JP2000506361A - 細胞内および核内輸送に使用しうるイムノベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的に活性な成分をイムノベクターとカップリングするための生成物であって、該イムノベクターが生物学的に活性な成分に真核細胞にインターナリゼーションする能力を付与でき、前記イムノベクターが細胞核内又は細胞核の間近に該生物学的に活性な成分を導入することができる程度に細胞のＤＮＡに対して親和性を有することを特徴とする生成物。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞内および核内輸送に使用しうるイムノベクター 本発明は、真核細胞の核内へのハプテン、タンパク質、核酸および他の分子の 能動的導入に関する。本発明は、種々の分野、特に遺伝子治療およびワクチンの 分野に適用することができるため、非常に重要である。 遺伝子治療は、依然として非常に多数のパラメーターに左右され、そのような パラメーターとしては、宿主生物のこれらの細胞の細胞質を経由して前もって決 定された特定の性質を有する活性成分を該生物の細胞核内へ輸送しうるベクター であって、これらのベクターの使用に関連した遺伝的改変を伴うことのないベク ターを開発すること、および導入する活性成分の生物活性を低下させないことが 挙げられる。現在知られている限りにおいては、これらのすべての条件が満たさ れているとは到底言うことができない(１)。 実際、細胞内にＤＮＡを導入するために現在一般的に使用されている方法とし ては、ＤＮＡがリン酸カルシウムまたはDEAE−デキストランと共沈する性質を利 用する一般的な非選択的方法、又はこのほかには、電場の影響下で細胞内へＤＮ Ａを直接導入する（エレクトロポレーション）方法が挙げられる。これらの方法 は、細胞に非常に有毒であり、用いる細胞によっては高い死亡率および高い変異 性につながる。他の方法は、細胞膜上に存在する受容体による細胞内への該遺伝 子の進入のターゲッティングを利用する。ついでＤＮＡは、これらの受容体に特 異的なリガンド［アシアロオロソムコイド(２)、インスリン（３）またはトラン スフェリン(４)］または膜構成成分に特異的な抗体（５）のいずれかを介して細 胞内に浸透する。このＤＮＡ／リガンドコンプレックスは、エンドサイトーシス の過程により細胞内に浸透する。したがって、このトランスフェクションは、リ ソソーム小胞中での該コンプレックスの実質的な分解により制限されてしまう。 これらの欠点を克服するために種々の方法が提案されており、特に、クロロキン によりリソソーム画分を遮断する方法、あるいは該エンドサイトーシス小胞の膜 を分解することによりエンドソーム画分から逃れるアデノウイルスを同 時に加える方法が挙げられる(６)。 本発明の目的は、現在までにその用途が考えられているウイルスベクターより 効率的かつ安全な新しいタイプのベクターを提供することである。 したがって、本発明は、生物学的に活性な成分とこれらの新規ベクター（以下 「イムノベクター」と称する）の１つとの間のカップリング生成物であって、前 記カップリング生成物が、これらのイムノベクターに共有結合または非共有結合 された前記の生物学的に活性な成分の真核細胞内でのインターナリゼーションを 可能にするイムノベクターの能力によって、及び、前記イムノベクターが、これ らの細胞の核の間近またはこれらの細胞の核内に前記の生物学的に活性な成分を 導入しうる程度までの、これらの細胞のＤＮＡに対する親和性によって特徴づけ られるカップリング生成物に関する。 好ましくは、これらのイムノベクターは、これらの細胞内のＤＮＡ配列を認識 しうる抗体または抗体の断片であり、これに生物学的に活性な成分が共有結合ま たは非共有結合していてもよく、更に、これらの抗体又は抗体断片は、これらの 生物学的に活性な成分をこれらの細胞の膜または細胞質を経由してインビトロお よびインビボで輸送し、該成分をこれらの細胞の核の付近または更にその内部に さえも輸送しうる。 本明細書中では、「生物学的に活性な成分」なる語は、問題となっている生物 活性型を有する任意の分子、高分子または分子群に関するものであると理解され る。 本発明はまた、特にハプテン、タンパク質および／または核酸を細胞、特に真 核細胞の核内に導入する方法であって、この方法が前記イムノベクターの特性の 利用に基づく方法に関する。 播種状エリテマトーデス（DLE）の患者から得た血清を含有する培地中でイン ビトロでヒトリンパ球細胞をインキュベートした場合にヒトリンパ球の核内に浸 透しうる抗体の存在は、１９７８年にAlarcon-Segoviaらにより初めて報告され た(７)。その後、同じチームにより、これらの抗体がIgGアイソタイプの抗体で あり、遊離のまたはタンパク質とコンプレックスを形成したリボ核酸と反応しう ることが示された(８)。最近、この型の抗体が、MRL lpr/lpr狼瘡マウス で検出されたが、さらに、溶血性自己免疫疾患症候群のNZBマウスおよび正常なB ALB/cマウスにおいても検出されている。これらのマウスの脾臓から調製された いくつかのモノクローナル抗体は、培養中に維持された細胞の核内にインビトロ で浸透しうることが判明している(10〜13)。ヒトの場合と同様に、これらのモノ クローナル抗体は、核酸を認識しうることが認められた。さらに、これらの抗体 はまた、マウスに注射されると、いくつかの型の細胞内に、そして最終的にはそ れらの核内に浸透しうることが示された(11)。 本発明は、この型の抗体またはこれらの抗体の断片が、対応する細胞の膜およ び細胞質を経由して、ハプテン、タンパク質、核酸などの生物学的に活性な成分 を輸送し、前記細胞の核内への該成分の導入を保証しうるベクター（以下、「イ ムノベクター」と称する）としても使用することができるという知見に由来する ものである。 これらの抗体は、血清（特に、対応するエピトープを有する核酸断片に対して 前もって免疫された動物からのもの）からのポリクローナル形態またはモノクロ ーナル抗体を分泌するハイブリドーマからのモノクローナル形態として得てもよ い。 任意の型の結合、即ち化学結合又はその他の結合を用いて、核酸に親和性を有 する抗体または抗体断片型のイムノベクターを、例えばハプテンまたは核酸のよ うな生物学的に活性な成分へカップリングさせること（これは、該成分を細胞の 膜および細胞質を経由して輸送する事を目的とする。）を保証し、これらの活性 成分を核内へ導入することを保証することができる。 