JP2009039126A - レクチンに対する高親和性核酸リガンド - Google Patents

レクチンに対する高親和性核酸リガンド Download PDF

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Abstract

【課題】レクチンに対する核酸リガンドの同定方法および製造方法、並びにこうして同定および製造された核酸リガンドを提供する。
【解決手段】レクチンについて高親和性オリゴヌクレオチドリガンド、特に、レクチン、コムギ胚芽アグルチニン、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチンに結合する能力を有する核酸リガンド。また、このようなリガンドを得るための方法。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明
発明の分野
本発明は、レクチンに対する高親和性核酸リガンドの同定方法および調製方法を記載する。レクチンは炭水化物結合性タンパク質である。このような核酸リガンドの同定のために本発明において使用される方法は、セレックス（ＳＥＬＥＸ）と呼ばれ、これは、指数的濃縮によるリガンドの系統的進化(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)の頭文字をとったものである。本明細書では、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、およびＰ−セレクチンに結合する高親和性核酸リガンドが具体的に開示される。
発明の背景
レクチンの生物学的役割（非免疫起源の非酵素的炭水化物結合性タンパク質；アイ・ジェイ・ゴールドスタイン（I.J．Goldstein）ら，１９８０，Ｎａｔｕｒｅ ２８５：６６）は、炭水化物の生物学的役割と密接に関連している。炭水化物の１つの役割は、糖結合体の物理的性質（すなわち、溶解度、安定性、活性、酵素に対する感受性または抗体認識）の修飾であるが、近年炭水化物生物学のより興味深く関係のある側面が出現してきた。糖結合体の炭水化物部分は、情報の豊富な分子である（エヌ・シャロンとエィチ・リス（N．Sharon and H．Lis），１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：２２７−２３４；ケー・ドリカマーとエム・テイラー（K．Drickamer and M．Taylor），１９９３，Ａｎｎｕ，Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２３７−２６４；エー・バルキ（A．Varki），Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．３：９７−１３０）。ある範囲内でレクチンによる炭水化物の結合は特異的である（すなわち、ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトースのみに結合するレクチンがあり、他のレクチンはマンノースに結合し、さらに別のものはシアル酸などに結合する；ケー・ドリカマーとエム・テイラー（K．Drickamer and M．Taylor）、前述）。結合の特異性は、糖結合体の炭水化物部分に含有される情報を解読し、多くの重要な生物学的機能を媒介することを可能にする。
多くの哺乳動物レクチン、植物レクチン、微生物レクチンおよびウイルスレクチンが記載されている（アイ・オフェクとエヌ・シャロン（I．Ofek and N．Sharon）、１９９０，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：９１−１１３：ケー・ドリカマーとエム・テイラー（K．Drickamer and M．Taylor），前述；アイ・ジェイ・ゴールドスタインとアール・ディー・ポレツ（I.J．Goldstein and R.D. Poretz），１９８６，Ｔｈｅ Ｌｅｃｔｉｎｓ、３３−２４７頁；エー・バルキ（A．Varki）ら、前述）。これらのタンパク質は、リソソーム酵素の輸送、血清タンパク質のクリアランス、エンドサイトーシス、食作用、オプソニン作用、微生物およびウイルス感染、毒素結合、受精、免疫および炎症応答、成長や転移のような症状における細胞接着や移動などの、多様な生物学的反応を媒介する。植物レクチンについては共生や宿主防御における役割が提唱されているが、異論もある。いくつかのレクチンの機能的役割はよく理解されているが、他の多くはあまりまたは全く理解されていない。
レクチンにより媒介される反応の多様性と重要性は、充分に記録されている哺乳動物レクチン（アシアロ糖タンパク質受容体と血清マンノース結合タンパク質）、およびウイルスレクチン（インフルエンザウイルス血球凝集素）により説明される。肝アシアロ糖タンパク質受容体はガラクトースとＮ−アセチルガラクトースに特異的に結合し、こうして末端Ｎ−アセチルガラクトースまたはガラクトース残基（末端シアル酸があらかじめ除去されることにより露出される）を提示する血清糖タンパク質のクリアランスを媒介する。ヒトマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、末端マンノース、フコースおよびＮ−アセチルガラクトサミン残基に結合する血清タンパク質である。これらの末端残基は、微生物に共通であるが哺乳動物糖結合体ではない。ＭＢＰの結合特異性は、自己を非自己から区別する非免疫的機構を構成し、オプソニン作用と補体結合による宿主防御を媒介する。インフルエンザウイルス血球凝集素は、細胞表面受容体のシアル酸残基に結合することにより鼻の内皮細胞に結合する感染の初期段階を媒介する。
レクチンが媒介する機能の多様性は、レクチンアンタゴニストの広範囲の可能な治療用標的を提供する。内因性炭水化物に結合するレクチンおよび外因性炭水化物に結合するレクチンのいずれも、標的の候補である。例えば、哺乳動物セレクチンに対するアンタゴニストである内因性炭水化物結合性レクチンのファミリーは、多くの白血球媒介性疾患の治療に応用される。受容体へのセレクチンの結合の阻害は細胞接着を阻止し、従って炎症、凝固、移植片拒絶、腫瘍転移、リウマチ様関節炎、再潅流障害、脳卒中、心筋梗塞、火傷、乾癬、多発性硬化症、細菌性敗血症、血量減少性ショックおよび外傷性ショック、急性肺傷害、およびＡＲＤＳの治療に有用であろう。
Ｅ−、Ｐ−およびＬ−セレクチンは、四糖であるシアリル−ルイスX（シー・フォクサル(C．Foxall)ら、１９９２，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１７，８９５−９０２）を認識する３つの相同的なＣ−型レクチンである。セレクチンは炎症の場での活性化血管内皮への好中球と単球の初期の接着を媒介する（アール・エス・コトラン(R.S．Cotran)ら，１９８６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４，６６１−；エム・エー・ジュチラ(M.A．Jutila)ら，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３，３３１８−；ジェイ・ジー・ゲング（J.G．Geng）ら，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，７５７；ユー・エィチ・フォン・アドリアン(U.H．Von Adrian)ら，１９９４，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６３，Ｈ１０３４−Ｈ１０４４）。さらにＬ−セレクチンは、末梢および腸間膜リンパ節へのリンパ球の帰巣に関係があり（ダブリュー・エム・ガラチン(W.M．Gallatin)ら，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０４，３０；ティー・ケー・キシモト（T.K．Kishimoto）ら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７，２２４４−）、Ｐ−セレクチンは好中球および単球への血小板の接着を媒介する（エス−シー・スー−リン（S-C.Hsu-Lin）ら，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９，９１２１）。
セレクチンのアンタゴニスト（抗体および炭水化物）は、炎症の場での好中球の血管外遊出を阻止すること（ピー・ピスクエタとエフ・ダブリュー・ルシンカス（P．Piscueta and F．W．Luscinskas），１９９４，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏ．１４５，４６１−４６９）、虚血・再潅流の動物モデル（エー・エス・ウェイリッチ（A.S．Weyrich）ら，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１，２６２０−２６２９；アール・ケー・ウィン(R.K．Winn)ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２、２０４２−２０４７）、急性肺傷害（エム・エス・ムリガン(M.S．Mulligan)ら，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，６４１０−６４１７；エー・シーカンプ（A．Seekanp）ら，１９９４，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４４，５９２−５９８）、インスリン炎／糖尿病（エックス・ディー・ヤング(X.D．Yang)ら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０，１０４９４−１０４９８）、髄膜炎（シー・グラネット(C．Granet)ら，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，９２９−９３６）、出血ショック（アール・ケー・ウィン(R.K．Winn)ら，Ａｍ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７，Ｈ２３９１−Ｈ２３９７）および移植において有効であることが証明されている。さらにセレクチン発現は、関節炎のモデル（エフ・ジャマー（F．Jamar）ら，１９９５，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ １９４，８４３−８５０）、実験的アレルギー脳脊髄炎（ジェイ・エム・ドップ(J.M．Dopp)ら，１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．５４，１２９−１４４）、皮下炎症（エー・シバー（A．Siber）ら，１９９４，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０，１６３−１７０）、糸球体腎炎（ピー・ジー・チッピング（P.G．Tipping・）ら，１９９４，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４６，７９−８８）、白血病細胞および大腸ガン（アール・エム・ラフレニー(R.M．Lafrenie)ら，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ［Ａ］３０Ａ，２１５１−２１５８）で記載されており、Ｌ−セレクチン受容体は、中枢神経系の有鞘領域で観察されている（ケー・フアング（K．Huang）ら，１９９１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８，１７７８−１７８３）。これらの動物モデルデータは、宿主組織の傷害が好中球に媒介される広範囲の疾患においてセレクチンアンタゴニストの治療的役割が期待されることを強く支持している。
内因性炭水化物を認識するレクチンの他の例は、ＣＤ２２β、ＣＤ２３、ＣＤ４４および精子レクチンである（エー・バルキ（A．Varki），１９９３，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．３，９７−１３０；ピー・エム・ワサーマン（P.M．Wassarman），１９８８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７，４１５−４２２）。ＣＤ２２βは、Ｂリンパ球活性化の初期段階に関与し、アンタゴニストは免疫応答を調節し得る。ＣＤ２３は、低親和性ＩｇＥ受容体であり、アンタゴニストはアレルギーや喘息のＩｇＥ応答を調節し得る。精子レクチンは、精子／卵子接着および先体（acrosome）応答に関与すると考えられ、アンタゴニストは、接着を阻止するかまたは未成熟な殺精子先体応答を誘導することにより、有効な避妊薬となり得る。
外因性炭水化物を認識するレクチンに対するアンタゴニストは、感染症の防止に対して広く応用できる。多くのウイルス（インフルエンザＡ、ＢおよびＣ；センダイ、ニューキャッスル病、コロナウイルス、ロタウイルス、脳脊髄炎ウイルス、脳心筋炎ウイルス、レオウイルス、パラミキソウイルス）は、細胞に付着するためにウイルス粒子の表面のレクチンを利用し、これは感染の必要条件であり、これらのレクチンに対するアンタゴニストは感染症を防止すると予測される（エー・バルキ（A．Varki），１９９３，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．３，９７−１３０）。同様に多くの細菌のコロニー形成／感染症では、哺乳動物の細胞表面の糖結合体に接着するために、細胞表面レクチンを利用する。細菌の細胞表面レクチンに対するアンタゴニストは、広範囲の細菌感染症の治療薬になり得ると期待され、胃（ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)）、尿管（大腸菌（E．coli））、肺（クレブシェラ・ニューモニー(Klebsiella pneumoniae)、ストレプトコッカス・ニューモニー（Streptococcus pneumoniae））、および口（アクチノミセス・ナエスルンディ(Actinomyces naeslundi)およびアクチノミセス・ビスコスス（Actinomyces viscosus））コロニー形成／感染症がある（エス・エヌ・アブラハム（S.N．Abraham），１９９４，Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ：Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ中のＢａｃｔｅｒｉａｌ Ａｄｈｅｓｉｎｓ，シー・ディー・ウェグナー(C.D．Wegner)編；ビー・ジェイ・マン(B.J．Mann)ら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，３２４８−３２５２）。細菌に媒介される具体的な疾患には、嚢胞性繊維症患者の罹患率と死亡率の主因である緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）感染症がある。緑膿菌(P．aeruginosa)の治療において高親和性アンタゴニストが有効であるという例外は、３つの観察結果に基づく。第１に、細菌細胞表面ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌ結合性レクチンは、肺上皮のアシアロガングリオシド（αＧＭ１およびαＧＭ２）に接着して感染を媒介する（エル・イムンド(L．Imundo)ら，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２，３０１９−３０２３）。第２に、インビトロで緑膿菌(P．aeruginosa)の結合は、ガングリオシド四糖残基であるＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃの競合を受ける。第３に、インビボでシュードモナス（Pseudomonas）表面抗原に対する抗体を点滴すると、肺や胸膜への傷害を防ぐことができる（ジェイ・エフ・ピッター(J.F．Pitter)ら，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２，１２２１−１２２８）。
感染を開始するためにレクチンを利用する非細菌性微生物には、エントアメーバ・ヒスタリチカ(Entamoeba histalytica)（小腸粘膜への接着を媒介するＧａｌ特異的レクチン；ダブリュー・エー・ペトリ・ジュニア(W.A．Petri，Jr.)，１９９１，ＡＭＳ Ｎｅｗｓ ５７：２９９−３０６）およびプラスモジウム・ファシパルム（Plasmodium faciparum）（赤血球のグリコホリンＡの末端Ｎｅｕ５Ａｃ（ａ２−３）Ｇａｌに特異的なレクチン；ピー・エー・オーランディ（P.A．Orlandi）ら，１９９２，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１６：９０１−９０９）がある。これらのレクチンに対するアンタゴニストは、赤痢やマラリアの治療薬の候補である。
毒素は、外因性炭水化物を認識する別のクラスのタンパク質である（ケー−エー・カールソン（K-A Karlsson），１９８９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：３０９−３５０）。毒素は、機能性および細胞認識／接着ドメインからなる複雑な２ドメイン分子である。接着ドメインはしばしばレクチンである（すなわち、細菌毒素：百日咳毒素、コレラ毒素、熱感受性毒素、ベロ毒素および破傷風毒素；植物毒素：リシンおよびアブリン）。レクチンアンタゴニストは、毒素がその標的細胞に結合するのを妨害し、従って抗毒素として有用であると期待される。
レクチンの役割が推定される他の条件がある。例えば、遺伝的突然変異により、血清マンノース−結合タンパク質（ＭＢＰ）のレベルが低下する。このレクチンのレベルが不足している幼児は、重症の感染症になるが成人はそうならない。東洋人および西洋人でも突然変異の頻度が高いことは、低レベルの血清マンノース−結合タンパク質が有効である条件が存在するかも知れないことを示唆する。リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、そのような条件の１つである。ＲＡの重症度は、Ｆｃ領域炭水化物上の末端ガラクトース残基が欠如しているＩｇＧ抗体の上昇と相関する（エー・ヤング（A．Young）ら，１９９１，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．３４，１４２５−１４２９；アイ・エム・ロイツ（I.M．Roitt）ら，１９８８，Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍ．１，４９９−５０６）。通常の炭水化物と異なり、これらのｇａｌ−欠損炭水化物はＭＢＰの基質である。ＭＢＰ／ＩｇＧ免疫複合体は、補体活性化を介して宿主の組織傷害に寄与する。同様に、好酸球塩基性タンパク質は細胞毒性を有する。細胞毒性がこのタンパク質のレクチン活性により媒介されるなら、レクチンアンタゴニストは、好酸球媒介肺傷害の治療に応用できる可能性がある。
レクチンアンタゴニストはまた、イメージング剤または診断薬として有用かも知れない。例えばＥ−セレクチンアンタゴニストは、炎症内皮のイメージングに使用できる。同様に特異的血清レクチンに対するアンタゴニスト（すなわち、マンノース結合タンパク質）もまた、タンパク質レベルの定量に有用となり得る。
レクチンはしばしば複雑な複数ドメインのマルチマータンパク質である。しかし哺乳動物レクチンの炭水化物結合活性は、普通炭水化物認識ドメインすなわちＣＲＤの性質である。哺乳動物レクチンのＣＲＤは、３つの系統樹的に保存されたクラスに分類される：Ｃ型、Ｓ型およびＰ型（ケー・ドリカマーとエム・テイラー（K．Drickamer and M．Taylor），１９９３，Ａｎｎｕ，Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２３７−２６４）。Ｃ型レクチンはリガンド結合にＣａ++を必要とし、細胞外膜および可溶性タンパク質であり、クラスとして多様な炭水化物に結合する。Ｓ型レクチンは還元条件下で最も活性があり、細胞内および細胞外の両方に存在し、β−ガラクトシダーゼに結合し、Ｃａ++を必要としない。Ｐ型レクチンは、主要なリガンドとして６−リン酸塩に結合する。
レクチンの特異性は、普通単糖および／またはオリゴ糖で発現され（すなわち、ＭＢＰはマンノース、フコースおよびＮ−アセチルグルコサミンに結合する）、単糖に対する親和性は弱い。単糖の解離定数は、典型的にはミリモルの範囲である（ワイ・シー・リー（Y.C．Lee），１９９２，ＦＡＳＥＢ Ｊ．６：３１９３−３２００；ジー・ディー・グリック（G.D．Glick）ら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３６６０−２３６６９；ワイ・ナガタとエム・エム・バーガー(Y．Nagata and M.M．Burger)，１９７４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：１１６−３１２２）。
マンノースオリゴマーと複合体を形成したＭＢＰの共結晶（co-crystal）は、Ｃ型レクチンの親和性と特異性に対する分子的限界の情報を与える（ダブリュー・アイ・ウェイス(W.I．Weis)ら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３６０：１２７−１３４；ケー・ドリカマー（K．Drickamer），１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２１：４５６−４５９）。マンノースの３−および４−ヒドロキシル基は、結合Ｃａ＋＋イオン＃２と配位結合を形成し、グルタミン酸（１８５と１９３）やアスパラギン（１８７と２０６）と水素結合を形成する。ＣＲＤと結合した糖の接触が制限されていることは、単糖結合の範囲と一致する（Ｎ−アセチルグルコサミンはエクアトリアル３−および４−ヒドロキシルを有し、フコースは同様に２位および３位に形成されたヒドロキシルを有する）。
天然のリガンドに対するマンノース結合タンパク質や他のレクチンの親和性は、単糖に対する親和性より大きい。特異性と親和性の上昇は、１）末端糖との追加の結合（すなわち、ニワトリ肝臓レクチンは、マンノースまたはフコースよりも大きな親和性でＮ−アセチルグルコースに結合し、２−置換基との相互作用を示唆する）；２）複合体オリゴ糖に結合するためのＣＲＤの凝集（すなわち、哺乳動物アシアリル糖タンパク質受容体）；３）追加の糖残基との相互作用（すなわち、セレクチンのレクチンドメインは、四糖シアリル−ルイスXの２つの残基、荷電末端残基であるシアル酸、およびフコース残基と相互作用するようである：コムギ胚芽アグルチニンはＮ−アセチルグルコサミンのトリマーのすべての３つの残基と相互作用するようである）；または４）糖タンパク質の非炭水化物部分との接触、のいずれかによる、タンパク質とリガンドの追加の接触により達成される（ケー・ドリカマー（K．Drickamer），１９９３，前述）。
単糖およびオリゴ糖に対するレクチンの低親和性が、有効な治療薬である高親和性アンタゴニストを開発する上での大きな障害である。アンタゴニストを開発するための使用されているアプローチは、天然に存在するものと同じである：１）置換基を付加または修飾して相互作用の数を増加させる；および２）単純なリガンドをマルチマー化する。
第１のアプローチはあまり成功していない。例えば、シアル酸の同族体は、インフルエンザウイルス血球凝集素に対する親和性について解析されている（エス・ジェイ・ワトウィッチ(S.J．Watowich)ら，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：７１９−７３１）。最適な類似体の解離定数は、３０〜３００μＭであり、これは標準的単糖よりわずかに１０〜１００倍良いだけである。
セレクチンに対する炭水化物リガンドの修飾もあまり成功していない。静止ＥＬＩＳＡ競合測定法において、固定されたシアリル−ルイスXに対するＥ−セレクチン／ＩｇＧキメラの結合の阻害に対する、シアリル−ルイスａとシアリル−ルイスＸのＩＣ５０は、それぞれ２２０μＭおよび７５０μＭである（アール・エム・ネルソン(R.M．Nelson)ら，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１，１１５７−１１６６）。シアリル−ルイスａ誘導体（ＧｌｃＮＡｃへの脂肪族アグリコンの付加とＮ−アセチルのＮＨ2基による置換）のＩＣ50は、１０倍改善されて２１μM になった。同様にシアリル−ルイスXからＮ−アセチルを除去すると、測定法依存性に阻害が改善される（シー・フォクサル(C．Foxall)ら、１９９２，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１７，８９５−９０２；エス・エー・デフリース（S.A．DeFrees）ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５，７５４９−７５５０）。
第２のアプローチである単純なリガンドのマルチマー化は、複合炭水化物に結合するレクチンに対する親和性が劇的に改善されることがある（ワイ・シー・リー（Y.C．Lee）、前述）。一方このアプローチは、単純なオリゴ糖に結合するレクチンに対して大きな増強は示さず、Ｅ−セレクチンに対する最小の炭水化物リガンドであるシアリル−ルイスXのダイマー化は、阻害を約５倍改善させる（エス・エー・デフリース（S.A．DeFrees）ら，前述）。
別のアプローチは、天然のリガンドに化学的に無関係な化合物を設計することである。静止ＥＬＩＳＡ競合測定法では、イノシトールポリアニオンは、１．４μＭ〜２．８μＭの範囲のＩＣ50でＬ−セレクチンおよびＰ−セレクチン結合を阻害する（オー・セコニ（O．Cecconi）ら，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１５０６０−１５０６６）。セレクチンのアミノ酸配列に基づく合成オリゴペプチドは、５０μＭ〜１ｍＭの範囲のＩＣ50で固定化Ｐ−セレクチン結合への好中球結合を阻害する（ジェイ・ジー・ゲング(J.G．Geng)ら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１９８４６−１９８５３）。
レクチンは、後述のセレックス技術によるアンタゴニストの単離のほぼ理想的な標的である。この理由は、炭水化物結合部位に結合したオリゴヌクレオチドリガンドは、関連する糖により特異的に溶出されるためである。競合する糖より数オーダー大きい親和性を有するオリゴヌクレオチドリガンドは、核酸リガンド対競合物質比を適切に操作することにより得られる。炭水化物結合部位はレクチンの活性部位であり、この方法により単離される基本的にすべてのリガンドはアンタゴニストである。さらにセレックスリガンドは、単糖やオリゴ糖よりはるかに大きな特異性を示すであろう。
標的分子に対する高特異性結合を有する核酸分子のインビトロ進化法が開発されている。指数的濃縮によるリガンドの系統的進化（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment）(セレックス（ＳＥＬＥＸ）と呼ぶ)は、現在は放棄されている米国特許出願第０７／５３６，４２８号（標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化」）、現在米国特許第５，４７５，０９６号である１９９１年６月１０日出願の米国特許出願第０７／７１４，１３１号（標題「核酸リガンド」）、現在米国特許第５，２７０，１６３号である１９９２年８月１７日出願の米国特許出願第０７／９３１，４７３号（標題「核酸リガンド」（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０７８号も参照）に記載されており、この各々は本明細書に具体的に引用される。これらの各出願は本明細書においてまとめてセレックス（ＳＥＬＥＸ）特許出願と呼び、任意の所望の標的分子に対して核酸リガンドを作成するための基本的に新規な方法を記載している。
セレックス法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択と、同じ一般的選択法を用いる結合、分配および増幅の段階的繰り返しを用いて、結合親和性と選択性の事実上すべての所望の基準を達成する。セレックス法は、核酸の混合物（好ましくは、ランダム化された配列のセグメントからなる）から出発して、結合に好ましい条件下で標的に混合物を接触させる工程、標的分子に特異的に結合した核酸から結合しなかった核酸を分離する工程、核酸−標的分子複合体を解離させる工程、核酸−標的分子複合体から解離した核酸を増幅して、リガンドが濃縮された核酸の混合物を得る工程、次に標的分子に対して高特異性、高親和性の核酸リガンドを得るのに必要な回数、結合、分離、解離および増幅工程を繰り返す工程からなる。
