JP2000510266A

JP2000510266A - 悪性腫瘍に関連した変化を自動的に検出する方法および装置

Info

Publication number: JP2000510266A
Application number: JP09540332A
Authority: JP
Inventors: マックオーリー、カラム・イー; パルシック、ブランコ; ガーナー、デイビッド・エム; ハリソン、エス・アラン
Original assignee: ONCOMETRICS IMAGING CO RPORATION
Current assignee: ONCOMETRICS IMAGING CO RPORATION
Priority date: 1996-05-10
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 2000-08-08
Also published as: AU2377997A; CA2253850C; US5889881A; CA2253850A1; WO1997043732A1; US6493460B1; EP0901665A1

Abstract

(57)【要約】悪性腫瘍に関連した変化を検出する方法である。細胞のサンプルが採取され、核のＤＮＡ材料を識別するために染色される。このサンプルは、デジタル顕微鏡により映像化される。対象物を含む画素の強度対そのスライド映像中の全画素の平均強度に基づいて、重要な対象物が細胞のサンプルにおいて識別される。各対象物について正確なエッジが配置され、顕微鏡の照明強度の変化が補償される。コンピュータシステムは、各対象物について特徴値を計算し、その特徴値に基づいて細胞が悪性腫瘍に関連した変化を示しているか否かが決定される。

Description

【発明の詳細な説明】悪性腫瘍に関連した変化を自動的に検出する方法および装置発明の分野本発明は、一般に映像血球計算システムに関し、とくに細胞核の悪性腫瘍に関連した変化を検出する自動システムに関する。発明の背景患者の癌を診断する最も一般的な方法は、疑わしい組織のサンプルを取って、顕微鏡で明らかに悪性の細胞がそこに存在しているかどうかを検査することである。このプロセスは、疑わしい組織の位置が分かっている場合は比較的容易であるが、容易に識別可能な腫瘍または前癌症状の病変が全く存在しない場合にはあまりたやすいものではない。たとえば、喀痰サンプルから肺癌の存在を検出するためには、１以上の比較的稀な癌細胞がそのサンプル中に存在している必要がある。したがって、そのサンプルが肺の状態を正しく反映していない場合、肺癌の患者は適切に診断されない可能性がある。悪性腫瘍に関連した変化（ＭＡＣ）は、癌組織の近くで認められる見掛け上は正常な細胞の核の中で発生することが知られている僅かな変化である。さらに、ＭＡＣは前癌症状の病巣の近くで認められる組織中で検出されている。ＭＡＣを示する細胞は悪性の細胞よりも非常に多いため、ＭＡＣは、とくに癌細胞の位置を決定できない場合に、癌の存在を診断する付加的な方法を提供する。癌または前癌症状の病巣を有する患者の中のＭＡＣを検出する探知装置(resea rcher)の能力にかかわらず、ＭＡＣは依然として、患者が癌になっているか、または癌に発展するかどうかを判断して決定するためのスクリーニングツールとして広く承認されてはいない。伝統的に、ＭＡＣは、腫瘍または前癌症状の病巣に近い位置から細胞サンプルを注意深く選択して、その細胞を比較的高い倍率で観察することによって検出されてきた。しかしながら、細胞の中で発生する悪性腫瘍に関連した変化は非常に僅かであるため、とくに人間の病理学者が、患者が癌であるか否かを知らなかった場合、その病理学者が通常の顕微鏡的な装置の操作によって高い信頼性の下にこれを検出することはできない。たとえば、悪性腫瘍に関連した変化は、核のエッジの形状の僅かなバリエーションと結び付けて考えられる核内のＤＮＡの分布によって示される可能性がある。しかしながら、正常な細胞からの核は、類似したタイプであるがＭＡＣを意味する程ではない変化を示すことがある。人間のオペレータはこのような僅かな細胞変化を容易に定量化することができないため、細胞がＭＡＣを示しているかどうかを判断して決定することは困難である。さらに、ＭＡＣを示す変化は、異なるタイプの癌によって変わる可能性があり、したがってそれらを検出することが一層難しくなる。発明の概要本発明は、細胞サンプル中の悪性腫瘍に関連した変化を自動的に検出するシステムである。このシステムはＣＣＤカメラを有するデジタル顕微鏡を備え、このＣＣＤカメラは、コンピュータシステムによって制御され、かつそのコンピュータシステムとインターフェースされている。デジタル顕微鏡によって捕捉された映像は、映像処理ボードに記憶され、悪性腫瘍に関連した変化（ＭＡＣ）の存在を検出するためにコンピュータシステムにより操作される。現在の技術水準では、ＭＡＣを検出するには、高い空間分解能、高い光度測定(photometric)分解能で映像が捕捉される必要があり、その核から得られた全ての情報が焦点を結んでおり、全ての情報が（ある背景ではなく）その核に属し、また、その核および核材料の正確で再生可能な区分化が行われていると考えられる。以下、これらの各ステップを詳細に説明する。悪性腫瘍に関連した変化を検出するために、細胞サンプルが採取され、その細胞の核材料を識別するために着色され、顕微鏡によって映像化される。この染料は化学量論的であり、ＤＮＡだけに特有である。その後、コンピュータシステムがその映像を解析して、その映像を構成している全ての画素のヒストグラムを計算する。最初に、この映像中の対象物を構成している画素から背景画素を分ける強度しきい値が設定される。しきい値より小さい強度値を有する全ての画素は、おそらく重要な対象物として識別され、一方このしきい値より大きい強度値を有するものは背景として識別されて無視される。配置された各対象物に対して、コンピュータシステムは、その対象物の面積、形状および光密度を計算する。細胞核でない可能性が高い対象物は無視される。次に、映像が完全に較正(decalibrate)される。すなわち、現在のフレームからスライドの走査前に捕捉された空の(empty)フレームを減算し、平均背景光レベルに等しいオフセット値を加算して戻すことによって映像が補正される。このプロセスは、このシステムのあらゆるシェーディング、不均一な照明および映像獲得システムの他の不完全なものを補正する。この完全な較正に続いて、残り全ての対象物の映像がさらに正確に焦点を結ばれて捕捉されなければならない。これは、近似的なフレーム焦点の周囲の多焦点平面においてステージのｚ方向に顕微鏡を移動することによって達成される。残存する各対象物に対して、コントラスト関数（テクスチャ特徴）が計算される。このコントラスト関数は、その対象物の正確な焦点にピーク値を有する。最高のコントラスト値の映像だけがコンピュータメモリ中に保存され、このようなピーク値に達しなかった対象物はそれ以上検討されない。映像に焦点が結ばれた残りの各対象物はさらに、その対象物を包囲している材料の局部吸光度を補償される。これは、空フレームの等価な正方形を使用して、その対象物が適合する正方形の面積に等しい面積を有する小さな１組の画素だけが補正されることを除いて、上述のフレーム完全較正について説明されたものに類似した局部的な完全較正である。局部完全較正過程により全ての映像が補正された後、対象物のエッジが計算される。すなわち、正方形の中のどの画素がその対象物に属し、どれが背景に属しているかを決定する境界が決定される。このエッジ決定は、エッジ再配置アルゴリズムによって行われる。このプロセスにおいて、残存する各対象物の第１の輪郭をもつフレームのもとのマスクのエッジは、いくつかの画素に対して内部および外部に向けて拡張される。このフレーム中のあらゆる画素に対して、グラジエント値、すなわち、検討されている画素に接触している全ての隣接画素間の和と差とが計算される。その後、リム（縁）が裂けていないという条件で、リムから最低のグラジエント値が除去される。このプロセスは、残りの画素のリムが１つになるまで続けられる。対象物の適当なエッジが確実に配置されるようにするために、このエッジは前のように再び拡張されてもよく、新しいエッジが前のエッジと同じになるまで、このプロセスが繰り返される。