JP2001258599A - 細胞系譜抽出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】細胞系譜を計算機で構築することにより、細胞
系譜を省力でかつ短時間で構築する。 【解決手段】観察対象の細胞について焦点面を変化させ
て２次元画像を複数撮影し、かつ、該２次元画像を時系
列に複数撮影することで焦点面、時点で異なる複数の２
次元画像を得る工程と、前記夫々の２次元画像におい
て、画像処理を行うことで細胞核領域を抽出する工程
と、前記夫々の２次元画像において抽出された細胞核領
域から、同一細胞核に由来する細胞核領域を統合する工
程と、統合された細胞核領域において、画像中の細胞核
領域が出現、消滅する時点、位置の情報から細胞系譜を
構築する工程とを含むことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は細胞系譜抽出方法に
係り、詳しくは、観察対象の４次元顕微鏡画像から細胞
系譜を作成する方法に関するものである。また、本発明
は、好適には、ノマルスキー型透過型微分干渉顕微鏡
（以下「ノマルスキー顕微鏡」という）で撮影した線虫
（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の発生過程の４次元画像から、
細胞系譜を作成する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】線虫は１９６５年にＳｉｄｎｅｙ Ｂｒ
ｅｎｎｅｒによって見出された実験生物で、現在の分子
生物学で特に詳しく解析されている実験生物（大腸菌、
酵母、線虫、ハエ、アフリカツメガエル、セブラフィッ
シュ、ネズミ等）の一つである。線虫は、これらの実験
生物の中では多細胞生物の最も単純な生物として位置付
けられている。線虫は、受精卵が成虫になるまで、おお
よそ三日間を要する。

【０００３】多細胞生物は基本的に一つの受精卵（単細
胞）が秩序正しく分裂を繰り返して多数の細胞からなる
成虫を形成する。受精卵からの分裂の秩序を樹形図的に
記述したものを細胞系譜と呼ぶ。線虫は多細胞生物の中
で唯一受精卵から成虫までの細胞系譜が明らかにされて
いる。この細胞系譜は１９８３年にＳｕｌｓｔｏｎ等に
よって決定された。

【０００４】正常な線虫（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）は全て
の個体でその受精卵から成虫になるまでの細胞系譜が一
定である。特定の遺伝子に突然変異が起きるとその遺伝
子の機能に変化が生じ、細胞分裂のパターン、すなわち
細胞系譜がｗｉｌｄ ｔｙｐｅのものと比べて変化す
る。この細胞系譜の変化から突然変異した遺伝子の機能
を推定し、その推定を出発点にした研究の進展により大
量の遺伝子が急速に同定され、また、突然変異体動物が
大量生産され始めてきている。これらの資源を有効活用
することを考えると、遺伝子、突然変異体解析の出発点
である細胞系譜解析の自動化は必要不可欠な技術であ
る。

【０００５】従来の細胞系譜の作成には、いわゆるノマ
ルスキー顕微鏡が用いられる。ノマルスキー顕微鏡は、
偏光版、ノマルスキープリズムのセットにより作成した
２種類の光線（同波形、同位相、光路のみ微妙にズレて
いる）を観察対象に照射し、観察対象を透過させる。観
察対象を透過する光路の長さや、屈折率の差に起因して
透過後の2本の光線の位相はズレている。透過後の２本
の光線を偏向板、ノマルスキープリズムのセットを用い
て同光路に収束させると、この２本の光線の位相のズレ
は干渉作用を引き起こす。この干渉作用による明暗像を
もって、観察するのがノマルスキー顕微鏡である。この
方法によれば、透明な観察対象の内容物の分布や外形状
を明暗像で捉えることができる。生物学で言うと、通常
の光学顕微鏡では透明に見える細胞の内容物（細胞核）
や、外形（細胞膜）を明暗像で捕らえることができる。

【０００６】線虫の細胞系譜を決定したＳｕｌｓｔｏｎ
等はノマルスキー顕微鏡を肉眼で見てスケッチして作成
したと言われており、相当の時間（おそらく１年以上）
を要したものと思われ、また、その労力は多大なもので
ある。

