JPH08501943A - 核酸リガンドおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、セレックス方法に基づく改良された核酸リガンドの同定および製造のための方法を含む。ＨＩＶ−ＲＴ、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ、ＨＩＶ−１ ｔａｔ、トロンビン、および塩基性繊維芽細胞増殖因子タンパクに対する核酸リガンドも含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸リガンドおよびその製造方法発明の分野 本発明に記載されるのは、核酸リガンドを同定および製造するための方法であ る。核酸リガンドとは、目的の標的分子に特異的に結合する２本鎖または１本鎖 ＤＮＡまたはＲＮＡ種である。この核酸リガンドの同定は、「指数的濃縮のため のリガンドの系統的進化」（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ） の頭字語である、セレックス（ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法に基づく。 本発明の方法は、選択された標的に対して改良された核酸リガンドを創製する ために、セレックス法から得た情報を分析、応用することよりなる。これらの方 法は、コンピューターモデル化、境界測定方法および化学修飾方法を含む。本発 明の方法によれば、１）選択された標的への結合に関して、核酸リガンドのどの 核酸残基が決定的であるか；２）どの核酸残基が核酸リガンドの構造に影響を及 ぼすか；および３）核酸リガンドの３次元構造はどうなっているか、を決めるこ とが可能である。この情報により、構造安定性が向上していると共に標的への結 合能力が優れた、改良された核酸リガンドの同定と製造が可能になる。本情報は また、標的へのリガンドとしても機能する非核酸またはハイブリッド核酸種を製 造するために使用することもできる。本発明の方法はさらに、治療方法および／ または診断方法の調製に使用される標的種の分析を可能にする。 具体的には本発明において、ＨＩＶ−ＲＴ、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ、ＨＩＶ−１ｔａｔ 、トロンビン、および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）タンパクに 対する、高親和性核酸リガンドが記載される。本発明で同定される核酸リガンド により特徴付けられる修飾核酸リガンドと模倣リガンドも、本発明の範囲に含ま れる。さらに、標的分子の生物活性を修飾することができる核酸リガンド（例え ばｂＦＧＦの作用を阻害する核酸リガンド）も、本発明の範囲に含まれる。また さらに、修飾ヌクレオチドを含有する核酸リガンドも本発明に含まれる。発明の背景 多くのタンパクまたは低分子は、核酸に特異的に結合することは知られていな い。例外である公知のタンパクは、核酸中にコードされている遺伝情報の細胞構 造への転移と遺伝物質の複製を引き起こすために生細胞中で機能する、リプレッ サー、ポリメラーゼ、アクチベーターなどの制御タンパクである。さらには、Ｇ ＴＰのような低分子は幾つかのイントロンＲＮＡに結合する。 生物は核酸の機能を、主として情報提供の役割に限定して進化してきた。クリ ック（Ｃｒｉｃｋ）により提案されたセントラルドグマは、核酸（ＲＮＡまたは ＤＮＡ）は元々の形でも拡大された形でも、鋳型の核酸中の情報を「読み」、そ して相補核酸を産生する複製過程を通して、他の核酸の合成のための鋳型として 作用することができることを提唱している。遺伝学と遺伝子発現の全ての実験例 は、核酸のこれらの性質に依存している：本質的に、塩基対という化学概念のた め、そして複製過程は比較的誤りのない方法でその塩基対形成を使用できるため 、２本鎖核酸の情報は重複が多い。 タンパクの個々の成分である２０個の天然アミノ酸は、極めて広範囲の結合活 性や触媒活性を提供するのに十分な、化学的相違と活性を有する。しかし核酸は 、ウイルスからウイルス、細胞から細胞、および生物から生物へ遺伝情報を伝え る遺伝的役割を有する以外は、タンパクに比べてその化学的可能性は狭いと考え られている。この点で核酸成分であるヌクレオチドは、ワトソン−クリック（Ｗ ａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対中に情報の重複を可能にする、対の表面のみを 有さなければならない。核酸成分は、広範囲の結合または触媒作用に十分な、化 学的相違と活性を有する必要はない。 しかし、天然に見い出された少数の核酸は、ある種の標的分子への結合に関与 し、少数の触媒作用の例さえ報告されている。この種の活性の範囲は、タンパク （さらに具体的には抗体）に比較して狭い。例えば、核酸があるタンパク標的に 高い親和性と高い特異性で結合することが公知である場合、その結合は、ＤＮＡ またはＲＮＡリガンドからなるヌクレオチドの正確な配列に依存している。例え ば、短い２本鎖ＤＮＡ配列は、原核生物と真核生物の両方の転写を抑制または活 性化する標的タンパクに結合することが知られている。他の短い２本鎖ＤＮＡ配 列は、高い親和性と高い特異性で選択されるタンパク標的である制限エンドヌク レアーゼに結合することが知られている。他の短いＤＮＡ配列は、恐らく染色体 の作用機構に関与する特異的タンパクの結合のためのリガンドを生成することに より、染色体上の動原体（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅｓ）と末端小粒（ｔｅｌｏｍｅ ｒｅｓ）として作用する。例えば、２本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡ結合に機能する標的 タンパクの隅や裂け目（ｎｏｏｋｓ ａｎｄｃｒａｎｎｉｅｓ）の中に結合する 周知の能力を有する。１本鎖ＤＮＡも高い親和性と高い特異性で少数のタンパク に結合することができるが、そのような例は少ない。２本鎖ＤＮＡ結合タンパク の公知の例から、Ｂ型２本鎖ＤＮＡの大きな溝の中にアミノ酸側鎖を突き出した 種々のタンパクのモチーフ（ｍｏｔｉｆ）が関係するものとして、結合相互作用 を説明することが可能となり、特異性を与える配列を調べることが可能になった 。 ２本鎖ＤＮＡはしばしば、ある蛋白（例えば、大腸菌のエンドヌクレアーゼＲ ＮａｓｅIII）のリガンドとして作用する。１本鎖ＲＮＡに結合する標的タンパ クの例が知られているが、これらの場合にその１本鎖ＲＮΛはしばしば、分子内 ２本鎖の局所領域を含む複雑な３次元形状を形成する。アミノ−アシルｔＲＮＡ シンセターゼは、高い特異性でｔＲＮＡ分子に強く結合する。ＲＮＡウイルスの ゲノム中の短い領域は、強くそして高い特異性でウイルスの外被タンパクに結合 する。ＲＮＡの短い配列は、バクテリオファージＴ４がコードするＤＮＡポリメ ラーゼに、これも高い親和性と高い特異性で結合する。すなわち、特異的タンパ ク標的の結合相手となる、２本鎖または１本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡリガンドを 見つけることが可能である。多くの公知のＤＮＡ結合タンパクは２本鎖ＤＮＡに 特異的に結合し、一方多くのＲＮＡ結合タンパクは１本鎖ＲＮＡを認識する。こ の文献上の統計的偏りは、ＤＮＡを２本鎖ゲノムとして使用し、ＲＮＡをゲノム としての役割を越えて働く１本鎖物質として使用する、現在の生物圏の統計的傾 向を確実に反映している。化学的には、１本鎖ＤＮＡを、特異的なタンパクの相 互作用の十分に有能な相手として無視する大きな理由はない。 ＲＮＡとＤＮＡはまた、より小さい標的分子に結合することが見い出された。 ２本鎖ＤＮＡは、例えばアクチノマイシンＤのような種々の抗生物質に結合する 。 特定の１本鎖ＲＮＡは、抗生物質チオストレプトン（ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ ｅ）に結合し；特定のＲＮＡ配列と構造は、恐らく他の抗生物質（特にその機能 が標的生物のリボソームを不活化するもの）に結合する。進化的に関連するＲＮ Ａのファミリーは、２０個のアミノ酸の１つと結合する（ヤルス，Ｍ．（Ｙａｒ ｕｓ，Ｍ．）（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５１）と同様に、特 異的にそして適切な親和性でヌクレオチドやヌクレオシドに結合する（バス，Ｂ ．（Ｂａｓｓ，Ｂ．）およびセック，Ｔ．（Ｃｅｃｈ，Ｔ．）（１９８４） Ｎ ａｔｕｒｅ ３０８：８２０）。触媒性ＲＮＡも公知であるが、これらの化学的 可能性の範囲は狭く、これまではおもに核酸のホスホジエステル転移反応や加水 分解に関与するとされてきた。 これらの公知の例にもかかわらず、大多数の主要なタンパクと他の細胞成分は 、生理的条件下では核酸に結合しないと考えられ、そのような結合は観察されて も非特異的であると考えられている。核酸の他の化合物へ結合する能力は前述の 比較的少数の例に限定されているか、または特異結合のための核酸の化学的能力 は、天然の構造中で避けられている（に対して選択されている）。本発明は、核 酸が化学化合物として事実上無限の配列の形状、サイズおよび配置を形成でき、 生物系で示されるよりもはるかに広い範囲の結合と触媒作用を有することができ るという、本発明者らの根本的な考え方を前提とする。 タンパク−核酸結合の幾つかの公知の例において、化学的相互作用が研究され ている。例えば、バクテリオファージＲ１７外被タンパク結合のＲＮＡ部位のサ イズと配列が、ウーレンベック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）とその共同研究者により 同定された。Ｒ１７外被タンパクの最小の天然ＲＮＡ結合部位（２１塩基の長さ ）は、ｍＲＮＡのサイズ可変の標識断片を、タンパク−ＲＮＡ断片複合体がフィ ルターに結合して残る、ニトロセルロースフィルター結合測定法により決定され た（キャリー（Ｃａｒｅｙ）ら（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２： ２６０１）。個々の核酸のタンパク結合への寄与を測定するために、最小Ｒ１７ 外被タンパク結合部位の多くの配列変種が、インビトロで作成された（ウーレン ベック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）ら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ ｕｒｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ １：５３９、およびロマニウク （Ｒｏｍａｎｉｕｋ）ら（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６：１５６ ３）。結合部位のヘアピンループ構造の維持がタンパク結合に必須であるが、加 えて結合部位の多くの１本鎖残基のヌクレオチド置換が、ヘアピン軸の隆起した ヌクレオチドを含めて、結合に著しく影響することが見い出された。同様の研究 で、翻訳オペレーターへのバクテリオファージＱβ外被タンパクの結合が検討さ れた（ウィセレルとウーレンベック（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ ａｎｄＵｈｌｅｎｂ ｅｃｋ）（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：７１）。Ｑβ外被タン パクＲＮＡ結合部位は、隆起したヌクレオチドと３塩基ループを含む８塩基対の ヘアピン構造を有する約２０塩基よりなるという点から、サイズおよび予測され る２次構造において、Ｒ１７のものと同様であることが見い出された。Ｒ１７外 被タンパク結合部位と異なり、ループの１本鎖残基の１つのみが結合に必須であ り、隆起したヌクレオチドの存在は必要ではない。この翻訳制御に関連したタン パク−ＲＮＡ結合相互作用は、かなり高い特異性を示す。 核酸は溶液中で２次および３次構造を形成することが知られている。２本鎖型 のＤＮＡは、いわゆるＢ二重らせん型、Ｚ−ＤＮＡおよびスーパーらせんツイス ト構造を含む（リッチ，Ａ．（Ｒｉｃｈ，Ａ．）ら（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：７９１）。１本鎖ＲＮＡは、ヘアピンループやにせ結 び目（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ）構造のような、２次構造の局在化領域を形成する （シメル，Ｐ．（Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｐ．）（１９８９）Ｃｅｌｌ ５８：９） 。しかし、対になっていないループヌクレオチドのループ構造の安定性、形成と 変性の速度論、熱力学に及ぼす影響はほとんど知られておらず、そして３次構造 と３次元形状について、また核酸の３次折畳み（ｔｅｒｔｉａｒｙ ｆｏｌｄｉ ｎｇ）の速度論と熱力学についてもほぼ何も知られていない（ターク（Ｔｕｅｒ ｋ）ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：１ ３６４）。 ＲＮＡバクテリオファージＱβの複製における、ある型のインビトロの進化が 報告されている。ミルズ（Ｍｉｌｌｓ）ら（１９６７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５８：２１７；レビンソーンとスピーグルマン（Ｌ ｅｖｉｎｓｏｈｎ ＆ Ｓｐｉｅｇｌｅｍａｎ）（１９６８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６０：８６６；レビンソーンとスピーグ ルマン（１９６９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３：８ ０５；サッフヒル（Ｓａｆｆｈｉｌｌ）ら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５１ ：５３１；カシアン（Ｋａｃｉａｎ）ら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：３０３８；ミルズら（１９７３）Ｓｃｉｅｎ ｃｅ １８０：９ｌ６。ファージＲＮＡは、ファージ特異性タンパクの翻訳を指 令するポリシストロン性メッセンジャーＲＮＡとして、またＱβＲＮＡレプリカ ーゼにより触媒されるそれ自体の複製の鋳型としての作用する。このＲＮＡレプ リカーゼは、それ自信のＲＮＡ鋳型に対して、高度に特異的であることが示され た。インビトロの複製周期の過程で、やはりＱβレプリカーゼにより複製される 小さいＲＮＡ変種が単離された。複製周期を行う条件の小さな変更により、異な るＲＮＡが集積したが、これは恐らく変更した条件がそれらの複製により適して いたからであろう。これらの実験では、選択されたＲＮＡは、複製を開始するた めにレプリカーゼにより有効に結合し、そしてＲＮＡの伸長の間、速度論的に適 した鋳型を働かなければならなかった。クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら（１９７ ４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９：７１９は、Ｑβレプリカーゼの突然変異ＲＮ Ａ鋳型の単離を報告し、この複製は天然の鋳型に比べて臭化エチジウムによる阻 害に対してより抵抗性であることを報告した。