料に10mlの0.1Ｍ水酸化ナトリウムを加え、該溶液を70℃で２日間維持した。水性：試料に10mlの精製水を加え、該溶液を70℃で７日間維持した。酸化：10mlの0.1Ｍ水性ＡＣＶＡ溶液を加え、試料を40℃で７日間維持した。光：試料に約15,000キロルクス(klx)時間の合計照射量を与えた（ＵＶで）。アッセイ：１ｇ／ｌのヘプタンスルホン酸（ナトリウム塩）を含み且つ濃オルトリン酸によりpH3.0に調整した0.05Ｍオルトリン酸二水素カリウム緩衝液（89容量％）とアセトニトリル（11容量％）とから成る移動相を使って、試料を25cm×内径0.46cmのHypersil BDS C8 5μｍカラム(Anachem， Luton，Beds.)上での定組成クロマトグラフィーにかけた。流速は２ml／分であり、検出波長は283nmであり、注入容量は20μｌであり、そしてカラム温度は40 ℃であった。正確に調製された外部標準〔公称0.01mg（塩基）／ml〕に関して試料を定量した。不純物法：クロマトグラフィー条件は、21 0nmの検出波長を使用すること以外はアッセイの時と同じであった。主として特定のプロセス不純物を評価するためには、85容量％対15容量％の水性移動相対アセトニトリル移動相の比を用いる第二のＨＰＬＣ系を使用した。正確に調製された外部標準（公称0.005mg（塩基）／ml）に関して不純物を定量した。ＴＬＣ法各試料20μｌをシリカゲルＴＬＣプレート（Merck 60F₂₅₄）上にスポットした。プレートをアセトニトリル／水酸化アンモニウム(SG 0.88)／水（90:5:5容量％）移動相中で10cmの高さまで展開した。短波長紫外光（254nm）下と、ニトロプルシド（ナトリウム）−フェリシアニド噴霧試薬による処理後の両方で、希薄ミトグアゾン二塩酸塩スポットに対して不純物を評価した。結果公称ミトグアゾン二塩酸塩濃度0，80％，100％および120％を表す三重反復試料を分析した。得られた結果を表Ｉに与える。表Ｉ回収率データＨＰＬＣアッセイ^*：データの最小二乗法回帰分析は99.8％の平均正確度を与えた（相関係数0.99935）。ストレス付加試料の分析ストレス付加試料をＨＰＬＣにより分析し、一方でクロマトグラフィー不純物濃度をＨＰＬＣとＴＬＣにより測定した。クロマトグラフィーデータを表IIに与える。表II ストレス付加ミトグアゾン二塩酸塩のクロマトグラフィー分析と不純物データＨＰＬＣ，ＴＬＣおよび質量分析法を使って、出発原料中に含まれるかまたは製造工程中に生成される不純物を同定しそして定量した。本発明者らは、ジアミノグアニジン関連不純物が合計ＭＧＢＧ二塩酸塩不純物レベルの70％以上を占めることを発見した。不純物生成の一般的反応スキームとそれらの化学名は以下の通りである。ここでＩ＝〔２−〔（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ〕プロピリデン〕カルボンイミド酸ジヒドラジド。 II＝〔２−〔（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ〕−１−メチルエチリデン〕カルボンイミド酸ジヒドラジド。 III＝ビス〔２−〔（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ〕−１−メチルエチリデン〕カルボンイミド酸ジヒドラジド。 IV＝ビス〔２−〔（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ〕プロピリデン〕カルボンイミド酸ジヒドラジド。Ｖ＝〔２−〔（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ〕−１−メチルエチリデン〕〔２−〔（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ〕プロピリデン〕カルボンイミド酸ジヒドラジド。ＭＧＢＧ二塩酸塩中の不純物レベルを減らすために、下記に記載するような反応パラメーターおよび再結晶の研究に基づいて実施例１の方法を変更した。Ａ．反応パラメーター１．溶媒および出発原料の溶解性大部分の有機溶媒への重炭酸アミノグアニジンの溶解性は非常に限られており、水にはほとんどまたは全く溶解性をもたない。