ES2198495T3 - Inmunovectores utilizables para el transporte intracelular e intranuclear. - Google Patents

Inmunovectores utilizables para el transporte intracelular e intranuclear.

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ES2198495T3 ES96924965T ES96924965T ES2198495T3 ES 2198495 T3 ES2198495 T3 ES 2198495T3 ES 96924965 T ES96924965 T ES 96924965T ES 96924965 T ES96924965 T ES 96924965T ES 2198495 T3 ES2198495 T3 ES 2198495T3
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Gerard Buttin
Therese Ternynck
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Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PRODUCTO DE ACOPLAMIENTO ENTRE UN PRINCIPIO BIOLOGICAMENTE ACTIVO Y UN INMUNOVECTOR CARACTERIZADO AL MISMO TIEMPO POR LA CAPACIDAD QUE TIENE EL INMUNOVECTOR PARA PERMITIR LA ENTRADA EN LAS CELULAS EUCARIOTICAS DEL PRINCIPIO BIOLOGICAMENTE ACTIVO Y POR LA AFINIDAD DEL INMUNOVECTOR POR EL ADN DE ESTAS CELULAS, HASTA EL PUNTO DE SER APROPIADO PARA TRANSFERIR EL PRINCIPIO BIOLOGICAMENTE ACTIVO HASTA LA PROXIMIDAD INMEDIATA DE LOS NUCLEOS DE ESTAS CELULAS O HASTA DICHOS NUCLEOS.

Description

Inmunovectores utilizables para el transporte intracelular e intranuclear.
La presente invención se refiere a la transferencia activa de haptenos, de proteínas, de ácidos nucleicos y otras moléculas en el núcleo de células eucariotas. Esta invención reviste una importancia principal puesto que puede ser aplicada a diversos campos, en particular el de la terapia génica y de las vacunas.
La terapia génica queda acondicionada por un número considerable de parámetros, entre los cuales el desarrollo de vectores capaces de transportar a través del citoplasma de estas células del organismo del huésped de los principios activos dotados de propiedades específicas predeterminadas en los núcleos de células del organismo en ausencia de alteraciones genéticas asociadas a la utilización de estos vectores, y la no degradación de la actividad biológica de los principios activos transferidos. Se sabe que hasta el presente todas estas condiciones están lejos de ser reunidas (1).
En efecto, los procedimientos actuales utilizados corrientemente para transferir el ADN en las células son los siguientes: unos procedimientos generales, no selectivos, que utilizan la propiedad del ADN de coprecipitar con el fosfato de calcio o el DEAE-dextrano, o bien la introducción directa del ADN en las células bajo el efecto de un campo eléctrico (electroporación). Estos procedimientos son muy tóxicos para las células, provocan una gran mortalidad y una gran variabilidad según las células utilizadas. Otros procedimientos utilizan un apuntado de la entrada del gen en las células por unos receptores presentes en su membrana. El ADN puede entonces penetrar en la célula por medio o bien de un ligando específico de estos receptores asialorosomucoide (2), insulina (3) o transferrina (4), o bien de anticuerpos específicos de constituyentes membranarios (5). El complejo ADN/ligando penetra en la célula por un proceso de endocitosis. La transfección es por tanto limitada por una destrucción importante del complejo en las vesículas lisosomiales, y diferentes procedimientos han sido propuestos para evitar estos inconvenientes, en particular el bloqueo del compartimiento lisosomial por la cloroquina o la adición simultánea de adenovirus que escapan al compartimiento endosomial y destruyen la membrana de las vesículas de endocitosis (6).
La presente invención tiene por objeto poner a disposición un nuevo tipo de vectores a la vez más eficaces y de mayor inocuidad que los vectores virales cuya utilización está prevista hasta el presente.
La invención se refiere por tanto a un producto de acoplamiento entre un principio biológicamente activo y uno de estos nuevos vectores; a continuación denominados ``inmunovectores'', estando el producto de acoplamiento caracterizado, a la vez por la capacidad del inmunovector de permitir la internalización en unas células eucariotas de principios biológicamente activos ligados de forma covalente o no covalente a estos inmunovectores, y por su afinidad para el ADN de estas células, hasta el punto de hacer dicho inmunovector apto para transferir el principio biológicamente activo a la proximidad inmediata de los núcleos de estas células o en los núcleos de estas células.
Estos inmunovectores consisten preferentemente en unos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aptos para reconocer unas secuencias de ADN en el seno de estas células, y a las cuales pueden estar ligados de forma covalente o no covalente unos principios biológicamente activos, siendo estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos además capaces de transportar in vitro e in vivo estos principios biológicamente activos a través de las membranas y el citoplasma de estas células, y de transferirlos a la proximidad e incluso en el núcleo de estas células.
Queda entendido que en la presente descripción el término ``biológicamente activo'' se refiere a cualquier molécula, macromolécula, grupo de moléculas que posean la actividad biológica del tipo en cuestión.
La invención se refiere también a un procedimiento de transferencia, en particular de haptenos, de proteínas y/o de ácidos nucleicos en el núcleo de células, particularmente de células eucariotas, estando este procedimiento basado en la utilización de las propiedades de dichos inmunovectores.
La existencia de anticuerpos capaces de penetrar en el interior de núcleos de linfocitos humanos cuando estas células son incubadas in vitro en un medio de cultivo que contiene un suero que proviene de enfermos afectados de lupus eritematoso diseminado (LED), ha sido informada por primera vez por Alarcón-Segovia et al. en 1987 (7). A continuación, el mismo equipo ha demostrado que esos anticuerpos son de isótopo IgG y son capaces de reaccionar con unos ácidos ribonucleicos, libres o complejados con unas proteínas (8). Recientemente, este tipo de anticuerpo se ha detectado en la rata lúpica MRL lpr/lpr, pero también en la rata NZB que presenta un síndrome de enfermedad hemolítica autoinmune e incluso en la rata normal BALB/c. Algunos anticuerpos monoclonales, preparados a partir del bazo de estas ratas, han resultado capaces de penetrar in vitro en el núcleo de células mantenidas en cultivo 
\hbox{(10-13)}
. Como en el ser humano, se ha notado que estos anticuerpos monoclonales eran capaces de reconocer unos ácidos nucleicos. Además, se ha demostrado que estos anticuerpos son también capaces, cuando son inyectados en las ratas, de penetrar en varios tipos de células, para encontrarse de nuevo en sus núcleos (11).
La invención resulta del descubrimiento de que este tipo de anticuerpos o de los fragmentos de estos anticuerpos podían también ser utilizados como vectores, a continuación ``monovectores'' aptos para transportar unos principios biológicamente activos, tales como unos haptenos, una proteínas, y unos ácidos nucleicos a través de las membranas y del citoplasma de las células correspondientes, y para asegurar su transferencia al núcleo de dichas células.
\newpage
Estos anticuerpos pueden ser obtenidos en forma policlonal a partir de un suero, en particular de un animal previamente inmunizado contra unos fragmentos de ácido nucleico portadores del epítopo correspondiente, o en forma monoclonal, a partir de híbridomas secretores de dichos anticuerpos.
Cualquier tipo de enlace, químico o no, puede ser utilizado para asegurar el acoplamiento de un inmunovector del tipo anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tenga afinidad para los ácidos nucleicos al principio biológicamente activo, por ejemplo un hapteno o un ácido nucleico, a fin de transportarlo a través de las membranas y el citoplasma de las células, y para asegurar la transferencia de estos principios activos en el núcleo.
De manera preferida se recurrirá a un modo de acoplamiento químico, que permita la realización de enlaces covalentes o no covalentes.
Unos productos de acoplamiento preferidos son aquellos cuyos inmunovectores son seleccionables por un test de penetración celular que comprende una primera incubación del inmunovector estudiado en presencia de células en cultivo en el núcleo de las cuales el principio activo susceptible de ser asociado al inmunovector debe ser transportado, seguido, después de fijación y permeabilización de estas células, de otra incubación con unos anticuerpos antiinmunovectores marcados 4, finalmente de una detección en la proximidad inmediata del núcleo e incluso en el seno de éste de la reacción inmunológica del tipo antígeno-anticuerpo entre el inmunovector y el anticuerpo antiinmunovector.