この突然変異体は最初のＲＮＡ集 団には存在しないが、Ｑβレプリカーゼでのインビトロ複製周期の間に逐次の突 然変異により生成されることが示唆された。選択の間の変異の唯一の起源は、Ｑ βレプリカーゼによる伸長の間の内因性のエラー率であった。これらの研究で「 選択」と呼ばれるものは、最初は均一なＲＮＡ配列の限られた数の自然発生的な 変異体の１つまたはそれ以上の優先的増幅により生じた。目的とした結果の選択 はなく、あるのはただＱβレプリカーゼの作用の様式に内在したものであった。 ジョイスとロバートソン（Ｊｏｙｃｅ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）（ジョ イス（１９８９） ＲＮＡ：触媒、スプライシング、進化（ＲＮＡ：Ｃａｔａｌ ｙｓｉｓ，Ｓｐｌｉｃｉｎｇ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ）、ベルフォートとシャブ（ Ｂｅｌｆｏｒｔ ａｎｄ Ｓｈｕｂ）（編）、エルセビア社 （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、アムステルダム、８３−８７ページ：およびロバートソ ンとジョイス（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４４：４６７）は、１本鎖ＤＮＡを 特異的に切断するＲＮＡを同定する方法を報告した。触媒活性の選択は、特定の 位置で基質ｓｓＲＮＡまたはＤＮＡの切断を触媒し、基質の３’末端をリボザイ ムの３’末端へ転移するリボザイムの能力に基づいていた。目的の反応の生成物 は、触媒反応により形成される結合部を介して完成した生成物にのみ結合できて 、リボザイム配列の選択的逆転写を可能にする、オリゴデオキシヌクレオチドプ ライマーを使用することにより選択された。この選択された触媒配列は、Ｔ７Ｒ ＮＡポリメラーゼのプロモーターをｃＤＮＡの３’末端へ結合させ、続いてＲＮ Ａを転写させることにより増幅された。この方法は、少数のリボザイム突然変異 体から、選択された基質の切断に対して最も反応性のある突然変異体を同定する ために使用された。 先行技術は、他の物質との相互作用における核酸については、限られた範囲の 化学的機能以上には、教えたり示唆したりはしていない（ある種の特定のオリゴ ヌクレオチド配列に結合するように進化したタンパクの標的として；そしてさら に最近になって、限定された範囲の活性を持った触媒として）。先行の「選択」 実験は、既に記載された機能の狭い範囲の突然変異体に限定されてきた。ここで 、核酸が非常に広い範囲の機能を有し、この可能性を実現するための方法論が本 明細書で開示されることが、初めて理解されるであろう。 １９９０年６月１１日に出願された、ゴールドとタークの、「指数的濃縮のた めのリガンドの系統的進化」（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ） という名称の、合衆国特許出願番号０７／５３６，４２８号と、１９９１年６月 １０日に出願された、ゴールドとタークの、「核酸リガンド」（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｌｉｇａｎｄｓ）という名称の、合衆国特許出願番号０７／７１ ４，１３１号（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０７８号も参照）は、任意の目的の標的 に対する核酸リガンドを作るための根本的に新規な方法を記載している。これら の出願はどれも、本明細書ではまとめてセレックス特許出願と呼び、参照により 本明細書中に取り組み込まれる。 セレックス特許出願の方法は、核酸は種々の２次元および３次元構造を形成す るのに十分な能力と、事実上任意の化合物（サイズが大きいものまたは小さいも のも）とのリガンド（特異的結合対を形成する）として作用する、モノマー内で 利用可能な十分な化学的な融通性を有するという独特の洞察に基づく。 この方法は、結合親和性と選択性の任意の目的基準を事実上達成するために、 同一の一般的な選択テーマを使用する、候補の混合物からの選択と、構造改良の 段階的な繰り返しを含む。本明細書中でセレックスと呼ばれる方法は、核酸（好 ましくはランダム化された配列の切片よりなる）の混合物から出発して、混合物 を結合に適する条件下で標的に接触させ、標的分子に結合した核酸から未結合の 核酸を分画し、核酸−標的対を解離させ、核酸−標的対から解離した核酸を増幅 して、リガンドが濃縮された核酸混合物を生成し、次に結合、分画、解離および 増幅の工程を必要な回数繰り返す、工程を含む。 調製の理論には拘束されないが、セレックスは、多くの可能な配列と構造を含 有する核酸混合物中に、目的の標的に対する広い範囲の結合親和性が存在すると いう、発明者らの洞察に基づく。例えば２０ヌクレオチドのランダム化された切 片からなる核酸混合物は、４²⁰の候補の可能性を有する。標的に対する高い親和 性定数を有するものが、最も結合しやすい。分画、解離および増幅後、さらに高 い結合親和性の候補を得るために、第２の核酸混合物が生成され濃縮される。生 じる核酸混合物が、主にただ１つまたは数種の配列よりなるまで、さらに選択を 重ねることにより徐々に最もよいリガンドが得られる。次にこれらはクローン化 され、配列を決め、そして純粋なリガンドとしての結合親和性について個々に試 験される。 選択と増幅の周期は、目標が達成されるまで繰り返される。最も一般的なケー スでは、周期の繰り返しにより結合強度の著しい改良が見られなくなるまで、選 択／増幅は続けられる。この方法は、約１０¹⁸もの多くの異なる核酸種を採取す るのに使用できる。試験混合物の核酸は、好ましくは十分な増幅に必要な保存配 列と共に、ランダム化された配列部を含む。核酸配列の変種は、ランダム化され た核酸配列の合成と、ランダムに切断した細胞性核酸からのサイズ選択を含む、 多くの方法で製造することができる。可変配列部は、全部または一部ランダム配 列を含有してよく；またランダム配列とともに組み込まれた保存配列の部分も含 有してよい。試験核酸の配列変化は、選択／増幅の繰り返しの前またはその間に 、突然変異誘発により導入するかまたは増加させてよい。 セレックス特許出願の方法の１つの実施態様で、選択された標的に最も強力に 結合する核酸リガンドを単離するのに、その選択工程は非常に有効であり、ただ １回の選択と増幅が必要なだけである。そのような有効な選択は、例えば、カラ ムに結合した標的と会合する核酸の能力が、カラムが最も高い親和性の核酸リガ ンドの分離と単離を可能にするように機能する、クロマトグラフィー型の工程で 起きる。 多くの場合に、単一の核酸リガンドが同定されるまでセレックスの反復工程を 行うことは必ずしも望ましいことではない。標的に特異的な核酸リガンド溶液は 、多くの保存配列と、標的に対する核酸リガンドの親和性に著しく影響すること なく置換または付加される多くの配列を有する、一群の核酸の構造またはモチー フを含む。セレックス工程を完了する前に終結させることにより、多くの核酸リ ガンド溶液群のメンバーの配列を決定することが可能である。 種々の核酸の１次、２次および３次構造が存在することが知られている。最も 一般的に非ワトソン−クリック型の相互作用に関係することが証明されている構 造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称的および非対称的な隆起、にせ結び 目およびその無数の組み合わせである。ほとんどすべての既知のそのようなモチ ーフは、それらが３０ヌクレオチド以下の核酸配列内に形成されることを示唆し ている。この理由のため、隣接するランダム化された切片を扱うセレックス工程 は、約２０−５０ヌクレオチドの間のランダム切片を含有する核酸配列で開始す るのが、しばしば好ましい。 セレックス特許出願はまた、標的分子の１つまたはそれ以上の部位に結合する 核酸リガンド、および標的の特定部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドに 結合する、核酸リガンドを入手する方法を記載している。このセレックス法は、 考え得る任意の標的に結合する核酸リガンドを単離し同定する手段を提供する。 しかし好適な実施態様において、セレックス法は、標的が蛋白（核酸結合タンパ クと、生物学的機能の一部として核酸と結合することが知られていないタンパク の両者を含む）である状況に適用される。 高解像度でのＲＮＡ構造についてはほとんど知られていない。２本鎖ＲＮＡの 基本的なＡ型らせん構造は、繊維回折（ｆｉｂｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ） 研究から知られている。Ｘ線結晶学により、少数のｔＲＮＡと短いポリＡＵらせ んの構造が与えられた。ｔＲＮＡ／シンセターゼＲＮＡ／タンパク複合体のＸ線 構造も解明された。２つのテトラヌクレオチドのヘアピンループと１つのモデル のにせ結び目は、ＮＭＲ研究から明らかになっている。 構造データの不足の裏には幾つかの理由がある。インビトロのＲＮＡ合成法が 出現するまでは、構造研究に十分な量のＲＮＡを単離することは困難であった。 触媒性ＲＮＡの発見までは、構造研究に値すると考えられるＲＮＡ分子はほとん どなかった。良質なｔＲＮＡ結晶を得るのが困難であり、他の結晶の研究に水を 差した。このサイズの分子のＮＭＲ研究の技術は、ようやく最近になって利用可 能となった。 上述のように、いくつかの触媒性ＲＮＡ構造が公知であり、そして種々の標的 分子に強く結合するＲＮＡを選択するセレックス技術が開発されているため、新 しい触媒性ＲＮＡ構造も選択することができるかもしれない。これらの作用を正 確に知るために、そしてこれらを改良するためにこの知識を利用するために、こ れらの分子の構造を知ることが重要になった。 厳密なＮＭＲ、および厳密なＸ線結晶構造解析を用いるよりも少ない努力で、 ＲＮＡの構造を予測することを可能にするために、ＲＮＡの折畳み（ｆｏｌｄｉ ｎｇ）について十分に理解することが好ましい。タンパクとＲＮＡの両者にとっ て、配列に基づき、限られた（または全然ない）実験データを加味して、構造を 推定できるようにしたいという要求が常にあった。 タンパク構造の予測は、困難であることがよく知られている。まず第一に、タ ンパクの２次構造と３次構造は協同的に形成し；タンパクの折畳みは、完全に折 り畳まれた状態と完全に折り畳まれていない状態の２状態モデルにより熱力学的 に近似され得る。このことは、タンパク構造をモデル化するための自由度の数が 非常に大きいことを意味し；予測可能な中間物なしに、予測問題をより小さく扱 える小問題に分解できない。対照的に、しばしばＲＮＡは、３次相互作用よりも 安定性を与える充分に規定された２次構造を作るようである。例えば、ｔＲＮＡ の３次構造は、マグネシウムのキレート化によりまたは温度の上昇により、その ２次構造を破壊することなしに、破壊され得る。ＲＮＡの２次構造の予測は充分 理解されており、小さいＲＮＡ分子についてそれは一般的に非常に正確である。 ＲＮＡでは、構造予測は小問題に分解され；最初に２次構造の予測；次に生じた らせんと残った１本鎖が相互にどのように配置されるかを予測する。 ＲＮＡについて、構造予測の最初の試みはｔＲＮＡについてなされた。規範的 なｔＲＮＡクローバー葉の２次構造は比較配列分析から明らかになり、問題は４ つの短いＡ型らせんを空間で相互に配置するという１つの問題に絞られた。ｔＲ ＮＡモデルを作成するために、手作業のＣＰＫのモデル化、たやすく算出できる エネルギーの最小化、および架橋研究と系統発生の共通変化（ｐｈｙｌｏｇｅｎ ｅｔｉｃ ｃｏｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）から得られたいくつかの距離上の制限が 使用され、そして数年後フェニルアラニンｔＲＮＡの最初の結晶構造が解決され た時、これは不運にも間違いであることが判明した。 コンピューターによるモデル化が手作業のモデル化に取って代わり、重力と質 量により負わされたモデル作成者の困難さを救済した。コンピューターによるモ デル化は、例えば相同の構造が公知である場合に付加的な実験データなしに使用 することができるのみである；例えばカブ黄色モザイクウイルス（ｔｕｒｎｉｐ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）のＲＮＡゲノムの３’末端の構造 は、ｔＲＮＡの公知の３Ｄ構造と、ＴＹＭＶの３’末端は多くの細胞性ｔＲＮＡ 修飾酵素によりｔＲＮＡ様として認識されるという知識に基づいてモデル化され た。このモデルはＲＮＡにせ結び目の最初の３Ｄモデルであり；単離されたモデ ルにせ結び目の基本構造はＮＭＲデータにより確証された。 幾つかのＲＮＡ分子の構造をモデル化するために、化学的および酵素的保護デ ータを手作業で点検して、コンピューターによるモデル化法が使用された。１つ の単離された基礎構造において、単離されたＧＮＲＡヘアピンループのＮＭＲ研 究により、ＧＮＲＡの４ヌクレオチドループの形態の１つのモデルが、本質的に 正しいことが示された。 フランソワ・マイケル（Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｍｉｃｈｅｌ）（（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４２：３９１）は、グループＩイントロンの触媒活性コアのモ デルを構築した。ｔＲＮＡのように、グループＩイントロンコアの２次構造は比 較配列分析からよく知られているので、問題はらせんと残った１本鎖領域を正し く配置するという１つの問題に絞られる。上記マイケル（１９８９）は、整列さ せた一組の８７のグループＩイントロン配列を目で分析して、７つの強力な対と ２次構造の外側にトリプレットの共通変化を検出し、これを彼は３次接触と解釈 して彼のモデルに制限として手作業で組み込んだ。今のところ、マイケルのモデ ルの独立した確認はない。 他にも架橋、蛍光遷移、または系統発生の共通変化から距離の制限を扱う自動 化方法を案出しようという試みはなされてきた。ＲＮＡは円筒形（Ａ型らせん） とビーズ（１本鎖残基）の集合として処理され、距離幾何学と呼ばれる数学的技 術が、一組の距離制限と矛盾しないこれらの要素の配置を作成するのに使用され る。フェニルアラニンｔＲＮＡの３次構造の７つの距離制限の小さい一組を使用 して、この方法により、約２／３回はありふれたＬ型のｔＲＮＡ構造が作成され た。 ＨＩＶ−１のｔａｔタンパクは、ＨＩＶ−１のウイルスゲノムの長い末端繰り 返し（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）中の転写を活性 化する。カレン（Ｃｕｌｌｅｎ）ら（１９８９） Ｃｅｌｌ ５８：４２３を参 照のこと。活性化の機構は不明確であるか、または少なくとも議論のあるところ であるが、転写されたＲＮＡはトリヌクレオチド隆起のある特異なヘアピン構造 （ＴＡＲと呼ばれる）を含有することが必要である。図２５に天然のＴＡＲ Ｒ ＮＡとｔａｔの相互作用の部位が示されている。ｔａｔタンパクの小さい基本ド メインはＴＡＲ ＲＮＡ配列と直接相互作用することが証明されている。ウィー クス（Ｗｅｅｋｓ）ら（１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１２８１；ロイ （Ｒｏｙ）ら（１９９０） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４：１３６５；カルナン（Ｃ ａｌｎａｎ）ら（１９９１ａ）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２０１を参照のこと。 