JP2000508891A - 増殖分化因子―１４ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 増殖分化因子−14（ＧＤＦ−14）を、そのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列とともに記載する。また、ＧＤＦ−14ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列を用いる診断ならびに治療方法も記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 増殖分化因子-14 発明の背景 １．発明の分野 本発明は増殖因子に関し、特に増殖分化因子-14（ＧＤＦ−14）と称する、ト ランスフォーミング増殖因子β（ＴＦＧ−β）スーパーファミリーの新しいメン バーに関する。 ２．関連技術の説明 トランスフォーミング増殖因子β（ＴＦＧ−β）スーパーファミリーは、胚発 生期の広範な分化過程に影響を与える構造的に関連した１群のタンパク質を包含 する。このファミリーは、正常な雄性発達に必要なミュラー(Mullerian)抑制物 質（ＭＩＳ）(Behringerら，Nature，345:167，1990)、背−腹軸形成および成虫 原基の形態形成に必要なショウジョウバエデカペンタプレジック(decapentapleg ic)（ＤＰＰ）遺伝子産物(Padgettら，Nature，325:81-84，1987)、卵の植物極 に局在するアフリカツメガエルVg-1遺伝子産物(Weeksら，Cell，51:861-867，19 87)、アフリカツメガエル胚における中胚葉および前葉構造の形成を誘導するこ とができる(Thomsenら，Cell，63:485，1990)アクチビン(activin)(Masonら，Bi ochem．Biophys．Res．Commun.，135:957-964，1986)、運動ニューロンおよび中 脳ドーパミン作動性ニューロンの生存を促進することができるＧＤＮF（Linら,S cience，260:1130，1993；Tomaeら，Nature，373:335，1995；Beckら，Nature， 373:339，1995；Hendersonら，Science，266:1062，1994；Vanら，Nature，373: 341，1995；Oppenheimら，Nature，373:344，1995）およびde novoで軟骨および 骨形成を誘導することができる(Sampathら，Ｊ.Biol．Chem.，265:13198，1990) 骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ、オステオゲニン、ＯＰ−１）を含む。ＴＧＦ− β類は、脂肪組織形成、筋形成、軟骨形成、造血および上皮細胞分化を含む種々 の分化過程に影響を及ぼすことができる（総論については、Massague，Cell 49: 437，1987参照）。 ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質は最初大きい前駆体タンパク質として合成 され、これは次にＣ末端から約110〜140アミノ酸はなれた塩基性残基の集団（ク ラスター）の箇所で加水分解開裂を受ける。このタンパク質のＣ末端領域、つま り成熟領域はすべて構造的に関連しており、また異なるファミリーメンバーは相 同性の程度に基づいて個別のサブグループに分類することができる。特定サブグ ループ内の相同性はアミノ酸配列同一性が70%から90%の範囲であるが、サブグル ープ間の相同性はこれより有意に低く、一般に20%から50%に過ぎない。各場合に おいて、活性種はＣ末端断片のジスルフィド結合二量体であるように思われる。 研究は、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの前領域(pro-region)をＴＧＦ−βフ ァミリーの別のメンバーの成熟領域と共に同時発現させた場合、生物的に活性な ホモ二量体の細胞内二量体化および分泌が起こることを示した(Gray，A.およびM aston，A.，Science，247:1328，1990)。Hammondsら(Molec．Emdocrin，5:149， 1991)によるさらなる研究は、BMP-4成熟領域と組み合わせたBMP-2前領域の使用 が、成熟BMP-4の発現を劇的に向上させることを示した。研究されたファミリー メンバーの殆どについて、ホモ二量体種が生物的に活性であることが判明したが 、インヒビン類(Lingら，Nature，321:779，1986)およびＴＧＦ−β類(Cheifetz ら，Cell，48:409，1987)のような他のファミリーメンバーについては、ヘテロ 二量体もまた検出された。そして、これらは個々のホモ二量体とは異なる生物的 特性を有するように思われる。 発現パターンが組織特異的である新規な因子の同定は、その組織の発生および 機能の理解をより深めるであろう。 発明の概要 本発明は、細胞増殖および分化因子ＧＤＦ-14、この因子をコードするポリヌ クレオチド配列、およびこの因子に結合する抗体を提供する。この因子は、種々 の細胞増殖疾患に関連する疾患に関連するように思われる。 したがって、本発明は１つの実施態様において、ＧＤＦ-14に関連する細胞増 殖疾患を検出する方法を提供する。また別の実施態様において、本発明はＧＤＦ -14活性を抑制または増強することによる細胞増殖疾患または免疫疾患の治療 法を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、ヒトＧＤＦ-14のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を 示す。推定上のタンパク質分解プロセシング部位が、四角く囲ったアミノ酸で示 されている。 図２は、ＧＤＦ−14とＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーとのアミ ノ酸相同性を示す。数字は、第１番目の保存されたシステインからＣ末端までの 間で計算された各対間のアミノ酸同一性パーセントを示す。 図３は、ヒトＧＤＦ-14プローブを用いて釣り上げた、成体組織から単離した ＲＮＡのノーザンブロットである。 発明の詳細な説明 本発明は、増殖および分化因子ＧＤＦ-14、およびＧＤＦ-14をコードするポリ ヌクレオチド配列を提供する。ＧＤＦ-14は筋肉、脳、子宮、脾臓および胸腺に おいて最高レベルで発現され、他の組織においてはより低いレベルで発現される 。１つの実施態様において、本発明はＧＤＦ-14の発現または機能に関連する細 胞増殖疾患又は免疫疾患の検出法を提供する。また別の実施態様において、本発 明はＧＤＦ-14活性を抑制または増進する作用物質を用いることによる細胞増殖 疾患または免疫疾患の治療法を提供する。 ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、多数の細胞型において増殖、分化、および 他の機能を制御する多機能性ポリペプチドから成る。これらペプチドの多くは他 のペプチド増殖因子に対し正および負の両方の調節効果を有する。本発明のＧＤ Ｆ-14タンパク質とＴＧＦ−βファミリーメンバーとの間の構造的相同性は、Ｇ ＤＦ-14がこの増殖および分化因子のファミリーの新規なメンバーであることを 示している。他の多数のメンバーの公知の活性に基づいて、ＧＤＦ-14もまた診 断および治療用試薬として有用な生物活性を有することが予想できる。 このスーパーファミリーのあるメンバーは、神経系の機能に関連する発現パタ ーンまたは活性を有する。例えば、ファミリーの１メンバーであるＧＤＮＦ は、ドーパミン作動性ニューロン(Linら，Science，260:1130，1993)および運動 ニューロン（Hendersonら，Science，266:1062，1994；Yanら，Nature，373:341 ，1995；Oppenheimら，Nature，373:344，1995）の生存を促進することができる 強力な神経栄養性因子であることが示されている。