このようにして、エッジは最高の局部グラジエントに沿って計算される。その後、コンピュータシステムは、各対象物に対して１組の特徴値を計算する。いくつかの特徴計算に対して、最高のグラジエント値に沿ったエッジは、１以上の画素だけエッジを拡張するか、あるいはエッジを徐々に破壊(erode)するかのどちらかによって補正される。これは、各特徴が対象物のクラス間の大きいほうの識別能力を獲得するように行われ、それによって対象物が特定化する。その後、これらの特徴値は、その対象物が人工的な物であるか、細胞核であるかを決定するために特徴値を使用する分類機によって解析される。対象物が細胞核であると思われる場合、その特徴値は、その核が悪性腫瘍に関連した変化を示しているかどうかを決定するために分類機によってさらに解析される。悪性腫瘍に関連した変化および悪性腫瘍に関連したスコア全体の少なくとも一方を有するように見えるサンプル中の対象物の個数に基づいて、細胞サンプルが採取された患者が健康であるか、あるいは悪性腫瘍が隠れているかを決定することができる。図面の簡単な説明以下の詳細な説明および添付図面を参照することにより、本発明の上記の特徴および多数の付加的な利点が容易に明らかになり、よく理解されるであろう。図１は、本発明によるＭＡＣ検出システムのブロック図である。図２Ａ乃至２Ｃは、ＭＡＣを検出するために本発明によって行われたステップを示す一連のフローチャートである。図３は、重要な対象物をスライドの背景から分離するために使用されるヒストグラムの一例である。図４は、ＭＡＣの検出のために細胞サンプルを処理するために使用される好ましい着色過程のフローチャートである。図５および６は、映像中に位置された対象物の概略図である。図７Ａ乃至７Ｆは、本発明が対象物のエッジを位置決めするための動作するかを示す。図８および９は、人工物と細胞核とを分離し、またＭＡＣ核と非ＭＡＣ核とを分離する分類機の説明図である。図１０は、ＭＡＣの存在に基づいて、患者が正常であるか異常であるかを決定するために本発明によって行われるステップのフローチャートである。好ましい実施形態の詳細な説明上述のように、本発明は、患者から採取された細胞の核の中の悪性腫瘍に関連した変化（ＭＡＣ）を自動的に検出するシステムである。ＭＡＣの有無から、その患者に悪性の癌があるかどうかを判断することができる。図１には、本発明によるＭＡＣ検出システムのブロック図が示されている。このシステム10は、コンピュータシステム30によって制御され、かつこのコンピュータシステム30とインターフェースされているデジタル顕微鏡12を備えている。この顕微鏡12は、寸法がほぼ０．３μｍ×０．３μｍの正方形画素を有する科学的ＣＣＤを使用するデジタルＣＣＤカメラ14を有していることが好ましい。科学的ＣＣＤは、１００％の充填係数と、２５６以上の中間調レベルの解像度とを有している。このＣＣＤカメラは、顕微鏡12の平坦な対物レンズ22の１次画像平面に取付けられることが好ましい。細胞サンプルは、顕微鏡のモータ化されたステージ20上に配置され、この顕微鏡の位置は、コンピュータシステム30によって制御される。モータ化されたステージ20は、スライド解析プロセスを完全に自動化することができるように、自動スライドローダを有していることが好ましい。フィードバック制御手段を備えていることが好ましい安定した光源18は、そのスライドの映像がＣＣＤカメラによって捕捉されているあいだ細胞サンプルを照明する。サンプル16とＣＣＤカメラ14との間に配置されるレンズ22は、歪みのない映像を生成する１乃至２μｍの範囲の被写界深度を提供する２０ｘ／０．７５対物レンズであることが好ましい。本発明のこの実施形態において、使用されるデジタルＣＣＤカメラ14は、Xillix Technologies社（Richmond,B.C.,Canada）製の商標名Microimagerである。このＣＣＤカメラによって生成された映像は、デジタルカメラ14とコンピュータシステム30との間のインターフェースとして機能する映像処理ボード32によって受取られる。デジタル映像は映像処理ボードに記憶され、ＭＡＣの検出を容易にするように操作される。映像処理ボードは、デジタル映像から１組のアナログビデオ信号を生成し、顕微鏡によって観察された対象物の映像を表示するためにビデオ信号を映像モニタ36に供給する。コンピュータシステム30はまた、キーボードやマウスのような１以上の入力装置38と、大容量デジタル記憶装置、モデムまたは離れた位置にあるコンピュータと通信するためのネットワークカードのような１以上の周辺装置42と、モニタ40 とを備えている。図２Ａ乃至２Ｃは、サンプルがＭＡＣを示しているか否かを決定するために本発明のシステムによって行われるステップを示している。はじめにステップ50において、細胞サンプルが採取される。バイオプシや、削り取ったりする等の任意の数の通常の方法によって細胞を採取してもよい。その細胞はスライドに固着され、ステップ52において、サンプル中の核のＤＮＡを識別する変形フォイルゲン方法を使用して着色される。着色過程の詳細は図４に示されており、以下これを詳細に説明する。ステップ54において、スライドからのフレームの映像がＣＣＤカメラによって捕捉され、映像プロセッサに転送される。このプロセスにおいて、このカメラ内のＣＣＤセンサはクリアされ、そのカメラのシャッタが一定期間開かれ、この期間は光源18の強度に依存している。以下に説明するステップにしたがって映像が最適化された後、新しいフレームの別の映像がカメラによって捕捉され、コンピュータメモリ中に転送されることができるように、スライド上の新しい位置にステージが移動する。スライド上の細胞サンプルは顕微鏡によって観察される面積よりもはるかに大きい面積を有しているため、そのサンプルがＭＡＣに関して陽性であるか、陰性であるかを判断するために多数のスライド映像が使用される。スライド上における捕捉された各映像の位置は、所望された場合に、映像中の重要な対象物をスライド上で発見できるようにコンピュータシステムに記録される。スライドからの映像がＣＣＤカメラによって捕捉され、映像処理ボードに記憶されると、コンピュータシステムは、ＣＣＤカメラによって生成された映像に対象物がないかどうかを判断する。これは、暗画素についてデジタル映像を走査することによって行われる。暗画素すなわち背景強度マイナス予め定められたオフセット値の強度を有する画素の個数が予め定められた最小値より少ない場合、コンピュータシステムは、その映像が空白であると仮定し、ステップ60で顕微鏡ステージが新しい位置に移動され、ステップ54で新しい映像が捕捉される。映像が空白でない場合、コンピュータシステムは、映像の焦点を全体的に結ぼうとする。一般に、映像の焦点が結ばれた場合、映像中の重要な対象物は最大の暗さを有する。したがって、焦点を結ぶために、ステージの高さが調節され、新しい映像が捕捉される。対象物の画素の暗さが決定され、映像中の画素の平均的な暗さが最大になるまでプロセスが繰り返される。最大になった時点で、コンピュータシステムは、グローバルな焦点が達成されたと仮定する。ステップ62において大まかなグローバルな焦点を結ばせた後、コンピュータシステムは、全ての画素のヒストグラムを計算する。図３に示されているように、ヒストグラムは、各強度レベルにおける画素の個数のグラフである。Microimage r（商標名）ベースの顕微鏡システムにおいて、各画素は０（最大の暗さ）乃至２５５（最大の明るさ）の範囲の強度を有することができる。このヒストグラムは一般に、背景画素の平均強度を表す第１のピーク90を含んでいる。それより小さい第２のピーク92は、対象物を含む画素の平均強度を表す。ピーク90と92との間に位置するしきい値94を計算することによって、映像中の重要な対象物を背景からありのままに分離することが可能である。図２Ｂに戻ると、コンピュータシステムは、ステップ68で映像中の対象物を背景から分離するしきい値を計算する。ステップ72において、しきい値より小さい強度を有する細胞映像中の全ての画素が識別される。図５には、ステップ72の結果が示されている。フレーム映像200は、多数の重要な対象物202，204，206，… ，226が含まれている。