Entre los inmunovectores preferidos de la presente invención, se mencionarán los anticuerpos que tienen afinidad para un ácido nucleico o un fragmento de éstos, conservando este último esta afinidad.
Los anticuerpos que tienen también la capacidad de fijarse sobre las células, en particular las células linfoides son también utilizables. Esta última categoría de inmunovectores puede también ser seleccionada por un test, el cual puede entonces también comprender la incubación de los inmunovectores para el estudio con unas células linfoides, el lavado de dichas células linfoides, la incubación de estas últimas con unos anticuerpos antiinmunovectores marcados, y la determinación del número de células positivas en cada población.
En una realización, las células linfoides utilizadas son unos esplenocitos de ratas autoinmunes que presentan un síndrome lúpico.
Un inmunovector preferido para el producto de acoplamiento se elige entre los IgG monoclonales, los fragmentos (Fab')2 ó (Fab'), o cualesquiera polipéptidos que correspondan al (los) sitio(s) de los anticuerpos implicado(s) en el conocimiento del ácido nucleico correspondiente.
Preferentemente, este inmunovector es una inmunoglobulina, más particularmente una IgG que presenta una actividad anti-ADN y que proviene de individuos normales.
Además, este inmunovector puede ser una IgG que presenta una actividad anti-ADN y que proviene de individuos que presentan unos síndromes autoinmunes, más particularmente unos síndromes de lupus eritematoso diseminado.
En una realización particular de la invención, el inmunovector acoplado al principio activo es un anticuerpo biespecífico que reconoce por una parte el ADN, y por otra parte una proteína tal como Tat, Rev del retrovirus VIH, así como unos marcadores de superficie tales como CD3,CD4, CD8, CD19 y CD34.
Preferentemente, el principio biológicamente activo apropiado al inmunovector es una molécula elegida entre en particular unos ácidos nucleicos, unas proteínas y en particular las enzimas, por ejemplo la peroxidasa, unos haptenos en particular la biotina o la fluoresceína, los activadores o inhibidores de enzimas y los medicamentos.
En una realización preferida, el ácido nucleico apropiado es un polinucleótido, siendo el inmunovector una IgG, efectuándose el acoplamiento por medio de la p-benzoquinona a razón de una molécula de inmunovector para 4 moléculas de polinucleótido.
Un principio biológicamente activo utilizado preferentemente, está constituido por un plásmido destinado a integrarse en el núcleo de las células diana para la expresión de una proteína codificada por un gen contenido en dicho plásmido. Cuando un plásmido de este tipo es acoplado a un inmunovector del tipo anticuerpo, que tiene afinidad para el ADN, este inmunovector es, de forma preferida, previamente acoplado a un agente capaz de inducir un efecto de compactado sobre el ADN, siendo este agente preferentemente la polilisina.
En efecto, la polilisina, que por sus propiedades catiónicas es capaz de compactar el ADN, favorece la transfección de las células. El acoplamiento de polilisina con el inmunovector, que se efectúa con la ayuda de un agente de acoplamiento, más particularmente una carbodiimida tal como la EDC (1-(3-dimetilaminopropil)-1'-etilcarbodiimida), permite al ADN reaccionar con ésta. Esto tiene por efecto inducir la liberación del sitio activo del anticuerpo que puede estar a veces enmascarado cuando el anticuerpo es acoplado a un principio activo del tamaño de un plásmido.
Otros agentes susceptibles de tener, gracias a sus propiedades catiónicas, un efecto de compactado sobre el ADN (2-6), pueden también ser acoplados al inmunovector para cumplir dicha función.
De manera más específica, un principio biológicamente activo utilizado preferentemente está constituido por un gen destinado a integrarse en el genoma de las células dianas, en particular por recombinación homóloga, más particularmente un ADN ``desnudo'' que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido originario de células bacterianas o eucariotas, de células fúngicas, o de virus, teniendo este polipéptido propiedades vacunantes.
Ventajosamente, este principio activo permite la inmortalización de tipos celulares elegidos, particularmente los macrófagos, las células dendríticas, las células B y T, y las células hematopoyéticas, en particular de origen humano.
De manera también preferida, este principio biológicamente activo es un oligonucleótido antisentido que permite la inhibición de la síntesis proteínica o nucleotídica, por ejemplo en las células infectables por un retrovirus VIH, o en unas células tumorales.
Así, los inventores han intentado, por una parte, obtener a partir del bazo de ratas antiinmunes (NZB x NZW)F1, que presentan un síndrome lúpico, unos anticuerpos monoclonales IgG que han sido seleccionados por su capacidad de reaccionar con el ADN pero también, por su capacidad de penetrar hasta el núcleo de las células. Paralelamente, unos anticuerpos policlonales que reaccionan con el ADN y que pueden penetrar en los núcleos de las células han sido aislados por cromatografía de afinidad. Esta cromatografía ha sido aplicada o bien a un ``pool'' de sueros de pacientes normales o a un suero individual normal, y preferentemente a unos sueros que provienen de pacientes afectados de infecciones, particularmente a un suero de pacientes normales afectados de LED, o bien a un suero de rata (NZB x NZW)F1.
En un procedimiento de selección de inmunovectores según la presente invención, el test de penetración celular de los inmunovectores comprende una primera incubación de progenies celulares eucariotas en un medio que contiene dichos inmunovectores preferentemente en concentración creciente, y después la fijación y, si es necesario, la permeabilización, o viceversa, de estas células, seguida de una incubación de dichas progenies celulares con unos anticuerpos antiinmunovectores marcados preferentemente con la fluoresceína o la peroxidasa, y la localización de los anticuerpos así marcados en la proximidad de los núcleos de dichas células o mejor aún en el interior de los núcleos. Las progenies celulares se eligen en particular entre los fibroblastos, los timocitos o los esplenocitos.
Sin que las condiciones de reacción que siguen tengan un carácter limitativo, puede mencionarse que la primera incubación es a menudo efectuada a 37ºC, durante aproximadamente 2 a 8 horas con unas concentraciones de inmunovectores de aproximadamente 1 a 70 \mug/ml, sobre unas progenies celulares inseminadas a una concentración que va de 5 x 10^{3} a 5 x 10^{6} células por mililitro.
En una de las realizaciones del procedimiento, la progenie celular es una progenie fibroblástica en crecimiento exponencial inseminada a una concentración de 2 x 10^{4} células por mililitro, o unos timocitos o unos esplenocitos de rata BALB/c los cuales son puestas en suspensión a razón de aproximadamente 10^{6} células por mililitro.
Por otra parte, la invención se refiere a un procedimiento de preparación de producto de acoplamiento inmunovector-molécula(s), siendo los inmunovectores elegidos entre los anticuerpos, más particularmente las IgG obtenidos según el procedimiento de selección, los fragmentos (Fab')2 ó (Fab'), o cualquier otro polipéptido correspondiente al sitio de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos implicados en el transporte de las moléculas.
En el procedimiento de preparación de un producto de acoplamiento según la invención, se actúa de manera que a cada monovector es acoplada por lo menos una molécula de producto biológicamente activo, estando la molécula ligada al inmunovector preferentemente de forma covalente.
Los ejemplos que siguen ilustran unas condiciones en las cuales, unos haptenos como la fluoresceína y la biotina, unas pequeñas moléculas como unas hormonas, unas proteínas y en particular unas enzimas, unos inhibidores o activadores de enzimas y unos medicamentos, por ejemplo unos antivirales tales como el aciclovir o el AZT, pueden ser activamente transportadas a través del citoplasma de las células tratadas y transferidas en el núcleo de dichas células. En particular, la fluoresceína ha sido acoplada a los grupos aminados libres de los inmunovectores por medio de un grupo activo isotiocianato y la biotina por medio de un éster succinimida activo. El acoplamiento de los haptenos u otros con el inmunovector puede ser efectuado por medio de otros reactivos o grupos de puenteo homo- o heterobifuncionales conocidos en la literatura como los imidoésteres y N-hidroxisuccinimidil ésteres que pueden reaccionar con los grupos aminados, por ejemplo unos derivados de grupos alquilo, haloarilo, haloacetil y piridil disulfuro que reaccionan preferentemente con maleimidas, o por medio de unos grupos sulfhidrilo, unas carbodiimidas, así como unas moléculas que soportan unos grupos fotoactivables como la azidobenzoil hidrazida (13).