この基本ドメイン中のアルギニンは、相互作用に決定的に重要なようである。カ ルナンら（１９９１ａ）上記；スブラマニアン（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ）ら（ １９９１） ＥＭＢＯ １０：２３１１−２３１８；カルナンら（１９９１ ｂ） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１１６７−１１７１を参照のこと。アルギニン は単独ではＴＡＲ ＲＮＡ配列に特異的に結合し、ｔａｔタンパク結合のため競 合するようである。タオ（Ｔａｏ）ら（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２７２３−２７２６；パグリシ（Ｐｕｇｌｉｓｉ ）ら（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：７６−８０を参照のこと。 Ｔａｔ−ＴＡＲ相互作用だけではトランス活性化を支持するには不足であり； ＴＡＲへのｔａｔタンパクと協同の結合、そして続くインビボまたはインビトロ のトランス活性化には、恐らく細胞性因子（６８ｋＤループ結合タンパク）が必 要である。マルシニアク（Ｍａｒｃｉｎｉａｋ）ら（１９９０ａ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：３６２４；マルシニアクら（１９ ９０ｂ） Ｃｅｌｌ ６３：７９１を参照のこと。レトロウイルスにより形質転 換した細胞株のＴＡＲ配列の過剰発現は、これらをＨＩＶ−１感染に対して高度 に抵抗性にしている。スレンジャー（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ）ら（１９９０）Ｃｅ ｌｌ ６３：６０１を参照のこと。 トロンビンは、重要な凝血促進活性と抗凝固活性を有する、多官能性のセリン プロテアーゼである。凝血促進酵素として、トロンビンはフィブリノーゲンを凝 固させて、血液凝固第Ｖ因子、第VIII因子、及び第ＸIII因子を活性化し、血小 板を活性化する。トロンビンによるフィブリノーゲンの特異的切断は、血液凝固 形成の最初の事象であるフィブリンモノマーの重合を開始させる。血小板血栓の 形成における主要な事象は、「非結合」から「結合」モードへの血小板の活性化 であり、トロンビンは血小板凝集の最も強力な生理学的アクチベーターである（ バーントとフィリップス（Ｂｅｒｎｄｔ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）（１９８ １）Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ 、Ｊ．Ｌ．ゴードン（Ｊ．Ｌ．Ｇｏｒｄｏｎ）（編）（アムステルダム：エルセ ビア社（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）／北オランダ生物医学出版社（Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌ ｌａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ））、４３−７４ページ；ハンセ ンとハーカー（Ｈａｎｓｅｎ ａｎｄ Ｈａｒｋｅｒ）（１９８８） Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３１８４；エイト（Ｅｉｄｔ） ら （１９８９） Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ８４：１８）。こうして、凝血 促進物質としてトロンビンは、出血の阻止（生理的止血）と血管閉塞性血栓（病 的な血栓症）において中心的な役割を演じる。 抗凝固物質としてトロンビンは、血管内皮細胞の表面に発現するトロンボモジ ュリン（ＴＭ）に結合する。ＴＭは、活性部位の配置のアロステリックな変化と トロンビン上のＴＭとフィブリノーゲン結合部位の重複の組み合わせにより、基 質特異性をフィブリノーゲンと血小板からプロテインＣに変える。リン脂質表面 に存在する活性化プロテインＣ、Ｃａ²⁺、および第２のビタミンＫ依存性タンパ クコファクターであるプロテインＳは、タンパクを分解する第Ｖａ因子と第VIII ａ因子による凝固を阻害する。このようにトロンビン−ＴＭ複合体の形成は、ト ロンビンを凝血促進酵素から抗凝固酵素へと変換し、そしてこれらの対立する活 性の間の正常なバランスが止血の制御に決定的に重要である。 トロンビンはまた、凝固系から遠く離れた生物学的応答にも関与する（シュー マン（Ｓｈｕｍａｎ）（１９８６） Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４８ ５ ：３４９に総説；マークス（Ｍａｒｘ）（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６ ：１２７８）。トロンビンは単球の走化性物質であり（バー−シャビト（Ｂａｒ −Ｓｈａｖｉｔ）ら（１９８３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：７２８）、リンパ 球（チェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９７６） Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１０１： ４１）、間充織細胞（チェンとブキャナン（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｂｕｃｈａｎａ ｎ）（１９７５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２：１３ １）、および繊維芽細胞（マークス（１９９２）上記）の細胞分裂促進物質であ る。トロンビンは内皮細胞を活性化して、好中球接着タンパクＧＭＰ−１４０（ ＰＡＤＧＥＭ）を発現させ（ハットリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）ら（１９８９）Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７７６８）、血小板由来増殖因子を産生させる（ダ ニエル（Ｄａｎｉｅｌ）ら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９５ ７９）。最近トロンビンが、培養神経細胞による神経突起の収縮を引き起こすこ とが示された（マークス（１９９２）上記に総説）。 トロンビンが血小板と内皮細胞を活性化する機構は、これらの細胞に見い出さ れる機能性のトロンビンリセプターを介する。このリセプターの推定されるトロ ンビン切断部位（ＬＤＲ／Ｓ）は、リセプターのタンパク分解的な切断によりト ロンビンリセプターが活性化されることを示唆する。この切断という事象がＮ末 端ドメインを「露にし」て、これがリガンドとして作用してリセプターを活性化 する（ビュー（Ｖｕ）ら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：１０５４）。 血管傷害と血栓形成は、動脈硬化を含む種々の血管の疾患の病因の中心的な事 象である。種々の疾患状態や種々の部位（冠状動脈、心臓内および人工心臓弁） の血栓を導く、血小板および／または凝固系の活性化の発病過程は、異なるよう である。従って閉塞した血管を開き、再閉塞を妨げるためには、血栓溶解剤と併 用して、血小板阻害剤、抗凝固剤、または両者の組み合わせの使用が必要かも知 れない。 凝固カスケードの化合物による制御されたタンパク分解は、止血のために決定 的に重要である。その結果、部分的に一連の特異性の高いプロテアーゼ阻害剤に 基づく種々の複雑な制御系が存在する。病的な状態では、活性プロテアーゼの過 剰な産生または阻害活性の不活化により、機能的な阻害活性は妨害される。多数 の外傷（組織損傷）または感染（敗血症）に応答する炎症の持続は、トロンビン を含む血漿カスケード系と、リソソーム由来の両方のタンパク分解酵素に依存す る。これらの場合の多臓器不全（ＭＯＦ）は、併発するプロテアーゼとその阻害 性制御物質の不均衡により増強される。脳内のトロンビン活性の不均衡は、神経 変性疾患を引き起こす。 トロンビンは本来、ヘパリン依存性反応でアンチトロンビンIII（ＡＴIII）に 結合することにより、止血中に阻害される。ヘパリンは、ＡＴIIIの作用を増進 する能力によりその効果を発揮する。脳では、プロテアーゼネキシン（ｐｒｏｔ ｅａｚｅ ｎｅｘｉｎ）（ＰＮ−１）が、神経突起の生長を制御するトロンビン の天然の阻害剤であろう。 ヘパリンは、Ｄ−グルコサミンとウロン酸残基が交互に繰り返される鎖からな るグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓｏａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）である。現 在ヘパリンは、不安定な狭心症、肺塞栓症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、 および続く心筋梗塞の治療に抗凝固剤として広範囲に使用されている。その抗凝 固効果は、ＡＴIIIとの相互作用により媒介される。ヘパリンがＡＴIIIに結合す る と、ＡＴIIIの配置が変化して、著しく増強されたトロンビンの阻害剤となる。 ヘパリンは一般にある種の徴候に有効であると考えられているが、ＡＴIII・ヘ パリン複合体の物理的サイズが体内の多くの生物学的に活性のトロンビンへの接 近を防止して、凝血の形成を阻害する能力を減少させている。ヘパリンの副作用 には、出血、血小板減少、骨祖鬆症、皮膚の壊死、脱毛症（ａｌｐｅ）、過敏症 および低アルドステロン症（ｈｙｐｏａｌｄｏｓｅｒｏｎｉｓｍ）がある。 ヒルジンは、ヨーロッパの医用ヒルであるヒルディス・メディシナリス（Ｈｉ ｒｕｄｉｓ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ ）由来の、トロンビンの強力なペプチド阻 害剤である。ヒルジンは、α−トロンビンの全ての公知の機能を阻害し、２つの 別の部位（セリンプロテアーゼ活性の触媒部位またはその近くの高い親和性部位 と２番目のアニオン性の外の部位（ａｎｉｏｎｉｃ ｅｘｏｓｉｔｅ））で速度 論的にトロンビンに結合することが示されている。アニオン性の外の部位はまた 、フィブリノーゲン、ヘパリン、ＴＭ、および恐らく血小板と内皮細胞の活性化 の媒介に関係するリセプターにも結合する。Ｃ末端ヒルジンペプチド（これはト ロンビンとの共結晶化によりアニオン性の外の部位で結合することが示された） は、恐らくこの部位での結合に競合することにより、フィブリン形成、血小板と 内皮細胞の活性化、およびＴＭ結合を介するプロテインＣの活性化に阻害効果を 有する。このペプチドは、トリペプチド発色性基質（ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ ｃ ｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）、第Ｖ因子または第Ｘ因子に対 してはタンパク分解活性を阻害しない。 トロンビンの構造は、そのアニオン性の外の部位により、核酸結合の特に望ま しい標的になっている。この部位での部位特異的突然変異誘発は、フィブリノー ゲン−凝血とＴＭ結合活性が分離可能なものであることを示した。恐らく、トロ ンビンとどのように相互作用するか（すなわちそれが真似をする基質）に依存し て凝血促進および／または抗凝固効果を有するＲＮＡリガンドを選択されるので あろう。 トロンビンの１本鎖ＤＮＡリガンドは、セレックスと同一の方法により調製さ れた。ボック（Ｂｏｃｋ）ら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４を参照 のこと。コンセンサスリガンドは比較的少ない回転のセレックスを実行後に同 定され、これはインビトロの凝血形成を妨げる能力を有することが証明された。 このリガンドは、本明細書ではＧ１５Ｄ（配列ＩＤ番号：１）と呼ぶ、１５塩基 のＤＮＡ ５’ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’である。その１次配列の 対称性は、Ｇ１５Ｄが規則的な固定された３次構造を有することを示唆する。ト ロンビンへのＧ１５ＤのｋＤは、約２×１０^-7である。抗凝固物質としての有効 なトロンビン阻害のためには、トロンビンへのリガンドの親和性が強いほど良い 。 塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、間充織と神経外胚葉由来の多くの 細胞にとっての多官能性エフェクターである（リフキンとモスカテリ（Ｒｉｆｋ ｉｎ ＆ Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ）（１９８９）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１０９ ：１；ベアードとボーレン（Ｂａｉｒｄ ＆ Ｂｏｈｌｅｎ）（１９９１） Ｐ ｅｐｔｉｄｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄＴｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐ ｔｏｒｓ（スポーン，Ｍ．Ｂ．とロバーツ，Ａ．Ｂ．（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ． ＆ Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．）編）；３６９−４１８ページ、スプリンガー社 （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、ニューヨーク；バシリコとモスカテリ（Ｂａｓｉｌｉｃ ｏ ＆ Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ）（１９９２）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９：１１５）。これは、酸性ＦＧＦ（ジェイ（Ｊａｙｅ）ら（１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：５４１；アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら（１９８６ ） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：５４５）、ｉｎｔ−２（ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら （１９８６） ＥＭＢＯ Ｊ． ５：９１９）、ｋＦＧＦ／ｈｓｔ／ＫＳ３（デ リーボビ（Ｄｅｌｌｉ−Ｂｏｖｉ）ら（１９８７） Ｃｅｌｌ ５０：７２９； タイラ（Ｔａｉｒａ）ら（１９８７） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ８４：２９８０）、ＦＧＦ−５（ザン（Ｚｈａｎ）ら（１９８８） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３４８７）、ＦＧＦ−６ （マリックス（Ｍ ａｒｉｃｓ）ら（１９８９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ４：３３５）およびケラチン生 成細胞増殖因子／ＦＧＦ−７（フィンチ（Ｆｉｎｃｈ）ら（１９８９） Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２４５：７５２）をも含む関連タンパクのファミリーの内で、最も検 討された、そして最もよく性状解析されたメンバーの１つである。 