これらの対象物のいくつかは細胞核であり、それらはＭＡＣの存在について解析されることとなり、一方別の対象物は残骸、塵埃粒子、白血球のような人工物であり、細胞映像から除去されなければならない。再び図２Ｂを参照すると、映像中の対象物が識別されると、コンピュータシステムは、以下さらに詳細に説明する原則にしたがって各対象物の面積、形状（球形度）および光密度を計算する。ステップ76において、コンピュータシステムは、細胞核である可能性がない対象物をメモリから除去する。本発明のこの実施形態において、細胞核ではないと思われる対象物は、２，０００μｍ₂より大きい面積、１ｃより低い（すなわち、正常な個体の染色体の総数の１／２より低い）光密度、あるいは４より大きい球形度を有するものとして識別される。図６にはステップ76の結果が示されている。図６には、前に識別された重要な対象物がいくつか残っている。残っている各対象物は、悪性腫瘍に関連した変化を検査されるべき細胞核の可能性がさらに高くなる。図２Ｂに再び戻ると、細胞核である可能性がない各対象物を除去した後、コンピュータシステムはステップ78で暗画素について走査することによって対象物が残っているかどうかを判断する。対象物が残っていなければ、コンピュータシステムはステップ54に戻り、スライド上の新しい映像が捕捉され、ステップ54乃至 76が繰り返される。ステップ76における人工物を除去しようとする第１の試みの後、対象物が映像中に残っている場合、コンピュータシステムは、ステップ80において映像の照明強度の変化を補償する。これを行うために、コンピュータシステムは、検討されている細胞の映像に対して使用されたのと同じ露出時間空白スライド中を走査することによって得られた較正映像を呼び出す。その後、コンピュータシステムは、空白スライドから得られた較正映像の中の画素の強度値を細胞サンプルから得られた映像の中で見出だされた対応した画素の強度値から画素単位で減算し始める。その後、コンピュータシステムは、空白スライドから得られた較正映像中の画素の平均照明に等しい値を細胞映像の各画素に加算する。この加算の結果、細胞映像が均一の強度で照明される。照明強度の変化が補正されると、コンピュータシステムは、ステップ82で映像中の重要な各対象物の焦点を改良(refine)しようとする（図２Ｃ）。最適焦点は、その対象物が最小の寸法と最大の暗さとを有している場合に得られる。したがって、コンピュータシステムは、予め定められた量だけグローバルな焦点位置より上方にステージを移動させ、その後下方の順次連続する位置に移動させる。各位置において、ＣＣＤカメラは、フレームの映像を捕捉して、残りの対象物を含む画素および面積および強度を計算する。最終的に、対象物を含む画素が最大の暗さを有し、最小の面積を占めている位置から得られた各対象物の１つの映像だけがコンピュータメモリに記憶される。予め定められた数のステージ位置の後で最適焦点が得られない場合、対象物はコンピュータメモリから除去され、無視される。対象物の最適焦点が定められると、ＣＣＤカメラから受取られた映像が、コンピュータメモリにおいて検討中の対象物を含む画素を重書きする。局部的焦点の結果は、コンピュータのメモリにおいて疑似焦点映像を生成し、それによって最終的には重要な各対象物がその可能な限り最良の焦点で記録される。ステップ84において、コンピュータシステムは、細胞映像中の焦点を結ばれた対象物が見出だされたかどうかを判断する。見出だされない場合、コンピュータシステムは、図２Ａに示されているステップ54に戻り、それによってスライドが別の位置に移動され、新しい映像が捕捉される。対象物の映像の焦点が結ばれると、コンピュータシステムはステップ85において対象物の近くの光の局部吸光度を補償する。これを行うために、コンピュータシステムは、全ての辺が２つの画素だけ対象物より大きい領域を有するボックス内の多数の画素を解析する。このようなボックスの一例は、図６に示されているボックス207である。その後、コンピュータシステムは、空白スライドから得られた較正映像中の対応した正方形から強度値を画素単位で減算する。次に、較正映像の平均照明強度が、その対象物を取り囲んでいるボックス中の各画素に付加される。その後、ボックス中にあるが、その対象物の一部ではない画素の平均強度値が決定され、その後、この局部平均値が対象物を包囲しているボックス中の各画素から減算される。対象物の周囲の吸光度が補償されると、コンピュータシステムは、ステップ86 において細胞映像中に残っている各対象物のさらに正確なエッジを決定する。以下、エッジを計算するために必要なステップを説明する。局部吸光度が補償され、対象物の正確なエッジの位置が決定されると、コンピュータシステムはステップ87において残りの各対象物に対して１組の特徴を計算する。これらの特徴値は、細胞核から別の人工物を分離し、ＭＡＣを示す核を識別するために使用される。ステップ88において、コンピュータシステムは、各対象物に対して計算された特徴値を比較して、その対象物が人工物か否か判断し、否である場合、その対象物はＭＡＣを示す核であるか否かを判断して決定する分類機を動作させる。ステップ90において、疑似焦点(pseudo-focus)デジタル映像、特徴計算、および各焦点を結んだ対象物に対する分類機の結果がコンピュータのメモリに記憶される。最後に、ステップ92において、コンピュータシステムは、スライドをさらに走査する必要があるかどうかを判断して決定する。上記に示したように、各細胞映像の寸法はスライド全体の寸法よりはるかに小さいため、そのスライドが適切に解析されたことを確実にするために多数の細胞映像が捕捉される。十分な数の細胞映像が解析されると、ステップ94で処理が停止される。一方、さらに走査が要求される場合にはコンピュータシステムはステップ54にループで戻り、細胞サンプルの新しい映像が捕捉される。上記に示されているように、デジタル顕微鏡でサンプルを映像化することが可能になる前に、核材料を識別するためにサンプルが着色される。図４は、細胞サンプルを着色するために使用されるステップのフローチャートである。はじめにステップ100において、スライド上に細胞サンプルが置かれ、空気乾燥され、その後５０％のグリセロール溶液中に４分間浸される。その後、ステップ102において、蒸留水中で２分間細胞を洗滌する。ステップ104において、サンプルが５０％のエタノール溶液中に２分間浸漬され、ステップ106で再び蒸留水中で２分間洗滌される。その後、ステップ108において、サンプルはボーム・スプリンガー(Bohm-Springer)溶液に３０分間浸され、続いてステップ110で蒸留水で１分間洗滌される。ステップ112において、サンプルは５Ｎ（規定の）ＨＣｌ溶液に４５分間浸され、ステップ114で蒸留水によりこれを１分間すすぐ。その後、ステップ116においてサンプルがチオニン染料中で６０分間着色され、ステップ118で蒸留水でこれを１分間すすぐ。ステップ120において、サンプルは、亜硫酸塩の溶液に６分間浸され、続いてステップ122で蒸留水によりこれを１分間すすぐ。次に、サンプルはステップ12 ４で５０％，７５％および１００％のエタノールの溶液中でほぼ１０秒間づつ脱水される。その後ステップ126において、サンプルは、キシレンの最後の溶液に１分間浸され、その後ステップ128でカバースリップが載せられる。細胞サンプルが処理された後、上述のようにそれはいつでもデジタル顕微鏡によって映像化され、解析されることができる状態となる。図７Ａ乃至７Ｆは、本発明が対象物の正確なエッジを計算する方法を示す。図７Ａに示されているように、対象物230は、ヒストグラムから計算され、かつ上記に説明された背景／対象物しきい値より小さい強度値を有する画素から成る。正確なエッジを計算するために、対象物のもとのエッジに位置する画素は、新しいエッジ領域242を形成するように拡張される。もとのエッジの内側にある画素の第２の帯域(band)もまた、第２のエッジ領域244を形成するように選択される。その後、コンピュータシステムは、エッジ領域242と244とによって限定された環状リング内のどこかに本当のエッジがあると仮定する。本発明の好ましい実施形態において、環状リングはほぼ１０画素の幅を有する。エッジを決定するために、コンピュータは、環状リングに含まれている各画素のグラジエントを計算する。