JP2000510700A

JP2000510700A - 抗血小板化合物の血中レベルを追跡するための方法と試薬

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Publication number: JP2000510700A
Application number: JP09540929A
Authority: JP
Inventors: キャロン，クリストファー，ピー．; フェイジェン，ラリー，ピー．; ハース，ニール，エフ．; メイヤー，デブラ，エム．; ページ，ジミイ，ディ．; ペッグ，ジョディ，アン
Original assignee: ジー．ディー．サールアンドカンパニー
Priority date: 1996-05-15
Filing date: 1997-05-12
Publication date: 2000-08-22
Also published as: DE69708102T2; AU2997597A; ATE208505T1; WO1997043650A1; DE69708102D1; ES2166996T3; CA2253402A1; EP0912901B1; EP0912901A1; US6150114A; PT912901E; DK0912901T3

Abstract

(57)【要約】抗血小板化合物で治療されている被験体の血液中のこの化合物の量を測定するための方法であって、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を含有する被験体の血液のＡＣＴ数を算出し、その数値を標準化濃度数値と比較する、上記方法。ヘパリンおよび抗血小板化合物で現在治療されている被験体において、本方法は、血液試料に追加のヘパリンを加えることなく行うことができる。本発明はまた、抗血小板化合物と免疫反応する試薬、および免疫反応性試薬を含むキットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】抗血小板化合物の血中レベルを追跡するための方法と試薬発明の背景発明の分野本発明は一般に、被験体に投与される抗血小板化合物の量を追跡するための方法に関する。さらに詳しくは本発明は、被験体の血液の活性化凝固時間の測定により被験体の抗血小板化合物の量の迅速な測定を可能にする方法およびキットを提供する。先行技術の説明血小板は、血管傷害の部位で最初の止血血栓を提供することにより血流の停止（止血）に有効な機能を有する。一般に血小板はまず、傷害された血管の内皮下領域で巨大分子に結合し、次に凝集して一次止血血栓を形成する。傷害の近くの血小板の凝集は、次に血漿凝固因子を活性化し、これがフィブリン凝塊を形成して、凝集物を支持し強固する。血小板はまた、動脈硬化や血栓症に至る有害な反応に参加する。血栓症は、血小板が凝集するかおよび／またはフィブリン凝塊が血管を閉塞するプロセスである。動脈を閉塞する血栓は、その動脈から血液を供給される組織の死滅を引き起こす。この閉塞は、脳卒中、不安定狭心症、および心筋梗塞のような症状を引き起こす。血栓症はまた、術後の合併症を引き起こす。例えば、人工器官（例えば、人工心臓弁）の移植または経皮経管冠動脈形成術（ＰＣＴＡ）のために開かれた部位で血液血栓が形成される。従って血小板機能のアンタゴニストが研究されており、動脈硬化や血栓症に起因する合併症を治療または防止するために抗血小板化合物が開発されている。異なる機能を有する多くの抗血小板化合物が当該分野で記載されている。ザブロッキー（Zablocki）らは、フィブリノゲン−血小板糖タンパク質IIｂ/IIIａ（「ｇｐIIｂ/IIIa」）相互作用を破壊することにより機能し、すべての血小板活性化物質の活性なインヒビターである、開発中のフィブリノゲン受容体アンタゴニストを記載している。ザブロッキー（Zablocki J.A.）ら、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ（１９９４）、第３（５）巻、４３７〜４４８頁。ジピリダモール、チクロピジンおよびアスピリンのような化合物は、公知の抗血小板化合物である。マジェルス（Majerus，P.W.）ら、「グッドマンとギルマンの治療の薬理学的基礎」（Goodman and Gilman's The Pharmaclogical Basis of Therapeutics）（ハードマンとリンバード（Hardman，J．and Limberd，L.）、第９版、１９９６）１３４１〜１３５９頁中。抗血小板化合物をカバーするいくつかの特許が出ており、さらに別の化合物をカバーする特許出願が公表されている。例えば、米国特許第５，３４４，９５７号（ボビー（Bovy）ら）は、血小板凝集インヒビターとして有用な置換β−アミノ酸誘導体を開示し、ＰＣＴ出願公報ＷＯ９４／２２８２０号（アブッド（Abood）ら）は、血小板インヒビターとして有用な１−アミジノフェニル−ピロリドンピペリジノンおよびアゼチノンを開示している。これらの文献、特許および刊行物の開示内容（およびそこに引用されている文献を含む）は、技術の現状をより完全に規定するために、参考のため本明細書に組み込まれる。活性化凝固時間の測定は、ハッタースライ（Hattersly，P.G.）により、全血凝固を追跡するための高感度な試験として開発された。ハッタースライ（Hatter sly,P.G.）、Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．（１９６６）、１９６巻、１５０〜１５４頁。他の研究者らは、この試験を、薬剤活性を証明するための測定法として使用した。モリテルノ（Moliterno）らは、抗ｇｐIIｂ/IIIａ抗体Ｃ７Ｅ３を投与する時の活性化凝固時間の上昇を記載している。モリテルノ（Moliterno）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．（１９９５）、７５巻、５５９〜５６２頁。抗血小板化合物を用いる治療法が増えるに従って、治療される被験体における化合物の量の追跡法がますます重要になっている。濃度を追跡し、これに応じて投与量を調整することは、過剰な投与を防止し、化合物のクリアランスが障害されているかどうかの追跡を補助するであろう。すなわち、これらの化合物の血中濃度の迅速かつ容易な測定を可能にする方法が必要とされている。我々は、抗血小板化合物と免疫反応する抗体が、その化合物を含有する血液の活性化凝固時間または血小板凝集に影響を与えることを発見した。活性化凝固時間は、抗体の存在下では大きく異なることが見いだされ、その結果活性化凝固時間数（本明細書において、「ＡＣＴ数」と呼ぶ）を算出して、血液中の化合物の特定の濃度を与えるプロットした曲線または表に関連付けることができ、こうして、これらの化合物の濃度を追跡するための迅速で、手間のかからない方法が提供される。