別のファミリーメンバーであ るドルサリン-1(dorsalin-1)は、神経堤細胞の分化を促進しうる(Baslerら，Cel l，73:687，1993)。インヒビンおよびアクチビンは脳で発現されることが示され ている(Meunierら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，85:247，1988；Sawchenko ら，Nature，334:615，1988)。そして、アクチビンは神経細胞生存分子として機 能しうることが示されている(Schubertら，Nature，344:868，1990)。別のファ ミリーメンバーであるＧＤＦ−１は、発現パターンにおいて神経系特異的であり (Lee，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.，88:4250，1991)、また、他のファミリ ーメンバーのあるもの、例えばＶｇｒ−１(Lyonsら，Proc．Natl．Acad．Sci．U .S.A.，86:4554，1989；Jonesら，Development，111:581，1991)、ＯＰ−１(Ozk aynakら，J．Biol．Chem.，267:25220，1992)、およびＢＭＰ−4(Jonesら，Deve lopment，111:531，1991)もまた、神経系で発現されることが知られている。脳 および筋肉におけるＧＤＦ-14の発現は、ＧＤＦ-14もまた神経系の機能に関連し た活性を有する可能性があることを示唆する。特に、例えば、骨格筋は運動ニュ ーロンの生存を促進する１つまたは複数の因子を生ずることが知られている(Bro wn，Trends Neurosci.，7:10，1984)。このファミリーの他のメンバーの公知の 神経栄養性活性および筋肉におけるＧＤＦ-14の発現は、ＧＤＦ-14の活性の１つ は運動ニューロンに対する栄養因子としての活性でありうることを示唆する。ま たは、ＧＤＦ-14は他のニューロン集団に対する神経栄養性活性を有するのかも しれない。したがって、ＧＤＦ-14は、筋萎縮性側索硬化、パーキンソン病もし くはアルツハイマー病等の神経変性疾患の治療において、または移植前培養中の 細胞または組織の維持において、in vitroおよびin vivoの用途を持ちうる。 ＧＤＦ-14はまた、筋肉変性疾患または傷による組織修復、等の筋肉が関与す る疾患過程の治療においても用途をもちうる。この点に関して、ＴＧＦ−βファ ミリーの他の多くのメンバーは組織補修の重要な媒介体でもある。ＴＧＦ− βはコラーゲンの形成に対して顕著な効果を及ぼし、そして新生マウスにおいて めざましい血管形成応答を引き起こすことが示されている(Robertら，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 83:4167，1986)。ＴＧＦ−βはまた、培養中の筋芽細胞の分 化を抑制することが示されている(Massagueら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83 :8206，1986)。さらに、筋芽細胞は遺伝子療法において遺伝子を筋肉に運ぶ伝達 体として用いることができるので、移植前の細胞を維持するため、または融合プ ロセスの効率を高めるためにＧＤＦ-14の特性を利用することができるであろう 。 ＧＤＦ-14はまた、免疫疾患の治療にも適用し得る。特に、ＴＧＦ−βは、Ｂ およびＴ細胞の増殖および機能に対する強力な抑制効果を含む広範な免疫調節活 性を有することが示されている（総論については、Palladinoら，Ann．N.Y.Acad ．Sci.，593:181，1990参照）。脾臓および胸腺におけるＧＤＦ-14の発現は、Ｇ ＤＦ-14が類似の活性を有しうること、そしてそれゆえ抗炎症剤として、または リンパ細胞の異常な増殖若しくは機能に関連する疾患の治療に使用しうることを 示唆している。 ＧＤＦ−14は、種々のタイプの損傷の修復を促進するのに適用し得る。ＴＧＦ −βファミリーの多くのメンバーは、組織修復の重要なメディエーターであるこ とが知られている。ＴＧＦ−βは、コラーゲンの形成に顕著な影響を及ぼすこと が示されており、新生マウスにおいて著しい血管形成応答を引き起こす（Robert sら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83:4167，1986）。ＢＭＰは、新たな軟骨お よび骨の成長を誘発することができ、骨折および他の骨欠損の治療に有効である （Glowackiら，Lancet，1:959，1981；Fergusonら，Clin．Orthoped．Relat．Re s.，227:265，1988；Johnsonら，Clin．Orthoped．Relat．Res.，230:257，1988 ）。ＧＤＦ−14は同様の活性または関連する活性を有する可能性があり、例えば 外傷または火傷により引き起こされる組織損傷の修復に有用であり得る。 ＧＤＦ−14は、生殖または妊娠中の母親や胎児の成長もしくは機能の様々な面 を調節する上である役割を担っている可能性がある。そのため、ＧＤＦ−14また はＧＤＦ−14の機能を妨害する薬剤は、避妊レジメ、体外受精処置におけ る成功の増大化、早産の防止、または胎児の成長もしくは発育の促進に有用であ り得る。 ＧＤＦ−14はまた、種々のタイプの癌の治療にも適用し得る。このファミリー の既知の幾つかのメンバーは、腫瘍抑制剤として機能することができる。例えば 、インヒビンαは性腺腫瘍（Matzukら，Nature，360:313，1992）および副腎腫 瘍（Matzukら，PNAS，91:8817，1984）の双方の発生・進行を抑制することが示 されている。同様に、ＭＩＳは、ヌードマウスにおけるヒト子宮内膜および卵巣 腫瘍の増殖を抑制することが示されている（Donahceら，Ann．Surg.，194:472， 1981）。最後に、ＴＧＦ−βは多くの細胞型に対する強力な増殖抑制剤であり、 ＴＧＦ−βに対する抵抗性は結腸癌の進行において重要な役割を担っている（Ma rkowitzら，Science，268:1336，1995）。 本明細書で用いる「実質的に純粋な」という用語は、天然において関連してい る他のタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質を実質的に含まないＧＤＦ -14をさす。当業者はタンパク質精製のための標準的技法を用いてＧＤＦ-1４を 精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは非還元性ポリアクリルア ミドゲル上に単一の主要バンドを生じる。ＧＤＦ-14ポリペプチドの純度は、ア ミノ末端アミノ酸配列分析によっても確認できる。ＧＤＦ-14ポリペプチドには 、ＧＤＦ-14の活性が残存するものであれば該ポリペプチドの機能性断片が含ま れる。ＧＤＦ-14の生物活性を有するより小さいペプチドも本発明に包含される 。 本発明はＧＤＦ-14タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。こ れらのポリヌクレオチドには、ＧＤＦ-14をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび ＲＮＡ配列が含まれる。ＧＤＦ-14の全部または一部をコードする全てのポリヌ クレオチドもまた、ＧＤＦ-14活性を有するポリペプチドをコードする限り、こ こに含まれることが理解される。そのようなポリヌクレオチドは、天然に存在す るポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、および意図的に操作されたポリヌ クレオチドを包含する。例えば、ＧＤＦ-14ポリヌクレオチドを部位特異的突然 変異誘発にかけることが可能である。ＧＤＦ-14のポリヌクレオチド配列は、ア ンチセンス配列をも含む。