インビトロで、ｂＦＧＦは細胞の増殖、遊走、プラスミノーゲンアクチベータ ーとコラゲナーゼ活性の誘導を剌激する（プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）ら（１９８ ６） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ６：４０６０；モスカテリら（１９８６ ） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２０９１；ミグナ ッチ（Ｍｉｇｎａｔｔｉ）ら（１９８９） Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０８ ：６７１）。インビボで、これは新血管新生の最も強力な誘導物質の１つである 。そのインビボの血管新生活性は、組織修復と創傷治癒だけでなく、病的な新血 管新生により特徴付けられる疾患の状態（例えば腫瘍の増殖、腫瘍の転移、糖尿 病性網膜症および慢性関節リウマチ）においての役割をも示唆する（フォークマ ンとクラグスブルン（Ｆｏｌｋｍａｎ ＆ Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ）（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２；ゴスポダロビッツ（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗ ｉｔｚ）（１９９１） Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２５：３ ０７）。 ｂＦＧＦは分泌のためのシグナル配列を持たないが、恐らくエキソサイトーシ スにより運ばれて原形質膜の両側に見い出される（ブロダブスキー（Ｖｌｏｄａ ｖｓｋｙ）ら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１６：２６８；ミ グナッチとリフキン（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４７：２０ １）。細胞外マトリックスでは、これは典型的には、ヘパラン硫酸プロテオグリ カンを含有する分画と会合している。実際ヘパリンアフィニティークロマトグラ フィーは、これと他のヘパリン結合増殖因子の精製に有用な方法である。ｂＦＧ Ｆは、細胞培養では低親和性部位と高親和性部位に結合する。低親和性部位は、 ｂＦＧＦが約ナノモルの親和性で結合する、細胞に会合したヘパラン硫酸プロテ オグリカンよりなる（モスカテリ（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３１ ：１２３）。ｂＦＧＦの全ての生物学的効果は、二量体チロシンキナーゼ ＦＧＦリセプターである高親和性結合部位（１０−１００ｐＭ）との相互作用に より媒介される（ウエノ（Ｕｅｎｏ）ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７ ：１４７０）。現在までに５つのＦＧＦリセプター遺伝子が同定されてお り、その各々が別のｍＲＮＡスプライシングの結果として数種の構造変異体を産 生できる（アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）ら（１９９２） Ｃａｎｃ ｅｒ Ｒｅｓ．５２：２００４；ウエノら（１９９ ２）上記）。これまでに、低親和性結合部位と高親和性結合部位がｂＦＧＦの全 体の親和性を決定するのに協同して作用するというかなりの証拠がある。グリコ サミノグリカン合成に欠損のある変異体細胞株（ヤヨン（Ｙａｙｏｎ）ら（１９ ９１）Ｃｅｌｌ ６４：８４１）またはヘパリチナーゼ（ｈｅｐａｒｉｔｉｎａ ｓｅ）処理細胞（ラプレーガー（Ｒａｐｒａｅｇｅｒ）ら（１９９１）Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２５２：１７０５）を用いた実験は、細胞に会合したヘパラン硫酸また はこれが無い状態で、ｂＦＧＦに外から添加したヘパリンの結合にはチロシンキ ナーゼリセプターを介してのシグナルが必要であることを証明した。観察された Ｋｄを速度論成分に分解した最近の結果は、低親和性部位と高親和性部位へのｂ ＦＧＦの会合速度は同等であるが、細胞表面リセプターからのｂＦＧＦの解離速 度は、細胞に会合したヘパラン硫酸に比べて２３倍遅いことを示している（ヌー ゲントとエーデルマン（Ｎｕｇｅｎｔ ＆Ｅｄｅｌｍａｎ）（１９９２）Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：８８７６）。しかし、遅い解離速度はリセプターが 細胞表面に結合している時にのみ観察され、これは両部位への同時結合が全体の 高親和性結合に寄与していることを示唆している。これは、最近解けたｂＦＧＦ のＸ線結晶構造から決定されたように、ヘパリン結合部位とリセプター結合部位 が、分子の近くではあるが分離した領域に位置するという観察結果を考えると、 ありうることである（ザング（Ｚｈａｎｇ）ら（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３４４６；エリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏ ｎ）ら（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８： ３４４１；アゴ（Ａｇｏ）ら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０：３６０ ；ズー（Ｚｈｕ）ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：９０）。 ｂＦＧＦ拮抗物質が有用な薬剤応用を有するというアイデアは、新規なもので はない（ゴスポダロビッツ（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ）（１９９１）上記に 総説）。今ではｂＦＧＦは、血管損傷に続く平滑筋細胞の病変の進展に中心的な 役割を果たすことが知られている（レイディー（Ｒｅｉｄｙ）らＣｉｒｃｕｌａ ｔｉｏｎ、追補III８６：III−４３）。ｂＦＧＦ（およびＦＧＦファミリーの他 のメンバー）の過剰発現は、多くの悪性疾患に相互に関係し（ハラ バン（Ｈａｌａｂａｎ）ら（１９９１） Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ６３８：２３２；タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ら（１９９０） Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：５７１０；フジモト（Ｆｕｊｉ ｍｏｔｏ）ら（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ ｍｕｎ．１８０：３８６）、そして最近、中和活性抗ｂＦＧＦ抗体が、腫瘍に関 連した血管新生を阻害することによりインビボで固形腫瘍増殖を抑制することが 見い出された（ホリ（Ｈｏｒｉ）ら（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１： ６１８０）。この点に関して注目すべきことは、公知の抗原虫活性を有するポリ 硫酸化ナフタレン誘導体であるスラミン（ｓｕｒａｍｉｎ）の、抗腫瘍剤として の最近の治療試験である。スラミンは、ポリアニオン結合部位に結合して、増殖 因子のリセプターとの相互作用を破壊することにより、ｂＦＧＦの活性を阻害す ると考えられている（ミッドー（Ｍｉｄｄａｕｇｈ）ら（１９９２） Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：９０１６；エリクソンら（１９９２）上記）。多くの 副作用と実質的な毒性を有することに加えて、スラミンは他の数種のヘパリン結 合増殖因子と相互作用し、これにより有益な臨床効果を特異的薬剤−タンパク相 互作用に結びつけることを困難にしている（ラ・ロッカ（Ｌａ Ｒｏｃｃａ）ら （１９９０）ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓ ２：１０６）。あるヘパリン製剤の抗血 管新生の性質も観察され（フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）ら（１９８３） Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９；クルム（Ｃｒｕｍ）ら（１９８５） Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２５０：１３７５）、これらの効果は恐らく少なくとも一部は、これら のｂＦＧＦシグナルに干渉する能力に基づいている。ｂＦＧＦ結合に寄与する特 定のヘパリン画分は、現在部分的に解明されている（イシャイ−ミカエリ（Ｉｓ ｈａｉ−Ｍｉｃｈａｅｌｉ）ら（１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１ ：２０８０；ターンブル（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ）ら（１９９２） Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６７：１０３３７）が、典型的なヘパリン製剤はサイズ、硫酸化の 程度およびイズロン酸（ｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）含有量の点で不均一であ る。さらに、ヘパリンは多くの酵素と増殖因子にも影響を及ぼす。従って、モノ クローナル抗体を除いて、ｂＦＧＦの特異的拮抗物質は知られていない。発明の要約 本発明は、核酸リガンドを同定し産生する方法、およびこうして同定し産生さ れた核酸リガンドを含む。上述のセレックス法は、特定の標的に対する単一の核 酸リガンドまたは核酸リガンドのファミリーの同定を可能にする。本発明の方法 は、改良された核酸リガンドを同定し産生するための、セレックスにより得られ た核酸リガンドまたは核酸リガンドのファミリーの分析を可能にする。 本発明には核酸リガンドの３次元構造を決定する方法も含まれる。このような 方法は、数学的モデル化とセレックス由来のリガンドの構造修飾を含む。さらに 本発明には、リガンドの３次元構造を維持するのにどの核酸残基が必要か、そし てどの残基が標的と相互作用してリガンド−標的結合対の形成を促進するかを、 決める方法も含まれる。 本発明の１つの実施態様では、標的の１つまたはそれ以上の生物学的活性を阻 害する能力により核酸リガンドが好ましい。このような場合、核酸リガンドが目 的の生物学的活性を有効に阻害するかどうかを決めるための方法が与えられる。 さらに、薬剤または診断目的に使用するための、より強く結合するＲＮＡリガ ンド、およびより小さく、より安定なリガンドを同定する方法も、本発明に含ま れる。 本発明はＨＩＶ−ＲＴとＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクに対する改良された核酸 リガンドを含む。また本発明は、特に本明細書で同定された核酸リガンドと実質 的に相同であり、そして実質的にこれと同一のＨＩＶ−ＲＴまたはＨＩＶ−１Ｒ ｅｖタンパクに結合する能力を有する核酸配列も含む。 また本発明の範囲には、伸長した核酸リガンドを同定するための連続的なセレ ックス実験を実施する方法も含まれる。特に、ＨＩＶ−ＲＴに対する伸長した核 酸リガンドが開示される。伸長したＨＩＶ−ＲＴ核酸リガンドと実質的に相同で あり、そして実質的にこれと同一のＨＩＶ−ＲＴに結合する能力を有する核酸配 列もまた、本発明に含まれる。 本発明の範囲にはＨＩＶ−１ｔａｔタンパクに対する核酸リガンドが含まれる 。さらに具体的には、ｔａｔタンパクに結合できるＲＮＡ配列が同定されている 。図２６と２７に示される核酸リガンドの解が、本発明に含まれる。 さらに、ａ）核酸の候補混合物を調製し；ｂ）該候補混合物のメンバーをｔａ ｔ タンパクに対する親和性に基づいて分画し；そしてｃ）選択された分子を増幅 して、ｔａｔタンパクに対して相対的に高い結合親和性を有する核酸配列が濃縮 された、核酸の混合物を得る工程よりなる、ＨＩＶ−１ｔａｔタンパクに対する 核酸リガンドとリガンドの解を同定する方法が、本発明に含まれる。 さらにトロンビンに対する核酸リガンドが、本発明に含まれる。さらに具体的 には、トロンビンに結合できるＲＮＡ配列が同定されている。本発明には図２９ と３０に示される核酸リガンドの解が含まれる。 さらに、ａ）核酸の候補混合物を調製し；ｂ）該候補混合物のメンバーをトロ ンビンに対する親和性に基づいて分画し；そしてｃ）選択された分子を増幅して 、トロンビンへの相対的に高い結合親和性を有する核酸配列が濃縮された、核酸 の混合物を得る工程よりなる、トロンビンに対する核酸リガンドとリガンドの解 を同定する方法が、本発明に含まれる。 さらに具体的には、本発明は、図２９に示したリガンド（配列ＩＤ番号：１３ ７−１５５）を含む、上述の方法により同定されたトロンビンに対するＲＮＡリ ガンドを含む。さらに本発明には、任意の特定のリガンドと実質的に相同であり 、そして実質的に同一のトロンビンに結合する能力を有する、トロンビンに対す るＲＮＡリガンドも含まれる。さらに本発明には、本明細書に記載されたリガン ドと実質的に同一の構造を有し、そして実質的に同一のトロンビンに結合する能 力を有する、トロンビンに対するＲＮＡリガンドが含まれる。 さらに本発明には、ｂＦＧＦに対する核酸リガンドが含まれる。具体的には、 ｂＦＧＦに特異的に結合できるＲＮＡ配列が提供される。本発明には表II−IV（ 配列ＩＤ番号：２７−８９）に示される核酸リガンド配列が含まれる。 また本発明には、ｂＦＧＦの阻害物質である、ｂＦＧＦの核酸リガンドも含ま れる。具体的には、リセプターへのｂＦＧＦの結合を阻害するＲＮＡリガンドが 同定され、記載される。 さらに本発明には、ａ）核酸の候補混合物を調製し；ｂ）該候補混合物のメン バーをｂＦＧＦに対する親和性に基づいて分画し；そしてｃ）選択された分子を 増幅して、ｂＦＧＦへの相対的に高い結合親和性を有する核酸配列が濃縮された 、 核酸の混合物を得る工程よりなる、ｂＦＧＦに対する核酸リガンドとリガンド配 列を同定する方法が含まれる。 さらに具体的には、本発明は表II−IVに示したリガンドを含む、上述の方法に より同定されたｂＦＧＦに対するＲＮＡリガンドを含む。さらに本発明には任意 の特定のリガンドと実質的に相同であり、そして実質的に同一のｂＦＧＦに結合 する能力を有する、ｂＦＧＦに対するＲＮＡリガンドも含まれる。さらに本発明 には、本明細書に記載されたリガンドと実質的に同一の構造を有し、そして実質 的に同一のｂＦＧＦを阻害する能力を有する、ｂＦＧＦに対するＲＮＡリガンド が含まれる。 