基本的なセレックス法は、多くの具体的な目的を達成するために修飾されている。例えば、１９９２年１０月１４日出願の米国特許出願第０７／９６０，０９３号（標題「構造の基本に基づく核酸の選択方法」）は、ゲル電気泳動とともにセレックスを用いて、具体的な構造的特徴（例えば、ベントＤＮＡ）を有する核酸分子を選択する。１９９３年９月１７日出願の米国特許出願第０８／１２３，９３５号（標題「核酸リガンドの光選択」）は、標的分子に結合および／またはこれを架橋および／または光不活性化することができる光反応性基を含有する核酸リガンドを選択するための、セレックスに基づく方法を記載する。１９９３年１０月７日出願の米国特許出願第０８／１３４，０２８号（標題「テオフィリンとカフェインを区別する高親和性核酸リガンド」）は、密接に関連した分子を区別することができる高特異性の核酸リガンドを同定するための方法（逆セレックス（Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ）と呼ぶ）を記載する。１９９３年１０月２５日出願の米国特許出願第０８／１４３，５６４号（標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化：溶液セレックス」）は、標的分子に対して高い親和性および低い親和性を有するオリゴヌクレオチドを効率よく分離する、セレックスに基づく方法を記載する。１９９２年１０月２１日出願の米国特許出願第０７／９６４，６２４号（標題「核酸リガンドの製造方法」）は、セレックス実施後の改良された核酸リガンドを得るための方法を記載する。１９９５年３月８日出願の米国特許出願第０８／４００，４４０号（標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化：ケミ−セレックス（Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ）」）は、リガンドをその標的に共有結合させるための方法を記載する。
セレックス法は、リガンドに改良された特性（例えば、改良されたインビボの安定性または改良された送達特性）を与える修飾されたヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような修飾の例には、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置での化学的置換がある。修飾ヌクレオチドを含有するセレックスで同定される核酸リガンドは、１９９３年９月８日出願の米国特許出願第０８／１１７，９９１号（標題「修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド」）に記載されており、これはピリミジンの５−および２’−位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する。米国特許出願第０８／１３４，０２８号（前述）は、２’−アミノ（２’−ＮＨ2）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）で修飾された１つまたはそれ以上のヌクレオチドを含有する高特異性の核酸リガンドを記載する。１９９４年６月２２日出願の米国特許出願第０８／２６４，０２９号（標題「分子内求核性置換による２’修飾ピリミジンの新規調製法」）は、２’−修飾ヌクレオシドの新規な作成法を記載する。
セレックス法は、１９９４年８月２日出願の米国特許出願第０８／２８４，０６３号（標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化：キメラ−セレックス」）に記載されるように、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドとの組合せを包含する。セレックス法はまた、１９９４年８月２８日出願の米国特許出願第０８／２３４，９９７号（標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化：ブレンドセレックス」）および１９９５年５月４日出願の米国特許出願第０８／４３４，４６５号（標題「核酸リガンド複合体」）に記載されるように、選択された核酸リガンドを非オリゴヌクレオチド機能単位との組合せを包含する。これらの出願は、オリゴヌクレオチドの広範囲の形や他の性質および効率的な増幅や複製能を、他の分子の好ましい性質と組合せることを可能にする。基本的なセレックス法の修飾を記載する前述の出願の各々は、参考のためその全体が本明細書に引用される。
本発明は、レクチン標的に対する核酸リガンドを得るためにセレックス法を応用する。レクチン標的すなわちレクチンは、非免疫起源のすべての非酵素的炭水化物結合性タンパク質を含有し、前述したものを含むがこれらに限定されない。
具体的には、コムギ胚芽アグルチニンに対する高親和性核酸リガンドおよび種種のセレクチンタンパク質が単離されている。本発明の目的において、コムギ胚芽アグルチニン、コムギ胚芽レクチンおよびＷＧＡは相互に交換可能である。コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）は、糖結合体の単離、精製および構造研究に広く使用されている。すでに概説したように、セレクチンは重要な抗炎症標的である。セレクチンに対するアンタゴニストは、炎症の場で白血球の血管外遊出を調節し、こうして好中球による宿主組織傷害を低下させる。セレックスを用いることにより、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチン媒介接着の高親和性アンタゴニストが単離される。
発明の簡単な説明
本発明は、レクチンに対する核酸リガンドの同定方法および製造方法、並びにこうして同定および製造された核酸リガンドを包含する。さらに詳しくは、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチンに特異的に結合することができる核酸リガンドが提供される。
さらに本発明は、（ａ）核酸の候補混合物を調製する工程、（ｂ）レクチンに対する親和性に基づき、該候補混合物のメンバーを分離する工程、そして（ｃ）選択された分子を増幅して、レクチンへの結合について比較的高い親和性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得る工程、からなるレクチンに対する核酸リガンドおよび核酸リガンド配列の同定方法を含む。
さらに詳しくは、本発明は上記方法により同定されたレクチンに対する核酸リガンドを包含し、表２に記載のコムギ胚芽アグルチニン、表８、１２、および１６に記載のＬ−セレクチンに対する核酸リガンド、および表１９と２５に記載のＰ−セレクチンに対する核酸リガンドを包含する。さらに、Ｅ−セレクチンおよび血清マンノース−結合タンパク質に対する核酸リガンドが包含される。また記載したリガンドの任意のものに実質的に相同的なレクチンに対する核酸リガンドであって、レクチンに結合し、炭水化物に結合するレクチンの能力に拮抗する実質的に同じ能力を有する核酸リガンドが包含される。さらに本発明には、本明細書に記載のリガンドと実質的に同じ構造を有し、レクチンに結合し、炭水化物に結合するレクチンの能力に拮抗する実質的に同じ能力を有する核酸リガンドが包含される。
本発明はまた、本明細書で同定される核酸リガンドに基づく修飾ヌクレオチド配列およびその混合物を包含する。
本発明また、治療、予防および診断的応用における核酸リガンドの使用を包含する。
発明の詳細な説明
本出願は、セレックス法として知られている方法により一般的に同定される複合組織標的に対する核酸リガンドを記載する。セレックスは、現在は放棄されている米国特許出願第０７／５３６，４２８号（標題「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化」）、現在米国特許第５，４７５，０９６号である１９９１年６月１０日出願の米国特許出願第０７／７１４，１３１号（標題「核酸リガンド」）、現在米国特許第５，２７０，１６３号である１９９２年８月１７日出願の米国特許出願第０７／９３１，４７３号（標題「核酸リガンド」、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０７８号も参照）に記載されている。この各々は参考のため本明細書に具体的に引用され、まとめてセレックス特許出願と呼ぶ。
多くの基本的な型では、セレックス法は以下の一連の工程により定義される： １）異なる配列の核酸の候補混合物を調製する。候補混合物は一般的に、固定された配列の領域（すなわち、候補混合物の各メンバーは同じ位置に同じ配列を含有する）およびランダム化された配列の領域を含有する。固定された配列領域は：（ａ）下記の増幅工程を助ける、（ｂ）標的に結合することが知られている配列を模倣する、または（ｃ）候補混合物中の核酸の特定の構造配置の濃度を増強させることにより、選択される。ランダム化された配列は完全にランダム化されている（すなわち、任意の位置に塩基が見つかる確率は４分の１である）か、または部分的にランダム化されている（例えば、任意の位置に塩基が見つかる確率は、０〜１００％の任意のレベルである）。
２）候補混合物は、標的と候補混合物中のメンバーとの結合に適した条件下で、選択された標的と接触される。これらの条件下で、標的と候補混合物の核酸との相互作用は、標的と標的に対して最も強い親和性を有する核酸との間の核酸−標的対を形成すると考えられる。
３）標的に対して最も強い親和性を有する核酸は、標的に対してより弱い親和性を有する核酸から分離される。候補混合物中には最も強い親和性の核酸に対応するほんのわずかの配列（おそらく１分子のみの核酸）しか存在しないため、分離中に候補混合物中の多量の核酸（約０．０５〜５０％）が保持されるように、分離基準を設定することが一般的に好ましい。
４）標的に対して比較的強い親和性を有するものとして分離中に選択される核酸は、次に標的に対して比較的高い親和性を有する核酸が濃縮されている新しい候補混合物を作成するために増幅される。
５）前述の分離および増幅工程を繰り返すことにより、新たに形成される候補混合物はユニーク配列がより少なくなり、標的に対する核酸の平均的な親和性の程度は一般的に上昇する。極端な場合は、セレックス法は、標的分子に対して最も強い親和性を有する元々の候補混合物からの核酸である１つまたは少数のユニークな核酸しか含有しない候補混合物を与えるであろう。
セレックス特許出願は、この方法を記載し、詳細に説明している。ここには、この方法で使用される標的；候補混合物内の核酸の分離方法；および濃縮された候補混合物を作成するための分離された核酸の増幅方法が含まれる。セレックス特許出願はまた、多くの標的分子種（核酸結合性および非核酸結合性タンパク質である両方のタンパク質を含む）に対して得られるリガンドを記載している。
本発明はまた、前記のリガンドを含有し、ここでリガンドのインビボの安定性を増加させるか、またはリガンドの送達を増強または媒介するためにいくつかの化学的修飾が行われる。そのような修飾の例には、ある核酸配列の糖および／またはリン酸および／または塩基位置の化学的置換がある。例えば、１９９３年９月９日出願の米国特許出願第０８／１１７，９９１号（標題「修飾ヌクレオチド含有高親和性核酸リガンド」）を参照（これは参考のため本明細書に引用される）。さらに、１９９２年１０月２１日出願の同時係属および同一出願人の米国特許出願第０７／９６４，６２４号（’６２４）（現在米国特許第５，４９６，９３８号）では、セレックスの実施後に改良核酸リガンドを得るための方法が記載される。’６２４出願（標題「核酸リガンドの製造方法」）は、参考のため本明細書に引用される。さらに’６２４出願は、核酸リガンドの３次元構造を決定するための方法が含有される。そのような方法には、数学的モデルおよびセレックス誘導リガンドの構造修飾（例えば、化学的修飾およびヌクレオチド置換）がある。他の修飾は当業者に公知である。このような修飾は、セレックス後に行われる（すでに同定されている非修飾リガンドの修飾）か、またはセレックス工程中に取り込まれる。さらに本発明の核酸リガンドは種々の他の化合物（例えば、親油性化合物または非免疫原性、高分子量化合物があるがこれらに限定されない）と複合体を形成する。親油性化合物には、コレステロール、ジアルキルグリセロール、およびジアシルグリセロールがあるが、これらに限定されない。非免疫原性、高分子量化合物には、ポリエチレングリコール、デキストラン、アルブミンおよび磁鉄鉱があるが、これらに限定されない。本明細書に記載の核酸リガンドは、親油性化合物（例えば、コレステロール）と複合体を形成するか、または親油性成分（例えば、リポソーム）からなる複合体に結合されるかまたはカプセル化される。複合体形成した核酸リガンドは、細胞内標的への核酸リガンドの送達のために、細胞による核酸リガンドの細胞摂取を増強させることができる。複合体形成した核酸リガンドはまた、薬物動態および安定性が増強し得る。１９９５年５月４日出願の米国特許出願第０８／４３４，４６５号（標題「核酸リガンド複合体」）（参考のため本明細書に引用される）は、核酸リガンドおよび親油性化合物または非免疫原性、高分子量化合物からなる治療用または診断用複合体の製造方法を記載する。
本明細書に記載の方法およびこのような方法により同定される核酸リガンドは、治療および診断目的に有用である。治療用途には、ヒト患者の疾患または症状の治療または防止がある。治療用途の多くは、本発明の背景で記載され、特にセレクチンに対する核酸リガンドは抗炎症剤として有用である。セレクチンに対するアンタゴニストは、炎症の場での白血球の血管外遊出を調節し、こうして好中球が引き起こす宿主の組織傷害が低下する。診断用途には、インビボまたはインビトロの応用がある。セレックス法は一般に、そして本発明で具体的に特許請求されるセレックス法は、特に診断応用に適している。セレックスは、高親和性および驚くべき特異性で標的に結合することができる核酸リガンドを同定する。これらの特性はもちろん診断用リガンドで当業者が求める好ましい性質である。
本発明の核酸リガンドは、当業者の使用するいくつかの方法に従って日常的に診断目的に適合させてもよい。診断薬は、使用者が特定の位置または濃度である標的の存在が識別できればよい。標的と結合対を形成する能力は、診断目的の陽性のシグナルを発生させるのに充分であろう。当業者はまた、核酸リガンドの存在を追跡するための標識物を取り込むために、当該分野で公知の方法により、このようなリガンドを適合させることができるであろう。このような標識物は、多くの診断法で使用できる。本明細書に記載のレクチン（特にセレクチン）に対する核酸リガンドは、レクチンタンパク質の同定に具体的に使用できる。
セレックスは標的分子に対する高親和性リガンドを提供する。これは、核酸研究の分野では前例のないユニークな業績である。本発明は、セレックス法をレクチン標的に応用する。具体的に本発明は、コムギ胚芽アグルチニンおよびセレクチン、特にＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、およびＥ−セレクチンに対する核酸リガンドの同定を記載する。後述の例のセクションにおいて、レクチンに対する核酸リガンドを単離し同定するために使用される実験パラメータが記載される。
薬剤として有用な核酸を製造するために、核酸リガンドは、（１）標的に対して目的の効果を達成できる方法で標的に結合し；（２）目的の効果を得るためにできるだけ小さく；（３）できるだけ安定であり、；そして（４）選択されるリガンドに対して特異的なリガンドである、ことが好ましい。多くの場合、核酸リガンドは標的に対してできるだけ高い親和性を有することが好ましい。
本発明では、５０個のランダム位置（５０Ｎ）を含有する縮重ライブラリーからコムギ胚芽アグルチニンに対して特異的な高親和性を有する核酸リガンドを得るためにセレックス実験を行った。本発明は、例１および２に記載の方法により同定された表２（配列番号４〜５５）に示すコムギ胚芽アグルチニンに対する特異的核酸リガンドを包含する。具体的には、２’−ＮＨ2修飾ピリミジンが提供される。本発明により包含されるリガンドの範囲は、セレックス法により同定される、修飾されたかまたは修飾されていない、コムギ胚芽アグルチニンに対するすべての核酸リガンドを含む。さらに詳しくは本発明は、表２に示すリガンドに実質的の相同的な核酸配列を包含する。実質的に相同的とは、７０％を超え、最も好適には８０％を超える一次配列相同性を意味する。表２に示すコムギ胚芽アグルチニンのリガンドの配列同族体を再検討すると、一次相同性がほとんどまたは全くない配列が、実質的に同じ結合能力でコムギ胚芽アグルチニンに結合することがあることがわかった。このため本発明は、表２に示す核酸リガンドと実質的に同じコムギ胚芽アグルチニンへの結合能力を有する核酸リガンドも包含する。コムギ胚芽アグルチニンに結合する実質的に同じ能力とは、親和性が、本明細書に記載のリガンドの親和性の数オーダーの範囲内であることを意味する。ある配列（本明細書に記載のものと実質的に相同的）がコムギ胚芽アグルチニンに実質的に同じ能力で結合するか否かを決定することは、当業者の技術の範囲内である。
本発明では、３０または４０個のランダム位置（３０Ｎまたは４０Ｎ）を含有する縮重ライブラリーからＬ−セレクチンに対して特異的な高親和性を有する核酸リガンドを得るためにセレックス実験を行った。本発明は、例７、８、１３、１４、２２、および２３に記載の方法により同定された表８、１２および１６（配列番号６７〜１１７、１２９〜１８０、１８５〜１９６および２９３〜３８８）に示すＬ−セレクチンに対する特異的核酸リガンドを包含する。具体的には、２’−ＮＨ2または２’−Ｆピリミジンを含有するＲＮＡリガンドおよびｓｓＤＮＡリガンドが提供される。本発明により包含されるリガンドの範囲は、セレックス法により同定される、修飾されたかまたは修飾されていない、Ｌ−セレクチンに対するすべての核酸リガンドを含む。さらに詳しくは本発明は、表８、１２、および１６に示すリガンドに実質的の相同的な核酸配列を包含する。実質的に相同的とは、７０％を超え、最も好適には８０％を超える一次配列相同性を意味する。表８、１２、および１６に示すＬ−セレクチンのリガンドの配列同族体を再検討すると、一次相同性がほとんどまたは全くない配列が、実質的に同じ結合能力でＬ−セレクチンに結合することがあることがわかった。このため本発明は、表８、１２、および１６に示す核酸リガンド実質的に同じＬ−セレクチンへの結合能力を有する核酸リガンドも包含する。Ｌ−セレクチンに結合する実質的に同じ能力とは、親和性が、本明細書に記載のリガンドの親和性の数オーダーの範囲内であることを意味する。ある配列（本明細書に記載のものと実質的に相同的）がＬ−セレクチンに実質的に同じ能力で結合するか否かを決定することは、当業者の技術の範囲内である。
本発明では、５０個のランダム位置（５０Ｎ）を含有する縮重ライブラリーからＰ−セレクチンに対して特異的な高親和性を有する核酸リガンドを得るためにセレックス実験を行った。本発明は、例２７、２８、および３５に記載の方法により同定された表１９および２５（配列番号１９９〜２４７、および２５１〜２９０）に示すＰ−セレクチンに対する特異的核酸リガンドを包含する。具体的には、２’−ＮＨ2または２’−Ｆピリミジンを含有するＲＮＡリガンドが提供される。本発明により包含されるリガンドの範囲は、セレックス法により同定される、修飾されたかまたは修飾されていない、Ｐ−セレクチンに対するすべての核酸リガンドを含む。さらに詳しくは本発明は、表１９および２５に示すリガンドに実質的の相同的な核酸配列を包含する。実質的に相同的とは、７０％を超え、最も好適には８０％を超える一次配列相同性を意味する。表１９および２５に示すＰ−セレクチンのリガンドの配列同族体を再検討すると、一次相同性がほとんどまたは全くない配列が、実質的に同じ結合能力でＰ−セレクチンに結合することがあることがわかった。このため本発明は、表１９および２５に示す核酸リガンド実質的に同じＰ−セレクチンへの結合能力を有する核酸リガンドも包含する。Ｐ−セレクチンに結合する実質的に同じ能力とは、親和性が、本明細書に記載のリガンドの親和性の数オーダーの範囲内であることを意味する。ある配列（本明細書に記載のものと実質的に相同的）がＰ−セレクチンに実質的に同じ能力で結合するか否かを決定することは、当業者の技術の範囲内である。
本発明では、４０個のランダム位置（４０Ｎ）を含有する縮重ライブラリーからＥ−セレクチンに対して特異的な高親和性を有する核酸リガンドを得るためにセレックス実験を行った。本発明は、例４０に記載の方法により同定されたＥ−セレクチンに対する特異的核酸リガンドを包含する。本発明により包含されるリガンドの範囲は、セレックス法により同定される、修飾されたかまたは修飾されていない、Ｅ−セレクチンに対するすべての核酸リガンドを含む。
さらに本発明は、本発明の核酸リガンドを含む多価複合体を包含する。多価複合体は結合エネルギーを上昇させて、核酸リガンドのより遅いオフレート（off-rate）により良好な結合親和性を促進する。多価複合体は、低用量においてモノマーより有用である。さらに高分子量ポリエチレングリコールは、複合体のインビボのクリアランス速度を低下させるために、複合体の一部に含有される。具体的にはＬ−セレクチンに対する核酸リガンドが、多価複合体に入れられる。
前述のように、レクチンに選択的に結合できる能力のため、本明細書に記載のレクチンに対する核酸リガンドは薬剤として有用である。従って本発明はまた、レクチンに結合できる核酸リガンドを投与することによるレクチン媒介性疾患の治療法を包含する。
核酸リガンドの治療用組成物は、注射により非経口投与で投与されるが、他の有効な投与型（例えば、関節内注射、吸入ミスト、経口活性製剤、経皮的イオン導入法または坐剤）も使用できる。１つの好適な担体は生理食塩水であるが、他の薬剤学的に許容される担体も使用可能である。１つの好適な実施態様において、担体とリガンドは生理的適合性のある徐放製剤を構成する。このような担体の主要な溶媒は、天然では水溶性または非水溶性である。さらに担体は、製剤のｐＨ、浸透圧、粘性、清澄性、色、無菌性、安定性、溶解速度、または臭いを修飾または維持するための他の薬剤学的に許容される賦形剤を含有してよい。同様に、担体は、リガンドの安定性、溶解、放出もしくは吸収速度を修飾または維持するための薬剤学的に許容されるさらに別の賦形剤を含有してよい。このような賦形剤は、単位服用量または複数回投与型の非経口投与用の製剤の製造に普通に使用される物質である。
治療用組成物がいったん製剤化されれば、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、脱水もしくは凍結乾燥粉末として無菌バイアル中に保存される。このような製剤は、即時使用型または投与直前に復元を必要とする型で保存される。全身性送達のための核酸リガンドを含有する製剤の投与方法は、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内に、または膣もしくは直腸坐剤で投与される。
多くの疾患に対する充分に確立した動物モデルが存在し、これらはセレクチンアンタゴニスト治療の候補である。オリゴヌクレオチドセレクチンアンタゴニストの効果を試験するためのモデルには、以下のものがある：
１）腹膜炎（ピー・ピズクエタとエフ・ダブリュー・ルシンカス（P．Piscueta and F．W．Luscinskas），１９９４，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏ．１４５，４６１−４６９）、糖尿病（エー・シー・ハニネン(A.C．Hanninen)ら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２，２５０９−２５１５）、リンパ球追跡（エル・エム・ブラッドレイ（L.M．Bradley）ら，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２４０１−２４０５）、糸球体腎炎（ピー・ジー・チッピング（P.G．Tipping）ら，１９９４，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４６，７９−８８）、実験的アレルギー脳脊髄炎（ジェイ・エム・ドップ(J.M．Dopp)ら，１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．５４，１２９−１４４）、ヒトの急性炎症／ＳＣＩＤマウスキメラ（エィチ・−シー・ヤン(H.-C．Yan)ら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，３０５３−３０６３）、エンドトキシン−媒介炎症（ダブリュー・イー・サンダース(W.E．Sander)ら，１９９２，Ｂｌｏｏｄ ８０，７９５−８００）のマウスモデル；
２）急性肺傷害（エム・エス・ミリガン(M.S．Milligan)ら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，８３２−８４０）、後ろ足虚血／再潅流傷害（エー・シーカンプ（A．Seekanp）ら，１９９４，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４４，５９２−５９８）、遠位肺傷害（エー・シーカンプ（A．Seekanp）ら，１９９４，前述；ディー・エル・ガーデン(D.L．Garden)ら，１９９３，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ７５，２５２９−２５４３）、腸間膜細静脈の好中球回転（ケー・レイ（K．Ley）ら，１９９３，Ｂｌｏｏｄ ８２，１６３２−１６３８）、心筋梗塞再潅流傷害（ディー・アルタビラ（D．Altavilla）ら，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．ＰＨａｒｍａｃｏｌ．２７０，４５−５１）のラットモデル；
３）出血ショック（アール・ケー・ウィン(R.K．Winn)ら，Ａｍ Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７，Ｈ２３９１−Ｈ２３９７）、耳虚血再潅流傷害（ディー・ミヘルシック（D．Mihelcic）ら，１９９４，Ｂｏｌｌｏｄ ８４，２３３３−２３２８）、腸間膜細静脈の好中球回転（エー・エム・オロフソン（A．M．Olofsson）ら，Ｂｌｏｏｄ ８４，２７４９−２７５８）、実験的髄膜炎（シー・グラネート（C．Granert）ら，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３，９２９−９３６）；肺、腹膜および皮下細菌感染（エス・アール・シャラー(S.R．Sharer)ら，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，４９８２−４９８８）、心筋再潅流傷害（ジー・モントルチオ（G．Montrucchio）ら，１９８９，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２５６，Ｈ１２３６−Ｈ１２４６）、中枢神経系虚血傷害（ダブリュー・エム・クラーク（W.M．Clark）ら，１９９１，Ｓｔｒｏｋｅ ２２，８７７−８８３）のウサギモデル；
４）心筋梗塞再潅流傷害のネコモデル（エム・ブエルケ（M Buerke）ら，１９９４，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１７２，１３４−１４２）；
５）心筋梗塞再潅流傷害のイヌモデル（ディー・ジェイ・レファー（D.J．Lefer）ら，１９９４，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９０，２３９０−２４０１）
６）関節炎のブタモデル（エフ・ジャマー（F．Jamar）ら，１９９５、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ １９４，８４３−８５０）・
７）皮膚炎症のアカゲザルモデル（エー・シルバー（A．Silber）ら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０，１６３−７５）；
８）腎移植のカニクイザルモデル（エス・−エル・ウィー(S.-L．Wee)，１９９１，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｄ．２３，２７９−２８０）；および
９）ダクロン移植（ティー・パ；アブリカ(T．Palabric)ら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５９，８４８−８５１）、敗血症、外傷および血量減少ショック（エィチ・レドル（H．Redl）ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３９，４６１−４６６）のヒヒモデル。
本明細書に記載のレクチンに対する核酸リガンドは、薬剤および診断薬として有用である。
例
以下の例は本発明のいくつかの態様であり、本発明を限定するものではない。例１〜６は、コムギ胚芽アグルチニンに対する２’−ＮＨ２ ＲＮＡリガンドの同定と性状解析を記載し、例７〜１２は、Ｌ−セレクチンに対する２’−ＮＨ２ＲＮＡリガンドの同定と性状解析を記載する。例１３〜２１は、Ｌ−セレクチンに対するｓｓＤＮＡリガンドの同定と性状解析を記載する。例２２〜２５は、Ｌ−セレクチンに対する２’−Ｆ ＲＮＡの同定と性状解析を記載する。例２６は、Ｐ−セレクチンに対するｓｓＤＮＡリガンドの同定を記載する。例２７〜３９は、Ｐ−セレクチンに対する２’−ＮＨ２および２’−Ｆ ＲＮＡリガンドの同定と性状解析を記載する。例４０は、Ｅ−セレクチンに対する核酸リガンドの同定を記載する。
例１
コムギ胚芽アグルチニンに対する核酸リガンド
本例に記載の実験法は、例２〜６に記載のコムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）に対する核酸リガンドの同定と性状解析に使用される。
実験法
Ａ）材料