重炭酸塩から塩酸塩に変換するための実施例１の操作における反応媒質は、水対イソプロパノールの１：１混合物である。濃ＨＣｌの滴下添加によりスラリーが塩酸塩に変換される。塩酸塩は水に易溶である。従って、最適溶媒を変更するのが容易であった（「濃度」の項目を参照のこと）。メチルグリオキサールジメチルアセタールは133-135℃の沸点を有する淡黄色油状物である。それは大部分の有機溶媒と水に可溶である。メチルグリオキサールビス（グアニルヒドラゾン）二塩酸塩は水とＤＭＳＯには易溶であり、メタノールには微溶であり、そして他の大部分の低極性溶媒には不溶である。それは１モルの水にはなかなか溶けない。反応媒質（水性イソプロパノール）中でそれは容易に晶出するが、２モルの重炭酸アミノグアニジンに基づいて計算して約43％の総収率を達成するためには、反応の終わりに追加のイソプロパノールを添加する必要がある。２．ｐＨの効果媒質のｐＨは、アミノグアニジンとメチルグリオキサールジメチルアセタールとの重要な反応パラメーターである。実施例１に記載の手順の終点は約４の最終ｐＨを有した。表IIIに列挙した実験は収率に対するｐＨの効果を表す。得られた二次収穫物は主に未反応の塩酸アミノグアニジンであった。表III ミトグアゾン（粗製）の合成 ^* HClの添加後に計ったpH ^** 回収されたアミノグアニジンHCl−生成物なし ^***HPLC分析３．濃度表IIIに示した163〜182の実験は実施例１に記載したのと全く同様に実施した。水：イソプロパノールの比は１：１であり、濃度は基質５部：溶媒3.12部であった。この非常に濃厚な混合物は、目的とした20kgスケールにおける50ガロン反応がま中での有効な攪拌に十分な容量を提供しないだろう。水：イソプロパノールの比を２：３に調整し、容量を増加させて基質５部：溶媒５部の濃度を提供した。追加の加熱の必要なしにアミノグアニジンHClが溶液状態であることに注目することが重要である。この変更から得られた結果は実験193（100gスケール）と次の194（500gスケール）に示される。これらの２実験の上に別の変数を重ねた。それを下の「化学量論」のところで説明する。４．添加の速度および操作のタイミング実施例１では、アミノグアニジンへのＨＣｌの添加は過剰な発泡を避けるために2.5時間かけて行われる。3.67モルスケールでは、約1.5時間で転化を終えることができるが、最終的な速度は反応容器からの安全なCO₂ガス発生により規定すべきである。該手順によると生じた溶液を一晩放置しておいた。しかしながら、もし34℃で透明溶液が生じ且つｐＨが０〜１であるなら、反応混合物を一晩攪拌する明白な理由は存在しない。実験182，193および194では、ＨＣｌの添加終了後１時間以内にグリオキサールの添加を開始した。メチルグリオキサールジメチルアセタールの添加を、表IVに示されるように1. 5時間から3.5時間まで異なる時間に渡り実施した。添加の速度は本質的に重要でないようであった。操作は2.5時間を要するが、反応がまスケールでの操作の便宜のために幾らかの調整を行うことができる。上記操作から得られる沈澱を一晩攪拌しておいた。翌日、イソプロパノールを添加して、より多量の生成物を溶液から晶出させた。混合物を５〜10℃に１時間冷却し、次いで濾過した。この操作順序はより合理化されており、純度または収率に何も犠牲を払わずにＭＧＢＧの調製を行う追加の日を省く。５．温度アミノグアニジン重炭酸塩から塩酸塩への変換は吸熱反応である。外部暖熱により温度を約25〜30℃に維持すべきである。メチルグリオキサールジメチルアセタールの添加中の温度範囲は表IVに示される。幾らかの温度の変動を故意に実験に組み込んだ。しかしながら、わずかに高められた温度で反応を実施することに何も明らかな利点がなかった。温度範囲は 28〜34℃であるべきである。６．化学量論実験173〜182における化学量論は、表IIIの操作と同じであった。メチルグリオキサールジメチルアセタール（1.6モル）を3.67モルの重炭酸アミノグアニジンと反応させる。しかしながら、粗生成物のＴＬＣの最終検査では、低レベルの未反応アミノグアニジンが観察される場合があった。