JP2000505646A - 補体系蛋白の高親和性核酸リガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 補体系蛋白に対する高親和性核酸リガンドを同定、調製する方法を記載する。補体系蛋白、Ｃｌｑに対する高親和性核酸リガンドを同定、調製する方法を記載する。本発明は、ＳＥＬＥＸ法により同定される、Ｃｌｑに対する特異的なＲＮＡリガンドを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 補体系蛋白の高親和性核酸リガンド発明の分野 本明細書中には、補体系蛋白に対する高親和性核酸リガンドを同定、調製する 方法を記載する。このような核酸リガンドを同定するために本明細書中で利用す る方法はＳＥＬＥＸと呼ばれるが、これは「Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment（指数濃縮によるリガンドの系統的進化）」の頭字 語である。本明細書中には、補体系蛋白Ｃｌｑに対する高親和性核酸リガンドを 同定、調製する方法を記載する。本発明は、Ｃｌｑの高親和性核酸リガンドを含 む。また、ＣｌｑのＲＮＡリガンドも開示する。また、補体系を抑制および／ま たは活性化する高親和性核酸リガンドも開示する。本発明のオリゴヌクレオチド は薬剤または診断薬として有用である。発明の背景 補体系は、制御されたカスケード系の中で協同作用して細胞外の形態の病原体 を攻撃する、少なくとも20種類の血漿蛋白および膜蛋白の組から成る（47及び48 ）。別個の二つの酵素的活性化カスケード、即ち古典的経路および代替経路と、 膜侵襲複経路として知られている非酵素的経路がある。古典的経路は通常、異物 粒子と結合した抗体によって開始する。これはＣ１、Ｃ４、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５（ 経路中の順）など、数種類の成分から成る。 補体系の古典的経路の開始は、免疫活性化因子と非免疫活性化因子の両方によ る第１の補体成分（Ｃ１）の結合および活性化に続いて起きる（１）。Ｃ１はカ ルシウム依存性複合体のＣｌｑ、ＣｌｒおよびＣｌｓから成り、Ｃｌｑ成分の結 合を通じて活性化される。Ｃｌｑは６個の同じサブユニットを含み、各サブユニ ットは３種類の鎖（Ａ鎖、Ｂ鎖、Ｃ鎖）から成る。各鎖はコラーゲン様の尾部と 結合した球状頭部領域を有する。抗原−抗体複合体によるＣｌｑの結合および活 性化はＣｌｑ球状頭部領域を通じて起きる。蛋白、脂質、核酸を含む多くの非抗 体Ｃｌｑ活性化因子（２）はコラーゲン様柄領域上の別個のサイトを通じて結合 、活性化する。 非抗体Ｃｌｑ蛋白活性化因子にはＣ−反応性蛋白（ＣＲＰ）（３）と血清アミ ロイド蛋白（ＳＡＰ）（４）が含まれ、これらはそれぞれホスホリピドまたは炭 水化物と結合することにより凝集するとＣｌｑを活性化する。単量体のＣＲＰま たはＳＡＰはＣｌｑを活性化しない。Ｃｌｑは、アルツハイマー病に見られるプ ラークの成分である、凝集したβ−アミロイド・ペプチドと結合することを通じ ても活性化される（５，６）。また、Ｃｌｑの活性化はアルツハイマー病に伴う 組織損傷の悪化も来す可能性がある。Ｃｌｑコラーゲン様領域と結合する他の蛋 白としては、コラーゲン（４９）、フィブロネクチン（１２）、ラミニン（１３ ）、フィブリノーゲンおよびフィブリン（１４）、ＨＩＶｒｓｇｐ４１（１５） 、アクチン（１６）およびタバコ糖蛋白（１７）などがある。 また、Ｃｌｑはムコ多糖（１９）、フカン（fucan）（２０）、プロテオグリ カン（２１）を含む陰イオン炭水化物（１８）により、またリポ多糖類（ＬＰＳ ）を含む脂質により結合し、活性化できる（２２、２３）。また、ＤＮＡ（２４ −２６）およびＲＮＡ（２７）もＣｌｑと結合でき、活性化する可能性を秘めて いる。Ｃｌｑを活性化する細胞内成分としては、細胞膜および細胞下膜（２８− ３２）、中間フィラメント（３３）、およびアクチン（１６）などがある。これ らの相互作用はいずれも、抗体のない状態で、細菌（またはウイルス）感染に対 する予防に、あるいは組織損傷に対する反応（３４）として、古典的経路を取り 入れる。 ＣＲＰ（３）、ＳＡＰ（３５）、β−アミロイド・ペプチド（３６）、ＤＮＡ （３７）を含む非酵素活性化因子の結合サイトは残基１４−２６にあるＣｌｑＡ 鎖のアミノ末端に局在している。この配列を含む合成ペプチドは結合と活性化を 両方とも効果的に抑制する。ペプチド１４−２６はいくつかの塩基性残基を含み 、ヘパリン結合モチーフの一つに適合する（３８、３９）。また、このペプチド は後尾にコラーゲンをもつacetycholinesteraseの中のペプチド１４５−１５６ と高い相同性を有し、このサイトはヘパリン−硫酸エステル基底膜結合と関連す る（４０）。また、残基７６−９２の第２のＣｌｑ Ａ鎖サイトも比較的弱い結 合に関与し、このサイトは球状頭部領域とコラーゲン様尾部との連結部にある。 代替経路として知られている第２の酵素的活性化カスケードは、補体系の活性 化および増幅のための迅速な抗体非依存性経路である。代替経路はＣ３、Ｂ因子 、 Ｆ因子など、いくつかの成分を含む。膜侵襲経路として知られている非酵素的経 路はＣ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９から成る。この膜侵襲経路は細胞を直接溶解す る。さらに、この経路は内皮細胞や血小板などの細胞を溶解することなく刺激す る。 補体系は細菌、ウイルス感染防御で、そしておそらく癌に対する免疫監視でも 、重要な役割を有する。これは補体成分欠損者で最も明確に立証される。早期成 分（Ｃ１，Ｃ４、Ｃ２またはＣ３）欠損者は再発性の感染を被る一方、後期成分 （Ｃ５からＣ９まで）欠損者はnisseria感染に感受性である。補体の古典的経路 は抗体により、ＣＲＰまたはＳＡＰの結合により、あるいはＬＰＳを通じての直 接活性化により、細菌に対して活性化される。補体の代替経路はＣ３の細胞外被 への結合を通じて活性化される。補体はウイルスにより抗体を通じて活性化され 、またウイルス感染細胞に対しても活性化されるが、これはウイルス感染細胞が 異物として認識されるためである。同様に、形質転換細胞も異物として認識され 、補体により溶解されたり免疫クリアランスの標的にされる。 補体の活性化は治療目的に使用することができ、使用されてきた。次いで腫瘍 細胞に対して作成された抗体が補体の活性化と腫瘍排除の誘発に使用された。ま た、補体をポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体と共に使用して望まし くないリンパ球が除去される。例えば、臓器移植前に抗リンパ球グロブリンまた はモノクローナル抗Ｔ細胞抗体を使用して、除去しなければ拒否反応を媒介する リンパ球を除去する。 補体系は健康維持で重要な役割を持つが、疾患の原因となる、あるいはそれに 寄与する潜在能力を持っている。補体系は多数の腎臓病、リウマチ、神経疾患、 皮膚病、血液学的疾患、血管／肺疾患、アレルギー、感染、生体適合性／ショッ ク、その他の疾患または病変に関係している（４８および５０参照）。補体系は 、必ずしも疾患状態の唯一の原因ではなく、病理発生に寄与するいくつかの因子 の一つであろう。 in vivoで補体系を抑制するいくつかの薬剤が開発されたが、多くは毒性があ るか抑制が不十分であった（４８）。ヘパリン、Ｋ７６ＣＯＯＨおよびメシル酸 nafamstatは動物実験で有効性が明らかにされた（４８）。補体系の天然抑制因 子の組換え体が開発、検討されており、それには膜調節蛋白の補体レセプター１ （ＣＲ１）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、膜コファクター蛋白（ＭＣＰ）、ＣＤ５ ９などが含まれる。 古典的経路と代替経路が両方ともＣ５成分に集まるため、Ｃ５は補体系抑制薬 の開発のための魅力的な標的である（５０）。MatisおよびRollins（1995）は抗 炎症生物薬剤としてＣ５特異性のモノクローナル抗体を開発した。 Ｃ３は両経路に共通であるため、補体系抑制薬の開発のための魅力的な標的で ある。Ｃ３を調節すると、補体系のほとんどの生物活性が制限される。ＤＡＦ、 ＭＣＰ、ＣＲ１およびＨ因子を含むほとんどの天然抑制因子はＣ３を標的として いる。 ＳＥＬＥＸ 標的分子と極めて特異的に結合する核酸分子のin vitro進化方法を開発した。 