各画素のグラジエントは、各画素とその周囲の８個の隣接する画素との間の強度差の和として定義される。類似した強度レベルを持つ隣接画素を有する画素は、低いグラジエントを有することになり、一方対象物のエッジに位置する画素は高いグラジエントを有することになる。環状リング中の各画素のグラジエントが計算されると、コンピュータシステムは、グラジエントの範囲を多数のしきい値に分割し、低いグラジエント値を有する画素をそのリングから除去し始める。画素を除去するために、コンピュータは検討されている対象物をラスター方式で走査する。図７Ｃに示したように、ラスター走査はポイントＡから始まり、ポイントＢに到達するまで右方向に連続する。第１の走査中、外側エッジすなわちエッジ領域242上の画素だけが除去される。その後、コンピュータシステムは、たとえばポイントＤからスタートして、環状リングの内側エッジ領域244上の画素だけを除去しながらラスター方式で戻りつつポイントＢまで上方に向かって連続することによって逆方向に走査する。その後、コンピュータシステムは別の直交方向に走査する。たとえば、ポイントＣからスタートし、ラスター方式でポイントＤの方向に連続し、この時、外側エッジ領域242上の画素だけを除去する。このプロセスは、そのグラジエントしきい値における除去可能な画素がなくなるまで続けられる。環状リングの周囲の画素のチェーンを壊す画素は除去されることができないという条件の下で、画素が環状リングから除去される。さらに、画素除去の同じ段階(pass)中に隣接した画素を除去することはできない。第１のグラジエントしきい値以下のグラジエントを有する全ての画素が除去されると、しきい値は増加し、このプロセスが再びスタートする。図７Ｄに示されているように、画素単位の除去プロセスは、単一の画素チェーン240'が検討されている対象物を取り囲むまで連続する。対象物の正確なエッジを配置した後、新しく見出されたエッジを含む画素がその対象物に含まれるかどうかを決める必要がある。これを行うために、新しく見出されたエッジを含む各画素の強度がその隣接する８個の画素と比較される。たとえば、図７Ｅに示されているように、画素246の強度はそれを取り囲む８個の画素と比較される。画素246の強度が画素250の強度より小さい場合、画素246は背景に属しているので、画素チェーンから除去される。チェーンを完成させるために、図７Ｆに示されているように、エッジが破壊されないように画素248および252が付加される。エッジ再配置アルゴリズムを完成し、各画素が重要な対象物に含まれているかどうかを決定した後、システムはその対象物の特徴値を計算する準備が完了している。各焦点を結んだ対象物について特徴が計算されると、コンピュータシステムは、その対象物が悪性腫瘍に関連した変化に関して解析すべき細胞核なのか、あるいは無視すべき人工物であるのかを判断しなければならない。上述のように、このシステムでは、明白な人工物はそれらの面積、形状（球形度）および光密度に基づいて除外される。しかしながら、その他の人工物は、コンピュータにとって認識が困難なこともある。人工物をさらに除去するために、コンピュータシステムは、対象物について計算された特徴の値を解釈する分類機を使用する。図８に示されているように、分類機290は、対象物をその特徴値に基づいて解析するコンピュータプログラムである。分類機を構成するために、２つのデータベースが使用される。第１のデータベース275は、図１に示されているシステムによって映像化されており、熟練した病理学者により以前に核ではない、すなわち人工物であると識別された対象物の特徴値を含んでいる。第２のデータベース 285は、システムによって映像化されており、熟練した病理学者により以前に細胞核であると識別された対象物について計算された特徴を含んでいる。これらの各データベースの中のデータは、細胞核と人工物とを区別できる弁別関数を導き出すために漸次的な線形弁別関数解析を使用する統計学的コンピュータプログラム中に供給される。その後、分類機は、しきい値および線形弁別関数の少なくとも一方に基づいて２進決定ツリーとして構成される。この２進ツリーは、対象物のアイデンティティを決める特徴値に基づいて一連の質問に答える。２進ツリーにおいて使用される特定のしきい値は、既知の対象物に関して計算された特徴値のヒストグラムを比較する統計学者によって設定される。たとえば、白血球は一般に５０μｍ²より小さい面積を有している。本発明は赤血球を人工物として扱っているため、２進決定ツリーは、対象物の面積を５０μｍ²のしきい値と比較するノードを含むことができる。しきい値より小さい面積を有する対象物は無視され、一方大きい面積を有するものは、それらがＭＡＣと思われる細胞であるか、または人工物であるかを判定するために解析される。本発明のこの好ましい実施形態において、対象物のタイプを分ける弁別関数は、ＢＭＤＰ統計ソフトウェア社(Los Angeles California)から入手可能なＢＭＤＰプログラムによって形成される。弁別関数および適当なしきい値が与えられたとすると、２進ツリー分類機の構成は当業者にとって非常に容易なことである。２進ツリー分類機が形成されると、それは知られていない対象物から採取された１組の特徴値292を与えられることができ、特徴データと関連した対象物が人工物または細胞核のいずれであるかを示す表示294を生成する。図９は、スライドが悪性腫瘍に関連した変化を示しているか否かを判断するために分類機がどのようにして使用されるかを示す。分類機300は、１対のデータベースを使用して構成される。第１のデータベース302は、図１に示されているデジタル顕微鏡システムによって映像化されており、健康な患者から採られたことが分かっている見掛け上正常な細胞から得られた特徴値を含んでいる。第２のデータベース304は、上述のデジタル顕微鏡システムによって映像化されており、異常（すなわち、癌）のある患者から採取されたことが分かっている見掛け上正常な細胞から計算された特徴値を含んでいる。本発明のこの好ましい実施形態において使用された分類機300は、ここでもまた細胞の２つのグループを分離することのできる弁別関数およびしきい値の少なくとも一方からなる２進決定ツリーである。分類機が構成されると、健康状態が分かっていない患者から採取された細胞を映像化することによって得られた特徴値306がこの分類機に与えられる。分類機は、核がＭＡＣを示しているか否かの判断308を下す。図１０は、患者が癌である可能性があるかどうかを判断するために本発明によって行われるステップのフローチャートである。ステップ325からはじめると、コンピュータシステムは、スライド上の各焦点を結んだ核について計算された特徴をリコールする。ステップ330において、コンピュータシステムは、これらの特徴に基づいてＭＡＣを識別する分類機を動作させる。ステップ332において、コンピュータシステムは、検討されている核がＭＡＣに関して陽性か否かを示す表示を生成する。ステップ332に対する答えがイエスの場合、ステップ334において、そのスライドのＭＡＣが陽性の核の個数を合計する累算器のカウントが増加される。ステップ336において、コンピュータシステムは、特徴が計算された全ての核が解析されたかどうかを判断して決定する。否である場合、ステップ338 で次の組の特徴がリコールされ、プロセスが繰り返される。ステップ340において、コンピュータシステムは、スライド上のＭＡＣの陽性の細胞の周波数が予め定められたしきい値を越えるかどうかを判断する。たとえば、子宮頸癌を検出するための細胞の特定の処理（カナダのブリティッシュ・コロンビアでのやり方のように空気乾燥される）では、ＭＡＣが陽性の上皮細胞の合計個数を、解析した上皮細胞の合計個数で除算し、それがスライド当たり０．４５を越えると、その患者が癌であるか、もしくは癌になる可能性が８５％であると判断する。ＭＡＣを示した細胞の周波数がしきい値を越えた場合、コンピュータシステムは、ステップ342でその患者が健康であることを示し、またしきい値を越えなければ、ステップ344でその患者がおそらく癌であること、または癌になることを示す。ＭＡＣを示す患者が癌である、あるいは癌に進行すると思われるしきい値は、癌であった者と癌でなかった者との非常に多数の患者のＭＡＣスコアを比較することによって決定される。