ＭＬの濃縮は、表IIIのプロセスの化学量論において存在する約10％の未反応アミノグアニジンの単離をもたらした。従って、実験193〜194では比率を1.79：3.67に調整した結果、アミノグアニジンのレベルが粗生成物中と母液中の両方において減少したようであった。この変更の結果として収率の有意な変化は認められなかったが、それらの実験ではＭＧＢＧの回収率に対してわずかに負の影響を与え得る追加の水が存在したことに注目すべきである。これらの実験結果に基づくと、化学量論は１：２の比であるべきである。Ｂ．再結晶１．微量不純物の除去実施例１の方法は、水性イソプロパノールとジエチルエーテルからの再結晶に続き、最終薬剤物質の溶液中に認められる曇り（ヘーズ）を取り除くための濾過を含んだ。本発明者らの１つの主目的は、潜在的に危険なジエチルエーテルを、実施例１の方法で提供されるのと同等の精製レベルを達成するであろう低揮発性溶媒に置き換えることであった。第二の目的は曇りを確認することおよびその生成を防ぐ方法を開発することであった。一連の再結晶実験をＭＧＢＧに関して実施した。ジエチルエーテルと置き換えるために選んだ溶媒はＴＨＦであった。安全性と環境的観点から適当であるのに加えて、ＴＨＦの水溶性は実施例１の方法においてジエチルエーテルを使った時に観察された二相分離をなくすのに有利であった。処理量を向上させるために溶媒容量をスケールダウンし、そして実験をスケールアップした。再結晶操作は、実施例１で達成されたものよりも高い純度レベルを達成する際に効果的である。結果の要約を表Ｖに与える。表Ｖ再結晶実験 H₂O:iPrOH:THF比−溶媒のグラム数で与えられる * 実施例１の方法２．不溶性不純物の単離合成したＭＧＢＧの幾つかの粗製バッチは、水溶液中に不溶性の曇りを含んでいた。実施例１の手順に従ってそれらのバッチの１つから水性イソブロパノール混合物を調製し、そして不溶物を濾過して1.8gの白色固体（全粗製物の0.5％）を分離した。試料を温水から濾過して少量のＭＧＢＧを除去した。不純物はピルブアルデヒドのポリマーだと思ったが、Ｃ，Ｈ，Ｎ元素分析はＭＧＢＧのものに非常に近似していることを示した。ＭＳ(LSIMS)はＭＧＢＧに一致するMH^*185を与えた。電子噴射ＭＳにおいてＭＧＢＧ硫酸塩またはリン酸塩[MH+]＝283という更なる証拠が認められた。実験173からの粗製ＭＧＢＧをＨＰＬＣにより分析すると99％純粋であることがわかった。続いて、不溶性物質をＨＰＬＣにより分析するとＭＧＢＧと一致することもわかった。ＭＧＢＧ塩の正確な同定は、10.8％硫黄を示す元素分析から行った。硫酸塩の起源は、おそらく出発の重炭酸アミノグアニジンからであろう。文献検索から、シアナミドとの反応に硫酸ヒドラジンを使用する少なくとも１つの製造方法が見つかった。ホウ酸塩緩衝化生成物を重炭酸塩で中和して重炭酸アミノグアニジンを与えた。アミノグアニジンの硫黄分析は極低レベル（0.025％）を示した。これらの結果に基づく結論は、硫酸塩の除去が曇り問題をなくすであろうということである。３．最終再結晶 50〜60℃の脱イオン水１容からの最終精製が実施例１に記載されている。溶液を濾過し、酸性化し、そしてイソプロパノールで更に希釈して、回収率94％で最終生成物を得た。再結晶実験を表VIに示す。実験160は、水：イソプロパノールの１：５比を使って実施例１の手順に従って行った。別の実験（160 〜195）において、回収率および純度に対する影響を調べるためにその比を変更した。実験195と196では、水溶液を濾過前に少量のイソプロパノールで希釈した。これは、50ガロン反応がま中での効率的攪拌を可能にするために溶媒容量を増やす目的で行った。表VIに示される再結晶実験に基づいて純度に関するささやかな改善が観察された。表VI 最終再結晶実施例２は、上述した実験結果に基づいて必要と認められた変更を組み込んだ本発明の方法を例証する。実施例２実験段階Ａ２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕重炭酸アミノグアニジン（Aldrich 98.5％）を35〜40℃のＤＩ水（脱イオン水）中で約30分間スラリー状にし、懸濁液を濾過して約1％w/wにのぼるジアミノグアニジンや他の不純物を濾過した。