この方法、即ちＳＥＬＥＸと呼ばれる指数濃縮によるリガンドの系統的進化は、 現在は放棄されている「指数濃縮によるリガンドの系統的進化」という名称の米 国特許出願第07/536,428号、1991年６月10日出願の「核酸リガンド」という名称 の米国特許出願第07/714,131号、現在は米国特許第5,475,096号、1992年８月17 日出願の「核酸リガンド」という名称の米国特許出願第07/931,473号、現在の米 国特許第5,270,163号（PCT/US91/04078も参照）に記載され、これらの各々を参 照により特に本明細書の一部とする。本明細書では一括してＳＥＬＥＸ特許出願 と呼ぶこれらの出願の各々はあらゆる所望の標的分子に対する核酸リガンドを作 成する根本的に新規の方法を記載している。 ＳＥＬＥＸ法は、同一の一般的選択方式を用い、結合親和性および選択性の望 むほぼ全ての基準の達成を目的とした候補オリゴヌクレオチド混合物からの選択 と、結合、分配および増幅の階段的反復を含む。好ましくは無作為配列セグメン トから成る核酸混合物から出発して、ＳＥＬＥＸ法は、結合に好適な条件下で混 合物を標的と接触させる段階と、標的に特異的に結合した核酸から結合していな い核酸を分配する段階と、核酸−標的複合体を解離する段階と、核酸−標的複合 体から解離した核酸を増幅してリガンドの豊富な核酸混合物を得る段階と、次い で結合、分配、解離および増幅の段階を望み通りに何回も繰り返して行ない、極 めて特異的で高親和性の標的分子に対する核酸リガンド得る段階とを含む。 この基本的なＳＥＬＥＸ法は多くの特定の目的を達成するために修正された。 例えば、1992年10月14日に出願の「構造に基づいて核酸を選択する方法」という 名称の米国特許出願第07/960,093号は、屈曲ＤＮＡ（bentDNA）などの特定の構 造特性をもつ核酸を選択するためのＳＥＬＥＸの電気泳動との併用を記載してい る。1993年９月17日に出願の「核酸リガンドの光選択」という名称の米国特許出 願第08/123,935号は、標的分子と結合および／または光架橋および／またはそれ を光不活化できる光反応基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸに基 づく方法を記載している。1993年10月７日に出願の「テオフィリンとカフェイン を識別する高親和性核酸リガンド」という名称の米国特許出願第08/134,028号は 、カウンター−ＳＥＬＥＸと呼ばれる、近縁種の分子を識別できる高親和性核酸 リガンドを同定する方法を記載している。1993年10月25日に出願の「指数濃縮に よるリガンドの系統的進化：解決法ＳＥＬＥＸ」という名称の米国特許出願第08 /143,564号は、標的分子に対する高親和性を有するオリゴヌクレオチドと低親和 性を有するオリゴヌクレオチドの極めて効率よい識別を達成する、ＳＥＬＥＸを ベースとした方法を記載している。1992年10月21日に出願の「核酸リガンドの製 造方法」という名称の米国特許出願第07/964,624号、現在の米国特許第5,496,93 8号は、ＳＥＬＥＸを行なった後にさらに優れた核酸リガンドを得る方法を記載 している。1995年３月８日に出願の「指数濃縮によるリガンドの系統的進化」と いう名称の米国特許出願第081400,440号は、リガンドを標的に共有結合する方法 を記載している。 ＳＥＬＥＸ法は、リガンドにin vivo安定性の向上や送達特性の向上などの特 性の向上を付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドを含む。この ような修飾としては、例えばリボースおよび／またはリン酸エステルおよび／ま たは塩基の各位置での化学修飾などがある。修飾ヌクレオチドを含む、ＳＥＬＥ Ｘ法で同定される核酸リガンドが、ピリミジンの５位および２’位が化学修飾さ れたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載した1993年９月８日に 出願の「修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド」という名称の米国特許 出願第08/117,991号に記載されている。前掲の米国特許出願第08/134,028号 は、２’−アミノ（２’−ＮＨ₂）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）および／また は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）により修飾された一つ以上のヌクレオチド を含む特異性の高い核酸リガンドを記載している。1994年６月22日に出願の「２ ’位修飾ピリミジンの新規製造方法：分子内求核置換」という名称の米国特許出 願第08/264,029号は、種々の２’位修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを 記載している。 ＳＥＬＥＸ法は、1994年８月２日に出願の「指数濃縮によるリガンドの系統的 進化：キメラＳＥＬＥＸ」という名称の米国特許出願第08/284,063号と1994年４ 月28日に出願の「指数濃縮によるリガンドの系統的進化：混合ＳＥＬＥＸ」とい う名称の米国特許出願第08/234,997号にそれぞれ記載されているように、選択し たオリゴヌクレオチドを他の選択したオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレ オチド機能単位と組み合わせる段階を含む。これらの応用によると、他の分子の 所望の特性を備えたオリゴヌクレオチドの、形状その他の特性の広範にわたる組 合せと効率のよい増幅複製特性とが可能になる。基本的なＳＥＬＥＸ法の修正を 記載した上記の特許出願の各々は、その全てを参照により特に本明細書の一部と する。発明の概要 本発明は、補体系蛋白および相同蛋白に対する核酸リガンドを同定、製造する 方法と、こうして同定、製造される核酸リガンドを含む。ほぼ相同とは、80％以 上のアミノ酸配列同一性を意味する。ここで例示するのは、Ｃｌｑに対する核酸 リガンドを同定、製造する方法と、こうして同定、製造される核酸リガンドであ る。Ｃｌｑと特異的に結合する核酸リガンド配列を提供する。特に、Ｃｌｑと特 異的に結合するＲＮＡ配列を提供する。特に本発明は、表２（配列番号：５〜２ ０）に示すＲＮＡリガンド配列を含む。また、本発明は、補体系の蛋白質の機能 を抑制する核酸リガンドも含む。ここで本発明は、Ｃｌｑの機能を抑制するＲＮ Ａリガンドを含む。また、補体系を抑制および／または活性化する核酸リガンド も含む。 さらに本発明は、（ａ）核酸候補混合物を調製する段階と、（ｂ）核酸候補混 合物を補体系蛋白と接触させる段階と、（ｃ）前記候補混合物の成分同士を前記 補体系蛋白に対する親和性に基づいて分配する段階と、（ｄ）選択された分子を 増幅して前記補体系蛋白と結合する比較的高い親和性をもつ核酸配列の豊富な核 酸混合物を得る段階とを含む、補体系蛋白に対する核酸リガンドおよび核酸リガ ンド配列を同定する方法を含む。 また、本発明は（ａ）核酸候補混合物を調製する段階と、（ｂ）核酸候補混合 物をＣｌｑと接触させる段階と、（ｃ）前記候補混合物の成分同士をＣｌｑに対 する親和性に基づいて分配する段階と、（ｄ）選択された分子を増幅してＣｌｑ と結合する比較的高い親和性をもつ核酸配列の豊富な核酸混合物を得る段階とを 含む、Ｃｌｑに対する核酸リガンドおよび核酸リガンド配列を同定する方法をも 含む。 より具体的には、本発明は上記の方法によって同定される、表２（配列番号： ５〜２０）に示すリガンドを含む、Ｃｌｑに対するＲＮＡリガンドを含む。また 、所与のリガンドのいずれかとほぼ相同で、Ｃｌｑと結合しＣｌｑの機能を抑制 するほぼ同じ能力を有する、Ｃｌｑに対するＲＮＡリガンドも含む。本発明はさ らに、本明細書に提供するリガンドとほぼ同じ構造形態を有し、Ｃｌｑと結合し Ｃｌｑの機能を抑制するほぼ同じ能力を有する、Ｃｌｑに対する核酸リガンドを 含む。 また、本発明は本明細書で同定されたＲＮＡリガンドに基づいた修飾ヌクレオ チド配列とその混合物も含む。発明の詳細な説明 定義 本明細書中に使用する「核酸リガンド」は、標的に対する望ましい作用を有す る非天然産の核酸である。望ましい作用としては、標的の結合、標的の触媒的変 化、標的または標的の機能活性を修正、変更するような標的との反応、自殺阻害 剤で起きるような標的との共有結合、標的と他の分子との反応の促進などがある が、これらに限定されない。好ましい態様では、この作用に標的分子への結合親 和性があり、このような標的分子は主としてワトソン／クリック塩基対合または 三重らせん結合に依存する機構を通じて核酸リガンドと結合するポリヌクレオチ ド以外の三次元化学構造であり、核酸リガンドが標的分子と結合する既知の生理 機能を有する核酸ではない。