Además, los inventores han preparado unos productos de acoplamiento en los que el inmunovector es un anticuerpo biespecífico contra un antígeno diana, construido, o bien por vía química o bien por ingeniería genética, y han paralelamente inmunizado unos individuos, por ejemplo unas ratas, con dichos antígenos dianas, y seleccionado unos inmunovectores anticuerpos biespecíficos que reaccionan preferentemente con dichos antígenos dianas, de manera que la acción de los inmunovectores sea específicamente dirigida.
Unas técnicas relativas a la síntesis de anticuerpos biespecíficos han sido en particular descritas por Porstmann et al. en 1984 (16), habiendo sido un estudio titulado ``Development of a bispecific monoclonal antibody for use in molecular hybrisation'' publicado por otra parte en 1994 por Auriol et al. (17).
De manera ventajosa, los anticuerpos biespecíficos utilizados en este procedimiento reconocen entre otros las proteínas Tat, Rev del retrovirus VIH, así como unos marcadores de superficie CD3, CD4, CD8, CD19 y CD34.
Por otra parte, la presente invención se refiere a un procedimiento de transferencia de un principio activo en los núcleos de células eucariotas elegidos, caracterizado por el acoplamiento de este principio activo con un inmunovector que posee a la vez la capacidad de permitir la internalización de este principio activo en estas células eucariotas y una afinidad para el ADN de estas células, hasta el punto de hacerlo apto para transportar este principio biológicamente activo hasta la proximidad inmediata o en los núcleos de estas células.
Este principio biológicamente activo puede ser acoplado de forma covalente o no covalente al inmunovector.
Preferentemente, este procedimiento de transferencia está caracterizado porque el inmunovector que entra en la constitución de este producto se elige entre los que son seleccionables por un test de penetración celular comprende una primera incubación del inmunovector estudiado en presencia de células en el núcleo de las cuales el principio activo susceptible de estar asociado al inmunovector debe ser transportado, seguido después de fijación e impermeabilización de estas células, por otra incubación con unos anticuerpos antiinmunovectores marcados, y finalmente la detección en la proximidad inmediata del núcleo e incluso en el seno de éste de la reacción inmunológica del tipo antígeno-anticuerpo entre el inmunovector y el anticuerpo antiinmunovector.
En una realización preferida del procedimiento de transferencia según la invención, el inmunovector utilizado está formado por un anticuerpo que tiene afinidad para un ácido nucleico, o por un fragmento de este anticuerpo que conserva esta afinidad.
Este inmunovector utilizado en este procedimiento es preferentemente elegido entre los anticuerpos, preferentemente unos IgG monoclonales, los fragmentos (Fab')2 ó (Fab'), o cualesquiera polipéptidos que correspondan al (los) sitio(s) de los anticuerpos implicado(s) en el reconocimiento del ácido nucleico correspondiente.
Ventajosamente, una vez el producto de acoplamiento inmunovector/principio activo preparado, puede ser utilizado para la transferencia intranuclear de otras moléculas. Así, al conjugado fluoresceína/inmunovector experimentado, se puede asociar un anticuerpo antifluoresceína acoplado con una tercera molécula, y así transferir dicha tercera molécula a los núcleos de las células. De manera similar, el conjugado biotina/inmunovector puede permitir enlace de un anticuerpo antibiotina o de avidinaestreptavidina acoplado con una tercera molécula a transferir a los núcleos.
En la presente invención, se han transferido al núcleo una enzima tal como la peroxidasa de rábano silvestre, pero otras proteínas que poseen actividades biológicas variadas pueden también ser utilizadas. Se ha utilizado también la peroxidasa acoplada al inmunovector por medio del glutaraldehído. Sin embargo, otros procedimientos conocidos en la literatura, como los descritos en el caso de los haptenos, pueden ser también utilizados.
Como en el caso de los conjugados haptenos/inmunovector, puede ser utilizado, en asociación con los conjugados proteína/inmunovectores, un anticuerpo antiproteína acoplado con una tercera molécula para la transferencia intranuclear de dicha molécula.
En la invención aquí descrita, aunque se haya transferido un polinucleótido al núcleo, una gran variedad de ácidos nucleicos que poseen actividades biológicas apropiadas puede ser también activamente transferida a nivel intranuclear.
Así, un procedimiento de transferencia de principios activos según la invención permite en particular la transferencia de genes destinados a integrarse en el genoma de las células dianas, en particular por recombinación homóloga más particularmente la transferencia de ADN ``desnudo'', pudiendo este último ser en particular utilizado como ``ADN vacuna''.
Una de las técnicas de recombinación homóloga posible es la descrita por le Mouellic et al. en 1990 (18).
Unos recientes trabajos efectuados por Whalen R. G. et al. han permitido demostrar la existencia de una respuesta inmunitaria a continuación de una transferencia de ADN. Estos trabajos que han constituido el objeto de la solicitud de patente WO 95/11307 han sido más particularmente aplicados a la expresión de moléculas monoclonales del tipo citoquina IL2 (19).
Además, este procedimiento de transferencia permite introducir unas secuencias nucleotídicas implicadas en la inmortalización de diferentes tipos celulares, particularmente los macrófagos, las células dendríticas, las células B y T, y las células hematopoyéticas en particular de origen humano. A título de secuencias nucleotídica se pueden citar las secuencias oncógenas o unas secuencias virales asociadas a unos fenómenos de transformación celular.
Permite también la transferencia de oligonucleótidos antisentido que permiten la inhibición de la síntesis proteínica o nucleotídica, por ejemplo en las células infectables por un retrovirus tal como VIH, o las células tumorales.
En la presente invención, el polinucleótido ha sido acoplado al inmunovector por medio de la p-benzoquinona. Sin embargo, otros procedimientos conocidos en la literatura pueden ser también empleados.
Por otra parte, la presente invención se refiere también a las células eucariotas que contienen unas moléculas activas preferentemente a nivel nuclear, caracterizadas porque dichas moléculas no son naturalmente incorporables a los núcleos de dichas células, o tienen un porcentaje de expresión bajo en dichas células. Estas moléculas son presentadas en estas células en la proximidad inmediata de sus núcleos o en éstos, o acopladas a un inmunovector caracterizado por su afinidad para el ADN de estas células, en estado de producto de acoplamiento según la invención.
Entre las células previstas por la presente invención, se encuentra de nuevo en particular las células infectables por un virus o las células tumorales.
Entran también en el marco de la presente invención los hibridomas que producen los anticuerpos según la presente invención, tales como los depositados en la CNCM el 30 junio de 1995 con los números I-1605, I-1606, I-1607.
Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica caracterizada porque contiene, en asociación con un vehículo fisiológicamente aceptable, un producto de acoplamiento según la invención en el cual el principio biológicamente activo es un principio activo de medicamento o de vacuna y el inmunovector es compatible con el organismo del huésped al cual el medicamento está destinado.
Entra también en el marco de la presente invención, la utilización del producto de acoplamiento de la invención para la expresión en unas células receptoras de una secuencia nucleotídica heteróloga con respecto al ADN del huésped.
Ejemplos I. Preparación de inmunovectores A) Inmunovectores policlonales
Las IgG humanas o murinas son en principio aisladas por paso de una mezcla de sueros que provienen de individuos afectados de lupus eritematoso diseminado -o de ratas lúpicas (NZB x NZW)F1- sobre proteína A inmovilizada sobre Sepharose (14).
Las IgG aisladas son pasadas sobre una columna de ADN inmovilizado sobre celulosa. Los anticuerpos específicos anti-ADN presentes en estas IgG son fijados sobre este inmunoadsorbente ADN-celulosa y eluidos con un tapón carbonato bicarbonato de sodio 20 \muM, pH 10, que contiene 5% de dimetilsulfóxido (15). Se aíslan así 1 a 2 mg de anticuerpos a partir de 10 mg de IgG. Los anticuerpos eluidos son dializados, concentrados y conservados a +4ºC hasta su utilización.