コムギ胚芽レクチン（トリチクム・ブルガレ（Triticum vulgare）セファロース６ＭＢビーズは、ファルマシアバイオテク(Pharmacia Biotech)から購入した。コムギ胚芽レクチン、コムギ胚芽アグルチニン、およびＷＧＡは、本明細書において互いに交換して使用可能である。遊離のコムギ胚芽レクチン（トリチクム・ブルガレ（Triticum vulgare）や他のすべてのレクチンは、イー・ワイ・ラボラトリーズ（E Y Laboratories）から得た；メチル−α−Ｄ−マンノピラノシドはカルビオケム(Calbiochem）から、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ＧｌｃＮＡｃ、および三糖Ｎ Ｎ’Ｎ’−トリアセチルキトトリオース、（ＧｌｃＮＡｃ）3は、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.）から購入した。２’−ＮＨ2修飾ＣＴＰとＵＴＰは、ピエケン(Peken)らの方法（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４−３１７）に従って調製した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドはオペロン（Operon）により合成された。他のすべての試薬および化学物質は、市販品を購入した。特に明記していない場合は、実験ではハンクス液（ＨＢＳＳ；１．３ｍＭ ＣａＣｌ2、５．０ｍＭ ＫＣｌ、０．３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．４ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、４．０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、０．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、５．６ｍＭ Ｄ−グルコース；ギブコビーアールエル（GibcoBRL））を使用した。
Ｂ）セレックス
セレックス法は、米国特許第５，２７０，１６３号などに詳細に記載されている。コムギ胚芽アグルチニンセレックス実験では、初期ＲＮＡプールのＤＮＡ鋳型は、５０ランダムヌクレオチドを含有し、Ｎ９ ５’および３’固定領域（５０Ｎ９）5'gggaaaagcgaaucauacacaaga-50N-gcuccgccagagaccaaccgagaa 3'（配列番号１）が隣接している。すべてのＣおよびＵは、リボースの２’−ＯＨと置換された２’−ＮＨ２を有する。ＰＣＲのプライマーは、以下のものである：５’プライマー 5'taatacgactcactatagggaaaagcgaatcatacacaaga 3'（配列番号２）および３’プライマー5'ttctcggttggtctctggcggagc 3’（配列番号３）。出発ランダムプールの固定領域は、ＰＣＲとｃＤＮＡ合成のためのＤＮＡプライマーアニーリング部位ならびにコンセンサスＴ７プロモーターを含有し、インビトロ転写を可能にする。これらの１本鎖ＤＮＡ分子は、ＰＣＲ増幅により転写可能な２本鎖鋳型に変換した。ＰＣＲ条件は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、０．１％トリトンＸ−１００と、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、および２５Ｕ／ｍｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼであった。転写反応物は、５ｍＭ ＤＮＡ鋳型、５Ｕ／μｌ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、４０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ スペルミジン、０．００２％トリトンＸ−１００、４％ＰＥＧ８０００、２ｍＭずつの２’−ＯＨ ＡＴＰ、２’−ＯＨ ＧＴＰ、２’−ＮＨ２ ＣＴＰ、および２’−ＮＨ２ ＵＴＰ、および０．３１ｍＭ α−３２Ｐ ２’−ＯＨ ＡＴＰを含有した。
ＷＧＡ／ＲＮＡ複合体を非結合ＲＮＡから分離する方策は、１）セファロースビーズに固定化されたＷＧＡとともにＲＮＡプールをインキュベートする；２）
充分に洗浄して非結合ＲＮＡを除去する；および３）洗浄したビーズを高濃度の（ＧｌｃＮＡｃ）3を含有する緩衝液中でインキュベートして炭水化物結合部位に結合したＲＮＡ分子を特異的に溶出することである。セレックスプロトコールは表１に示す。
コムギ胚芽レクチンセファロース６ＭＢビーズ上のＷＧＡ密度は、約５mg/mlのゲルすなわち１１６μＭである（製造業者の説明書）。ＨＢＳＳで充分に洗浄後、固定化ＷＧＡをＲＮＡとともに室温で１〜２時間、２ｍｌのシリコーン化カラムで回転を続けながらインキュベートした（表１）。非結合ＲＮＡは、ＨＢＳＳで充分に洗浄して除去した。結合ＲＮＡは２つの画分として溶出した。まず、非特異的に溶出したＲＮＡを、ＨＢＳＳ中の１０ｍＭメチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（表１；ラウンド１〜４）、またはＨＢＳＳ（表１；ラウンド５〜１１）とインキュベートおよび洗浄して除去した。第２に、特に溶出したＲＮＡを、ＨＢＳＳ中の０．５〜１０ｍＭ（ＧｌｃＮＡｃ）3とインキュベートおよび洗浄して除去した（表１）。特異的に溶出された投入ＲＮＡのパーセントを表１に記録する。
特異的に溶出した画分は以下のラウンドで使用するために処理した。固定化ＷＧＡから溶出した画分を、１％ＳＤＳ、２％β−メルカプトエタノールで９０℃で５分間加熱し、フェノール／クロロホルムで抽出した。ＡＭＶ逆転写酵素により５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）2、１０ｍＭ ＤＴＴ、１００pmol ＤＮＡプライマー、０．４ｍＭずつのｄＮＴＰ、０．４Ｕ／μｌ ＡＭＶ ＲＴ中で４８℃で６０分間逆転写した。このｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により、約５００pmolの２本鎖ＤＮＡが得られ、この転写体を次のセレックスを開始するために使用した。
Ｄ）ニトロセルロースフィルター結合測定法
セレックス特許出願に記載されているように、ニトロセルロースフィルター分離法を使用して、ＷＧＡおよび他のタンパク質に対するＲＮＡリガンドの親和性を測定した。フィルターディスク（ニトロセルロース／酢酸セルロース混合マトリックス、孔径０．４５μＭ、ミリポア(Millipore)；または純粋なニトロセルロース、孔径０．４５μＭ、バイオラッド(Bio-Rad)）を、真空マニホールド上に置き、真空下でＨＢＳＳ緩衝液４mlで洗浄した。32Ｐ標識ＲＮＡプールと非標識ＷＧＡを含有する反応混合物を、ＨＢＳＳ中で室温で１０分間インキュベートし、濾過し、次に直ちにＨＢＳＳ ４ｍｌで洗浄した。フィルターを空気乾燥し、フルロール無しでベックマン(Beckman)ＬＳ６５００液体シンチレーションカウンターで計測した。
ＷＧＡは分子量４３．２kDのホモダイマーであり、ダイマー当たり４つのＧｌｃＮＡｃ結合部位を有する。親和性の計算のために、モノマー１つ当たり１つのＲＮＡリガンド結合部位があると仮定する（ダイマー当たり２つ）。モノマー濃度は、ダイマー濃度の２倍であると規定する。１相性に結合するＲＮＡプールまたは特異的リガンドに対する平衡解離定数（Ｋd）は、以下の式で与えられる：
Ｋd＝［Ｐｆ］［Ｒｆ］／［ＲＰ］
ここで、［Ｒｆ］＝遊離ＲＮＡ濃度
［Ｐｆ］＝遊離ＷＧＡモノマー濃度
［ＲＰ］＝ＲＮＡ／ＷＧＡモノマー複合体の濃度
Ｋd＝解離定数、である。
平衡状態で結合したＲＮＡの画分を反応物の総濃度の関数として表すように、この式を並びかえて、１相性結合曲線のＫdを計算するために使用した：
ｑ＝（Ｐt＋ＲT＋Ｋd−（（ＰT＋ＲT＋Ｋd）2−４ＰTＲT）1/2）
ｑ＝結合したＲＮＡの画分
［ＰT］＝総ＷＧＡモノマー濃度
［ＲT］＝総ＲＮＡ濃度
Ｋdは、グラフィックスプログラムであるカレイダグラフ（Kaleidagraph）（シネジ・ソフトウェア（Synergy Software）、リーディング(Reading)、ペンシルバニア州）を用いて、データ点の最小二乗適合により求めた。
Ｅ）クローニングと配列決定
第６および第１１ラウンドのＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーとともに増幅した。これらの制限部位を用いて、ＤＮＡ配列をｐＵＣ１８ベクターに方向をそろえて挿入した。これらの組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９（ストラタジーン（Stratagene）、ラホイヤ（La Jolla）、カリホルニア州）に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアルカリ加水分解法（ゾウ（Zhou）ら，１９９０ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８：１７２−１７３）で調製し、約７２クローンをシーケナーゼプロトコール（ユナイテッドステーツバイオケミカル社(United States Biochemical Corporation)、クリーブランド、オハイオ州）を用いて配列決定した。配列を表２に示す。
Ｆ）競合的結合試験
ＲＮＡリガンドと（ＧｌｃＮＡｃ）3がＷＧＡ上の同じ部位に結合するかを調べるために、競合的結合実験を行った。３２Ｐ標識ＲＮＡリガンドと非標識ＷＧＡを含有する反応混合物のセット（それぞれ、一定の濃度（表５））をＨＢＳＳ中で室温で１５分間（ＧｌｃＮＡｃ）3とともにインキュベートした。次にＮ−アセチル反応混合物を２倍希釈系列の（ＧｌｃＮＡｃ）3とともに１５分間インキュベートした。最終（ＧｌｃＮＡｃ）3濃度は、７．８μＭ〜８．０μＭの範囲である（表５）。反応混合物を濾過し、処理し、上記「ニトロセルロースフィルター結合測定法」、段落Ｄで記載したように計測した。
添加した競合物質の総濃度［ＣT］の関数として遊離タンパク質の濃度［Ｐ］
を測定するために、以下の式により競合的力価測定実験を解析した：
０＝［Ｐ］（１＋ＫL［ＬT］／（１＋ＫL［Ｐ］）＋ＫC［ＣT］／（１＋ＫC［Ｐ］））−ＰT
ここで、ＬTは初期リガンドの濃度、ＫLは分子種Ｌのタンパク質に対する結合定数（１：１化学量論を仮定する）であり、ＫCは分子種Ｃのタンパク質に対する結合定数（１：１化学量論を仮定する）である。式１の解を直接得ることはできないため、１×１０−１５での精度で［Ｐ］の値を求めるために反復計算を行う。
［Ｐ］のこれらの値を用いて、［ＣT］の関数としてのタンパク質−リガンド複合体の濃度［ＰＬ］を以下の式により求めた：
［ＰＬ］＝ＫL［ＬT］［Ｐ］（１＋ＫL［Ｐ］）
実験データは％［ＰＬ］で表されるため、［ＰＬ］の計算された濃度を初期濃度［ＰＬ0］により標準化してから、競合物質を添加した。［ＰＬ0］は、使用した条件で標準的結合式の２次の解を用いて計算した。最大（Ｍ）および最小（Ｂ）％［ＰＬ］は、以下の式で示す解析の間浮動させた。
％［ＰＬ］＝［ＰＬ］／［ＰＬ0］* （Ｍ−Ｂ）＋Ｂ
ピー・アール・ベビントン（P.R．Bevington）（１９６９）、自然科学のデータ生理と誤差解析（Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences）（マグローヒル（McGraw-Hill）出版）に記載のように、非線形最小自乗適合法を使用した。使用したプログラムは、元々マトラブ（MatLab）のスタンレイ・ジェイ・ギル（Stanley J．Gill）により書かれ、スタンレイ・ジェイ・ギル（Stanley J．Gill）が競合解析のために修飾したものである。ＫLとＰTを固定して［ＣT］の関数としてＫC、ＭおよびＢの最も適合するパラメータを得るために、データを式１−３に適合させた。
Ｇ）ＷＧＡ凝集活性の阻害
凝集は、レクチンと細胞の相互作用により容易に観察される結果であり、Ｎ−アセチルレクチン分子が２つまたはそれ以上の細胞と架橋することが必要である。レクチン媒介凝集は、適切な特異性を有する糖により阻害される。ＷＧＡの血球凝集活性およびＲＮＡリガンドＧｌｃＮＡｃと（ＧｌｃＮＡｃ）3の阻害活性の視覚的測定は、ヒツジ赤血球を用いてファルコン（Falcon）丸底９６ウェルプレート中で行った。各ウェルには５４μｌの赤血球（２．５×１０８細胞／ｍｌ）と５４μｌの試験溶液を入れた。
ＷＧＡ凝集活性を測定するために、各試験溶液は４倍希釈系列からのＷＧＡ希釈物を含有した。最終ＷＧＡ濃度は、０．１pM〜０．５pMの範囲であった。阻害測定法のために、試験溶液は８０ｎＭのＷＧＡ（モノマー）と指定されたインヒビターの４倍希釈系列物を含有した。反応混合物を室温で２時間インキュベートし、次に赤血球の沈降パターンに変化は観察されなかった。これらの実験は、ゼラチンベロナール緩衝液（０．１５ｍＭ ＣａＣｌ2、１４１ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％ゼラチン、１．８ｍＭ バルビタールナトリウム、および３．１ｍＭ バルビタール酸、ｐＨ７．３〜７．４；シグマ（Sigma）＃Ｇ−６５１４）中で行った。
凝集のない場合赤血球は、小さなペレットとして沈降する。凝集した細胞は、より分散したペレットを形成する。従って、視覚試験において、ペレットの直径により凝集が判定される。阻害実験は、凝集の陽性対照と陰性対照と、インヒビター自身は正常な沈降パターンを変化させないことを示すための適切な対照を含有する。
例２
ＷＧＡに対するＲＮＡリガンド
Ａ．セレックス
セレックスの出発ＲＮＡライブラリーであるランダム化された５０Ｎ９（配列番号１）は、約２×１０１５分子（２nmolのＲＮＡ）を含有した。セレックスプロトコールは表１に概説する。ＷＧＡへのランダム化されたＲＮＡの結合は、３６μＭ ＷＧＡモノマーでは検出されない。この相互作用の解離定数は、＞４ｍＭであると推定される。
（ＧｌｃＮＡｃ）3により溶出される投入ＲＮＡのパーセントは、第１ラウンドの０．０５％から第５ラウンドの２８．５％まで上昇した（表１）。第５ラウンドのＲＮＡのバルクＫdは６００ｎＭであった（表１）。特異的に溶出されたＲＮＡのさらなる増加は、ラウンド６ａ（表１）では観察されず、選択の厳密性を増加させるために２つの修飾を加えてラウンド６を繰り返した：ゲルの容量、従ってＷＧＡの質量を１０倍低下させ；そしてＲＮＡを、増加する濃度の（ＧｌｃＮＡｃ）3で特異的に段階的に溶出し、最後に溶出したＲＮＡのみを以後のラウンドに使用した。特異的に溶出したＲＮＡのパーセントは、ラウンド６ｂの５．７％からラウンド８の２１．４％に増加し、バルクＫdは継続して改良された（２６０μＭ、ラウンド８のＲＮＡ、表１）。
ラウンド９から１１について、ＷＧＡをさらに１０倍減少させて厳密性をさらに上昇させた。ラウンド１１のＫdは６８ｎＭであった。バルクの出発ＲＮＡプールとラウンド６と１１のＲＮＡの配列決定は、ラウンド６の可変領域の一部の非ランダム性とラウンド１１の増加した非ランダム性を明らかにした。
セレックスの進行を追跡するために、リガンドをクローン化し、ラウンド６ｂとラウンド１１から配列決定した。２つの各ラウンドから、３６個のランダムに採取するクローンを配列決定した。配列を用手法で整列させた。これを表２に示す。
Ｂ．ＲＮＡ合成
第６および第１１ラウンドから、それぞれ２９のうちの２７と３５のうちの２１の配列決定されたリガンドはユニークであった。リガンドの名前の「．」の前の数は、それがラウンド６またはラウンド１１プールからクローン化されたかどうかを示す。全クローンのうちの一部のみを表２に示す（配列番号４〜５５）。進化した全ランダム領域は、大文字で示す。固定領域の任意の部分は小文字で示す。特に明記していない場合は、各クローンは定義により進化した配列と関連する固定配列の両方を含有する。ユニークな配列とは、他のすべてのものから３つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なるものであると、機能的に定義される。表２において、リガンド配列は標準的１文字コードで示す（コーニッシュ−ボウデン（Cornish-Bowden），１９８５ ＮＡＲ １３：３０２１−３０３０）。２回以上単離された配列は、括弧付きの数字（ｎ）で示し、その後にリガンド単離数を示す。これらのクローンは９つの配列ファミリー（１〜９）と無関係の配列（オーファン）に分類される。
ラウンド６からラウンド１１までのファミリーの分布は、選択的圧力の増加に応答してリガンドファミリーが出現および消失することを明確に例示する（表２）。ラウンド６に多い（１１／２９リガンド）ファミリー３は、ラウンド１１までにほとんど消失している（２／２５）。同様に小さなファミリー６からファミリー９までは実質的に消失する。これに対して、ラウンド１１の主要なファミリー（１、２、４、および５）のうちの１つのみ（ファミリー１）がラウンド６で検出された。ファミリーの出現および消失は、その結合親和性にほぼ相関する。
整列（表２）は、ファミリー１〜４と６〜９のコンセンサス配列を規定する（配列番号５６〜６３）。ファミリー１〜３のコンセンサス配列は長く（それぞれ、２０、１６および１６）、保存性が非常に高い。ファミリー１と２のコンセンサス配列は共通の２つの配列を含有する（トリヌクレオチドＴＣＧとペンタヌクレオチドＡＣＧＡＡ）。関連するテトラヌクレオチド、ＡＡＣＧ、はファミリー３に存在する。可変領域内のコンセンサス配列の位置の変化は、リガンドは、５’または３’領域の特異的配列を必要としないことを示す。
ファミリー１と２のコンセンサス配列は、５またはそれ以上の長さのヌクレオチドの相補的配列が隣接している。これらの相補的配列は保存されておらず、大部分はわずかな不連続性を有する。ファミリー３もまた、隣接相補的配列を示すが、これらは長さと構造が変化し、保存された配列の２つのヌクレオチド対を利用する。
ファミリー４のコンセンサス配列（表２）において信頼性は、少数のリガンド、スペースの変化および高いＧ含量により限定される。ペンタヌクレオチドであるＲＣＴＧＧもまた、ファミリー５と８の中に存在する。ファミリー５のリガンドは、ファミリー４のリガンド（特にリガンド１１．２８）に対して他の配列類似性を示す。
Ｃ．親和性
ファミリー１〜９の代表的メンバーとオーファンリガンドの解離定数は、ニトロセルロースフィルター結合実験により測定し、これを表３に記載する。これらの計算では、１つのＷＧＡモノマーに対して１つのＲＮＡリガンド結合部位があると仮定する。試験した最も高いＷＧＡ濃度（３６μＭ ＷＧＡモノマー）ではランダムＲＮＡの結合は観察されず、タンパク質濃度よりＫｄが少なくとも１００倍高い（すなわち、４ｍＭ）ことを示している。
表３のデータは、リガンド結合のいくつかの特性を示す。第１に、ＷＧＡに対するＲＮＡリガンドは、１相性に結合する。第２に、測定された解離定数の範囲は１．４ｎＭ〜８４０ｎＭである。第３に多くのリガンドの結合（そのほとんどは第６ラウンドの単離体である）は、試験した最も高いＷＧＡ濃度でも５％未満であった。これらのリガンドの解離定数は、２０μＭより大きいと推定される。第４に、平均して第１１ラウンドの単離体は、第６ラウンドのものより大きい親和性を有する。第５に、セレックスはおそらく、完了しておらず、最適のリガンド（１１．２０）（配列番号４０）は主要な分子種ではない。セレックスはラウンド１１で任意に停止させたため、１１．２０が最終的に最適なものであるかどうかは明らかではない。第６に、予測されたようにセレックスは完了しておらず、モノオリゴヌクレオチドやオリゴ糖よりはるかに大きい親和性でＷＧＡに結合する（ＲＮＡリガンドが単離された（すなわち、１１．２０の親和性は５×１０５で、ＧｌｃＮＡｃのＫd＝７６０μＭより高く、および（ＧｌｃＮＡｃ）3のＫd＝１２μＭより８５０良い；ワイ・ナガタとエム・バーガー（Y．Nagata and M．Burger），１９７４，前述）。この観察結果は、競合的溶出により、競合する糖より数オーダー大きい親和性を有するオリゴヌクレオチドリガンドが単離されるという説を確認している。
さらにこれらのデータは、標的密度の高い条件下（ビーズ１μｌ当たり１１６pmolのＷＧＡダイマー）でも、結合活性（avidity）の問題を克服し、nmolの親和性を有するリガンドを回収することができる。６ラウンドから１１ラウンドにおいて（表２）、バルクＫｄの改良により示される（表１）ように選択的圧力の増加に応答して、平均より弱い親和性を有する配列ファミリー（表３）はプールから排除される。
例３
ＷＧＡに対するＲＮＡリガンドの特異性
ウレックス・ヨーロパエウス（Ulex europaeus）、ダツラ・ストラモニウム（Datura stramonium）およびカナバリア・エンシホルミス（Canavalia ensiformis）からのＧｌｃＮＡｃ結合レクチンに対するＷＧＡリガンド６．８、１１．２０、および１１．２４（配列番号１３、４０、および１９）の親和性が、ニトロセルロース分離により測定される。測定結果を表４に示す。これらのリガンドはＷＧＡに対する特異性が高い。例えば、ＷＧＡに対するリガンド１１．２０の親和性は、ウレックス・ヨーロパエウス（U．europaeus）、ダツラ・ストラモニウム（D．stramonium）およびカナバリア・エンシホルミス（C．ensiformis）のレクチンに対する親和性より１，５００、８，０００および＞１５，０００倍大きい。トリチクム・ブルガレ（T．vulgare）とダツラ・ストラモニウム（Datura stramonium）が示すリガンドに対する親和性の８，０００倍の差は、それらのＧｌｃＮＡｃのオリゴマーに対する親和性の３〜１０倍の差に匹敵し、競合的溶出により、モノマー性および競合する糖よりはるかに大きい親和性を有するオリゴヌクレオチドリガンドが選択されるという説を確認している（ジェイ・エフ・クロウレイ（J.F．Crowley）ら，１９８４，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２３１：５２４−５３３；ワイ・ナガタとエム・バーガー（Y．Nagata and M．Burger），１９７４，前述；ジェイ−ピー；プリバト（J-P．Privat）ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４６：２２９−２３２）。
例４
競合的結合試験
ＲＮＡリガンドと炭水化物が共通の部位に結合するなら、ＲＮＡリガンドの結合は炭水化物により競合的に阻害されると予測される。さらにもしオリゴヌクレオチドリガンドが炭水化物結合部位にのみ結合するなら、阻害は、高濃度の炭水化物で完了することが予測される。表５に報告する実験において、２倍希釈系列の非標識（ＧｌｃＮＡｃ）3を、ＷＧＡとα−３２Ｐ標識ＲＮＡリガンドを含有する３セットの結合反応物（６．８、１１．２０、または１１、２４（配列番号１３、４０、１９）；［ＲＮＡ］最終＝［ＷＧＡ］最終＝１５ｎＭ）に加えた。室温で１５分間インキュベート後、反応物を濾過し、標準的結合実験で処理した。
定性的には、高（ＧｌｃＮＡｃ）3濃度で阻害が完了するため、ＲＮＡリガンドは（ＧｌｃＮＡｃ）3が結合する部位にのみ結合することが明らかである（表５）。これらのデータは、（ＧｌｃＮＡｃ）3が、これらのＲＮＡリガンドにより結合されない１つまたはそれ以上の部位に結合する可能性を否定しない。
定量的には、これらのデータは、競合的阻害の単純なモデル（表５）に一致し、（ＧｌｃＮＡｃ）3に対するＫｄの推定値８．４、１０、９、および１９．４μＭを与える。これらの推定値は、文献値とよく一致している（１２μＭ＠４Ｃ、ナガタとバーガー（Y．Nagata and M．Burger），１９７４，前述；１１μＭ＠１０．８Ｃ、バン・ランドシュート（Van Landschoot）ら，１９７７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：２７５−２８３；５０μＭ、エム・モンシグニー（M．Monsigny）ら，１９７９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８：３９−４５）。これらのデータは、特異的炭水化物による競合的溶出は、レクチンの炭水化物結合部位を標的にしているという説を確認している。
例５
ＷＧＡ凝集活性の阻害
０．５μＭでＲＮＡリガンド６．８と１１．２０（配列番号１３と４０）は、ＷＧＡ媒介ヒツジ赤血球凝集を完全に阻害する（表６）。リガンド１１．２４（配列番号１９）はそれほど有効ではなく、試験した最も高い濃度である２μＭで部分的阻害を示すのみである（表６）。（ＧｌｃＮＡｃ）3とＧｌｃＮＡｃは、高濃度（それぞれ、８μＭと８００μＭ）で凝集を完全に阻害する（表６、モンシグニー（Monsigny）ら，１９７９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．前述）。この凝集の阻害は、本法により単離されるリガンドは、レクチン機能のアンタゴニストになるという説を確認している。凝集は複数の炭水化物結合部位の関数であるため、阻害はまた、２つ以上オスモル濃度ＲＮＡリガンドが１つのＷＧＡプライマーに結合していることを示唆する。
凝集の阻害の別の解釈は、電荷の反発により、陰性荷電したＷＧＡ／ＲＮＡ複合体が、陰性荷電した細胞表面上の炭水化物（凝集に必要な条件）への結合を妨害するというものである。この説明は、２つの理由により考えにくい。まず第１に、固定化され精製されたタンパク質に対して選択された陰性荷電したオリゴヌクレオチドリガンドは、細胞表面に提示されるとタンパク質に結合することが知られている（例えば、例１０、Ｌ−セレクチン細胞結合を参照）。第２に、陰性荷電したスクシニル化ＷＧＡは、赤血球を凝集させるのに未変性の、ＷＧＡ（ｐＩ＝８．５）と同様に有効である（エム・モンシグニー（M．Monsigny）ら，１９７９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．前述）。
例６
高親和性ＷＧＡリガンドの２次構造
好適な例において、整列した配列の比較解析は、２次構造と構造−機能相関関係の推定を可能にする。配列中の２つの位置のヌクレオチドがワトソン−クリック塩基対合規則に従って共変動するなら、これらの位置のヌクレオチド配列は対合し易い。非保存配列、特に長さが変化するものは、機能に直接関係しにくく、高度に保存された配列は、直接関係し易い。
それぞれファミリー１と２の比較解析は、大きい高度に保存されたループ（図１ａと１ｂ）を有するヘアピン構造を与える。ループヌクレオチドの間の相互作用が発生し易いが、これはこれらのデータでは規定されない。各リガンドのステムは、配列、長さおよび構造が変化する（すなわち、種々のバルジ（bulge）や内部ループが可能である；表２）。定性的には、ステムはワトソン−クリック共変動により確認されること、そして比較解析の規則によりステムはＷＧＡの結合に直接関係していないことは、明らかである。ファミリー３は、同様にヘアピンを形成することができ、ここでは２対の保存ヌクレオチドがステムに使用される（図１ｃ）．
配列ファミリーを相同的な構造に折り畳むことは不可能であり、単一のファミリーに割り当てることは問題がある。リガンド１１．７（ファミリー４の主要なメンバー）とリガンド１１．２８の両方とも、２つの平面のＧ−カルテットに折り畳むことができる。しかし、その割り当ては推定されている：１）１１．２８は、５つのＧＧジヌクレオチドと１つのＧＧＧＧテトラヌクレオチドを含有し、他のＧ−カルテットを可能にする；そして２）リガンド１１．２と１１．３３はＧ−カルテットを形成することができない。一方、すべてのリガンドは、ループ内の保存配列ＧＡＧＲＦＴＮＣＲＴとヘアピンを形成することができる。しかし、保存配列ＲＣＴＧＧＣ（表２）はこれらのヘアピンにおいて一貫した役割を持たない。
ファミリー５については複数Ｇ−カルテット構造が可能である。これらの１つは、リガンド１１．７Ｇ−カルテットに似ている。リガンド１１．２０については、納得できるヘアピン構造は不可能である。
例７
ヒトＬ−セレクチンに対する２’−ＮＨ 2 ＲＮＡリガンド
この例に概説する実験方法は、例８〜１２のヒトＬ−セレクチンに対する２’−ＮＨ2ＲＮＡリガンドを同定し性状解析するのに使用される。
実験方法
Ａ）材料
ＬＳ−Ｒｇはキメラタンパク質であり、ヒトＬ−セレクチンの細胞外ドメインがヒトＧ２免疫グロブリンのＦｃドメインに結合している（ナガード（Norgard）ら，１９９３，ＰＮＡＳ：１０６８−１０７２）。ＥＳ−Ｒｇ、ＰＳ−ＲｇおよびＣＤ２２β−Ｒｇは、ヒトＧ１免疫グロブリンＦｃドメインに結合したＥ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＣＤ２２βの同族作製体である（アール・エム・ネルソン（R.M．Nelson）ら，１９９３，前述；アイ・スタメンコビック（I．Stamenkovic）ら，１９９１，Ｃｅｌｌ ６６：１１３３−１１４４）。精製されたキメラは、エー・バルキ（A．Varki）により提供された。可溶性Ｐ−セレクチンはアールアンドディーシステムズ（R & D Systems）から購入した。プロテインＡセファロース４ファストフロウビーズは、ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech）から購入した。抗Ｌ−セレクチンモノクローナル抗体：ＳＫ１１はベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）（サンホセ、カリホルニア州）から得た；ＤＲＥＧ−５６（Ｌ−セレクチン特異的モノクローナル抗体）は、エンドゲン（Endogen）（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から購入した。２’−ＮＨ２修飾ＣＴＰとＵＴＰは、ピエケン（Peken）らの方法（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４−３１７）に従って調製した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドはオペロン（Operon）により合成された。他のすべての試薬および化学物質は、市販品を購入した。特に明記していない場合は、実験ではＨＳＭＣ緩衝液（１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ヘペス（ｐＨ７．４）を使用した。
Ｂ）セレックス