発明の要約本発明は、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を含有する被験体の血液のＡＣＴ数を算出し、算出されたＡＣＴ数を標準化濃度曲線と比較し、こうして被験体の血液中の抗血小板化合物の量を測定することを特徴とする、抗血小板化合物で治療されている被験体の血液中のこの化合物の量を測定するための方法を提供する。本発明はまた、ヘパリンと、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を含有する被験体の血液のＡＣＴ数を算出し、算出されたＡＣＴ数を標準化濃度曲線と比較し、こうして被験体の血液中の抗血小板化合物の量を測定することを特徴とする、抗血小板化合物で治療されている被験体のこの化合物の量を測定するための方法を提供する。本発明はまた、ａ）被験体から血液試料を採取し；ｂ）この試料を少なくとも２つの部分に分離して、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を少なくとも１つの部分に加え；ｃ）試薬を含有しない（ｂ）の血液試料の少なくとも１つの部分の活性化凝固時間を測定し；ｄ）試薬を含有する（ｂ）の血液試料の少なくとも１つの部分の活性化凝固時間を測定し；ｅ）（ｃ）と（ｄ）の測定値からＡＣＴ数を算出し；そしてｆ）（ｅ）からのＡＣＴ数を標準化濃度曲線と比較して、こうして被験体の血液中の抗血小板化合物の濃度を測定することを特徴とする、抗血小板化合物で治療されている被験体の血液中のこの化合物の濃度を測定するための方法を提供する。本発明はさらに、抗血小板化合物と免疫反応し基本的にヘパリンと免疫反応しないマウスのハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体を提供する。最後に本発明は、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を含む、抗血小板化合物で治療されている被験体の抗血小板化合物の濃度を追跡するためのキットを提供する。図面の簡単な説明図１。この図は、２つの抗血小板試験化合物Ｂ（■）とＤ（●）の種々の濃度について測定された活性化凝固時間（ＡＣＴ）に及ぼす作用を示す。これらの化合物の構造を、本発明の詳細な説明に示す。各化合物について濃度は、ＩＣ₅₀の倍数として示してある。化合物ＢのＩＣ₅₀は２７ng/mlであり、化合物ＤのＩＣ₅ ₀ は４３ng/mlである。図２。この図は、抗体有りおよび抗体無しの血液試料についての活性化凝固時間比の比較を示す。図３。抗血小板化合物Ｂ、Ｄ、および陰性対照として使用されたメルク（Merc k）化合物ＭＫ３８３を認識し中和する能力について、モノクローナル抗体を血小板凝集測定法で試験した。使用した抗血小板化合物のレベルは、それ自身で少なくとも５０％の凝集阻害を示した。図４。この図は、種々のモノクローナル抗体の存在下で、抗血小板化合物Ｂを含有する血液について活性化凝固時間の比較を示す。「対照」は、化合物Ｂおよび抗化合物Ｂ抗体を含まない血液の凝固時間である。「ＣｏｎｔＭａｂ」は、無関係のタンパク質に対する抗体についての凝固時間である。「Ｂ」は、化合物Ｂのみが存在する血液の凝固時間である。図５。モノクローナル抗体９Ｆ７を、抗血小板化合物ＢとＤを中和する能力について、２人の異なるドナーからの全血で試験した。発明の詳細な説明Ａ．方法本発明は、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を含有する被験体の血液のＡＣＴ数を算出し、算出されたＡＣＴ数を標準化濃度曲線と比較し、こうして被験体の血液中の抗血小板化合物の量を測定することを特徴とする、抗血小板化合物で治療されている被験体の血液中のこの化合物の量を測定するための方法を提供する。本明細書において「ＡＣＴ数を算出する」とは、標準化曲線と比較することができる数を与える任意の計算を包含する。例えば、ＡＣＴ数は、ａ）血液試料中に免疫反応性試薬が存在する被験体の血液試料の活性化凝固時間と、ｂ）血液中に免疫活性試薬の無い被験体の血液試料の活性化凝固時間、との比率でもよい。あるいは、算出されたＡＣＴ数は、血液試料中に免疫反応性試薬が存在する場合および存在しない場合の活性化凝固時間の差でもよい。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、他の算出方法を容易に認識できるであろう。いずれにしても、ＡＣＴ数は、標準化濃度曲線と同じ方法で被験体の血液試料について算出され、これらはすぐ比較され、血液中の化合物の濃度が決定される。本明細書において「標準化濃度曲線」という用語は、活性化凝固時間と抗血小板化合物の血中濃度との関係を証明する任意の方法を意味する。例えば、標準化濃度曲線は、抗血小板化合物についてｙ軸に沿ってプロットされた活性化凝固時間と、ｘ軸沿ってプロットされた化合物の濃度とを有してもよい。既知の濃度の抗血小板化合物についていくつかの活性化凝固時間が算出されていれば、そのプロットは、その用語が当業者により理解されるように大体「曲線」になるであろう。すなわち、この例の算出したＡＣＴ数と標準化曲線の「比較」は、算出されたＡＣＴ数に等しいｙ軸上の値を見つけ、次に同じｙ軸値を有する「曲線」上の点を見つけ、そして曲線上の点のｘ軸の値を読むことからなる。こうしてｘ軸値は、血液中の化合物の濃度を与える。別の好適な実施態様において、「曲線」はまた、算出された値の表により表すことができる。すなわち、ｘ軸とｙ軸の値を比較する代わりに、これらの値は、種々の範囲についてあらかじめ算出され表で提示されて、これは直ぐ読むことができ、被験体の血液中の化合物の濃度の正確な値または範囲を与えるであろう。別の実施態様において標準化曲線はまた、数式で表され、これは次に、測定された活性化凝固時間に基づく濃度を算出するのに使用することができる。例えばこの式またはアルゴリズムは、コンピュータープログラムに取り込まれて、これは入力した活性化凝固時間またはＡＣＴ数に基づき自動的に血液濃度を算出する。このようなプログラムはまた、活性化凝固時間を測定するための装置に組み込むこともできる。本発明の方法は、好ましくは被験体の血液中のｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストのような抗血小板化合物の濃度を追跡するために使用される。被験体は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは、入院患者もしくは通院している「外来患者」として、脳卒中、心筋梗塞、または素安定狭心症のような疾患の治療を受けているヒト患者である。この方法はまた、人工心臓弁のような人工器官を挿入するための手術またはＰＣＴＡを受けている被験体の抗血小板化合物の血中レベルを追跡するために使用することができる。