【０００７】最近では、ノマルスキー顕微鏡を用いた４
Ｄ顕微鏡画像を用いて作成するのが一般的である。特定
の焦点で観察される顕微鏡画像は観察対象を特定の位置
で水平に切断して得られる２次元（ｘ−ｙ軸）断面像と
考えられる。すなわち、焦点を上下に動かす（ｚ軸方向
に動かす）ことで観察対象をｚ軸方向の様々な位置で切
断した断面像が得られる。これらの画像を統合すると観
察対象の３次元の形を捉えることができる（３次元画
像）。さらに、このような３次元画像の撮影を時間を追
って撮影していくことで観察対象の時間変化を捉えるこ
とができる。このようにして撮影したものを４Ｄ（４次
元）顕微鏡画像と呼ぶ。

【０００８】４Ｄ顕微鏡画像を用いる作業はＳｕｌｓｔ
ｏｎ当時と比較して楽になったものと考えられるが、撮
影した画像から細胞核、細胞膜を人間が判断しているた
め、やはりかなりの労力と時間を要する。受精卵から１
６細胞くらいまでの作成であっても、１日以上はかか
る。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、かかる従来
の細胞系譜の作成を容易に行うべく創案されたものであ
って、細胞系譜を計算機で構築することにより、細胞系
譜を省力でかつ短時間で構築することを目的とするもの
である。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、かかる課題を
解決するために本発明が採用した技術手段は、観察対象
の細胞について焦点面を変化させて２次元画像を複数撮
影し、かつ、該２次元画像を時系列に複数撮影すること
で焦点面、時点で異なる複数の２次元画像を得る工程
（４次元顕微鏡画像を得る工程）と、前記夫々の２次元
画像において、画像処理を行うことで細胞核領域を抽出
する工程と、前記夫々の２次元画像において抽出された
細胞核領域から、同一細胞核に由来する細胞核領域を統
合する工程と（４次元統合核領域を得る工程）、統合さ
れた細胞核領域（４次元統合核領域）において、画像中
の細胞核領域が出現、消滅する時点、位置の情報から細
胞系譜を構築する工程とを含むことを特徴とするもので
ある。

【００１１】好ましくは、該画像は、透過型微分干渉顕
微鏡で撮影したものであり、さらに好ましくは、ノマル
スキー型透過型微分干渉顕微鏡で撮影したものである。
もっとも、画像はこれらで撮影したものに限定されるも
のではない。

【００１２】細胞核を抽出する工程は、画像の明暗の細
かい変化が少ない領域を核として検出する手法、あるい
は、光の角度に沿って広い範囲で明暗の変化の大きい部
分を核として抽出する手法を含む。前者の例としては、
Kirschフィルタ、Preｗittフィルタ、エントロピーフィ
ルタ、ＦＦＴフィルタを用いるものが挙げられる。Kirs
chフィルタは好ましくは、Kirschテンプレート型エッジ
検出オペレータと移動平均法を組み合わせたフィルタで
ある。Preｗittフィルタは好ましくは、Prewittテンプ
レート型エッジ検出オペレータの出力を２値化し、さら
に距離変換を適用するフィルタである。後者の例として
は、見た目の光の角度に沿って上下所定ピクセル分の輝
度値の合計の差分を取るフィルタが採用される。

【００１３】夫々の２次元画像において抽出された細胞
核から、同一細胞核に由来する細胞核領域を統合する工
程は、同焦点面の画像群に含まれる同一の細胞核由来の
核領域を統合する工程と、同時点の画像群に含まれる同
一の細胞核由来の細胞核領域を統合する工程と、前記二
つの工程で得られた細胞核領域をさらに統合する工程を
含む。また、４次元統合された細胞核領域において、画
像中の細胞核領域が出現、消滅する時点、位置の情報か
ら細胞系譜を構築する工程は、複数の細胞核領域の４次
元距離を求めることにより、ある細胞と、その細胞の細
胞分裂後の細胞とを特定する工程を含むものである。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明に係る細胞系譜抽出方法な
いしシステムの一つの実施形態を、線虫初期胚の細胞系
譜の作成に基づいて説明する。図１はシステムの構成図
であって、線虫初期胚のノマルスキー型顕微鏡４Ｄ画
像を撮影する工程、複数のアルゴリズムを用いた画像
処理によって、個々の２次元画像において細胞核の位置
を抽出する工程、各アルゴリズムによる核認識結果を
合わせる工程、必要に応じて、誤認された核領域を人
間の判断で除去する工程、複数の焦点面、複数の時点
（時系列）の画像における核情報を統合する工程、４
次元統合核領域の出現、消滅の時点・位置の情報から細
胞系譜を構築する工程とを備えている。