当業者に明らかなように、使用される特定のしきい値は、検出されるべき癌のタイプや、細胞を映像化するために使用される装置等に依存する。本発明のＭＡＣ検出システムはまた、癌治療法の効きめを決定するために使用される。たとえば、肺癌の治療として肺の一部を切除された患者に対して、残っている肺組織から採取された見掛け上正常な細胞のサンプルを提供するように求めることができる。強いＭＡＣの存在が検出された場合、癌が再発する確率が高い。逆に、癌治療が有効な場合には、ＭＡＣ細胞の個数が減少することが認められている。上述のように、悪性腫瘍に関連した変化を検出する本発明の能力は、計算された特徴の値に依存している。以下は、各焦点を結んだ対象物についてここで計算された特徴のリストである。 I．２座標系、専門用語および表記法各映像は、背景によって取り囲まれた対象物（不規則的な形状の）の映像を含んでいる正方形画素の長方形アレイである。各画素Ｐ_ijは、その映像の対応した小さいセグメントの光度測定値（中間調値）を表す整数であり、０（完全に不透明）乃至２５５（完全に透明）の範囲であってもよい。映像の方形は、上下の少なくとも２行と左右の２列が対象物を完全に含むことのできる最小の方形より大きく、背景が対象物の周囲に存在することを確実にしている。この方形映像は、スパン(spanning)ｉ＝１のＬ個の列とｊ＝１のＭ個の行の画素Ｐ_ijのマトリクスであり、座標系の原点ｉ＝ｊ＝１として左最上部の画素を有している。対象物である映像の領域は、その特性関数Ωによって示される。これは、時に “対象物マスク”あるいは単に“マスク”とも呼ばれる。いくつかの特徴について、対象物の全周囲で１つの画素分対象物マスクを拡張することが理解できる。このマスクをΩ⁺で表す。同様に、破壊されたマスクはΩ^-で表される。対象物マスクは２進関数である： Ω＝（Ω_1,1，Ω_1,2，…Ω_i,j…Ω_L,M）（１）ここで、 Ω_i,j＝（ｉ，ｊ）∈対象物ならば、１（ｉ，ｊ）∈対象物ならば、０ここで、“（ｉ，ｊ）∈対象物”は、座標：（ｉ，ｊ）の画索が対象物の一部であることを意味し、“（ｉ，ｊ）∈対象物”は、座標：（ｉ，ｊ）の画素が対象物の一部でないことを意味している。 II 形態特徴形態特徴は、対象物の映像の面積、形状および境界線バリエーションを評価する。 II．１面積面積Ａは、マスクΩによって定義された対象物に属する画素の総数として定義される。ここでｉ，ｊおよびΩは、上記の段落Ｉ．２において定義されている。 II．２ｘ＿ｃｅｎｔｒｏｉｄ，ｙ＿ｃｅｎｔｒｏｉｄｘ＿ｃｅｎｔｒｏｉｄおよびｙ＿ｃｅｎｔｒｏｉｄは、映像の原点（左上の隅）に関して定義された対象物の幾何学的中心の座標である。ここで、ｉおよびｊは映像の画素座標であり、Ωは上記の段落Ｉ．２において定義された対象物マスクであり、Ａは対象物面積である。 II．３ｍｅａｎ＿ｒａｄｉｕｓ，ｍａｘ＿ｒａｄｉｕｓｍｅａｎ＿ｒａｄｉｕｓおよびｍａｘ＿ｒａｄｉｕｓ特徴は、対象物の重心からその８個の接続されたエッジ画素までの対象物の半径ベクトルの長さの平均および最大値である：ここで、ｒ_kはｋ番目の半径ベクトルであり、Ｎは対象物エッジ上の８個接続された画素の個数である。 II．４ｖａｒ＿ｒａｄｉｕｓｖａｒ＿ｒａｄｉｕｓ特徴は、段落II．３で定義された対象物の半径ベクトルの長さの分散である。り、Ｎは８個の接続されたエッジ画素の個数である。 II．５球形度球形度特徴は、対象物の重心（上記の段落II．２において定義された）を中心とする２つの円の半径の比として計算された形状の尺度である。一方の円は、対象物の周囲の内側に完全に内接する最大の円であり、対象物の半径ベクトルの絶対値最小長に対応している。他方の円は、対象物の周囲を完全に外接さぜる最小の円であり、対象物の半径ベクトルの絶対値最大長に対応する。球形度の最大値：１は、円形の対象物に対して次のように求められる：ここで、r_kはｋ番目の半径ベクトルである。 II．６離心率離心率特徴は、対象物の特性関数Ωの２次中心モーメントマトリクスの最大および最小固有値の比の平方根として計算された形状関数である。ここで、λ₁およびλ₂はそれぞれ最大および最小固有値であり、特性関数Ωは式（１）によって与えられるとおりである。２次中心モーメントマトリクスは次のように計算される：離心率は、対象物を記述する“最良の適合（ｂｅｓｔｆｉｔ）”楕円の短径に対する長径の比として定められ、円に対して最小値１を示す。 II．７ｉｎｅｒｔｉａ＿ｓｈａｐｅｉｎｅｒｔｉａ＿ｓｈａｐｅ特徴は、面積の２乗によって正規化された対象物マスクの慣性モーメントとして計算された対象物の“真円度”の尺度であり、円に対して最小値１を示す。ここで、Ｒ_i,jは画素Ｐ_i,jの、対象物重心（段落II．２で定義された）までの距離であり、Ａは対象物の面積であり、Ωは式１によって定義されたマスクである。 II．８密集度(compactness) 密集度特徴は、“真円度”のもう１つの尺度である。これは、対象物の面積で除算した周囲の２乗として計算され、円に対して最小値１を示す。密集度＝Ｐ²／４πＡ（１２）ここで、Ｐは対象物の周縁であり、Ａは対象物の面積である。この周縁は、境界線画素（それら自身８個接続されている）の４個接続された隣接画素を考慮することによって境界線画素から計算される。ここで、Ｎ₁は１個の非対象物隣接画素を有するエッジ上の画素の個数であり、Ｎ₂は、２個の非対象物隣接画素を有するエッジ上の画索の個数であり、Ｎ₃は、３個の非対象物隣接画素をもつエッジ上の画素の個数である。 II．９ｃｅｌｌ＿ｏｒｉｅｎｔｃｅｌｌ＿ｏｒｉｅｎｔ特徴は、対象物の主軸の、ｙ方向からの方向偏差として測定された対象物の方位を表す：ここで、ｙ_moment2およびｘｙ_crossmoment2は、上記の式１によって定義された特性関数Ωの２次中心モーメントであり、λ₁はその関数の２次中心モーメントマトリクスの最大固有値（上記の段落II．６参照）である。対象物の主軸は、最大固有値に対応した固有ベクトルによって定義される。幾何学的に解釈したｃｅｌｌｏｒｉｅｎｔは、ｙ軸と“最良適合”楕円の長径との間の角度（時計方拘に測定された）である。細胞懸濁液のスライドについて、推測的に好ましい細胞の方位は存在しないので、この特徴は無意味である。組織学的セクション、およびおそらく塗抹（標本）について、この特徴は有効かもしれない。塗抹（標本）では、たとえば残骸がスライドの長軸に沿って優先的に伸ばされる可能性がある。 II．１０伸び率段落II．１０乃至II．１３における特徴は、１２８の個別の等しいステップ（すなわち、ステップ当り２π／１２８の角度）によって半径ベクトルを掃引する（段落II．２で定義された対象物重心から対象物の周囲まで）ことによって計算され、このとき最上部左端の対象物エッジ画素からスタートして、時計方向に掃引する。この関数は、１２８個の各角度における対象物エッジ画素位置の平均から補間される。伸び率特徴は、主な方向（長径に対応した）対それに垂直な方向に沿った対象物の程度の別の尺度である。これらの長さは、対象物の半径関数のフーリエ変換係数を使用して評価される。ここで、ａ₂ｂ₂は、次式のｒ（θ）によって定義される対象物の半径関数のフーリエ変換係数である。 II．１１ｆｒｅｑ＿ｌｏｗ＿ｆｆｔｆｒｅｑ＿ｌｏｗ＿ｆｆｔは、対象物の半径関数のフーリエスペクトルの低い高調波（第３乃至第１１の高調波）のエネルギとして測定された粗境界線バリエーションの評価を示す。ここでａ_nｂ_nは、式１６によって定義された半径関数のフーリエ変換係数である。 II．１２ｆｒｅｑ＿ｈｉｇｈ＿ｆｆｔｆｒｅｑ＿ｈｉｇｈ＿ｆｆｔは、対象物の半径関数の高周波フーリエスペクトル（第１２乃至第３２の高調波）のエネルギとして測定された微境界線バリエーションの評価を示す。ここでａ_n，ｂ_nは、式１６によって定義されたｎ番目の高調波のフーリエ変換係数である。 II．１３ｈａｒｍｏｎ０１＿ｆｆｔ，…，ｈａｒｍｏｎ３２＿ｆｆｔｈａｒｍｏｎ０１＿ｆｆｔ，…，ｈａｒｍｏｎ３２＿ｆｆｔ特徴は、各高調波１乃至３２に対して対象物半径関数のフーリエ変換係数の大きさとして計算された境界線バリエーションの評価である。ここで、ａ_nｂ_nは、式１６によって定義されたｎ番目の高調波のフーリエ変換係数である。 III．光度測定特徴光度測定特徴は、対象物の絶対強度および光密度レベルの評価、ならびにそれらの分布特性を示す。 