好ましくは、共有結合または非共有結合の形成を可能にする化学的カップリン グ様式を用いる。 好ましいカップリング生成物は、イムノベクターが、細胞透過試験により選別 可能なものである。該細胞透過試験は、該イムノベクターと結合しうる活性成分 が輸送されるべき該細胞の核内において、培養中の細胞の存在下で、関心のある イムノベクターを第１インキュベーションに付し、ついで、該細胞を固定し透過 可能とした後、標識された抗イムノベクター抗体と共に更にインキュベートし、 最後に、該核の間近または該核の内部においてさえも、該イムノベクターと該抗 イムノベクター抗体との抗原−抗体免疫反応を検出することを具備する。 本発明の好ましいイムノベクターとしては、核酸に対して親和性を有する抗体 またはこの親和性を保持するその断片が挙げられる。 また、細胞、特にリンパ球様細胞に対する結合能を有する抗体を使用すること もできる。また、後者の部類のイムノベクターは、さらに、関心のあるイムノベ クターをリンパ球様細胞と共にインキュベートし、該リンパ球様細胞を洗浄し、 標識された抗イムノベクター抗体と共に該細胞をインキュベートし、各集団内の 陽性細胞の数を測定することを具備する試験により選択されうる。 １つの実施態様では、用いるリンパ球様細胞は、狼瘡症候群が現れている自己 免疫マウス脾細胞である。 該カップリング生成物のための好ましいイムノベクターは、モノクローナルIg G、(Fab')2または(Fab')断片、または対応する核酸の認識に関与する抗体の部位 に対応する任意のポリペプチドから選ばれる。 好ましくは、このイムノベクターは、抗ＤＮＡ活性を保持し、正常な個体から 得られる免疫グロブリン、特にIgGである。 さらに、このイムノベクターは、抗ＤＮＡ活性を保持し、自己免疫症候群、特 に播種状エリテマトーデス症候群を現している個体から得られるIgGであっても よい。 本発明の特定の実施態様では、活性成分にカップリングするイムノベクターは 、一方ではＤＮＡを、他方ではHIVレトロウイルスのTat、Revなどのタンパク質 、およびCD3、CD4、CD8、CD19、CD34などの表面マーカーを認識する二重特異性 抗体である。 好ましくは、イムノベクターにカップリングする生物学的に活性な成分は、特 に、核酸、タンパク質、特に酵素、例えばペルオキシダーゼ、ハプテン、特にビ オチンまたはフルオレセイン、酵素活性化剤または阻害剤および医薬から選ばれ る分子である。 好ましい実施態様では、カップリングされる核酸はポリヌクレオチドであり、 イムノベクターはIgGであり、該カップリングは、ポリヌクレオチド４分子当た りイムノベクター１分子の割合でｐ−ベンゾキノンを介して行なわれる。 好ましく使用される生物学的に活性な成分は、プラスミドに含有される遺伝子 にコードされるタンパク質の発現のために標的細胞の核内に組込むことが意図さ れる該プラスミドよりなる。そのようなプラスミドを、ＤＮＡに対して親和性を 有する抗体型のイムノベクターにカップリングさせる場合には、好ましくは、こ のイムノベクターを、ＤＮＡに対する圧縮効果を誘導しうる物質（この物質は、 好ましくは、ポリリジンである。）に前もってカップリングさせる。 実際に、ポリリジンは、そのカチオン性によりＤＮＡを圧縮する能力を有し、 細胞のトランスフェクションを促進する。カップリング剤（特に、EDC（1−(3− ジメチノレアミノプロピル)−1'−エチルカルボジイミド）のようなカルボジイ ミド）の助けによりポリリジンをイムノベクターにカップリングさせることによ り、該ＤＮＡをこれと反応させることが可能となる。これは、プラスミドのサイ ズの活性成分に抗体をカップリングさせる場合にマスクされることがある抗体の 活性部位の遊離を誘導する効果を有する。 また、これらのカチオン性によりＤＮＡに対する圧縮効果を有しうる他の物質 を（２−６）イムノベクターにカップリングさせて、そのような機能を達成させ てもよい。 さらに詳しくは、好ましく使用される生物学的に活性な成分は、標的細胞のゲ ノム中に、特に相同的組換えにより組込むことを意図した遺伝子、特に、細菌ま たは真核細胞、真菌細胞またはウイルスに由来するポリペプチド（このペプチド はワクチン特性を有する。）をコードする核酸配列を含有する「裸」のＤＮＡよ りなる。 有利には、この活性成分は、選択された細胞型、特にマクロファージ、樹状細 胞、ＢおよびＴ細胞、および造血細胞、特にヒト由来のものの不死化を可能とす る。 さらにより好ましくは、この生物学的に活性な成分は、例えばHIVレトロウイ ルスが感染しうる細胞または腫瘍細胞において、タンパク質またはヌクレオチド の合成を抑制しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。 したがって、本発明者らは一方では、狼瘡症候群の自己免疫マウス(NZB×NZW) F1の脾臓から、ＤＮＡと反応する能力および細胞核まで浸透する 能力に関して選択されたIgGモノクローナル抗体を得ることを試みた。同時に、 ＤＮＡと反応し細胞核内に浸透しうるポリクローナル抗体をアフィニティークロ マトグラフィーにより単離した。このクロマトグラフィーは、正常患者の血清の 「貯蔵物(pool)」または正常な個体の血清、好ましくは感染症に罹患した患者か ら得た血清、特にDLEに罹患した正常患者の血清またはマウス(NZB×NZW)F1血清 に適用した。 本発明のイムノベクターの選択方法では、イムノベクターの細胞浸透の試験は 、該イムノベクターを含む培地中で真核細胞系を第１インキュベーション（好ま しくは次第に濃度を増加させる）に付し、ついで固定し、必要な場合にはこれら の細胞を透過可能とし(その逆もある)、ついで該細胞系を抗イムノベクター抗体 （好ましくはフルオレセインまたはペルオキシダーゼで標識されているもの）と インキュベートし、このように標識された抗体を該細胞の核付近へ、より好まし くは核内へ局在化させることを具備する。該細胞系は、特に、繊維芽細胞、胸腺 細胞または脾細胞から選択される。 第１インキュベーションは、しばしば、５×10³から５×10⁶細胞/mlの濃度で 接種された細胞系について、約１〜70μg/mlのイムノベクター濃度で37℃で約２ から８時間行なうが、これらの反応条件は限定的なものではない。 該方法の実施態様の１つでは、該細胞系は、2×10⁴細胞/mlの濃度で接種され た指数増殖中の繊維芽細胞系、または約10⁶細胞/mlの割合で懸濁されたBALB/cマ ウスの胸腺細胞または脾細胞である。 