前述のように、いくつかの抗血小板化合物が開発されており、その一部は臨床試験中である。本発明の方法により追跡できる化合物の例には、以下のものがあるが、これらに限定されない：抗体Ｃ７Ｅ３（セントコア（Centocor））；ＭＫ３８３：Ｎ（ブチルスルホニル）−Ｏ−（４−（４−ピペリジニル）ブチル）− Ｌ−チロシン、一塩酸塩（メルク（Merck）、ウエストポイント、ペンシルバニア州、米国１９４８６−０００４）；Ｌ−７０３０１４：（Ｒ）−ベータ［［［［１−オキソ−４（４−ピペリジニル）ブチル］アミノ］アセチル］アミノ］− １Ｈ−インドール−３−ペンタン酸（メルク（Merck））；ＲＯ４４−９８８３：（Ｓ）−［［１−［２−［［４−（アミノイミノメチル）ベンゾイル］アミノ］−３−（４−ヒドロキシフェニル）−１−オキソプロピル］−４−ピペリジニル］オキシ］酢酸（ホフマンラロッシュ（Hoffman LaRoche）、ナトレイ（Nutle y）、ニュージャージー州、米国０７１１０−１１９９）；ＧＲ１４４．０５３：４（４−（４−（アミノイミノメチル）フェニル）−１−ピペラジニル）−３ −メチル−１−ピペリジンアセテート（グラクソ（Glaxo）、リサーチトライアングルパーク（Research Triangle Park）、ノースカロライナ州、米国２７７０９）；ＢＩＢＵ１０４：メチルトランス−５−（Ｓ）−［［４−［４−（イミノ［（メトキシカルボニル）アミノ］メチル］フェニル］フェノキシ］メチル］− ２−オキソピロリジン−３−アセテート（ベーリンガーインゲルハイム（Boehri nger-Ingleheim）、リッジフィールド（Ridgefield）、コネチカット州、米国０６８７７−０３６８）；ＤＭＰ７２８：Ｎ−［３−（アミノメチル）ベンゾイル］−Ｄ−２−アミノブタノイル−Ｎ２−メチル−Ｌ−アルギニル−グリシル−Ｌ−アスパラギン酸、環状（４１→１）ペプチド；（デュポンメルク（DuPo nt Merck）、ウィルミングトン（Wilmington）、デラウェア州、米国１９８０５、および環状ヘプタペプチドインテグレリン（Integrelin）（登録商標）（シーオーアール・セラピューティクス（COR Therapeutics）、Ｓｏ．サンフランシスコ、カリホルニア州、米国）。本発明の好適な実施態様において、ｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストは、米国特許第５，３４４，９５７号（参考のため本明細書に組み込まれる）に記載のβ− アミノ酸誘導体の任意のものである。これらの誘導体は、一般式：を有する。これらの誘導体の特に好適な実施態様は、式：（３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４ −ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸エチル、一塩酸塩）を有する「化合物Ａ」を含む。化合物Ａは、式：（３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４ −ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸、一塩酸塩）を有する活性なｇｐ IIｂ/IIIａアンタゴニスト「化合物Ｂ」のプロドラッグ型である。これらの方法の別の好適な実施態様において、抗血小板化合物は、ＰＣＴ出願公報ＷＯ９４／２２８２０号（参考のため本明細書に組み込まれる）に記載の１ −アミジノフェニル−ピロリドン、ピペリジノンまたはアゼチノンの任意のものである。これらの化合物は、一般式：を有する。これらの化合物の特に好適な実施態様は、式：（Ｎ−［［［１−［４−アミノイミノメチル）フェニル］−２−オキソ−３Ｓ− ピロリジニル］アミノ］カルボニル］β−アラニン、エチルエステル）を有する「化合物Ｃ」である。化合物Ｃは、式：（３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−２−オキソ−ピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロアセテート）を有する、活性なｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニスト「化合物Ｄ」のプロドラッグ型である。現在このような患者の血液凝固を防止するために最も広く使用されている化合物は抗凝固剤ヘパリンである。ヘパリンは、肥満細胞を含有するヒト組織中に存在するグリコサミノグリカンである。被験体に投与されるヘパリンは、典型的にはブタの小腸粘膜またはウシの肺から抽出される。すなわち本発明の方法は、前述のような抗血小板化合物により、単独で、他の抗血小板化合物と組合せて、またはヘパリンと組合せて、抗血小板化合物で治療される被験体について使用される。被験体がヘパリンの無い抗血小板化合物で治療されている時、本発明は、抗血小板化合物の作用を増強するために活性化凝固時間の測定の前に、試料にヘパリンを添加することを企図する。すなわち、本発明はまた、ヘパリンと、抗血小板化合物と免疫反応する試薬とを含有する被験体の血液のＡＣＴ数を算出し、算出されたＡＣＴ数を標準化濃度曲線と比較し、こうして被験体の血液中の抗血小板化合物の量を測定することを特徴とする、抗血小板化合物で治療されている被験体の血液中のこの抗血小板化合物の量を測定するための方法を提供する。本発明はまた、ａ）被験体から血液試料を採取し；ｂ）この試料を少なくとも２つの部分に分離して、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を少なくとも１つの部分に加え；ｃ）試薬を含有しない（ｂ）の血液試料の少なくとも１つの部分の活性化凝固時間を測定し；ｄ）試薬を含有する（ｂ）の血液試料の少なくとも１つの部分の活性化凝固時間を測定し；ｅ）（ｃ）と（ｄ）の測定値からＡＣＴ数を算出し；そしてｆ）（ｅ）からのＡＣＴ数を標準化濃度曲線と比較して、こうして被験体の抗血小板化合物の濃度を測定することを特徴とする、抗血小板化合物で治療されている被験体の血液中の抗血小板化合物の濃度を測定するための方法を提供する。本発明の方法の実施において、抗血小板化合物で治療されている被験体からの血液は、ヘパリンを含有するシリンジ中に採取されるか、または採血後ヘパリンを加えることができる。ヘパリンと全血の比は、約１：１０かそれ未満であり、こうして血液中のヘパリンの最終濃度は、１．０単位／ml〜３．０単位／mlの間、好ましくは約１．５単位／mlである。本発明の方法の実施において、使用される免疫反応性試薬の量は、抗血小板化合物の作用を中和するのに有効な量である。この有効量を測定する方法は、当業者に公知である。好適な実施態様において、有効量は、試料中の免疫反応性試薬の最終濃度約１００nM〜５００nMを与える量であろう。活性化凝固時間は、現在入手できるいくつかの装置により測定できる。