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝暗号の縮重の 結果、縮重した配列をも包含する。20個の天然のアミノ酸が存在するが、それら の殆どは２個以上のコドンによって特定される。したがって、ヌクレオチド配列 によってコードされるＧＤＦ-14ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化し ていないかぎり、すべての縮重したヌクレオチド配列は本発明に包含される。 本明細書では、ヒトＧＤＦ-14遺伝子を含有する部分ＤＮＡ配列を具体的に開 示する。この配列は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの既知のメンバーに対して 有意な相同性を示すタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含 有する。この配列は推定上のRXXRタンパク質分解プロセシング部位を含有し、こ の部位の後に、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの特徴(hallmarks)の全てを含む1 12個のアミノ酸からなる配列が存在する。図２は、ＧＤＦ−14とＴＧＦ−βスー パーファミリーの他のメンバーとのＣ末端部分の比較を示すものである。ＧＤＦ −14は、Ｖｇｒ−１およびＢＭＰ５に対して最も相同性が高い（32％の同一性） 。ＴＧＦ−βおよびインヒビン−βと同様に、ＧＤＦ−14は、推定上の開裂部位 の後に９個のシステイン残基を含有する。既知のファミリーメンバーから類推し て、Ｃ末端の112個のアミノ酸の二量体は、活性なＧＤＦ−1４分子に相当すると 推定される。好ましくは、ヒトＧＤＦ−14ヌクレオチド配列は配列番号１または 図１のヌクレオチド配列である。 ＧＤＦ-14をコードするポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）ならびに配 列番号１に相補的な核酸配列を含む。相補配列はアンチセンスヌクレオチドを含 みうる。配列がＲＮＡの場合、配列番号１のデオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃお よびＴは、それぞれリボヌクレオチドＡ、Ｇ、ＣおよびＵに置き換えられる。長 さが少なくとも15塩基の上記の核酸配列の断片もまた本発明に含まれる。この長 さは、断片が図１のタンパク質またはＧＤＦ−14の近縁ファミリーメンバーをコ ードするＤＮＡに生理的条件下で選択的にハイブリダイズするのを可能とするに 十分である。「選択的にハイブリダイズする」という用語は、無関係のヌクレオ チド配列を排除する中程度にまたは高度にストリンジェントな条件下でのハイブ リダイゼーションを意味する。 推定上のタンパク質分解プロセシング部位に続くＧＤＦ-14のＣ末端領域は、 ＴＧＦ−βスーパーファミリーの公知メンバーに有意な相同性を示す。ＧＤＦ-1 4配列は、他のファミリーメンバーにおいて高度に保存されている残基の殆どを 含有している（図１参照）。 組換えＧＤＦ-14一次アミノ酸配列のマイナーな改変は、本明細書に記載のＧ ＤＦ-14ポリペプチドに比較して実質的に同等の活性を有するタンパク質をもた らしうる。このような改変は、部位特異的突然変異誘発によるもののように意図 的なものも、また自然発生的なものもある。このような改変によってもたらされ たポリペプチドはすべて、ＧＤＦ-14の生物活性が存在するかぎり、本発明に包 含される。さらに、１個または複数のアミノ酸の欠失もまた、生物活性を有意に 変更することなく、結果として生ずる分子の構造の改変をもたらしうる。これは 、より広い有用性をもつ、より小さい活性分子の開発をもたらしうる。例えば、 ＧＤＦ-14生物活性に必要とされないアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸を除 去することができる。 本発明のＧＤＦ-14ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、開示され た配列およびその同類変形を包含する。ここで使用する「同類変形(conservativ e variation)」という用語は、アミノ酸残基を別の、生物学的に類似の残基で置 換することをさす。同類変形の例は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメ チオニン等の疎水性残基の別の疎水性残基との置換、またはある極性残基の別の 極性残基との置換（例えば、アルギニンをリシンに、グルタミン酸をアスパラギ ン酸に、またはグルタミンをアスパラギンに置換する）等を含む。「同類変形」 という用語は、置換したポリペプチドに対して作成された抗体が非置換ポリペプ チドとも免疫反応するならば、非置換親アミノ酸の代わりに置換したアミノ酸を 使用することをも含む。 本発明のＤＮＡ配列は、幾つかの方法によって取得できる。例えば、上記ＤＮ Ａは当分野で周知のハイブリダイゼーション技法を用いて単離することができる 。これらの方法には以下のものが含まれるがそれだけに限定されない。すなわち 、１）相同的ヌクレオチド配列を検出するための、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ ライブラリーのプローブとのハイブリダイゼーション、２）興味のあるＤＮＡ配 列とアニーリングが可能なプライマーを用いた、ゲノムＤＮＡまた はｃＤＮＡのポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）、および３）共通の 構造的特徴をもつクローン化ＤＮＡ断片を検出するための、発現ライブラリーの 抗体スクリーニングである。 好ましくは、本発明のＧＤＦ-14ポリヌクレオチドは哺乳動物、そして最も好 ましくはマウス、ラットまたはヒトから引き出される。核酸ハイブリダイゼーシ ョンに依存するスクリーニング手順は、適切なプローブがあれば、任意の生物か ら任意の遺伝子配列を単離することを可能とする。当該タンパク質をコードする 配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは、化学的に合成することが できる。このためには、アミノ酸配列の中の短い、一続きのオリゴペプチドが分 かっていなければならない。タンパク質をコードするＤＮＡ配列は遺伝子暗号か ら推論することができるが、暗号の縮重を考慮しなければならない。配列が縮重 している場合、混合付加反応を実施することができる。これは、変性２本鎖ＤＮ Ａの異種混合物を包含する。このようなスクリーニングのためには、１本鎖ＤＮ Ａまたは変性２本鎖ＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションを実施するのが好ま しい。興味のあるポリペプチドに関連するｍＲＮＡ配列が極めて少量しか存在し ない供給源より引き出したｃＤＮＡクローンの検出には、ハイブリダイゼーショ ンが特に有用である。つまり、非特異的結合を避けるためのストリンジェントな ハイブリダイゼーション条件を用いることにより、例えば、標的ＤＮＡと混合物 中の単一プローブ（該ＤＮＡの完全な相補体である）とのハイブリダイゼーショ ンによって、特定ｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフィーによる視覚化を可 能とすることができる(Wallaceら，Nucl．Acid Res.，9:879，1981;Maniatisら ，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor，N.Y.，1989 )。 