本発明はまた、本明細書で同定された核酸リガンド配列に基づく修飾ヌクレオ チド配列とその混合物も含む。具体的には、ＲＮＡリガンドのインビボ安定性を 増加させるために、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置を 修飾した、ＲＮＡリガンドが本発明に含まれる。塩基配列の特異的変化、および 核酸または非核酸部分の原化合物への付加を含む、ＲＮＡリガンドに対する他の 修飾が本発明に包含される。図の簡単な説明 図１は、ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＨＩＶ−ＲＴ）の高親和性阻害性リガンドを 記載する、１次および２次セレックス実験によるコンセンサスにせ結び目を示す 。コンセンサス２次構造はにせ結び目であり；このにせ結び目の５’らせん（軸 １）は１次配列のレベルで保存され、３’らせん、すなわち軸２は保存されてい ない。Ｘは、非保存のヌクレオチドの位置を示し；Ｘ−Ｘ’は好ましい塩基対を 示す。ここに示すように２６のヌクレオチドに番号がつけられている。 図２は、５’情報の境界の改良を示す。一連のモデルリガンドは、鋳型オリゴ からＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した（ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ ）ら（１９８７） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１５：８７８３）。左上に描 いたのは完全なリガンドＢである。右端には、四角で囲まれた領域に生じる個々 のリガンドＡからＥの変動を示す。これらのモデルリガンドの個々の結合曲線を 、グラフに示す。 図３は、ＨＩＶ−ＲＴへの結合に及ぼす、リガンドＢ配列内の種々のヌクレオ チド置換の効果を示す。種々の置換と、リガンドＢの結合への割合で表現された 、その結果としてのＨＩＶ−ＲＴへの親和性が記載される。リガンドＢは、各実 験で試験された対照であり；リガンドＢの親和性を１．０として標準化して、相 対親和性を示す（リガンドＢのＫｄを各リガンドのＫｄで割る）。種々の末端を 切り取ったリガンドＢの親和性も示す。Ｕ１−Ｇｌ６を置換するアステリスク付 のＧ−Ｇに関連する値は、図２のリガンドＣに由来する。 図４は、リガンドＢの変性したコンフォメーションに対する非変性コンフォメ ーションの化学プローブを示す。リガンドＢの種々のヌクレオチドを、非変性お よび変性した条件下で化学物質と反応させて、修飾した位置を測定し、電気泳動 にかけ、比較のために可視化して比較した。■はその位置の塩基の反応性の高い 塩基対形成基を示し、□は部分的反応性を示す；▲はプリンＮ７位の強力な反応 性を示し、△は部分的反応性を示す（ＤＥＰＣでの修飾に対して）。クエスチョ ンマークは、Ｇ（−２）とＧ（−１）上のこれらの位置は、ゲル上のバンドの密 集により区別できなかったことを示す。 図５は、ＨＩＶ−ＲＴに結合した時のリガンドＢの修飾可能な基の反応性を示 す。ＨＩＶ−ＲＴに結合した時に、非変性コンフォメーションの反応性に比較し て変化した反応性を示した基を図に示す。 図６は、ＨＩＶ−ＲＴと複合体を形成するリガンドＢの修飾妨害結果を示す。 修飾についての記号は、四角で囲まれた凡例にあるとおりである。ＨＩＶ−ＲＴ への結合（選択される集団中でその位置で低下する修飾に反映される）に対して 、強く（黒の記号）または部分的に（白の記号）選択される修飾を示す。 図７は、右上に示されるリガンドＢ配列のリボース上のヒドロキシルの代わり の２’−メトキシの置換を示す。白丸は示される位置でのヒドロキシル基を示し 、黒丸はメトキシ置換を示す。 図８は、Ｕ１からＡ５とＡ１２からＡ２０の位置での２’−ヒドロキシルに対 する２’−メトキシリボースの混合集団からのＨＩＶ−ＲＴによる選択を示す。 下記の配列（配列ＩＤ番号：２）： ５’−（ＡＡＡＡＡ）_d（ＵＣＣＧＡ）_x（ＡＧＵＧＣＡ）_m（ＡＣＧＧＧＡＡＡ Ａ）_x（ＵＧＣＡＣＵ）_m-3 （ここで、下付文字の「ｄ」は２’−デオキシを示し、下付文字の「ｘ」はこれ らのヌクレオチドがホスホラミジト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）試薬と ５０−５０混合されてリボース上の２’−メトキシまたは２’−ヒドロキシルが 生じることを示し、そして下付文字の「ｍ」はこれらのヌクレオチドが全てリボ ース上の２’−メトキシであることを示す）を有するオリゴヌクレオチドを合成 した。 図９は、出発物質のＲＮＡと、実験の一部としてＨＩＶ−ＲＴを用いてセレッ クスから得られた配列の集合（配列ＩＤ番号：１１５−１３５）を示す。 図１０は、図９に示される配列のリストから得られた、コンセンサス伸長ＨＩ Ｖ−ＲＴリガンド（配列ＩＤ番号：１３６）を示す。 図１１は、ＨＩＶ−ＲＴのにせ結び目リガンドの改定した記述を示す。図１の 標識に関する約束に加えて、Ｓ−Ｓ’はこの位置での好ましいＣ−ＧまたはＧ− Ｃ塩基対を示す。 図１２は、セレックス実験から得られたＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクの高い親 和性ＲＮＡリガンドの配列を示す。このＲＮＡの特定の塩基に関して使用される 番号付きの概略図を示す。この配列はＥＮＵを用いる化学修飾に使用された。図 １２はまた、ａ）でＤＭＳ、ケトキサール（ｋｅｔｈｏｘａｌ）、ＣＭＣＴ、お よびＤＥＰＣを用いた化学修飾実験に使用された伸長したＲＮＡ配列も示す。伸 長したリガンド配列の１次伸長に使用されたオリゴヌクレオチドの配列をｂ）に 示す。 図１３は、非変性条件下でのＨＩＶ−１ ＲｅｖリガンドＲＮＡの化学修飾の 結果を示す。ａ）には化学修飾試薬、その特異性および部分的および全面的修飾 を示す記号をリストしている。修飾された塩基毎に表示された修飾の程度とタイ プと一緒に、ＲＮＡ配列を示す。ｂ）には、修飾とコンピューター構造予測デー タに対応する、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ ＲＮＡリガンドのらせん、隆起、およびヘ アピン構造要素を示す。 図１４は、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクへの結合を妨害するリガンドＲＮＡの 化学修飾の結果を示す。タンパク結合を妨害する修飾を記載し、強い妨害と弱い 妨害に分類した。記号は、塩基対形成修飾、Ｎ７修飾、またはリン酸修飾のいず れかを意味する。 図１５は、リン酸アルキル化の修飾妨害値（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｔ ｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）を示す。データはＡ１７の３’リン酸に対し て標準化してある。 図１６は、Ｎ３ＣとＮＩＡのＤＭＳ修飾の修飾妨害値を示す。データはＣ３６ ；Ａ３４に対して標準化してある。 図１７は、ＮＩＧとＮ２Ｇのケトキサール修飾の修飾妨害値を示す。データは Ｇ５に対して標準化してある。 図１８は、Ｎ３ＵとＮＩＧのＣＭＣＴ修飾の修飾妨害値を示す。データはＵ３ ８に対して標準化してある。 図１９は、Ｎ７ＡとＮ７ＧのＤＥＰＣ修飾の修飾妨害値を示す。データはＧ１ ９；Ａ３４に対して標準化してある。 図２０は、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクの存在下でのＲＮＡリガンドの化学修 飾を示す。非変性条件下であるがタンパクの存在しない条件下での修飾に比較し て、タンパクの存在下での修飾の低下または修飾の増強のいずれかを示した位置 を示す。 図２１は、セレックスで使用された「６ａ」の偏ったランダム領域の隣接する ５’と３’配列を示す。最初のＲＮＡ集団を産生する鋳型は、下記のオリゴヌク レオチド： （ここで、鋳型オリゴの小文字は、各位置で６２．５％の小文字のものと各１２ ．５％の他の３つのヌクレオチドの量での試薬の混合物を合成に使用したことを 示す）から作成された。６ａ配列の下に記載したのは、このＲＮＡの集団を有す る Ｒｅｖタンパクを用いてセレックスを６回実施した後にクローン化した３８単離 体の配列である。これらの単離体に見い出される６ａ配列との差は太字で示して ある。下線部は、モチーフＩ Ｒｅｖリガンドの隆起に隣接する軸を包含する予 測された塩基対である。５’と３’の固定隣接配列から含まれる塩基は小文字で ある。 図２２は： Ａ）図２１に見い出された配列の集合中の、Ｒｅｖ ６ａリガンド配列の対応す る位置に見い出された各ヌクレオチドの数； Ｂ）これらの位置に見い出された各ヌクレオチドの小数で示した頻度（ｘ÷３８ 、ここでｘは１からの数）；そして Ｃ）Ｂ）の小数で示した頻度と、鋳型合成の間の投入したオリゴヌクレオチドの 混合物に基づく予測頻度との差［「野生型」の位置については、（ｘ÷３８）− ０．６２５、そして代替配列については、（ｘ÷３８）−０．１２５］、 を含む３セットの表を示す。 図２３は： Ａ）図２１に見い出された配列の集合中の、Ｒｅｖ ６ａリガンド配列の対応す る位置に見い出された各ヌクレオチドの数； Ｂ）これらの位置に見い出された各ヌクレオチドの小数で示した頻度（ｘ÷３８ 、ここでｘはＡからの数）；そして Ｃ）Ｂ）の小数で示した頻度と、鋳型合成の間の投入したオリゴヌクレオチドの 混合物に基づく予測頻度との差［「野生型」の位置については、（ｘ÷３８）− ０．３９５；１つの代替ヌクレオチドと１つの野生型ヌクレオチドを含有する塩 基対については、（ｘ÷３８）−０．０７８；そして２つの代替ヌクレオチドの 塩基対については（ｘ÷３８）−０．０１６］、 を含む３セットの表を示す。値はプリンとピリミジン対のみが示され、他の８つ のピリミジンとプリン対は集合的に数えて「その他」として示し、セクションＣ ）に（ｘ÷３８）−０．２５２として計算してある。 図２４は、あらかじめ決定されたＲｅｖタンパクリガンドモチーフＩコンセン サス（１９９１年６月１０日に出願した、合衆国特許出願番号０７／７１４，１ ３１号；ＷＯ９１／１９８１３号）を示す。同じ出願から６ａ配列、および好ま しいコンセンサスは、図２２と２３に与えられるデータから解釈されるように、 偏ったランダム化セレックスにより誘導される。好ましいコンセンサス中の絶対 的に保存される位置は太字で示し、そしてＳ−Ｓ’はＣ−ＧまたはＧ−Ｃ塩基対 を示す。 図２５は、ｔａｔタンパクと相互作用するＨＩＶ−１からの天然ＲＮＡ配列（ すなわちＴＡＲ ＲＮＡ）を示す。配列の四角で囲んだ領域は、ｔａｔ−ＴＡＲ 相互作用において重要であることが見い出されたヌクレオチドである。 図２６は、ＨＩＶ−１ｔａｔタンパクに対する核酸リガンドとして本発明によ り単離されたリガンドの配列を示す。これらの配列は、３つのモチーフ（Ｉ、II およびIII）中の共通の２次構造と１次配列により分類される。ＲＮＡらせんを 予測させる逆繰り返し配列を、矢印で示す。各モチーフ中の一次配列の相同の領 域は、破線の四角で囲まれている。高い親和性結合に必須の配列情報の境界は、 実線の四角で示してある。配列１と１７は、３つの同定されたモチーフのいずれ にも適合しない。 図２７は、図２６に示す各リガンドモチーフのコンセンサス２次構造と一次配 列の概略図を示す。Ｘは非保存ヌクレオチドの位置を示す。Ｘ’はらせん中のそ の位置でのＸに相補的な塩基対を示し、Ｒはプリンを、そしてＹはピリミジンを 示す。モチーフIII中の破線は、そのループの部分での可変数のヌクレオチドを 示す。 図２８は、図２６から選択されたリガンドＲＮＡ、および４０ｎ ＲＮＡ候補 混合物のニトロセルロースフィルターへの、ｔａｔタンパク濃度依存性の結合を 示す。 図２９は、セレックスにより単離されたヒト・トロンビン・タンパク（シグマ （Ｓｉｇｍａ））に対するＲＮＡリガンドのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号： １３７−１５５）を示す。各配列は、左から右へ３つのブロック：１）５’固定 領域、２）３０Ｎ可変領域、および３）３’固定領域に分画される。個々の配列 は、下線付の太字で示すように、３０Ｎ可変領域内の保存配列モチーフにより、 クラスＩとクラスIIに分類される。 図３０は、ＲＮＡリガンド（配列ＩＤ番号：１５６−１５９）の提案される２ 次構造を示す。（Ａ）は、７６ヌクレオチドのクラスＩＲＮＡクローン６、１６ 、および１８の配列、そしてクラスIIの７２ヌクレオチドのクローン２７の配列 を示す。境界位置（［は５’境界を意味し、そして］は３’境界を意味する）も 、示してある。境界実験から決定された、各ＲＮＡの可能な２次構造が、（Ｂ） に示してある。境界は下線で示される。（Ａ）と（Ｂ）には５’と３’の固定領 域を小文字で示し、３０Ｎランダム領域は大文字で、そして保存領域は太字の大 文字で示してある。合成されたヘアピン構造は、記載したヌクレオチドの総数と 一緒に四角で囲んである。 図３１は、トロンビンのリガンドの結合曲線を示す。ヒト・トロンビン（シグ マ（Ｓｉｇｍａ））との結合分析のために、（Ａ）で、クラスＩから３つ：ＲＮ Ａ６、ＲＮＡ１６、およびＲＮＡ１８、およびクラスIIから１つ：ＲＮＡ２７を 含む、ユニークな３０Ｎ配列モチーフを有するＲＮＡを選択した。３０Ｎ３候補 混合物の大量のＲＮＡ配列の結合も、示してある。（Ｂ）では、クラスＩＲＮＡ クローン６、１６、１８、およびクラスIIＲＮＡクローン２７の結合を示すが、 エンザイムリサーチラボラトリーズ（Ｅｎｚｙｍｅ ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ）からのヒト・トロンビンとの結合を示す。（Ｃ）では、（Ｂ ）と同一の条件下での、１５塩基のｓｓＤＮＡ５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴ ＴＧＧ−３’（Ｇ１５Ｄ）（配列ＩＤ番号：１）、クラスＩクローン１６ヘアピ ン構造（２４Ｒ、３９Ｄ）およびクラスIIクローン２７ヘアピン構造（３３Ｒ） の結合を示す（図３０Ｂ参照）。ＲＮＡヘアピン構造の場合は、ＲはＲＮＡ合成 を意味し、そしてＤはＤＮＡ鋳型からの転写を意味する。 図３２は、未修飾ＲＮＡと、２’−ＮＨ₂リボースヌクレオチドを含有するよ うに修飾されたピリミジンを有するＲＮＡとの間の、ＲＮＡリガンドの結合比較 を示す。（Ａ）大量ＲＮＡ３０Ｎ候補混合物と２−ＮＨ₂修飾３０Ｎ候補混合物 、（Ｂ）クラスＩＲＮＡ１６と２−ＮＨ₂修飾ＲＮＡ１６、および（Ｃ）クラスI IIＲＮＡ２７と２−ＮＨ₂修飾ＲＮＡ２７の結合比較が示してある。 図３３は、本発明の１５塩基のｓｓＤＮＡ Ｇ１５ＤとＲＮＡヘアピンリガン ド間の、ヒト・トロンビンへの結合に関する競合実験を示す。Ａ）では、トレー サ−Ｇ１５Ｄの濃度はタンパク濃度１ｐＭに等しい。結合の競合物は、Ｇ１５Ｄ 自体、クラスＩＲＮＡｌ６からの２４と３９ヌクレオチドのＲＮＡヘアピン構造 、およびクラスIIＲＮＡ２７からの３３ヌクレオチドＲＮＡヘアピン構造を含む （図３０参照）。結合は、結合したＧ１５Ｄの相対割合として表してあり、これ は競合物のある時のＧ１５Ｄ結合と、競合物のない時のＧ１５Ｄ結合との比であ る。Ｂ）では、ＲＮＡ３３はトレーサーであり、このトレーサーの濃度はプロテ アーゼの濃度３００ｎＭに等しい。結合の競合物は、ｓｓＤＮＡ Ｇ１５ＤとＲ ＮＡ２４を含む。 図３４は、記載されたＲＮＡリガンド阻害剤の存在下および非存在下での、ト ロンビンの機能の測定の結果を示す。