核酸リガンドは、核酸候補混合物から同定された核 酸を含み、前記核酸リガンドは、（ａ）核酸候補混合物を補体系蛋白と接触させ る段階であって、候補混合物を基準とした、前記補体系蛋白に対する高い親和性 を有する核酸を候補混合物の残りの部分から分配する段階と、（ｂ）親和性の高 い核酸を候補混合物の残りの部分から分配する段階と、（ｃ）親和性の高い核酸 を増幅して核酸配列が豊富な核酸混合物を得る段階とを含む方法による、与えら れた標的のリガンドである。 「候補混合物」は、所望のリガンドを選択するための配列と異なった配列の核 酸の混合物である。候補混合物の源は、天然産の核酸またはそのフラグメント、 化学合成核酸、酵素的合成核酸、あるいは前述の技術の組合せによって作成され る核酸とし得る。好ましい態様では、各核酸に増幅プロセスを促進するための、 無作為領域をとり囲む固定配列がある。 「核酸」とは、一本鎖または２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはそれらのあら ゆる化学修飾物のいずれかを意味する。修飾としては、核酸リガンド塩基または 核酸リガンド全体に追加の電荷、分極性、水素結合、静電的相互作用、流動性な どを組み込む他の化学基を提供するものなどがあるが、これらに限定されない。 このような修飾としては２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン 修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨー ド−ウラシルの置換、主鎖修飾、メチル化、イソ塩基のイソシチジンやイソグア ニジンなどの珍しい塩基対合の組合せなどがあるが、これらに限定されない。ま た、修飾にはキャッピングなどの３’位および５’位の修飾も含まれる。 「ＳＥＬＥＸ」法には、標的と所望の仕方、例えば蛋白質との結合などで相互 作用する核酸リガンドの選択と、それら選択された核酸の増幅との組合せが含ま れる。選択／増幅の段階を繰り返し操作すると、標的と最も強く総合作用する、 一つまたは少数の核酸が、非常に多くの核酸を含むプールから選択できる。選択 ／増幅手順の反復は、選択した目標が達成されるまで続ける。本発明では、ＳＥ ＬＥＸ法を使用してＣｌｑに対する核酸リガンドを得る。 ＳＥＬＥＸ法はＳＥＬＥＸ特許出願に記載されている。 「標的」とは、リガンドが必要な、注目するあらゆる化合物または分子を意味 する。標的は蛋白、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖蛋白、ホルモン、受容体、 抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝産物、遷移状態類似体、コファクター、抑制 因子、薬物、染料、栄養素、成長因子等とし得るが、これらに限定されない。本 出願では、標的は補体系蛋白、好ましくはＣｌｑである。 「補体系蛋白」とは、Ｃｌ、Ｃｌｑ、Ｃｌｒ、Ｃｌｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ３ａ、 Ｃ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ａ，Ｃ５、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｂ因 子（Ｂ）、Ｄ因子（Ｄ）、Ｈ因子（Ｈ）、それらの受容体薬物、その他の可溶の 膜抑制因子／調節蛋白などの補体系のあらゆる蛋白または成分を意味するが、こ れらに限定されない。 「補体系」は、調節されたカスケード系中で細胞外の形態の病原体もしくは感 染細胞または形質転換細胞を攻撃するために、あるいは免疫反応物または細胞破 片のクリアランスで、協同作用する血漿蛋白および膜蛋白の組である。補体系は 、ある病原体によって、あるいは病原体に結合した抗体によって自然に活性化さ れる。病原体は、取り込んで破壊するための補体系蛋白（オプソニンを作用させ たもの）によって被覆される。また、この病原体は直接溶解、不活化される。同 様の機構が感染細胞、形質転換細胞、損傷細胞を標的にする。また、補体は免疫 および細胞破片のクリアランスにも関係する。 ＳＥＬＥＸは、現在は放棄された「指数濃縮によるリガンドの系統的進化」と いう名称の米国特許出願第07/536,428号、1991年６月10日に出願の「核酸リガン ド」という名称の米国特許出願第07/714,131号、現在の米国特許第5,475,096号 、1992年８月17日に出願の「核酸リガンド」という名称の米国特許出願第07/931 ,473号、現在の米国特許第5,270,163号に記載されている （PCT/US91/04078も参照）。これらの出願の各々を参照により本明細書の一部と するが、これらを一括してＳＥＬＥＸ特許出願と呼ぶ。 その最も基本的な形態では、ＳＥＬＥＸ法は以下の一連の段階によって定義さ れる。 １）配列の異なる核酸の候補混合物を調製する。候補混合物には通常、固定配 列（即ち候補混合物の各要素が同一の配列を同一の位置に含む）の領域と無作為 配列の領域を含む。固定配列領域は、（ａ）下記の増幅段階で補助する、（ｂ） 標的と結合することが知られている配列に似せる、（ｃ）候補混合物中の核酸の 所与の構造配列の集中度を高める、のいずれかの目的で選択する。無作為配列は 、全く無作為（即ち任意の位置に塩基を見いだす確率が４分の１）とするか、一 部のみ無作為（即ち任意の位置に塩基を見いだす確率を０％から１００％までの 任意の水準で選択できる）とすることができる。 ２）標的と候補混合物の要素との結合に好適な条件の下で候補混合物を選択し た標的と接触させる。この状況では、候補混合物の核酸と標的との相互作用は、 標的に対する強い親和性を有する核酸と標的との間で核酸−標的対を形成すると 考えられる。 ３）標的に対する親和性が比較的低い核酸から標的に対する親和性が最も高い 核酸を分配する。候補混合物中には親和性の最も高い核酸に対応する配列が極め て少数しか（おそらく核酸１分子のみ）存在しないため、通常は、分配する間に 候補混合物中のかなりの量の核酸（およそ5〜50％）が保持されるように設定す ることが望ましい。 ４）標的に対する親和性が最も高いとして分配する間に選択された核酸を、次 に増幅して、標的に対する親和性が比較的高い核酸の豊富な新しい候補混合物を 作成する。 ５）上記の分配、増幅の段階を繰り返すことにより、新たに形成された候補混 合物に含まれる結合の弱い配列はますます少なくなり、概して標的に対する核酸 の平均親和度は上昇する。究極まで推し進めると、ＳＥＬＥＸ法は標的分子に対 する親和性の最も高い元の候補混合物からの核酸を代表する一つまたは少数の、 独特の核酸を含む候補混合物をもたらす。 ＳＥＬＥＸ特許出願には、この方法に関して極めて詳細に記載、説明されてい る。この方法に使用できる標的、候補混合物中の核酸を分配する方法、分配した 核酸を増幅して豊富にした候補混合物を生成させる方法などが含まれる。また、 ＳＥＬＥＸ特許出願は、蛋白が核酸結合蛋白である蛋白標的と核酸結合蛋白でな い蛋白標的とを両方とも含む、数種類の標的種に対して得られたリガンドも記載 している。 補体系蛋白に対する核酸リガンドは、親油性化合物（例えばコレステロール） と複合させても、親油性成分（例えばリポソーム）から成る複合体と結合させて も、それに封入してもよい。その全体を本明細書の一部とする、1995年５月４日 に出願の「核酸リガンド複合体」という名称の米国特許出願第08/434,465号は、 核酸リガンドと親油性化合物または非免疫原性の高分子量化合物から成る治療ま たは診断用の複合体を記載している。 本明細書中に記載する方法およびこのような方法により同定した核酸リガンド は、治療と診断の両目的に有用である。治療用途としては、人間の患者の疾患ま たは病気、特に補体系の活性化による疾患または病気の治療または予防などがあ る。補体系は必ずしも疾患状態の唯一の原因ではなく、各々病理発生に寄与する 数種類の因子の一つであろう。