さらに、本発明は、イムノベクター−分子カップリング生成物の製造法であっ て、該イムノベクターが、抗体、特に、選択方法により得られたIgG、(Fab')2ま たは(Fab')断片、または該分子の輸送に関与する抗体または抗体断片の部位に対 応する任意のポリペプチドから選択される製造法に関する。 本発明のカップリング生成物の製造法においては、生物学的に活性な生成物の 少なくとも１つの分子が各イムノベクターにカップリングされることが保証され 、前記分子は該イムノベクターに好ましくは共有結合で結合する。 以下の具体例においては、ハプテン、例えばフルオレセインおよびビオチン、 小分子、例えばホルモン、タンパク質、好ましくは酵素、酵素阻害剤または活性 化剤および医薬、例えば抗ウイルス剤、例えばアシクロビルまたはAZTが、処理 された細胞の細胞質を経由して能動輸送され、該細胞の核内へ導入されうる条件 を例示する。特に、活性イソチオシアネート基を介してフルオレセインを、そし て活性スクシンイミドエステルを介してビオチンを、イムノベクターの遊離アミ ノ基にカップリングさせる。イムノベクターへのハプテンなどのカップリングは 、例えば、優先的に反応するアルキル、ハロアリール、ハロアセチルおよびピリ ジルジスルフィド基の誘導体、マレイミドなどの、該アミノ基と反応しうるイミ ドエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルなどの文献公知の他 のホモまたはヘテロ二官能性架橋基または試薬を用いて、あるいはスルフヒドリ ル基、カルボジイミド、並びに光活性化されうる基を有する分子、例えばアジド ベンゾイルヒドラジドによって行なってもよい(13)。 さらに、本発明者らは、イムノベクターが標的抗原に対する二重特異性抗体で あるカップリング生成物を製造し、化学的ルートまたは遺伝子工学的ルートのい ずれかにより該カップリング生成物を構築し、同時に、前記標的抗原で個体（例 えばマウス）を免疫し、好ましくは前記標的抗原と反応する二重特異性抗体であ るイムノベクターを選択して、イムノベクターの作用を特異的に方向づけした。 二重特異性抗体の合成に関する技術は、特に、Porstmannら(1984、(16))(「分 子ハイブリダイゼーションで使用するための二重特異性モノクローナル抗体の開 発(Development of a bispecific monoclonal antibody for use in molecular hybridisation)」と題されている研究)に記載されており、さらに、Auriolら(17) により１９８４年に公開されている。 有利には、この方法で使用する二重特異性抗体は、とりわけ、HIVレトロウイ ルスのタンパク質Tat、Revおよび表面マーカーCD3、CD4、CD8、CD19およびCD34 を認識する。 さらに、本発明は、選択された真核細胞の核に活性成分を導入する方法であっ て、この活性成分とイムノベクターとをカップリングによって特徴づけられ、該 イムノベクターがこれらの真核細胞内のこの活性成分のインターナリゼーション を可能にする能力を有し、かつ、前記イムノベクターがこれらの細胞の間近、又 は核内においてこの生物学的に活性な成分を輸送することができる程度にまでこ れらの細胞のＤＮＡに親和性を有する方法に関する。 この生物学的に活性な成分は、イムノベクターに共有結合で、または非共有結 合でカップリングしていてもよい。 好ましくは、この導入方法は、この生成物の組成物中に含まれるイムノベクタ ーが、該イムノベクターと結合しうる活性成分の輸送標的となる核を有する培養 中の細胞の存在下で、関心のあるイムノベクターを第１インキュベーションに付 し、ついで、これらの細胞を固定し透過可能とした後、標識された抗イムノベク ター抗体と共に更にインキュベートし、最後に、該核の間近または更に該核の内 部において、該イムノベクターと該抗イムノベクター抗体との抗原−抗体免疫反 応を検出することを具備する細胞浸透試験により選択可能なものから選ばれるこ とを特徴とする。 本発明の導入方法の好ましい実施態様では、用いるイムノベクターは、核酸に 対する親和性を有する抗体、またはこの親和性を保持するこの抗体の断片よりな る。 好ましくは、この方法で用いるイムノベクターは、抗体、好ましくはモノクロ ーナルIgG、(Fab')2または(Fab')断片、または対応する核酸の認識に関与する抗 体の部位に対応する任意のポリペプチドから選ばれる。 有利には、イムノベクター／活性成分のカップリング生成物を調製したら、そ れを、他の分子の核内導入に使用してもよい。例えば、試験するフルオレセイン ／イムノベクター複合体（conjugate）を、第３の分子とカップリングした抗フ ルオレセイン抗体と結合させ、それにより、その第３の分子を該細胞の核内に導 入してもよい。同様に、ビオチン／イムノベクター複合体により、抗ビオチン抗 体の結合または核内に導入されるべき第３の分子とカップリングしたアビジン− ストレプトアビジンの結合が可能となりうる。 本発明では、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素を核内に導入し たが、種々の生物活性を有する他のタンパク質を使用してもよい。また、グルタ ルアルデヒドを介してイムノベクターにカップリングさせたペルオキシダーゼを 使用してもよい。しかしながら、文献公知の他の方法（例えば、ハプテンの場合 に記載したもの）を用いてもよい。 ハプテン／イムノベクター複合体の場合と同様、タンパク質／イムノベクター 複合体と共に、第３の分子とカップリングさせた抗タンパク質抗体を使用して、 該分子を核内導入してもよい。 本明細書に記載している本発明では、ポリヌクレオチドを核内に導入したが、 適切な生物活性を有する多種多様な核酸を核内レベルで能動的に導入してもよい 。 したがって、本発明の活性成分の導入方法により、特に、標的細胞のゲノム内 に特に相同的組換えにより組込もうとする遺伝子の導入、より詳しくは「裸」の ＤＮＡの導入が可能となる。特に後者を「ＤＮＡワクチン」として使用すること が可能である。 可能な相同的組換え技術の１つは、Mouellicら(18)により１９９０年に記載さ れているものである。 Whalen,R.G.らが行なった最近の研究で、ＤＮＡ導入後の免疫応答の存在を示 すことが可能となった。これらの研究は、特許出願第ＷＯ95/11307号の主題であ り、特に、IL2サイトカイン型のモノクローナル抗体の発現に適用されている(19 )。 