Ａ）では、記載したトロンビンとＲＮＡ濃 度での、発色性基質Ｓ−２２３８（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐニトロ アニリン）のトロンビンによる加水分解を、ＯＤ４０５での変化により測定した 。Ｂ）では、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換と、その結果生じる凝固形 成を、記載されたＲＮＡリガンド阻害剤の存在下および非存在下での傾斜試験（ ｔｉｌｔ ｔｅｓｔ）により測定した。 図３５は、トロンビンのリガンドに対する結合の特異性を示す。Ａ）ヒト・ア ンチトロンビンIII（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、およびＢ）ヒト・プロトロンビ ン（シグマ）との結合分析のために、クラスＩＲＮＡ１６、クラスIIＲＮＡ２７ 、および大量の３０Ｎ３ ＲＮＡを選択した。 図３６は、ファミリー１リガンド７Ａ（△）、ファミリー２リガンド１２Ａ（ □）、セレックス実験ＡのランダムＲＮＡ（＋）およびセレックス実験Ｂのラン ダムＲＮＡ（×）の結合曲線を示す。ニトロセルロースフィルターに結合したＲ ＮＡの画分を、遊離のタンパク濃度の関数としてプロットして、データの点を式 ２に適合させた。以下の濃度のＲＮＡを使用した：７Ａと１２Ａでは＜１００ｐ Ｍ、ランダムＲＮＡでは１０ｎＭ。結合反応は、０．０１％ヒト血清アルブミン を含有するリン酸緩衝化生理食塩水中で３７℃で行った。 図３７は、低親和性（パネルＡ）と高親和性（パネルＢ）細胞表面リセプター への¹²⁵ Ｉ−ｂＦＧＦの結合に及ぼす、リガンド５Ａ（○）、７Ａ（△）、１２ Ａ（□）、２６Ａ（◇）、セレックス実験ＡのランダムＲＮＡ（＋）およびセレ ックス実験ＢのランダムＲＮＡ（×）の効果を示す。実験は、基本的にログハニ とモスカテリ（Ｒｏｇｈａｎｉ ＆ Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ）（１９９２）Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２２１５６に記載されたように行った。 図３８は、³²Ｐ−標識ＲＮＡリガンド５Ａ（○）、７Ａ（△）、１２Ａ（□） および２６Ａ（◇）の、ヘパリン（平均分子量５，０００Ｄａ）による競合置換 を示す。ニトロセルロースフィルターに結合した全体の投入ＲＮＡのパーセント を、ヘパリン濃度の関数としてプロットする。実験は、０．０１％ヒト血清アル ブミン、０．３μＭのＲＮＡ、および３０ｎＭのｂＦＧＦを含有するリン酸緩衝 化生理食塩水中で３７℃で行った。 図３９は、高い親和性でｂＦＧＦに結合するファミリー１リガンドの提唱され た２次構造を示す。矢印は、保存ループに隣接する２本鎖（軸）領域を示す。小 文字は、定常領域にあるヌクレオチドを示す。 図４０は、ファミリー１リガンドの提唱された二次構造を示す。 図４１は、ファミリー１とファミリー２リガンドのコンセンサス構造を示す。 Ｙ＝ＣまたはＵ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｗ＝ＡまたはＵ；Ｈ＝Ａ、Ｕ、またはＣ；Ｄ ＝Ａ、Ｇ、またはＵ；Ｎ＝任意の塩基である。相補塩基がプライムされる。カッ コ内の記号は、その位置で下付文字で示した境界範囲内の可変数の塩基または塩 基対を示す。好ましい実施態様の詳細な説明 本出願は、セレックスと呼ばれる核酸リガンドを同定するための方法の拡張と 改良である。セレックス法は、「核酸リガンド」という標題で１９９１年６月１ ０日に出願された合衆国特許出願番号０７／７１４，１３１号、および「指数的 濃縮によるリガンドの系統的進化」という標題で１９９０年６月１１日に出願さ れた合衆国特許出願番号０７／５３６，４２８号、および「核酸リガンド」とい う標題で１９９１年１２月２６日に公開されたＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９１／１ ９８１３号に詳細に記載されている。これらの出願の全文は、セレックス方法の 定義と説明を含めて（しかしこれに制限されない）、参照により具体的に本明細 書に取込まれている。 本出願は、基本的セレックス方法に基づく、改良された核酸リガンドを同定し 産生するための方法を含む。本出願は、本発明の下記の実施態様を包含する異な るセクションを含む：Ｉ．セレックス方法：II．セレックスを実施した後の改良 された核酸リガンドを同定する技術；III．連続セレックス実験−ウォーキング 法（ｗａｌｋｉｎｇ）；IV．共分散分析によるリガンドの構造の解明；Ｖ．ＨＩ Ｖ−ＲＴの改良された核酸リガンドの解明（実施例１）；VI．伸張された核酸リ ガンドを同定するためのＨＩＶ−ＲＴ核酸リガンドを用いるウォーキング法実験 の実行；およびVII．ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクの改良された核酸リガンド（ 実施例２）；ＨＩＶ−１ｔａｔタンパクに対する核酸リガンド（実施例３）；ト ロンビンへの核酸リガンド（実施例４）；およびｂＦＧＦに対する核酸リガンド （実施例５）の解明。 ＨＩＶ−ＲＴとＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクに対する改良された核酸リガンド が、本明細書に開示され、特許請求される。本発明は、本明細書中で同定された 特異的核酸リガンドを含む。本発明に包含されるリガンドの範囲は、本明細書中 で記載される方法により同定されたＨＩＶ−ＲＴとＲｅｖタンパクの全てのリガ ンドに拡大される。さらに具体的には、本発明は、本明細書中で同定された核酸 リガンドと実質的に相同であり、生理的条件下でＨＩＶ−ＲＴまたはＲｅｖタン パクに結合する、実質的にこれらと同一の能力を有する核酸配列を含む。実質的 に相同とは、相同の程度が７０％以上、最も好ましくは８０％以上であることを 意味する。実質的に相同とはまた、塩基対形成領域を含む核酸リガンドの領域で の塩基対フリップ（ｆｌｉｐｓ）も含む。ＨＩＶ−ＲＴまたはＲｅｖタンパクに 結合する実質的に同一の能力とは、親和性が本明細書中で記載された核酸リガン ドの親和性の大きさと２桁の範囲内にあり、そして好ましくは１桁の大きさの範 囲内にあることを意味する。ある配列が、本明細書中で同定された配列と実質的 に相同であり、ＨＩＶ−ＲＴまたはＲｅｖタンパクに結合する実質的にこれらと 同一の能力を有するかどうかを決定することは、当業者にとって特別難しいこと ではない。 Ｉ．セレックス方法． 最も基本的な形では、セレックス方法は以下の一連の工程により定義される： １）異なる配列の核酸の候補混合物を調製する。候補混合物は、一般に固定配 列の領域（すなわち、候補混合物の各メンバーは同一位置に同一配列を含有する ）とランダム化した配列を含む。固定配列領域は、ａ）以下に記載される増幅工 程を援助するため；ｂ）標的に結合することが公知の配列の模倣を促進するため ；またはｃ）候補混合物中の、特定の構造配置の核酸の濃度を上昇させるために 、選択される。ランダム化された配列は、完全にランダム化（例えば、任意の位 置の塩基を見い出す確率が４分の１）されるか、または一部のみがランダム化（ 例えば、任意の位置の塩基を見い出す確率が０と１００パーセントの間の任意の レベルを選択されうる）されていてよい。 ２）候補混合物を、標的と候補混合物のメンバー間の結合に都合のよい条件下 で、選択された標的に接触させる。これらの状況下では、標的と候補混合物の核 酸間の相互作用により、標的と、標的に対する最も強力な親和性を有する核酸と の間の核酸−標的対を形成すると考えられる。 ３）標的に対して最も高い親和性を有する核酸は、標的に対して低い親和性を 有する核酸から分画される。高親和性核酸に相当する極く少数の配列（おそらく １分子の核酸）しか候補混合物中に存在しないため、一般に、分画中かなりの量 （約５−５０％）の核酸が候補混合物に残るように、分画の基準を設定すること が必要である。 ４）分画中、標的に対して相対的に高い親和性を有するとして選択された核酸 は次に、標的に対して比較的に高い親和性を有する核酸中で濃縮される新規な候 補混合物を生成させるために増幅される。 ５）前述の分画と増幅工程を繰り返すことにより、新規に形成される候補混合 物のユニークな配列の割合は徐々に少なくなり、標的に対する核酸の親和性の平 均の程度は一般に上昇する。極言すれば、セレックス方法は、標的分子に対する 最も高い親和性を有する、元の候補混合物からの核酸である１つあるいは少数の ユニークな核酸を含有する候補混合物を生成する。 セレックス特許出願は、この方法を非常に詳細に記載している。ここには、こ の方法に使用することができる標的；最初の候補混合物の調製方法；候補混合物 内の核酸を分画する方法；および分画した核酸を増幅して濃縮した候補混合物を 生成する方法も含まれる。セレックス特許出願はまた、核酸結合タンパクである タンパクとそうでないタンパクの両者を含む、多くの標的種に対して得られたリ ガンド溶液を記載している。 セレックスは、標的分子の高親和性リガンドを提供する。これは、核酸研究の 分野で前例のない、非凡な功績を表す。本発明は、目的の特徴を有する新規な核 酸リガンドを開発するために、セレックスによるリガンド溶液を取る方法に関す る。特定の核酸リガンドについての目的の特徴は種々である。全ての核酸リガン ドは、標的種と複合体を形成することができる。ある場合には、核酸リガンドは 標的の１つまたはそれ以上の生物活性を修飾するように作用することが好ましい 。他の場合には、核酸リガンドは標的の存在を同定するのに役立ち、そして標的 の生物活性に及ぼす効果は無関係である。 II．セレックス実施後の改良された核酸リガンドを同定する技術。 薬剤としての使用に好ましい核酸を産生するために、核酸リガンドは、１）標 的に対して目的の効果を達成できる方法で標的に結合し；２）目的の効果を得る ために可能な限り小さく；３）可能な限り安定であり；そして４）選択された標 的に特異的なリガンドであることが好ましい。全てではないが、ほとんどの状況 で、核酸リガンドが標的に対して可能な限り最も高い親和性を有することが好ま しい。治療中の分解とその場でのクリアランスに対する抵抗性、種々の組織ある いは細胞膜障壁を超える能力、または標的分子に対する親和性を有意に妨害しな い他の付加的な特性を与えるリガンドの修飾または誘導体化も、改良として与え られてよい。本発明は、セレックス実施後の改良された核酸リガンドを入手する 方法を含む。 標的分子機能に及ぼすリガンド効果の測定。セレックスにより得られた核酸リ ガンドの用途の１つは、標的分子の機能に変化させるリガンドを見い出すことで ある。リガンド分析はセレックス濃縮の間に遭遇するよりもはるかに多くの作業 を要するため、まず標的タンパクの機能の阻害または増強を最初に測定するのは 良い方法である。クローニングと配列決定の前に、組み合わせたリガンドプール のこのような機能試験を実行することもできる。選択された標的の生物学的機能 についての測定は、一般に当業者に利用可能で公知であり、核酸リガンドの存在 下で阻害が起こるかどうか決定することを容易に実施できる。 リガンドの親和性測定。セレックス濃縮は、標的分子に対するおそらく種々の 親和性を有する多くのクローン化リガンドを与える。配列比較は、モチーフへの リガンドの分類を可能にする、コンセンサス２次構造と１次配列をもたらすかも 知れない。クローン化配列の全集団中に単一のリガンド配列（いくらかの変異を 有する）がしばしば見い出されるが、リガンドの配列クローン化集団中の単一の リガンド配列の表現の程度は、標的分子の親和性に絶対的には相関しない。従っ て、ただ多量にあることがセレックス後の「勝者」を判定する唯一の基準ではな く、配列比較により到達するコンセンサスの重要性を重み付けるために、種々の リガンド配列（配列分析により見つけられる各モチーフを適切に定義する）につ いての結合測定が必要である。配列比較と親和性測定の組み合わせが、さらに拡 大したリガンドの性状解析のための候補の選択へと導くはずである。 情報境界測定。特異的親和性に相当する配列の量を決定するための重要な接近 手段は、リガンド配列中のその情報の境界を確立することである。これは便利に は、情報の５’と３’境界が見つけられるように、加水分解された目的のリガン ドのプールから、末端標識した断片を選択することにより達成される。３’境界 を決定するために、ＰＣＲリガンドのインビトロ大規模転写を実施して、増強ス クリーン上へのＵＶ遮蔽を使用してＲＮＡをゲル精製し、精製されたＲＮＡをホ スファターゼ処理し、充分にフェノール抽出し、³²Ｐでキナーゼにより標識し、 そして標識産物をゲル精製する（ガイドとしてゲルのフィルムを使用する）。生 じた産物は、次にリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｔ１による予備的部分消化（ 異なる酵素濃度と時間で、７Ｍ尿素、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．２ の緩衝液中で５０℃で）と、アルカリ性加水分解（５０ｍＭＮａＣＯ３で、１Ｍ 重炭酸と炭酸溶液を予め混合することによりｐＨ９．０に調整して；９５℃で２ ０から６０分間の範囲で試験）を行う。一旦アルカリ性加水分解の最適条件が確 立すると（従って小断片から大断片まで等しく分散する）、スケールアップして 標的による選択のために十分な物質を得ることができる（通常はニトロセルロー スフィルターで）。次に、標的タンパク濃度を最も低い飽和タンパク濃度から、 リガンドの結合測定により測定された約１０％のＲＮＡが結合するタンパク濃度 まで変化させて、結合測定を組み立てる。標的の絶対量を減らすよりは（標的の 供給が許すならば）むしろ容量を増やすことにより標的濃度を変化させるべきで ある；フィルターに結合するＲＮＡの量は標的の絶対量により制限されるため、 これは良好なシグナル対ノイズ比を与える。ＲＮＡはセレックスにおけるように 溶出され、次にＴ１部分消化物と一緒に変性ゲルに流され、従って加水分解バン ドの位置がリガンド配列に関係づけることができる。 ５’境界は同様に決定される。大規模なインビトロ転写物が上述のように精製 される。ＲＮＡの３’末端を標識する２つの方法がある。１つの方法は³²ＰでＣ ｐをキナーゼ処理（または³²Ｐ−Ｃｐを購入する）し、ＲＮＡリガーゼで精製さ れたＲＮＡに結合させる。次に標識したＲＮＡを前述のとおり精製して、同一の 実験を行う。もう１つの方法は、未標識ＲＮＡを部分アルカリ性加水分解して、 バンド位置の測定としてアニーリングし、標識したプライマーを逆転写酵素で伸 長させることである。ｐＣｐ標識法に対する利点の１つは、方法の簡便性、境界 と相互に関連させることができるより完全なラダー配列決定（ジデオキシ鎖終末 配列決定による）、および測定可能な産物量が多いことである。不利な点は、溶 出したＲＮＡの伸長は、時々人工的な停止を含有することであるため、洗浄なし で出発物質をニトロセルロースフィルター上にスポットし、溶出し、投入ＲＮＡ として測定することにより制御することが重要である。 その結果、標的に結合する高親和性に要する配列情報の境界を見い出すことが 可能である。 教示的な例は、ＨＩＶ−ＲＴの核酸リガンドに見い出される情報の境界の測定 である。（１９９１年６月１０日に出願された合衆国特許出願番号０７／７１４ ，１３１号と、「核酸リガンド」という標題の１９９１年１２月２６日に公開さ れたＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１９８１３号を参照のこと）。