III．１ＤＮＡ＿ＡｍｏｕｎｔＤＮＡ＿Ａｍｏｕｎｔは、一度拡張されたマスクΩ⁺によって定義された対象物の積分された光密度の“生の”（正規化されていない）尺度である。ここで、一度拡張されたマスクΩ⁺は、段落Ｉ．２において定義されており、ＯＤは式２１にしたがって計算された光密度である。ここで、Ｉ_Bは局部背景の強度であり、Ｉ_i,jはｉ，ｊ番目の画素の強度である。 III．２ＤＮＡ＿ＩｎｄｅｘＤＮＡ＿Ｉｎｄｅｘは、対象物の積分された光密度の正規化された尺度である。ここで、ｉｏｄ_normは、スライドからの特定の対象物個体群（たとえば、白血球）に対するＤＮＡ量の平均値である。 III．３ｖａｒ＿ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ｍｅａｎ＿ｉｎｔｅｎｓｉｔｙｖａｒ＿ｉｎｔｅｎｓｉｔｙおよびｍｅａｎ＿ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ特徴は、マスクΩによって定義される対象物の強度関数Ｉの分散および平均である。ここで、Ａは対象物の面積であり、Ωは式１において定義された対象物マスクで均強度である。平均強度は、段落III．２において定義されたｉｏｄ_normに対して正規化される： III．４ＯＤ＿ｍａｘｉｍｕｍＯＤ＿ｍａｘｉｍｕｍは、上記の段落III．２において定義されたｉｏｄ_norm に対して正規化された対象物の光密度の最大値である： III．５ＯＤ＿ｖａｒｉａｎｃｅＯＤ＿ｖａｒｉａｎｃｅは、対象物の光密度関数の正規化された分散（２次モーメント）である。の光密度の平均値である：ここで、Ａは対象物の面積（画素の総数）である。測定値を細胞の染色強度から独立させるために平均光密度の２乗で分散を除算する。 III．６ＯＤ＿ｓｋｅｗｎｅｓｓＯＤ＿ｓｋｅｗｎｅｓｓ特徴は、対象物の光密度関数の正規化された３次モーメントである。の光密度の平均値であり、Ａは対象物の面積（画素の総数）である。 III．７ＯＤ＿ｋｕｒｔｏｓｉｓＯＤ＿ｋｕｒｔｏｓｉｓは、対象物の光密度関数の正規化された４次モーメントである。の光密度の平均値であり、Ａは対象物の面積である。ＩＶ別個のテクスチャ特徴別個のテクスチャ特徴は、対象物を光密度の低、中および高領域に分割することに基づいている。この対象物の低、中および高密度領域への分割は、高い光密度しきい値と、中間の光密度しきい値という２つのしきい値に基づいている。これらのしきい値は、上記の段落III．２に示されているように対象物の特定のサブセット（たとえば、リンパ細胞）のＤＮＡ量に基づいたサンプルのｉｏｄ_norm 値に対して基準化されている。デフォルト値に関して、これらのしきい値は、白血球中の濃縮されたクロマチンが高い光密度材料となるように選択されている。第２のしきい値は、高しきい値と０との中間の位置に設定される。これらのしきい値が計算されるデフォルト値の設定は、以下のようにコンピュータに記憶される：ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ＿ＨＩＧＨ＿ＴＨＲＥＳ＝３６ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ＿ＭＥＤＩＵＭ＿ＴＨＲＥＳ＝１８Ａ^highは、０と１８の間の光密度を有する画素の面積である。Ａ^med.は１８と３６の間の光密度を有する画素の面積であり、Ａ^lowは３６より大きい光密度を有する画素の面積である。面積Ａ^high，Ａ^med.およびＡ^lowの合計が対象物の総面積である。使用される実際のしきい値は、これらのパラメータを１００で除算し、かつ係数ｉｏｄ_norm／１００で乗算したものである。以下の説明において、Ω^low、Ω^medおよびΩ^highはそれぞれ、式１と同様に定義された対象物の低、中程度および高光密度領域に対するマスクである。ＩＶ．１低ＤＮＡ領域，中ＤＮＡ領域、高ＤＮＡ領域これらの別個のテクスチャ特徴は、対象物の総面積に対する対象物の低、中間および高光密度領域の比を表す：ここで、Ωは式１において定義された対象物マスクであり、Ａは対象物の面積である。ＩＶ．２低ＤＮＡａｍｎｔ、中ＤＮＡａｍｎｔ、高ＤＮＡａｍｎｔこれらの別個のテクスチャ特徴は、対象物の低、中間および高光密度領域に対する総吸光率を表わし、それらは低、中間および高密度領域の積分された光密度を、積分された全光密度でそれぞれ除算した値として計算される：ここで、Ωは式１において定義された対象物マスクであり、ＯＤは式２１で定義された光密度である。ＩＶ．３低ＤＮＡｃｏｍｐ、中ＤＮＡｃｏｍｐ、高ＤＮＡｃｏｍｐ、中高ＤＮＡｃｏｍｐこれらの別個のテクスチャ特徴は、単一の（おそらく分離された）対象物としてそれぞれ処理された低、中間、高、および中高組合せ密度領域の密集度(compa ctness)の特性である。それらは、各領域の周囲の２乗を、その領域の４π（面積）で除算したものとして計算される。ここで、Ｐは式１３と同様に定義された各光密度領域の周縁であり、Ａは式２と同様に定義された領域の面積である。ＩＶ．４ｌｏｗ＿ａｖ＿ｄｓｔ、ｍｅｄ＿ａｖ＿ｄｓｔ、ｈｉ＿ａｖ＿ｄｓｔ、ｍｈ＿ａｖ＿ｄｓｔこれらの別個のテクスチャ特徴は、対象物ｍｅａｎ＿ｒａｄｉｕｓで正規化された対象物の中心と、低、中間、高、および中高組合せの各密度画素との間の平均分離を表している。ここでＲ_i,jは、段落II．７において画素Ｐ_i,jから対象物重心（段落II．２で定義された）までの距離として定義されており、対象物ｍｅａｎ＿ｒａｄｉｕｓは、式５によって定義されている。ＩＶ．５低ＶＳｍｅｄ＿ＤＮＡ、低ＶＳｈｉｇｈ＿ＤＮＡ、低ＶＳｍｈ＿ＤＮＡこれらの別個のテクスチャ特徴は、中間、高および中高組合せの各平均吸光値によって正規化された低密度領域の平均吸光率を表している。それらは、中間、高および中高組合せの密度クラスタの平均光密度を、低密度クラスタの平均光密度で除算したものとして計算される。ここで、ＯＤは式２１と同様に定義された領域光密度であり、Ωは式１と同様に定義された領域のマスクであり、Ａは式２と同様に定義された領域の面積である。ＩＶ．６ｌｏｗ＿ｄｅｎ＿ｏｂｊ、ｍｅｄ＿ｄｅｎ＿ｏｂｊ、ｈｉｇｈ＿ｄｅｎ＿ｏｂｊこれらの別個のテクスチャ特徴は、低、中間および高密度の１以上の画素からなる対象物の別個の８個接続されたサブコンポーネントの数である。ＩＶ．７ｌｏｗ＿ｃｎｔｒ＿ｍａｓｓ、ｍｅｄ＿ｃｎｔｒ＿ｍａｓｓ、ｈｉｇｈ＿ｃｎｔｒ＿ｍａｓｓこれらの別個のテクスチャ特徴は、低、中間および高光密度クラスタ（それらは単一の対象物であるかのように処理される）の幾何学的中心と、そのｍｅａｎ＿ｒａｄｉｕｓによって正規化された対象物全体の幾何学的中心との間の分離を表す。ここで、対象物のｍｅａｎ＿ｒａｄｉｕｓは式５によって定義され、対象物の重心は段落II．２で定義され、Ωは式１と同様に定義される領域マスクであり、Ａは式２と同様に定義される領域面積である。Ｖマルコフテクスチャ特徴マルコフテクスチャ特徴は、対象物画素の連続発生マトリクスΔ_λ,μから定義される。このマトリクスの各要素は、中間調レベルλの画素が中間調レベルμ の画素に次いで（８個接続したものを介して）発生する条件つき確率を表し、ここで、λ、μはそれぞれマトリクスの行および列インデクスである。しかしながら、マルコフテクスチャ特徴を計算するためにここで使用される計算アルゴリズ差を有する隣接画素の確率であり、ここでは８個接続された隣接（画素）が仮定されている。和および差ヒストグラムにおいて使用される中間調レベルの値１，ｍは、それぞれ個別の対象物のダイナミック・レンジを４０レベルに量子化することによって得られる。完全なものにするために、マルコフテクスチャ特徴の式は、一般式と実際に使用される計算式の両方を含んでいる。Ｖ．１エントロピーエントロピー特徴は、対象物中間調レベル構成における“無秩序”の尺度を表し、大きい値は“霜降り状の”ランダムフィールドのようなまとまりのない分布に対応する：Ｖ．２エネルギエネルギ特徴は、空間的に構成(organize)され、中間調スケール分布を有する対象物について大きい値を示す。それはエントロピーとは逆に、一定の中間調レベルの大きい領域を有する対象物に大きい値を示す：Ｖ．３コントラストコントラスト特徴は、頻繁な大きい中間調スケールバリエーションを有する対象物について大きい値を示す。