最も広く利用されている２つの入手できる装置は、ヘモテク（Hemotech）（メトロニック（Metronic）、パーカー社（Parker Co.）、米国８０１３４−９０６１）とヘモクロン（Hemochron）（インターナショナルテキンダイン（International Tec hindyne）；ニュージャージー州、米国）である。へモテク（Hemotech）は、カオリン活性化血液試料中に出し入れされる機械的プランジャーを利用する。凝固試験は、複数２チャネル試験カートリッジを使用して行われる。各カートリッジは、試薬リザーバーと反応室を有し、外部ヒートブロックであらかじめ加熱されるか、または装置中で加熱される。血液試料は、加熱されたカートリッジに加えられる。試験を開始すると、機械は自動的に、カオリン試薬を反応室に入れ、あらかじめ決められた間隔で各反応室でプランジャーの上げ下げが始まる。プランジャーの作用により試料が試薬と混合され、凝固形成について試験される。凝固が形成されると、プランジャーの下方への動きが低下する。プランジャーの降下速度の低下は、光学系により検出され、凝固の形成を機械が知らせる。各凝固時間、または平均およびチャネルの差は、機械の前面に表示される。ヘモクロン（Hemoch ron）は類似の装置であるが、血液の凝固活性化にカオリンの代わりに珪藻土を使用する。ヘモクロン（Hemochron）は、検出器から動いて離れていく磁石を追跡することにより、凝固形成を測定する。２つの装置の比較は、各装置の測定値を相互に交換することができないことを示している。アベンダコとファーガソン（A．Avendaco and J．Ferguson）、Ｊ．Ａ．Ｃ．Ｃ．（１９９４年３月１５日）、２３巻（４）、９０７〜９１０頁。すなわち、標準化濃度曲線もまた、入手できる試験装置について標準化される。Ｂ．抗体上記方法のいずれかの実施において、抗血小板化合物と免疫反応する試薬は、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体のどちらでもよい。好適な実施態様において、抗血小板化合物と免疫反応する試薬はモノクローナル抗体である。「抗体」という用語は、文法的に種々の型で、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性を有する部分（すなわち、抗体結合部位を含有する分子、すなわち「パラトープ」）を意味する。本明細書において「抗体」は、完全な免疫グロブリン分子またはパラトープを含有する免疫グロブリン分子の任意の部分を意味し、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、およびＦ(v)のような当該分野で公知の部分を含む。「免疫反応する」という用語は、種々の型で、抗原決定基を含有する分子と、抗体結合部位を含有する分子（例えば、全抗体分子またはその一部）との間の特異的結合を意味する。「抗原決定基」という用語は、抗体結合部位により免疫学的に結合される抗原の実際の構造部分を意味する。この用語はまた、「エピトープ」と相互に交換して使用可能である。本明細書において、「特異的結合」という用語は、その種々の型で、細胞表面受容体とリガンド分子の間の非ランダム結合反応を意味する。ポリクローナル抗体または「抗血清」は、動物（例えば、ヤギ、マウスまたはウサギ）に、化合物に対する抗体を産生する目的の化合物を投与することにより産生することができる。抗体レベルまたは「力価」が充分なレベルに達すると、抗体含有血清が動物から採取される。目的の化合物と免疫反応する抗体は、当業者に公知の技術（例えば、アフィニティクロマトグラフィー）により分離することができる。モノクローナル抗体は、コーラーとミルスタイン（Kohler and Milstein）がＮａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５〜４９７頁（１９７５）に記載した方法（参考のため本明細書に組み込まれる）を使用して産生することができる。一般的にはマウスに、目的の抗原が接種される。これは、抗原に対する抗体を発現するリンパ球の増殖を刺激する。脾臓からリンパ球を採取し、ポリエチレングリコールのようなポリマーにより処理してミエローマ細胞に融合させる。融合されていない細胞は増殖できない培地中で増殖させることにより、ハイブリッド細胞を選択する。各ハイブリッド細胞をさらに培養し、抗原に結合する抗体の存在について試験する。ある場合には目的の抗原が、抗体を産生するように接種した動物を刺激しない場合がある。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生を確実にするために、抗原に担体分子を結合して、動物の免疫反応を刺激するのに充分大きい化合物を作成してもよい。担体分子は、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはサイログロブリンのようなタンパク質を含有してもよい。担体分子、特に目的の抗原を含む新しい化合物は、ハプテンとして知られ、当業者に公知の方法で調製される。本発明の方法の実施に特に好適なモノクローナル抗体を産生する以下のハイブリドーマが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ），１２３０１パークローンドライブ（Parklawn Drive）、ロックビル（Rockville）、メリーランド州２０８５２、アメリカ合衆国、に、１９９６年４月１２日に寄託された：１）ＡＴＴＣ受託番号ＨＢ−１２０８１を割り当てられた、Ｐ１８７．４Ｄ７．Ｂ３．Ａ１（本明細書において「４Ｄ７」とも呼ぶ）；２）ＡＴＴＣ受託番号ＨＢ−１２０８２を割り当てられた、Ｐ１８７．９Ｆ７．Ａ５．Ａ１（本明細書において「９Ｆ７」とも呼ぶ）。これらのハイブリドーマは、特許出願の係属中はハイブリドーマの入手が制限され、特許の付与後は、寄託されたハイブリドーマの公衆への入手の制限は永久に取り除かれる。すなわち本発明は、上記抗血小板化合物のいずれかと免疫反応する抗体を提供する。この抗体は、精製したかまたは精製していないポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体（これらの免疫反応性断片を含む）でもよい。本発明はまた、モノクローナル抗体を産生または「分泌」するハイブリドーマを提供する。好適な実施態様において本発明はまた、抗血小板化合物と免疫反応し基本的にヘパリンと免疫反応しない、マウスハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体を提供する。Ｃ．キット本発明の抗体は、本発明の方法を実施するための「キット」の一部として提供されると予想される。このキットは、特異的抗血小板化合物のための免疫反応性「試薬」（すなわち、前記で定義した抗体）を提供するであろう。