これらの実験は、 以下に詳しく記載される。濃縮ＲＮＡの元のプールは、ＨＩＶ−ＲＴへの少数の 特異的リガンドをもたらした（１つのリガンドである１．１は全集団の１／４を 占め、ニトロセルロース親和性配列は１／２を、そして少数のＲＮＡはそのどち らにも親和性がなかった）。２つの高親和性ＲＴリガンドは、配列．．．ＵＵＣ ＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＧＧＡＡＡＡ．．．．（配列ＩＤ番号：６）を共有し ていた。両リガンドの境界実験は、明白な３’境界と、やや明白さに欠ける５’ 境 界を確立した。境界実験と２次セレックス実験から、最も高親和性のリガンドは 、必須情報 ＵＣＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＧＧＡＡＡＡＮ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’（配 列ＩＤ番号：７）（ここでＮ’は、ＵＣＣＧのＣＧＧＧへの対生成により形成さ れるヘアピンの８塩基ループ配列中のＮに対する塩基対）を含有し、５’Ｕは小 さな欠失があっても親和性には重要でないことが推測される。本出願で、モデル 化合物の構築により、１つだけの５’Ｕの配列は２つの５’Ｕ’のものに比べて 親和性に差がない（２つのリガンドの比較により共有される）こと、両方のＵ’ の除去は親和性に５倍の低下をもたらし、次のＣの除去は親和性にさらに劇的な 損失をもたらすことが確認された。境界実験で明白に見えた３’境界は、さほど 顕著ではなかった。この新規な情報は、３’末端で重要なものは（軸１の２つの 鎖間をループする配列に）少なくとも３つの塩基対のヌクレオチドを有すること であるということを導き出すために使用できる。２つだけの塩基対ヌクレオチド では、１２倍の親和性低下をもたらす。３’塩基対ヌクレオチドがない場合（ル ープ２の末端で切った時）は、親和性は約７０倍低下する。 親和性への個々のヌクレオチドの貢献度の定量的および定性的評価。 ２次セレックス。一旦最小の高親和性リガンド配列が同定されると、それは標 的分子との相互作用に決定的な境界内のヌクレオチドを同定するのに有用である 。１つの方法は、高親和性リガンド配列の全てのヌクレオチドが部分的にランダ ム化されているか、またはランダム化が異なるブロックに完全にランダムなブロ ックが散在している、新規ランダム鋳型を作ることである。このような「２次」 セレックスは、決定的なヌクレオチドまたは構造が絶対的に保存されていて、さ ほど決定的でない特徴は優先され、そして重要でない位置は不偏である、リガン ド配列のプールを生成する。こうして２次セレックスは、比較的少数のリガンド 配列に基づくコンセンサスをさらに精巧に作り上げるのを助ける。さらに、元の セレックスでは未定の配列を有する高親和性リガンドでさえ、提供されることも ある。 本出願で我々は、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクのリガンドのこのような偏った ランダム化を示す。１９９１年６月１０日に出願された合衆国特許出願番号０７ ／７１４，１３１号と、「核酸リガンド」という標題の１９９１年１２月２６日 に公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１９８１３号で、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタ ンパクに対する核酸リガンドが記載された。これらのリガンド配列の１つは、他 の全てのリガンド配列よりも高い親和性で結合した（図１２に示されるＲｅｖリ ガンド配列６ａ）が、クローンされ配列決定された５３単離体中２つだけのコピ ーとして存在した。本出願で、６ａ配列の（ＲｅｖリガンドモチーフＩの他のも のへの相同性により定義されるＲｅｖタンパク結合部位からなる部分の配列に限 定された）各ヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド合成の間に他の３つのヌクレ オチドと６２．５：１２．５：１２．５：１２．５の比で混合された、２次セレ ックス実験に、この配列は組み込まれた。例えば、オリゴ合成中に位置Ｇ１にこ の配列が組み込まれると、Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣの試薬は６２．５：１２．５： １２．５：１２．５の比で混合される。Ｒｅｖタンパクを使用して６回のセレッ クスの後に、さらに包括的なコンセンサスした記述が得られるように、この混合 物からリガンドをクローン化した。 ヌクレオチド置換。別の方法は、セレックスのコンセンサスが混乱する場合に 、オリゴ転写した変異体を試験することである。前述のとおり、これは、ＨＩＶ −ＲＴを結合するのに必要な情報の５’と３’境界の性質を理解する助けとなっ た。添付した実施例に示すように、これは、ＨＩＶ−ＲＴにせ結び目の軸１内で ヌクレオチドのコンセンサスを定量する助けとなった。 化学修飾。別の１組の有用な技術が、化学修飾実験として包括的に記載される 。このような実験は、変性した状態の修飾パターンと非変性のものを比較するこ とにより、ＲＮＡの非変性構造を探るために使用される。次に標的分子に結合さ れることになるＲＮＡリガンドの化学修飾パターンは、非変性パターンとは異な り、標的分子の結合による構造の変化、または標的分子による基の保護を示して いる。さらに、リガンドの結合構造に決定的な位置でまたは標的分子との相互作 用に決定的な位置で修飾されると、標的分子はＲＮＡリガンドに結合しない。こ れらの位置が同定されるこのような実験は、「化学修飾妨害」実験として記載さ れる。 当業者に公知の、このような実験を行うための種々の利用可能な試薬がある（ アーレスマン（Ｅｈｒｅｓｍａｎｎ）ら（１９８７） Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒ ｅｓ．１５：９１０９を参照のこと）。塩基を修飾する化学物質は、リガン ドＲＮＡを修飾するために使用できる。リガンドのプールは種々の濃度で標的に 結合し、結合したＲＮＡは（ほとんど境界実験の場合のように）回収され、溶出 されたＲＮＡは修飾について分析される。測定は、逐次の修飾依存性の塩基の脱 離および塩基のない位置でのアニリン切断であるか、あるいは感受性のある（修 飾された）位置の逆転写測定法による。このような測定法では、標的タンパクで 選択したＲＮＡ中の他のバンドに対して消失する未選択のＲＮＡ中の（修飾され た塩基を示す）バンドが、現れたりする。エチルニトロソ尿素による同様の化学 修飾、または混合した化学的合成、あるいは例えばリボースの２’−メトキシま たはホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）による酵素的合 成が、基本骨格上の必須な原子団を同定するために使用できる。２’−メトキシ 対２’−ＯＨ混合物を用いる実験では、本質的なＯＨ基の存在は、標的により厳 しく選択された分子の他の位置に関して加水分解の増大をもたらす。 リガンドに関する有用な情報を得、その機能的安定性を改良する努力を助ける ための化学修飾の利用の例を、ＨＩＶ−ＲＴについて以下に示す。エチルニトロ ソ尿素修飾妨害により、修飾が結合を妨害した５つの位置と、劇的に妨害したこ れらの位置の２つが同定された。リガンドの塩基上の種々の原子団の修飾もまた 、ＨＩＶ−ＲＴとの相互作用に決定的であるとして同定された。これらの位置は 主に５’らせん中、およびセレックス系統発生で高度に保存される架橋ループ配 列（ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｌｏｏｐ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（図１の軸Ｉとループ２ ）にあった。これらの実験は系統発生の有効性を確認しただけでなく、さらに安 定なＲＮＡを作るための進行中の試みに情報を与えた。基本骨格のリボース部分 に全ての位置で２’−メトキシを有するＲＴリガンドが合成された。結合したこ の分子はＨＩＶ−ＲＴに対する親和性が劇的に低下した。先の修飾妨害実験とセ レックス系統発生比較に基づいて、３’らせん（図１の軸II）は本質的にこの分 子の構造成分であることが決定された。次にそのらせんの１２のリボース残基が ２’−メトキシであるリガンドが合成され、これはＨＩＶ−ＲＴに高親和性で結 合した。残る１４残基の２’−ＯＨのいずれかが結合に特に必要であるかを調べ るために、全てのリボースがにせ結び目である分子を２’−ＯＨと２’−メトキ シ形成のための混合等モル（経験的に最適と決定した）試薬で合成した。この混 合物からＨＩＶ−ＲＴを選択した後、アルカリ性加水分解により、これらの位置 に２’ヒドロキシルが支配的であることを示す増強された加水分解のバンドが現 れる。この実験の解析により、ＨＩＶ−ＲＴへの高親和性結合のためには、残基 （Ｇ４、Ａ５、Ｃ１３およびＧ１４）は２’−ＯＨを有さなければならないとい う結論が導かれた。 結合リガンドと未結合リガンドのバンドの強度の比較により、結合を妨害する 修飾だけでなく、結合を増強する修飾も明らかになるかも知れない。正確にこの 修飾でリガンドを作成し、親和性の増強について試験する。こうして化学修飾実 験は、ちょうど「ウォーキング」（下記を参照のこと）が隣接ドメインとの追加 的なヌクレオチドレベルの接触のためであるように、標的分子との追加的な局所 的接触を探索する方法でありえる。 セレックス方法の生成物の１つは、そのコンセンサスに基づく設計のオリゴヌ クレオチドの化学合成または酵素的合成を可能にする、１次と２次構造のコンセ ンサスである。セレックスの複製機構はサブユニットレベル（例えばリボヌクレ オチド）で、いくぶん変動が制限されていることが必要なため、このようなリガ ンドは標的分子の結合表面の利用可能な原子空間を不完全に満たす。しかしこれ らのリガンドは、標的分子と追加的に接触するように誘導体化できる高親和性の 骨格として考えることができる。さらに、コンセンサスは、結合に直接関係のあ る原子団記述子と、関係のある原子団相互作用に符合する原子団記述子を含有す る。例えば、ＨＩＶ−ＲＴのにせ結び目リガンドの各リボヌクレオチドは、リボ ース上に２’ヒドロキシル基を含有するが、にせ結び目リガンドのリボースの２ つだけはこの位置で２’−メトキシで置換できない。リボヌクレオチド混合物を 有するデオキシリボヌクレオチド混合物を用いる同様な実験（２’−メトキシと ２’ヒドロキシ混合物で行ったように）により、ＨＩＶ−ＲＴ結合にとって重要 でないリボースおよびその数が明らかになる。２’位をさらに極端な置換をした 同様な実験により、２’位の許容される置換も明らかになる。この方法により、 ＨＩＶ−ＲＴに対して高親和性を与えるにせ結び目リガンドの誘導体を見つける ことができると予測される。このような誘導体化は、標的タンパクへ直接的な共 有結合を特異的に可能にする架橋剤の使用を除外しない。このような誘導体化分 析はリボースの２’位に限定されず、ヌクレオチドリガンドの塩基または基本骨 格の任意の位置の誘導体化を含有する。 この分析を論理的に拡張すると、ポリマー性リガンドの１つまたは少数のヌク レオチドが、化学的誘導体探索のための部位として使用される状況になる。リガ ンドの残りの部分は、結合に対する非妨害性と親和性の増強が試験されるモノマ ー（またはモノマー群）を、きちんと繋ぎ止めるのに役立つ。このような探索に より、最初のリガンドの骨組の構造をまね、その核酸の骨組とは独立の標的分子 に対して有意で特異的な親和性を有する低分子が得られるであろう。大量生産、 臨床上の投与経路、体内送達、クリアランスまたは分解の面で最初のセレックス リガンドに比べて利点を有する、このような誘導体化されたサブユニットは、治 療薬になり元のリガンドの痕跡をほとんど残さない。すなわちこのアプローチは セレックスの追加的な有用性である。セレックスリガンドは、標的機能に重要で あることが知られている標的分子上の定義された部位に向けられた化学探索を可 能にしている。 構造決定。これらの努力は、ＨＩＶ−ＲＴに対するリガンドの配列と構造依存 性会合を確認し評価する助けになった。リガンド／標的分子複合体の原子レベル での解析を可能にするために、別の方法が実施される。これらは、ＮＭＲ分光学 とＸ線結晶学である。そのような構造を手にして、次に、セレックスにより供給 された進化したリガンドの改良として、合理的な設計をすることができる。核酸 構造のコンピューターモデル化は以下に記載される。 化学修飾。本発明は、リガンドのインビボの安定性を増強するために、あるい はリガンドの体内送達を促進または媒介するために、いくつかの化学修飾をされ た核酸リガンドを含む。このような修飾の例は、特定のＲＮＡ配列のリボースお よび／またはリン酸位置での化学置換を含む。例えば、クック（Ｃｏｏｋ）らの ＰＣＴ出願ＷＯ９２０３５６８号；シナジ（Ｓｃｈｉｎａｚｉ）らの合衆国特許 ５，１１８，６７２号；ホッブス（Ｈｏｂｂｓ）ら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ．１２：５１３８：グシュルバウアー（Ｇｕｓｃｈｌｂａｕｅｒ）ら（１９７７ ） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４：１９３３；シバハル（Ｓｈｉ ｂａｈａｒｕ）ら（１９８７） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５ ：４４０３；ピーケン（Ｐｉｅｋｅｎ）ら（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ２ ５３ ：３１４を参照のこと（これらは各々参考のため本発明に特に引用されてい る）。 III．連続セレックス実験−ウォーキング法 本発明の１つの実施態様では、ある標的について最小コンセンサスリガンド配 列が決定された後に、この最小コンセンサスリガンド配列にランダム配列を追加 して、標的とさらに（おそらく分離してはいるが隣接したドメインに）接触させ ることが可能である。この方法はセレックス特許出願では「ウォーキング法」と 呼ばれている。ＨＩＶ−ＲＴに対する結合が増強されたリガンドを開発するため 、ウォーキング法プロトコールの使用の成功例を以下に示す。 ウォーキング法実験は、連続して実施される２つのセレックス実験を含む。こ の候補混合物の各メンバーが、セレックス由来の核酸リガンドに対応する固定さ れた核酸領域を有するように、新しい候補混合物が生成される。候補混合物の各 メンバーはまた、配列のランダム化された領域も含有する。本方法により「伸長 した」核酸リガンドと呼ばれるもの（これは標的の２つ以上の結合ドメインに結 合する領域を含有する）を同定することが可能である。 IV．共分散分析によるリガンドの構造の解明 本発明は、核酸の３次元構造の決定のための経験的方法と共に、核酸リガンド の構造の決定のためのコンピューターモデル化方法を含む。 ２次構造予測は、配列の整合を修正するための有用なガイドである。またこれ は、Ａ型らせんの外形中にいくつかの塩基を無理に入れることにより、３Ｄ構造 予測を修正するための有用な手段である。 ２次構造の安定性を計算するためのエネルギーパラメーターの表が存在する。 初期の２次構造予測プログラムは、配列により形成される塩基対の数を単に最大 にすることを試みたが、最も最近のプログラムは、これらの熱力学パラメーター により計算される最小の自由エネルギーを有する構造を見い出そうとしている。 