このような疾患または病気としては、ループス腎 炎、膜増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、膜性腎炎、ＩｇＡ腎症などの腎疾患；リ ウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ベーチェット症候群、若 年性リウマチ、シェーグレン症候群、全身性硬化症などのリウマチ性疾患；重症 筋無力症、多発性硬化症、脳狼癒、ギラン−バレー症候群、アルツハイマー病な どの神経疾患；天庖瘡／類天庖瘡、光毒性反応、血管炎、熱傷などの皮膚疾患； 発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、ハム試験陽性遺伝性赤芽球性多核症（ＨＥＭ ＰＡＳ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの血液学的疾患；バイパス 術後症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、カテーテル反応、アナフィラキ シー、移植拒否、子癇前症、血液透析、血小板貯蔵などの生体適合性／ショック 症状；アテローム動脈硬化、心筋梗塞、卒中、再潅流傷害などの血管／肺疾患； アナフィラキシー、喘息、皮膚反応などのアレルギー；敗血症性ショック、ウイ ルス感染、細菌感染などの感染症；アテローム、腸管炎、甲状腺炎、不妊症、発 作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、溶血性貧血などの、その他の病気などがあるが 、これらに限定されない。 他の場合では、人間の患者での疾患または病気の治療または予防で補体系を活 性化することが望ましい。例えば、細菌またはウイルスの感染、あるいは悪性病 変の治療では補体系を活性化することが望ましい。さらに、移植前にＴ細胞上の 補体系を活性化すると、拒否を媒介するＴ細胞を取り除くことにより器官または 組織の拒否を予防し得る。 さらに、細胞表面の標的と結合する核酸リガンドに補体系活性化能を付与する ことによりこの核酸リガンドの効能を高め得る。このとき核酸が結合すると、例 えば膜侵襲複合体の溶解およびオプソニン作用を通じた細胞のクリアランスなど により、標的の機能が抑制されると共に細胞が取り除かれる。核酸リガンドは、 古典的経路または代替経路のいずれかを通じて補体系を活性化し得る。Ｃｌｑ核 酸リガンドは、細胞表面成分を標的とする他の構造物と結合できる。例えば、Ｃ ｌｑ核酸リガンドは細胞標的、サイトカイン、成長因子などに対する抗体、ある いは細胞の受容体に対するリガンドと結合し得る。これによると、Ｃｌｑ核酸リ ガンドは標的細胞表面上で多量体となり、補体系を活性化することにより細胞を 死滅させる。 基本型の古典的経路活性化因子は、Ｃｌｑ成分上の球状頭部と結合することを 通じて補体系を活性化する免疫凝集体である。一般に、複数のＦｃドメインがＣ ｌｑと結合することが要求され、５量体のＩｇＧは特に有効な活性化因子である 。これに対し、核酸はＣｌｑコラーゲン様尾部領域上の離れたサイトと結合する ことを通じて活性化できる。また、このサイトは、Ｃ−反応性蛋白、血清アミロ イド蛋白、エンドトキシン、β−アミロイドペプチド１〜４０、ミトコンドリア 膜などの種々の非抗体活性化因子と結合する。免疫グロブリン同様、これらの非 抗体活性化因子を活性化するには多量体化する必要がある。 また、Ｃｌｑコラーゲン様尾部領域上のサイトと結合する核酸リガンドも、凝 集させると活性化因子となる。このような補体活性化凝集体は、腫瘍特異抗原（ ＴＳＡ）や白血球抗原と結合するなど細胞表面上に形成されると溶解性となる。 核酸リガンドによって媒介される活性化度は、核酸リガンドの凝集度（即ち核酸 リガンド−Ｃｌｑ相互作用の多重度）に応じて高まる。補体系によって媒介され る殺作用は、核酸リガンドが活性化しない単量体として循環するが標的細胞表面 上で多量体化されると活性化因子となる場合に特に特異的である。あらゆる補体 系活性化同様、その程度と特異性は標的細胞上に付着するＣ３量によって求まる 。付着したＣ３は、Ｃ５を切断し膜侵襲複合体の形成を開始するコンベルターゼ 酵素を生成させる。また、Ｃ３は食細胞の摂食を標的とする古典的血清オプソニ ンでもある。 基本型の代替経路活性化因子は、細菌および酵母の細胞壁、フコイジン、セフ ァロースなどを含む反復炭水化物単位、あるいはエンドトキシンやグリコカリッ クスなどの糖脂質である。核酸リガンドは、細胞表面上のＣ３成分を凝集するこ とにより代替経路を活性化し得る。Ｃ３を細胞上に付着させると、Ｂ因子の結合 と代替経路のＣ３コンバターゼの生成が促進される。核酸リガンドをＣ３と結合 させると、抑制因子であるＨ因子の結合が阻害され、Ｃ３ｂの崩壊が予防される 。また、これによってＣ３コンバターゼの生成と代替経路の活性化も増強される 。ヘパリンが活性型Ｃ３に結合して代替経路の活性化を促進し得るため、Ｃ３核 酸リガンドにこの活性があるのであろう。核酸リガンドがＣ３と結合すると、膜 関連抑制因子ＣＲ１、ＣＲ２、ＭＣＰ、ＤＡＦが阻害され、Ｃ３ｂコンバターゼ の崩壊が予防され、代替経路の活性化が促進される。この代替経路のメカニズム は、殺細胞作用および細胞溶解におけるＣｌｑ依存性の活性化と同様に有効とな り得る。 核酸リガンドによって媒介される補体系の殺細胞作用は、例えばａ）腫瘍細胞 の直接殺細胞、ｂ）標的の微生物または感染細胞の溶解、ｃ）リンパ球またはリ ンパ球の亜集団の除去など、いくつかの方法で使用することが可能である。核酸 リガンドは、現在これらの目的で使用されている抗体と取って代わり得る。 診断への利用には、in vivoとin vitroの診断的応用が両方とも含まれる。一 般にＳＥＬＥＸ法は、そして特に本明細書中で教示、請求したＳＥＬＥＸ法の特 定の適応形態は、とりわけ診断用途に適応される。ＳＥＬＥＸ法は標的と高い親 和性と驚くべき特異性で結合できる核酸リガンドを同定する。勿論これらの特性 は当業者が診断用リガンドに求める望ましい性質である。 本発明の核酸リガンドは、当業者によって用いられる多くの技術のいずれによ る診断目的にも定型的に適合する。診断用薬は、与えられた標的の存在を使用す る者が特定の場所に、または濃度で確認できるようにし得ることだけが必要であ る。診断目的の陽性シグナルを引き起こすには、標的と結合対を形成する能力が あれば十分であろう。また、当業者なら、当技術分野で知られている方法により 、どんな核酸リガンドでも標識タグを組み込んで、このようなリガンドの存在を 追跡できるように適応させることができよう。このようなタグは多くの診断法で 使 用し得る。本明細書に記載するＣｌｑに対する核酸リガンドは、特にＣｌｑ蛋白 の同定に使用される。 ＳＥＬＥＸ法は標的分子の高親和性リガンドを提供する。このことは、核酸研 究の分野で前例のない、無類の業績であることを表す。本発明はＳＥＬＥＸ法を 、補体活性化の古典的経路の第１成分（Ｃｌ）の一部であるＣｌｑという特定の 標的に適用する。Ｃｌｑに対する核酸リガンドを単離、同定するための実験的パ ラメーターを下記実施例の項に記載する。 薬剤としての用途に望ましい核酸を創製するには、核酸リガンドが（１）標的 に所望の効果を及ぼし得るように標的と結合し、（２）所望の効果を得られる最 小の大きさであり、（３）できるだけ安定であり、そして（４）選択した標的に 対する特異的なリガンドであることが好ましい。ほとんどの状況では、核酸リガ ンドができるだけ高い標的に対する親和性を有することが好ましい。 小分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリペプチドな どを含むがこれらに限定されない薬剤が、望ましくない仕方で補体系を活性化す る。補体系蛋白に対する核酸リガンドは、薬剤を投与して補体系を活性化する望 ましくない副作用を誘発せずに治療有効量を達成できるように、補体系を一時的 に抑制することにより予防薬として使用し得る。 同時係属しており、一緒に譲渡された1992年10月21日に出願の米国特許出願第 07/964,624号（’624）、現在の米国特許第5,496,938号には、ＳＥＬＥＸを行な った後に向上した核酸リガンドを得る方法が記載されている。「核酸リガンドの 製造方法」という名称のこの‘624出願は、参照により特に本明細書の一部とす る。 本発明では、無作為の50位置（５０Ｎ）を含む縮重ライブラリーからＣｌｑに 対する高い親和性をもつＲＮＡを識別するためにＳＥＬＥＸ実験を行なった（実 施例１）。本発明は、実施例１に記載した方法によって同定される、表２（配列 番号：５〜２０）に示したＣｌｑ特異的ＲＮＡリガンドを含む。さらに本発明は 、Ｃｌｑの機能を抑制する、Ｃｌｑに対するＲＮＡリガンドを含む。本発明が対 象とするリガンドの範囲は、修飾の有無に関わらず、ＳＥＬＥＸ法により同定さ れる、Ｃｌｑの核酸リガンド全てに及ぶ。より具体的に述べると、本発明は表 ２（配列番号：５〜２０）に示したリガンドとほぼ相同の核酸配列を含む。ほぼ 相同とは、70％を超える、最も好ましくは80％を超える一次配列相同性を意味す る。表２（配列番号：５〜２０）に示した、Ｃｌｑに対するリガンドの配列相同 性を検討すると、一次相同性がほとんど、あるいは全くない配列に同じＣｌｑ結 合能がある場合があることが明らかになる。これらの理由により、本発明は表２ （配列番号：５〜２０）に示した核酸リガンドとほぼ同じ構造およびＣｌｑ結合 能を有する核酸リガンドも含む。