セレックス法は、米国特許第５，２７０，１６３号などに詳細に記載されている。ＬＳ−Ｒｇセレックスの合成ＤＮＡ鋳型のヌクレオチド配列は、４０個の位置でランダム化された。この可変領域は、Ｎ７ ５’および３’固定領域が隣接する（４０Ｎ７）。４０Ｎ７転写体は、配列 5'gggaggacgaugcgg-40N-cagacgacucgcccga 3'（配列番号６４）を有する。すべてのＣとＵは、リボースの２’−ＯＨと置換された２’−ＮＨ2を有する。ＰＣＲのプライマーは、以下のものである：
Ｎ７ ５’プライマー 5'taatacgactcactatagggaggacgatgcgg 3’（配列番号６５）
Ｎ７ ３’プライマー5'tcgggcgagtcgtcctg 3'（配列番号３）。
固定領域は、ＰＣＲとｃＤＮＡ合成のためのプライマーアニーリング部位ならびにコンセンサスＴ７プロモーターを含有し、インビトロ転写を可能にする。初期ＲＮＡプールは、まず１nmolの合成１本鎖ＤＮＡをクレノウで伸長して、次に得られる２本鎖分子をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで転写させた。クレノウ伸長条件は：反応容量１ｍｌ中３．５nmolのプライマー５Ｎ７、１．４nmolの４０Ｎ７、１×クレノウ緩衝液、０．４ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰである。
以後のラウンドにおいて、溶出したＲＮＡは、１本鎖ｃＤＮＡのＡＭＶ逆転写酵素媒介合成の鋳型であった。これらの１本鎖ＤＮＡ分子は、ＰＣＲ増幅により２本鎖転写鋳型に変換した。ＰＣＲ条件は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、および２５Ｕ／ｍｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼであった。転写反応物は、０．５ｍＭ ＤＮＡ鋳型、２００ｎＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、８０ｍＭ ヘペス（ｐＨ８．０）、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ スペルミジン、２ｍＭずつの２’−ＯＨ ＡＴＰ、２’−ＯＨ ＧＴＰ、２’−ＮＨ2 ＣＴＰ、および２’−ＮＨ2ＵＴＰ、および２５０ｎＭ α−３２Ｐ ２’−ＯＨ ＡＴＰを含有した。
ＬＳ−Ｒｇ／ＲＮＡ複合体を非結合ＲＮＡから分離する方策は、表７ａと表７ｂに概説される。まず、プロテインＡセファロースビーズに固定化されたＬＳ−ＲｇとともにＲＮＡプールをＨＳＭＣ緩衝液中でインキュベートする。第２に、充分に洗浄して非結合ＲＮＡを除去する。第３に、炭水化物結合部位に結合したＲＮＡ分子を、洗浄したビーズを、２価陽イオンの代わりに５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＨＭＳＣ緩衝液中でインキュベートして特異的に溶出する。５ｍＭで溶出した後、非特異的５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶出を行う。ＬＳ−Ｒｇを、製造業者（ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech））の説明書に従ってプロテインＡセファロースベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）に結合させた。
高濃度の（ＧｌｃＮＡｃ）3を含有する緩衝液中でインキュベートして炭水化物結合部位に結合したＲＮＡ分子を特異的に溶出することである。セレックスプロトコールは表１に示す。
５ｍＭ ＥＤＴＡ溶出は、特異的部位溶出法の変法である。これは炭水化物競合による溶出ほど特異的ではないが、Ｃ型（カルシウム依存性結合）レクチンの一般的な方法であり、（シアリル−ルイスXの場合のように）必要な炭水化物のコストおよび／または濃度が妥当でない場合は、実際的な方法である。低ＥＤＴＡ濃度は緩衝液のイオン強度を大きく上昇させず、結合カルシウムの非存在下でＣ型レクチンのコンフォメーションはほんのわずかに変化するのみなので（ケー・ドリカマー（K．Drickamer），１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２１：４５６−４５９により観察された未公表の結果）、この方法は、レクチンの結合Ｃａ++と結合を形成するリガンドに対して非常に特異的であると考えられる。
４℃で行った初期のセレックスラウンドでは、固定化ＬＳ−Ｒｇの密度は１６．７pmol／μｌプロテインＡセファロース４ファストフロウビーズ（Protien A Sepharose 4 Fast Flow beads）であった。後期のラウンドでは、選択の厳密性を増加させるため、ＬＳ−Ｒｇの密度は必要に応じて減少させた（表７ａと７ｂ）．第７ラウンドで、セレックスを分岐させ、４℃（表７ａ）と室温（表７ｂ）で平衡して行った。洗浄と溶出緩衝液は、関連するインキュベート温度に平衡化させた。第５ラウンドから開始して、しばしばセレックスを２つ以上のＬＳ−Ｒｇ密度で行った。
各ラウンドの前に、ＲＮＡを２ｍｌのシリコーン化カラム中で１００μｌのプロテインＡセファロースビーズに１時間バッチ吸着させた。非結合ＲＮＡと最小の洗浄（２倍量）で溶出したＲＮＡを合わせて、セレックス投入材料として使用した。セレックスのために、充分洗浄し、固定化したＬＳ−Ｒｇを前吸着したＲＮＡと１〜２時間、２ｍｌのシリコーン化カラム中で絶えず振盪しながらバッチインキュベートした。非結合ＲＮＡは、充分にバッチ洗浄して除去した（２００〜５００μｌ ＨＳＭＣ／洗浄）。結合ＲＮＡは２つの画分として溶出した。まず、結合ＲＮＡを２価陽イオンのないＨＳＭＣ中の５ｍＭ ＥＤＴＡでインキュベートおよびカラムを洗浄した。第２に、残存する溶出可能なＲＮＡを、２価イオンのないＨＳＭＣ中の５０ｍＭ ＥＤＴＡでインキュベートおよび／または洗浄して除去した。溶出した投入ＲＮＡを表７ａと７ｂに記録した。すべてのラウンドで、ＬＳ−Ｒｇのない等量のプロテインＡセファロースビーズを、セレックスビーズと同様に処理して、バックグランド結合を測定した。非吸着、洗浄および溶出画分をベックマン（Beckman）ＬＳ６５００シンチレーションカウンター中で計測して、各ラウンドのセレックスを追跡した。
溶出した画分は以下のラウンドで使用するために処理した（表７ａと７ｂ）。フェノール／クロロホルムで抽出しイソプロパノール／エタノール（１：１、ｖ／ｖ）で沈殿させ、ＲＮＡをＡＭＶ逆転写酵素により、１）４８℃で１５分間および次に６５℃で１５分間、または２）３７℃と４８℃で１５分間ずつ、５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）2、１０ｍＭ ＤＴＴ、１００pmol ＤＮＡプライマー、０．４ｍＭずつのｄＮＴＰ、０．４Ｕ／μｌ ＡＭＶ ＲＴ中で、ｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ産物の転写体を次のセレックスを開始するために使用した。
Ｃ）ニトロセルロースフィルター結合測定法
セレックス特許出願に記載されているように、ニトロセルロースフィルター分離法を使用して、ＬＳ−Ｒｇおよび他のタンパク質に対するＲＮＡリガンドの親和性を測定した。フィルターディスク（ニトロセルロース／酢酸セルロース混合マトリックス、孔径０．４５μＭ、ミリポア（Millipore））を、真空マニホールド上に置き、真空下でＨＳＭＣ緩衝液２ｍｌで洗浄した。３２Ｐ標識ＲＮＡプールと非標識ＬＳ−Ｒｇを含有する反応混合物を、ＨＳＭＣ中で４℃、室温または３７℃で１０〜２０分間インキュベートし、濾過し、次に直ちに同じ温度でＨＳＭＣ ４ｍｌで洗浄した。フィルターを空気乾燥し、フルロール無しでベックマン（Beckman）ＬＳ６５００液体シンチレーションカウンターで計測した。
ＬＳ−Ｒｇは、ヒトＬ−セレクチンの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列をヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域をコードするＤＮＡに融合させて作製される組換え遺伝子の発現産物であるダイマータンパク質である。親和性の計算のために、ＬＳ−Ｒｇモノマー１つ当たり１つのＲＮＡリガンド結合部位があると仮定する（ダイマー当たり２つ）。モノマー濃度は、ＬＳ−Ｒｇダイマー濃度の２倍であると規定する。１相性に結合するＲＮＡプールまたは特異的リガンドに対する平衡解離定数（Ｋd）は、以下の式で与えられる：
Ｋｄ＝［Ｐｆ］［Ｒｆ］／［ＲＰ］
ここで、［Ｒｆ］＝遊離ＲＮＡ濃度
［Ｐｆ］＝遊離ＬＳ−Ｒｇモノマー濃度
［ＲＰ］＝ＲＮＡ／ＬＳ−Ｒｇモノマー複合体の濃度
Ｋd＝解離定数、である。
平衡状態で結合したＲＮＡの画分を反応物の総濃度の関数として表すように、この式を並びかえて、１相性結合曲線のＫdを計算するために使用した：
ｑ＝（Ｐt＋ＲT＋Ｋd−（（ＰT＋ＲT＋Ｋd）2−４ＰTＲT）１／２）
ｑ＝結合したＲＮＡの画分
［ＰＴ］＝２×（総ＬＳ−Ｒｇ濃度）
［ＲT］＝総ＲＮＡ濃度
多くのリガンドおよび進化したＲＮＡプールは、２相性結合曲線を与えた。２相性結合は、平衡状態ではない２つの親和性分子種の結合として説明される。２相性結合データは、以下の式から計算した
ｑ＝２Ｐt＋Ｒt＋Ｋd1＋Ｋd2−［（Ｐt＋Ｘ1Ｒ1＋Ｋd1）2−４ＰtＸ1Ｒt］１／２−［（Ｐt＋Ｘ2＋Ｒt＋Ｋd2）2−４ＰtＸ2Ｒt］１／２
ここで、Ｘ1とＸ2は親和性分子種Ｒ1とＲ2のモル分率であり、Ｋd1とＫd2は、対応する解離定数である。Ｋdは、グラフィックスプログラムであるカレイダグラフ（Kaleidagraph）（シネジ・ソフトウェア（Synergy Software）、リーディング（Reading）、ペンシルバニア州）を用いて、データ点の最小二乗適合により求めた。
Ｄ）クローニングと配列決定
第６、第１３（室温）および第１４ラウンド（４℃）のＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄIII 制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーとともに再増幅した。これらの制限部位を用いて、ＤＮＡ配列をｐＵＣ１８ベクターに方向をそろえて挿入した。これらの組換えプラスミドを大腸菌ＤＨ５α（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアルカリ加水分解法（ＰＥＲＦＥＣＴｐｒｅｐ、５’−３’、ボールダー（Boulder）、コロラド州）で調製した。約１５０クローンをシーケナーゼプロトコール（アマシャム（Amersham）、アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）を用いて配列決定した。配列を表８に示す。
Ｅ）細胞結合試験
進化したリガンドプールおよびクローン化リガンドが、細胞表面に提示されているＬ−セレクチンに結合する能力は、単離したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いる実験で試験した。健常志願者から採取した全血を５ｍＭ ＥＤＴＡで抗凝固処理した。血液６ｍｌを、１５ｍｌのポリエチレン試験管中の６ｍｌのヒストペーク（Histopaque）勾配に重層し、室温で３０分間遠心分離（７００ｇ）した。単核細胞層を集め、１０ｍｌのＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まないＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ（−）；ギブコ（Gibco）１４１９０−０２９）で希釈し、室温で１０分間遠心分離（２２５ｇ）した。２つの勾配からの細胞ペレットを合わせ、１０ｍｌのＤＰＢＳ（−）に再懸濁し、上記のように遠心分離した。これらのペレットを、１％ＢＳＡを補足したＳＭＨＣＫ緩衝液１００μｌに再懸濁した。細胞を血球計算計で計測し、ＳＭＨＣＫ／１％ＢＳＡで２×１０７細胞／ｍｌに希釈し、直ちに結合測定物に加えた。細胞生存活性を、トリパンブルー排除により追跡した。
細胞結合測定法では、一定数の細胞を増加する濃度の放射能標識リガンドで力価測定した。使用の約１０分間前に、試験リガンドをＤＰＢＳ（−）／１％ＢＳＡで最終濃度の２倍まで連続的に２倍希釈した。等量（２５μｌ）の各リガンド希釈物と細胞懸濁液（２×１０7細胞／ｍｌ）を０．６５ｍｌのエッペンドルフ試験管に加え、静かにボルテックスし、氷上で３０分間インキュベートした。１５分目に、試験管を再度ボルテックスした。リガンド／ＰＢＭＣ懸濁液を５０μｌの氷冷フタル酸油（１：１＝ジノニル：フタル酸ジブチル）に重層し、４℃で５分間微量遠心分離した。試験管をドライアイス／エタノールで凍結し、目に見えるペレットを切り離してシンチレーションバイアルに入れ、ベックマン(Beckman)ＬＳ６５００シンチレーションカウンターで例７段落Ｃに記載のように計測した。
Ｌ−セレクチン特異的阻止モノクローナル抗体であるＤＲＥＧ−５６との競合によりＰＢＭＣへの結合の特異性を試験し、結合の飽和性は非標識ＲＮＡとの競合により試験した。実験操作と条件はＰＢＭＣ結合実験と同様であったが、放射能標識ＲＮＡリガンド（最終濃度５ｎＭ）は、ＰＢＭＣと混合する前に連続希釈した競合物質に加えた。
Ｆ）シアリル−ルイスＸへのセレクチン結合の阻害
進化したＲＮＡプールまたはクローン化リガンドが、ＬＳ−Ｒｇのシアリル−ルイスXへの結合を阻害する能力を、競合ＥＬＩＳＡ測定法により試験した（シー・フォックサル（C．Foxall）ら，１９９２，前述）。これらの測定のために、コーニング（Corning）（２５８０１）９６マイクロタイタープレートのウェルを１００ngのシアリル−ルイスX／ＢＳＡ結合体でコーティングし、一晩空気乾燥し、３００μｌのＰＢＳ（−）で洗浄し、次にＳＨＭＡＣＫ中の１％ＢＳＡで室温で６０分間阻止した。ＲＮＡリガンドをＳＨＭＡＣＫ／１％ＢＳＡ中のＬＳ−Ｒｇと室温で１５分間インキュベートした。阻止溶液の除去後、５０μｌのＬＳ−Ｒｇ（１０ｎＭ）またはＬＳ−Ｒｇ（１０ｎＭ）／ＲＮＡリガンドミックスを、コーティングし阻止したウェルに加え、室温で６０分間インキュベートした。結合溶液を除去し、ウェルを３００μｌのＰＢＳ（−）で洗浄し、次にＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧと室温でプローブ結合させ、ＬＳ−Ｒｇ結合を定量した。ＯＰＤペルオキシダーゼ基質（シグマ（Sigma）Ｐ９１８７）と室温で暗所で３０分間インキュベート後、ＬＳ−Ｒｇ結合の程度と阻害パーセントをＯＤ450から求めた。
例８
ヒトＬ−セレクチンに対する２’−ＮＨ 2 ＲＮＡリガンド
Ａ．セレックス
セレックスの出発ＲＮＡプールであるランダム化された４０Ｎ７（配列番号６３）は、約１０１５分子（１nmolのＲＮＡ）を含有した。セレックスプロトコールは表７ａと７ｂおよび例７に概説する。ＬＳ−Ｒｇに対するランダム化されたＲＮＡの解離定数は、約１０μＭであると推定される。ラウンド１と２についてセレックスとバックグランドビーズからの５ｍＭ ＥＤＴＡによるＲＮＡ溶出プロフィールに差は観察されず、一方５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶出は、バックグランドより２〜３倍過剰に産生した（表７ａ）。ラウンド１と２からの５０ｍＭ溶出したＲＮＡを、それぞれラウンド２と３の投入材料のために増幅した。ラウンド３から開始して、セレックスビーズからの５ｍＭ溶出はバックグランドより有意に高く、次のラウンドの投入ＲＮＡのために処理した。５ｍＭ ＥＤＴＡにより溶出される投入ＲＮＡのパーセントは、最初のラウンドの０．５％からラウンド５の８．４％まで増加した（表７ａ）。１０μｌ ＬＳ−Ｒｇビーズから特異的に溶出したＲＮＡのさらなる増加は、ラウンド６で観察されなかった（表７ａ）。選択の厳密性を上昇させるために、ラウンド５で固定化ＬＳ−Ｒｇの密度を１０倍低下させ、後のラウンドでタンパク質密度をさらに低下させた。選択されたプールの親和性は急速に上昇し、プールは徐々に２相性結合特性を進化させた。
第６ラウンドＲＮＡを用いる結合実験は、Ｌ−セレクチンの進化プールの親和性は温度感受性であることを明らかにした。第７ラウンドで、セレックスを分岐させ、１つは４℃（表７ａ）で継続しもう１つは室温（表７ｂ）で行った。第６、１３（室温）、および１４（４℃）ＲＮＡプールのバルク配列決定は、ラウンド６で検出可能な非ランダム性と後のラウンドで劇的な非ランダム性を明らかにした。第６ラウンドＲＮＡは、４℃で約４０ｎＭの解離定数で１相性に結合し、第１３および１４ラウンドＲＮＡは、約７００pMの高親和性Ｋｄで２相性に結合した。高親和性で結合した２つのプールのモル分率は、それぞれ２４％と６５％であった。２価陽イオンの非存在下では、第１３および１４ラウンドのＫｄは、それぞれ４５ｎＭと４８０ｎＭに増加した（ＨＳＭＣ、マイナスＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋、プラス２ｍＭ ＥＤＴＡ）。
セレックスの進行を追跡するために、リガンドをクローン化し、ラウンド６、１３（室温）および１４（４℃）から配列決定した。配列を用手法で、しばしば存在する局所的整列からコンセンサス配列を決定するコンピュータープログラムを用いて整列させた。
Ｂ．配列
表８において、リガンド配列を標準的１文字コードで示す（コーニッシュ−ボウデン（Cornish-Bowden），１９８５ ＮＡＲ １３：３０２１−３０３０）。リガンドの名前の「．」の前の文字／数の組合せは、それがラウンド６またはラウンド１３または１４プールからクローン化されたかを示す。進化したランダム領域のみを表８に示す。固定領域の任意の部分は小文字で示す。特に明記していない場合は、各クローンは定義により進化した配列と関連する固定配列の両方を含有する。第６、１３、および１４ラウンドからの、それぞれ４８のうちの２６、２４のうちの８および７０のうちの９の配列リガンドはユニークであった。ユニークな配列とは、他のすべてのものから３つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なるものであると、機能的に定義される。２回以上単離された配列は、括弧付きの数字（ｎ）で示し、その後にリガンド単離数を示す。これらのクローンは１３の配列ファミリー（Ｉ〜XIII）と、無関係の配列（オーファン）の群に分類される（配列番号６７〜１１７）。
２つのファミリー（ＩとIII）は、複数の系統からのリガンドにより定義される。両方のファミリーはしばしばラウンド６に存在するが、最後のラウンドではファミリーIII リガンドのみが同定された。６つのファミリー（IV、V、VI、VII、VIII、およびおそらくII）は、コンセンサス配列の信頼を制限するちょうど２つの系統によりそれぞれ規定される。５つのファミリー（IXからXIII）は、コンセンサス配列の決定を前提にする単一の系統により規定される。
ファミリーIIからのリガンドは、最終ラウンドのほとんどを占める：６０／７０リガンドはラウンド１４にあり、９／２４はラウンド１３にある。ファミリーIIは、単一の配列の３つの突然変異性変化により示される。単一の系統の回復の１つの説明は、リガンドの情報含量は極端に高く、従って出発プール中のユニークな分子種により表された。ファミリーIIリガンドは第６ラウンドでは検出されず、これは初期集団中の提供頻度に一致する。別の説明はサンプリング誤差である。第６ラウンドで問題のある関係の配列が検出された。
最もよく規定されるコンセンサス配列は、表８に示すようにファミリーＩのもの、ＡＵＧＵＧＵＡ（配列番号１１８）、およびファミリーIII のもの、ＡＡＣＡＵＧＡＡＧＵＡ（配列番号１２０）である。ファミリーIII は、２つの追加の種々にスペースのある配列（ＡＧＵＣとＡＲＵＵＡＧ）（これは保存されているかも知れない）を有する。テトラヌクレオチドＡＵＧＷは、ファミリーＩ、III、およびVII のコンセンサス配列中、およびファミリーII、VIIIおよびIX中に存在する。この配列が重要であるなら、これはファミリーVIIIのリガンドの保存された配列は順番に入れ替わっていることを示唆する。配列ＡＧＡＡは、ファミリーIVおよびVIのコンセンサス配列中およびファミリーＸとXIII中に存在する。
Ｃ．親和性
すべてのオーファンを含むラウンド１３と１４からの代表的リガンドの解離定数は、例７に示すニトロセルロースフィルター結合実験により測定し、その結果を表９に示す。これらの計算は、キメラ１つ当たり２つのＲＮＡリガンド結合部位が存在することを仮定する。ランダムＲＮＡの親和性は、信頼性を持って測定できないが、約１０μＭであると推定される。
一般的に、リガンドは４℃で５０pM〜１５ｎＭの範囲の解離定数で１相性に結合する。最も高い親和性のリガンドのいくつかは、２相性に結合する。ファミリーＩ、VII、ＸからのリガンドおよびオーファンＦ１４．７０は、４℃と室温でほぼ同様に結合するが、一般的に温度が上昇すると親和性は低下する。観察された親和性は、炭水化物リガンドより数オーダー大きい親和性を有するオリゴヌクレオチドリガンドを単離することが可能であるという説を支持する。
例９
Ｌ−セレクチンに対する２’−ＮＨ 2 ＲＮＡリガンドの特異性
ＥＳ−Ｒｇ、ＰＳ−Ｒｇ、およびＣＤ２２β−Ｒｇに対するＬ−セレクチンリガンドの親和性は、例７に示すニトロセルロース分離法により測定した。表１０に示すように、リガンドはＬ−セレクチンに対して特異性が高い。一般に、ＥＳ−Ｒｇに対するリガンドの親和性は、ＰＳ−Ｒｇに対するより１０3倍低く、ＬＳ−Ｒｇに対するより約１０４倍低い。バックグランドより大きい結合は、試験した最も高いタンパク質濃度（６６０ｎＭ）でもＣＤ２２β−Ｒｇについては観察されず、リガンドはキメラ作製体のＦｃドメインに結合しないこと、および無関係のレクチンのシアル酸結合部位に対する親和性を持たないことを示す。オリゴヌクレオチドリガンド結合の特異性は、セレクチンによる同系の炭水化物の結合と非常に対照的なものであり、セレックスリガンドは炭水化物リガンドより大きな特異性を有するという説を確認している。
例１０
ヒトＰＢＭＣに対するＬ−セレクチン２’−ＮＨ 2 ＲＮＡリガンドの結合
精製され固定化されたタンパク質に対してＬ−セレクチンリガンドが単離されたため、細胞表面に提示されるＬ−セレクチンにこれらが結合することを証明することが必須である。第２および第９ラウンドのＲＮＡを比較（図２）すると、進化した（第９ラウンド）リガンドプールは単離されたＰＢＭＣに高親和性で結合し、飽和的に特異的結合が予測される。ラウンド２のＲＮＡの結合は、非飽和性（非特異的結合の特性）と思われる。クローン化されたリガンドＦ１４．１２（配列７８）もまた、飽和的に解離定数１．３ｎＭで結合するが、ランダム４０Ｎ７（配列番号６４）はラウンド２のＲＮＡ（図３）に似ている。結合の飽和性は、図４のデータにより確認される；５ｎＭ ３２Ｐ−標識Ｆ１４．１２ ＲＮＡ結合の＞９０％は、過剰の冷ＲＮＡにより競合を受ける。特異性は図５の結果により証明される；５ｎＭ ３２Ｐ−標識Ｆ１４．１２ ＲＮＡの結合は、抗Ｌ−セレクチン阻止モノクローナル抗体であるＤＲＥＧ−５６により完全に競合を受けるが、イソタイプの一致した無関係の抗体によっては影響されない。これらのデータは、細胞表面タンパク質に対するリガンドを単離するために固定化され精製されたタンパク質を使用することの実現可能性、および細胞表面のＬ−セレクチンに対するＦ１４．１２の結合特異性を確認している。
例１１
シアリル−ルイス X への結合の阻害
２〜５ｍＭ ＥＤＴＡにより溶出されるオリゴヌクレオチドリガンドは、その結合エネルギーの一部を、レクチンドメインの結合Ｃａ＋＋との接触から得ると考えられ、従って結合についてシアリル−ルイスXと競合すると考えられる。リガンドＦ１４．１２（配列番号７８）が固定化シアリル−ルイスXへのＬＳ−Ｒｇ結合を阻害する能力を、競合ＥＬＩＳＡ測定法で測定した。予測されるように、４ｍＭ ＥＤＴＡはＬＳ−Ｒｇ結合を７．４倍低下させ、２０ｍＭのラウンド２のＲＮＡはＬＳ−Ｒｇ結合を阻害しなかった。炭水化物結合は、Ｃａ＋＋依存性であることが知られており、ラウンド２のＲＮＡは１０ｎＭ ＬＳ−Ｒｇに結合するには親和性が低すぎる（表７）。
この測定法ではＦ１４．１２ ＲＮＡは、ＩＣ５０が約１０ｎＭで濃度依存性にＬＳ−Ｒｇ結合を阻害する（表６）。完全な阻害は５０ｎＭのＦ１４．１２で観察される。観察された阻害は、実験条件下で妥当であった；室温でＦ１４．１２のＫｄは約１ｎＭ（表９）であり、１０ｎＭ ＬＳ−Ｒｇは２０ｎＭの結合部位である。これらのデータは、ＲＮＡリガンドはＬＳ−Ｒｇ結合に対してシアリル−ルイスXと競合することを証明し、低濃度のＥＤＴＡは、レクチンドメインの炭水化物結合部位に結合するリガンドを特異的に溶出させるという説を支持する。
例１２
Ｌ−セレクチンに対する高親和性２’−ＮＨ 2 リガンドの２次構造
好適な例において、整列した配列の比較解析により、２次構造と構造−相関関係の推定が可能になる。配列中の２つの位置のヌクレオチドがワトソン−クリック塩基対合規則に従って共変動するなら、これらの位置のヌクレオチド配列は対合し易い。非保存配列、特に長さが変化するものは、機能に直接関係しにくく、高度に保存された配列は、直接関係し易い。
それぞれファミリー１整列の比較解析は、コンセンサス配列ＡＵＧＵＧＵＧＡが可変サイズループ内に含有されているヘアピン構造を示唆する（図７ａ）。ステム配列は保存されず、５’または３’−固定または可変配列であり得る。ステムを形成しない１つのリガンド（Ｆ１４．１２（配列番号７３））は、他の性状解析されたリガンドより有意に低い親和性を有する（表９）。
ファミリーIII について提唱された構造もまた、保存配列ＡＡＣＡＵＧＡＡＧＵＡが可変長ループ内に含有されているヘアピンである（図７ｂ）。ステムの５’−半分は、あまり保存されていない配列ＡＧＵＣの一部かも知れない５’−固定配列である。
ファミリーIIについては整列データはないが、この配列は折り畳まれてシュードノット（pseudoknot）を形成する（図７ｃ）。このモデルの３つの魅力的な特徴は、１）らせんがたがいに重なる、２）構造は可変配列のみを利用する、および３）構造は主要な変化配列と適合性を有する、ことである。
例１３
ヒトＬ−セレクチンに対するｓｓＤＮＡリガンド
本例で概説する実験方法は、例１４〜２１に記載のヒトＬ−セレクチンに対するｓｓＤＮＡリガンドを同定し性状解析するために使用した。
実験方法
Ａ）材料
他に特に明記しない場合は、Ｌ−セレクチン／ＩｇＧ２キメラ（ＬＳ−Ｒｇ）に対するｓｓＤＮＡセレックスで使用したすべての材料は、例７段落Ａと同じであった。セレックス実験の緩衝液は、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）を使用した。すべての結合親和性実験のために緩衝液は、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌおよび２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）を含有する点で上記緩衝液とは異なる。
Ｂ）セレックス
セレックス法は、米国特許第５，２７０，１６３号などに詳細に記載されている。ｓｓＤＮＡセレックスのために使用した方策は、後述するように例７段落Ｂに記載のものと基本的に同じである。ＬＳ−Ｒｇセレックスの合成ＤＮＡ鋳型のヌクレオチド配列は、４０個の位置でランダム化された。この可変領域は、ＢＨ ５’および３’固定領域が隣接する。このランダムＤＮＡ鋳型は、４０ＢＨ（配列番号１２６）と呼び、以下の配列 5'-ctacctacgatctgactagc<40N>gcttactctcatgtagttcc-3'（配列番号６４）を有する。ＰＣＲのプライマーは、以下のものである：５’−プライマー：5'-ctacctacgatctgactagc-3'（配列番号１２７）および３’プライマー：5'ajajaggaactacatgagagtaagc-3'（配列番号１２８）。固定領域は、ＰＣＲのためのプライマーアニーリング部位を含有する。初期ＤＮＡプールは、５００pmolずつの各２つの型の１本鎖ＤＮＡ：１）合成ｓｓＤＮＡ、および２）１nmolの合成ｓｓＤＮＡ鋳型からのＰＣＲ増幅したｓｓＤＮＡ、を含有した。
以後のラウンドにおいて、溶出したＤＮＡは、ＰＣＲ増幅の鋳型であった。ＰＣＲ条件は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、および２５Ｕ／ｍｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼのストフェル（Stoffel）断片であった。ＰＣＲ増幅後、２本鎖ＤＮＡをγ３２Ｐ−ＡＴＰを使用して末端標識した。相補的な鎖は、８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素で電気泳動して分離した。３’ＰＣＲプライマーのビオチン化による鎖の分子量の差により、鎖は分離される。高特異性を得るために、最終ラウンドでＤＮＡ鎖は末端標識の前に分離された。溶出した画分はエタノール沈殿により処理した。
ＬＳ−Ｒｇ／ｓｓＤＮＡ複合体の非結合ｓｓＤＮＡからの分離方策は、例７段落Ｂに記載の通りであるが、２ｍＭ ＥＤＴＡを特異的溶出のために使用した。
セレックス方策は表１１に概説される。
Ｃ）ニトロセルロースフィルター結合測定法
セレックス特許出願および例７段落Ｃに記載されているように、ニトロセルロースフィルター分離法を使用して、ＬＳ−Ｒｇおよび他のタンパク質に対するｓｓＤＮＡリガンドの親和性を測定した。これらの実験のために、ギブコビーアールエル（GibcoBRL）９６ウェルマニホールドを、例７の１２ウェルのミリポア（Millipore）マニホールドの代わりに使用し、放射能はフジックスＢＡＳ１００ホスホリメージャー（Fujix BAS100 phophorimager）で測定した。結合データは、例７段落Ｃに記載のように解析した。
Ｄ）クローニングと配列決定