B) Inmunovectores monoclonales murinos
Los esplenocitos que provienen de ratas lúpicas (NZB x NZW)F1 son fusionados con el mieloma X63 según el procedimiento de Köhler y Milstein. Los hibridomas producidos son ensayados en ELISA para secreción de IgG y para su actividad anti-ADN. Los hibridomas secretores de IgG anti-ADN son subclonados por lo menos dos veces y los clones que han permanecido doblemente positivos (IgG + anti-ADN) son cultivados en masa o bien unos ascitas son preparados a partir de estos clones en las ratas. En una experiencia típica a partir del bazo de una rata (NZB x NZW)F1, se han obtenido aproximadamente 300 pocillos positivos que secretan unas IgG de las que 60 eran capaces de reaccionar con el ADN. Después de clonado, 20 clones secretaban la IgG que reconoce el ADN. De estos 20 clones, aproximadamente la mitad secretaban unos anticuerpos capaces de penetrar en el núcleo de las células mientras que los otros no eran capaces (ver C: test de penetración intranuclear de los inmunovectores). Las IgG monoclonales son aisladas a partir de los sobrenadantes de cultivo o de los líquidos de ascitas por precipitación con sulfato de amonio al 45% seguida, después de diálisis, por paso sobre la proteína A inmovilizado sobre Sepharose. Después de neutralización de las IgG eluidas, las preparaciones son dializadas, concentradas y conservadas a -20ºC hasta su utilización.
Los anticuerpos de ratas anteriormente evocados serán subsiguientemente humanizados por la utilización de una de las técnicas conocidas, por ejemplo la descrita por Riechmann et al. (20).
C) Selección de los inmunovectores 1) Test de penetración intranuclear de los inmunovectores
Dos progenies de fibroblastos - PtK2 que provienen del riñón de la rata canguro y GMA-32 que provienen del riñón de hámster - han sido principalmente utilizadas. Las láminas que soportan los fibroblastos en crecimiento exponencial inseminadas con 2 x 10^{4} células/ml, 24 horas antes y puestas en cultivo en medio RPMI 1640 ó MEM (que contiene 10% de suero de ternera fetal, 2mM-L-glutamina y 1% de piruvato de sodio) son incubadas a 37ºC en medio de cultivo renovado, que contiene unas cantidades elegidas de inmunovector (1 a 70 \mug/ml). Después de 2 a 4 horas de incubación, las células son lavadas con PBS y fijadas con o bien etanol durante 10 minutos a -20ºC, o bien con 0,2% de glutaraldehído y 2% de formaldehído en PBS durante 20 minutos. Después de tres lavados con PBS, las células son permeabilizadas durante 20 minutos en PBS que contiene 0,2% de sueroalbúmina bovina y 0,5% de saponina.
Las preparaciones celulares son entonces lavadas con PBS e incubadas durante 45 minutos a 24ºC con unos anticuerpos de conejo o de cordero antiinmunoglobulinas de rata (o antiinmunoglobulinas humanas) marcadas con fluoresceína o con peroxidasa (20 \mug/ml). Después de lavado, las preparaciones celulares incubadas con el anticuerpo fluorescente son examinadas a microscopio de fluorescencia. Las preparaciones celulares incubadas con el anticuerpo marcado con la peroxidasa son en principio incubadas en el substrato citoquímico de la peroxidasa (diaminobencidina (DAB) + H_{2}O_{2}) y, después de lavado, la preparación es examinada a microscopio óptico (14). Se cuenta el número de células positivas.
Tal como se ha descrito anteriormente, unos timocitos de rata han sido también utilizados para ensayar la penetración de los inmunovectores en el núcleo. Unas suspensiones de timocitos han sido preparadas a partir del timo de rata BALB/c. Los timocitos, a una concentración de 1 x 10^{6} células/ml, son incubados a 37ºC durante 3 horas en un medio de cultivo que contiene unas cantidades crecientes de inmunovector (1 a 70 \mug/ml). Después de lavado y fijación, los linfocitos son tratados como las preparaciones de fibroblastos anteriores para la detección intranuclear de los anticuerpos.
2) Test de fijación de los anticuerpos anti-ADN sobre las células linfoides
De manera que se ponga en evidencia una reacción con las membranas de las células, 10^{6} timocitos o esplenocitos de rata han sido incubados en frío durante 45 minutos con 0,1 ml de los diferentes anticuerpos monoclonales diluidos en una solución de albúmina bovina al 0,1% que contiene 0,2% de azida de sodio. Después de lavado, las células son incubadas con unos anticuerpos anti-IgG de rata fluorescente durante 45 minutos en frío. Después de lavado, las células son examinadas al FACS y el número de células positivas determinado en cada población.
De los 20 anticuerpos monoclonales examinados, aproximadamente la mitad secretan unos anticuerpos que son capaces de penetrar en el núcleo de las células mientras que la otra mitad no es capaz. Ha podido ser establecida una correlación entre los anticuerpos monoclonales que penetran con una gran eficacia en el núcleo de las células (número de células marcadas, dilución limite para obtener un marcado) y su aptitud para marcar los timocitos y los esplenocidos.
II. Preparación de inmunovectores que soportan unos haptenos, proteínas o ácidos nucleicos A) Preparación de fragmentos F(ab')2 y Fab' de inmunovectores
Los fragmentos F(ab')2 de los inmunovectores se preparan según unos procedimientos descritos que implican una proteolisis con la pepsina seguida de una reducción por la cisteína para obtener el fragmento Fab' (14). Así en 5 ml de tampón citrato-ácido cítrico 0,1 M, pH 3,5, que contiene 5 mg de inmunovector, se añaden 150 \mug de pepsina y se incuba 2 horas a 37ºC. El medio es ajustado a pH 8 y la preparación filtrada sobre una columna de proteína A-Sepharose para eliminar las IgG no digeridas. Después de diálisis contra PBS, esta preparación de F(ab')2 es conservada a -20ºC hasta utilización. Para obtener los fragmentos Fab' se añade cisteína a una concentración final de 0,02 M en la preparación del F(ab')2. Después de 10 minutos de incubación a 37ºC, se añade 0,04 M de yodoacetamida y se deja incubar durante 30 minutos. Esta preparación de Fab' es dializada contra PBS y es conservada a -20ºC hasta su utilización.
B) Inmunovectores/haptenos Acoplamiento con la biotina
En 0,5 ml de tampón fosfato 0,1 M, pH 7, que contiene 1 mg de anticuerpos, se añaden 2 \mul de una solución 0,1 M de d-biotina-N-hidroxisuccinimida éster en dimetilformamida (1 mg del éster activo en 30 \mul de dimetilformamida). Se deja la solución durante una hora a temperatura del laboratorio y se dializa contra PBS a +4ºC durante toda la noche.
Acoplamiento con la fluoresceina
En 1 ml de una solución de carbonato de sodio 0,1 M que contiene 1 mg de anticuerpo, se añaden 20 \mul de una solución de isotiocianato de fluoresceína en dimetilsulfóxido (10 mg/ml). Se deja la solución 3 horas a temperatura del laboratorio y se dializa contra PBS a +4ºC.
C) Inmunovectores/proteínas Acoplamiento con la peroxidasa
Diez miligramos de peroxidasa se disuelven en 0,2 ml de glutaraldehído al 1% en tampón fosfato 0,1 M pH 6,8. Después de incubación a la temperatura del laboratorio durante 18 horas, la solución es filtrada sobre una columna de Sephadex G25 (0,9 x 60 cm) equilibrada con NaCl 0,15 M para eliminar el exceso de glutaraldehído. A esta solución de peroxidasa activa, se añade 1 ml de una solución de NaCl 0,15 M que contiene 5 mg de anticuerpo y 0,2 ml de tampón carbonato-bicarbonato 1M pH 9,5. La solución es conservada a +4ºC durante 24 horas y después se añade lisina a la concentración final de 0,1 M, y después es dializada contra PBS a 4ºC.