ＧＤＦ-14をコードする特定ＤＮＡ配列の展開もまた、１）ゲノムＤＮＡから の２本鎖ＤＮＡの単離；２）興味のあるポリペプチドに必要なコドンを提供する ＤＮＡ配列の化学的製造；および３）真核ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆 転写による２本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成、によって得ることができる。後者 の場合、一般にｃＤＮＡと呼ばれる、ｍＲＮＡの２本鎖ＤＮＡ相補体が最後に形 成される。 組換え手順に使用する特定ＤＮＡ配列を展開するための上記の３つの方法のう ち、ゲノムＤＮＡ単離体の単離は最も一般的でない方法である。イントロンの存 在ゆえに、哺乳動物ポリペプチドの微生物による発現を得ることが望ましい場合 は、特にそうである。 所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が分かっている場合、ＤＮＡ 配列の合成はしばしば最良の方法である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の 全配列が分かっていない場合、ＤＮＡ配列の直接合成は不可能であり、最良の方 法はｃＤＮＡ配列の合成である。興味のあるｃＤＮＡ配列を単離するための標準 的手順の中に、高レベルで遺伝子を発現するドナー細胞中に豊富に存在するｍＲ ＮＡの逆転写によって引き出される、プラスミドまたはファージに担持されるｃ ＤＮＡライブラリーの形成がある。ポリメラーゼチェーンリアクション技術と組 み合わせて用いた場合、稀少な発現産物であってもクローン化が可能である。ポ リペプチドのアミノ酸配列の重要な部分が分かっている場合、標的ｃＤＮＡに存 在すると推定される配列を写した、標識化１本または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ プローブ配列の作成を、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション手順に採用しう る。この手順は、１本鎖形態に変性させたｃＤＮＡのクローン化コピーを用いて 実施される(Jayら，Nucl．Acid Res.，11:2325，1983)。 ＧＤＦ-14に特異的な抗体を用いて、少なくとも１個のエピトープを有するＧ ＤＦ-14ペプチドについて、λ gt11等のｃＤＮＡ発現ライブラリーを間接的にス クリーニングすることができる。そのような抗体はポリクローナル的またはモノ クローナル的に誘導して、ＧＤＦ-14ｃＤＮＡの存在を示す発現産物の検出に使 用することができる。 ＧＤＦ-14をコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主細胞へのＤＮＡ導入によりi n vitroで発現させることができる。「宿主細胞」とは、その中でベクターが増 殖可能であって、そのＤＮＡが発現される細胞をいう。この用語はまた、本宿主 細胞の任意の子孫をも包含する。全ての子孫が親細胞と同一ではないかもしれな い、ということが理解される。なぜなら、複製の際に起こる突然変異がありうる からである。しかし、「宿主細胞」という用語を用いるとき、そのような子孫も 包含される。安定した（外来ＤＮＡが宿主中に継続的に維持される、 の意）ＤＮＡ導入法は当分野で公知である。 本発明において、ＧＤＦ-14ポリヌクレオチド配列を組換え発現ベクターに挿 入することができる。「組換え発現ベクター」という用語は、ＧＤＦ-14遺伝子 配列の挿入または組み込みにより遺伝子的に操作された、プラスミド、ウイルス 、または当分野で公知の他の伝達体をいう。このような発現ベクターは、宿主の 挿入遺伝子配列の効率的転写を促進するプロモーター配列を含有する。発現ベク ターは典型的には複製起点、プロモーター、および形質転換細胞の表現型選択を 可能とする特定の遺伝子を含有する。本発明に使用するのに適切なベクターは、 以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、細菌における発現の ためのＴ７に基づく発現ベクター(Rosenbergら，Gene，56:125，1987)、哺乳動 物細胞における発現のためのpMSXND発現ベクター(LeeおよびNathans，J．Biol． Chem.，263:3521，1988)および昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス 由来のベクターである。ＤＮＡセグメントは、調節エレメント、例えばプロモー ター（例：Ｔ７、メタロチオネインＩ、またはポリヘドリンプロモーター）に機 能しうる形で連結されてベクター内に存在しうる。 ＧＤＦ-14をコードするポリヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物に おいて発現させることができる。宿主は、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物を 含みうる。真核生物またはウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を原核生物におい て発現させる方法は、当分野で周知である。宿主中で発現および複製が可能な、 生物的に機能性のウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターが、当分野で公知で ある。そのようなベクターは、本発明のＤＮＡ配列を組み込むために使用される 。好ましくは、ＧＤＦ-14の全コード配列を含有するｃＤＮＡクローンから、Ｇ ＤＦ-14の成熟Ｃ末端領域を発現させる。または、ＧＤＦ-14のＣ末端部分を、Ｔ ＧＦ−βファミリーの他のメンバーの前領域を有する融合タンパク質として発現 させるか、あるいは他の前領域とともに同時発現させることができる（例えば、 Hammondsら，Molec．Endocrin．5:149，1991；Gray，AおよびMason，A.，Scienc e，247:1328，1990参照）。 組換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の通常の技法によ り実施することができる。宿主が大腸菌等の原核生物の場合、ＤＮＡ取り込 みが可能なコンピテント細胞は、周知の手順を用いて指数増殖期の後に集菌し、 次いでCaCl₂法で処理した菌体から調製することができる。あるいは、MgCl₂また はRbClを用いることができる。所望であれば、宿主細胞の原形質体を形成してか ら形質転換を実施することもできる。 宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム共沈降法、マイクロインジェクショ ン、エレクトロポレーション等の通常の機械的手順、リポソームに封入したプラ スミドの挿入、またはウイルスベクター等のＤＮＡトランスフェクション法が使 用できる。真核細胞はまた、本発明のＧＤＦ-14をコードするＤＮＡ配列および 選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子（例えば、単純ヘルペスチ ミジンキナーゼ遺伝子等）を用いて、同時形質転換することができる。別な方法 は、サルウイルス40（SV40）またはウシパピローマウイルス等の真核細胞ウイル スベクターを用いて、真核細胞を一過性に感染させ、または形質転換し、タンパ ク質を発現させるものである（例えば、Eukaryotic Viral Vectors，Cold Sprin g Harbor Laboratory，Gluzman編，1982参照）。 微生物により発現された本発明のポリペプチド、またはその断片の単離および 精製は、分取クロマトグラフィー、およびモノクローナルまたはポリクローナル 抗体を使用する免疫学的分離を含む通常の手段により実施することができる。 本発明のＧＤＦ-14ポリペプチドは、ＧＤＦ-14ポリペプチドのエピトープに免 疫反応する、または結合する抗体を作成するためにも使用できる。