典型的には、このキットはまた、算出されたＡＣＴ数を比較し、被験体の血液中の抗血小板化合物の量を測定するための、前記で定義した標準化曲線も含むであろう。しかしこれらの曲線は、通常の技術および本発明の教示を使用することにより、公に利用できるようになるかまたは当業者が決定することができるであろう。すなわち本発明はまた、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を含む化合物で治療されている被験体の抗血小板化合物の濃度を追跡するためのキットも提供する。キットの好適な実施態様において、試薬は、ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ− １２０８１により産生されるモノクローナル抗体を含む。別の好適な実施態様において、試薬は、ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ−１２０８２により産生されるモノクローナル抗体を含む。上記本発明はさらに、以下の例で例示される。これらの例は、以下の請求の範囲に詳述される本発明の範囲を決して限定するものではなく、またそのようなものと解してはならない。例例１ − ヘパリン化ヒト全血中の活性化凝固時間（ＡＣＴ）の測定方法この例は、ヘモクロン（Hemochron）−８０００を使用して活性化凝固時間を測定する方法を示す。この方法は、種々の既知濃度の抗血小板化合物について標準化濃度曲線を算出するために使用することができる。この方法はまた、本発明の方法のためのＡＣＴ数の算出に使用するための、活性化凝固時間を測定するために使用することができる。調製１．ヒトの志願者から血液を、ヘパリンを含有するシリンジに採取した。ヘパリン対全血の比は、シリンジ中のヘパリンの最終濃度が１．４単位/mlになるように、１：１０であった。２．ヘモクロン（Hemochron）−８０００をセットアップして、同じ製造業者（インターナショナルテキンダイン（International Techindyne））のＰ−２１５試験管を使用してＡＣＴを行なった。操作１．１mlの血液試料を、２．５〜１０μｌの化合物または食塩水とともに、室温で５分間インキュベートした。２．Ｐ−２１５試験管に４００μｌの検体試料をピペットで入れて、ヘモクロン（Hemochron）をスタートさせた。試験管を静かに混合し、ヘモクロン（Hemochr on）に置き、装置の光が点灯するまで１回転させた。３．３０秒以内に装置の第２のチャネルについて工程２を繰り返して、平均活性化凝固時間を得た。装置は凝固形成を検出し、各チャネルについての時間および２つの平均の時間を表示する。４．抗体を使用する時は、化合物と全血のインキュベーション後にこれを加え、さらに５分間インキュベートしてから試験を開始した。工程２と３を前述のように繰り返した。例２ − 活性化凝固時間に及ぼす抗血小板化合物濃度の影響の証明１．４単位／mlのヘパリンのみを含有する各ドナーからの対照全血について、まず活性化凝固時間を測定した（秒）。次に各ドナーについてヘパリン以外に抗血小板化合物ＢとＤの濃度を変えて、例１に示すように凝固時間を測定した。特定の濃度の化合物の凝固時間を、化合物を含有しない対照の凝固時間で割って、凝固比を得た。この凝固比を、化合物濃度に対してプロットする。図１は、異なる濃度の抗血小板化合物が、例１の方法により測定した活性化凝固時間に直接影響を与えることを示す。例３ − 活性化凝固時間に及ぼすポリクローナル抗体の影響の測定ヘパリンのみ（対照）およびヘパリンと５×１０^-8Ｍの抗血小板化合物Ｂを含有する血液試料について、無関係のウサギ抗血清、ウサギＩｇＧ、および化合物Ｂに対するウサギポリクローナル抗体の１０μｌと５μｌの非存在下または存在下で、例１に記載のように活性化凝固時間を算出した。活性化凝固時間比は、例２に記載のように算出した。図２から明らかなように、抗体の存在は、抗血小板化合物を含有する血液の活性化凝固時間に顕著な影響を与える。抗体の濃度が高い（１０μｌ）ほど、凝固に及ぼす化合物Ｂの影響が完全に逆転した。例４ − モノクローナル抗体（Ｍａｂ）産生化合物Ｂのリジン含有誘導体である「化合物Ｅ」（Ｎ−［Ｎ−［４−［［４− （アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］−Ｌ− アスパルチル］−Ｌ−リジン、ビス（トリフルオロ酢酸塩）、２水和物）を、抗体産生のためのハプテンとして使用した。このハプテンをサイログロブリンに結合させて、担体タンパク質を得て、マウスに注射した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合した化合物Ｅに対する抗体についてマウスをスクリーニングし、最も高い力価を有するマウスを選択して、モノクローナル抗体産生のためのクローンを産生した。融合とモノクローナル抗体産生は、標準的方法に従って行なった。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、２５μｇの化合物Ｅを毎月腹腔内注射して免疫した。抗原はフロイントアジュバントで投与し、免疫は８週間続けた。高力価の循環抗化合物Ｅを産生するマウスから脾臓を切り出し、脾臓を切って脾細胞を取り出した。脾細胞を、マウスミエローマ細胞に融合させた。アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ），１２３０１パークローンドライブ（Parklawn Drive）、ロックビル（Rockville）、メリーランド州２０８５２、アメリカ合衆国から得たマウスミエローマ細胞（ＳＰ２／ｍｉｌ６）ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ−２０１６に、融合させた。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４８巻、１９９〜２０７頁（１９９２）参照。細胞をポリエチレングリコールで融合させ、脾細胞とミエローマ細胞の融合から得られる細胞のみが増殖できる選択条件下（ＨＡＴ培地）で、増殖させた。調整培地試料が、ウシ血清アルブミンに結合した固定化化合物Ｅに結合する能力を評価することにより、融合の子孫を抗体の存在について解析した。単一の融合の産物に由来する細胞のコロニーを得るために、陽性子孫を軟寒天に継代した。抗化合物Ｅ抗体を産生する１０個の陽性コロニーを得た。１０個のうち９個は、ＩｇＧ１、Ｋイソタイプであり、１つ（７Ｃ４）はＩｇＧ２、Ｋイソタイプであった。すべての精製した抗体は、化合物Ｂに特異的に結合した。これらの抗体を含有する腹水をＢａｌｂ／ｃマウスで産生させ、プロテインＧ −セファロースアフィニティクロマトグラフィーにより、抗体を均一になるまで精製した。腹水と精製ＩｇＧの両方を、凝集測定法（例５）とＡＣＴ測定法（例７）で中和活性について試験した。