D) Inmunovectores/ácidos nucleicos Polinucleótidos
El polinucleótido utilizado estaba compuesto por 15 nucleótidos y llevaba una fluoresceína en 5' y un grupo NH_{2} libre en 3'. Se ha preparado según unos procedimientos clásicos de síntesis nucleica. Este nucleótido está acoplado con el inmunovector por medio de la p-benzoquinona (14). En 0,4 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 6 que contiene 1 mg de inmunovector (molécula entera F(ab')2 ó Fab') se añaden 0,1 ml de etanol que contiene 3 mg de p-benzoquinona. Después de una incubación de una hora a la temperatura del laboratorio la preparación es filtrada sobre columna de Sephadex G-25. La fracción que contiene el inmunovector activado es adicionada con polinucleótido en una relación de una molécula de inmunovector para 4 moléculas de polinucleótido, y la solución llevada a pH 9,2 con tampón carbonato-bicarbonato. Después de 18 horas de incubación a la temperatura del laboratorio, la reacción es parada por adición de lisina a la concentración de 0,1 M final y a continuación dializada contra PBS. Esta preparación es conservada a +4ºC hasta su utilización.
Plásmidos
Se han ensayado dos plásmidos, uno primero que soporta el promotor de la vimentina corriente arriba del gen que codifica para los antígenos T, t del SV40 (pHuVim 830 T, t) (21) y un segundo que soporta el gen de la luciferasa (22) bajo control de un promotor del citomegalovirus (pCMV-Luc) (5).
Estos plásmidos son mantenidos en la cepa E. Coli y se preparan con un cultivo bacteriano por el método estándar de lisis en presencia de detergente y en medio alcalino. Los plásmidos son a continuación purificados por cromatografía sobre una columna de resina (Qiagen Plasmid Kits).
Los inmunovectores J-20.8 y F-14.6 son utilizados para este trabajo. Estos anticuerpos se preparan por el procedimiento de preparación de inmunovectores monoclonales anteriormente descrito en el párrafo I.B/. Los anticuerpos son acoplados a la poli-L-lisina con la ayuda de una agente de acoplamiento, en particular una carbodiimida, tal como la EDC (1-(3-dimetilaminopropil)-1'- etilcarbodiimida). En ciertos casos, unas IgG policlonales son añadidas al anticuerpo anti-ADN en una relación 10 : 1 de manera que aumente la concentración de IgG en el medio y favorezcan así el acoplamiento con la polilisina.
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2 mg de anticuerpos monoclonales (J-20.8 ó F-14.6) en 1 ml de PBS o de IgG policlonales concentradas a 20 mg/ml son dializados toda la noche contra un tampón MES, 10 mM, pH 5. Dos mg de poli-L-lisina (PM = 18.000) se disuelven en 1 ml de este mismo tampón y después se añaden a 0,2 mg de EDC (en 50 \mul de tampón MES) durante 30 segundos. La solución de poli-L-lisina es entonces añadida a la mezcla anticuerpos/EDC y la incubación se prosigue durante 2 horas.
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la preparación es a continuación filtrada sobre una columna proteína A-Sepharose para separar el exceso de poli-L-lisina de los anticuerpos conjugados con la polilisina que son eluidos a pH 3 en las condiciones habituales, neutralizados y dializados contra PBS.
III. Ejemplos de transferencia de sustancias en los núcleos de las células por unos inmunovectores asociados a estas sustancias A) Transferencia in vitro de la fluoresceina
Unos fibroblastos de la progenie GM A-32 en cultivo son sobre unas láminas de cristal son incubados a 37ºC durante 2 a 4 horas en medio de cultivo RPMI que contiene cantidades crecientes de inmunovectores monoclonales (anticuerpo J-20.8 ó fragmentos Fab'2) marcados con la fluoresceína. Al cabo de este tiempo, las células son lavadas y fijadas como se ha descrito en IC1. Después de inclusión en el medio Mowiol, las mismas son examinadas al microscopio en fluorescencia. La casi totalidad de los núcleos de los fibroblastos muestra un marcado fluorescente. Por el contrario, los núcleos de fibroblastos incubados con un anticuerpo monoclonal testigo Ig 2a sin actividad anti-ADN, que no penetra en los núcleos, no presenta fluorescencia (Figuras 1 y 2).
B) Transferencia in vivo de la fluoresceína a los linfocitos periféricos de la rata
Un mg de inmunovector (anticuerpo monoclonal C-2.1 ó F-4.1 o de anticuerpo testigo, anticuerpo monoclonal G-14) marcado con la fluoresceína es inyectado a dos ratas a razón de 0,2 ml por vía intravenosa y 0,3 ml por vía intraperitoneal. Después de 5 horas las ratas son sangradas y sacrificadas y los linfocitos de la sangre que circulan son analizados por FACS. Se observa que 60% de los linfocitos de la sangre periférica que proviene de la rata inyectada con el inmunovector son fluorescentes mientras que ninguno de los linfocitos del animal testigo lo es (Figura 3). El examen al microscopio muestra fluorescencia a nivel de los núcleos en la mayoría de las células.
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C) Transferencia de la biotina
Unos fibroblastos de la progenie PtK2 (10^{5}/ml), puestos en cultivo 24 horas antes, son incubados en un medio de cultivo RPMI completo con unas IgG policlonales anti-ADN humanas marcadas con biotina en cantidades crecientes (5-100 \mug). Después de 3 horas, las células son lavadas, fijadas y permeabilizadas como se ha descrito en IC. Las células son a continuación incubadas con RPMI que contiene 1 \mug/ml de estreptavidina marcada con la peroxidasa. Después de una hora, las células son lavadas tres veces con PBS y la peroxidasa asociada a las células es revelada utilizando el medio DAB + H_{2}O_{2}. Las preparaciones son incluidas en Mowiol y examinadas al microscopio óptico. Un gran número de núcleos de los fibroblastos incubados con la IgG anti-ADN son positivos mientras que las células incubadas con unas IgG que provienen de individuos normales y marcadas con la biotina, son negativas.
D) Transferencia de la peroxidasa
En las condiciones definidas en el párrafo IIIC, los fibroblastos PtK2 son incubados con unas cantidades crecientes de fragmentos Fab' de un inmunovector (anticuerpo J-20.8) marcado con la peroxidasa. Después de 3 horas, las células son lavadas tres veces con PBS y fijadas durante 20 minutos con 0,2% de glutaraldehído y 2% de formaldehído en PBS. Después de lavado, se revela la actividad de la peroxidasa por el test coloreado DAB + H_{2}O_{2} y se examinan las preparaciones al microscopio óptico. Una gran proporción de núcleos de los fibroblastos incubados con los fragmentos Fab' del anticuerpo J-20.8 son positivos para la peroxidasa, mientras que los incubados con el anticuerpo control 48.9 son negativos.
E) Transferencia de polinucleótido marcado con fluoresceína
3 x 10^{6} esplenocitos, preparados a partir del bazo de rata BALB/c, son incubados en 1 ml de RPMI que contiene 40 \mug/ml de inmunovector (J-20.8) o de su fragmento Fab' acoplado de forma covalente al polinucleótido. Después de tres horas de incubación a 37ºC, las células son lavadas con PBS, fijadas en 4% de paraformaldehído y examinadas a microscopio. 8 a 10% de las células muestran una fluorescencia molecular (Figura 4).
F) Transferencia de plásmido
La eficacia de transfección ha sido evaluada por la puesta en evidencia de la síntesis de las proteínas codificadas por estos genes, o bien con la ayuda de anticuerpos anti-antígeno T acopladas a la peroxidasa, o bien por una dosificación luminométrica de la actividad de la luciferasa sobre su substrato la luciferina.
Las células utilizadas son unos fibroblastos de la progenie GMA-32 y unas células del carcinoma Hep 2. Las mismas son cultivadas en un medio completo (medio RPMI 1640 que contiene 10% de suero de ternera fetal, 2 mM L-glutamina, 1% de piruvato de sodio y unos antibióticos), a 37ºC con 5% de CO_{2}.
Plásmido pHuVim 830 T, t: las células Hep 2 son inseminadas la vigilia a razón de 2 x 10^{4} células en 0,5 ml de medio completo por pocillo de una placa de 24 pocillos. Para la transfección, el medio es retirado y reemplazado por 0,3 ml de medio completo que contiene 20 \mug de anticuerpo-poli-L-lisina y 2 \mug de plásmido, ó 20 \mug de anticuerpos nativos y 2 \mug de plásmido ó 2 \mug de plásmido solo. Después de 6 horas, el medio es cambiado y el cultivo es proseguido cambiando el medio cada dos días y desdoblando las células si es necesario. La eficacia de la transfección es ensayada en tiempos variables.