さらに、この導入方法は、種々の細胞型、特にマクロファージ、樹状細胞、Ｂ およびＴ細胞ならびに造血細胞、特にヒト由来のものの不死化に関与するヌクレ オチド配列の導入を可能とする。ヌクレオチド配列としては、細胞トランスフォ ーメーション現象に関連した腫瘍形成性配列またはウイルス配列が挙げられる。 また、それは、例えば、HIVなどのレトロウイルスが感染しうる細胞または腫 瘍細胞において、タンパク質またはヌクレオチドの合成を抑制しうるアンチセン スオリゴヌクレオチドの導入を可能とする。 本発明では、ｐ−ベンゾキノンを介してポリヌクレオチドをイムノベクターに カップリングさせたが、文献公知の他の方法を使用してもよい。 さらに、本発明はまた、活性分子を好ましくは核レベルで含有する真核細胞で あって、前記分子が前記細胞の核内に天然では取込まれることがないか、あるい は前記細胞中で低い発現レベルを有することを特徴とする真核細胞に関する。こ れらの分子は、これらの細胞内でそれらの核の間近またはそれらの核内で見出さ れ、本発明のカップリング生成物の形態のこれらの細胞のＤＮＡに対するその親 和性により特徴づけられるイムノベクターにカップリングされている。 本発明に関連した細胞としては、特に、ウイルスにより感染されうる細胞また は腫瘍細胞が挙げられる。 CNCMに1995年６月30日に第I-1605号、第I-1606号および第I-1607号として寄託 されている、本発明の抗体を産生するハイブリドーマも本発明の範囲内に含まれ る。 さらに、本発明は、本発明のカップリング生成物と、生理学的に許容しうる賦 形剤（vehicle）とを含有することを特徴とする薬学的組成物であって、生物学 的に活性な成分が医薬またはワクチン活性成分であり、イムノベクターが、該医 薬が向けられている宿主生物に適合性であることを特徴とする薬学的組成物に関 する。 また、本発明の範囲内には、宿主のＤＮＡに対して異種であるヌクレオチド配 列の受容細胞における発現のための、本発明のカップリング生成物の使用も含ま れる。 例 １．イムノベクターの調製 Ａ）ポリクローナルイムノベクター まず、播種状エリテマトーデスに罹患した個体から−、または狼瘡マウス(NZB ×NZW)F1から−得た血清の混合物を、セファロース上に固定化されたプロテイン Ａ上に通すことにより、ヒトまたはネズミIgGを単離する(14)。 その単離されたIgGを、セルロース上に固定化されたＤＮＡのカラムに通す。 これらのIgG中に存在する特異的抗ＤＮＡ抗体を、このＤＮＡ−セルロース免疫 吸着剤に結合させ、５％ジメチルスルホキシドを含有する20μM炭酸ナトリウム −重炭酸ナトリウム緩衝液（pH10）で溶出した(15)。ついで、10mgのIgGから１ から２mgの抗体を単離する。溶出した抗体を透析し、濃縮し、これを使用するま で＋４℃で保存する。 Ｂ）ネズミモノクローナルイムノベクター 狼瘡マウス(NZBxNZW)F1から得られた牌細胞を、K6hlerおよびMilsteinの方法 により、X63メラノーマと融合させる。得られたハイブリドーマを、IgG の分泌および抗ＤＮＡ活性に関してELISAにより試験する。抗ＤＮＡ IgGを分泌 するハイブリドーマを少なくとも２回サブクローニングし、依然として二重陽性 （IgG＋抗ＤＮＡ）のクローンをバルク培養するか、又はそのほかの方法として 、マウスにおいてこれらのクローンから腹水を調製する。典型的な実験では、マ ウス(NZB×NZW)F1の脾臓から出発して、IgGを分泌する約300個の陽性ウェルを得 た。そのうちの60個は、ＤＮＡと反応する能力を有していた。クローニングの後 、20個のクローンが、ＤＮＡを認識するIgGを分泌した。これら20個のクローン のうちの約半数が、該細胞の核内に浸透する能力を有する抗体を分泌したが、残 りはこの能力を有していなかった(Ｃ：「イムノベクターの核内浸透試験」を参 照)。45％硫酸アンモニウムで沈殿させ、ついで透析した後、セファロース上に 固定化されたプロテインＡ上に通すことにより、培養上清または腹水から該モノ クローナルIgGを単離する。溶出したIgGを中和した後、該調製物を透析し、濃縮 し、使用するまで−20℃で保存する。 ついで前記のマウス抗体を、公知技術の１つ（例えば、Riechmannらにより記 載されているもの(20)）を用いてヒト化する。 Ｃ）イムノベクターの選択 １）イムノベクターの核内浸透試験 ２つの繊維芽細胞系（カンガルーネズミの腎臓から得たPtK2およびハムスター の腎臓から得たGMA-32）を主として使用した。24時間前に2×10⁴細胞/mlで接種 し、RPMI 1640またはMEM培地（10％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよ び１％ピルビン酸ナトリウムを含有するもの）中で培養した指数増殖期の繊維芽 細胞を保持するスライドを、選択された量のイムノベクター(１から70μg/ml)を 含有する新たに取り換えられた培地中37℃でインキュベートする。２から４時間 インキュベートした後、該細胞をPBSで洗浄し、エタノールで−20℃で10分間ま たはPBS中0.2％グルタルアルデヒドおよび２％ホルムアルデヒドで20分間固定す る。PBSで３回洗浄した後、0.2％ウシ血清アルブミンおよび0.5％サポニンを含 有するPBS中で20分間、該細胞を透過可能とした。 ついで、該細胞調製物をPBSで洗浄し、フルオレセインまたはペルオキシダー ゼで標識された抗マウス免疫グロブリン（または抗ヒト免疫グロブリン）ウサ ギまたはヒツジ抗体（20μg/ml）と共に24℃で45分間インキュベートする。洗浄 後、蛍光抗体とインキュベートした細胞調製物を、蛍光顕微鏡下で検査する。ペ ルオキシダーゼ標識抗体とインキュベートした細胞調製物をまず、ペルオキシダ ーゼの細胞化学的基質（ジアミノベンジジン(DAB)＋H₂O₂）中でインキュベート し、洗浄後、該調製物を光学顕微鏡下で検査する(14)。陽性細胞の数を計数する 。 また、前述のとおり、マウス胸腺細胞を使用して、核内へのイムノベクターの 浸透を調べた。BALB/cマウス胸腺から、胸腺細胞の懸濁液を調製した。１×10⁶ 細胞/mlの濃度で胸腺細胞を、次第に増加する量（１から70μ/ml）のイムノベク ターを含有する培地中37℃で３時間インキュベートする。洗浄および固定後、前 記繊維芽細胞の調製の場合と同様にして、抗体の核内検出のために該リンパ球を 処理する。 ２）リンパ球様細胞に対する抗ＤＮＡ抗体の結合の試験 該細胞膜との反応を確認するために、10⁶個のマウス胸腺細胞または脾細胞を 、0.2％アジ化ナトリウムを含有する0.1％のウシアルブミン溶液中に希釈した種 々のモノクローナル抗体の0.1mlと低温で45分間インキュベートした。洗浄後、 蛍光抗マウスIgG抗体と共に該細胞を低温で45分間インキュベートする。洗浄後 、該細胞をFACSにより調べ、各集団内の陽性細胞の数を測定する。 調べた20個のモノクローナル抗体のうちの約半数が、該細胞の核内に浸透する 能力を有する抗体を分泌し、一方、残りの半分はこの能力を有していない。該細 胞の核内に高い効率で浸透するモノクローナル抗体（標識細胞の数、標識を得る ための限界希釈）と、それらが胸腺細胞および脾細胞を標識する能力との間の相 関を確認することができた。 II．ハプテン、タンパク質または核酸を保持するイムノベクターの調製 Ａ）イムノベクターのF(ab')2およびFab'断片の調製 ペプシンでタンパク質分解し、ついでシステインで還元してFab'断片を得るこ とを含む、開示されている方法により(14)、イムノベクターのF(ab')2断片を調 製する。ついで、イムノベクター５mgを含有する0.1Ｍクエン酸塩−クエン酸緩 衝液（pH3.5）の５mlに、150μgのペプシンを加え、該混合物を37℃ で２時間インキュベートする。該培地をpH８に調整し、該調製物をプロテインＡ −セファロースカラム上で濾過して、未消化のIgGを除去する。PBSに対して透析 した後、使用するまでこのF(ab')2調製物を−20℃で保存する。Fab'断片を得る ために、該F(ab')2調製物にシステインを最終濃度が0.02Mになるまで加える。37 ℃で10分間インキュベートした後、0.04Mヨードアセトアミドを加え、該混合物 を30分間インキュベートする。このFab'調製物をPBSに対して透析し、使用する まで−20℃で保存する。 Ｂ）イムノベクター／ハプテン ビオチンへのカップリング ジメチルホルムアミド中のd−ビオチン−N−ヒドロキシスクシンイミドエステ ルの0.1M溶液２μl（ジメチルホルムアミドの30μl中の活性エステルの１mg）を 、抗体１mgを含有する0.1Mリン酸緩衝液（pH７）0.5mlに加える。該溶液を室温 で１時間放置し、PBSに対して＋４℃で一晩透析する。 フルオレセインとのカップリング 抗体１mgを含有する炭酸ナトリウムの0.1M溶液1mlに、ジメチルスルホキシド 中のフルオレセインイソチオシアネートの溶液（10mg/ml）20μlを加える。該溶 液を実験室温度で３時間放置し、PBSに対して＋4℃で透析する。 Ｃ）イムノベクター／タンパク質 ペルオキシダーゼとのカップリング 0.1Mリン酸塩緩衝液（pH6.8）中の１％グルタルアルデヒド0.2mlに10ミリグラ ムのペルオキシダーゼを溶解する。実験室温度で18時間インキュベートした後、 0.15M NaClで平衡化させたセファデックスG25カラム（0.9×60cm）上で該溶液を 濾過して、過剰なグルタルアルデヒドを除去する。この活性化されたペルオキシ ダーゼ溶液に、抗体5mgを含有する0.15MNaCl溶液１mlおよび１M炭酸塩−炭酸水 素塩緩衝液(pH9.5)0.2mlを加える。該溶液を＋４℃で24時間保存し、ついでリジ ンで最終濃度が0.1Mになるまで補足し、ついでPBSに対して４℃で透析する。 Ｄ）イムノベクター／核酸 ポリヌクレオチド 使用するポリヌクレオチドは15個のヌクレオチドよりなり、５'側にフルオレ セインを、３'側に遊離NH₂基を保持していた。これは、核酸合成の通常の方法に より調製した。このヌクレオチドを、ｐ−ベンゾキノンを介してイムノベクター にカップリングさせた(14)。ｐ−ベンゾキノン３mgを含有するエタノール0.lml を、イムノベクター（全分子、F(ab')2またはFab'）１ｍgを含有する0.1Mリン酸 塩緩衝液（pH６）0.4mlに加える。実験室温度で１時間インキュベートした後、 該調製物をセファデックスG-25カラム上で濾過する。活性化されたイムノベクタ ーを含有する画分を、ポリヌクレオチド４分子に対してイムノベクター１分子の 割合にてポリヌクレオチドで補足し、該溶液を炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液でpH9. 2に調整する。実験室温度で18時間インキュベーションした後、リジンを最終濃 度が0.1Mになるまで加えることにより該反応を停止させ、ついでPBSに対して透 析する。この調製物を、使用するまで＋４℃で保存する。 プラスミド ２つのプラスミドを試験した。第１プラスミドは、SV40 T、t抗原をコードす る遺伝子の上流にビメンチンプロモーターを保持し(pHuVim830T,t)(21)、第２プ ラスミドは、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝 子（22）を保持する（pCMV-Luc）(５)。 これらのプラスミドをE.coli株中で維持し、アルカリ培地中デタージェントの 存在下で標準的な溶解方法により細菌培養の後で調製する。ついで樹脂カラム（ Qiagen Plasmid Kits）上のクロマトグラフィーにより該プラスミドを精製する 。 この研究では、イムノベクターJ-20.8およびF-14.6を使用する。これらの抗体 は、第I.B/節に既に記載したモノクローナルイムノベクターの調製方法により調 製する。該抗体を、カップリング剤、特にカルボジイミド、例えばEDC（1−(3− ジメチルアミノプロピル)−1'−エチルカルボジイミド）の助けによりポリ−L− リジンにカップリングさせる。幾つかの場合には、ポリクローナルIgGを抗ＤＮ Ａ抗体に10：１の割合で加えて培地中のIgGの濃度を増加させ、それによりポリ リジンとのカップリングを促進させる。 PBS１ml中のモノクローナル抗体（J-20.8またはF-14.6）または濃縮ポリク ローナルIgG（20mg/ml）の２mgを10mM MES緩衝液（pH5）に対して一晩透析する 。ポリ−L−リジン（分子量18,000）２mgを、この同じ緩衝液の１mlに溶解し、 ついで0.2mgnoEDC（MES緩衝液50μl中）で30秒間補足する。ついで該ポリ−L− リジン溶液を該抗体／EDC混合物に加え、インキュベーションを２時間続ける。 ついで、該調製物をプロテインＡ−セファロースカラム上で濾過して、ポリリ ジンと複合体形成した抗体から過剰のポリ−L−リジンを分離し、該抗体を通常 の条件下pH３で溶出し、中和し、PBSに対して透析する。 