ほぼ同じＣｌｑ結合能とは、親和性が本明細書 に記載したリガンドの親和性の１または２オーダー以内であるという意味である 。与えられた配列（本明細書に具体的に記載した配列とほぼ相同）がほぼ同じＣ ｌｑ結合能を持つかどうかの判定は、十分に当業者の技能の範囲内である。 核酸の治療、予防、in vivo診断への各用途で遭遇する一つの潜在的な問題は 、ホスホジエステル体のオリゴヌクレオチドが所望の効果が現れる前にエンドヌ クレアーゼ、エキソヌクレアーゼなどの酵素により体液中で急速に分解される可 能性があることである。核酸リガンドのある化学修飾は核酸リガンドのin vivo 安定性を向上させたり、核酸リガンドの送達を媒介するようにし得る。例えば、 参照により特に本発明の一部とする、1993年９月９日に出願の「修飾ヌクレオチ ドを含む高親和性核酸リガンド」という名称の米国特許出願第08/117,991号と19 95年５月４日に出願の「核酸リガンド複合体」という名称の米国特許出願第08/4 34,465号を参照のこと。本発明で考察する核酸リガンドの修飾としては、核酸リ ガンド塩基または核酸リガンド全体に追加の電荷、分極性、疎水性、水素結合、 静電的相互作用、流動性などを組み込む他の化学基を提供するものなどがあるが 、これらに限定されない。このような修飾としては２’位の糖修飾、５位のピリ ミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、 ５−ブロモまたは５−ヨード−ウラシルの置換；主鎖修飾、ホスホロチオエート 修飾またはアルキルリン酸修飾、メチル化、イソ塩基のイソシチジンやイソグア ニジンなどの珍しい塩基対合の組合せなどがあるが、これらに限定されない。ま た、修飾にはキャッピングなどの３’位および５’位の修飾も含まれる。 この修飾はＳＥＬＥＸ前の修飾または後の修飾とすることができる。ＳＥＬＥ Ｘ前の修飾によると、ＳＥＬＥＸの標的に対する特異性と向上したin vivo安定 性の両方をもつ核酸リガンドが得られる。２’−ＯＨ核酸リガンドに対して施し たＳＥＬＥＸ後の修飾によると、核酸リガンドの結合能に悪影響を与えずにin v ivo 安定性を向上させることができる。本明細書中に記載するのは、２’−ＮＨ₂ 修飾してＳＥＬＥＸ法に組み込んだ核酸リガンドである。 他の修飾が当業者に知られている。このような修飾はＳＥＬＥＸ後（あらかじ め同定した未修飾リガンドの修飾）またはＳＥＬＥＸ法への組み込みにより施さ れる。 上記のように、核酸リガンドはＣｌｑと選択的に結合するため、本明細書に記 載したＣｌｑに対する核酸リガンドは薬剤として有用である。従って、本発明は また、補体系蛋白または相同蛋白質と結合できる核酸リガンドを投与することに よって補体系に媒介される疾患を治療する方法をも含む。アルツハイマー病また は心筋梗塞などの、ある疾患または病気はコラーゲン様領域を通じてＣｌｑを活 性化する。アルツハイマー病では、β−アミロイドがＣｌｑを活性化する。中間 フィラメント、mitochondial膜、アクチンなど、心筋梗塞中に露出する心筋中の 構造物はＣｌｑを活性化する。従って、本発明の核酸リガンドはアルツハイマー 病または心筋梗塞の治療に有用である。 核酸リガンドの治療組成物は注射により非経口的に投与するが、関節内注射、 吸入水剤、経口活性化製剤、経皮吸収イオン浸透療法、坐剤など、他の効果的な 剤形も考えられる。一つの好ましい担体は生理食塩液であるが、製剤学上許容さ れる他の担体も使用してよい。好ましい一態様では、担体とリガンドが生理的に 適合する徐放製剤を構成する。このような担体の一次溶媒は、本質的に水系でも 非水系でもよい。さらに、この担体は製剤のｐＨ、浸透圧モル濃度、粘度、清澄 度、色度、無菌性、安定性、溶解速度、においなどの変更または維持のための製 剤学上許容される他の賦形剤を含んでもよい。同様に、この担体はリガンドの安 定性、溶解速度、放出、吸収などの変更または維持のための、さらに別の製剤学 上許容される賦形剤を含んでもよい。このような賦形剤は単位服用量または多回 服用量の剤形のいずれかでのparental投与のための製剤を処方するために従来、 通常用いられる賦形剤である。 いったん治療組成物を処方すると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体 、 乾燥または凍結乾燥した粉末として滅菌バイアルに保存する。このような製剤の 保存は調製済みの形態でも投与直前に溶解が必要な形態でもよい。全身送達させ るために核酸リガンドを含む製剤を投与する方法は、皮下、筋肉内、静脈内、鼻 腔内、経膣、直腸内坐剤を介してもよい。 以下の実施例では、Ｃｌｑに対する高親和性ＲＮＡリガンドを同定するための ＳＥＬＥＸ法の使用を記載する。 下記実施例は、本発明を説明、例証するために提供するものであって、本発明 を制限しようとするものではない。実施例１には、実施例２で使用する種々の材 料と実験法を記載する。実施例２には、Ｃｌｑに対する２−ＮＨ₂ＲＮＡリガン ドを記載する。実施例３には、補体系蛋白Ｃ３の核酸リガンドの生成を記載する 。実施例４には、補体系蛋白Ｃ５の核酸リガンドの生成を記載する。実施例５に は、補体系の活性化を記載する。実施例１．実験法 この実施例では、Ｃｌｑに対する２‘−ＮＨ₂ＲＮＡリガンドの同定のために 実施例２で行なわれる、実施例２に組み込まれた方法を提供する。 Ａ．生化学薬品 ＣｌｑおよびＣ４−欠損モルモット血清はQuidel(米国カリフォルニア州サン ディエゴ)から入手した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ抗ＢＳＡ、Ｃ ＲＰ、ＳＡＰおよびβ−アミロイドペプチド１〜４０および１〜４２は、シグマ （米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。ヌクレオチドＧＴＰ、ＡＴＰお よびデオキシヌクレオチドはファルマシア（スウェーデン、ウプサラ）から入手 した。Ｔａｑポリメラーゼはパーキンエルマー（米国コネティカット州ノーウォ ーク）から入手した。修飾ヌクレオチド２‘−ＮＨ₂−ＣＴＰおよび２’−ＮＨ₂ −ＵＴＰは文献の記載（42）と同様に調製した。ニワトリ逆転写酵素はLife Sciences（米国フロリダ州セントピーターズバーグ）から入手し、Ｔ７ＲＮＡポ リメラーゼはUSB（米国オハイオ州クリーヴランド）から入手した。ニトロセル ロースフィルターはミリポア（米国マサチューセッツ州ベッドフォード）から入 手した。全ての薬品はなるべく高い等級のものとした。 Ｂ．ＲＮＡ ＳＥＬＥＸ法 ＳＥＬＥＸ法はＳＥＬＥＸ特許出願に詳細に記載されている（42、43も参照） 。簡単に言うと、Ｔ７プロモーターを含む５’固定領域でＤＮＡテンプレートを 合成した後に無作為配列の５０回ストレッチを行ない、さらに３’固定領域でこ れを行なった（表１；配列番号：１〜２）。ＳＥＬＥＸの１回目を行なうため、 ＧＴＰ／ＡＴＰ混合物と２’−ＮＨ₂−ＣＴＰ／ＵＴＰヌクレオチドを用い、α −[³²Ｐ］−ＡＴＰを加えて１ナノモル（約１０¹⁴のユニーク配列）のＲＮＡを Ｔ７ポリメラーゼによりin vitro転写を行なった（44）。この回およびその後の 回のＳＥＬＥＸのため、7Ｍ尿素、10mMトリス−ホウ酸塩、2mMＥＤＴＡ（ｐＨ8. 3）泳動緩衝液による8％アクリルアミドゲル上の電気泳動によってＲＮＡを精製 した。オートラジオグラフィーを行なった後、標識２’−ＮＨ₂−ＲＮＡ転写体 を含むバンドを切り出して−７０℃で保存し、次いで100mM ＮａＣ１、2mM Ｅ ＤＴＡ400μlを加え、ゲルをすり潰し、スラリーを2cmのガラスウール（ＲＮＡ 分解酵素不含−Alltech Associates、米国イリノイ州ディアフィールド）と２個 のニトロセルロースフィルターにかけた。ＲＮＡに6.6ＭＮＨ₄ＯＡｃ（ｐＨ7.7 ）１／５体積＋エタノール２体積を加えて沈殿させた。ペレットを80％エタノー ルで２回洗浄し、乾燥させた。乾燥ＲＮＡペレットを1mMＭｇＣｌ₂含有リン酸緩 衝生理食塩水（ＭｇＰＢＳ）(45)に溶解した。 ＳＥＬＥＸの各回に対し、ＭｇＰＢＳ中でＲＮＡをＣｌｑと共に３７℃で１０ 分間インキュベートした。次に、試料を43mmのニトロセルロースフィルターでろ 過し、フィルターをＭｇＰＢＳ10mlで洗浄した。いくつかの回に対しては、希釈 したＲＮＡをあらかじめニトロセルロースフィルターに終夜しみ込ませてバック グラウンドを低減させた。ほとんどの回に対し、各試料のＫｄを測定するため、 ＲＮＡとＣｌｑの量を両方とも少なくして（結合の測定に適した範囲内となるよ うに選択）４試料を平行して操作した。さらに、バックグラウンドを測定するた め、各回ごとに蛋白質を加えないでＲＮＡ試料をろ過した。 