Plásmido pCMV-Luc: las células GMA-32 son inseminadas la vigilia a razón de 7 x 10 x 10^{4} células/0,5 ml de medio completo por pocillo de una placa de 24 pocillos de medio de cultivo completo. Para la transfección, el medio es retirado y reemplazado por 0,5 ml de medio completo que contiene 8 \mug de J-20.8/polisina ó de F-14.6/polilisina, ó 20 \mug IgG policlonal y 2 \mug de plásmido ó 2 \mug de plásmido solo. Después de 6 horas, el medio es cambiado. La eficacia de la transfección es ensayada 24 horas después del inicio de la transfección.
Control de la transfección
Plásmido pHuVim 830 T,t: La síntesis del antígeno T en el núcleo de las células transfectadas es puesta en evidencia por un procedimiento inmunocitoquímico. Las células son lavadas 3 veces con PBS y después fijadas 10 minutos en metanol a -20ºC. Las mismas son a continuación incubadas con el anticuerpo antiantígeno T acoplado a la peroxidasa durante 1 hora. Después de lavado, la peroxidasa es revelada por la mezcla DAB + H_{2}O_{2}. En el pocillo incubado con el complejo J-20.8-polilisina y plásmido, unas células aisladas y de algunos focos de células tienen un núcleo fuertemente coloreado de marrón después de 48 horas y después de 2 semanas. El testigo con el anticuerpo nativo o el plásmido solo es negativo.
Plásmido pCMV-Luc: La eficacia de la transfección es puesta en evidencia por la síntesis de luciferasa detectable en los lisados de las células transfectadas. Esta enzima cataliza la oxidación de la luciferina que se traduce por un producto detectable en un luminómetro. Después del cultivo, las células son lavadas con PBS y después lisadas en un tampón Tris-fosfato, 25 mM, pH 7,8, que contiene 8 mM MgCl_{2}, 1 mM DTT, 1% Tritón X 100, 1% BSA y 15% de glicerol. El lisado es dosificado en un luminómetro por adición automática de una solución de luciferina (0,25 mM) y de ATP (1 mM). Un alicuota del mismo lisado es dosificado en cuanto a su concentración de proteínas por un reactivo de Coomassie (Bio-Rad Protein Assay). Los resultados son expresados en unidades (RLU) por mg de proteínas. Como muestra la tabla, la transferencia de genes tiene lugar en presencia de las preparaciones de anticuerpos J-20.8/polilísina y F-14.6/polilísina mientras que las IgG/polilisina no tienen efecto.
La eficacia de transfección para una misma relación anticuerpo/plásmido es 10 veces más elevada con la preparación J-20.8 que con la F-14.6. Además, la adición de IgG policlonales concentradas durante el acoplamiento a la polilisina parece aumentar la eficacia de transfección puesto que 2 \mug de J-20.8 (complejo 20: 0,5) de la preparación J-20.8-IgG/polilisina dan unos resultados del mismo orden de magnitud que 8 \mug (complejo 8: 0,5) de la preparación J-20.8/polilisina.
El conjunto de los resultados obtenidos están resumidos en la tabla siguiente:
Inmunovector Relación Dosificación
anticuerpo/plásmido RLU/mg x 10^{4}
\mug/\mug
20 : 0,5 5,8
J.20.8-IgG/polilisina
20 : 0,5 63,00
8 : 2 2,00
8 : 1 15,00
J-20.8/polilisina
8 : 1 38,00
8 : 0,5 13,00
F-14.6/polilisina 8 : 0,5 1,3
20 : 0,5 <0,1
IgG/polilisina
20 : 0,5 <0,1
2 <0,1
Plásmido solo (\mug) 1 <0,1
0,5 <0,1
En lo que precede, los inmunovectores preferidos estaban esencialmente formados por unos anticuerpos anti-ADN o unos fragmentos de estos anticuerpos bajo reserva de que estos fragmentos retengan el sitio de reconocimiento para el ADN entero. Desde luego que naturalmente los inmunovectores utilizables en el marco de la invención podrían estar constituidos de cualquier otra forma, siempre que permitieran también el transporte del principio biológicamente activo que les estaría asociado a través de las membranas de estas células y de su citoplasma y su transferencia a la proximidad del núcleo de las células, incluso en el interior de este núcleo.
A título de ejemplos de dichos inmunovectores, se pueden citar unos conjugados entre una proteína nuclear, por ejemplo una histona, una proteína hnRNP, una polimerasa o un factor asociado a esta polimerasa, y el producto activo, siendo esta proteína nuclear a su vez (salvo que sea ella sola capaz de asegurar la internalización y el transporte de un principio biológicamente activo hacia el núcleo de las células) conjugada con el anticuerpo antirrecepto membranario de la célula o cualquier otra molécula que permita la internalización en la célula del conjugado así producido. Desde que este conjugado es apto para difundir hasta el núcleo de las células y que por otra parte podría a su vez transportar y transferir, como se ha definido más arriba, en principio biológicamente activo que estaría acoplado a este conjugado, constituye un inmunovector que entra en el marco de la presente invención.
Las técnicas de selección que han sido descritas más arriba, para la elección de inmunovectores eficaces para la transferencia de un principio activo en el núcleo de las células son por tanto aplicables a la selección de los conjugados mencionados.
El experto en la materia comprenderá que un criterio de selección suplementario podría, para por lo menos algunos de los conjugados utilizados, residir en la ausencia de una intervención indeseable de la proteína nuclear que contiene con el funcionamiento de la célula. Es por otra parte de observar que solamente la parte de la proteína intranuclear que soporta su sitio de reconocimiento del ADN correspondiente es indispensable para la realización de acuerdo con la invención.
Leyenda de las figuras Figura 1 Transferencia in vitro de la fluoresceína
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Marcado de los núcleos de los fibroblastos GMA 32 por un inmunovector marcado con la fluoresceína (anticuerpo J-20.8) en A y B (ampliación x 100).
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C: Ausencia de marcado con el anticuerpo control fluorescente ( x 100).
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D: Otro campo visto con pequeña ampliación (x 40).
Figura 2
La misma preparación que la de la Figura 1A analizada en microscopio confocal. Los fibroblastos GMA 32 están marcados esencialmente en el núcleo. En la Figura 2A, se puede observar una fluorescencia total. La Figura 2B corresponde al análisis de la intensidad de fluorescencia.
Figura 3 Transferencia de la fluorescencia in vivo
Análisis con el FACS de las células de la sangre periférica de las ratas inyectadas 5 horas antes en la Figura 3A, el anticuerpo control fluorescente y en la Figura 3B con un inmunovector fluorescente el anticuerpo (J-20.8). Histogramas que representan en abscisas, la intensidad de fluorescencia (en unidad arbitraria) y en ordenadas, el número de células.
Figura 4
Análisis de las células de la sangre periférica (de la figura 3) en microscopía confocal. En la figura 4A, se puede observar una fluorescencia total. La Figura 4B corresponde al análisis de la intensidad de fluorescencia.
Figura 5 Transferencia in vitro de un nucleótido
Análisis en microscopía confocal de un esplenocito de rata en el cual ha penetrado el fragmento Fab' de un inmunovector (anticuerpo J-20.8) acoplado a un nucleótido fluorescente. En la Figura 5A, se observa una fluorescencia total. La Figura 5B corresponde al análisis de la intensidad de fluorescencia.
Referencias
(1)
``Non-viraltherapy'', Current Opinion on Biotechnology, Vol. 5, p. 626-636, (1994), Ledley F.D.
(2)
T.D. McKee, M.E. DeRome, G.Y. WU y M.A. Findeis. Preparation of asioloorosolucoid-polylysine conjugates. Bioconjugate Chem., 5:306 (1994).