【００１５】線虫初期胚のノマルスキー型顕微鏡による
４Ｄ画像の撮影について説明する。４Ｄ画像が意味する
こところは、従来技術の欄に記載したとおりであって、
焦点を異ならしめて撮影した複数の２次元画像と、該複
数の２次元画像を時系列に撮影してなる複数の２次元画
像を言う。すなわち、焦点面、時点が異なる複数の２次
元画像を統合した画像を４Ｄ画像と言う。本実施の形態
で処理対象とする線虫の初期胚の画像は、焦点面を上下
に変えて３０〜９０枚の１セットとし、１〜５分毎に撮
影する。実験では、８９の焦点面、２０の時系列点につ
いて、合計１７８０枚の二次元画像を撮影した。細胞の
長尺方向の半径は約６０μｍ、短尺方向の半径は約３０
μｍである。撮影は９０秒毎に行った。処理対象の顕微
鏡画像の例を図２に示す。横軸が時間軸（時点）、縦軸
が焦点軸（焦点面）である。

【００１６】個々の２次元画像における細胞核の位置の
抽出について説明する。個々の２次元顕微鏡画像を、３
種類の画像処理アルゴリズムを用いて処理する。これら
３種類のアルゴリズムのどれか一つでも核であると認識
した領域は、画像処理システム全体の結論として核であ
る領域（核領域）と判断する。

【００１７】［核認識（画像処理）アルゴリズムＡ］こ
のアルゴリズムは、顕微鏡画像の明暗の細かい変化が少
ない領域を核として検出する。ノマルスキー型顕微鏡画
像において、細胞質は、細胞内小器官のため明暗の細か
い変化に富んだ領域となるが、細胞核は、明暗の細かい
変化が少ない領域になるという性質を備えている。画像
処理アルゴリズムＡはこの性質を利用するものである。
この特徴を捉えるべく、Ｋｉｒｓｃｈのオペレータで原
画像を変換すると、画像の明暗の少ない部位が輝度の小
さい領域として表される画像が得られる。この画像に、
平滑化処理として移動平均法を採用し、さらに２値化処
理を適用し、輝度の変化の少ない領域（細胞核）を細胞
質から分離する。

【００１８】画像処理アルゴリズムＡについて詳述する
と、Ｋｉｒｓｃｈのエッジ検出オペレータを使用し、画
像の輝度の変化が激しい領域を抽出するに当り、以下の
係数行列のなかで、出力が最大のものを利用する。

【数１】

【００１９】平滑化においては、以下の式を用いる。

【数２】 ２値化後、核と思われる形状の連結成分を抽出する。図
３に例を示す。

【００２０】［核認識（画像処理）アルゴリズムＢ］こ
のアルゴリズムも、顕微鏡画像の明暗の細かい変化が少
ない領域を核として検出するものである。Ｐｒｅｗｉｔ
ｔのテンプレート型オペレータで原画像を変換し、２値
化すると、画像の明暗の変化の激しい領域（細胞質）
は、白点がまばらに分布する領域として、画像の明暗の
変化の少ない領域（細胞核）は白点のない黒い領域とし
て表される画像が得られる。この画像から、距離変換処
理で白点のない領域を抽出する。

【００２１】具体的には、Ｐｒｅｗｉｔｔのテンプレー
ト型エッジ検出オペレータを使用し、画像の輝度の変化
が激しい領域を抽出するに当り、以下の係数行列の中
で、出力が最大のものを利用する。