III．物質に結合したイムノベクターによる細胞核内への該物質の導入の例 Ａ）フルオレセインのインビトロでの導入 ガラスカバーグラス上の培養中のGM A-32系の繊維芽細胞を、フルオレセイン で標識した次第に増加する量のモノクローナルイムノベクター（J-20.8抗体また はFab'2断片）を含有するRPMI培地中、37℃で２から４時間インキュベートする 。この時間の終了時に、IC1に記載されているとおりに、該細胞を洗浄し、固定 する。それらを、Mowiol培地に加えた後、蛍光顕微鏡下で検査する。事実上、該 繊維芽細胞のすべての核が蛍光標識を示す。一方、核へ浸透しない抗ＤＮＡ活性 を有さない対照モノクローナル抗体Ig 2aと共にインキュベートした繊維芽細胞 の核は、蛍光を全く示さない(図１および２)。 Ｂ）マウス末梢リンパ球内へのフルオレセインのインビボでの導入 １mgのイムノベクター（モノクローナル抗体C-2.1またはF-4.1または対照抗体 （モノクローナル抗体G-14）(フルオレセインで標識されているもの)を、0.2ml の量にて静脈内に、0.3mlの量にて腹腔内に２匹のマウスに注射する。５時間後 、該マウスを出血させ犠牲にし、循環血リンパ球をFACSにより分析する。イムノ ベクターを注射したマウスから得た末梢血リンパ球の60％が蛍光性であり、一方 、対照動物からのリンパ球はいずれも蛍光性でないことが認められる(図３)。顕 微鏡検査は、該細胞の大多数において核のレベルで蛍光を示す。 Ｃ）ビオチンの導入 前もって24時間培養したPtK2系の繊維芽細胞（10⁵/ml）を、ビオチンで標識さ れた次第に増加する量のヒト抗ＤＮＡポリクローナルIgG（５〜100μg） と共に完全RPMI培地中でインキュベートする。３時間後、ICに記載されていると おりに、該細胞を洗浄し、固定し、透過可能とする。ついで該細胞を、ペルオキ シダーゼで標識されたストレプトアビジン１μg/mlを含有するRPMIと共にインキ ュベートする。１時間後、該細胞をPBSで３回洗浄し、DAB＋H₂Ｏ₂培地を用いて 、該細胞に結合したペルオキシダーゼを表示させた。該調製物をMowiolに加え、 光学顕微鏡下で検査した。抗ＤＮＡ IgGと共にインキュベートした繊維芽細胞の 多数の核は陽性であり、一方、正常な個体から得、ビオチンで標識したIgGと共 にインキュベートした細胞は陰性である。 Ｄ）ペルオキシダーゼの導入 第IIIC節で定義した条件下、ペルオキシダーゼで標識した次第に増加する量の イムノベクター（抗体J-20.8）のFab'断片と共に、PtK2繊維芽細胞をインキュベ ートする。３時間後、該細胞をPBSで３回洗浄し、PBS中の0.2％グルタルアルデ ヒドおよび２％ホルムアルデヒドで20分間固定する。洗浄後、着色DAB＋H₂O₂試 験により該ペルオキシダーゼ活性を表示させ、該調製物を光学顕微鏡下で検査す る。J-20.8抗体のFab'断片と共にインキュベートした繊維芽細胞の核の大部分は ペルオキシダーゼに関して陽性であり、一方、対照抗体48.9と共にインキュベー トしたものは陰性である。 Ｅ）フルオレセインで標識したポリヌクレオチドの導入 BALB/cマウス脾臓から調製した３×10⁶個の脾細胞を、イムノベクター（J-20. 8）またはそのFab'断片（ポリヌクレオチドに共有結合でカップリングしている もの）の40μg/mlを含有するRPMIの１ml中でインキュベートする。37℃で３時間 インキュベートした後、該細胞をPBSで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中で 固定し、顕微鏡下で検査する。８から10％の細胞が、核内蛍光を示す(図４)。 Ｆ）プラスミドの導入 ペルオキシダーゼにカップリングした抗Ｔ抗原抗体の助けによりこれらの遺伝 子にコードされるタンパク質の合成を確認することにより、あるいはルシフェラ ーゼの基質（ルシフェリン）上のルシフェラーゼの活性の発光測定アッセイによ り、トランスフェクション効率を評価した。 使用する細胞は、GMA-32系の繊維芽細胞およびHep2カルチノーマ細胞である。 それらを完全培地（10％ウシ胎児血清、２mML−グルタミン、１％ピルビン酸ナ トリウムおよび抗生物質を含有するRPMI 1640培地）中、５％CO₂、37℃で培養す る。 プラスミドpHuVim 830T,t 前日にHep2細胞を、24ウェルプレートの1ウェル当たり完全培地0.5ml中２×10⁴ 細胞の量で接種する。トランスフェクションのために、該培地を除去し、20μ ｇの抗体−ポリ−L−リジンおよび２μｇのプラスミド、または20μｇの天然抗 体および２μｇのプラスミド、または２μｇのプラスミドのみを含有する0.3ml の完全培地と取り換える。６時間後に培地を変え、必要であれば、２日毎に培地 を変え細胞を２つに細分することにより、該培養を続ける。種々の時点でトラン スフェクション効率を調べる。 プラスミドpCMV-Luc 前日にGMA-32細胞を、完全培地の24ウェルプレートの１ウェル当たり７から10 ×10⁴細胞／完全培地0.5mlの量で接種する。トランスフェクションのために、該 培地を除去し、８μｇのJ-20.8/ポリリジンまたはF-14.6/ポリリジン、または20 μｇのJ-20.8ポリクローナルIgGおよび２μｇのプラスミド、または２μｇのプ ラスミドのみを含有する0.5mlの完全培地と取り換える。６時間後に培地を変え る。トランスフェクション開始の24時間後に、トランスフエクション効率を調べ る。トランスフェクションの対照 プラスミドvHuVim 830T,t トランスフェクションされた細胞の核内でのＴ抗原の合成を、免疫細胞化学的 方法により確認する。該細胞をPBSで３回洗浄し、ついでメタノール中、−20℃ で10分間固定する。ついで、ペルオキシダーゼにカップリングされた抗Ｔ抗原抗 体と共にそれらを１時間インキュベートする。洗浄後、該ペルオキシダーゼを、 DAB＋H₂O₂混合物で表示させる。J-20.8ポリリジンおよびプラスミドコンプレッ クスと共にインキュベートしたウェルでは、単離された細胞および細胞の数個の クラスターが、48時間後および２週間後に褐色に強く着色された核を有する。 天然抗体による対照または該プラスミド単独の場合は、陰性である。 プラスミドpCMV-Luc トランスフェクションされた細胞の溶解物中で検出可能なルシフェラーゼ合成 により、トランスフェクション効率を確認する。