第１３、１５および１７ラウンドのＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄIII 制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーとともに再増幅した。例７段落Ｄに記載の方法を使用して約１４０個のリガンドをクローン化し配列決定した。得られた配列を表１２に示す。
Ｅ）細胞結合試験
進化したリガンドプールが、細胞表面に提示されているＬ−セレクチンに結合する能力は、例７段落Ｅに記載のように、単離したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いる実験で試験した。
フローサイトメトリー
白血球に対するオリゴヌクレオチドの結合はフローサイトメトリーで試験した。簡単に説明すると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準的方法でヒストペーク（Histopaque）で精製した。細胞（５００細胞／ｍｌ）を、０．２５ｍｌのＳＭＨＣＫ緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）、８．９ｍＭ ＮａＯＨ、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）のフルオレセイン標識したオリゴヌクレオチドと室温で１５分間インキュベートした。細胞の蛍光染色は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ蛍光活性化細胞ソーター解析（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、サンホセ、カリホルニア州）で定量した。
全血中の白血球に結合するオリゴヌクレオチドの能力を調べるために、２５μｌアリコートのヘパリン化全血を、２μｇのＣｙ５ＰＥ標識抗ＣＤ４５（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）のケン・デービス（Ken Davis）から供与された）と０．１５μＭのＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１（オペロンテクノロジーズ（Operon Technologies）、アラメダ（Alameda）、カリホルニア州、により、５’−フルオレセインホスホルアミダイトで合成した；配列番号１８５）とともに、２２℃で３０分間染色した。特異性を測定するために、他の試料を０．３μＭのＤＲＥＧ−５６または７μＭの非標識ＬＤ２０１Ｔ１の存在下でＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１で染色したか、または細胞を４ｍＭ ＥＤＴＡを添加後再度測定した。全血の最終濃度は少なくとも７０％（ｖ／ｖ）であった。染色され濃縮された全血を、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＣａＣｌ2、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、および０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ3で１／１５希釈し、直ちにベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒでフローサイトメトリーを行った。リンパ球と顆粒球を、サイドスキャターとＣＤ４５ＣｙＰＥ染色を使用してゲーティングを行った。
Ｆ）マルチマーオリゴヌクレオチドリガンドの合成と性状解析
分岐ダイマーオリゴヌクレオチド複合体の合成
標準的固体状態法により、３’−３’シメトリックリンキング（Symmetric Linking）ＣＰＧ（オペロン（Operon）、アラメダ（Alameda）、カリホルニア州、）から開始して、ダイマーオリゴヌクレオチドを合成した。分岐したオリゴヌクレオチドは、２つのコピーの端を切り取ったＬ−セレクチンＤＮＡリガンド（この各々は５単位のエチレングリコールスペーサーを介して上記ＣＰＧに３’末端により結合している）を含有する（図８Ａ）。各リガンドは５’末端でフルオレセインホスホルアミダイトで標識した（グレンリサーチ（Glen Research）、スターリング（Sterling）、バージニア州）。ＬＤ２０１Ｔ１（配列番号１４２）
の３つのトランケートについて、分岐したダイマーを作成した。使用したトランケートリガンドはＬＤ２０１Ｔ４（配列番号１８７）、ＬＤ２０１Ｔ１０（配列番号１８７）、およびＬＤ２０１Ｔ１（配列番号１８５）であった。分岐したダイマーはゲル電気泳動で精製した。
多価ビオチン化ＤＮＡリガンド／ストレプトアビジン複合体の合成
ビオチン化ＤＮＡをフルオレセインまたはフィコエリスリン標識ストレプトアビジン（それぞれＳＡ−ＦＩＴＣ、ＳＡ−ＰＥ）と反応させて、多価オリゴヌクレオチド複合体を作成した（図８Ｂ）．ストレプトアビジン（ＳＡ）はテトラマータンパク質であり、各ユニットがビオチン結合部位を有する。５’および３’ビオチン化ＤＮＡは、それぞれＢｉｏＴＥＧとＢｉｏＴＥＧ ＣＰＧ（グレンリサーチ（Glen Research）、スターリング（Sterling）、バージニア州）を用いて、オペロンテクノロジー社(Operon Technologies Inc.)(アラメダ (Alameda)、カリホルニア州)により合成された。予測される化学量論は、１つの複合体当たり２〜４個のＤＮＡ分子である。ＬＤ２０（配列番号１４２）の３つのトランケートについてＳＡ／ｂｉｏ−ＤＮＡ複合体を作成した。端を切り取ったリガンドは、ＬＤ２０１Ｔ１（配列番号１８７）、ＬＤ２０１Ｔ１０（配列番号１８８）、およびＬＤ２０１Ｔ１（配列番号１８５）であった。ｂｉｏ−ＤＮＡ／ＳＡ多価複合体は、ビオチン修飾オリゴヌクレオチド（１ｍＭ）とフルオレセイン標識ストレプトアビジン（０．１７ｍＭ）を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）中で室温で少なくとも２時間インキュベートして作成した。オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン複合体は、遊離ストレプトアビジンまたはオリゴヌクレオチドから複合体をさらに精製することなく、反応混合物から直接使用した。
ダンベルダイマー多価複合体の合成
ポリエチレングリコールＰＥＧ３４００ＭＷのホモ２官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（またはＮＨＳ）活性ステル、および５’末端アミノ修飾物質Ｃ６ｄＴ（グレンリサーチ（Glen Research））と３’−３’−末端ホスホジエステル結合を有する２９量体ＤＮＡオリゴヌクレオチドＮＸ３０３（配列番号１９６）から、「ダンベル」ＤＮＡダイマー複合体を作成した（図８Ｃ）。結合反応は、ＰＥＧに対して過剰当量のＤＮＡリガンドを含有する１％ＴＥＡを有するＤＭＳＯ中で行った。ＰＥＧ結合体は、逆相クロマトグラフィーにより遊離オリゴヌクレオチドから精製した。次に陰イオン交換ＨＰＬＣによりモノマーからダイマーを精製した。前記したようにフルオレセインを有する５’末端でオリゴヌクレオチドを標識した。
フォークダイマー多価複合体の合成
フォークダイマー多価複合体（図８Ｄ）を合成するために、グリセロールをその２位で線状ＰＥＧ分子（分子量２０kD）の１つの末端に結合して、ビスアルコールを得た。これをさらに修飾してビススクシネートエステルとし、これを活性化してＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性ステルにした。この活性ステルを、端を切り取ったＤＮＡ核酸リガンドＮＸ３０３（配列番号１９６）の５’末端で一次アミンに結合させた。結合反応は、ＰＥＧに対して過剰当量のＤＮＡリガンドを含有する１％ＴＥＡを有するＤＭＳＯ中で行った。ＰＥＧ結合体は、逆相クロマトグラフィーにより遊離オリゴヌクレオチドから精製した。次に陰イオン交換ＨＰＬＣによりモノマーからダイマーを精製した。前記したようにフルオレセインを有する５’末端でオリゴヌクレオチドを標識した。
マルチマーオリゴヌクレオチドリガンドの性状解析
ヒト末梢血単核細胞へのダイマーとマルチマーオリゴヌクレオチド複合体の結合を、例１３段落Ｄに記載のようにフローサイトメトリーにより解析した。
Ｇ）光架橋
ＤＮＡリガンドＬＤ２０１Ｔ４（配列番号１８７）の光架橋物を、ヌクレオチドＴ１５（図１２）の代わりに５−ブロモ−デオキシウラシルを用いることにより合成した。４nmolの３２Ｐ−標識ＤＮＡを１×ＳＨＭＡＣＫ＋０．０１％ヒト血清アルブミン（ｗ／ｖ）中の４nmolのＬ−セレクチン−Ｒｇとインキュベートし、次に室温で５０cmの距離からエキシマレーザーから１２，５００パルスで１７５mJ/ パルスで照射した。タンパク質とＤＮＡを４００μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび８．４ｍｌのエタノールを加え、次に−７０℃で沈殿させた。沈殿物を遠心分離し、真空乾燥し、１００μｌの０．１Ｍトリス（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＣａＣｌ2に再懸濁した。４５μｇのキモトリプシンを加え、３７℃で２０分後、８％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素／１×ＴＢＥゲルにのせ、キシレンシアノールが１５cm泳動するまで電気泳動した。ゲルを５分間１×ＴＢＥに浸漬し、次に１×ＴＢＥ中２００mAmpで３０分間イモビロン−Ｐ（ミリポア(Millipore)）にブロットした。膜を水で２分間洗浄し、空気乾燥し、オートラジオグラフィーを取った。遊離ＤＮＡバンドより遅く移動する標識バンド（ＬＤ２０１Ｔ４に架橋したキモトリプシンペプチドを示す）を観察し、オートラジオグラフィーを鋳型として使用して膜からこのバンドを切り取った。ペプチドをエドマン分解により配列決定し、得られた配列はＬＥＫＴＬＰＳＲＳＹＹである。ブランク残基は、レクチンドメインの架橋アミノ酸Ｆ８２に対応する。
Ｈ）リンパ球移動実験
ヒトＰＢＭＣをフィコール−ハイペーク勾配によりヘパリン化血液から精製し、ＨＢＳＳ（カルシウム／マグネシウムを含まない）で２回洗浄し、５１Ｃｒ（アマシャム（Amersham））で標識した。標識後、細胞をＨＢＳＳ（カルシウム／マグネシウムを含まない）と１％ウシ血清アルブミン（シグマ（Sigma））で２回洗浄した。メスのＳＣＩＤマウス（６〜１２週令）に２×１０６細胞を静脈内注射した。細胞は処理しなかったか、または１３pmolの抗体（ＤＲＥＧ−５６もしくはＭＥＬ−１４）、または４、１、もしくは０．４nmolの修飾オリゴヌクレオチド（合成は後述）と混合した。１時間後、マウスを麻酔し、血液試料を採取し、マウスを安楽死させた。ＰＬＮ、ＭＬＮ、パイエル板、脾臓、肝臓、肺、胸腺、腎臓および骨髄を取り出し、臓器に取り込まれたカウントをパッカード（Packard）ガンマカウンターで測定した。第２のプロトコールで、精製し、標識し、そして前述のように洗浄した２×１０6個のヒトＰＢＭＣを、抗体またはオリゴヌクレオチド前処理無しでメスのＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。細胞の注射の１〜５分前に、マウスに１５pmolのＤＲＥＧ−５６または４nmolの修飾オリゴヌクレオチドを注射した。臓器に取り込まれたカウントは、前述のように定量した。
ｄＴ−５’−ＣＥポリスチレン支持体（グレンリサーチ（Glen Research））に結合させて３’−３’末端ホスホジエステル結合を得て、５’末端アミノ修飾物質Ｃ６ｄＴ（グレンリサーチ（Glen Research））を有して、修飾ヌクレオチドＮＸ２８８（配列番号１９３）およびＮＸ３０３（配列番号１９６）の合成を開始した。ＮＸ２８８とＮＸ３０３が合成されると、次に５’アミン残基を介してオリゴヌクレオチドに２０，０００分子量ＰＥＧ２−ＮＨＳエステル（シアウォーターポリマーズ（Shearwater Polymers）、ハンツビル（Huntsville）、アラバマ州）を結合させた。反応物中のＰＥＧ：オリゴのモル比は、３：１〜１０：１であった。反応は、８０：２０（ｖ：ｖ）１００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８）：ＤＭＦ中で３７℃で１時間行った。
Ｉ）シアリル−ルイスXへのＬ−セレクチン結合の阻害
ＣａＣｌ2とＭｇＣｌ2を含有しない１×ＰＢＳ（ギブコ／ビーアールエル（GIBCO/BRL））中のＳＬｅX−ＢＳＡ（オックスフォードグリコシステムズ（Oxford GlycoSystems）、オックスフォード、英国）を、１００nm/ ウェルで２２℃で一晩インキュベートしてマイクロタイタープレートに固定化した。ウェルを、２０ｍＭヘペス、１１１ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＫＣｌ、８．９ｍＭ ＮａＯＨ（最終ｐＨ８）、および１％のグロブリンを含まないＢＳＡ（シグマ（Sigma））からなる測定緩衝液で１時間阻止した。回転振盪で９０分間インキュベートした反応混合物は、測定緩衝液中に５ｎＭ Ｌ−セレクチン−Ｒｇ、１：１００希釈の抗ヒトＩｇＧ−ペルオキシダーゼ結合体（シグマ（Sigma））、および０〜５０ｎＭの競合物質を含有した。インキュベート後、プレートをＢＳＡを含有しない緩衝液で洗浄して、非結合キメラ抗体複合体を除去し、Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩ペルオキシダーゼ基質（シグマ（Sigma））とともに暗所で２２℃で振盪してインキュベートした。バイオキネティクスリーダー（Bio-Kinetics Reader）モデルＥＬ３１２ｅ（バイオテクインスツルメンツ（Bio-Tek Instruments）、ラグナヒルズ（Laguna Hills）、カリホルニア州）で４５０nmで吸収を読んだ。値は、１つの代表的な実験からの二重測定または三重測定の平均±標準誤差である。
例１４
Ｌ−セレクチンに対するｓｓＤＮＡ
セレックスの出発ｓｓＤＮＡプールであるランダム化された４０ＢＨ（配列番号１２６）は、約１０１５分子（１nmolのｓｓＤＮＡ）を含有した。ＬＳ−Ｒｇに対するランダム化されたｓｓＤＮＡの解離定数は、約１０μＭＭであると推定される。セレックスプロトコールは表１１に示す。
セレックスの初期ラウンドは、プロテインＡセファロースビーズ１μｌ当たり１６．７pmolのＬＳ−Ｒｇ密度で４℃で行った。以後のラウンドは室温で行った以外は、表１１に示すように行った。２ｍＭ ＥＤＴＡ溶出は、ラウンド１〜３では省略した。これらの３つのラウンドの５０ｍＭ ＥＤＴＡのシグナル対ノイズ比は、それぞれ５０、１２および２５であった（表１１）。これらのＤＮＡを、ラウンド２〜４の投入材料のために増幅した。ラウンド４から開始して２ｍＭ ＥＤＴＡ溶出をプロトコールに加えた。このおよび以後のすべてのラウンドで、２ｍＭ ＥＤＴＡ溶出したＤＮＡを、次のラウンドの投入材料のために増幅した。
選択の厳密性を増加させるために、ラウンド４で固定化ＬＳ−Ｒｇの密度を１０倍低下させ、選択の厳密性を増加させる必要に応じてタンパク質をさらに低下させた。これらの条件下で、選択されたプールの親和性の急速な上昇が観察された（表１１）；４℃ではラウンド７のｓｓＤＮＡの解離定数は６０ｎＭであった。
第７ラウンドのＤＮＡを用いる結合実験は、Ｌ−セレクチンの進化するプールの親和性はわずかに温度感受性であることを明らかにした（４℃、室温、３７℃でそれぞれＫｄ：６０ｎＭ、９４ｎＭおよび２３０ｎＭ）生理学的温度で結合するリガンドの選択を増強するために、ラウンド８、１３、１６、および１７を３７℃で行った。ラウンド１５のｓｓＤＮＡの親和性は温度感受性であるが、室温で最適（１６０ｐＭ）であり、４℃や３７℃より３倍高い。
ＤＮＡプールのバルク配列決定は、ラウンド５ですこし非ランダム性があり、ラウンド１３で劇的な非ランダム性があることを示す。ラウンド１３、１５、および１７からリガンドをクローン化し配列決定した。配列を用手法としばしば存在する局所的整列からのコンセンサス配列を決定するネクスター(NeXsdar)コンピュータープログラムで整列させた。
Ｂ．配列
表１２においてリガンド配列は標準的１文字コードで示す（コーニッシュ−ボウデン（Cornish-Bowden），１９８５ ＮＡＲ １３：３０２１−３０３０）。進化したランダム領域のみを表１２に示す。固定領域の任意の領域を小文字で示す。特に明記していない場合は、各クローンは定義により進化した配列と関連する固定配列の両方を含有する。ユニークな配列とは、他のすべてのものから３つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なるものであると、機能的に定義される。２回以上単離された配列は、括弧付きの数字（ｎ）で示し、その後にリガンド単離数を示す。これらのクローンは６つの配列ファミリーと無関係の配列またはオーファンに分類される（表１２）（配列番号１２９〜１８０）。
ファミリー１は３３系統からのリガンドにより規定され、充分規定されたコンセンサス配列、ＴＡＣＡＡＧＧＹＧＹＴＡＶＡＣＧＴＡ（配列番号１８１）を有する。ＣＡＡＧＧとＡＣＧおよび６ヌクレオチドのスペースの保存は、ほとんど完全である（表１２）。コンセンサス配列は、３〜５ヌクレオチドの長さの可変であるが相補的な配列が隣接している。ファミリー１の統計的優位性は、バルク集団の性質はファミリー１リガンドの性質を反映するものであることを示唆する。ｓｓＤＮＡファミリー１と２’−ＮＨ2ファミリーＩはコンセンサス配列、それぞれＣＡＡＧＧＣＧおよびＣＡＡＧＧＹＧを共有する。
ファミリー２は、単一の配列で示され、ファミリー１に関係する。このリガンドは絶対的に保存されたＣＡＡＧＧを含有し、ファミリー１の高度に保存されたＡＣＧを含有するが、この２つの成分の間のスペースは著しく異なる（６ヌクレオチドに対して２３）。
ファミリー４〜６は、それぞれコンセンサス配列を信頼性を制限する少数のリガンドにより規定され、ファミリー７は、コンセンサス配列の決定を前提にする単一の配列により規定される。ファミリー５は、２つの保存配列ＡＧＧＧＴとＲＣＡＣＧＡＹＡＣＡ（この位置は順番に入れ替わっている）を含有する。
Ｃ．親和性
表１２からの代表的リガンドの解離定数は、表１３に示す。これらの計算では、１つのキメラに対して２つのｓｓＤＮＡリガンド結合部位があると仮定する。
ランダムｓｓＤＮＡの親和性は信頼性を持って測定できないが、約１０μＭであると推定される。
室温では、解離定数は４３ｐＭ〜１．８ｎＭの範囲であり、これはランダム化されたｓｓＤＮＡより少なくとも５×１０３〜２×１０５倍の改善である（表１３）。３７℃では、Ｋｄは１３０ｐＭ〜２３ｎＭの範囲である。温度感受性の程度は、非感受性（リガンドＬＤ１２２とＬＤ１２７（配列番号１５９と１６２））〜８０倍（リガンドＬＤ１１２（配列番号１３５））まで変動する。一般に、ファミリー１リガンドの中でラウンド１５からのものの親和性は、ラウンド１３のものより大きい。最適のリガンド（ＬＤ２０８、ＬＤ２２７、ＬＤ２３０および１ｄ２３３（配列番号１３３、１３４、１３２、および１４６））について、室温と３７℃の親和性の差は約４倍である。
進化したｓｓＤＮＡリガンドプールの観察された親和性は、炭水化物リガンドより数オーダー大きい親和性を有するオリゴヌクレオチドリガンドを単離することが可能であるという我々の説を再確認している。
例１５
Ｌ−セレクチンに対するｓｓＤＮＡリガンドの特異性
ＬＳ−Ｒｇ、ＥＳ−Ｒｇ、ＰＳ−Ｒｇ、ＣＤ２２β−ＲｇおよびＷＧＡの代表的なクローン化されたリガンドの親和性を、ニトロセルロース分離法により測定し、その結果を表１４に示す。リガンドはＬ−セレクチンに対して特異性が高い。ＬＳ−Ｒｇの親和性より、ＥＳ−Ｒｇの親和性は約１０３倍小さく、ＰＳ−Ｒｇの親和性は約５×１０３倍小さい。バックグランドより大きい結合は、それぞれ０．７と１．４μＭタンパク質のＣＤ２２β−ＲｇまたはＷＧＡについて観察され、リガンドはキメラ作製体のＦｃドメインに結合せず、また無関係のシアル酸結合部位に対する親和性を有さないことを示している。
オリゴヌクレオチドリガンド結合の特異性は、セレクチンによる同系の炭水化物の結合と大きく異なり、セレックスリガンドは炭水化物リガンドより大きな特異性を有するという説を再確認する。
例１６
細胞結合試験
例１３段落Ｅに記載のように、ラウンド１５のｓｓＤＮＡプールが、末梢血単核細胞表面に提示されているＬ−セレクチンに結合する能力について試験した。
抗Ｌ−セレクチンモノクローナル抗体と競合させて、進化したプールを親和性と特異性について試験した。図９は、ラウンド１５のｓｓＤＮＡは約１．６ｎＭの解離定数で単離されたＰＢＭＣに結合することを示し、特異的結合について予測されるように飽和的に結合する。図１０は結合の特異性を直接証明する；この実験で２ｎＭの３２Ｐ標識したラウンド１５のｓｓＤＮＡは、Ｌ−セレクチン阻止モノクローナル抗体ＤＲＥＧ−５６により完全に競合を受けるが、イソタイプが一致した無関係の抗体には影響されない。同様の実験で、ＬＤ２０１Ｔ１（配列番号１８５）は、高親和性でヒトＰＢＭＣに結合することが証明された。結合は飽和性、２価陽イオン依存性であり、ＤＲＥＧ−５６により阻止された。
これらのデータは、細胞表面タンパク質に対するリガンドを単離するために固定化され精製されたタンパク質を使用することの実現可能性、および細胞表面のＬ−セレクチンに対するラウンド１５のｓｓＤＮＡとＬＤ２０１Ｔ１の結合特異性を確認している。
全血中の白血球へのＬＤ２０１Ｔ１の結合は、フローサイトメトリーにより調べた。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＬＤ２０１Ｔ１は、ヒトリンパ球および好中球に特異的に結合し（図１１Ａ／Ｂ）；結合は、ＤＲＥＧ−５６、非標識ＬＤ２０１により競合、および４ｍＭ ＥＤＴＡの添加により阻害される（図１１Ａ／Ｂ）。これらの細胞結合試験は、ＬＤ２０１Ｔ１は、リンパ球および好中球上のヒトＬ−セレクチンに飽和的にかつ特異的に結合することを証明している。
例１７
Ｌ−セレクチンに対する高親和性アミノ酸配列リガンドの２次構造
好適な例において、整列した配列の比較解析は、２次構造と構造−機能相関関係の推定を可能にする。配列中の２つの位置のヌクレオチドがワトソン−クリック塩基対合規則に従って共変動するなら、これらの位置のヌクレオチド配列は対合し易い。非保存配列、特に長さが変化するものは、機能に直接関係しにくく、高度に保存された配列は、直接関係し易い。
ファミリー１の２４配列の比較解析は、これらのリガンドのヘアピン構造を支持する（図１２）。図において、コンセンサスヌクレオチド配列、不変ヌクレオチドを太字で示して特定される。ステムの右側は、同じ線の上にあるステム中の位置の特定の塩基対の存在の数を示すマトリックスである。推定される構造は、ＧＹＴＡテトラループ、３ヌクレオチド対に上のステムおよび６〜７ヌクレオチド対に下のステムからなる。上および紫檀御神酒は、非対称のＡＡ内部ループまたは「バルジ」により分離される。上のステムの３つの塩基対のうちの２つおよび下のステムの７のうち６つは、共変動により証明される。２つの不変対（７／２０位と１０／１９位）は、いずれもワトソン−クリック塩基対である。この構造は、標的タンパク質への結合において不変ヌクレオチド（特に、Ａ８、Ａ９およびＴ１５）の直接の関与の可能な基礎を提供する。
Ｌ−セレクチンへのオリゴヌクレオチド結合の部位は、１群の競合実験により推定される。ＤＲＥＧ−５６は、レクチンドメインに結合することが知られている抗Ｌ−セレクチン、接着阻止モノクローナル抗体である。３つの無関係のリガンド、ＬＤ２０１Ｔ１（配列番号１８５）、ＬＤ１７４Ｔ１（配列番号１９４）およびＬＤ１９６Ｔ１（配列番号１９５）のＬＳ−Ｒｇへの結合は、ＤＲＥＧ−５６により阻止されるが、イソタイプの一致した対照によっては阻止されない。交差競合実験では、ＬＤ２０１Ｔ１、ＬＤ１７４Ｔ１、またはＬＤ１９６Ｔ１は、放射能標識ＬＤ２０１Ｔ１がＬＳ−Ｒｇに結合することを妨害し、このリガンドが同じかまたは重複する部位に結合するという仮説に一致する。阻止および競合実験は、結合の２価陽イオン依存性と組合せると、３つのすべてのリガンドがレクチンドメインに結合することを示唆する。この結論は、光架橋実験によりＬＤ２０１Ｔ１について証明されている。
ＬＤ２０１Ｔ４（配列番号１８７：図１２）のＴ１５が５−ブロモウラシルで置換されるなら、例１３段落Ｇに記載のようにエキシマレーザーで照射すると、得られるＤＮＡはＬＳ−Ｒｇに対して高収率（１７％）で光架橋する。架橋の高収率は、タンパク質とＴ１５の間の一点の接触を示す。この点接触に対応するキモトリプシンペプチドを配列決定すると、レクチンドメインから得られたペプチドが明らかになった；Ｆ８２は架橋性アミノ酸である。すなわち、Ｆ８２は、高収率光架橋を可能にする重なった配置でＴ１５に接触する。高度に関連するＥ−セレクチン（グレーブス（Graves）ら，Ｎａｔｕｒｅ ３６７，５３２−５３８，１９９４）の構造との推定から、Ｆ８２は、提唱される炭水化物結合部位に隣接している。すなわち、この光架橋は、リガンドＬＤ２０１Ｔ１がＬＳ−Ｒｇのレクチンドメインに接触することの直接の証拠を提供し、炭水化物結合部位への接近を立体障害するか、またはＤＮＡ結合に際してレクチンドメインのコンフォメーションを変化させることにおける、オリゴヌクレオチドの機能の説明を与える。
例１８
Ｌ−セレクチンｓｓＤＮＡリガンドトランケートデータ
ファミリー１リガンドの最小の高親和性配列を規定するための初期の実験は、２６より多いヌクレオチドヘアピン（図１２；表１３）が必要であることを示している。ヘアピンに対応するリガンド、それぞれＬＤ２０１（配列番号１７３）とＬＤ２２７（配列番号１３４）由来のＬＤ２０１Ｔ４（配列番号１８７）とＬＤ２２７Ｔ１（配列番号１９２）は、全長の前駆体より２０倍および１００倍低い親和性で結合する。ＬＤ２０１Ｔ３（配列番号１８６）（リガンドＬＤ２０１の４１ヌクレオチドトランケート）は、全長リガンドに比較して約１５倍低下しており、４９量体であるＬＤ２０１Ｔ１（配列番号１８５）の親和性は、有意に変化していない（表１２と１３）。
さらなる実験は、トランケートＬＤ２０１Ｔ１０（配列番号１８８）とＬＤ２２７Ｘ１（配列番号１９１）は、全長ものと同様の親和性で結合する。これらのリガンドはいずれも、コンセンサスステムの底部で延長しているステムを有する。加えたステムの配列の変化は、結合に対してその影響はあったとしてもほとんどなく、これは結合に直接関与していないことを示唆している。
添加したステムは、単一のらせんのバルジによりコンセンサスステムから分離される。２つのリガンドの単一のらせんバルジは長さが異なり、無関係な配列を有する。さらに、ＬＤ２０１のバルジは、元々のステム底部の５’末端にあり、ＬＤ２２７のそれは３’末端にある。すなわち、２つのリガンドは、明らかなコンセンサス構造を示す。ループ（ＬＤ２０１）を除去するか、または配列（ＬＤ２２７）をでたらめにするかもしくは端を切り取ると、親和性が減少し、出っ張った配列が結合に直接関与していることを示唆する。ＬＤ２０１Ｔ３はＬＤ２０１Ｔ１０より長いが、切り取られた端の位置のため、単一のらせんループおよび延長したステムを形成することはできない。
例１９
シアリル−ルイス X への結合の阻害
シアリル−ルイスXはセレクチンに結合される最小炭水化物リガンドである。ｓｓＤＮＡリガンドがシアリル−ルイスXへのＬ−セレクチンの結合を阻害する能力は、例１３段落Ｉに記載のように、競合ＥＬＩＳＡ測定法により測定される。ＬＤ２０１Ｔ１（配列番号１８５）、ＬＤ１７４Ｔ１（配列番号１９４）およびＬＤ１９６Ｔ１（配列番号１９５）は、固定化されたＳＬｅXへのＬＳ−Ｒｇの結合を用量依存性に阻害し、ＩＣ50値は約３ｎＭであった。これは、同様のプレート結合測定法でのＳＬｅXの公表されているＩＣ50より、１０5〜１０6倍の改善である。ＬＤ２０１Ｔ１に基づくでたらめにした配列は、この測定法では活性を示さなかった。これらのデータは、ＤＮＡリガンドがＬＳ−Ｒｇ結合についてシアリル−ルイスXと競合することを証明し、低濃度のＥＤＴＡがレクチンドメインの炭水化物結合部位に結合するリガンドを特異的に溶出させるという説を支持する。
例２０
Ｌ−セレクチンｓｓＤＮＡリガンドによるリンパ球移動の阻害
末梢リンパ節へのリンパ球の移動は、みごとにＬ−セレクチンに依存する。スプラーグ−ドーレイ（Sprague-Dawley）ラットリガンドはヒトＬ−セレクチンに結合し齧歯類のＬ−セレクチンには結合しないため、インビボの効果を評価するために、異種移植リンパ球移動系が確立された。５１Ｃｒで標識したヒトＰＢＭＣをＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。１時間後、細胞の移動を測定した。この系では、ヒトの細胞は末梢および腸間膜リンパ節に移動する（ＰＬＮとＭＬＮ）。この蓄積は、ＤＲＥＧ−５６に阻害される（図１３）がＭＥＬ−１４（マウスＬ−セレクチン依存性移動を阻止するモノクローナル抗体）には阻害さない。初期の実験で、細胞を注射の前にＤＲＥＧ−５６または３’キャップ形成させＰＥＧ修飾したオリゴヌクレオチドとともにインキュベートした。ＮＸ２８８（配列番号１９３）は、ＰＬＮ（図１３）およびＭＬＮへの細胞の移動を用量依存性に阻害したが、他の臓器の細胞の蓄積には影響を与えなかった。試験した最も高濃度（４nmol）でこのＤＮＡリガンドによる阻害は、ＤＲＥＧ−５６（１３pmol）に匹敵したが、でたらめにした配列は有意な作用はなかった（図１３）。ＬＤ１７４Ｔ１（配列番号１９４）の活性は、ＮＸ２８８と同様であった。
修飾オリゴヌクレオチドは細胞でプレインキュベートされない時有効かどうかを調べるために、ＤＲＥＧ−５６（１３pmol／マウス）または修飾オリゴヌクレオチド（４nmol／マウス）をマウスに静脈内注射し、１〜５分後、放射能標識したヒト細胞を静脈内投与した。再度、ＮＸ２８８（配列番号１９３）とＤＲＥＧ−５６はＰＬＮとＭＬＮへの移動を阻害したが、でたらめにした配列は効果はなかった（図１４）。従って、修飾オリゴヌクレオチドは、移動を有効に阻止するためにプレインキュベートを必要としなかった。これらの実験は、インビボでＬ−セレクチン依存性プロセスの阻害におけるオリゴヌクレオチドリガンドの効果を証明している。