505g（3.８モル）の濾過済の重炭酸ジアミノグアニジンを200ｇのＤＩ水と300g（156ml）のイソプロパノールに懸濁して、濃厚であるが攪拌可能な混合物を与えた。過剰な発泡を避けるために 1.5時間かけて濃ＨＣｌ（376g，37.8％）を注意深く滴下添加した（注１）。該ＨＣｌの５％を添加し終わると混合物は容易に攪拌できた。反応は吸熱性であるので、19〜28℃の間に温度を維持した。添加の終わりに無色透明溶液が得られた（注２）。それを32℃に温め、20分間攪拌した（注３）。次いでメチルグリオキサールジメチルアセタール（212g，1.79モル）（Fluka，98％）を30〜35℃の温度で1.5時間に渡り添加した（注４）。懸濁液を周囲温度で一晩攪拌した。翌朝、イソプロパノール（2.0kg）を15〜20分間に渡り添加した。懸濁液を約10℃に冷却し、攪拌を1.5時間続けた。濾過により固体を収集し、２×200 mlのイソプロパノールで洗浄した。30〜35℃の真空オーブン中で一晩乾燥した後、463g（43 ％）の粗製ＭＧＢＧが得られた。ＴＬＣ〔アセトン90、水5、NH₄OH 5〕；ＨＰＬＣ（ＥＴＩ〜0.79％）；ＮＭＲ（DMSO-d₆）。注１．CO₂の過剰発生を避けるためにＨＣｌは注意深く添加しなければならない。注２．ｐＨを確認し、必要なら濃ＨＣｌの添加によりｐＨを０〜１に調整すること。注３．前の実験では混合物を一晩攪拌しておいた。これは不要である。注４．別の実験において、メチルグリオキサールジメチルアセタールをＨＣｌ添加の１時間後に添加したが、何ら明らかな結果がなかった。一晩の攪拌は随意である。注５．添加の約２／３が終了したところで、生成物が晶出し始め、穏やかな発熱が観察された。最終精製 920gのＤＩ水中の粗製ＭＧＢＧ（460ｇ）の懸濁液を40〜50℃に温めて透明な淡黄色溶液を与えた。この混合物を30℃に冷やし、920mgの濃ＨＣｌを添加した。リトマス紙を使って０〜１のｐＨを確認した。イソプロパノール（350g，446m l）を素早く添加し、混合物を28〜32℃で１時間攪拌した。溶液を濾過して不溶性物質を除去した。濾液を反応フラスコに移し、0.5gの濃ＨＣｌで更に酸性化した。激しく攪拌した溶液にイソプロパノール（1.84kg）を10〜15分間に渡り添加した。その混合物を８〜12℃に冷やし、更に１時間攪拌した。生じた固体を濾過し、濾過ケークを２×200mlのイソプロパノールですすいだ。30〜40℃の真空オーブン中で24時間乾燥した後、回収率は約90％であった。ＨＰＬＣ（ＥＴＩ）＝ 0.65％，ＮＭＲ（DMSO-d₆）：ＩＲ(KBr)。本発明の方法に従って調製したＭＧＢＧは少なくとも99.0％純粋であり、癌や他の疾患の治療用医薬組成物での使用に十分適する。本発明を特にそれの幾つかの好ましい態様に関して詳細に記載してきたが、本発明の精神および範囲内で変更および修正を行えることは理解されるだろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】 1. ２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕の製造方法であって、次の段階： a) 重炭酸アミノグアニジンを水に懸濁しそして懸濁液を濾過することにより重炭酸アミノグアニジンから不純物を除去し； b) 濾過した重炭酸アミノグアニジンを、水性反応媒質中でメチルグリオキサールジメチルアセタールと反応させて２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を生成せしめ；そして c) 酸性水性イソプロパノール媒質からの再結晶により２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を精製するを含んで成る方法。 2. 