この酵素は、ルシフェリンの酸 化を触媒し、それにより、ルミノメーターで検出可能な生成物が生じる。培養後 、該細胞をPBS中で洗浄し、ついで８mMMgCl₂、１mM DTT、１％トリトンX100、１ ％BSAおよび15％グリセロールを含有する25mMトリスーリン酸塩緩衝液（pH7.8） 中で溶解する。ルシフェリン（0.25mM）およびATP（１mM）の溶液の自動添加に より、該溶解物をルミノメーター中でアッセイする。同じ溶解物のアリコートを 、Coomassie（Bio-RadProteinAssay）試薬を用いて、そのタンパク質濃度に関し てアッセイする。その結果を、タンパク質１mg当たりの単位（RLU）で表す。表 に示されているとおり、抗体調製物J-20.8/ポリリジンおよびF-14.6/ポリリジン の存在下では遺伝子導入が起こるが、IgG/ポリリジン調製物は何ら影響を及ぼさ ない。 同じ抗体/プラスミド比率の場合のトランスフェクション効率は、J-20.8調製 物ではF-14.6より10倍高い。さらに、J-20.8-IgG/ポリリジン調製物のJ-20.8（ コンプレックス20：0.5）の２μgは、J-20.8/ポリリジン調製物の８μg（コンプ レックス８：0.5）と同程度の結果を与えるため、ポリリジンにカップリングさ れている間に濃縮ポリクローナルIgGを加えることにより、トランスフェクショ ン効率が増加するようである。 得られたすべての結果を、以下の表に要約する。 これまでの説明では、好ましいイムノベクターは、抗ＤＮＡ抗体またはこれら の抗体の断片（ただし、これらの断片は全ＤＮＡに対する認識部位を保持するも のである）より本質的になるものであった。勿論、言うまでもないことであるが 、本発明の範囲内で使用することができるイムノベクターは、それが、これらの 細胞の膜およびそれらの細胞質を経由して、それと結合する生物学的に活性な成 分の輸送、および該細胞の核の間近またはこの核の内部へのその導入を可能にす る限り、他の任意の方法により調製してもよい。 このようなイムノベクターの例示として、核タンパク質（例えば、ヒストン、 タンパク質hnRNP、ポリメラーゼまたはこのポリメラーゼに結合した因子）と活 性な生成物との複合体が挙げられる。この場合、この核タンパク質自体は(それ が、単独で、インターナリゼーションおよび細胞核内への生物学的に活性な成分 の導入を引き起こす能力を有さない限り)、抗細胞膜受容体抗体またはこのよう にして得られる複合体の細胞内へのインターナリゼーションを可能にする他の任 意の分子と複合体形成している。この複合体が細胞核まで拡散する能力を有し、 さらに、前記のとおり、それが今度は、この複合体にカップリングする生物学的 に活性な成分を輸送し導入しうる限り、それは、本発明の範囲内に含まれるイム ノベクターを構成する。 細胞の核内へ活性成分を導入するための効率的なイムノベクターの選択に関し て前記した選択技術は、前記複合体の選択に同等に適用することができる。 当業者であれば、使用する複合体の少なくともいくつかに関しては、選択の追 加的な基準は、これが細胞機能と共に含むその望ましくない作用を伴わないと理 解することができるであろう。実際、対応するＤＮＡの認識部位を保持する核内 タンパク質の一部のみが、本発明の実施態様に必須であることに注目すべきであ る。図面の説明 図１ ：フルオレセインの「インビトロ」での導入 ＡおよびＢ：フルオレセインで標識されたイムノベクター（抗体J-20.8）によ るGMA32繊維芽細胞の核の標識(倍率100倍)。 Ｃ：蛍光対照抗体の場合には標識が存在しない(100倍)。 Ｄ：低倍率で観察したもう１つの視域(40倍)。図２ ：図1Aの場合と同じ調製物の共焦点顕微鏡下での分析。GMA32繊維芽細胞を 本質的に核内で標識する。図2Aでは、全蛍光が認められる。図2Bは、蛍光強度の 分析に対応する。図３ ：フルオレセインの「インビボ」での導入 図3Aでは蛍光対照抗体を、図3Bでは蛍光イムノベクター［抗体(J-20.8)]を５ 時間前に注入したマウス末梢血細胞のFACS分析。ヒストグラムは、ｘ軸上に蛍光 強度（単位は任意）を、ｙ軸上に細胞数を表す。図４ ：末梢血細胞（図３のもの）の共焦点顕微鏡による分析。図4Aでは、全蛍光 が認められる。図4Bは、蛍光強度の分析に対応する。図５ ：ヌクレオチドの「インビトロ」での導入 蛍光ヌクレオチドにカップリングされたイムノベクター（抗体J-20.8）のFab' 断片が浸透したマウス脾細胞の共焦点顕微鏡検査。図5Aでは、全蛍光が認められ る。図5Bは、蛍光強度の分析に対応する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 45/00 48/00 48/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ビュッタン、ジェラール フランス国、75013 パリ、リュ・クルー ルバルブ 63 (72)発明者 テルニンク、テレーズ フランス国、75015 パリ、ブールバー ル・ガリバルディ 39 (72)発明者 ナトー、ファリダバノ フランス国、92160 アントニー、リュ・ ミラボー 65 (72)発明者 アブラメア、アレクサンドル フランス国、94400 ビトリー−スール− ザン、リュ・ジュリアン−グリモ 139

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物学的に活性な成分とイムノベクターとの間のカップリング生成物であ って、前記カップリング生成物が、真核細胞内での前記の生物学的に活性な成分 のインターナリゼーションを可能にする能力によって、及び前記イムノベクター が、これらの細胞の核の間近または前記核内に前記の生物学的に活性な成分を導 入できる程度の、これらの細胞のＤＮＡに対する前記イムノベクターの親和性に よってことを特徴づけられるカップリング生成物。 ２．前記の生物学的に活性な成分と該イムノベクターとの間のカップリングが 共有結合または非共有結合を含むことを特徴とする、請求の範囲第１項に記載の 生成物。 ３．前記生成物の組成物中に含まれるイムノベクターが、細胞透過試験であっ て、前記イムノベクターと結合しうる活性成分が進入しなければならない核にお いて、細胞の存在下で、関心のあるイムノベクターを第１インキュベーションに 付し、ついで、前記細胞を固定し透過可能とした後、標識された抗イムノベクタ ー抗体と共に更にインキュベートし、最後に、該核の間近または該核内において さえも、前記イムノベクターと前記抗イムノベクター抗体との抗原−抗体免疫反 応を検出することを具備した細胞透過試験により選択可能なものから選ばれるこ とを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の生成物。 ４．該イムノベクターが、核酸に対する親和性を有する抗体または前記親和性 を保持するこの抗体の断片よりなることを特徴とする請求の範囲第１項から第３ 項のいずれか１項に記載の生成物。 ５．該イムノベクターが、モノクローナルIgG、(Fab')2または(Fab')断片、ま たは対応する核酸の認識に関与する抗体の部位に対応する何れかのポリペプチド から選ばれることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の生成物。 ６．前記イムノベクターが、正常な個体から得られ抗ＤＮＡ活性を保持する免 疫グロブリン、特にIgGであることを特徴とする請求の範囲第４項または第５項 に記載の生成物。 ７.前記イムノベクターが、抗ＤＮＡ活性を保持する免疫グロブリン、特にIgG であり、自己免疫症候群、特に播種状エリテマトーデス症候群を現している個体 から得られることを特徴とする請求の範囲第４項または第５項に記載の生成物。 ８．請求の範囲第４項から第７項のいずれか１項に記載の生成物であって、こ れが、一方では該ＤＮＡを、他方ではHIVレトロウイルスのTat、Revのようなタ ンパク質を、他方ではCD3、CD4、CD8、CD19、CD34のような表面マーカーを認識 する二重特異性抗体であることを特徴とする生成物。 ９．該イムノベクターにカップリングされた活性成分が、核酸、タンパク質ま たはハプテンから選ばれる分子であることを特徴とする請求の範囲第１項から第 ８項のいずれか１項に記載の生成物。 １０．該イムノベクターにカップリングされた活性成分が、プラスミドであっ て、前記プラスミドに含まれる遺伝子にコードされるタンパク質の発現を可能に するものよりなることを特徴とする請求の範囲第１項から第８項のいずれか１項 に記載の生成物。 １１．該イムノベクターが抗体または抗体の断片である場合、後者をまず、該 ＤＮＡに対する圧縮効果を誘導しうる物質とカップリングさせることを特徴とし 、該物質が好ましくはポリリジンである請求の範囲第１０項に記載の生成物。 １２．該活性成分が、標的細胞のゲノム中に、特に相同的組換えにより組込む ことを意図した遺伝子、特に、細菌または真核細胞、真菌細胞またはウイルスに 由来するポリペプチドであって、前記ポリペプチドがワクチン特性を有するもの をコードする核酸配列を含有する「裸」のＤＮＡよりなることを特徴とする請求 の範囲第１項から第８項のいずれか１項に記載の生成物。 １３．該活性成分が、選択された細胞型、特にマクロファージ、樹状細胞、Ｂ およびＴ細胞および造血細胞、特にヒト由来のものを不死化しうることを特徴と する請求の範囲第１項から第８項のいずれか１項に記載の生成物。 １４．前記活性成分が、例えばHIVレトロウイルスに感染した細胞または腫瘍 細胞において、タンパク質またはヌクレオチドの合成を抑制しうるアンチセンス オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求の範囲第１項から第８項のいず れか１項に記載の生成物。 １５．好ましくは核で活性な分子を含有する真核細胞であって、前記分子が前 記細胞の核内に天然では取込まれることがないか、または前記細胞中で低い発現 レベルを有し、該分子が、これらの細胞内でそれらの核の間近またはそれらの核 内で見出され、請求の範囲第１項から第１２項のいずれか１項に記載の生成物に 対応するこれらの細胞のＤＮＡに対する親和性により特徴づけられるイムノベク ターにカップリングされていることを特徴とする真核細胞。 １６．請求の範囲第１５項に記載の細胞であって、これらがウイルスまたは腫 瘍細胞に感染しうることを特徴とする細胞。 １７．CNCMに1995年６月30日に受託番号第I-1605号、第I-1606号および第I-16 07号として寄託されているハイブリドーマ。 １８．選択された真核細胞の核内に該活性成分をインビトロで導入する方法で あって、前記活性成分をイムノベクターにカップリングすることによって特徴づ けられ、該イムノベクターがこれらの真核細胞における前記の生物学的に活性な 成分のインターナリゼーションを可能にする能力を有し、かつ、前記イムノベク ターがこれらの細胞の核の間近または該核内に前記の生物学的に活性な成分を輸 送できる程度に該細胞のＤＮＡに対して親和性を有する方法。 １９．該生物学的に活性な成分が、該イムノベクターに共有結合でまたは非共 有結合でカップリングされていることを特徴とする請求の範囲第８項に記載の方 法。 ２０．該生成物の組成物中に含まれるイムノベクターが、前記イムノベクター と結合しうる活性成分が進入しなければならない核において、細胞の存在下で、 関心のあるイムノベクターを第１インキュベーションに付し、ついで、該細胞を 固定し透過可能とした後、標識された抗イムノベクター抗体と共に更にインキュ ベートし、最後に、該核の間近または該核内においてさえも、該イムノベクター と該抗イムノベクター抗体との抗原−抗体免疫反応を検出することを具備する細 胞透過試験により選択可能なものから選ばれることを特徴とする請求の範囲第１ ８項または第１９項に記載の方法。 ２１．該イムノベクターが、核酸に対する親和性を有する抗体または前記親和 性を保持するこの抗体の断片より形成されることを特徴とする請求の範囲第１６ 項に記載の方法。 ２２．前記イムノベクターが、モノクローナルIgG、(Fab')2または(Fab')断片 、または対応する核酸の認識に関与する抗体の部位に対応する何れかのポリペプ チドから選ばれることを特徴とする請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２３．生理学的に許容しうる賦形剤と組み合わせて請求の範囲第１項から第９ 項のいずれか１項に記載の生成物を含有することを特徴とする薬学的組成物であ って、該生物学的に活性な成分が医薬またはワクチン活性成分であり、該イムノ ベクターが、該医薬が向けられた宿主生物と適合しうることを特徴とする薬学的 組成物。 ２４．受容細胞における、前記宿主のＤＮＡに対して異種であるヌクレオチド 配列のインビトロでの発現のための、請求の範囲第１項に記載の生成物の使用。