例２１
Ｌ−セレクチン核酸リガンドマルチマー
Ｌ−セレクチンに対する２つの核酸リガンドを結合させた多価複合体を作成した。核酸リガンドの多価複合体は、１９９５年５月４日出願の同時係属米国特許出願第０８／４３４，４６５号（標題「核酸リガンド複合体」）に記載されている（これは参考のため本明細書に引用される）。これらの多価複合体は結合エネルギーを上昇させて、核酸リガンドのより遅いオフレート（off-rate）により良好な結合親和性を促進する。これらの多価複合体は、低用量においてモノマーより有用である。さらに高分子量（２０kD）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、複合体のインビボのクリアランス速度を低下させるために、複合体の一部に含有される。具体的には複合体に取り込まれる核酸リガンドは、ＬＤ２０１Ｔ１（配列番号１８５）、ＬＤ２０１Ｔ４（配列番号１８７）、ＬＤ２０１Ｔ１０（配列番号１８８）およびＮＸ３０３（配列番号１９６）である。多価セレクチン核酸リガンド複合体は、例１３段落Ｆに記載のように製造した。
種々のモノマー核酸リガンドおよび多価複合体が、フローサイトメトリーで試験されている。多価複合体はモノマー型と同様の特異性を示したが、ヒトリンパ球に対しては親和性の増強とオフ−レートの改善（すなわち、遅い）を示した。蛍光標識したモノマーＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）精製したヒトリンパ球をインキュベートして得られる力価測定曲線は、細胞への結合が飽和性であることを示した。半飽和蛍光は、３ｎＭのオリゴヌクレオチドで起きた。これに対して、分岐したダイマーＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１およびビオ−ＬＤ２０１Ｔ１／ＳＡ多価複合体は、約０．１５ｎＭで半飽和を示し、親和性の見かけの２０倍上昇に対応する。同様の実験で、モノマーＬＤ２０１Ｔ４の２０ｎＭに比較してＬＤ２０１Ｔ４のダンベルおよびフォークダイマーの半飽和は、それぞれ０．１および０．６ｎＭで観察された。
モノマー性核酸リガンドと多価複合体について、動力学的競合実験を行った。動力学的競合実験は、ＰＢＭＣ精製したリンパ球で行った。細胞を前述のように染色したが、１０ｎＭのオリゴヌクレオチドを使用した。モノマー、ダイマーおよび多価複合体のオフ−レートは、蛍光標識したリガンドで染色した細胞に５００ｎＭの非標識オリゴヌクレオチドを添加して、時間の関数として平均蛍光強度の変化を測定することにより、求めた。Ｌ−セレクチン発現ヒトリンパ球からのモノマーＬＤ２０１Ｔ１の解離速度は、約０．００５秒-1であり、約２．４分間の半減期に対応する。ＬＤ２０１Ｔ１分岐ＤＭＡおよびビオチン結合体多価複合体は、モノマーリガンドで観察されたものより数倍遅く、同じ条件下で測定した抗Ｌ−セレクチン阻止抗体ＤＲＥＧ−５６で観察されたものと同じかまたはより遅いオフ−レートを示した。非結合核酸配列を含有する多価複合体は同じ条件下で細胞を染色せず、オフ−レート実験で競合しなかった。ＬＤ２０１Ｔ４ダンベルおよびフォークダイマーのオフ−レートは、ＬＤ２０１Ｔ１分岐ダイマーより速く試験したすべてのモノマーより良好であった。これらの結果は、ダイマーおよびマルチマー長さは、モノマーリガンドより高親和性で結合し、遅いオフ−レートこの親和性の上昇が得られるという説を確認している。
例２２
ヒトＬ−セレクチンに対する２’−Ｆ ＲＮＡリガンド
本例に記載の実験法は、例２３〜２５に記載のヒトＬ−セレクチンに対する２’−Ｆ ＲＮＡの同定と性状解析に使用された。
実験法
Ａ）材料
特に記載しない場合は、Ｌ−セレクチン／ＩｇＧ２キメラ（ＬＳ−Ｒｇ）に対する２’−Ｆ ＲＮＡセレックスで使用したすべての材料は、例７、段落ａおよび例１３段落Ａと同じである。すべてのセレックスと結合実験に使用したＳＨＭＡＣＫ−１４０緩衝液は、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、および２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）であった。
細胞外ドメインに対応するＬ−セレクチンの可溶性型は、アールアンドディーシステムズ（R & D Systems）から購入し、一部のニトロセルロースフィルター結合実験に使用した。
Ｂ）セレックス
セレックス法は、米国特許第５，２７０，１６３号などに詳細に記載されている。方法は、特に明記する場合を除き基本的に例７と１３に記載のものと同じである。合成ＤＮＡ鋳型の可変領域は、３０または４０個の位置でランダム化され、およびＮ７ ５’と、転写体３０Ｎ７（配列番号２９２）と４０Ｎ７（配列番号３８９）を産生する３’固定領域が隣接している。ＰＣＲのプライマーは、以下のものである：
Ｎ７ ５’プライマー 5'taatacgactcactatagggaggacgatgcgg 3’（配列番号６５）
Ｎ７ ３’プライマー5'tcgggcgagtcgtcctg 3'（配列番号３）。
初期ＲＮＡプールは、まず３nmolの合成１本鎖ＤＮＡをクレノウで伸長して、次に得られる２本鎖分子をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで転写させて作成した。クレノウ伸長条件は：反応容量０．５ｍｌ中６nmolのプライマー５Ｎ７、３nmolの３０Ｎ７または４０Ｎ７、１×クレノウ緩衝液、０．８ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰである。
以後のラウンドにおいて、溶出したＲＮＡは、１本鎖ｃＤＮＡのＡＭＶ逆転写酵素媒介合成の鋳型であった。これらの１本鎖ＤＮＡ分子は、ＰＣＲ増幅により２本鎖転写鋳型に変換した。ＰＣＲ条件は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、および１００Ｕ／ｍｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼであった。転写反応物は、精製されたＰＣＲ反応物の３分の１、２００ｎＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、８０ｍＭヘペス（ｐＨ８．０）、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭスペルミジン、１ｍＭずつの２’−ＯＨ ＡＴＰ、２’−ＯＨ ＧＴＰ、３ｍＭずつの２’−Ｆ ＣＴＰ、および２’−Ｆ ＵＴＰ、および２５０ｎＭα−３２Ｐ ２’−ＯＨ ＡＴＰを含有した。すべての転写反応物における、ＣＴＰとＵＴＰの代わりに２’−Ｆ ＣＴＰと２’−Ｆ ＵＴＰを使用したことに注意されたい。
ＬＳ−Ｒｇ／ＲＮＡ複合体を非結合ＲＮＡから分離する方策は、表１５に概説され、基本的に例７段落Ｂの記載と同じである。３７℃で行った最初のセレックスラウンドでは、固定化されたＬＳ−Ｒｇの密度は、プロテインＡセファロース４ファストフロービーズ１μｌ当たり１０pmolであった。製造業者（ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech））の説明書に従って、セファロースビーズをプロテインＡセファロースビーズに結合させた。後のラウンドで、選択の厳密性を増加させるため、ＬＳ−Ｒｇの密度は必要に応じて減少させた（表１５）．第７ラウンドで、セレックスを分岐させた。１つの分岐は前述のように継続した（例７段落Ｂ）．両方のセレックスの第２の分岐で、ＲＮＡプールを、５’および３’固定配列に相補的なオリゴヌクレオチドにプレアニーリングさせた。これらのラウンドを「逆セレックス」と名付けた。各ラウンドの前に、ＲＮＡを１００μｌのプロテインＡセファロースビーズに２ｍｌのシリコーン化カラム中で１５分間バッチ吸着させた。非結合ＲＮＡと最小の洗浄（２倍量）で溶出したＲＮＡを合わせて、セレックス投入材料として使用した。セレックスのために、充分洗浄し、固定化したＬＳ−Ｒｇを前吸着したＲＮＡと１〜２時間、２ｍｌのカラム中で絶えず振盪しながらバッチインキュベートした。非結合ＲＮＡは、充分にバッチ洗浄して除去した（５００μｌ ＳＨＭＣＫ １４０／洗浄）。さらに逆選択したラウンドを、２００ｎＭの両方の相補的なオリゴを含有する緩衝液で充分に洗浄した。結合ＲＮＡは２つの画分として溶出した。まず、２価陽イオンのないＳＨＭＡＣＫ １４０中の５ｍＭ ＥＤＴＡ １００μｌでインキュベートおよびカラムを洗浄して、結合ＲＮＡを溶出した。第２に、残存する溶出可能なＲＮＡを、２価イオンのないＳＨＭＡＣＫ １４０中の５０ｍＭ ＥＤＴＡ ５００μｌでインキュベートおよび／または洗浄して除去した。溶出した投入ＲＮＡのパーセントを表２２に記録した。すべてのラウンドで、ＬＳ−Ｒｇのない等量のプロテインＡセファロースビーズを、セレックスビーズと同様に処理して、バックグランド結合を測定した。すべての非吸着、洗浄および溶出画分をベックマン（Beckman）ＬＳ６５００シンチレーションカウンター中で計測して、各ラウンドのセレックスを追跡した。
５ｍＭ ＥＤＴＡ溶出物は以下のラウンドで使用するために処理した（表１５）。イソプロパノール／エタノール（１：１，ｖ／ｖ）で沈殿させた後、ＲＮＡをＡＭＶ逆転写酵素により、４８℃で１５分間および次に６５℃で１５分間、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）2、１０ｍＭ ＤＴＴ、２００pmol ＤＮＡプライマー、０．５ｍＭずつのｄＮＴＰ、０．４Ｕ／μｌ ＡＭＶ ＲＴ中で、ｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ産物の転写体を次のセレックスを開始するために使用した。
Ｃ）ニトロセルロースフィルター結合測定法
セレックス特許出願に記載されているように、ニトロセルロースフィルター分離法を使用して、ＬＳ−Ｒｇおよび他のタンパク質に対するＲＮＡリガンドの親和性を測定した。フィルターディスク（ニトロセルロース／酢酸セルロース混合マトリックス、孔径０．４５μＭ、ミリポア（Millipore））を、真空マニホールド上に置き、真空下でＳＨＭＡＣＫ １４０緩衝液３ｍｌで洗浄した。３２Ｐ標識ＲＮＡプールと非標識ＬＳ−Ｒｇを含有する反応混合物を、ＳＨＭＡＣＫ １４０中で３７℃で１０〜２０分間インキュベートし、次に直ちに同じ３ｍｌのＳＨＭＡＣＫ １４０で洗浄した。フィルターを空気乾燥し、フルロール無しでベックマン（Beckman）ＬＳ６５００液体シンチレーションカウンターで計測した。あるいは、基本的に例１３段落Ｅに記載のように９６ウェルマイクロタイタープレートマニホールドを用いて結合試験を行った。
Ｄ）クローニングと配列決定
第１２ラウンドのＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄIII 制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーとともに再増幅した。これらの制限部位を用いて、ＤＮＡ配列をｐＵＣ９ベクターに方向をそろえて挿入した。これらの組換えプラスミドを大腸菌ＤＨ５α（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアルカリ分解法（キアゲン（Quiagen）、キアウェル（QIAwell）、チャッツワース（Chattsworth）、カリホルニア州）で調製した。約３００クローンをエービーアイプリズム（ABI Prism）（パーキンエルマー（Perkin Elmer）、フォスターシティ（Foster City）、カリホルニア州）を用いて配列決定した。配列を表１６に示す。
Ｅ）細胞結合試験
細胞表面に提示されているＬ−セレクチンへの結合は、ヒトリンパ球を用いるフローサイトメトリー実験で試験した。簡単に説明すると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を標準法によりヒストペーク（Histopaque）で精製した。非標識２’−Ｆリガンドにより白血球結合を評価するために、細胞（５００細胞／ｍｌ）を、０．２５ｍｌのＳＭＨＣＫ緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）、８．９ｍＭ ＮａＯＨ、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）中の増加する濃度の各非標識２’−Ｆリガンドの存在下で、フルオレセイン標識したＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１（配列番号１８５）と室温で１５分間インキュベートした。細胞の蛍光染色は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ蛍光活性化細胞ソーター解析（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、サンホセ、カリホルニア州）で定量した。２’−Ｆ競合物質の親和性は、蛍光阻害曲線から計算した。
例２３
Ｌ−セレクチンに対する２’−Ｆ ＲＮＡリガンド
Ａ．セレックス
セレックスの出発ＲＮＡプールであるランダム化された３０Ｎ７（配列番号２９２）または４０Ｎ７（配列番号３８９）は、約１０１４分子（０．７nmolのＲＮＡ）を含有した。セレックスプロトコールは表２５と例２２に概説する。すべてのラウンドは３７℃で選択された。ＬＳ−Ｒｇへのランダム化されたＲＮＡの解離定数は、約１０μＭであると推定された。６回のラウンド後、プールの親和性は約３００ｎＭに改善した。第７ラウンドから回収されたＲＮＡのアリコートを、最初の逆セレックスラウンドの出発物質として使用した。５ラウンドの逆セレックスと５回の追加の標準ラウンドを平衡して行った。すなわち、全部で１２ラウンドを、両方のセレックスの両方分岐で行った（３０Ｎ７、逆セレックス３０Ｎ７、４０Ｎ７およびクラス４０Ｎ７）。１２ラウンドのプールのそれぞれの親和性は、６０〜４００ｐＭの範囲であった。リガンドはこれらのプールからクローン化した。
Ｂ．Ｌ−セレクチンに対する２’−Ｆ ＲＮＡリガンドの配列
表１６においてリガンド配列は標準的１文字コードで示す（コーニッシュ−ボウデン（Cornish-Bowden），１９８５ ＮＡＲ １３：３０２１−３０３０）。固定領域は小文字で示す。特に明記していない場合は、各クローンは定義により進化した配列と関連する固定配列の両方を含有する。ユニークな配列とは、他のすべてのものから３つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なるものであると、機能的に定義される。２回以上単離された配列は、括弧付きの数字（ｎ）で示し、その後にリガンド単離数を示す。
３０Ｎ７と４０Ｎ７セレックスの最終プールは、共通の主要な列ファミリーを有するが、２つのセレックスからの同じ配列はまれである（表１６）。３０Ｎ７と４０Ｎ７セレックスからのほとんどのリガンド（９２のユニークな配列のうち７２）は、２つの関連する配列モチーフ、ＲＹＧＹＧＵＵＵＵＣＲＡＧＹまたはＲＹＧＹＧＵＵＷＷＵＣＲＡＧＹの１つを含有する。これらのモチーフはファミリー１を規定する。このファミリーの中に３つのサブファミリーがある。サブファミリー１ａリガンド（５３／６６）は、ファミリー１コンセンサスモチーフの１ヌクレオチド５’方向に追加の配列モチーフＣＵＹＡＲＲＹを含有する。サブファミリー１ｂ（９／６６ユニーク配列）は、ＣＵＹＡＲＲＹモチーフが欠如する。サブファミリー１ｃ（５／６６）もまた、ＣＵＹＡＲＲＹモチーフが欠如しており、コンセンサスＹＧＵＵのＹとＧの間にＡが挿入されており、コンセンサスＧＡ塩基対が欠如する。配列サブファミリーの重要性は、リガンドの提唱されている２次構造に反映されている（例２５）。
５つの配列からなる第２のファミリーは、比較的よく規定されたコンセンサスを有する：ＵＡＣＵＡＮ0-1 ＵＧＵＲＣＧ．．．ＵＹＣＡＣＵＡＡＧＮ1-2 ＣＣＣ（表１６）。ファミリー３は、短い信頼性の低いコンセンサスモチーフを有する（表１６）。さらに約１２のオーファンまたは明らかに無関係の配列がある。オーファン配列のうち３つは少なくとも２回回収された（表１６）。
Ｃ．親和性
表１６からの代表的リガンドの解離定数は、表１７に示す。これらの計算は、キメラ１つ当たり２つのＲＮＡリガンド結合部位が存在することを仮定する。ランダム２’−Ｆ ＲＮＡの親和性は、信頼性を持って測定できないが、約１０μＭであると推定される。
解離定数は３７℃で３４ｐＭ〜３１５nmの範囲である。選択は３７℃で行われ２’−Ｆ ＲＮＡは熱安定性構造を形成するため、結合親和性は温度感受性であると予測される。しかし低温で結合は試験されていない。一般的に、親和性の極端な差は予測される２次構造に関係があるかも知れない。
観察された親和性は、炭水化物リガンドより数オーダー大きい親和性を有するオリゴヌクレオチドリガンドを単離することが可能であるという説を支持する。
例２４
細胞結合試験
全長２’−Ｆリガンドが、細胞表面に提示されているＬ−セレクチンに結合する能力をヒト末梢血リンパ球を用いるフローサイトメトリー実験により試験した。例２２段落Ｅに記載のように増加する濃度の非標識２’−Ｆリガンドの存在下で、リンパ球を１０ｎＭのＦＩＴＣ結合ＤＮＡリガンドＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１（配列番号１８５）で染色した。リガンドＬＦ１５１３（配列番号３２１）、ＬＦ１５１４（配列番号２９７）、ＬＦ１６１３（配列番号３３１）、およびＬＦ１６１８（配列番号３５１）は、濃度依存性にＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１の結合を阻害し、競合物質濃度１０〜３００ｎＭで完全な阻害が観察された。これらの結果は、２’−Ｆリガンドが細胞表面Ｌ−セレクチンに結合することができ、２’−ＦリガンドとＬＤ２０１Ｔ１は同じまたは重複する部位に結合することを示唆する。競合曲線から計算したフルオロリガンドの親和性は、０．２〜２５ｎＭの範囲である。ヒトリンパ球上のＬ−セレクチンに対する２つのリガンドの親和性（ＬＦ１６１３（Ｋｄ＝０．２ｎＭ）、ＬＦ１５１４（Ｋｄ＝０．８ｎＭ））は、ＤＮＡリガンドＬＤ２０１Ｔ１（Ｋｄ＝３ｎＭ）より有意に優れている。精製されたタンパク質とリンパ球Ｌ−セレクチンについての親和性の間の妥当な一致は、リンパ球に対する結合がＬ−セレクチンについて特異的であることを示唆する。これらのデータは、細胞表面タンパク質に対するリガンドを単離するために固定化され精製されたタンパク質を使用することの実現可能性を確認している。
例２５
Ｌ−セレクチンに対する高親和性２’−Ｆ ＲＮＡリガンドの２次構造
好適な例において、整列した配列の比較解析は、２次構造と構造−機能相関関係の推定を可能にする。配列中の２つの位置のヌクレオチドがワトソン−クリック塩基対合規則に従って共変動するなら、これらの位置のヌクレオチド配列は対合し易い。非保存配列、特に長さが変化するものは、機能に直接関係しにくく、高度に保存された配列は、直接関係し易い。
ファミリー１の２４配列の比較解析は、これらのリガンドのヘアピン構造を支持する（図１２）。図において、コンセンサスヌクレオチド配列、不変ヌクレオチドを太字で示して特定される。ステムの右側は、同じ線の上にあるステム中の位置の特定の塩基対の存在の数を示すマトリックスである。推定される構造は、ＧＹＴＡテトラループ、３ヌクレオチド対に上のステムおよび６〜７ヌクレオチド対に下のステムからなる。上および下のステムは、非対称のＡＡ内部ループまたは「バルジ」により分離される。上のステムの３つの塩基対のうちの２つおよび下のステムの７のうち６は、共変動により証明される。２つの不変対（７／２０位と１０／１９位）は、いずれもワトソン−クリック塩基対である。この構造は、標的タンパク質への結合において不変ヌクレオチド（特に、Ａ８、Ａ９およびＴ１５）の直接の関与の可能な基礎を提供する。
２１個のユニーク配列の解析から推定されるファミリー１ａリガンドの２次構造は、４〜７ヌクレオチド末端ループ、６塩基の上部ステムおよび４またはそれ以上の塩基対の下部ステムからなるヘアピンモチーフ（図１５）である。コンセンサス末端ループは、ＵＵＵＵテトラループまたはＵＵＷＷＵペンタループである。ヘキサ−およびヘプタループは比較的まれである。上部ステムと下部ステムは、ステムの５’−半分中の７ヌクレオチドのバルジが境界となる。上部ステム中の６塩基対のうち４つおよび下部ステムのすべての塩基対は、ワトソン−クリック共変動により支持される。上部ステム中の２つの不変塩基対のうち、１つはループを閉じるＧＣであり、他の１つは非標準的ＧＡである。下部ステムはしばしば４または５塩基対であるが、伸長することができる。上部ステムの配列は強く保存されているが、下部ステムの配列はそうではなく、ＹＲ’塩基対が内部バルジに隣接することが例外である。この塩基対は、上部ステムを伸長する可能性を小さくするように、７ヌクレオチドのバルジの３’位と共変動する。バルジの配列（ＣＵＹＡＲＲＹ）と長さ（７ｎｔ）の両方とも、高度に保存されている。
比較解析では、７ヌクレオチドのバルジ、上部ステムおよび末端ループの５’および３’位は、Ｌ−セレクチン結合に最も直接に関与し易い。具体的には、末端ループの５’Ｕおよび３’Ｕ、上部ステムのＧＣおよびＧＡ塩基対、バルジのＵとＡは、最も可能性のある候補である。下部ステムはその長さと配列が変動するため、直接関与する可能性は低い。結合のためのバルジの重要性は、リガンドＬＦ１５１２（配列番号３５７；Ｋｄ＝３１５ｎＭ）の低い親和性により支持される；このリガンドの最も単純な構造は、ＵＵＵＵテトラループと、７ヌクレオチドのバルジのみが欠如している１０塩基対（ほとんど完全な）コンセンサスステムである。
ファミリー１ｂの推定２次構造は、ファミリー１ａのそれに似ているが、上部ステムは普通７塩基対の長さであり、高度に保存されたコンセンサスを持たない１本鎖バルジは、わずかに４ヌクレオチドの長さである。この構造は、１ａ２次構造の許容される変動であり、上部ステムの長さの増加によりバルジは短くなる。リガンドＬＦ１５１１（配列番号３３２）の親和性は３００ｐＭである。
ファミリー１ｃは、１ａと１ｂに関連するコンセンサス配列ＧＵＵＵＵＣＮＲを有するが、おそらくデータ不足のため納得できる２次構造は明らかではない。ファミリーの最も高度な構造のメンバーであるＬＦ１６１８（配列番号３５１）は、ＵＵＵＵテトラループと７塩基対の「上部」ステムを可能にするが、１ａの下部ステムもコンセンサス７ヌクレオチドのバルジも持っていない。この上部ステムは、１ａと１ｂのループの閉じるＧに隣接する対をなさないＡを有し、不変のＧＡ塩基対を有さないという点で、１ａおよび１ｂとは異なる。ＬＦ１６１８の親和性は中程度の１０ｎＭであり、これはファミリー１ｃはあまり構造を形成しにくいことを示唆する。
ファミリー１リガンドに対する最小の高親和性配列を予測することができ、提唱される２次構造の部分的な試験となる。上部ステムと末端ループＬＦ１５１４Ｔ１（配列番号３８５）のみを含むか、またはこれらの成分＋７ヌクレオチドのバルジ配列ＬＦ１５１４Ｔ２（配列番号３８６）を含むトランケートは、高親和性では結合しないと予測される。一方、下部コンセンサスステムの底部で端を切り取られたリガンドであるＬＦ１５１４Ｔ４（配列番号３８７）およびＬＦ１８０７Ｔ４（配列番号３８８）は、高親和性で結合するであろうという妥当なしかし確固としたものではない予測がある。平衡した比較において、ＬＳ−Ｒｇに対するＬＦ１５１４Ｔ１とＬＦ１５１４Ｔ２の親和性は、全長ＬＤ１５１４（配列番号２９７）に比較して少なくとも１００倍低下しており、一方ＬＦ１５１４Ｔ４の親和性は２倍未満の低下であり、ＬＦ１８０７Ｔ４の親和性の低下は約３倍である。予測されたトランケート親和性と観察されたトランケート親和性の一致は、提唱された２次構造を支持する。
ｓｓＤＮＡリガンドＬＤ２０１Ｔ１（配列番号１８５）と接着阻止抗ヒトＬ−セレクチン抗体ＤＲＥＧ−５６はＬ−セレクチンのレクチンドメインに結合することが知られているため、放射能標識ＬＦ１８０７（配列番号３０９）と非標識ＤＲＥＧ−５６または非標識ＬＤ２０１Ｔ１の間の競合的は、２’−Ｆリガンドが精製されたＬＳ−Ｒｇのレクチンドメインにも結合するかどうかを決定するのに役立ち得る。これらの実験において、ＤＲＥＧ−５６とＬＤ２０１Ｔ１のいずれもＬＦ１８０７の濃度依存性阻害を与えた。完全な阻害は、３００ｎＭのモノクローナル抗体と１μＭのＬＤ２０１Ｔ１で得られた。競合的曲線から計算したＬＳ−Ｒｇの競合物質の親和性は、これらの既知の親和性とよく一致した。これらの結果は、ＬＦ１８０７、ＮＸ２８０およびＤＲＥＧ−５６が同じかまたは重複する結合部位を有するという仮説に一致し、従って２’−ＦリガンドはＬ−セレクチン媒介接着のアンタゴニストであることが予測される。これらの結果もまた、結合オリゴヌクレオチドの５ｍＭ溶出を用いるセレックスプロトコールは、レクチンドメインの結合カルシウムまたはその近くで結合したリガンドを優先的に溶出させるという説を再確認する。
例２６
ヒトＰ−セレクチンに対するｓｓＤＮＡリガンド
ＰＳ−Ｒｇは、レクチン、ＥＧＦ、およびヒトＰ−セレクチンの最初の２つのＣＲＤドメインがヒトＧ１免疫グロブリンのＦｃドメインに結合した、キメラタンパク質である（アール・エム・ネルソン（R.M．Nelson）ら，１９９３，前述）。精製されたキメラは、エー・バルキ（A．Varki）により与えられる。可溶性Ｐ−セレクチンは、アールアンドディーシステムズ（R & D Systems）から購入した。特に明記しない場合は、Ｐ−セレクチン／ＩｇＧ1キメラであるＰＳ−Ｒｇに対するｓｓＤＮＡセレックスで使用したすべての材料は、例７および１３と同じである。
セレックス法は米国特許第５，２７０，１６３号に記載されている。Ｐ−セレクチンの高親和性ｓｓＤＮＡアンタゴニストを進化させる具体的な方策および操作は、例７と１３に記載されている。
例２７
ヒトＰ−セレクチンに対する２’−Ｆ ＲＮＡリガンド
この例に概説する実験方法は、例２８〜３４のヒトＰ−セレクチンに対する２’−Ｆ ＲＮＡリガンドを同定し性状解析するのに使用した。
実験方法
Ａ）材料
ＬＳ−Ｒｇはキメラタンパク質であり、ヒトＰ−セレクチンの細胞外ドメインがヒトＧ２免疫グロブリンのＦｃドメインに結合している（ナガード（Norgard）ら，１９９３，ＰＮＡＳ：１０６８−１０７２）。ＥＳ−ＲｇおよびＣＤ２２β−Ｒｇは、ヒトＧ１免疫グロブリンＦｃドメインに結合したＥ−セレクチンおよびＣＤ２２βの同族作製体である（アール・エム・ネルソン（R.M．Nelson）ら，１９９３，前述；アイ・スタメンコビック（I．Stamenkovic）ら，１９９１，Ｃｅｌｌ ６６：１１３３−１１４４）が、ＬＳ−ＲｇはＩｇＧ２ Ｆｃドメインに結合したＬ−セレクチンを有する。精製されたキメラは、エー・バルキ（A. Varki）により提供された。可溶性Ｐ−セレクチンはアールアンドディーシステムズ（R & D Systems）から購入した。プロテインＡセファロース４ファストフロウビーズは、ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech）から購入した。抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体：Ｇ１はセントコア（Centocor）から得た。２’−Ｆ修飾ＣＴＰとＵＴＰは、ピエケン（Peken）らの方法（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４−３１７）に従って調製した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドはオペロン（Operon）により合成された。他のすべての試薬および化学物質は、市販品を購入した。特に明記していない場合は、実験ではＨＳＭＣ緩衝液（１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）を使用した。
Ｂ）セレックス
セレックス法は、米国特許第５，２７０，１６３号などに詳細に記載されている。ＰＳ−Ｒｇセレックスの合成ＤＮＡ鋳型のヌクレオチド配列は、５０個の位置でランダム化された。この可変領域は、Ｎ８ ５’および３’固定領域が隣接する。５０Ｎ８転写体は、配列 5'gggagacaagaauaaacgcucaa-50N-uucgacaggaggcucacaacaggc 3'（配列番号３９０）を有する。すべてのＣとＵは、リボースの２’−ＯＨと置換された２’−Ｆを有する。ＰＣＲのプライマーは、以下のものである：Ｎ８ ５’プライマー 5'taatacgactcactatagggagacaagaataaacgctcaa 3’（配列番号１９７）
Ｎ８ ３’プライマー5'gcctgttgtgagcctcctgtcgaa 3’（配列番号１９８）。
固定領域は、ＰＣＲとｃＤＮＡ合成のためのプライマーアニーリング部位ならびにコンセンサスＴ７プロモーターを含有し、インビトロ転写を可能にする。初期ＲＮＡプールは、まず１nmolの合成１本鎖ＤＮＡをクレノウで伸長して、次に得られる２本鎖分子をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼで転写させた。クレノウ伸長条件は：反応容量１ｍｌ中３．５nmolのプライマー５Ｎ８、１．４nmolの４０Ｎ８、１×クレノウ緩衝液、０．４ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰである。