異なる抗原決 定基特異性を有するプールされたモノクローナル抗体より本質的に成る抗体、お よび個別のモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は、上 記タンパク質の断片を含有する抗原から当業者に周知の方法により作成される(K ohlerら，Nature,256:495，1975；Current Protocols in Molecular Biology，A usubelら編，1989)。 本発明に用いる「抗体」という用語は、抗原決定基と結合可能な完全な分子お よびその断片(Fab、F(ab')₂およびFv、等）を包含する。これらの抗体断片は、 その抗原または受容体に選択的に結合する多少の能力を保持しており、以下の用 に定義される： （1）Fab:抗体分子の一価の抗原結合断片を含有する断片で、全抗体を酵素パパ インで消化し、完全なＬ鎖および一本のＨ鎖の一部を生じさせることにより作成 できる； （2）Fab'：抗体分子の断片で、全抗体をペプシンで処理し、次いで還元し、完 全なＬ鎖およびＨ鎖の一部を生じさせることにより得られる；抗体分子１個につ き２個のFab'断片が得られる； （3）F(ab')₂：全抗体を酵素ペプシンで処理し、その後の還元をしないで得るこ とができる抗体断片：F(ab')₂は、２つのジスルフィド結合によってつながれて いる２個のFab'断片からなる二量体である； （4）Fv：２本の鎖として発現されるＬ鎖の可変部およびＨ鎖の可変部を有する 、遺伝子工学的に作成された断片と定義される；および （5）１本鎖抗体（”SCA”）：適切なポリペプチドリンカーによって連結された Ｌ鎖の可変部およびＨ鎖の可変部を遺伝子工学的に融合させた１本鎖分子として 有する、遺伝子工学的に作成された分子と定義される。 これらの断片の作成方法は当分野で公知である（例えば、参照としてここに組 み入れるHarlowおよびLane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring H arbor Laboratory，New York，1988参照）。 本発明に用いる「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する、 抗原上の任意の抗原決定基を意昧する。抗原決定基は通常、アミノ酸または糖側 鎖等の化学的に活性な分子の表面配置からなり、そして通常特異的三次構造特性 および特異的電荷特性を有する。 本発明のＧＤＦ-14ポリペプチドに結合する抗体は、免疫感作抗原として、完 全なポリペプチドまたは興味のある小さいペプチドを含有する断片を用いて調製 することができる。動物を免疫感作するのに使用するポリペプチドまたはペプチ ドは、所望であればキャリアータンパク質と結合させることができる翻訳された ｃＤＮＡまたは化学合成物から誘導することが可能である。ペプチドに化学的に 結合させる、このような一般的に使用されるキャリアーは、スカシ貝ヘモシアニ ン(KLH)、チログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、および破傷風菌トキソイ ドを含む。次に、結合ペプチドは動物（例えば、マウス、ラット またはウサギ）を免疫感作するのに使用される。 所望であれば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体をさらに精製するこ とができる。例えば、マトリックスに結合させ、そしてポリペプチドまたはペプ チド（これに対して上記抗体が作成された）が結合しているマトリックスから溶 出させる、などして実施できる。当業者はポリクローナルおよびモノクローナル 抗体の精製および／または濃縮のための、免疫学技術において一般的な種々の技 法を知っているであろう（例えば、参照としてここに組み入れるColiganら，Uni t９，Current Protocols in Immunology，Wiley Interscience，1991参照）。 抗イディオタイプ技術を用いて、エピトープを模倣したモノクローナル抗体を 作成することもまた可能である。例えば、第１のモノクローナル抗体に対して作 成された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、超可変部に第１のモノクロー ナル抗体によって結合されたエピトープの「イメージ」である結合ドメインをも つであろう。 「細胞増殖疾患」という用語は、しばしば形態学的にも遺伝子型的にも周囲の 組織と相違するように見える悪性および非悪性細胞集団をさす。悪性細胞（例： ガン）は、多段階過程の結果として発生する。アンチセンス分子であるＧＤＦ-1 4ポリヌクレオチドは種々の器官系の悪性疾患を治療するのに有用である。本質 的に、ＧＤＦ-14の変更された発現と病因的に関連している任意の疾患は、ＧＤ Ｆ-14抑制試薬による治療が可能であると考えられる。そのような疾患の１つは 、例えば悪性細胞増殖疾患である。 本発明は、抗ＧＤＦ-14抗体をＧＤＦ-14関連疾患を有する疑いのある細胞と接 触させ、そして上記抗体への結合を検出することを含んでなる、細胞増殖疾患を 検出する方法を提供する。ＧＤＦ-14に反応性の抗体は、ＧＤＦ-14への結合の検 出を可能とする化合物を用いて標識される。本発明の目的のため、ＧＤＦ-14ポ リペプチドに特異的な抗体を使用して、体液および組織におけるＧＤＦ-14のレ ベルを検出することができる。検出可能な量の抗原を含有する任意の標本が使用 できる。疑わしい細胞におけるＧＤＦ-14のレベルを正常細胞におけるレベルと 比較して、被験者がＧＤＦ-14関連細胞増殖疾患を有するかどうかを決 定することができる。好ましくは、被験者はヒトである。 本発明の抗体は、in vitroまたはin vivo免疫診断または免疫療法を施すこと が望ましい任意の被験者に使用することができる。本発明の抗体は、例えば、イ ムノアッセイにおいて使用するのに適している。そこでは、上記抗体は液相で、 または固相キャリアーに結合させて使用できる。さらに、これらのイムノアッセ イにおける抗体は、種々の方法で検出可能に標識することができる。本発明の抗 体を使用できるイムノアッセイの種類の例は、直接または間接様式の競合および 非競合イムノアッセイである。そのようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノ アッセイ(RIA)およびサンドイッチ（免疫計量）アッセイである。本発明の抗体 を用いた抗原の検出は、フォワード、逆向き、または同時モードで行なわれるイ ムノアッセイ（生理的サンプルを用いる免疫組織化学的アッセイを含む）を用い て実施することができる。当業者は他のイムノアッセイ様式を知っているであろ う。または、過度の実験をすることなく容易に突き止めることができる。 本発明の抗体は、多数の異なるキャリアーに結合させて、本発明のポリペプチ ドを含む抗原の存在を検出するために使用できる。周知のキャリアーの例は、ガ ラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン 、アミラーゼ、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースお よび磁鉄鉱を含む。本発明の目的のためには、キャリアーの性質は可溶性であっ ても、不溶性であってもよい。当業者は、抗体を結合させるための他の適切なキ ャリアーを知っているか、または通常の実験を用いてそれらを突き止めることが できるであろう。 当業者に公知の多数の異なる標識および標識法が存在する。本発明に使用でき る標識の種類の例は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、化学発 光化合物、リン光化合物、および生物発光化合物である。当業者は、抗体に結合 させるための他の適切な標識を知っているか、または通常の実験を用いてそれら を突き止めることができるであろう。 より大きい感受性をもたらしうる別の技法は、抗体を低分子量のハプテン類に 結合させることからなる。次に、第２反応という手段により、これらのハプ テン類を特異的に検出することが可能である。