【数３】

【００２２】２値化の後、以下のメディアンフィルタを
用いる。

【数４】 さらに、以下の距離変換を行う。

【数５】 そして、２値化、連結成分処理を行う。図４に例を示
す。

【００２３】［核認識（画像処理）アルゴリズムＣ］こ
のアルゴリズムは、ノマルスキー型顕微鏡像において、
観察対象は特定の位置から斜めに光を当てたような影が
ついて観察されることを利用する。円形である細胞核の
核膜は、画像中で半周分が明るく、残りの半周分が暗く
現れる。この見た目の光の角度に沿って広い範囲で明暗
の変化の大きい部分を、核として抽出する。例えば、見
た目の光の角度に沿って上下３０ピクセル分の輝度値の
合計の差分を取り、この値をその点の変換後の値とす
る。変換後の画像を２値化することで、核の位置を白く
浮かび上がらせる。

【００２４】具体的には、核が光の方向に沿って、明る
い部分と暗い部分で囲まれるように見える性質を捉える
ため、以下の式で表されるフィルタをかける。ここに、
f（x，y）は原画像の輝度値、g(x，y)は変換後の画像の
輝度値、θは光の方向、ｍは輝度値を合計する範囲であ
る。

【数６】 ２値化後、連結成分処理を行う。図５に例を示す。図５
に示すように、このフィルタは、細胞の境界や、胚の外
にｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅを作りやすい。そこ
で、以下に述べるように、細胞境界の抽出、胚領域の抽
出を行い、結果を補正する。

【００２５】細胞境界検出のアルゴリズムについて説明
する。核認識のアルゴリズム３の補正のため、明らかに
細胞の境界になっている領域を探す。Ｐｒｅｗｉｔｔの
テンプレート型エッジ検出オペレータの結果を２値化す
る。円形率、面積、周の長さを利用して、細長い領域を
抽出する。結果を図６に示す。

【００２６】胚領域検出のアルゴリズムについて説明す
る。核認識アルゴリズム３の補正のため、画像中の胚の
領域を探す。Ｋｉｒｓｃｈのテンプレート型エッジ検出
オペレータの結果を２値化する。最大の連結成分を抽出
する。結果を図７に示す。

【００２７】前記３種類のアルゴリズムで認識された核
情報を合わせる。前述したように、３種類のアルゴリズ
ムのどれか一つでも核であると認識した領域は、画像処
理システム全体の結論として核である領域（核領域）と
判断する。

【００２８】次いで、自動核認識の結果から、誤認され
た核領域を人間の判断で除去する。前記の画像処理アル
ゴリズムは完全なものではなく、特に細胞の数が増加す
るに従い誤って核領域と認識された領域（ｆａｌｓｅ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ）が含まれるが。ｆａｌｓｅ ｐｏｓ
ｉｔｉｖｅが多いデータからは正しく細胞系譜を構築す
るのが困難であるため、本システムでは、人間の手で、
上記画像処理の結果から、ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖ
ｅ（核認識アルゴリズムによって、誤認識された領域、
すなわち実際では細胞核ではないのに、アルゴリズムに
よって核の存在する場所として認識された領域）を除去
するツールが含まれている。このようなＧＵＩツールに
ついて図８乃至図１０に基づいて説明する。

【００２９】先ず、図８に示すように、各核認識アルゴ
リズムの結果を統合し、「核領域」として認識された領
域（白線で囲まれた領域）を元画像に重ねて表示する
（核認識結果の表示）。次いで、図９、図１０に示すよ
うに、誤認識された「核領域」をマウスを用いて塗りつ
ぶす（誤認核領域上をマウスのボタンを押しながらなぞ
る）ことにより、誤認核領域を消去する（誤認識領域の
除去）。そして、誤認識領域の除去の結果の核領域情報
をこれに続く細胞系譜作成作業に使用できるファイル形
式で保存する。このツールを用いたｆａｌｓｅ ｐｏｓ
ｉｔｉｖｅの除去作業は容易であり、実際に試したとこ
ろ、略１時間で１７８０枚の画像から、ｆａｌｓｅ ｐ
ｏｓｉｔｉｖｅを除去することができた。尚、言うまで
もないが、このマニュアル処理は本発明の技術思想にお
ける必須構成要素ではなく、自動核認識の精度を向上さ
せることで、この工程を省くことも可能である。