Ｖ．４相関相関についての大きい値は、一定の中間調レベルの大きい接続されたサブコンポーネントを有し、かつ隣接するコンポーネント間の中間調レベル差が大きい対象物を示す。象物の平均強度である。Ｖ．５均質性均質性特徴は、中間調レベルのバリエーションがわずかで空間的に滑らかな対象物に対して大きい：Ｖ．６ｃｌ＿ｓｈａｄｅｃｌ＿ｓｈａｄｅ特徴は、対象物の残りのものに対して大きいコントラストを有する均一の強度の数個の異なる凝集塊を有する対象物に対して大きい絶対値を示す。負の値は、明るい背景に対する暗い凝集塊に対応し、一方正の値は暗い背景に対する明るい凝集塊を示す：Ｖ．７ｃｌ＿ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅｃｌ＿ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ特徴は、クラスタの暗さの尺度となる。ＶＩ．非マルコフテクスチャ特徴これらの特徴は、対象物の中間調レベル差の全体的な評価に基づいてテクスチャを記述している。ＶＩ．１ｄｅｎ＿ｌｉｔ＿ｓｐｏｔ，ｄｅｎ＿ｄｒｋ＿ｓｐｏｔこれらは、３×３ウインドウにより平均化された映像に基づく対象物強度関数の局部極大および局部極小を、それぞれ対象物面積で除算した個数である。およびここで、値ｍａｘ_i',j'に関して、それ以外ならば、０および、値ｍｉｎ_i ^, _,j ^,に関して、それ以外ならば、０ここで、Ｉは対象物強度であり、Ωは対象物マスクであり、Ａは対象物の面積である。ＶＩ．２ｒａｎｇｅ＿ｅｘｔｒｅｍｅこれは、対象物強度関数の最大の局部極大と最小の局部極小との間の強度差を、段落III．２において定義されたスライドＤＮＡ量ｉｏｄ_normに対して正規化したものである。局部極大ｍａｘ_i',j'および局部極小ｍｉｎ_i',j'は、上記の段落ＶＩ．１で定義したものである。ＶＩ．３ｒａｎｇｅ＿ａｖｅｒａｇｅこれは、局部極大の平均強度と局部極小の平均強度との間の強度差を、段落II Ｉ．２において定義されたスライドＤＮＡ量の値ｉｏｄ_normに対して正規化したものである。使用される局部極大ｍａｘ_i',j'および局部極小ｍｉｎ_i',j'は、上記の段落ＶＩ．１からのものである。ＶＩ．４ｃｅｎｔｅｒ＿ｏｆ＿ｇｒａｖｉｔｙｃｅｎｔｅｒ＿ｏｆ＿ｇｒａｖｉｔｙ特徴は、対象物の幾何学中心から光密度関数の“質量中心”までの距離を、対象物のｍｅａｎ＿ｒａｄｉｕｓによって正規化したものを表す：これは、ＯＤ分布の不均一性の尺度を示す。 VII フラクタルテクスチャ特徴フラクタルテクスチャ特徴は、垂直軸が光密度を表し、水平軸がｘおよびｙ空間座標を表す３次元棒グラフとして本質的に表される対象物の光密度の３次元平面の面積に基づく。したがって、各画素は、ｘ−ｙ平面における単位面積、プラス画素の光密度の、その隣接するものに関する変化に比例する３次元構造の側部の面積を割当てられる。フラクタル面積の最大値は、それらの間に高い光密度バリエーションを有する小さいサブコンポーネントを含む大きい対象物に対応する。ｆｒａｃｔａｌ１＿ａｒｅａとｆｒａｃｔａｌ２＿ａｒｅａとの相違は、これらの特徴が異なるスケールで計算されることである。第２のものは、４個の画素が単一の画素に平均化される映像に基づいており、したがってｆｒａｃｔａｌ１＿ａｒｅａのスケールの変化を表す。この計算には、付加的なマスク変換が必要であり、Ω_i2,j2は、４個の画素が１個の画素にマップ(map)されたもとのマスク Ωを表し、対象物画素から完全には構成されていない４個の画素の２乗はいずれもゼロに設定される。Ω_i2,j2中の各画索がΩ_i,j中の４個の画素となるように、 Ω_i,jは４だけ拡張されたΩ_i2,j2を表す。 VII．１ｆｒａｃｔａｌ１＿ａｒｅａ像に共通の係数によって基準化された映像の光密度関数である。 VII．２ｆｒａｃｔａｌ２＿ａｒｅａこれは、もう１つのフラクタルディメンションであるが、４個の画素の２乗が単一画素に平均化された映像に基づくものであり、したがって上記の段落VII.１におけるｆｒａｃｔａｌ１＿ａｒｅａのスケールの変化を表す。ここで、Ｌ₂およびＭ₂を整数とすると、Ｌ₂＝［Ｌ／２］，Ｍ₂＝［Ｍ／２］平均化されている。 VII．３ｆｒａｃｔａｌ＿ｄｉｍｅｎｆｒａｃｔａｌ＿ｄｉｍｅｎ特徴は、ｆｒａｃｔａｌ１＿ａｒｅａとｆｒａｃｔａｌ２＿ａｒｅａ間の差を、ｌｏｇ２で除算したものとして計算される。これは２から３まで変化し、測定された表面面積が非常に微細なスケールで増加する割合と関連している映像の“フラクタル特性(behavior)”の尺度を示す。 VIII ラン長テクスチャ特徴ラン長(length)特徴は、中間調レベルランに基づいてテクスチャを記述し、同じ中間調レベル値を有する同一直線上の連続する画素のセットを表している。ランの長さは、ランの中の画素の個数である。これらの特徴は、８レベルに変換される強度関数値を有する映像に対して計算される。ラン長テクスチャ特徴は４つの主方向：θ＝０°、４５°、９０°、１３５° 方向は正のｘ軸に関して時計方向に限定される。なお、ここで限定されたように、ラン長テクスチャ特徴は回転に関して不変ではなく、したがって、一般にこれらを別個に使用することはできない。それは、ほとんどのサンプルについて、テクスチャにとって推測的に好ましい方向が存在しないためである。たとえば、ある細胞について、ラン長特徴は４５°に向けられているが、次のものでは９０° でが、中間調レベル範囲ｐ（８中間調レベル外）に位置する画素からなる長さｑのランを所定の方向Θに含む回数を明示する。Ｎ^g＝８を中間調レベルの数とし、Ｎ^rを対象物において生じる異なるラン長の数とすると、ラン長特徴は以下のように記述される。 VIII．１ｓｈｏｒｔ０＿ｒｕｎｓ，ｓｈｏｒｔ４５＿ｒｕｎｓ，ｓｈｏｒｔ９０＿ｒｕｎｓ，ｓｈｏｒｔ１３５＿ｒｕｎｓこれらは、０°、４５°、９０°または１３５°を向いた短いラン（ｓｈｏｒｔｒｕｎ）が優勢である対象物について大きい値を示す。 VIII．２ lｏｎｇ０＿ｒｕｎｓ，ｌｏｎｇ４５＿ｒｕｎｓ，ｌｏｎｇ９０＿ｒｕｎｓ，ｌｏｎｇ１３５＿ｒｕｎｓこれらは、０°、４５°、９０°または１３５°を向いた長いラン（ｌｏｎｇｒｕｎ）が優勢である対象物について大きい値を示す。 VIII．３ｇｒｅｙ０＿ｌｅｖｅｌ，ｇｒｅｙ４５＿ｌｅｖｅｌ，ｇｒｅｙ９０＿ｌｅｖｅｌ，ｇｒｅｙ１３５＿ｌｅｖｅｌこれらの特徴は、中間調レベルの不均一性を評価し、ランが中間調レベルにわたって等しく分布している場合、それらの最低値を示す。 VIII．４ｒｕｎ０＿ｌｅｎｇｔｈ，ｒｕｎ４５＿ｌｅｎｇｔｈ，ｒｕｎ９０＿ｌｅｎｇｔｈ，ｒｕｎ１３５＿ｌｅｎｇｔｈこれらの特徴は、ラン長の不均一性を評価し、ランが長さにわたって等しく分布している場合、それらの最低値を示す。 VIII．５ｒｕｎ０＿ｐｅｒｃｅｎｔ，ｒｕｎ４５＿ｐｅｒｃｅｎｔ，ｒｕｎ９０＿ｐｅｒｃｅｎｔ，ｒｕｎ１３５＿ｐｅｒｃｅｎｔこれらの特徴は、対象物の面積に対する可能性のあるランの総数の比として計算され、最も線形の構造を有する画像に対して最低値を有する。ここで、Ａは対象物の面積である。 VIII．６ｔｅｘｔｕｒｅ＿ｏｒｉｅｎｔこの特徴は、対象物の直線テクスチャの最有力な方位を評価する。９と同様に計算された）である。ラン長の擬似２次モーメントは、以下のように計算される：方位は、段落II．９のｃｅｌｌ＿ｏｒｉｅｎｔのように、映像の線形構造の最有力な方位とｙ軸との間の角度（時計方向に測定された）として定められる。 VIII．７ｓｉｚｅ＿ｔｘｔ＿ｏｒｉｅｎｔこの特徴は、長いランに対してテクスチャ方位を増幅する。ここで、は、段落VIII．６で定義されたｒｕｎ＿ｌｅｎｇｔｈ擬似２次モーメントマトリクスの最大および最小固有値である。上記の各特徴は、映像中に配置された各焦点が結ばれた対象物に対して計算される。ある特徴は、細胞核から人工物を分離して、ＭＡＣを示す細胞と正常な細胞とを区別するために分類機によって使用される。上記に示されているように、分類機が完ぺきに訓練され、２進決定ツリーまたは線形弁別関数を生成するまで、人工物と細胞とを区別し、あるいはＭＡＣ細胞と非ＭＡＣ細胞とを区別するためにどの特徴が使用されるのかを予測することは不可能である。