例えば、アビジンと反応するビオ チン、または、特異的抗ハプテン抗体と反応することができるジニトロフェニル 、プリドキサール(puridoxal)、およびフルオレセイン等のハプテン類を使用す るのが一般的である。 本発明のモノクローナル抗体を抗原のin vivo検出のために使用する場合は、 検出可能に標識した抗体を診断的に有効な投与量で投与する。「診断的に有効」 という表現は、検出可能に標識したモノクローナル抗体を、本発明のポリペプチ ド（上記抗体は、これに対して特異的である）を含む抗原を有する部位の検出を 可能とするのに十分な量で投与することを意味する。 投与される検出可能に標識したモノクローナル抗体の濃度は、上記ポリペプチ ドを有する細胞への結合がバックグラウンドに比較して検出可能であるほど、十 分でなければならない。さらに、最良の標的対バックグラウンドシグナル比をも たらすために、検出可能に標識したモノクローナル抗体は迅速に循環系から除去 されることが望ましい。 概して、in vivo診断のための検出可能に標識したモノクローナル抗体の投与 量は、年齢、性別、および個人の疾患の程度、等の因子によって変わる。そのよ うな投与量は、例えば、多数の注射が行なわれるかどうか、抗原負荷、および当 業者に公知の他の因子によって変わりうる。 in vivo診断イメージングのためには、利用可能な検出機器の種類が放射性同 位体を選択する上での主要な因子である。選択された放射性同位体は、与えられ た種類の機器で検出可能な種類の崩壊を有するものでなければならない。in viv o診断のための放射性同位体の選択におけるさらに別の重要な因子は、宿主に対 して危険な放射を最小限にすることである。理想的には、in vivoイメージング に使われる放射性同位体は粒子放出を欠くものであるが、140〜250keVの範囲で 多数の光子を生じる。これらの光子は通常のガンマカメラで容易に検出できる。 in vivo診断のためには、放射性同位体を直接、または中間の官能基を用いて 間接に、免疫グロブリンに結合させることができる。金属イオンとして存在する 放射性同位体を免疫グロブリンに結合させるためにしばしば用いられる中 間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、エチレンジアミン四酢酸(EDT A)および類似の分子等の二官能キレート化剤である。本発明のモノクローナル抗 体に結合させることのできる金属イオンの典型的例は、¹¹¹In、⁹⁷Ru、⁶⁷Ga、⁶⁸G a、⁷²As、⁸⁹Zrおよび²⁰¹Tlである。 本発明のモノクローナル抗体もまた、磁気共鳴画像法(MRI)または電子スピン 共鳴(ESR)等におけるin vivo診断のため、常磁性同位体を用いて標識することが できる。一般に、診断画像を視覚化するための任意の常用の方法が使用できる。 通常は、γおよび陽電子を放出する放射性同位体がカメライメージングに、また 常磁性同位体がMRIに使用される。そのような技法において特に有用な元素は、^{1 57} Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Crおよび⁵⁶Feである。 本発明のモノクローナル抗体は、被験者におけるＧＤＦ-14関連疾患の改善の 経過をin vitroおよびin vivoでモニターするのに使用できる。したがって、例 えば、本発明のポリペプチドを含む抗原を発現する細胞数の増加または減少、あ るいは種々の体液中に存在するそのような抗原の濃度変化を測定することにより 、ＧＤＦ-14関連疾患の改善を目的とする特定の治療法が有効かどうかを決定す ることが可能であろう。「改善する」という用語は、治療を受けている被験者に おいて、ＧＤＦ-14関連疾患の有害な影響が少なくなることをさす。 本発明は、正常細胞における発現と比較して、変わった様式で発現されている 可能性のあるヌクレオチド配列を同定する。それゆえ、この配列に向けられた適 切な治療または診断技法を設計することが可能である。したがって、細胞増殖疾 患がＧＤＦ-14の発現と関連している場合は、翻訳レベルでＧＤＦ-14発現を妨害 する核酸配列が使用できる。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸およ びリボザイムを使用して、ｍＲＮＡをアンチセンス核酸でマスキングするか、ま たはそれをリボザイムで開裂することにより、特定のＧＤＦ-14ｍＲＮＡの翻訳 をブロックする。 アンチセンス核酸とは、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮ ＡまたはＲＮＡ分子である(Weintraub，Scientific American，262:40，1990)。 細胞において、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡとハイブリダイズし、２本 鎖分子を形成する。アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡの翻訳を妨害する。な ぜなら、細胞は２本鎖となったｍＲＮＡを翻訳しないからである。約15個のヌク レオチドよりなるアンチセンスオリゴマーが好ましい。なぜなら、それらは簡単 に合成され、そして標的のＧＤＦ-14産生細胞に導入された時、大きい分子より も問題を起こさないからである。遺伝子のin vitro翻訳を抑制するためのアンチ センス法の使用は、当分野で周知である(Marcus-Sakura，Anal．Biochem.，172: 289，1988)。 リボザイムは、ＤＮＡ制限酵素と類似の方法で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切 断することのできるＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチ ド配列を修飾することによって、ＲＮＡ分子中の特異的ヌクレオチド配列を認識 し、これを切断する分子を作製することができる（Cech，J．Amer．Med.Assn.， 260:3030，1988）。このアプローチの主な利点は、これが配列特異的であるため に特定の配列をもつｍＲＮＡのみが不活性化されることである。 リボザイムには、テトラヒメナ型（Hasselhoff，Nature，334:585，1988）と “ハンマーヘッド”型の２つの基本的型がある。テトラヒメナ型リボザイムは長 さ４塩基の配列を認識し、“ハンマーヘッド”型リボザイムは長さ１１−１１８ 塩基の塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、配列が標的ｍＲＮＡで示す排 他性が高くなる。従って、ハンマーヘッド型リボザイムがテトラヒメナ型リボザ イムよりも特定ｍＲＮＡ種を不活性化するうえで好ましく、１８塩基の認識配列 が短い認識配列よりも好ましい。 本発明はまた、ＧＤＦ−14タンパク質によって媒介される細胞増殖性または免 疫性疾患の治療のための遺伝子治療を提供する。このような治療は増殖性疾患を 有する細胞中にＧＤＦ−14アンチセンスポリヌクレオチドを導入することによっ て治療効果を達成する。アンチセンスＧＤＦ−14ポリヌクレオチドの送達は、キ メラウイルスやコロイド分散系などの組換え発現ベクターを用いて達成すること ができる。アンチセンス配列を治療用に送達するのに特に好ましいのはターゲッ ティングされたリポソームを使用することである。 本明細書で教示する遺伝子治療に使用できる各種ウイルスベクターには、アデ ノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアまたは好ましくはレトロウイルスな どのＲＮＡウイルスを含む。好ましくは、レトロウイルスベクターはネズ ミまたはトリレトロウイルスの誘導体である。