【００３０】異なる２次元画像において認識された同一
細胞核に由来する核領域の統合について説明する。２次
元画像での認識の結果から、画像上においてどの核がい
つどこで出現、消滅するか知るため、異なる２次元画像
で認識された同一の核をまとめる。例を図１１に示す。
横軸が時間軸（時点）、縦軸が焦点軸（焦点面）であ
る。

【００３１】［同焦点面の画像群に含まれる同一の細胞
核由来の核領域の統合］同じ焦点面で撮影された（すな
わち、ｚ軸の座標の値が等しい）時系列の画像群に注目
し、これらの画像それぞれの核領域で、同じ核に由来す
るもの（すなわち、同じ核の時間変化を追っていること
になるもの）を統合する。核領域Ｎ，Ｎ´が座標（ｘ，
ｙ），（ｘ´，ｙ´）で検出されたとき、Ｎ，Ｎ´の二
次的な距離ｄｘｙを以下のように定義すると共に、同一
の核由来と判断される条件を定める。

【数７】 この条件に従い、それぞれの核を最も早く検出された時
点から順次統合して行く。すなわち、同一の焦点で、時
系列の核の認識結果を一つの集合（セット）に統合す
る。以下の手順で行う。 １．出現時間の最も早い核を選ぶ。 ２．次の時点で、最も距離が近く、かつその距離がある
閾値（２５ピクセル）以下の核を同じ核に由来するもの
（ｓｕｃｃｅｓｓｏｒ）として同じ核に統合する。 ３．同じ核に由来するものがいなくなるまで２を繰り返
す。 ４．残っている核がなくなるまで、１−３を繰り返す。

【００３２】［同時点の画像群に含まれる同一の細胞核
由来の核領域の統合］前述した方法と同様にして、同時
点で焦点面（ｚ座標）の異なる画像群に含まれる同一の
細胞核由来の核領域を統合する。同一の時点で異なる焦
点面の核の認識結果を一つのセットに統合する。距離の
閾値は１０ピクセルである。

【００３３】［全４D画像中に現れる同一の細胞核由来
の核領域の統合］時系列、焦点方向にそれぞれに統合さ
れた核領域（統合核領域）の間で、共有する核領域をも
つ統合核領域の組み合わせが存在する場合、それらは同
一の核由来の統合核領域であるとみなし、それらをさら
に統合する（４Ｄ画像において統合された核領域を４次
元統合核領域という）。同焦点の画像群、同時点の画像
群において統合された各セットのうち、同一の核を含む
セット同士を一つのセットに統合する際に、５つ以下の
画像でしか認識されなかったセットは、フラグメントと
みなし、系譜には使用しない。図１２は核領域の統合を
説明する図である。白円は所定の細胞核が検出されなか
った画像であり、黒円は所定の細胞核が検出された画像
である。縦方向実線は同一の核と認識された一セットで
ある。横方向点線は同一の核と認識された一セットであ
る。

【００３４】４次元統合核領域には画像中の細胞核が出
現、消滅する時点、位置の情報が含まれている。それを
基に細胞系譜を構成する（図１３）。最初の時点に現れ
た核をルート（ｒｏｏｔ）とする。ある細胞（母細胞）
に対し、その細胞分裂後の二つの細胞（娘細胞）を探索
する際は、画像中における母細胞の核の消滅した時間・
位置を対応する４次元統合核領域より求める。それ以外
の全ての４次元統合核領域の出現時間、位置との４次元
距離を求める。その距離が最も小さいもの二つが娘細胞
に対応する４次元統合核領域であると判断し、細胞系譜
に加える。但し、４次元距離が規定値より大きい場合に
は娘細胞であるとは見なさない。

【００３５】より具体的には、以下のステップを取る。 １．出現時点が最も早い核（複数ありうる）を選び、系
譜に入れる。これらは、系譜のｒｏｏｔとなる。 ２．既に系譜に入っている核から、消滅時間が最も早い
もの一つを選ぶ。これをＮｐとする。 ３．Ｎｐから、４次元での距離が最も近く、かつその距
離が閾値（１００）以下である核２つを選び、娘細胞と
して系譜に入れる。 ４．系譜が拡大できなくなるまで、２−３のステップを
繰り返す。