フィルターを風乾し、細く切り、計数した後、1％ＳＤＳ，0.5mg/mlプロティ ナーゼＫ（ベーリンガー・マンハイム、米国インディアナ州インディアナポリス ）、1.5mM ＤＴＴ 400μｌで３７℃、６０分間抽出した。このＲＮＡ水溶液を フェノール、フェノール／クロロホルム（１：１）、クロロホルムで抽出した後 、上 記のようにＮＨ₉ＯＡｃ／ＥｔＯＨを添加した後に沈殿させた。ＲＮＡを50μｌ の体積で１時間から終夜、逆転写した。得られたＤＮＡを500μlの体積で特異プ ライマー（表１；配列番号：３〜４）により１２〜１４回ＰＣＲ増幅した後、フ ェノール／クロロホルムで抽出し、ＮＨ₉ＯＡｃ／ＥｔＯＨで沈殿させた。 Ｃ．クローニング １４回目から得られたＤＮＡについて２回目のＰＣＲ増幅を行なった後、ｍｏ ｎｏＱカラム（ファルマシア、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）に50mM トリス（ｐＨ8.0）から1M ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス（ｐＨ8.0）までのグラジ エントを用いたＦＰＬＣにより精製した。このＤＮＡをｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）ベクター（ストラタジーン、米国カリフォルニア州ラホーヤ）中でク ローン化し、コロニーを取り出して、終夜培養とプラスミド・ミニプレップ（PE RFECTprep、５’−３’、コロラド州ボールダー）に供した。精製したプラスミ ドを３’プライマーと５’プライマー（上記と同様）で増幅し、生成物をアガロ ースゲル電気泳動（45）で分析した。ＤＮＡをα−［³²Ｐ］−ＡＴＰにＴ７転写 して結合分析用の放射標識ＲＮＡを調製し、また、放射標識せずに抑制の検討用 のＲＮＡを調製した。 Ｄ．塩基配列決定 PERFECTprepキットを用いて精製したプラスミドについて、Sequenase Verson 2.0キット（USB、米国オハイオ州クリーブランド）にα−［³⁵Ｓ］−Ａ ＴＰを併用して塩基配列決定を行なった。試料を12％アクリルアミドゲル（7M尿 素、ＴＢＥ）で泳動した後、ゲルを乾燥し、塩基配列を決定するためフィルムに 露光させた。 Ｅ．結合アッセイ クローン化した個々のＤＮＡをα−［³²Ｐ］−ＡＴＰでＴ７転写し、完全長の ［³⁵Ｓ］−２’−ＮＨ₂−ＲＮＡをゲルで精製した（上記と同様）。ＲＮＡを試 料30μl（＜10pM）につき約5,000cpmとなるように懸濁し、一定量を種々の濃度 のＣｌｑと共にＭｇＰＢＳ中で３７℃、１０分間インキュベートした。次いで、 試料をニトロセルロースでろ過し、フィルターを緩衝液で洗浄し、赤外線灯下で 乾燥し、シンチレーション液（Ecoscint A、National Diagnostics、米国ジョー ジア州アトランタ）を加えて計数した。ＲＮＡ単独のバックグラウンド試料を平 行測定した。抑制作用を測定するため、ＲＮＡ＋Ｃｌｑ＋抑制因子（例えばＡ鎖 残基14〜26サイト、ＳＡＰ、β−アミロイドペプチド、ＣＲＰなど）を３７℃、 １０分間インキュベートした後、ろ過した。フィルターを洗浄し、計数した。 ウサギ抗ＢＳＡ（Sigma、ミズーリ州セントルイス）1mlと当量のＢＳＡ620μg にＰＥＧ８０００を終濃度1％となるように加えることによって免疫複合体（Ｉ Ｃ）を生成させた後、この試料を４℃で終夜インキュベートした。このＩＣを12 ,000rpmで１０分間微量遠心し、ＰＢＳで５回洗浄し、ＭｇＰＢＳ1mlに懸濁した 。Ｃｌｑ−免疫複合体へのＣｌｑ ＲＮＡクローン結合（Ｃｌｑ−ＩＣ）を測定 するため、精製［³²Ｐ］−ＲＮＡ20μl＋ＩＣ20μlを１０^-11Ｍから１０^-7Ｍま での種々の濃度のＣｌｑ（ＭｇＰＢＳ＋1％Triton溶液）20μlと混合した。この 試料を室温で３０分間インキュベートし、微量遠心し、ペレットと上清を計数し た。 Ｆ．溶血アッセイ 文献の記載（46）と同様にＣ４溶血アッセイにより補体の消費を測定した。試 料はすべて希釈し、カルシウム、マグネシウム、1％ゼラチンを含むベロナール 緩衝生理食塩水（ＧＶＢ⁺⁺−補体緩衝液）中でアッセイを行なった。β−アミロ イドペプチド消費によりＣ４消費を測定するため、250μg/mlとなるようにペプ チドをヒト全血清の１／８希釈液に加え、３７℃で６０分間インキュベートした 。次いで、Ｃ４溶血活性を測定するため試料を希釈した。Ｃｌｑ２’ＮＨ₂−Ｒ ＮＡクローンによる抑制を測定するため、最初のβ−アミロイドペプチドーヒト 全血清インキュベーション混合物中でＲＮＡをインキュベートした後、Ｃ４量を 上記と同様に測定した。実施例２．Ｃｌｑに対するＲＮＡリガンド Ａ．ＲＮＡ ＳＥＬＥＸ 無作為５０回７−２’ＮＨ₂ＲＮＡのプールに対するＣｌｑの結合をニトロセ ルロースフィルターで測定したところ、Ｋｄは2.3μＭであった。１回目のＳＥ ＬＥＸに対し、Ｃｌｑ濃度は0.156〜1.25μＭであり、ＲＮＡ濃度は15μＭであ った。ＳＥＬＥＸ法を通じ、ＲＮＡ濃度をＣｌｑ濃度の約１０倍に保ち、各回と も 最終１４回のＣｌｑ濃度136pMに下げた。ニトロセルロースフィルターに対する ＲＮＡのバックグラウンド結合はＳＥＬＥＸ法を通じて低値にとどまったが、こ れは主にＲＮＡをニトロセルロースフィルターにあらかじめ吸着させておいたか らである。Ｃｌｑに対するプールＲＮＡの結合は各回とも向上した。漸次改良さ れた１４回目のＲＮＡのプールはＫｄ＝670pMでＣｌｑと結合し、全体としてＫ ｄが3400倍向上した。 次いで、配列決定して結合を評価するため、バルクＲＮＡをクローン化した。 0.1nMおよび0.5nMのＣｌｑでの結合比較を通じ、個々のクローンをランク付けし 、Ｃｌｑ結合がバックグラウンドを超えるクローンを塩基配列決定し、表２（配 列番号：５〜２０）に示した。ファミリー１には全配列１９のうち１２が含まれ ていた。また、ファミリー２には３配列が含まれていた。ファミリー３とファミ リー４には両方とも２配列が含まれていた。ファミリー１とファミリー２の配列 には両方ともＧの豊富な領域が含まれ、両配列とも繰返し配列モチーフのＧＧＡ ＧおよびＧＧＵＧがあった。ファミリー１の要素の同一性と相同性はＧの豊富な ５’側半分の配列で最大である。Ｃの豊富な３’側半分の配列の配列相同性スト レッチは短いものでしかなく、しかもこれらは大きなギャップ領域の混在のある ものしか明らかにされていない。いずれのファミリーの配列も折りたたんで、か なりのワトソン−クリック型塩基対のあるステム−ループ構造とすることができ る。最も高親和性のリガンドに対する結合曲線全体から290pM〜3.9nMの範囲のＫ ｄが得られ、この高親和性リガンドが４つの配列ファミリーの全てに見られた。 これらの結合曲線はすべて単相であった。精製中に起きる核酸変化量のばらつき のため、最大結合量は100％ではなかった。このことが分かったのは、リガンド が通常、蛋白質と結合し、抽出された後に、再び結合し、100％近い最大結合量 となり得るためである（データは示していない）。 Ｂ．競合 交差競合が示すように、様々なファミリー由来のリガンドがＣｌｑ上の同一も しくは重複サイトと相互作用する。二系統の証拠が示すように、このサイトはＡ 鎖14〜26残基サイトまたはその付近のコラーゲン様の領域にある。一つは、Ｃｌ ｑは、ＩＣと結合した場合、さらにリガンドNo.50（配列番号：１２）と結合 することであり、免疫グロブリンＦｃと結合すると頭部領域を遮断するが、コラ ーゲン様の尾部は利用可能のままであり、このことからＳＥＬＥＸリガンドがこ の尾部と結合していることが示唆される。二つ目の、より直接的な証拠は、Ａ鎖 残基14〜26サイトと結合することが知られている蛋白質がリガンドNo.50と競合 することであり、この蛋白質にはＳＡＰ、β−アミロイド、ペプチド、ＣＲＰな どが含まれる。最後に、Ａ鎖上の残基14〜26と同じアミノ酸配列を有するペプチ ドがリガンドNo.50と競合する。この結果は、下記の溶血抑制に対する結果によ ってさらに支持される。 Ｃ．消費 Ａ鎖14〜26アミノ酸サイトと結合するＳＥＬＥＸリガンドはＣｌｑを活性化し 得るが、代わりにＳＥＬＥＸリガンドが他の分子の結合を阻害し、Ｃｌｑの活性 化を妨げることもある。これは、ＳＥＬＥＸリガンドと共にインキュベートした 後に、あるいは既知のＣｌｑ活性化因子をＳＥＬＥＸリガンドと共にインキュベ ートした後に、血清中のＣ４消費を測定することによって調べた。ＳＥＬＥＸリ ガンドは血清中でインキュベートしてもＣ４を消費せず、従ってＣｌｑ活性化因 子ではない。このリガンドはこの濃度では、リガンドがＣｌｑ頭部グループ付近 に結合したときに起きる抗体被覆ヒツジ赤血球の血清溶解を抑制しない（データ は示していない）。