１つの外来遺伝子を挿入すること のできるレトロウイルスベクターの例には、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍ ｏＭｕＬＶ）、ハーベイネズミ肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳癌ウイ ルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）を含むがこれに限定さ れない。さらに多数のレトロウイルスベクターが複数の遺伝子を導入することが できる。これらすべてのベクターは、形質導入された細胞が同定、生成できるよ うに選択可能なマーカー用の遺伝子を伝達または導入することができる。例えば 、特定標的細胞上の受容体のためのリガンドをコードする別の遺伝子とともに、 関心のあるＧＤＦ−14配列をウイルスベクターに挿入することによって、ベクタ ーはターゲット特異性となる。レトロウイルスベクターは例えば糖、糖脂質、ま たはタンパク質を結合させることによってターゲット特異性とすることができる 。レトロウイルスベクターをターゲットとする抗体を用いることによって好まし いターゲッティングを達成することができる。当業者であれば過度の実験を行う ことなく、ＧＤＦ−14アンチセンスポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベク ターをターゲット特異的に送達できるようにレトロウイルスゲノム中に挿入した り、あるいはウイルスエンベロープに結合させることのできる特異的ポリヌクレ オチド配列を知ることができ、また容易に確認することができる。 組換えレトロウイルスは欠損性であるので、感染ベクター粒子を生成するには 補助を必要とする。この補助は例えば、ＬＴＲ中の制御配列のコントロール下に レトロウイルスの構造遺伝子すべてをコードするプラスミドを含むヘルパーセル ラインを用いることによって提供することができる。これらのプラスミドは、封 入化のためのＲＮＡ転写物を認識するパッケージングメカニズムを可能にするヌ クレオチド配列をもたない。パッケージングシグナルを欠失するヘルパーセルラ インには、例えばψ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２を含むが、これに限定されな い。ゲノムは全くパッケージングされないので、これらのセルラインは空のビリ オンを作り出す。もしもパッケージングシグナルが完全であるが構造遺伝子が関 心のある別の遺伝子で置き換わった細胞中にレトロウイルスベクターを導入した 場合には、ベクターはパッケージングされベクタービリ オンが作り出される。 あるいは、慣用のリン酸カルシウムトランスフェクションを用いてレトロウイ ルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードするプラスミドでＮＩＨ３ Ｔ３またはその他の組織培養細胞を直接トランスフェクトできる。これらの細胞 を次に関心のある遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトする。得 られる細胞は培地中にレトロウイルスベクターを放出する。 ＧＤＦ−14アンチセンスポリヌクレオチドのための別のターゲッティングされ た送達系はコロイド分散系である。コロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノ カプセル、小球、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルお よびリポソームを含む脂質系を含む。本発明の好ましいコロイド系はリポソーム である。リポソームはin vitroおよびin vivoでの送達ベヒクルとして有用な人 工膜小胞である。０．２−４．０μｍの大きさの単ラメラ小胞（ＬＵＶ）は巨大 分子を含む水性バッファーの実質的部分を封入することができることが知られて いる。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび完全なビリオンを水性の内部に封入して生物学的に 活性な形で細胞に送達することができる（Fraley，et al.，Trends Biochem．Sc i.，6:77，1981）。哺乳動物に加えて、リポソームは植物、酵母および細菌細胞 にポリヌクレオチドを送達するのにも使用できる。リポソームが有用な遺伝子伝 達ベヒクルとなるためには、以下の特徴が存在していなければならない：（１） 生物学的活性を損なうことなく高率で関心のある遺伝子を封入できること、（２ ）非標的細胞に比較して標的細胞に優先的かつ実質的に結合すること、（３）高 率で標的細胞の細胞質に小胞の水性含有物を送達すること、および（４）遺伝子 情報が正確かつ有効に発現すること（Mannino，et al.，Biotechniques，6:682 ，1988)。 リポソームの組成は通常ステロイド、特にコレステロールと組み合わせたリン 脂質、特に高相転移温度（high-phase-transition-temperature）リン脂質の組 み合わせである。その他のリン脂質または脂質も使用できる。リポソームの物理 的性質はｐＨ、イオン強度、および２価カチオンの存在に依存する。 リポソーム製造に使用できる脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホ スファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールア ミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドおよびガングリオシドなどのホスファチジ ル化合物を含む。特に有用なのは、脂質部分が１４−１８炭素原子、特に１６− １８炭素原子を含み飽和であるジアシルホスファチジルグリセロールである。リ ン脂質の例には卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン およびジステアロイルホスファチジルコリンを含む。 リポソームのターゲッティングは解剖学的および機械的要因に基づいて分類で きる。解剖学的分類は選択性のレベル、例えば器官特異性、細胞特異性およびオ ルガネラ特異性に基づく。機械的ターゲッティングはそれが受動か能動かに基づ いて区別できる。受動ターゲッティングは、類洞毛細管を含む器官内の細網内皮 系（ＲＥＳ）の細胞へのリポソームの自然な分布傾向を利用する。一方、能動タ ーゲッティングは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質などの特 異的リガンドへのリポソームの結合によるか、あるいは自然に起きる局在部位以 外の器官および細胞型へのターゲッティングを達成するためにリポソームの組成 や大きさを変更することによるリポソームの変更を含む。 ターゲッティング送達系の表面は各種の方法で修飾することができる。リポソ ームターゲッティング送達系の場合、標的リガンドをリポソーム二重層と安定な 関係に維持するために脂質基をリポソームの脂質二重層に挿入することができる 。脂質鎖をターゲッティングリガンドと結合するために各種の結合基を用いるこ とができる。 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体には、細胞増殖性および 免疫性疾患の治療を含む様々な用途がある。さらに、ＧＤＦ−14は各種の遺伝子 治療法に使用できる。 以下の実施例は本発明を説明するものであってこれを限定するものではない。 これらの実施例は典型的使用例を示すものであるが、当業者に公知のその他の方 法もこれに代えて使用できる。実施例１ ：新規なＴＧＦ−βファミリーメンバーの同定と単離 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＣＴＲ34（5'-CCCGAATTCCGTTGCTGCC GTCTGCACACG-3'）およびＣＴＲ35（5'-CCCGAATTCGCACGCAGCAGGGCGCTGG-3'）のプ ライマーを用いてＧＤＦ−14を単離した。