以後のラウンドにおいて、溶出したＲＮＡは、１本鎖ｃＤＮＡのＡＭＶ逆転写酵素媒介合成の鋳型であった。これらの１本鎖ＤＮＡ分子は、ＰＣＲ増幅により２本鎖転写鋳型に変換した。ＰＣＲ条件は、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、および２５Ｕ／ｍｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼであった。転写反応物は、０．５ｍＭ ＤＮＡ鋳型、２００ｎＭ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、４０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭスペルミジン、４％ＰＥＧ８０００、１ｍＭずつの２’−ＯＨ ＡＴＰ、２’−ＯＨ ＧＴＰ、３．３ｍＭずつの２’−Ｆ ＣＴＰ、および２’−Ｆ ＵＴＰ、および２５０ｎＭ α−３２Ｐ ２’−ＯＨ ＡＴＰを含有した。
ＰＳ−Ｒｇ／ＲＮＡ複合体を非結合ＲＮＡから分離する方策は、Ｌ−セレクチンに対するリガンドについて例７に記載の方策と実質的に同じである（表１８）。
３７℃で行った初期のセレックスラウンドでは、固定化ＰＳ−Ｒｇの密度は２０pmol/ μｌプロテインＡセファロース４ファストフロウビーズであった。後期のラウンドでは、選択の厳密性を増加させるため、ＰＳ−Ｒｇの密度は必要に応じて減少させた（表１８）。第２ラウンドから開始して、しばしばセレックスを２つ以上のＰＳ−Ｒｇ密度で行った。各ラウンドで１つのみのＰＳ−Ｒｇ密度から溶出した材料は前に運搬された。
各ラウンドの前に、ＲＮＡを２ｍｌのシリコーン化カラム中で１００μｌのプロテインＡセファロースビーズに１時間バッチ吸着させた。非結合ＲＮＡと最小の洗浄（２倍量）で溶出したＲＮＡを合わせて、セレックス投入材料として使用した。セレックスのために、充分洗浄し、固定化したＰＳ−Ｒｇを前吸着したＲＮＡと０．５〜１時間、２ｍｌのシリコーン化カラム中で絶えず混合しながらバッチインキュベートした。非結合ＲＮＡは、充分にバッチ洗浄して除去した（５００μｌ ＨＳＭＣ／洗浄）。結合ＲＮＡは２つの画分として溶出した。まず、結合ＲＮＡを２価陽イオンのないＨＳＭＣ中の５ｍＭ ＥＤＴＡでインキュベートおよびカラムを洗浄した。第２に、残存する溶出可能なＲＮＡを、２価イオンのないＨＳＭＣ中の５０ｍＭ ＥＤＴＡでインキュベートおよび／または洗浄して除去した。溶出した投入ＲＮＡを表１８に記録する。すべてのラウンドで、ＰＳ−Ｒｇのない等量のプロテインＡセファロースビーズを、セレックスビーズと同様に処理して、バックグランド結合を測定した。非吸着、洗浄および溶出画分をベックマン（Beckman）ＬＳ６５００シンチレーションカウンター中で計測して、各ラウンドのセレックスを追跡した。
溶出した画分は以下のラウンドで使用するために処理した（表１８）。エタノール（２．５倍量）中の３００ｍＭの酢酸ナトリウムで沈殿させた後、ＲＮＡを８０μｌのＨ２Ｏに再懸濁し、４０μｌをＡＭＶ逆転写酵素により、４８℃で３０分間、５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ８．３）、６０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）2、１０ｍＭ ＤＴＴ、２００pmol ＤＮＡプライマー、０．４ｍＭずつのｄＮＴＰ、０．４Ｕ／μｌ ＡＭＶ ＲＴ中で、ｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ産物の転写体を次のセレックスを開始するために使用した。
Ｃ）ニトロセルロースフィルター結合測定法
セレックス特許出願に記載されているように、ニトロセルロースフィルター分離法を使用して、ＰＳ−Ｒｇおよび他のタンパク質に対するＲＮＡリガンドの親和性を測定した。フィルターディスク（ニトロセルロース／酢酸セルロース混合マトリックス、孔径０．４５μＭ、ミリポア（Millipore））を、真空マニホールド上に置き、真空下でＨＳＭＣ緩衝液２ｍｌで洗浄した。３２Ｐ標識ＲＮＡプールと非標識ＰＳ−Ｒｇを含有する反応混合物を、ＨＳＭＣ中で４℃、室温または３７℃で１０〜２０分間でインキュベートし、濾過し、次に直ちに同じ温度でＨＳＭＣ ４ｍｌで洗浄した。フィルターを空気乾燥し、フルロール無しでベックマン（Beckman）ＬＳ６５００液体シンチレーションカウンターで計測した。
ＰＳ−Ｒｇは、ヒトＰ−セレクチンの細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列をヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードするＤＮＡに融合させて作製される組換え遺伝子の発現産物であるダイマータンパク質である。親和性の計算のために、ＰＳ−Ｒｇモノマー１つ当たり１つのリガンド結合部位があると仮定した（ダイマー当たり２つ）。モノマー濃度は、ＰＳ−Ｒｇダイマー濃度の２倍であると規定する。ＲＮＡプールまたは特異的リガンドに対する平衡解離定数（Ｋd）は、例７段落Ｃに記載のように計算される。
Ｄ）クローニングと配列決定
第１２ラウンドのＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄIII 制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーとともに再増幅した。これらの制限部位を用いて、ＤＮＡ配列をｐＵＣ９ベクターに方向をそろえて挿入した。これらの組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）に形質転換した。プラスミドＤＮＡをアルカリ加水分解法（ＰＥＲＦＥＣＴｐｒｅｐ、５’−３’、ボールダー（Boulder）、コロラド州）で調製した。約５０クローンをシーケナーゼプロトコール（アマシャム（Amersham）、アーリントンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）を用いて配列決定した。得られたリガンド配列を表１９に示す。
Ｅ）境界実験
各リガンドの最小の高特異性配列を境界実験により決定した（ツエルク（Turek）ら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１３：７４９）。３’境界のために５’末端で３２Ｐ−標識したＲＮＡリガンド、５’境界のために３’末端で３２Ｐ−標識したＲＮＡリガンドの各ＲＮＡリガンドを、５０ｍＭＮａ2ＣＯ3（ｐＨ９）中で９５℃で８分間加水分解する。得られる部分加水分解物は、末端標識分子の集団を含有し、その加水分解された末端は、全長分子中の各プリン位置に対応する。加水分解物をＰＳ−Ｒｇ（５倍以上および以下の濃度、およびリガンドについて測定されたＫｄで）とともにインキュベートした。ＲＮＡ濃度はＫｄより有意に低い。反応物を室温で３０分間インキュベートし、濾過し、次に同じ温度で５ｍｌのＨＳＭＣで直ちに洗浄した。結合したＲＮＡをフィルターから抽出し、ＰＳ−Ｒｇとインキュベートされていない加水分解ＲＮＡの隣で８％変性性ゲルで電気泳動する。解析は、ツエルク（Turek）ら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１３：７４９に記載される通りである。
Ｆ）２’−Ｏ−メチル置換実験
ヌクレアーゼ消化に対する２’−ＦピリミジンＲＮＡリガンドの感受性を低下させるために、グリーン（Green）ら（１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７：６０−６８）が記載したように、セレックス後実験を行って、親和性を喪失することなく２’−ＯＭｅプリンで置換できる２’−ＯＨプリンを同定した。簡単に説明すると、それぞれ３つの混合した位置を有する７つのオリゴヌクレオチドを合成した。混合位置は、２：１の２’−ＯＨ：２’−ＯＭｅで合成されたＲＮＡ内の２’−ＯＨ精製ヌクレオチドとして規定される。２’−ＯＨの結合効率は、２’−ＯＭｅより低いため、得られるＲＮＡは各混合位置で２５〜５０％の２’−ＯＨを有する。次に３２Ｐ末端標識ＲＮＡリガンドを、非修飾リガンドのＫｄの２倍より高いおよび２．５倍未満の濃度のＰＳ−Ｒｇと、室温で３０分間インキュベートした。結合したＲＮＡ（選択されたＲＮＡ）をフィルターから抽出し、次に、結合および濾過していないＲＮＡ（非選択ＲＮＡ）と平衡して５０ｍＭ Ｎａ2ＣＯ3（ｐＨ９）中で９５℃で８分間加水分解する。選択されたＲＮＡを次に、非選択ＲＮＡの隣で２０％変性ゲルで電気泳動する。
特定の位置の２’−ＯＭｅ置換の結合親和性に及ぼす影響を調べるために、問題の位置に対応する非選択：選択バンドの強度の比を計算する。位置を混合した時の比選択：選択比を、位置を混合しない時の実験からのその位置についての平均比と比較する。混合した位置の比選択：選択比が、位置を混合しない時の比より有意に大きい場合、２’−ＯＭｅは親和性が上昇し得る。比が有意差がない場合、２’−ＯＭｅ置換は効果がない。
Ｇ）細胞結合試験
進化したリガンドプールおよびクローン化リガンドが、細胞表面に提示されているＰ−セレクチンに結合する能力は、ヒト血小板懸濁液を用いる実験で試験した。健常志願者から採取した全血をバキュテイナー（Vacutainer）６４５７試験管に採った。採取５分間以内に、４８５μｌの血液を、１５μｌのバイオデータトロンビネックス（Bio/Data THROMBINEX）で室温で５分間刺激した。刺激した血液の１００μｌのアリコートを、１ｍｌの４℃のＢＢ−（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．３５）、５ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％アジ化ナトリウム）に移し、７３５×ｇで５分間遠心分離した。この工程を繰り返し、得られたペレットを１ｍｌの４℃のＢＢ＋（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭヘペス（ｐＨ７．３５）、５ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％アジ化ナトリウム、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2）に再懸濁した。
抗原発現を検出するために、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ６１またはＰＥ結合抗ＣＤ６２抗体を含有する１５μｌのＢＢ＋（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））を１０μｌの血小板懸濁液とともに、４℃で２０〜３０分間インキュベートした。これを４℃のＢＢ＋で２００μｌに希釈し、ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒで、４８８nmでの励起とＦＬ１（５３０nm蛍光）またはＦＬ２（５８０nm蛍光）を使用して、血小板について機械をライブゲーティングして解析した。このゲートで１０００〜５０００イベントを記録した。
オリゴヌクレオチドリガンド結合を検出するために、ＦＩＴＣまたはビオチンに結合したリガンドを含有する１５μｌのＢＢ＋を１０μｌの血小板懸濁液とともに、４℃で２０〜３０分間インキュベートした。ＦＩＴＣ結合リガンドを４℃のＢＢ＋で２００μｌに希釈し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーターで解析した。ビオチン化リガンド反応物をストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＳＡ−ＰＥ）（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））で４℃で２０分間インキュベートし、次に希釈し解析した。５００μｌのＢＢ＋による洗浄工程と７００×ｇの遠心分離は、結果の質に影響を与えることなく使用した。血小板上で発現されるＰ−セレクチンへの結合（ＣＤ６２Ｐ）の特異性を、Ｐ−セレクチン特異的阻止モノクローナル抗体（Ｇ１）と競合させて試験した。結合の飽和性は非標識ＲＮＡとの自己競合により試験した。
Ｆ）シアリル−ルイスXへのセレクチン結合の阻害
進化したＲＮＡプールまたはクローン化リガンドが、ＰＳ−Ｒｇのシアリル−ルイスXへの結合を阻害する能力を、競合ＥＬＩＳＡ測定法により試験した（シー・フォックサル（C．Foxall）ら，１９９２，前述）。これらの測定のために、コーニング（Corning）（２５８０１）９６マイクロタイタープレートのウェルを１００ngのシアリル−ルイスX／ＢＳＡ結合体でコーティングし、一晩空気乾燥し、３００μｌのＰＢＳ（−）で洗浄し、次にＨＳＭＣ中の１％ＢＳＡで室温で６０分間阻止した。ＲＮＡリガンドをＨＳＭＣ／１％ＢＳＡ中のＰＳ−Ｒｇと室温で１５分間インキュベートした。阻止溶液の除去後、５０μｌのＬＳ−Ｒｇ（１０ｎＭ）またはＰＳ−Ｒｇ（１０ｎＭ）／ＲＮＡリガンドミックスを、コーティングし阻止したウェルに加え、室温で６０分間インキュベートした。結合溶液を除去し、ウェルを３００μｌのＰＢＳ（−）で洗浄し、次にＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧと室温でプローブ結合させ、ＰＳ−Ｒｇ結合を定量した。ＯＰＤペルオキシダーゼ基質（シグマ（Sigma）Ｐ９１８７）と室温で暗所で３０分間インキュベート後、ＰＳ−Ｒｇ結合の程度と阻害パーセントをＯＤ４５０から求めた。
例２８
ヒトＰ−セレクチンに対する２’−Ｆ ＲＮＡリガンド
Ａ．セレックス
セレックスの出発ＲＮＡプールであるランダム化された５０Ｎ８（配列番号３９０）は、約１０１５分子（１nmolのＲＮＡ）を含有した。セレックスプロトコールは表１８に概説される。ＰＳ−Ｒｇに対するランダム化されたＲＮＡの解離定数は、約２．５μＭであると推定される。セレックスからの５ｍＭ ＥＤＴＡによるＲＮＡ溶出プロフィールとバックグランドビーズは８倍の差が観察され、５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶出では表１８のバックグランドに対して３０〜４０倍過剰に産生された。ラウンド１〜３では、５ｍＭおよび５０ｍＭで溶出されたＲＮＡをプールし、次のラウンドのために処理した。ラウンド４からは、５ｍＭ溶離物を次のラウンドのために処理した。選択の厳密性を上昇させるために、固定化ＰＳ−Ｒｇの密度をラウンド２で５倍低下させ、カラムから溶離液される画分を減少させるからなく再度ラウンド３で低下させた。固定化ＰＳ−Ｒｇの密度をラウンド４でさらに１．６倍低下させ、ラウンド８までこの密度を維持し、後のラウンドでタンパク質密度をさらに低下させた。選択するプールの親和性は急速に低下し、プールは徐々に２相性結合性を進化させた。
第１２ラウンドのＲＮＡを用いる結合実験は、Ｐ−セレクチンの進化するプールの親和性は温度感受性でないことを明らかにした。第２、６、１１、および１２のＲＮＡプールのバルク配列決定は、ラウンド１２までに検出可能な非ランダム性があることを明らかにした。第６ラウンドＲＮＡは、解離定数がカルシウム８５ｎＭで３７℃で１相性に結合し、第１１および１２ラウンドのＲＮＡは、それぞれカルシウム１００および２０ｐＭの高親和性Ｋｄで２相性に結合した。試験したプールの結合は２価陽イオンを必要とした。２価陽イオンの非存在下では、第１２ラウンドのプールのＫｄは＞１０ｎＭに増加した。（ＨＳＭＣ、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を除去し、２ｍＭ ＥＤＴＡを加える）。第１２ラウンドのプールは、ＰＳ−Ｒｇに対して高親和性を示し、測定されたＫｄはそれぞれＥＳ−ＲｇとＬＳ−Ｒｇについて１．２μＭと４．９μＭであった。
Ｂ．ＲＮＡ配列
表１９においてリガンド配列は標準的１文字コードで示す（コーニッシュ−ボウデン（Cornish-Bowden），１９８５ ＮＡＲ １３：３０２１−３０３０）。固定領域配列を小文字で示す。特に明記していない場合は、各クローンは定義により進化した配列と関連する固定配列の両方を含有する。第１２ラウンドから、４４の配列決定したリガンドの２１はユニークであった。ユニークな配列とは、他のすべてのものから３つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なるものであると、機能的に定義される。２回以上単離された配列は、括弧付きの数字（ｎ）で示し、その後にリガンド単離数を示す。これらのクローンは５つの配列ファミリー（１〜５）と２つの無関係の配列（オーファン）の群に分類される（配列番号１９９〜２１９）。
ファミリー１は、１３の独立した系統からの２３リガンドである。コンセンサス配列は、２つの種々のスペースのある配列（ＣＵＣＡＡＣＧＡＭＣおよびＣＧＣＧＡＧ（表１９））からなる。１３リガンドのうち１１で、コンセンサスのＣＵＣＡＡは５’固定領域からであり、従って変動を最小にし、ＣＵＣＡＡまたは対をなすＧＡＧの重要性を解釈する信頼性を低下させる（例２７参照）。
ファミリー２〜５は、コンセンサス配列の決定を前提にする単一の配列の複数単離物により規定される。
Ｄ．親和性
代表的リガンド（すべてのオーファンを含む）の解離定数は、ニトロセルロースフィルター結合実験で測定され、結果を表２０に示す。これらの計算では、１つのキメラに対して２つの結合部位があると仮定する。ランダムＲＮＡの親和性は、約２．５μＭであると推定される。
一般に、リガンドは３７℃で１５ｐＭ〜４５０ｐＭの範囲の解離定数で１相性に結合する。ファミリー１〜４の全長リガンドは、温度感受性を示さない。観察された親和性は、炭水化物リガンドより数オーダー大きい親和性を有するオリゴヌクレオチドリガンドを単離することが可能であるという説を支持している。
例２９
２’−Ｆ ＲＮＡリガンドの特異性
ＥＳ−Ｒｇ、ＬＳ−Ｒｇ、およびＣＤ２２β−Ｒｇに対するＰ−セレクチンリガンドの親和性は、ニトロセルロース分離法により測定した。表２０に示すように、リガンドはＰ−セレクチンに対して特異性が高い。一般に、ＥＳ−ＲｇおよびＬＳ−Ｒｇに対するリガンドの親和性は、ＰＳ−Ｒｇに対するより１０４倍低い。バックグランドより大きい結合は、試験した最も高いタンパク質濃度（６６０ｎＭ）でもＣＤ２２β−Ｒｇについては観察されず、リガンドはキメラ作製体のＦｃドメインに結合しないこと、および無関係のレクチンのシアル酸結合部位に対する親和性を持たないことを示す。オリゴヌクレオチドリガンド結合の特異性は、セレクチンによる同系の炭水化物の結合と非常に対照的なものであり、セレックスリガンドは炭水化物リガンドより大きな特異性を有するという説を確認している。
例３０
シアリル−ルイス Ｘ への結合の阻害
２〜５ｍＭ ＥＤＴＡにより溶出されるオリゴヌクレオチドリガンドは、その結合エネルギーの一部を、レクチンドメインの結合Ｃａ＋＋との接触から得ると考えられ、従って結合についてシアリル−ルイスXと競合すると考えられる。競合測定法では、選択されたオリゴヌクレオチドリガンドは、固定化されたシアリル−ルイスXへのＰＳ−Ｒｇの結合を、ＩＣ50が１〜４ｎＭの範囲で競合的に阻害する（表２０）。具体的には、リガンドＰＦ３７７（配列番号２０６）のＩＣ５０は約２ｎＭである。完全な阻害は１０ｎＭのリガンドで得られる。この結果は、高親和性リガンドに典型的であり、実験条件下で妥当なものである。そのＫｄがＰＳ−Ｒｇ濃度（１０ｎＭ）よりはるかに低いリガンドのＩＣ50は、タンパク質濃度に限定され、ＰＳ−Ｒｇ濃度の約半分であると予測される。競合の特異性は、固定化されたシアリル−ルイスXへのＰＳ−Ｒｇの結合をラウンド２のＲＮＡ（Ｋｄ〜１μＭ）が阻害できないことにより証明される。これらのデータは、２’−Ｆ ＲＮＡリガンドが、ＰＳ−Ｒｇの機能的アンタゴニストであることを証明している。
例３１
高親和性リガンドの２次構造
好適な例において、整列した配列の比較解析は、２次構造と構造−機能相関関係の推定を可能にする。配列中の２つの位置のヌクレオチドがワトソン−クリック塩基対合規則に従って共変動するなら、これらの位置のヌクレオチド配列は対合し易い。非保存配列、特に長さが変化するものは、機能に直接関係しにくく、高度に保存された配列は、直接関係し易い。
ファミリー１の整列の比較解析は、そのステムが３つの非対称内部ループを含有するヘアピンモチーフを示唆する（図１６）。図ではコンセンサス位置を示し、不変ヌクレオチドは太字で記載される。ステムの右側は、同じ線の上にあるステム中の位置の特定の塩基対の存在の数を示すマトリックスである。このマトリックスは、ステムの９つの塩基対のうち６つはワトソン−クリック共変動により支持されることを示す。２つのコンセンサスモチーフ（ＣＵＣとＧＡＧ）は、ステムの末端を形成する。結合における末端の直接的役割に関する結論は、変動を制限する固定配列（１３リガンドのうち１１）の使用により影響される。ループの配列と長さの可変性は、これが結合に直接関与していないことを示唆する。この結論は、コンセンサスモチーフの循環的置換であるリガンドＰＦ４２２（配列番号２０２）により強化される。ステムの半分を２つ連結するループは他のリガンドの反対の末端にあるが、ＰＦ４２２は高親和性（Ｋｄ＝１７２ｐＭ；表２１）で結合する。
例３２
境界実験
例２７に記載したように多くのＰ−セレクチンリガンドについて境界実験を行った。ファミリー１リガンドの結果は、その提唱される２次構造と一致する。複合体境界分子種はサイズが３８〜９０ヌクレオチドまで変動するが、ファミリー１では４０〜４５である。これらの端を切り取ったリガンドの親和性は、表２２に示す。一般にトランケートは、全長に比較して親和性が１０倍以上低下しており、シアリル−ルイスXへのＰＳ−Ｒｇの結合を有効に阻害し、ＰＳ−Ｒｇの結合特異性を維持する（表２２）。これらのデータは、ＲＮＡリガンドの最小の高親和性結合成分を同定する境界方法を証明している。
例３３
ヒト血小板への２’−Ｆ ＲＮＡリガンドの結合
精製されたタンパク質に対してＰ−セレクチンリガンドが単離されたため、細胞表面に提示されるＬ−セレクチンにこれらが結合できることを、活性化ヒト血小板を用いるフローサイトメトリー実験で測定した。血小板は、サイドスキャター（side scatter）とＣＤ６１伸長によりゲーティングした。ＣＤ６１は、休止血小板と活性化血小板の両方の表面で構成的に発現される。Ｐ−セレクチンの発現は、抗ＣＤ６２Ｐモノクローナル抗体（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson））により追跡した。ビオチン化ＰＦ３７７ｓ１（配列番号２２３）／ＳＡ−ＰＥ（例２７段落Ｇ）で染色した活性化血小板の蛍光強度は、同様に染色した休止血小板より５倍以上大きい。力価測定実験において、最大の半分の蛍光は約５０ｐＭ ＰＦ３７７ｓ１（ＥＣ５０）で起き、これはＰＳ−Ｒｇに対する平衡解離定数である６０ｐＭに一致する。血小板への結合は、飽和性であるという基準で特異的である。飽和性は、力価測定のみでなく非標識ＰＦ３７７ｓ１との競合によっても証明されている。
血小板への結合は、１）ＰＳ−Ｒｇに結合しないオリゴヌクレオチドが血小板に結合する；２）ＰＦ３７７ｓ１の血小板への結合は２価陽イオン依存性であり、そして最も重要なことは３）結合は抗Ｐ−セレクチン接着阻止モノクローナル抗体であるＧ１により阻害されるが、イソタイプ対照抗体によっては阻害されない、という基準でＰ−セレクチン特異的である。これらのデータは、細胞表面Ｐ−セレクチンに対する高特異性リガンドを単離するために、固定化され精製されたタンパク質を使用することの実現可能性を確認している。
例３４
２’−Ｏメチル置換実験
例２７段落Ｆに記載したようにリガンドＰＦ３７７ｓ１（配列番号２２３）について２’−ＯＭｅプリン置換を行い、その結果を表２３に示す。データは、７〜９、１５、２７、２８、および３１位の２’−ＯＭｅプリンは結合を促進し、一方１３、１４、１６、１８、２１、２２、２４、および３０位の置換は親和性に対してほとんどまたは全く影響しないことを示す。すなわち、１５までの位置は置換しても活性はほんのわずかに低下するのみであるようである。この推測の部分的確認として、１１の位置で２’−ＯＭｅプリンで同時に置換した３７７ｓ１（ＰＦ３７７Ｍ６，配列番号２３５）の親和性は２５０ｐＭである（表２２）。
例３５
ヒトＰ−セレクチンに対する２’−ＮＨ 2 ＲＮＡリガンド
本例で説明する実験方法は、ヒトＰ−セレクチンに対する２’−ＮＨ２ＲＮＡリガンドを同定し性状解析するために例３６〜３８で使用した。
実験方法
Ａ）材料
他に特に明記しない場合は、Ｐ−セレクチン／ＩｇＧ１キメラ（ＰＳ−Ｒｇ）
に対する２’−ＮＨ2ＲＮＡセレックスで使用したすべての材料は、例２７と同じであった。２’−ＮＨ2修飾ＣＴＰとＵＴＰはピエケン（Peken）ら（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４−３１７）に従って調製した。セレックス実験の緩衝液は、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０．０ｍＭヘペス（ｐＨ７．４）を使用した。
Ｂ）セレックス
セレックス法は、米国特許第５，２７０，１６３号などに詳細に記載されている。ＰＳ−Ｒｇセレックスのための合成ＤＮＡ鋳型のヌクレオチド配列は、５０個の位置でランダム化された。この可変領域は、Ｎ８ ５’および３’固定領域が隣接する。この転写体５０Ｎ８は、5'gggagacaagaauaaacgcucaa-50N-uucgacaggaggcucacaacaggc 3'（配列番号２４８）を有する。すべてのＣとＵは、リボースの２’−ＯＨと置換された２’−ＮＨ2を有する。Ｐ−セレクチンに対する２’−ＮＨ2オリゴヌクレオチドリガンドを単離するために使用した方法は、例２７で２’−Ｆリガンドについて記載したものと同じであるが、転写反応では、１ｍＭずつの３．３ｍＭの２’−ＣＴＰと２’−ＵＴＰの代わりに２’−ＮＨ２−ＣＴＰと２’−ＮＨ２−ＵＴＰである。
Ｃ）ニトロセルロースフィルター結合測定法
セレックス特許出願および例２７段落Ｃに記載されているように、ニトロセルロースフィルター分離法を使用して、ＰＳ−Ｒｇおよび他のタンパク質に対するＲＮＡリガンドの親和性を測定した。これらの実験のために、例２３に記載のギブコビーアールエル（GibcoBRL）９６ウェルマニホールドまたは１２ウェルのミリポア（Millipore）マニホールド（例７Ｃ）を使用した。結合データは、例７段落Ｃに記載のように解析した。
Ｄ）クローニングと配列決定
第１２ラウンドのＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄIII 制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有するプライマーとともに再増幅した。例７段落Ｄに記載の方法を使用して約７５個のリガンドをクローン化し配列決定した。得られた配列を表２５に示す。
Ｅ）細胞結合実験
細胞表面に提示されたＰ−セレクチンに進化した長さプールが結合する能力を、例７段落Ｅで記載したようにヒト血小板懸濁液を用いるフローサイトメトリー実験で試験した。
例３６
ヒトＰ−セレクチンに対する２’−ＮＨ 2 ＲＮＡリガンド
セレックスの出発２’−ＮＨ2ＲＮＡプールであるランダム化された５０Ｎ８（配列番号２４８）は、約１０１５分子（１nmolの２’−ＮＨ２ＲＮＡ）を含有した。ＰＳ−Ｒｇに対するランダム化されたＲＮＡの解離定数は、約６．４μＭＭであると推定される。セレックスプロトコールは表２４に示す。
セレックスの初期ラウンドは、プロテインＡセファロースビーズ１μｌ当たり２０pmolのＰＳ−Ｒｇ密度で３７℃で行った。以後のラウンドはすべて３７℃で行ったが。初期のラウンドで、５ｍＭ ＥＤＴＡ溶出でバックグランドより高いシグナルはなかったが、５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶出ではバックグランドより７倍高いシグナルがあった。従って２つの溶出液を合わせて、以後のラウンドのために処理した。この方法をラウンド６まで続けた。ラウンド７から開始して５ｍＭ ＥＤＴＡ溶出液のみを以後のラウンドのために処理した。選択の厳密性を増加させるために、ラウンド６で固定化ＰＳ−Ｒｇの密度を１０倍低下させ、後のラウンドでタンパク質密度をさらに低下させた。これらの条件下で、選択されたプールの親和性の急速な上昇が観察された（表１１）
第１２ラウンドのＲＮＡを用いる結合実験は、Ｐ−セレクチンの進化するプールの親和性は、３７℃で選択を行うにもかかわらず温度感受性であることを明らかにした（４℃、室温、３７℃でそれぞれＫｄ：１３ｎＭ、９１ｎＭおよび３９０ｎＭ）。ＲＮＡプールのバルク配列決定は、ラウンド１０で劇的な非ランダム性があることを示し、ラウンド１２では多くの目に見える変化はなかった。ラウンド１２からリガンドをクローン化し配列決定した。
Ｂ．２’−ＮＨ2 ＲＮＡ配列
表２５においてリガンド配列は標準的１文字コードで示す（コーニッシュ−ボウデン（Cornish-Bowden），１９８５ ＮＡＲ １３：３０２１−３０３０）（配列番号２５１−２９０）。進化したランダム領域は表２５に大文字で示す。固定領域の任意の部分を小文字で示す。特に明記していない場合は、各クローンは定義により進化した配列と関連する固定配列の両方を含有する。１２ラウンドから、４０／６１の配列決定したリガンドがユニークであった。ユニークな配列とは、他のすべてのものから３つまたはそれ以上のヌクレオチドが異なるものであると、機能的に定義される。２回以上単離された配列は、括弧付きの数字（ｎ）で示し、その後にリガンド単離数を示す。ファミリー１からのリガンドは、１６／６１の配列を含有する最終プールを支配し、これらは複数系統に由来する。ファミリー２と３は、単一の配列の突然変異性変化により示される。「その他」と記載した配列は、明らかな類似性を有さない。ファミリー１は、コンセンサス配列ＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣ（配列番号２９１）が特徴である。
Ｃ．親和性
代表的リガンドの解離定数は、表２６に示す。これらの計算では、１つのキメラに対して２つのＲＮＡリガンド結合部位があると仮定する。ランダム２’−ＮＨ2ＲＮＡの親和性は約１０μＭであると推定される。