このリガンドは他のＣｌｑ活性化因子であるβ−アミロイド の１〜４０ペプチドによるＣ４消費を抑制する。このペプチドはＡ鎖14〜26残基 サイトでの結合を通じてＣｌｑを活性化することが知られており、従って、この 抑制によりＳＥＬＥＸリガンドがこのＡ鎖サイトで結合することが確認される。 ＳＥＬＥＸ法から得られる対照リガンドはニトロセルロースアッセイ法によりＣ ｌｑと結合しなかったが、これもβ−アミロイド1〜40ペプチドのＣｌｑ活性化 の阻害に効果がなかった。実施例３．補体系蛋白Ｃ３の核酸リガンド 補体系蛋白Ｃ３に対するリガンドを生成させるため、確定配列の横に位置する 50または30ヌクレオチドの近接無作為配列を含む約１０¹⁴個のＲＮＡ分子または ＤＮＡ分子のライブラリーを生成させる。一態様では、最初の候補混合物の無作 為ヌクレオチドが２’−ＮＨ₂ピリミジン塩基から成る。選択、増幅の操作は 当技術分野で知られている技術を用いて上記実施例１と同様に行なう。実施例４．補体系蛋白Ｃ５の核酸リガンド 補体蛋白Ｃ５に対するリガンドを生成させるため、確定配列の横に位置する50 または30ヌクレオチドの近接無作為配列を含む約１０¹⁴個のＲＮＡ分子またはＤ ＮＡ分子のライブラリーを生成させる。一態様では、最初の候補混合物の無作為 ヌクレオチドが２’−ＮＨ₂ピリミジン塩基から成る。選択、増幅の操作は当技 術分野で知られている技術を用いて上記実施例１と同様に行なう。実施例５．補体系の活性化 オリゴヌクレオチドは古典的経路と代替経路の両方を活性化し得る。一般に、 Ｇ−４分子（quartet）をなすポリ−Ｇ含有オリゴヌクレオチドは有効な活性化 因子である。このポリ−ＧオリゴヌクレオチドはＣｌｑコラーゲン様領域上の塩 基サイトと相互作用するが、このポリ−Ｇ構造は高分子量の凝集体を形成するた め、Ｃｌｑと結合してこれを活性化する。ホスホジエステル・オリゴヌクレオチ ドと比較して非特異結合能が高いホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドも有 効な補体系活性化因子である。ポリ−Ｇ含有ホスホロチオエートは高い効果をも ち、Ｇの乏しい配列でさえ活性化し得る。ポリ−Ｇ結合が起きるＣｌｑ上のサイ トは核酸結合と同様と思われる。オリゴヌクレオチドを活性化した結果を下に示 したが、古典的経路の活性化はＣ４ｄフラグメントＥＬＩＳＡ（Quidel、米国カ リフォルニア州サンディエゴ）により測定し、代替経路の活性化はＢｂＥＬＩＳ Ａ（Quidel、米国カリフォルニア州サンディエゴ）により測定した。別の経路で あるにもかかわらず、両経路のオリゴヌクレオチド活性化がＣｌｑ依存性である ことを示す証拠がある。 活性化は溶血アッセイによっても調べられる。２’−ＯＨポリ−Ｇやホスホロチ オエート・オリゴヌクレオチドなどを含む公知の活性化因子、並びに多量化Ｃｌ ｑ核酸リガンドや小さい（例えば１５量体など）２’−Ｆポリ−Ｇオリゴヌクレ オチドなどの潜在的な活性化因子をヒツジ赤血球上に被覆し、次いで血清補体に よる溶解を測定する。オリゴヌクレオチドおよび核酸リガンドを細胞上に被覆す る方法としては、受動的吸収、化学的結合、ストレプトアビジン−ビオチン結合 、特異的核酸結合などがある。新鮮なラット血清またはヒト血清による処理の後 、当業者に知られている標準的な方法により補体成分の細胞への付着、膜の損傷 および溶解を測定する。 オリゴヌクレオチドによる補体の活性化はオリゴヌクレオチドの多量化と関連 している可能性がある。ポリ−Ｇ２’−ＯＨオリゴヌクレオチドは大きな凝集体 を形成し、細胞に被覆すると、血清補体を活性化し、溶解を引き起こす。細胞上 のポリ−Ｇは、より大きな凝集体を形成し、溶液中より効果的に活性化する。さ らに、自己会合し、細胞表面に非特異結合するホスホロチオエート・オリゴヌク レオチドは高レベルの補体活性化溶解を引き起こす。１５量体２’−Ｆポリ−Ｇ などのより小さいオリゴヌクレオチドは溶液中では活性化しないが、細胞上の活 性化凝集体生成を誘導し得る。これらの特性は半特異的活性化オリゴヌクレオチ ドの設計に有用である。溶液中で活性化しないＣｌｑ核酸リガンドは、細胞と結 合する前に多量化すれば細胞上で活性化し、あるいは細胞上での多量化を誘導し 得るが、後者は特異性が最も高い。細胞上に結合すると、Ｃｌｑ核酸リガンドは Ｇの豊富な領域を通じて自己会合して３分子または４分子構造を形成し、それに よって補体系の活性化因子となる。 Ａ．Ｃｌｑ核酸リガンドの凝集 Ｃｌｑ核酸リガンドは、種々の長さの化学的架橋結合剤を用いて二量体化され る。代わりに、核酸リガンド単量体をビオチン化した後、ストレプトアビジンで 多量体化してもよい。これらの多量体は各々について補体活性化と赤血球溶解を 調べる。 また、核酸リガンドは、混合するとＣｌｑ上の２箇所で結合することができ、 補体系を活性化し得る核酸二量体が生成する形態でスペーサーおよび短い相補的 配列の追加と組み合わせることによっても合成される。様々なファミリー由来の 核酸リガンドを用いてヘテロダイマーを生成させることができ、同一ファミリー 由来の核酸リガンドを用いてホモダイマーを生成させることもできる。 多数の短いハイブリダイゼーション配列を含むオリゴヌクレオチドーデンドリ マーを合成する。次いで、核酸リガンドのＣｌｑへの結合に影響しないように相 補的配列をＣｌｑ核酸リガンドに組み込む。細胞表面上でデンドリマーとＣｌｑ 核酸リガンドとを組み合わせると、補体系の誘因となる多量体が生成する。デン ドリマーは、細胞表面と結合できるように最初に加える。次いで、Ｃｌｑ核酸リ ガンドを加えて細胞表面上のデンドリマーと結合させる。デンドリマーとＣｌｑ 核酸リガンドを別々に加えると、標的細胞に到達する前に補体系が活性化するこ とが防止され、それによって特異性が生じる。 ポリ−Ｇ配列をＣｌｑ核酸リガンドに付加すると、結合能がさらに高まる。さ らに、各Ｃｌｑ核酸リガンド上の短いポリ−Ｇ配列は高次構造を形成するが、こ の高次構造がＣｌｑ核酸リガンドを多量体化して活性化を引き起こすのに役立つ 。 Ｂ．赤血球と白血球の溶解 赤血球溶解を促進する核酸リガンドを、リンパ球や腫瘍細胞を含む有核細胞で 調べる。有核細胞には赤血球にない補体耐性メカニズムがあり、例えば有核細胞 は抗原を払い落とし、補体成分を含む膜小胞を小庖にして放出し、赤血球に比べ て高いレベルの補体抑制因子を発現することができ、最初の補体の攻撃に際して 防御メカニズムを強化し得る。殺細胞作用には高度の活性化が重要なので、活性 化因子は補体系成分の付着量と膜損傷度に見合うようにさせる。また、感受性が 細胞の種類に特異的であるかどうか判定するため多様な種類と由来の腫瘍細胞を 試みる。 核酸リガンドはＳＥＬＥＸ特許出願に記載されているほぼ全ての標的に対する ものを生成させ得る。Ｌ−セレクチンに対する核酸リガンドが作成された（1995 年６月７日に出願の「レクチンに対する高親和性核酸リガンド」という名称の米 国特許出願第08/479,724号参照、参照によりその全体を本明細書の一部とする） 。レクチンにより媒介される機能が多様なことにより、レクチン拮抗阻害体（ア ンタゴニスト）に対する潜在的な治療標的は多数ある。例えば、内因性の炭水化 物結合レクチンのファミリーである哺乳類セレクチン（selectin）に対する拮抗 阻害体は、多様な白血球介在疾患状態での治療適用があろう。セレクチンの受容 体への結合を抑制すると細胞接着が阻害され、その結果、炎症、凝集、移植拒否 、腫瘍転移、熱傷、乾癬、多発硬化症、細菌性敗血症、血液量不足および外傷性 ショック、急性肺損傷、急性呼吸不全症候群などの治療に有用であろう。Ｃｌｑ 核酸リガンドとＬ−セレクチン核酸リガンドを結合すると、標的における殺細胞 作用が促進されることによりＬ−セレクチン核酸リガンドがさらに有効となる。 Ｃｌｑ核酸リガンドをＬ−セレクチン核酸リガンドと結合し、結合体を上記と同 様に白血球溶解で調べる。また、他の細胞表面標的、それ自体で補体を活性化し ない全ての標的に対する抗体、サイトカイン、成長因子、細胞受容体に対するリ ガンドなどに対する核酸リガンドをＣｌｑ核酸リガンドと結合して殺細胞に使用 し得る。 Ｃ．ポリ−Ｇおよびホスホロチオエート補体活性化のメカニズム 古典的経路と代替経路の両方について、Ｃｌｑ核酸リガンドを抑制することと 抗体および枯渇化（depleted）血清試薬を使用することにより、ポリ−Ｇおよび ホスホロチオエート補体活性化のメカニズムを解明する。 古典的経路ではなく代替経路を通じた活性化オリゴヌクレオチド機能と、この オリゴヌクレオチドの特性を調べる。最も重要な代替経路成分はＣ３であり、Ｃ ３が表面に付着すると代替経路が開始され、Ｃ３が分解されると停止する。