(3)
Receptor-mediated endocytosis and nuclear transport of transfecting DNA construct. A.A. Rosenkrank, S.V. Yachmenev, D.A. Jans, N.V. Serebryakova, V.I. Murav'ev, R. Peters y A.S. Sobolev. Exp. Cell Res., 199:323 (1992).
(4)
Receptor-mediated endocytosis of transferrin-polycation conjugates an efficient way to introduce DNA into hematopoietic cell M. Zenke, P. Steinlein, E. Wagner, M. Cotte, H. Beug, y M.L. Birnstiel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3655 (1990).
(5)
J.R. Merwin, E.P. Carmichael, G.S. Noell, M.E. DeRome, W.L. Thomas, N. Robert, G. Spitalny y H.C. Chiou. CD5-mediated specific delivery of DNA to T lyphocytes: compartmentalization augmented by adenovirus J. Immunol. Methods, 186-257 (1995).
(6)
E. Wagner, K. Zatloukal, M. Cotten, H. Kirlappos, K. Mechtler, D.T. Curiel y M.L. Birnstiel. Coupling of adenovirus to transferrin-polylysine/DNA complexes enhances receptor-mediated gene delivery and expression of transfected genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89-6099 (1992).
(7)
``Antibody to nuclear ribonucleoprotein penetrates live human mononuclear cells through Fc receptors'', Nature, Vol. 271 (1978), Donarto Alarcón-Segovia et al.
(8)
``Antibody penetration into living cells'', The Journal of Immunology, Vol. 122 (1979), Donarto Alarcon-Segovia et al.
(9)
``V_{H} gene analysis of spontaneously activated B cells in adult MRL-lpr/lpr mice''. The Journal of Immunology, Vol. 147, páginas 1504-1511, (1991), Mary H. Foster et al.
(10)
``Murine Monoclonal Anti-DBA Antibodies Penetrate Cells, Bind to Nucleic, and Induce Glomerular Proliferation and Proteinuria In Vivo'', J. Am. Soc. Nephrol., Vol. 2, p. 1345-1354 (1992). Demetrios Vlahakos et al.
(11)
``Monoclonal Murine anti-DNA antibody interacts with living mononuclear cells'', Arthritis and Rheumatism, Vol. 30, No. 6, p. 669-678, (1987), Okudaira et al.
(12)
``Cross-reactions of anti-DNA autoantibodies with cell surface proteins'', Eur. J. Immunol., Vol. 23, p. 383-390, (1993), Eyal Raz et al.,
(13)
``Life Science & Analytical Research Products'', Pierce Interchim.
(14)
``Techniques immunoenzymatiques'', Editions Inserm, (1987), Ternynck T. y Avrameas S.
(15)
``DNA affinity column chromatography: applications in the isolation of distinct antibody populations SLE sera'', Clin. Exp. Immunol., Vol. 62, pp.321-328, (1985) Kubota et al.
(16)
"An antibody chimera technique applied to enzyme immunoassay for human alpha-1-fetoprotein with monoclonal and polyclonal antibodies", J. Immunol. Methods, (1984), Vol. 66, p. 179-185, Porstmann B et al.
(17)
"Development of a bispecific monoclonal antibody for use in molecular hybridization", J. Immunol. Methods, (1994), Vol. 169, p. 123-133, Auriol. J. et al.
(18)
``Targeted replacement of the homeobox gene Hox-3 1 by the Escherichia coli lacZ in mouse chimeric embryos'', Genetics, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1990), Vol. 87, p. 4712-4716, Le Mouellic et al.
(19)
``DNA-mediated immunization and the energetic immune response to hepatitis B surface antigen'', Clin. Immunology and Immunopathology, (1995), Vol. 75, p.1-12, Whalen R. G. et al.
(20)
``Rehasping human antibodies for therapy'', Nature (1988), Vol. 332, p. 323-327, Riechmann et al.
(21)
B. Schwartz, P. Vicart, C. Delouis y D. Paulin, Mammalian cell lines can be efficently established in vitro upon expression of the SV40 large T antigen driven by a promoter sequence derived from the human vimentin gene. Biol. Cell., 72:7 (1991).
(22)
S.K. Nordeen. Luciferase reporter gene vectors for analysis of promoters and enhancers. Bio Techniques, 6:454 (1988).

Claims (24)

1. Producto de acoplamiento entre un principio biológicamente activo y un inmunovector, caracterizado a la vez por la capacidad del inmunovector de permitir la internalización en unas células eucariotas de un principio biológicamente activo, y por la afinidad del inmunovector para el ADN de estas células, hasta el punto de hacer dicho inmunovector apto para transferir el principio biológicamente activo a la proximidad inmediata de los núcleos de estas células o en estos núcleos.
2. Producto según la reivindicación 1, caracterizado porque el acoplamiento entre el principio biológicamente activo y el inmunovector utiliza un enlace covalente o no covalente.
3. Producto según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, caracterizado porque el inmunovector que entra en la constitución de este producto se elige entre los que son seleccionables por un test de penetración celular que comprende una primera incubación del inmunovector estudiado en presencia de células en el núcleo de las cuales el principio es susceptible de ser asociado con el inmunovector debe ser transferido, seguida, después de fijación y permeabilización de estas células, de otra incubación con unos anticuerpos antiinmunovectores marcados, y finalmente de una detección en la proximidad inmediata del núcleo o incluso en el seno de éste de la reacción inmunológica del tipo antígeno-anticuerpo entre el inmunovector y el anticuerpo antiinmunovector.
4. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el inmunovector está formado por un anticuerpo que tiene afinidad para un ácido nucleico o un fragmento de este anticuerpo que conserva esta afinidad.
5. Producto según la reivindicación 4, caracterizado porque el inmunovector se elige entre las IgG monoclonales, los fragmentos (Fab')2 ó (Fab'), o cualesquiera polipéptidos que correspondan al (los) sitio(s) de los anticuerpos implicado(s) en el reconocimiento del ácido nucleico correspondiente.
6. Producto según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque los inmunovectores son unas inmunoglobulinas, en particular unas IgG portadoras de actividad anti-ADN que provienen de individuos normales.
7. Producto según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque los inmunovectores son unas inmunoglobulinas en particular unas IgG portadoras de actividad anti-ADN, que provienen de individuos que presentan unos síndromes autoinmunes, más particularmente los síntomas de lupus eritematoso diseminado.
8. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque se trata de un anticuerpo biespecífico que reconoce por una parte el ADN y por otra parte una proteína tal como Tat, Rev del retrovirus VIH, y, por otra parte, unos marcadores de superficie tales como CD3, CD4, CD8, CD19, y CD34.
9. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el principio activo acoplado al inmunovector es una molécula elegida entre unos ácidos nucleicos, unas proteínas o unos haptenos.
10. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el principio activo acoplado con el inmunovector está constituido por un plásmido que permite la expresión de una proteína codificada por un gen contenido en dicho plásmido.
11. Producto según la reivindicación 10, caracterizado porque cuando el inmunovector es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, este último es previamente acoplado a un agente capaz de inducir un efecto de compactado sobre el ADN, siendo este agente preferentemente la polilisina.
12. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el principio activo está constituido por un gen destinado a integrarse en el genoma de las células dianas, en particular por recombinación homóloga, más particularmente un ADN ``desnudo'' que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido originario de células bacterianas o de eucariotas, de célula fúngicas o de virus, teniendo estos polipéptidos propiedades vacunantes.
13. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el principio activo permite a la inmortalización de tipos celulares elegidos, particularmente los macrófagos, las células dendríticas, las células B y T, y las células hematopoyéticas, en particular de origen humano.
14. Producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el principio activo es un oligonucleótido antisentido que permite la inhibición de la síntesis proteínica o nucleotídica, por ejemplo en las células afectadas por un retrovirus VIH, o en unas células tumorales.
15. Células eucariotas que contienen unas moléculas activas preferentemente a nivel nuclear, caracterizadas porque dichas moléculas no son naturalmente incorporables a los núcleos de dichas células, o tienen un porcentaje de expresión bajo en dichas células, siendo dichas moléculas presentadas en estas células en la proximidad inmediata de sus núcleos o en éstos, y acopladas a un inmunovector caracterizado por su afinidad para el ADN de estas células, en estado de producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
16. Células según la reivindicación 15, caracterizadas porque se trata de células infectables por un virus o de células tumorales.