ＰＣＲは、94℃で１分間、50℃〜6０ ℃で２分間および72℃で１分間を40サイクル行った後、94℃で１分間、50℃〜60 ℃で２分間および72℃で４分間を１サイクル行った。ＰＣＲ産物をEcoRIで消化 し、アガロースゲルで電気泳動した。約200塩基対の長さの産物を切出し、精製 し、Bluescriptベクターにクローニングした。個々のサブクローンのＤＮＡ配列 分析によりＧＤＦ−14クローンを同定した。次に、このクローンを用いて、ヒト 胎盤ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene）をスクリーニングした。ライブラリー のスクリーニングおよびｃＤＮＡインサートの特性決定は先に記載（Lee，Mol． Endocrinol.，4:1034，1990）のようにして行った。 最も長いＧＤＦ−14ｃＤＮＡクローン（1.6kbのインサート）の部分ヌクレオ チド配列を図１に示す。この配列は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの既知のメ ンバーに対して有意な相同性を示すタンパク質をコードするオープンリーディン グフレームを含む。この配列は、推定上のRXXRタンパク質分解プロセシング部位 を含み、その後にＴＧＦ−βスーパーファミリーの特徴の全てを含む１12個のア ミノ酸からなる配列がつづく。図２は、ＧＤＦ−14とＴＧＦ−βスーパーファミ リーの他のメンバーとのＣ末端部分の比較を示す。ＧＤＦ−14は、Ｖｇｒ−１お よびＢＭＰ５に最も相同である（32％の同一性）。ＴＧＦ−βおよびインヒビン −βと同様に、ＧＤＦ−14は、推定上の開裂部位の後に９個のシステイン残基を 含有する。既知のファミリーメンバーから類推して、Ｃ末端の112個のアミノ酸 の二量体は、活性なＧＤＦ−14分子を提示すると推定される。実施例２ ：ＧＤＦ−14の発現 ＧＤＦ−14の発現パターンを調べるため、各種ヒト組織(Clontech)から調製し たＲＮＡサンプルを含むノーザンブロットをＧＤＦ−14を用いて釣り上げた。Ｒ ＮＡの単離とノーザン分析は文献（Lee，Mol．Endocrinol.，4:1034，1990）記 載の方法で行い、ただしハイブリダイゼーションは５ｘＳＳＰＥ、１０％硫酸デ キストラン、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌサケＤＮＡお よび各０．１％のウシ血清アルブミン、フィコールおよびポリビニルピ ロリドン中で行った。図３に示すように、ＧＤＦ−14プローブは、心臓、脳、胎 盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓を含むブロット上に存在する全てのサン プルにおいて、ＲＮＡ種を検出した。 本発明を現在好ましい態様と関連させて説明したが、本発明の精神を逸脱する ことなく各種の修飾が可能なことが理解されよう。従って本発明は以下の請求の 範囲によってのみ限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ 49/00 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ０７Ｋ 14/52 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/53 33/577 Ｂ 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的に純粋な増殖分化因子−14（ＧＤＦ−14）。 ２．請求項１のＧＤＦ−14ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオ チド配列。 ３．ＧＤＦ−14ヌクレオチド配列が次のａ〜ｆ： ａ．Ｔｂ５Ｕであり得る図１； ｂ．図１に相補的な核酸配列； ｃ．鎖長が少なくとも１５塩基で、図１のＧＤＦ−14ポリペプチドをコードす るＤＮＡに選択的にハイブリダイズするａまたはｂの断片； よりなる群から選ばれる、請求項２に記載のポリヌクレオチド配列。 ４．ポリヌクレオチドが哺乳動物の細胞から単離される、請求項２に記載のポリ ヌクレオチド配列。 ５．哺乳動物の細胞がマウス、ラットおよびヒトの細胞よりなる群から選ばれる 、請求項４に記載のポリヌクレオチド配列。 ６．請求項２のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 ７．ベクターがプラスミドである、請求項６に記載のベクター。 ８．ベクターがウイルスである、請求項６に記載のベクター。 ９．請求項６のベクターで安定に形質転換された宿主細胞。 10．細胞が原核細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。 11．細胞が真核細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。 12．請求項１のポリペプチドまたはその断片に結合する抗体。 13．抗体がポリクローナルである、請求項12に記載の抗体。 14．抗体がモノクローナルである、請求項12に記載の抗体。 15．請求項12の抗体を、ＧＤＦ−14関連疾患の疑いがある被検者の検体と接触さ せ、該抗体の結合を検出することを含んでなる、細胞増殖性疾患の検出方法。 16．検出をin vivoで行う、請求項15に記載の方法。 17．抗体が検出可能に標識される、請求項16に記載の方法。 18．検出可能な標識が放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物および化学 発光化合物よりなる群から選ばれる、請求項17に記載の方法。 19．検出をin vitroで行う、請求項15に記載の方法。 20．抗体が検出可能に標識される、請求項19に記載の方法。 21．標識が放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物およ び酵素よりなる群から選ばれる、請求項20に記載の方法。 22．細胞を、ＧＤＦ−14活性を抑制する試薬と接触させることを含んでなる、Ｇ ＤＦ−14の発現と関連した細胞増殖性疾患または免疫疾患の治療方法。 23．試薬が抗ＧＤＦ−14抗体である、請求項22に記載の方法。 24．試薬がＧＤＦ−14アンチセンス配列である、請求項22に記載の方法。 25．ＧＤＦ−14活性を抑制する試薬がベクターを用いて細胞に導入される、請求 項22に記載の方法。 26．ベクターがコロイド分散系である、請求項25に記載の方法。 27．コロイド分散系がリポソームである、請求項26に記載の方法。 28．リポソームが本質的にターゲット特異性である、請求項27に記載の方法。 29．リポソームが解剖的にターゲッティングされる、請求項28に記載の方法。 30．リポソームが機械的にターゲッティングされる、請求項29に記載の方法。 31．機械的ターゲッティングが受動的である、請求項30に記載の方法。 32．機械的ターゲッティングが能動的である、請求項30に記載の方法。 33．リポソームが糖、糖脂質およびタンパク質よりなる群から選ばれる成分とカ ップリングすることにより能動的にターゲッティングされる、請求項32に記載の 方法。 34．タンパク質成分が抗体である、請求項33に記載の方法。 35．ベクターがウイルスである、請求項34に記載の方法。 36．ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項35に記載の方法。 37．ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求項36に記載の方法。 38．レトロウイルスが本質的にターゲット特異性である、請求項37に記載の方法 。 39．ターゲット特異性の成分がレトロウイルスゲノムに挿入されたポリヌクレオ チドによりコードされる、請求項38に記載の方法。 40．ターゲット特異性の成分が糖、糖脂質およびタンパク質よりなる群から選ば れる、請求項38に記載の方法。 41．タンパク質が抗体である、請求項40に記載の方法。