本発明のこの実施形態において、上述された特徴の３０個のものは、本物の核から人工物を分離し、かつＭＡＣを有する細胞を識別する点においてより重要であると思われる。これらの主要なテクスチャ特徴は以下のとおりである。３０個の好ましい核の特徴（１）面積（２）平均半径（３）ＯＤ分散（４）ＯＤ非対称性(skewness) （５）範囲平均（６）ＯＤ最大値（７）光スポットの密度（８）低ＤＮＡ面積（９）高ＤＮＡ面積（１０）低ＤＮＡ量（１１）高ＤＮＡ量（１２）高平均距離（１３）中／高平均距離（１４）相関（１５）均質性（１６）エントロピー（１７）フラクタルディメンション（１８）ＤＮＡインデクス（１９）ラン０パーセント（２０）ラン４５パーセント（２１）ラン９０パーセント（２２）ラン１３５パーセント（２３）中間調レベル０（２４）中間調レベル４５（２５）中間調レベル９０（２６）中間調レベル１３５（２７）ラン長０（２８）ラン長４５（２９）ラン長９０（３０）ラン長１３５これらの特徴は、細胞のタイプを区別する最適の能力を有していることが認められているが、その他の対象物タイプは上述されたその他の特徴によって識別されてもよい。上述したように、本発明によるシステムが細胞核と人工物とを区別し、あるいは細胞とＭＡＣを示すものとを区別する能力は、計算された特徴の値に基づいて弁別を行う分類機の能力に依存しない。たとえば、本発明は、人工物から細胞核を分離するために、特定のタイプの対象物を識別するようにそれぞれ操作されるいくつかの異なる弁別関数を適用してもよい。たとえば、以下の弁別関数は、本発明の現在好ましい実施形態において小さいピクノーティックな(picnotic)対象物から中くらいの頸管細胞を分離するために使用される。屑片から細胞を分離できる別の弁別関数は：さらに、解析に適した細胞から無視すべき折重なった細胞を分離する第３の弁別関数は：明らかに、分類機によって生成された特定の線形弁別関数は、使用される分類機のタイプおよび細胞の訓練セットに依存することとなる。上記の例は、単に説明のために示されたものである。上述の説明から認められるように、本発明は、細胞サンプル中の悪性腫瘍に関連した変化を自動的に検出するシステムである。細胞サンプルを適切に染色および映像化することによって、スライド上に見出だされた各対象物の特徴が判断され、細胞サンプルが採取された患者が正常であるか、あるいは異常であるかを示す表示を提供するために使用されることができる。さらにＭＡＣは、施された癌治療が効果的であるかどうか、および癌が鎮静したかどうかを示す表示を提供する。本発明の好ましい実施形態が図示および説明されているが、本発明の技術的範囲を逸脱することなく種々の変更が可能なことが明らかになるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者パルシック、ブランコカナダ国、ブイ６エヌ・１ビー８、ブリティッシュ・コロンビア、バンクーバー、トラファルガー・ストリート 5357 (72)発明者ガーナー、デイビッド・エムカナダ国、ブイ６ピー・２ダブリュ５、ブリティッシュ・コロンビア、バンクーバー、ウエスト・シックスティーナインス・アベニュー 838 (72)発明者ハリソン、エス・アランカナダ国、ブイ６エス・１ティー８、ブリティッシュ・コロンビア、バンクーバー、ウエスト・トゥエンティーナインス・アベニュー 3884

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞サンプルを採取し、そのサンプル内の細胞核を識別するためにサンプルを染色し、デジタルＣＣＤカメラおよびプログラム可能なスライドステージを含むタイプのデジタル顕微鏡により細胞サンプルの映像を獲得し、映像の焦点を結び、その映像中の対象物を識別し、各対象物について１組の特徴値を計算し、特徴値を解析して、各対象物が悪性腫瘍に関連した変化を有する細胞核であるかどうかを決定するステップを含んでいる細胞サンプル中の悪性腫瘍に関連した変化の検出方法。２．細胞映像中の各対象物は、強度値をそれぞれ有する画素のグループを含んでおり、映像中の対象物を識別するステップは、映像中の全ての画素のヒストグラムを計算し、映像中の背景画素の平均強度を決定し、映像中の対象物画素の平均強度を決定し、背景画素の平均強度と対象物画素の平均強度との間にあるしきい値を決定し、しきい値より大きい強度を有する全ての画素を背景として識別し、しきい値以下の強度を有する全ての画素を対象物として識別するステップをさらに含んでいる請求項１記載の方法。３．各対象物は、背景から対象物を分離するエッジを有しており、細胞映像中の対象物を識別するステップは、対象物のエッジを拡張して環状リングの外側エッジを限定し、対象物のエッジを破壊して環状リングの内側エッジを限定することによって対象物を包囲する環状リングを生成し、その環状リンクにおける各画素のグラジエント値を計算し、その環状リングが対象物を囲む単一の画素チェーンを含むまで、低いグラジエント値を有する画素を環状リングから除去するステップを実行することによって対象物のエッジを識別するステップをさらに含んでいる請求項１記載の方法。４．１組の特徴値中の１以上の特徴を計算するステップは、特徴を計算する前に、対象物の本当のエッジを拡張または縮小するステップをさらに含んでいる請求項３記載の方法。５．映像は、コンピュータシステムのメモリに記憶され、異なるステージ位置において一連の映像を獲得することによって各対象物の局部的焦点を調節し、各対象物について、対象物の焦点が最良である映像を選択し、その最良の焦点の各対象物の映像をコンピュータのメモリに重書きするステップをさらに含んでいる請求項１記載の方法。６．デジタル顕微鏡中の空白スライドから得られたテスト映像を読込み、テスト映像の各画素の強度値を細胞サンプルの映像中の対応した画素から減算し、テスト映像中の画素の平均強度を決定することによって映像のデジタル顕微鏡の光源の照明強度の変化を補償し、細胞サンプルから得られた映像の各画素に平均強度を加算するステップをさらに含んでいる請求項５記載の方法。７．対象物の近くの画素のグループに対する平均画素強度を決定し、対象物の近くの画素のグループに対する平均画素強度を対象物に含まれている各画素から減算することによって対象物の周囲の局部吸光度を補償するステップをさらに含んでいる請求項６記載の方法。８．対象物の近くの画素のグループは、対象物の面積より少し大きい面積を有する正方形の境界線によって限定される請求項７記載の方法。９．各対象物について面積、形状および光密度を計算することによって映像から人工物を除去し、２，０００平方ミクロンより大きい面積を有する対象物、ならびに４より大きい形状または球形度と、１ｃより大きい光密度を有する対象物とを映像から除去するステップをさらに含んでいる請求項１記載の方法。１０．悪性腫瘍に関連した変化を有する細胞核を悪性腫瘍に関連した変化を有しない核から分離するために使用される特徴は、（１）面積（２）平均半径（３）ＯＤ分散（４）ＯＤ非対称性(skewness) （５）範囲平均（６）ＯＤ最大値（７）光スポットの密度（８）低ＤＮＡ面積（９）高ＤＮA面積（１０）低ＤＮＡ量（１１）高ＤＮＡ量（１２）高平均距離（１３）中／高平均距離（１４）相関（１５）均質性（１６）エントロピー（１７）フラクタルディメンション（１８）ＤＮＡインデクス（１９）ラン０パーセント（２０）ラン４５パーセント（２１）ラン９０パーセント（２２）ラン１３５パーセント（２３）中間調レベル０（２４）中間調レベル４５（２５）中間調レベル９０（２６）中間調レベル１３５（２７）ラン長０（２８）ラン長４５（２９）ラン長９０（３０）ラン長１３５を含むグループから選択される請求項１記載の方法。１１．患者から見掛け上正常な細胞のサンプルを採取し、（１）サンプル中の細胞の核を染色し、（２）デジタル顕微鏡で細胞の映像を獲得して、その映像をコンピュータシステムに記録し、（３）記録された細胞の映像を解析して、核を識別し、（４）サンプル中で見出だされた各核について１組の特徴値を計算し、その特徴値から、その核が悪性腫瘍に関連した変化を示しているかどうかを決定することによってサンプル中の細胞が悪性腫瘍に関連した変化を示しているかどうかを決定し、悪性腫瘍に関連した変化を示しているサンプル中の核の総数を決定して、その個数から、患者が癌になるかどうかを予測するステップを含んでいる患者の癌の進行を予測する方法。