【００３６】ここで、二つの核領域がｔ１，ｔ２，位置
（ｘ１，ｙ１，ｚ１），（ｘ２，ｙ２，ｚ２）に現れる
とすると、この二つの各領域の４次元距離ｄは以下の式
で定義される。ｃｚ、ｃｔは、時間、焦点面方向の距離
の重みであり、ｃｚ、ｃｔの具体的な値は、それぞれ
２，１０である。

【数８】

【００３７】第一の実施形態においては、核認識フィル
タとして三つの画像処理アルゴリズムを採用したが、本
発明に用いられる核認識フィルタはこれらに限定される
ものではない。以下に核認識フィルタの他の実施形態に
ついて説明する。

【００３８】［エントロピーフィルタ］特徴を計測した
い画像領域に対して、濃淡ヒストグラムH（ｌ）（濃淡
レベル数がLであれば、ｌ＝０，１，２，・・・，Ｌ−
１である）を求め、頻度の総数（画像領域の画素数N）
で各濃淡レベルの頻度を割って、総画素数が１．０にな
るように正規化する。それをP（ｌ）とする。以下の式
によって求められるEPYの値を基準にして核領域、細胞
質領域の区別を行う。６ｘ６ｐｉｘｃｅｌ〜２０ｘ２０
ｐｉｘｃｅｌ（あるいは画像上の核の直径に相当する大
きさ）の画像領域ウィンドウに対してスキャンすること
により良好な結果を得る。フィルタの出力結果を２値化
して使用する。

【数９】

【００３９】［ＦＦＴフィルタ］特徴を計測したい画像
領域に対して、２次元ＦＦＴパワースペクトル（高速フ
ーリエ変換パワースペクトル）を計算し低周波、高周波
領域の特徴を用いて核領域を検出する。通常のフーリエ
変換も使用することができる。フィルタの出力結果は２
値化して使用する。

【００４０】

【発明の効果】以上述べてきたように、本発明によれ
ば、細胞系譜を計算機で構築することができ、従来煩雑
かつ多大な労力を必要としていた細胞系譜を省力でかつ
短時間で構築できるという有利な効果を奏するものであ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る細胞系譜抽出方法のフロー図であ
る。

【図２】処理対象の顕微鏡画像の例を示す図である。

【図３】核認識アルゴリズムＡの処理工程を示す図であ
る。

【図４】核認識アルゴリズムＢの処理工程を示す図であ
る。

【図５】核認識アルゴリズムＣの処理工程を示す図であ
る。

【図６】細胞境界検出のアルゴリズムの処理工程を示す
図である。

【図７】胚領域検出のアルゴリズムの処理工程を示す図
である。

【図８】自動核認識の結果を人の手で修正するためのツ
ールを示す図である。

【図９】自動核認識の結果を人の手で修正するためのツ
ールを示す図である。

【図１０】自動核認識の結果を人の手で修正するための
ツールを示す図である。

【図１１】複数画像の同一の核をまとめる工程を説明す
る図である。

【図１２】図１１と同様に、複数画像の同一の核をまと
める工程を説明する図である。

【図１３】核の情報から細胞系譜を構成する工程を説明
する図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 北野 宏明 埼玉県川越市西小仙波町２−18−３ Ｆターム(参考） 4B063 QA11 QA18 QQ08 QS07 QS36 QX01 5B057 AA10 BA11 CD20 CE05 CE06 CE12 DA08 DB08 DC32 5L096 CA18 EA06 EA43 FA19 FA23 FA37 GA07 GA55 HA13