オリ ゴヌクレオチドは活性化された形態、すなわち蛋白分解された形態のＣ３と高い 結合を示し、従って、オリゴヌクレオチドは活性化を開始し得る。これは、上記 実施例３に記載したように、ポリヌクレオチドによる特異的アッセイとＣ３に対 する核酸リガンドの作成によって調べられる。 Ｄ．補体活性化のin vivo試験 核酸リガンドが介在した補体系活性化を動物で試験してin vivo核酸リガンド 作用を評価する。赤血球および／またはリンパ球を核酸リガンドで被覆し、ラッ トに注入してin vivoの殺細胞作用と細胞溶解を調べる。核酸リガンドの活性化 を補体系を活性化しないＭｏＡｂとも結合し、抗体をラット細胞抗原（例えばリ ンパ球抗原など）に対する抗体にする。次いで、この細胞を核酸リガンド−抗体 結合体で被覆し、ラットに注入する。代わりに、核酸リガンド−抗体結合体をラ ットに直接注入した後、in vivo殺白血球作用を測定してもよい。 また、Ｃｌｑ核酸リガンドを非ヒトＣｌｑと交差反応させ、非ヒトＣｌｑをin vivoアッセイに使用することもできる。マウス、ラット、ウサギなどのＣｌｑ などの種でＣｌｑ核酸リガンドを調べる。血清からＣｌｑを精製し、ニトロセル ロース結合アッセイによりＣｌｑ核酸リガンドの交差反応性を調べる。代わりに 、Ｃｌｑを免疫複合体と結合して血清に加えた後、凝集体と結合するＣｌｑ核酸 リガンドを試験してもよい。核酸リガンドが種特異的である場合、Ｉｇ−セファ ロースカラムによる連続環流によってラット血清からラットＣｌｑを枯渇させ、 当業者に知られている不法によりこの血清をヒトＣｌｑで再構成する。次いで、 この再構成動物を使用して、補体系活性化および殺細胞作用についてＣｌｑ核酸 リガンドを調べる。 引用文献 1.Cooper,N.R.1985.「古典的補体経路：第１補体成分の活性化および調節」Adv. 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【手続補正書】 【提出日】１９９８年８月７日（１９９８．８．７） 【補正内容】 （１）明細書２頁、２４行目の『acetycholinesterase』を、『アセチルコリン エステラーゼ』に補正する。 （２）明細書４頁、１８行目の『PCT/US91/04078』を『WO91/19813』に補正する 。 （３）明細書５頁、１０−１１行の『米国特許出願第08/134,028号』を『米国特 許出願第08/134,028号、現在の米国特許第5,580,737号』に補正する。 （４）明細書５頁、１４行目の『米国特許出願第08/143,564号』を『米国特許出 願第08/143,564号、現在の米国特許第5,567,588号』に補正する。 （５）明細書５頁、１７行目の『核酸リガンドの製造方法』を『HIV-RTおよびHI V-1 Revに対する核酸リガンド』に補正する。 （６）明細書５頁、２９行目の『米国特許出願第08/117,991号』を『米国特許出 願第08/117,991号、現在の米国特許第5,660,985号』に補正する。 （７）明細書５頁、２９行目の『米国特許出願第08/134,028号』を『米国特許出 願第08/134,028号、現在の米国特許第5,580,737号』に補正する。 （８）明細書６頁、３−４行の『２’位修飾ピリミジンの新規製造方法：分子内 求核置換』を『分子内求核置換による既知および新規な２’位修飾ヌクレオシド の新規製造方法』に補正する。 （９）明細書９頁、２３行目の『PCT/US91/04078』を『WO91/19813』に補正する 。 （１０）明細書１５頁、１７行目の『米国特許出願第08/117,991号』を『米国特 許出願第08/117,991号、現在の米国特許第5,660,985号』に補正する。 （１１）明細書１６頁、１４行目の『mitochondial』を『ミトコンドリア』に補 正する。 （１２）明細書１６頁、２７行目の『parental』を『非経口』に補正する。 （１３）明細書１８頁３行目の『５０回』を『５０Ｎ』に補正する。 （１４）明細書１９頁、４行目の『ＮＨ₉ＯＡｃ』を『ＮＨ₄ＯＡｃ』に補正する 。 （１５）明細書１９頁、２５行目の『［³⁵Ｓ］』を『α［³²Ｐ］』に補正する。 （１６）明細書２６頁、２０−２２行の『他の細胞表面標的、それ自体で補体を 活性化しない全ての標的に対する抗体、サイトカイン、成長因子、細胞受容体に 対するリガンドなどに対する核酸リガンドをＣｌｑ核酸リガンドと結合して』を 『他の細胞表面標的に対する核酸リガンド、それ自体で補体を活性化しない全て の標的に対する抗体、サイトカイン、成長因子、細胞受容体に対するリガンドな どをＣｌｑ核酸リガンドと結合して』に補正する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５ 43/00 ６４３Ｄ Ａ６１Ｋ 31/7105 31/70 ６２４ 48/00 48/00 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）核酸候補混合物を調製する段階と、 ｂ）核酸候補混合物を補体系蛋白と接触させる段階であって、候補混合物を基 準とした、前記補体系蛋白に対する高い親和性を有する核酸を候補混合物の残り の部分から分配する段階と、 ｃ）親和性の高い核酸を候補混合物の残りの部分から分配する段階と、 ｄ）親和性の高い核酸を増幅して前記補体系蛋白と結合する比較的高い親和性 および特異性をもつ核酸配列が豊富な核酸混合物を得る段階であって、前記補体 系蛋白の核酸リガンドが同定される段階と を含む、補体系蛋白に対する核酸リガンドを同定する方法。 ２．ａ）核酸候補混合物を調製する段階と、 ｂ）核酸候補混合物をＣｌｑと接触させる段階であって、候補混合物を基準と した、Ｃｌｑに対する高い親和性を有する核酸を候補混合物の残りの部分から分 配する段階と、 ｃ）親和性の高い核酸を候補混合物の残りの部分から分配する段階と、 ｄ）親和性の高い核酸を増幅してＣｌｑと結合する比較的高い親和性および特 異性をもつ核酸配列が豊富な核酸混合物を得る段階であって、Ｃｌｑの核酸リガ ンドが同定される段階と を含む、Ｃｌｑに対する核酸リガンドを同定する方法。 ３．ｅ） ｂ）、ｃ）およびｄ）の段階を繰り返す段階 をさらに含む、請求の範囲第１項の方法。 ４．ｅ） ｂ）、ｃ）およびｄ）の段階を繰り返す段階 をさらに含む、請求の範囲第２項の方法。 ５．前記核酸候補混合物が一本鎖核酸から成る請求の範囲第２項の方法。 ６．前記核酸候補混合物が一本鎖リボ核酸から成る請求の範囲第２項の方法。 ７．前記核酸候補混合物が一本鎖デオキシリボ核酸から成る請求の範囲第２項の 方法。 ８．前記核酸が修飾核酸である請求の範囲第２項の方法。 ９．前記修飾核酸が２’ＮＨ₂修飾核酸である請求の範囲第８項の方法。 １０．精製単離した、Ｃｌｑに対する非天然核酸リガンド。 １１．Ｃｌｑ上のコラーゲン様領域と結合する請求の範囲第１０項のＣｌｑに対 する核酸リガンド。 １２．請求の範囲第２項の方法に従って同定される請求の範囲第１１項のＣｌｑ に対する核酸リガンド。 １３．請求の範囲第３項の方法に従って同定される請求の範囲第１１項のＣｌｑ に対する核酸リガンド。 １４．前記リガンドが表２（配列番号：５〜２０）に示した配列から成る群から 選択されるＲＮＡである請求の範囲第１１項のＣｌｑに対する核酸リガンド。 １５．薬剤学的有効量のＣｌｑ核酸リガンドを投与する段階を含む、補体系介在 疾患の治療方法。 １６．前記核酸リガンドを請求の範囲第２項の方法に従って同定する請求の範囲 第１５項の方法。 １７．前記核酸リガンドを請求の範囲第３項の方法に従って同定する請求の範囲 第１５項の方法。 １８．前記補体系介在疾患が心筋梗塞およびアルツハイマー病から成る群から選 択される請求の範囲第１５項の方法。 １９．前記核酸リガンドが表２（配列番号：５〜２０）のリガンドの一つから選 択される請求の範囲第１５項の方法。 ２０．前記補体系蛋白がＣ５およびＣ３から成る群から選択される請求の範囲第 １項の方法。 ２１．ａ）疾患を特異的に治療する薬剤を投与する段階と、 ｂ）補体系の活性化を抑制するのに有効な量の核酸リガンドＣｌｑ抑制因子を 投与する段階と を含む、疾患の治療方法。 ２２．ａ）細菌細胞表面の標的またはウイルス粒子標的に対して生成させた核酸 リガンドをＣｌｑ核酸リガンドと結合する段階と、 ｂ）補体系の活性化し、感染細胞を溶解するのに有効な量の結合体を投与する 段階と を含む、細菌感染またはウイルス感染の治療方法。 ２３．ａ）腫瘍細胞表面の標的に対して生成させた核酸リガンドをＣｌｑ核酸リ ガンドと結合する段階と、 ｂ）補体系の活性化し、腫瘍または腫瘍細胞を死滅させるのに有効な量の結合 体を投与する段階と を含む、患者体内の腫瘍細胞を死滅させる方法。