例５ − ヒト血小板リッチ血漿の凝集クエン酸化全血を、９７０×ｇで室温で３．１分遠心分離して、ヒト血小板リッチ血漿（「ＰＲＰ」）を調製した。ＰＲＰを赤血球から注意深く除去し、５０ mlの円錐管に入れた。血小板凝集は、ＡＤＰ（２０μＭ）またはコラーゲン（４ μｇ/ml）をアゴニストとして使用して、凝集測定器（aggregometer）（バイオデータ（Bio-Data）モデルＰＡＰ−４、ホルシャム（Horsham）、ペンシルバニア州）中の光透過の増加として測定した。いずれが有用な方法でアンタゴニストを認識したかをスクリーニングするための手段として、ｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストである化合物Ｂ、化合物Ｄ、およびメルク（Merck）化合物ＭＫ３８３を中和する能力について、例４に従って産生した抗体を凝集で試験した。使用した抗血小板化合物のレベルは、それ自身で少なくとも５０％の凝集阻害を与えた。結果を図３に示す。例６ − 化合物Ｂの活性化凝固時間（ＡＣＴ）に及ぼすモノクローナル抗体の影響例４に従っていくつかのモノクローナル抗体を調製した。５×１０^-8Ｍの化合物Ｂの存在下で一連の抗体について、例１の方法に従って活性化凝固時間を算出した。図４から明らかなように、すべてのモノクローナル抗体は、化合物単独と比較して凝固時間を低下させた。無関係のタンパク質に対する対照モノクローナル抗体（「ＣｏｎｔＭａｂ」）は何の影響も与えなかった。例７ − モノクローナル抗体の中和活性例４に従って調製したモノクローナル抗体（９Ｆ７）を、抗血小板化合物ＢとＤを中和する能力について、２人の異なるドナーからの全血中で試験した。メドトロニックヘモテック（Medtronic Hemotec）装置を使用して、活性化凝固時間を測定した。図５から明らかなように、抗体９Ｆ７は、２つの抗血小板化合物についての活性化凝固時間測定値に顕著な影響を与えた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年５月７日（１９９８．５．７）【補正内容】ＥＰＡ０５２０４３６号は、未知の血小板インヒビター濃度を測定するための競合的免疫化学的測定法を開示する。すなわち、特異的に標識された６，１５− ＤＫ−１３，１４，ＤＨ−ＰＧＦ₁αを認識する抗体と、固相上の抗抗体を反応させて、マーカー活性を測定する。請求の範囲１．抗血小板化合物で治療されている被験体の血液中のこの化合物の量を測定するための方法であって、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を含有する被験体の血液のＡＣＴ数を算出し、算出されたＡＣＴ数を標準化濃度曲線と比較し、こうして被験体の血液中の抗血小板化合物の量を測定することを特徴とする、上記方法。２．抗血小板化合物はｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストである、請求の範囲第１項に記載の方法。３．ｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストは、３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−２ −オキソ−ピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロアセテートよりなる群から選択される、請求の範囲第２項に記載の方法。４．抗血小板化合物と免疫反応する試薬はモノクローナル抗体である、請求の範囲第１項に記載の方法。５．モノクローナル抗体は、３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−２−オキソ− ピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロアセテートよりなる群から選択される抗血小板化合物と免疫反応する、請求の範囲第４項に記載の方法。６．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８１およびＨＢ−１２０８２と呼ぶハイブリドーマによりなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗体である、請求の範囲第４項に記載の方法。７．ヘパリンと、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を含有する被験体の血液のＡＣＴ数を算出し、算出されたＡＣＴ数を標準化濃度曲線と比較し、こうして被験体の血液中の抗血小板化合物の量を測定することを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の方法。８．抗血小板化合物はｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストである、請求の範囲第７項に記載の方法。９．ｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストは、３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−２ −オキソ−ピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロアセテートよりなる群から選択される、請求の範囲第８項に記載の方法。１０．抗血小板化合物と免疫反応する試薬はモノクローナル抗体である、請求の範囲第７項に記載の方法。１１．モノクローナル抗体は、エチル３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−２− オキソ−ピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロアセテートよりなる群から選択される抗血小板化合物と免疫反応する、請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８１と呼ぶハイブリドーマにより産生される抗体である、請求の範囲第１０項に記載の方法。１３．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８２と呼ぶハイブリドーマにより産生される抗体である、請求の範囲第１０項に記載の方法。１４．請求の範囲第１項に記載の方法であって、ａ）被験体から血液試料を採取し；ｂ）この試料を少なくとも２つの部分に分離して、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を少なくとも１つの部分に加え；ｃ）試薬を含有しない（ｂ）の血液試料の少なくとも１つの部分の活性化凝固時間を測定し；ｄ）試薬を含有する（ｂ）の血液試料の少なくとも１つの部分の活性化凝固時間を測定し；ｅ）（ｃ）と（ｄ）の測定値からＡＣＴ数を算出し；そしてｆ）（ｅ）からの算出されたＡＣＴ数を標準化濃度曲線と比較して、こうして被験体中の抗血小板化合物の濃度を測定することを特徴とする、上記方法。