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）観察対象の細胞について焦点面を変
   化させて２次元画像を複数撮影し、かつ、該２次元画像
   を時系列に複数撮影することで焦点面、時点で異なる複
   数の２次元画像を得る工程と、（ｂ）前記夫々の２次元
   画像において、画像処理を行うことで細胞核領域を抽出
   する工程と、（ｃ）前記夫々の２次元画像において抽出
   された細胞核領域から、同一細胞核に由来する細胞核領
   域を統合する工程と、（ｄ）統合された細胞核領域にお
   いて、画像中の細胞核領域が出現、消滅する時点、位置
   の情報から細胞系譜を構築する工程とを含むことを特徴
   とする細胞系譜抽出方法。
2. 【請求項２】請求項１において、前記画像は、透過型微
   分干渉顕微鏡で撮影したものであることを特徴とする細
   胞系譜抽出方法。
3. 【請求項３】請求項１，２いずれかにおいて、細胞核領
   域を抽出する工程は、細胞核とそれ以外の細胞部分とに
   おける画像の明暗の差異を利用して画像処理を行うこと
   を含むことを特徴とする細胞系譜抽出方法。
4. 【請求項４】請求項３において、前記細胞核領域を抽出
   する工程は、細胞質に比べて画像の明暗の細かい変化が
   少ない領域を核領域として検出する手法を含むことを特
   徴とする細胞系譜抽出方法。
5. 【請求項５】請求項３において、前記細胞核領域を抽出
   する工程は、光の角度に沿って広い範囲で明暗の変化の
   大きい部分を核として抽出する手法を含むことを特徴と
   する細胞系譜抽出方法。
6. 【請求項６】請求項１乃至５において、前記細胞核の位
   置を抽出する工程は、複数の異なる細胞核領域認識アル
   ゴリズムを備えており、該複数のアルゴリズムの少なく
   とも一つに基づいて細胞核を認識した領域は、画像処理
   システムとして細胞核領域として扱うことを特徴とする
   細胞系譜抽出方法。
7. 【請求項７】請求項４，６いずれかにおいて、画像の明
   暗の細かい変化が少ない領域を核として検出する手法
   は、Kirschフィルタ、Preｗittフィルタ、エントロピー
   フィルタ、ＦＦＴフィルタからなる群から選択された一
   つあるいは複数のフィルタを用いるものであることを特
   徴とする細胞系譜抽出方法。
8. 【請求項８】請求項５，６いずれかにおいて、光の角度
   に沿って広い範囲で明暗の変化の大きい部分を核として
   抽出する手法は、見た目の光の角度に沿って上下所定ピ
   クセル分の輝度値の合計の差分を取る工程を含むもので
   あることを特徴とする細胞系譜抽出方法。
9. 【請求項９】請求項８において、該手法は、細胞境界の
   抽出、胚領域の抽出を行う工程を含み、該工程の結果に
   基づいて請求項８の手法による結果を補正することを特
   徴とする細胞系譜抽出方法。
10. 【請求項１０】請求項１乃至９いずれかにおいて、前記
    夫々の２次元画像において抽出された細胞核から、同一
    細胞核に由来する細胞核領域を統合する工程は、同焦点
    面の画像群に含まれる同一の細胞核由来の核領域を統合
    する工程と、同時点の画像群に含まれる同一の細胞核由
    来の細胞核領域を統合する工程と、前記二つの工程で得
    られた細胞核領域をさらに統合する工程を含むことを特
    徴とする細胞系譜抽出方法。
11. 【請求項１１】請求項１０において、前記二つの工程で
    得られた核領域を統合する工程は、各統合された統合核
    領域において、共有する核領域をもつ結合核領域の組み
    合わせが存在する場合、それらは同一の核由来の統合核
    領域であるとみなし、それらを統合する工程を含むこと
    を特徴とする細胞系譜抽出方法。
12. 【請求項１２】請求項１乃至１１いずれかにおいて、統
    合された細胞核領域において、画像中の細胞核領域が出
    現、消滅する時点、位置の情報から細胞系譜を構築する
    工程は、複数の細胞核領域の４次元距離を求めることに
    より、母細胞と、その細胞の細胞分裂後の娘細胞とを特
    定する工程を含むことを特徴とする細胞系譜抽出方法。
13. 【請求項１３】請求項１乃至１２いずれかにおいて、細
    胞核領域を統合する工程の前に、誤認された核領域を人
    間の判断で除去する工程を含むことを特徴とする細胞系
    譜抽出方法。