17. Hibridomas depositados en la CNCM el 30 de junio de 1995 con los números de registro:
I-1605
I-1606
I-1607.
18. Procedimiento de transferencia in vitro de un principio activo a los núcleos de células eucariotas elegidas, caracterizado por el acoplamiento de este principio activo inmunovector que posee a la vez la capacidad de permitir la internalización de este principio activo en estas células eucariotas y una afinidad para el ADN de estas células, hasta el punto de ser apto para transportar este principio biológicamente activo a la proximidad inmediata o a los núcleos de estas células.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque el principio biológicamente activo está acoplado de forma covalente o no covalente con el inmunovector.
20. Procedimiento según la reivindicación 18 ó 19, caracterizado porque el inmunovector que entra en la constitución de este producto se elige entre los que son seleccionables por un test de penetración celular que comprende una primera incubación del inmunovector estudiado en presencia de células en el núcleo de las cuales el principio activo es susceptible de ser asociado al inmunovector debe ser transportado, seguida después de fijación y permeabilización de estas células, de otra incubación con unos anticuerpos antiinmunovectores marcados, y finalmente por una detección en la proximidad inmediata del núcleo e incluso en el seno de éste de la reacción inmunológica del tipo antígeno-anticuerpo entre el inmunovector y el anticuerpo antiinmunovector.
21. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque el inmunovector está formado por un anticuerpo que tiene afinidad para un ácido nucleico o para un fragmento de este anticuerpo que conserva esta afinidad.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque el inmunovector se elige entre los anticuerpos, preferentemente unas IgG monoclonales, los fragmentos (Fab')2 ó (Fab'), o cualesquiera polipéptidos que correspondan al (los) sitio(s) de anticuerpos implicado(s) en el reconocimiento del ácido nucleico correspondiente.
23. Composición farmacéutica, caracterizada porque contiene, en asociación con un vehículo fisiológicamente aceptable, un producto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la cual el principio biológicamente activo es un principio activo de medicamento o de vacuna y el inmunovector es compatible con el organismo del huésped al cual el medicamento está destinado.
24. Utilización del producto según la reivindicación 1 para expresar in vitro en unas células receptoras una secuencia nucleotídica heteróloga con respecto al ADN del huésped.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2736642B1 (fr) * 1995-07-10 1997-09-12 Pasteur Institut Immunovecteurs, notamment anticorps et fragments d'anticorps utilisables pour le transport intracellulaire et intranucleaire de principes biologiquement actifs notamment d'haptenes, de proteines et d'acides nucleiques
FR2766826B1 (fr) 1997-08-04 2001-05-18 Pasteur Institut Vecteurs derives d'anticorps pour le transfert de substances dans les cellules
EP1006197A1 (en) * 1998-12-04 2000-06-07 Transgene S.A. Use of an immuno complex for the preparation of a therapeutic composition useful for transfecting a polynucleotide into macropinocyte cells
JP3513068B2 (ja) * 1999-05-12 2004-03-31 浜松ホトニクス株式会社 生細胞の細胞質内標的核酸を検出する方法
FR2805821B1 (fr) 2000-03-01 2004-01-16 Diatos Sequences d'acides amines facilitant la penetration d'une substance d'interet a l'interieur des cellules et/ou des noyaux cellulaires
US8003595B2 (en) 2000-03-01 2011-08-23 Cellectis Amino acid sequences facilitating penetration of a substance of interest into cells and/or cell nuclei
US20030032597A1 (en) * 2001-07-31 2003-02-13 Sebestyen Magdolna G. Targeting nucleic acids to a cellular nucleus
US7049286B2 (en) 2001-08-30 2006-05-23 Diatos, S.A. Insulin conjugates and methods of use thereof
AU2003221118A1 (en) * 2002-03-22 2003-10-08 Bipha Corporation Immunoglobulin/hydrophilic peptide complexes
ES2330115T3 (es) 2003-08-14 2009-12-04 Cellectis Composicion antibacteriana, mas particilarmente contra las bacterias gram-negativas, que comprende un peptido y un agente antibacteriano ventajosamente hidrofobo.
EP1797901A1 (en) 2005-12-16 2007-06-20 Diatos Cell penetrating peptide conjugates for delivering nucleic acids into cells
EP1818395A1 (en) 2006-02-08 2007-08-15 Diatos Compositions and methods for treating lysosomal storage diseases
AU2012298824B2 (en) 2011-08-23 2017-06-01 President And Fellows Of Harvard College Peptide nanoparticles and uses thereof
CN104244973B (zh) 2012-11-16 2017-10-20 美国联合生物医学公司 针对口蹄疫(fmd)的基于合成肽的紧急疫苗
EP3984554A4 (en) * 2019-06-11 2023-11-08 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. IMMUNOSUPPRESSION AGENT

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2334107A1 (fr) * 1975-12-05 1977-07-01 Pasteur Institut Procede de couplage de substances biologiques par des liaisons covalentes
US4650675A (en) * 1983-08-18 1987-03-17 The Children's Medical Center Corporation Oligonucleotide conjugates
US4599998A (en) * 1984-06-01 1986-07-15 Castillo James D Adjustable polycentric orthopedic appliance hinge
US4812397A (en) * 1987-02-10 1989-03-14 The Regents Of The University Of California MAB-anti-DNA related to nephritis
US5428132A (en) * 1987-10-11 1995-06-27 United States Of America Conjugate and method for integration of foreign DNA into cells
US4952499A (en) * 1988-02-11 1990-08-28 Dana-Farber Cancer Institute Genes and their encoded proteins which regulate gene expression of the interleukin-2 receptor and of human lymphotropic retroviruses
US5391723A (en) * 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
ZA914625B (en) * 1990-06-22 1993-02-24 Lilly Co Eli In vivo targeting with bifunctional antibodies
US5733523A (en) * 1990-12-10 1998-03-31 Akzo Nobel N.V. Targeted delivery of a therapeutic entity using complementary oligonucleotides
DE4104186A1 (de) * 1991-02-12 1992-08-13 Genentech Inc Neue, ueber endozytose in hoehere eukaryotische zellen aufnehmbare, nukleinsaeure enthaltende komplexe
AP257A (en) * 1991-04-26 1993-06-03 Surface Active Ltd A method of releasing an antigen from an antibody and methods for their use in diagnosis and therapy.
US5298422A (en) * 1991-11-06 1994-03-29 Baylor College Of Medicine Myogenic vector systems
US5922859A (en) 1992-02-01 1999-07-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Complexes containing nucleic acid which can be taken-up by endocytosis into higher eukaryotic cells
EP0656064B1 (en) * 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
DE4318402A1 (de) * 1993-06-03 1994-12-08 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum Nachweis eines programmierten oder induzierten Zelltods eukaryontischer Zeller
US5681700A (en) * 1994-05-25 1997-10-28 Oklahoma Medical Research Foundation Assay for pathogenicity of anti-DNA antibodies
US5648219A (en) * 1995-06-07 1997-07-15 Zymogenetics, Inc. Immortalized dendritic cells
US5837533A (en) * 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
US5908777A (en) * 1995-06-23 1999-06-01 University Of Pittsburgh Lipidic vector for nucleic acid delivery
FR2736642B1 (fr) * 1995-07-10 1997-09-12 Pasteur Institut Immunovecteurs, notamment anticorps et fragments d'anticorps utilisables pour le transport intracellulaire et intranucleaire de principes biologiquement actifs notamment d'haptenes, de proteines et d'acides nucleiques
US5616819A (en) * 1995-08-28 1997-04-01 Laroche Industries Inc. Process for preparing fluorinated aliphatic compounds
WO1997032602A1 (en) * 1996-03-08 1997-09-12 The Regents Of The University Of California DELIVERY SYSTEM USING mAb 3E10 AND MUTANTS AND/OR FUNCTIONAL FRAGMENTS THEREOF
US5992859A (en) * 1998-04-27 1999-11-30 Chum Power Machinery Corp. Bit holding system for a power hand tool

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Publication number Publication date
DE69628298D1 (de) 2003-06-26
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FR2736642B1 (fr) 1997-09-12
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