３７℃では、解離定数は６０ｐＭ〜５０ｎＭの範囲であり、これはランダム化された２’−ＮＨ2ＲＮＡより少なくとも１×１０３〜１×１０５倍の改善である（表２６）。４℃では、クローンＰＡ３５０（配列番号２５２）の著しい温度感受性の上昇があり、親和性は６倍増加した（表２６）。進化した２’−ＮＨ２ＲＮＡリガンドプールの観察された親和性は、炭水化物リガンドより数オーダー大きい親和性を有するオリゴヌクレオチドリガンドを単離することが可能であるという説を再確認している。
例３７
Ｐ−セレクチンに対する２’−ＮＨ 2 ＲＮＡの特異性
ＥＳ−ＲｇとＥＳ−Ｒｇに対するＰＡ３５０（配列番号２５２）の親和性は、ニトロセルロース分離法により測定し、結果を表２６に示す。これらのリガンドはＰ−セレクチンに対して非常に特異的である。ＰＳ−Ｒｇに対する親和性より、ＥＳ−Ｒｇの親和性は約６００倍低く、ＬＳ−Ｒｇに対する親和性は約５×１０５倍低い。バックグランドより大きい結合は、ＣＤ２２β−Ｒｇについては観察されず、リガンドはキメラ作製体のＦｃドメインに結合しないこと、および無関係のシアル酸結合部位に対する親和性を持たないことを示す。
オリゴヌクレオチドリガンド結合の特異性は、セレクチンによる同系の炭水化物の結合と非常に対照的なものであり、セレックスリガンドは炭水化物リガンドより大きな特異性を有するという説を確認している。
例３８
細胞結合試験
例２３段落Ｇに記載のように、ＦＩＴＣ標識リガンドＰＡ３５０（配列番号２５２）が、血小板細胞表面に提示されているＰ−セレクチンに結合する能力について、フローサイトメトリー実験により試験した。
Ｐ−セレクチンへの結合に対するＦＩＴＣ−ＰＡ３５０の特異性は、ＦＩＴＣ−ＰＡ３５０と非標識阻止モノクローナル抗体Ｇ１を、刺激した血小板に同時に加える競合実験で試験した。Ｇ１は血小板への結合についてＦＩＴＣ−ＰＡ３５０と有効に競合し、イソタイプの一致した対照はほとんどまたは全く効果はなく、これはＦＩＴＣ−ＰＡ３５０がＰ−セレクチンに特異的に結合することを示す。結合の特異性は、オリゴヌクレオチド結合は飽和性であり、１０ｎＭのＲＮａｓｅ保護測定法は２００ｎＭの非標識ＰＡ３５０により阻害されるという観察結果により、さらに証明される。さらにＦＩＴＣ−ＰＡ３５０の結合は、２価陽イオンに依存し、１０ｎＭのＦＩＴＣ−ＰＡ３５０では、活性化血小板は５ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で過剰の自己蛍光でも染色されない。
これらのデータは、細胞表面タンパク質に対するリガンドを単離するために固定化され精製されたタンパク質を使用することの実現可能性、および細胞表面のＰ−セレクチンに対するラウンド２’−ＮＨ2リガンドの結合特異性を確認している。
全血中の白血球へのＬＤ２０１Ｔ１の結合は、フローサイトメトリーにより調べた。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ＬＤ２０１Ｔ１は、ヒトリンパ球および好中球に特異的に結合し（図１１Ａ／Ｂ）；結合は、ＤＲＥＧ−５６、非標識ＬＤ２０１により競合、および４ｍＭ ＥＤＴＡの添加により阻害される（図１１Ａ／Ｂ）。これらの細胞結合試験は、ＬＤ２０１Ｔ１は、リンパ球および好中球上のヒトＬ−セレクチンに飽和的にかつ特異的に結合することを証明している。
例３９
シアリル−ルイス X へのＰ−セレクチン結合の阻害
競合測定法において、リガンドＰＡ３４１（配列番号２５１）とＰＡ３５０（配列番号２５２）は、固定化されたシアリル−ルイスXへのＰＳ−Ｒｇの結合を、ＩＣ５０が２〜５ｎｎＭの範囲で競合的に阻害する（表２６）。この結果は、高親和性リガンドに特異的であり、実験条件下で妥当である。そのＫｄがＰＳ−Ｒｇ濃度（１０ｎＭ）よりはるかに低いリガンドのＩＣ５０が、タンパク質濃度により限定され、ＰＳ−Ｒｇ濃度の約半分であると予測される。競合的の特異性は、固定化シアリル−ルイスXへのＰＳ−Ｒｇの結合をラウンド２ＲＮＡ（Ｋｄ〜１μＭ）が阻害できないことにより証明される。これらのデータは、２’−ＮＨ2ＲＮＡがＰ−セレクチンの機能的アンタゴニストであることを証明する。
例４０
ヒトＥ−セレクチンに対する２’−ＮＨ 2 ＲＮＡリガンド
ＥＳ−Ｒｇは、ヒトＥ−セレクチンの細胞外ドメインがＧ１免疫グロブリンのＦｃドメインに結合しているキメラタンパク質である（アール・エム・ネルソン（R.M．Nelson）ら，１９９３，前述）。精製されたキメラはエー・バルキ（A．Varki）により提供される。特に明記しない場合は、このセレックスで使用したすべての材料は、例７と１３に類似している。
セレックス方法は、米国特許第５，２７０，１６３号などに記載されている。
この理論と実験方法は、例７と１３に記載したものと同じである。
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ＷＧＡ ２’−ＮＨ2 ＲＮＡリガンドのコンセンサスヘアピン２次構造を示す：（ａ）ファミリー１、（ｂ）ファミリー２および（ｃ）ファミリー３。ヌクレオチド配列は、標準的１文字コードで記載される。不変ヌクレオチドは太字で記載される。固定配列から得られるヌクレオチド配列は小文字で記載される。 末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）に対するＬ−セレクチンセレックスの第２および第９ラウンドの２’−ＮＨ2 ＲＮＡプールの結合曲線を示す。 図３は、末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）に対するランダム４０Ｎ７ ２’−ＮＨ2ＲＮＡ（配列番号６４）とクローン化Ｌ−セレクチンリガンドであるＦ１４．１２（配列番号７８）の結合曲線を示す。 末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）に対する５ｎＭの３２Ｐ−標識Ｆ１４．１２（配列番号７８）の結合を、上昇する濃度の非標識Ｆ１４．１２（配列番号７８）と競合させた競合実験の結果を示す。 末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）（１０７／ｍｌ）に対する５nMの３２Ｐ−標識Ｆ１４．１２（配列番号７８）の結合を、上昇する濃度の阻止モノクローナル抗Ｌ−セレクチン抗体、ＤＲＥＧ−５６、またはイソタイプの一致した陰性対照抗体と競合させた競合実験の結果を示す。結合ＲＮＡは、１００×（競合物質の存在下で結合したネットカウント／競合物質の非存在下で結合したネットカウント）である。 固定化されたシアリル−ルイスX／ＢＳＡ結合体への可溶性ＬＳ−Ｒｇの結合を、上昇する濃度の非標識Ｆ１４．１２（配列番号７８）と競合させた競合実験の結果を示す。ＬＳ−Ｒｇの結合は、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ抗体で追跡した。結合したＬＳ−Ｒｇは、１００×（競合物質の存在下でのＯＤ４５０）／（（競合物質の非存在下でのＯＤ４５０）である。観察されたＯＤ４５０は、実験値からＬＳ−Ｒｇの非存在下でのＯＤ４５０を引いて、非特異結合について補正した。競合物質の非存在下でのＯＤ４５０は０．３２４であり、ＬＳ−Ｒｇの非存在下でのＯＤ４５０は０．０５２であった。ＬＳ−Ｒｇの結合には２価陽イオンが必要である。競合物質の非存在下では、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋が４ｍＭ ＥＤＴＡにより置換され、ＯＤ４５０が０．０４５に低下した。 Ｌ−セレクチン２’−ＮＨ２ ＲＮＡリガンドのヘアピン２次構造を示す：（ａ）Ｆ１３．３２（配列番号６７）、ファミリーＩ；（ｂ）６．１６（配列番号８４）、ファミリーIII ；および（ｃ）Ｆ１４．１２（配列番号７８）、ファミリーII。ヌクレオチド配列は、標準的１文字コードで記載される。不変ヌクレオチドは太字で記載される。固定配列から得られるヌクレオチド配列は小文字で記載される。 各ダイマーおよびマルチマーオリゴヌクレオチド複合体の模式図である：（ａ）ダイマー分岐オリゴヌクレオチド。 各ダイマーおよびマルチマーオリゴヌクレオチド複合体の模式図である：（ｂ）多価ストレプトアビジン／ビオ−オリゴヌクレオチド複合体（Ａ：ストレプトアビジン；Ｂ：ビオチン）； 各ダイマーおよびマルチマーオリゴヌクレオチド複合体の模式図である：（ｃ）ダイマーダンベルオリゴヌクレオチド。 各ダイマーおよびマルチマーオリゴヌクレオチド複合体の模式図である：（ｄ）ダイマーフォークオリゴヌクレオチド。 ＰＢＭＣ（１０7／ｍｌ）に対するＬ−セレクチンセレックス第１５ラウンドｓｓＤＮＡプールの結合曲線を示す。 末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）（１０７／ｍｌ）に対する２ｎＭの３２Ｐ−標識ラウンド１５のｓｓＤＮＡの結合を、上昇する濃度の阻止モノクローナル抗Ｌ−セレクチン抗体、ＤＲＥＧ−５６、またはイソタイプの一致した陰性対照抗体と競合させた競合実験の結果を示す。結合ＲＮＡは、１００×（競合物質の存在下で結合したネットカウント／競合物質の非存在下で結合したネットカウント）である。 全血中のヒトリンパ球と顆粒球に対するＬＤ２０１Ｔ１（配列番号１８５）のＬ−セレクチン特異的結合を示す。ａ、リンパ球に対するＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１の結合を、ＤＲＥＧ−５６、非標識ＬＤ２０１Ｔ１、により競合させ、ＥＤＴＡにより阻害させる。ｂ、顆粒球に対するＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１結合をＤＲＥＧ−５６、非標識ＬＤ２０１Ｔ１により競合させ、ＥＤＴＡにより阻害させる。すべての試料は、０．１５ｍＭ ＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１で染色した；太線：ＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１のみ；太い破線：０．３ｍＭＤＲＥＧ−５６を有するＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１；中間の太線：７ｍＭ非標識ＮＸ２８０を有するＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１；細線：４ｍＭ ＥＤＴＡ添加後に再測定したＦＩＴＣ−ＬＤ２０１Ｔ１染色細胞；細い破線：自己蛍光。 Ｌ−セレクチンに対するファミリー１のｓｓＤＮＡリガンドのコンセンサスヘアピン２次構造を示す。ヌクレオチド配列は、標準的１文字コードで記載される。不変ヌクレオチドは太字で記載される。高度に可変性の位置の塩基対はＮ−Ｎ’と記載する。ステムの右側は、同じ線の上にあるステム中の位置の特定の塩基対の存在の数を示すマトリックスである。 ヒトＰＢＭＣをＮＸ２８８（配列番号１９３）でインビトロで前処理すると、ＳＣＩＤマウスＰＬＮへのリンパ球の移動が阻害されることを示す。ヒトＰＢＭＣは、フィコール−ハイペーク勾配によりヘパリン化血液から精製し、ＨＢＳＳ（カルシウム／マグネシウムを含まない）で２回洗浄し、５１Ｃｒ（アマシャム（Amersham））で標識した。標識後、細胞をＨＢＳＳ（カルシウムとマグネシウムを含む）と１％ウシ血清アルブミン（シグマ（Sigma））で２回洗浄した。メスのＳＣＩＤマウス（６〜１２週令）に２×１０６細胞を静脈内注射した。細胞は処理しなかったか、または１３pmolの抗体（ＤＲＥＧ−５６もしくはＭＥＬ−１４）、または４、１、もしくは０．４nmolの修飾オリゴヌクレオチドと混合した。１時間後、マウスを麻酔し、血液試料を採取し、マウスを安楽死させた。ＰＬＮ、ＭＬＮ、パイエル板、脾臓、肝臓、肺、胸腺、腎臓および骨髄を取り出し、臓器に取り込まれたカウントをパッカード(Packard)ガンマカウンターで測定した。記載したデータは、三重測定の平均±標準誤差であり、３つの実験の代表値である。 ＮＸ２８８（配列番号１９３）の前注射が、ＳＣＩＤマウスＰＬＮおよびＭＬＮへのヒトリンパ球の輸送を阻害することを示す。ヒトＰＢＭＣを精製し、標識し、前述のように洗浄した。細胞を図１３に記載のように調製した。メスのＳＣＩＤマウス（６〜１２週令）に２×１０６細胞を静脈内注射した。細胞の注射の１〜５分前に、マウスに１５ｍｌのＤＲＥＧ−５６または４nmolの修飾オリゴヌクレオチドを注射した。細胞の注射１時間後にマウスを屠殺した。臓器に取り込まれたカウントを図１３に記載のように測定した。記載したデータは、三重測定試料の平均±標準誤差であり、２つの実験の代表値である。 Ｌ−セレクチンに対する２’−Ｆ ＲＮＡリガンドのコンセンサスヘアピン２次構造を示す。ヌクレオチド配列は、標準的１文字コードで記載される。不変ヌクレオチドは太字で記載される。高度に可変性の位置の塩基対はＮ−Ｎ’と記載する。ステムの右側は、同じ線の上にあるステム中の位置の特定の塩基対の存在の数を示すマトリックスである。 Ｐ−セレクチンに対する２’−Ｆ ＲＮＡリガンドのコンセンサスヘアピン２次構造を示す。ヌクレオチド配列は、標準的１文字コードで記載される。不変ヌクレオチドは太字で記載される。高度に可変性の位置の塩基対はＮ−Ｎ’と記載する。ステムの右側は、同じ線の上にあるステム中の位置の特定の塩基対の存在の数を示すマトリックスである。

Claims (65)

  1. 配列番号２２３で示されるヌクレオチド配列であるか、又は配列番号２２３に示される配列と７０％を超える一次配列相同性を有するヌクレオチド配列を含み、Ｐ−セレクチンに特異的に結合し、かつＰ−セレクチンの高親和性アンタゴニストである核酸リガンドであって、前記リガンドの一次配列がＣＵＣＡＡＣＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＡＵＣＧＡＣＧＵＣＡＧＣＡＡＡＣＧＣＧＡＧを含む核酸リガンド。
  2. 前記核酸リガンドがリボ核酸であって、ピリミジンが２’−フルオロ(２’−Ｆ)である請求項１に記載の核酸リガンド。
  3. 前記核酸リガンドがリボ核酸であって、ピリミジンが２’−アミノ(２’−ＮＨ２)である請求項１に記載の核酸リガンド。
  4. １５位までのプリンが２’−Ｏ−メチルである配列番号２２３の一次ヌクレオチド配列を含むリガンドである、請求項１−３のいずれか一項に記載の核酸リガンド。
  5. 配列番号２２３の一次ヌクレオチド配列の７−９位、１５位、２７位、２８位、および３１位のプリンが２’−Ｏ−メチルである、請求項４に記載の核酸リガンド。
  6. 配列番号２２３の一次ヌクレオチド配列の１３位、１４位、１８位、２１位、２２位および２４位のプリンが２’−Ｏ−メチルである、請求項４または５に記載の核酸リガンド。
  7. 配列番号２２３の一次ヌクレオチド配列の７−９位、１３−１５位、１８位、２１位、２２位、２４位、２７位、２８位、および３１位のプリンが２’−Ｏ−メチルである配列番号２２３の一次ヌクレオチド配列を含むリガンドである、請求項１に記載の核酸リガンド。
  8. Ｐ−セレクチンに結合するアプタマーであって、前記アプタマーは配列番号２２３を含む。
  9. 前記アプタマーがポリエチレングリコール部分にコンジュゲートされた、請求項８のアプタマー。
  10. 前記ポリエチレングリコール部分が前記アプタマーの５’末端にコンジュゲートされた、請求項９のアプタマー。
  11. 前記アプタマーがその３’末端に逆転されたデオキシチミジンをさらに含む、請求項１０のアプタマー。
  12. 前記アプタマーの中の少なくとも１つのグアニンが２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）であり、前記アプタマーの中の少なくとも１つのアデニンが２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）である、請求項８のアプタマー。
  13. 前記アプタマーがポリエチレングリコール部分にコンジュゲートされている、請求項１２のアプタマー。
  14. 前記ポリエチレングリコール部分が前記アプタマーの５’末端にコンジュゲートされている、請求項１３のアプタマー。
  15. 前記アプタマーがその３’末端に逆転されたデオキシチミジンをさらに含む、請求項１４のアプタマー。
  16. Ｐ−セレクチンに結合するアプタマーであって、前記アプタマーが配列番号２２３を含み、ここで配列番号２２３は７位、８位、９位、１３位、１４位、１５位、１８位、２１位、２２位、２４位、２７位、２８位、および３１位に２’−Ｏ−メチルプリンをさらに含むアプタマー。
  17. 前記アプタマーがポリエチレングリコール部分にコンジュゲートされた、請求項１６のアプタマー。
  18. 前記ポリエチレングリコール部分が前記アプタマーの５’末端にコンジュゲートされている、請求項１７のアプタマー。
  19. 前記アプタマーがその３’末端に逆転されたデオキシチミジンをさらに含む、請求項１８のアプタマー。
  20. Ｐ−セレクチンに結合するアプタマーであって、前記アプタマーがＰＥＧ４０Ｋ−ｎｈ−ｆＣ−ｆＵ−ｆＣ−ｒＡ−ｒＡ−ｆＣ−ｍＧ−ｍＡ−ｍＧ−ｆＣ−ｆＣ−ｒＡ−ｍＧ−ｍＧ−ｍＡ−ｒＡ−ｆＣ−ｍＡ−ｆＵ−ｆＣ−ｍＧ−ｍＡ−ｆＣ−ｍＧ−ｆＵ−ｆＣ−ｍＡ−ｍＧ−ｆＣ−ｒＡ−ｍＡ−ｒＡ−ｆＣ−ｒＧ−ｆＣ−ｒＧ−ｒＡ−ｒＧ−ｉｄＴ（配列番号３９２）を含み、ここで“ＰＥＧ４０Ｋ”は４０ｋＤａのポリエチレングリコール部分であり、“ｎｈ“はアミンリンカーであり、“ｉｄＴ”は逆転されたデオキシチミジンであり、“ｆ”はフルオロであり、“ｍ”はメトキシであり、そして“ｒ”はリボであるアプタマー。
  21. 前記アミンリンカーがヘキシルアミンリンカーである、請求項２０のアプタマー。
  22. Ｐ−セレクチンに特異的に結合する精製および単離された非天然存在の核酸リガンドであって、前記核酸リガンドが配列番号１９９−２４７および２５１−２９０に示されたいずれか１つの配列を有する核酸リガンド。
  23. Ｐ−セレクチンに特異的に結合する精製および単離された非天然存在の核酸リガンドであって、前記核酸リガンドが配列番号１９９−２４７および２５１−２９０に示されたいずれか１つの配列を有する核酸リガンドと実質的に同一の配列であって、かつ実質的に同じＰ−セレクチンとの結合能力を有する核酸リガンド。
  24. Ｐ−セレクチンに特異的に結合し、Ｐ−セレクチンの高親和性アンタゴニストである核酸リガンドであって、前記核酸リガンドが配列番号２０６で示される配列を有する核酸リガンド。
  25. レクチン媒介性の血小板異常を治療するための医薬組成物であって、医薬的有効量のＰ−セレクチンに対する核酸リガンドを含む医薬組成物。
  26. ａ） 核酸の候補混合物をレクチンと接触させ、ここで候補混合物よりレクチンへの親和性が上昇している核酸は、残りの候補混合物から分離される工程；
    ｂ） 残りの候補混合物から親和性が上昇した核酸を分離する工程；
    ｃ） 親和性が上昇した核酸を増幅して、レクチンへの結合について比較的高い親和性と特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得て、それによってレクチンの核酸リガンドを同定する工程、
    を含む方法によって、Ｐ−セレクチンに対する前記核酸リガンドが同定される、請求項２５の医薬組成物。
  27. Ｐ−セレクチンに対する核酸リガンドが、配列番号１９９−２４７、および２５１−２９０からなる群より選択される、請求項２５の医薬組成物。
  28. Ｐ−セレクチンに対する前記核酸リガンドが、配列番号２０６である、請求項２７の医薬組成物。
  29. Ｐ−セレクチンに対する前記核酸リガンドが、１９位を５’末端とし、５６位を３’末端とする３８塩基を含む配列番号２０６の断片である、請求項２８の医薬組成物。
  30. 前記３８塩基の中の少なくとも１つのグアニンが２’−Ｏ−メチルであり、前記３８塩基の中の少なくとも１つのアデニンが２’−Ｏ−メチルであるように、前記３８塩基がさらに修飾された、請求項２９の医薬組成物。
  31. 前記３８塩基が２’−Ｏ−メチルプリン置換によってさらに修飾された請求項２９の医薬組成物であって、前記３８塩基が５’−ＣＵＣＡＡＣＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＡＵＣＧＡＣＧＵＣＡＧＣＡＡＡＣＧＣＧＡＧ−３’（配列番号３９１）を含み、ここで少なくとも下線を引いた塩基が２’−Ｏ−メチルである医薬組成物。
  32. 哺乳類におけるレクチン媒介性の血小板異常を治療するための医薬組成物であって、Ｐ−セレクチンに対する核酸リガンドを含む医薬的有効量の剤形を含み、ここで前記リガンドはＰＳ−Ｒｇの機能的アンタゴニストである医薬組成物。
  33. ａ） 核酸の候補混合物をレクチンと接触させ、ここで候補混合物よりレクチンへの親和性が上昇している核酸は、残りの候補混合物から分離される工程；
    ｂ） 残りの候補混合物から親和性が上昇した核酸を分離する工程；および
    ｃ） 親和性が上昇した核酸を増幅して、レクチンへの結合について比較的高い親和性と特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得て、それによってＰ−セレクチンの核酸リガンドを同定する工程、
    を含む方法によって、Ｐ−セレクチンに対する前記核酸リガンドが同定される、請求項３２の医薬組成物。
  34. Ｐ−セレクチンに対する前記核酸リガンドが、配列番号１９９−２４７、および２５１−２９０からなる群より選択される、請求項３２の医薬組成物。
  35. Ｐ−セレクチンに対する前記核酸リガンドが、配列番号２０６である、請求項３４の医薬組成物。
  36. Ｐ−セレクチンに対する前記核酸リガンドが、１９位を５’末端とし、５６位を３’末端とする３８塩基を含む配列番号２０６の断片である、請求項３５の医薬組成物。
  37. 前記３８塩基の中の少なくとも１つのグアニンが２’−Ｏ−メチルであり、前記３８塩基の中の少なくとも１つのアデニンが２’−Ｏ−メチルであるように、前記３８塩基がさらに修飾された、請求項３６の医薬組成物。
  38. 前記３８塩基が２’−Ｏ−メチルプリン置換によってさらに修飾された請求項３６の医薬組成物であって、前記３８塩基が５’−ＣＵＣＡＡＣＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＡＵＣＧＡＣＧＵＣＡＧＣＡＡＡＣＧＣＧＡＧ−３’（配列番号３９１）を含み、ここで少なくとも下線を引いた塩基が２’−Ｏ−メチルである医薬組成物。
  39. 哺乳類の血液中の好中球に対する血小板の接着を阻害するための医薬組成物であって、Ｐ−セレクチンに対する核酸リガンドを含み、ここで前記リガンドはＰＳ−Ｒｇの機能的アンタゴニストである医薬組成物。
  40. ａ） 核酸の候補混合物をレクチンと接触させ、ここで候補混合物よりレクチンへの親和性が上昇している核酸は、残りの候補混合物から分離される工程；
    ｂ） 残りの候補混合物から親和性が上昇した核酸を分離する工程；および
    ｃ） 親和性が上昇した核酸を増幅して、レクチンへの結合について比較的高い親和性と特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得て、それによってＰ−セレクチンの核酸リガンドを同定する工程、
    を含む方法によって、Ｐ−セレクチンに対する前記核酸リガンドが同定される、請求項３９の医薬組成物。
  41. Ｐ−セレクチンに対する前記核酸リガンドが、配列番号１９９−２４７、および２５１−２９０からなる群より選択される、請求項３９の医薬組成物。
  42. Ｐ−セレクチンに対する前記核酸リガンドが、配列番号２０６である、請求項４１の医薬組成物。
  43. Ｐ−セレクチンに対する前記核酸リガンドが、１９位を５’末端とし、５６位を３’末端とする３８塩基を含む配列番号２０６の断片である、請求項４２の医薬組成物。
  44. 前記３８塩基の中の少なくとも１つのグアニンが２’−Ｏ−メチルであり、前記３８塩基の中の少なくとも１つのアデニンが２’−Ｏ−メチルであるように、前記３８塩基がさらに修飾された、請求項４３の医薬組成物。
  45. 前記３８塩基が２’−Ｏ−メチルプリン置換によってさらに修飾された請求項４３の医薬組成物であって、前記３８塩基が５’−ＣＵＣＡＡＣＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＣＡＵＣＧＡＣＧＵＣＡＧＣＡＡＡＣＧＣＧＡＧ−３’（配列番号３９１）を含み、ここで少なくとも下線を引いた塩基が２’−Ｏ−メチルである医薬組成物。
  46. 哺乳類の血液中の白血球に対する血小板の接着を阻害するための医薬組成物であって、Ｐ−セレクチンに対する核酸リガンドを含む医薬組成物。
  47. 哺乳類の血液中の炭水化物に対するＰ−セレクチンの結合を阻害するための医薬組成物であって、Ｐ−セレクチンに対する核酸リガンドを含む医薬組成物。
  48. Ｐ−セレクチンおよび前記Ｐ−セレクチンの炭水化物リガンドの間の結合を阻害する方法であって、前記Ｐ−セレクチンに対する核酸リガンドを前記Ｐ−セレクチンに接触させる工程を含み、ここでＰ−セレクチンに対する前記核酸リガンドが、配列番号１９９−２４７および２５１−２９０からなる群より選択される方法。
  49. 白血球の接着または移動を調節する方法であって、第一の細胞上にあるＰ−セレクチンおよび第二の細胞上にある前記Ｐ−セレクチンに対するリガンドの間の結合を阻害する工程を含み、前記阻害する工程は前記セレクチンに対する核酸リガンドが前記第一の細胞と相互作用することを可能にする工程を含み、ここで前記第一の細胞は好中球および単球からなる群より選択される白血球であり、前記第二の細胞は血管内皮細胞であり、そして前記核酸リガンドは配列番号１９９−２４７、２５１−２９０からなる群より選択される方法。
  50. 血小板の接着を調節する方法であって、第一の細胞上にあるＰ−セレクチンおよび第二の細胞上にある前記Ｐ−セレクチンに対するリガンドの間の結合を阻害する工程を含み、前記阻害する工程は前記Ｐ−セレクチンに対する核酸リガンドが前記第一の細胞と相互作用することを可能にする工程を含み、ここで前記第一の細胞は血小板であり、前記レクチンはＰ−セレクチンであり、そして前記Ｐ−セレクチンに対する核酸リガンドは配列番号１９９−２４７、および２５１−２９０からなる群より選択される方法。
  51. Ｐ−セレクチンおよび前記Ｐ−セレクチンに対する炭水化物リガンドの間の結合を阻害する方法であって、前記Ｐ−セレクチンに対する核酸リガンドを前記Ｐ−セレクチンに接触させる工程を含み、ここでＰ−セレクチンに対する前記核酸リガンドは配列番号２２３を含む方法。
  52. 配列番号２２３が少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルプリンをさらに含む、請求項５１の方法。
  53. 配列番号２２３が７位、８位、９位、１５位、２７位、２８位および３１位に２’−Ｏ−メチルプリンをさらに含む、請求項５１の方法。
  54. 配列番号２２３が、以下の１３位、１４位、１６位、１８位、２１位、２２位、２４位および３０位のうち１以上に２’−Ｏ−メチルプリンをさらに含む、請求項５３の方法。
  55. 配列番号２２３が、１３位、１４位、１８位、２１位、２２位、および２４位に２’−Ｏ−メチルプリンをさらに含む、請求項５３の方法。
  56. 白血球の接着または移動を調節する方法であって、第一の細胞上にあるＰ−セレクチンおよび第二の細胞上にある前記Ｐ−セレクチンに対するリガンドの間の結合を阻害する工程を含み、前記阻害する工程は前記セレクチンに対する核酸リガンドが前記第一の細胞と相互作用することを可能にする工程を含み、ここで前記第一の細胞は好中球および単球からなる群より選択される白血球であり、前記第二の細胞は血管内皮細胞であり、そして前記核酸リガンドは配列番号２２３である方法。
  57. 配列番号２２３が少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルプリンをさらに含む、請求項５６の方法。
  58. 配列番号２２３が、７位、８位、９位、１５位、２７位、２８位、および３１位に２’−Ｏ−メチルプリンをさらに含む、請求項５６の方法。
  59. 配列番号２２３が、以下の１３位、１４位、１６位、１８位、２１位、２２位、２４位および３０位のうち１以上に２’−Ｏ−メチルプリンをさらに含む、請求項５８の方法。
  60. 配列番号２２３が、１３位、１４位、１８位、２１位、２２位、および２４位に２’−Ｏ−メチルプリンをさらに含む、請求項５８の方法。
  61. 血小板の接着を調節する方法であって、Ｐ−セレクチンを有する第一の細胞上のレクチンおよび前記Ｐ−セレクチンに対するリガンドを有する第二の細胞上の前記Ｐ−セレクチンに対するリガンドの間の結合を阻害する工程を含み、前記Ｐ−セレクチンに対する核酸リガンドが第一の細胞と相互作用することを可能にする工程を含み、ここで前記第一の細胞は血小板であり、前記レクチンはＰ−セレクチンであり、そして前記Ｐ−セレクチンに対する前記核酸リガンドは配列番号２２３を含む方法。
  62. 配列番号２２３が少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルプリンをさらに含む、請求項６１の方法。
  63. 配列番号２２３が７位、８位、９位、１５位、２７位、２８位および３１位に２’−Ｏ−メチルプリンをさらに含む、請求項６１の方法。
  64. 配列番号２２３が以下の１３位、１４位、１６位、１８位、２１位、２２位、２４位および３０位のうち１以上に２’−Ｏ−メチルプリンをさらに含む、請求項６３の方法。
  65. 配列番号２２３が、１３位、１４位、１８位、２１位、２２位、および２４位に２’−Ｏ−メチルプリンをさらに含む、請求項６３の方法。
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