次の段階： a) 重炭酸アミノグアニジンを水に懸濁しそして該懸濁液を濾過することにより、アミノグアニジン塩から下式（上式中、Ｒ₁およびＲ₂は独立にＨまたはＣＨ₃である）を有する不純物を除去し； b) 約19℃〜約40℃の温度で、約０〜２のｐＨにおいて、水：イソプロパノールの約２：３反応媒質中で、濾過した重炭酸アミノグアニジンを約１：３の比でメチルグリオキサールジメチルアセタールと反応させて結晶性２，２’−（１− メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を生成せしめ；そして c) 酸性水性イソプロパノール媒質からの再結晶により２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を精製するを含んで成る、請求項１に記載の方法。 3. 次の段階： a) 重炭酸アミノグアニジンを水に懸濁しそして該懸濁液を濾過することにより、重炭酸アミノグアニジンから下式（上式中、Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃およびＲ₄は独立にＨまたはＣＨ₃である）を有する不純物を除去し； b) 約19℃〜約40℃の温度で、約０〜２のｐＨにおいて、水：イソプロパノールの約２：３反応媒質中で、濾過した重炭酸アミノグアニジンを約１：３の比でメチルグリオキサールジメチルアセタールと反応させて結晶性２，２’−（１− メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を生成せしめ；そして c) 酸性水性イソプロパノール媒質からの再結晶により２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を精製するを含んで成る、請求項１に記載の方法。 4. 水−イソプロパノール中での重炭酸アミノグアニジンとメチルグリオキサールジメチルアセタールとの前記反応が０〜１のｐＨで且つ28℃〜35℃の温度で行われる、請求項２に記載の方法。 5. 水−イソプロパノール中での重炭酸アミノグアニジンとメチルグリオキサールジメチルアセタールとの前記反応が０〜１のｐＨで且つ28℃〜35℃の温度で行われる、請求項３に記載の方法。 6. 前記２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕の精製が、次の段階： (1) ２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を水に溶解しそしてそれを塩酸で酸性化し； (2) 前記溶液にイソプロパノールを添加しそして該溶液を攪拌し； (3) 前記溶液を濾過してそこから不溶性物質を除去し； (4) 濾過した溶液を塩酸で更に酸性化し、次いでイソプロピルアルコールを添加して結晶性固体２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を得；そして (5) 前記結晶性２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を濾過しそして乾燥するを含んで成る、請求項２に記載の方法。 7. 前記２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕の精製が、次の段階： (1) ２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を水に溶解しそしてそれを塩酸で酸性化し； (2) 前記溶液にイソプロパノールを添加しそして該溶液を攪拌し； (3) 前記溶液を濾過してそこから不溶性物質を除去し； (4) 濾過した溶液を塩酸で更に酸性化し、次いでイソプロピルアルコールを添加して結晶性固体２，２’−（１−メチル−１，２− エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を得；そして (5) 前記結晶性２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕を濾過しそして乾燥するを含んで成る、請求項３に記載の方法。 8. 請求項１の方法により製造された２，２’−（１−メチル−１，２−エタンジイリデン）ビス〔ヒドラジンカルボキシミドアミド〕。 9. 哺乳類における癌または悪性疾患の治療方法であって、請求項８の化合物を含有する医薬組成物の有効量を前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。