１５．抗血小板化合物はｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストである、請求の範囲第１４項に記載の方法。１６．ｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストは、３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］− ２−オキソ−ピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロアセテートよりなる群から選択される、請求の範囲第１５項に記載の方法。１７．抗血小板化合物と免疫反応する試薬はモノクローナル抗体である、請求の範囲第１４項に記載の方法。１８．モノクローナル抗体は、３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−２−オキソ −ピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロアセテートよりなる群から選択される抗血小板化合物と免疫反応する、請求の範囲第１７項に記載の方法。１９．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８１と呼ぶハイブリドーマにより産生される抗体である、請求の範囲第１７項に記載の方法。２０．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８２と呼ぶハイブリドーマにより産生される抗体である、請求の範囲第１７項に記載の方法。２１．抗体は、抗血小板化合物と免疫反応し、基本的にヘパリンと免疫反応しない、マウスハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体であって、抗血小板化合物はｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストである、上記抗体。２２．ｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストは、エチル３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］− ４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−２−オキソピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロアセテートよりなる群から選択される、請求の範囲第２１項に記載のモノクローナル抗体。２３．ＡＴＣＣＨＢ−１２０８１と呼ぶハイブリドーマ細胞株。２４．ＡＴＣＣＨＢ−１２０８２と呼ぶハイブリドーマ細胞株。２５．請求の範囲第２３項に記載のハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体。２６．請求の範囲第２４項に記載のハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体。２７．抗血小板化合物と免疫反応する試薬を含有する被験体のＡＣＴ数を算出し、算出されたＡＣＴ数を標準化濃度曲線と比較することにより、抗血小板化合物で治療されている被験体の血液中のこの化合物の濃度を追跡するためのキットであって、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を含む、上記キット。２８．試薬はモノクローナル抗体である、請求の範囲第２７項に記載のキット。２９．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８１と呼ぶハイブリドーマにより産生される、請求の範囲第２７項に記載のキット。３０．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８２と呼ぶハイブリドーマにより産生される、請求の範囲第２７項に記載のキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/86 Ｇ０１Ｎ 33/86 33/96 33/96 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者フェイジェン，ラリー，ピー. アメリカ合衆国60062 イリノイ州ワウコンダ，レイクショアコート 25765 (72)発明者ハース，ニール，エフ. アメリカ合衆国60630 イリノイ州シカゴ, カタルパアベニュー 5079 (72)発明者メイヤー，デブラ，エム. アメリカ合衆国63385 ミズーリ州ウエンツビル，スウェイングオークスロード 1804 (72)発明者ページ，ジミイ，ディ. アメリカ合衆国60031 イリノイ州ガーニイ，イーストウッドアベニュー 4356 (72)発明者ペッグ，ジョディ，アンアメリカ合衆国63021 ミズーリ州ボールウイン，オークバラドライブ 1164

Claims

【特許請求の範囲】１．抗血小板化合物で治療されている被験体の血液中のこの化合物の量を測定するための方法であって、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を含有する被験体の血液のＡＣＴ数を算出し、算出されたＡＣＴ数を標準化濃度曲線と比較し、こうして被験体の血液中の抗血小板化合物の量を測定することを特徴とする、上記方法。２．抗血小板化合物はｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストである、請求の範囲第１項に記載の方法。３．ｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストは、３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−２ −オキソ−ピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロアセテートよりなる群から選択される、請求の範囲第２項に記載の方法。４．抗血小板化合物と免疫反応する試薬はモノクローナル抗体である、請求の範囲第１項に記載の方法。５．モノクローナル抗体は、３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−２−オキソ− ピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロ酢酸塩よりなる群から選択される抗血小板化合物と免疫反応する、請求の範囲第４項に記載の方法。６．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８１およびＨＢ−１２０８２と呼ぶハイブリドーマによりなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗体である、請求の範囲第４項に記載の方法。７．抗血小板化合物で治療されている被験体の血液中のこの化合物の量を測定するための方法であって、ヘパリンと、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を含有する被験体の血液のＡＣＴ数を算出し、算出されたＡＣＴ数を標準化濃度曲線と比較し、こうして被験体の血液中の抗血小板化合物の量を測定することを特徴とする、上記方法。８．抗血小板化合物はｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストである、請求の範囲第７項に記載の方法。９．ｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストは、３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−２ −オキソ−ピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロ酢酸塩よりなる群から選択される、請求の範囲第８項に記載の方法。１０．抗血小板化合物と免疫反応する試薬はモノクローナル抗体である、請求の範囲第７項に記載の方法。１１．モノクローナル抗体は、エチル３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−２− オキソ−ピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロ酢酸塩よりなる群から選択される抗血小板化合物と免疫反応する、請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８１と呼ぶハイブリドーマにより産生される抗体である、請求の範囲第１０項に記載の方法。１３．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８２と呼ぶハイブリドーマにより産生される抗体である、請求の範囲第１０項に記載の方法。１４．抗血小板化合物で治療されている被験体の血液中のこの化合物の濃度を測定するための方法であって、ａ）被験体から血液試料を採取し；ｂ）試料を少なくとも２つの部分に分離して、抗血小板化合物と免疫反応する試薬を少なくとも１つの部分に加え；ｃ）試薬を含有しない（ｂ）の血液試料の少なくとも１つの部分の活性化凝固時間を測定し；ｄ）試薬を含有する（ｂ）の血液試料の少なくとも１つの部分の活性化凝固時間を測定し；ｅ）（ｃ）と（ｄ）の測定値からＡＣＴ数を算出し；そしてｆ）（ｅ）からの算出されたＡＣＴ数を標準化濃度曲線と比較して、こうして被験体中の抗血小板化合物の濃度を測定することを特徴とする、上記方法。１５．抗血小板化合物はｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストである、請求の範囲第１４項に記載の方法。１６．ｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストは、３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］− ２−オキソ−ピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロ酢酸塩よりなる群から選択される、請求の範囲第１５項に記載の方法。１７．抗血小板化合物と免疫反応する試薬はモノクローナル抗体である、請求の範囲第１４項に記載の方法。１８．モノクローナル抗体は、３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］−４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−２−オキソ −ピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロ酢酸塩よりなる群から選択される抗血小板化合物と免疫反応する、請求の範囲第１７項に記載の方法。１９．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８１と呼ぶハイブリドーマにより産生される抗体である、請求の範囲第１７項に記載の方法。２０．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８２と呼ぶハイブリドーマにより産生される抗体である、請求の範囲第１７項に記載の方法。２１．抗体は、抗血小板化合物と免疫反応し、基本的にヘパリンと免疫反応しない、マウスハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体。２２．抗血小板化合物はｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストである、請求の範囲第２１項に記載のモノクローナル抗体。２３．ｇｐIIｂ/IIIａアンタゴニストは、エチル３Ｓ−［［４−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］アミノ］−１，４−ジオキソブチル］アミノ］− ４−ペンチン酸；および３−［［［［１−［４−（アミノイミノメチル）フェニル］−２−オキソピロリジン−３Ｓ−イル］アミノ］カルボニル］アミノ］プロパン酸、トリフルオロ酢酸塩よりなる群から選択される、請求の範囲第２２項に記載のモノクローナル抗体。２４．ＡＴＣＣＨＢ−１２０８１と呼ぶハイブリドーマ細胞株。２５．ＡＴＣＣＨＢ−１２０８２と呼ぶハイブリドーマ細胞株。２６．請求の範囲第２４項に記載のハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体。２７．請求の範囲第２５項に記載のハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体。２８．抗血小板化合物と免疫反応する試薬を含む抗血小板化合物で治療されている被験体の、抗血小板化合物の濃度を追跡するためのキット。２９．試薬はモノクローナル抗体である、請求の範囲第２８項に記載のキット。３０．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８１と呼ぶハイブリドーマにより産生される、請求の範囲第２８項に記載のキット。３１．モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ−１２０８２と呼ぶハイブリドーマにより産生される、請求の範囲第２８項に記載のキット。