このアプローチには２つの問題がある。第１に、熱力学の規則は、（典型的には １０％位まで）本質的に不正確であって、全体の最小エネルギーの１０％以内に 多くの異なる可能な構造が存在する。第２に、実際の２次構造は、配列の折り畳 みと合成の動力学に依存しており、全体の最小エネルギー状態に存在しない。そ れにも拘らず短い配列については、形成できる可能な構造が非常に限られている ため、これらの警告はさして重要ではない。 力ずくの予測方法がドット−プロットである：それ自体に対して配列のＮ×Ｎ プロットを作り、塩基対が可能なところ全部にＸの印をつける。Ｘの斜行路が、 可能ならせんの位置を示す。次に包括的枝分かれ検索方法は、長さＬまたはそれ 以上の融和性のある（すなわち重複のない）らせんのすべての可能性の形態を検 索して；これらの構造についてエネルギー計算をして、可能性の程度をランク付 けする。この方法の利点は、にせ結び目配置を含む全ての可能な形（トポロジー ）が試験され、そしていくつかの次善の構造が自動的に生成されることである。 この方法の欠点は、これが最悪の場合には、配列のサイズの指数関数因子に時間 比例して作動して、全体の最小値を見い出す程深くは見えない（配列のサイズと 使用された実際の枝分かれ検索方法に依存して）ことである。 賢明な（そして現在最も使用されている）予測方法は、ズーカー（Ｚｕｋｅｒ ）のプログラム（ズーカー（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８）であ る。元々はルス・ヌシノフ（Ｒｕｔｈ Ｎｕｓｓｉｎｏｖ）により開発されたア ルゴリズムに基づいて、ズーカープログラムは、にせ結び目配置は許容しないと いう大きな簡素化仮定をしている。これによりわずかＮ³からＮ⁴（ここでＮは配 列の長さである）に比例する時間に作動する、動的なプログラム法の使用が可能 になる。このズーカープログラムは、数百以上のヌクレオチドの配列を厳密に扱 うことができる唯一のプログラムであるため、生物学者により最も一般的に使用 されるようになった。しかし、いくつかの異なるセレックス実験において、いく つかのにせ結び目になったＲＮＡ構造が得られた（そしてそれは目で認識された ）という点で、ズーカープログラムがにせ結び目になった配置を予測できないと いうことは、致命的な欠陥である。にせ結び目になった配置を予測できる、力ず くの方法を使用しなければならない。 本発明の比較配列分析の主要な要素は、配列共分散である。共分散は、１つの 位置の本体が別の位置の本体に依存している時である；例えば、必要なワトソン −クリック塩基対は、２つの位置の１つの情報が、もう１つの位置の絶対的な情 報を与えるという点において、強力な共分散を示す。共分散分析は以前、共通構 造を有する多くの関連配列（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびグループＩイ ントロン）が存在するＲＮＡの２次構造を予測するために使用された。今や共分 散分析が、３次の接触にも使用できることが明白となった。 ストルモとグーテル（Ｓｔｏｒｍｏ ａｎｄ Ｇｕｔｅｌｌ）は、整列した配 列のセット中の２つの位置間の共分散の量を正確に測定するアルゴリズムを設計 し実行した。このプログラムは「ミキシー」（ＭＩＸＹ）（位置ＸとＹでの相互 情報（Ｍｕｔｕａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｘ ａｎｄ Ｙ））と呼ばれる。 整列した配列のセットを考える。各カラムまたは位置で、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、お よびギャップの出現の頻度が計算される。これを頻度ｆ（ｂ_x）、すなわち塩基 ｂのカラムｘでの頻度と呼ぶ。次に１度に２つのカラムを考える。ある塩基ｂが カラムＸに現れる頻度はｆ（ｂ_x）、そしてある塩基ｂがカラムｙに現れる頻度 はｆ（ｂ_y）である。もし位置ｘと位置ｙが他方に関係ない（すなわちこれらの 位置が独立である）ならば、共分散はなく、どの配列でも位置ｘとｙに塩基ｂ_x とｂ_yを観察する頻度は、ｆ（ｂ_xｂ_y）＝ｆ（ｂ_x）ｆ（ｂ_y）のはずである。観 察される対の頻度に、予想される頻度からの実質的な偏差があるならば、これら の位置は共分散すると言われる。期待値からの偏差の量は、情報尺度Ｍ（ｘ，ｙ Ｍ（ｘ，ｙ）は、位置ｘの本体を認識することから位置ｙを認識することから 、位置ｙに関する情報のビット数として記述される。もし共分散がないなら、Ｍ （ｘ，ｙ）はゼロであり；Ｍ（ｘ，ｙ）の大きな値は強い共分散を示す。 本方法はｔＲＮＡ配列のデータセットに適用された時に、これらの数は３次構 造中の密接な物理接触の確率に極めてよく相関した。２次構造は、Ｍ（ｘ，ｙ） 値のピークとして極めて明白であり、結晶構造から知られた多くの３次接触もま たピークとして現れる。 これらの共分散値は３次元構造予測を開発するのに使用できるかもしれない。 いくつかの面で、この問題はＮＭＲによる構造決定の問題に似ている。最後に 実際の電子密度地図が得られる結晶学とは異なり、ＮＭＲは一連の原子間距離を 与える。得られる原子間距離の数により、それらが一致する１つ、少数、または 多くの３Ｄ構造が現れる。原子間距離のマトリックスを３Ｄ空間の構造に変換す るために、数学的手法を開発する必要があった。使用される２つの主要な技術は 、距離幾何学と制御された分子動力学である。 距離幾何学は、より形式的な純粋に数学的手法である。原子間距離は、Ｎ次元 空間（ここでＮは原子の数である）中の座標と考えられる。言い換えると、原子 の「位置」は、我々が普通に考える３つ（ｘ，ｙ，ｚ）の代わりに、他の全ての 原子へのＮ個の距離により特定される。全原子間の原子間距離は、Ｎ×Ｎ距離マ トリックスに記録される。完全で正確な距離マトリックスは、行列代数演算を使 用して、容易に３×Ｎデカルト座標に変換される。ＮＭＲに適用した距離幾何学 の要領は、不完全（少数の原子間距離のみが知られている）で不正確なデータ（ 距離はせいぜい数オングストロームの確度まで知られている）を扱うことである 。このように距離幾何学に基づく構造計算の多くの時間は、距離マトリックスを 前処理し、未知の距離値の範囲を既知のものに基づいて計算し、既知のものの範 囲を限定することに費される。通常、一連のＮＭＲデータに一致する距離マトリ ックスから多数の構造が抽出され；もしこれらがすべてうまく重複していれば、 このデータは唯一の構造を決めるのに十分であった。ＮＭＲ構造決定とは異なり 、共分散は不正確な距離値だけを与えるが、しかしこれはある距離の制約が適用 されるかどうかに関して、絶対的な知識よりは見込みがある。 制御された分子動力学は、より特別な方法である。全ての原子が感じる力（フ ァンデルワールス力、共有結合長と結合角、静電力）を記述することを試みる実 験的な力の場では、すべての原始にランダム速度（ある温度でのボルツマン分布 から）を割り当てて、ニュートン動力学方程式を使用してフェムト秒間の各原子 の運動を計算することにより、多くのフェムト秒時間工程の分子運動の模擬実験 ができる；これが「分子動力学」である。制御された動力学において、原子が特 定の距離範囲を越える時に、原子に対して余分の特別な力を割り当てる。 本件では、制御された分子動力学を用いてデータの確率の性質を扱うのはかな り容易である。共分散値は、ある原子間のある距離範囲での人工的な力の制御に 変換され；共分散の大きさに従い力の大きさを変える。 ＮＭＲと共分散分析は、原子または位置間の距離制限を生成し、そしてそれは 距離幾何学または制御された分子動力学により構造へと容易に変換される。核酸 の３次元構造を決定するために利用される実験データの別の源は、化学的または 酵素的保護実験であり、これらは個々の原子または位置に溶媒接近の制限を生成 する。 Ｖ．ＨＩＶ−ＲＴの改良された核酸リガンドの解明 本発明の方法の例は、ＨＩ Ｖ−１逆転写酵素（ＨＩＶ−ＲＴ）の核酸リガンドについて本明細書に示される 。合衆国特許出願番号０７／７１４，１３１号と、「核酸リガンド」という標題 の１９９１年１２月２６日に公開されたＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９１／１９８１ ３号には、ＨＩＶ−ＲＴ標的でセレックスを実施した時に得られた結果が記載さ れている。ＨＩＶ−ＲＴに対して高親和性を有することが見い出された核酸配列 を調べることにより、核酸リガンド溶液はにせ結び目として配置されていると結 論された。 本明細書では、境界の検討により核酸リガンド溶液を表すために必要な最小数 の配列を確立する実験が記載される。リガンド溶液のＨＩＶ−ＲＴへの結合に対 する、溶液中の個々のヌクレオチドの寄与を評価するために使用される、リガン ド溶液の変異体の構築も記載される。さらに１）予測されるにせ結び目構造を確 認するため；２）ＨＩＶ−ＲＴに結合した時に、どの修飾可能な基が化学攻撃か ら保護される（または結合により非保護になる）かを決定するため；および３） どんな修飾がＨＩＶ−ＲＴへの結合を妨害する（おそらくリガンド溶液の３次元 の修飾により）か、従っておそらく標的との近傍の接触に関与しているものを決 定するために、リガンド溶液の化学修飾も記載される。 以前に決定された核酸リガンド溶液は、図１に示される。軸１（標識されて） が保存され、軸２が比較的非保存であるＲＮＡにせ結び目（ここでＸは非保存で あり、Ｘ’はＸに対して塩基対を形成する）が示される。最初のセレックスのコ ンセンサスでは、Ｕ１が好ましかった（コンセンサスに寄与する１８配列の内の １１でこの相対位置に存在している）が、Ａ１もしばしば（１８配列の内の６で ）見い出された。Ｇ４−Ｃ１３の塩基対にＣ−Ｇが置換したものと、Ａ−Ｕが置 換したものの２つの配列があった。軸１の２本の鎖に連結しているヌクレオチド の好ましい数は、８（１８配列の内の８で）であった。軸２よりなる塩基対を形 成したヌクレオチドの数とパターン、およびＡ５とＡ１２の選択は、下記のよう にランダム領域が構築された２次セレックスのコンセンサスから得られた：ＮＮ ＵＵＣＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＧＧＡＡＡＡＮＮＮＮ（配列ＩＤ番号：８）（ Ｎはランダム化されている）。リガンドの１つは、ＨＩＶ−ＲＴを著しく阻害し 、ＡＭＶまたはＭＭＬＶの逆転写酵素を阻害しないことが見い出された。 情報境界の改良 ３２のヌクレオチド位置がランダム化された最初の２回のセ レックス実験は、軸１の５’末端に可変長のある高親和性リガンドを与えた；す なわちあるリガンドは、ＣＧＧＧＡと塩基対を形成できるＵＵＣＣＧ、ＣＧＧＧ と塩基対を形成できるＵＣＣＧ、またはＣＧＧと塩基対を形成できるＣＣＧを有 していた。ＨＩＶ−ＲＴとの相互作用に高親和性を供与する配列の境界の決定は 、末端標識したクローン化ＲＮＡの部分アルカリ性加水分解物からの選択により 達成できた。これは、高親和性リガンドは必須情報ＵＣＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＣ ＧＧＧＡＡＡＡＮＮ’Ｎ’Ｎ’（配列ＩＤ番号：７）（ここでＮ’は、ＵＣＣＧ のＣＧＧＧへの対生成により形成されるヘアピンの８塩基ループ配列中のＮへの 塩基対）を含有し、５’Ｕはなくても親和性の損失は小さいであろうということ を示唆する、迅速で定性的な分析である。均一な状況で５’配列をより厳密に試 験するために、図２に示す結合実験を実施した。オリゴヌクレオチド鋳型から転 写されたＲＮＡは、左端に並ぶ四角Ａ−Ｅに示すように５’末端が変化している ことを除き、図の右上隅に示す完全な配列と同じであった。その結果、ＨＩＶ− ＲＴとの最も高親和性結合のために１つの５’Ｕで十分であり（四角ＡとＢ）、 Ｕがないと結合が低下し（四角Ｃ）、そしてさらに５’配列を除去すると非特異 性配列なみに結合を低下させた（四角Ｄ）。本明細書で記載される残りの実験に は、１つの５’Ｕ（Ｕ１）だけを有する設計（本明細書では以後リガンドＢと呼 ぶ）が使用された。 リガンドＢの３’末端で種々の３’切片を作ることにより、軸２の長さへの依 存性も試験した。３’末端から３つのヌクレオチド（Ａ２４−Ｕ２６）を削除し てもＨＩＶ−ＲＴに対する分子の親和性に変化はなかった。３’末端の４つのヌ クレオチド（Ｃ２３−Ｕ２６）の削除は、結合を７倍低下させ、５つ（Ｇ２２− Ｕ２６）では約１２倍の低下、そして６ヌクレオチド（Ｕ２１−Ｕ２６、すなわ ち３’らせんなし）では約７０倍親和性の低下をもたらした。このような低下は 、以下に報告される単塩基置換で見い出された低下に比べてそれほど劇的ではな く、これは（以下に報告される他のデータと共に）このらせんが、主にループ２ 中で非常に重要な基の位置づけを支援する構造上の役割を担うことを示唆してい る。 軸１についてのセレックスコンセンサスの試験。保存される軸１中の種々のヌ クレオチド置換を調製し、ＨＩＶ−ＲＴに対するこれらの親和性を測定した。図 ３に示すように、モデルＲＮＡでのＵ１のＡによる置換はＨＩＶ−ＲＴに対する 親和性にほとんど変化を起こさなかった。この位置のＣ（これは軸１の安定性を 増強する）またはＧ（前述のＵ欠失実験により表される）は、約２０倍の親和性 の低下をもたらした。Ｇ１６のＡによる置換（これはＵ１と塩基対を形成する） は、特異的結合を破壊した。Ｃ２−Ｇ１５の代わりにＧ−Ｃ対を使用すると、こ れも結合を破壊し、Ｃ３−Ｇ１４の代わりに使用すると約１０倍結合を低下させ た。これらの２つの位置はセレックスリガンドの系統発生に高度に保存されてい た。種々の組み合わせでＧ４−Ｃ１３塩基対を置換した。親和性に影響したこれ らの順序は、Ｇ４−Ｃ１３＝Ｃ−Ｇ＞Ｕ−Ａ＞Ａ−Ｕ＞＞＞＞Ａ−Ｃ（ここでＡ −ＵはＧ４−Ｃ１３に比べて約２０倍親和性を低下させ、Ａ−Ｃは少なくとも１ ００倍低下させた）であった。これらの結果は、以前測定したセレックスコンセ ンサスと矛盾しない。 にせ結び目構造の化学探索。リガンドｂの非変性構造を探索するため、リガン ドＢのＨＩＶ−ＲＴに対する親和性を著しく低下させる化学修飾を同定すため、 そしてＨＩＶ−ＲＴによる結合に付随する構造の変化を発見するために、多くの 化学修飾実験が行った。使用した化学物質は、リン酸を修飾するエチルニトロソ 尿素（ＥＮＵ）、Ｃ（Ｎ３で）とＡ（Ｎ１で）の塩基対形成面を修飾する硫酸ジ メチル（ＤＭＳ）、Ｕ（Ｎ３で）と少量のＧ（Ｎ１で）の塩基対形成面を修飾す るカルボジイミド（ＣＭＣＴ）、ＡのＮ７と少量のＧのＮ７を修飾するジエチル ピロカーボネート（ＤＥＰＣ）、およびＧのＮ１とＮ２の塩基対を修飾するケト キサールである。大部分の化学修飾の測定は、標識プライマーがアニーリングさ れ、ＡＭＶ逆転写酵素で伸長されることができる配列を含むように長く伸ばされ たリガンドＢ配列で行われた。ＥＮＵまたはＤＥＰＣで修飾された位置の測定は 、各々の修飾依存性加水分解、または修飾された塩基の除去とそれに続くこの部 位での基本骨格のアニリン切断を用いて、リガンドＢに行われた。 変性リガンドＢの修飾と比較した非変性構造の探索の結果を、図４に要約する 。ＥＮＵ修飾のパターンは、リガンドの変性状態と非変性状態の間に差はなく、 これはにせ結び目の溶液構造には、リン酸またはプリンのＮ７位置の安定な関与 がないことを示唆している。他の修飾データは、軸２はどちらかというと安定に 形成されていて、示された塩基対に影響するいかなる化学修飾にも抵抗性である が、末端Ａ６−Ｕ２６は、この位置で塩基対状態と変性状態間に平衡状態を示す 修飾にいくぶん感受性であることを示唆する。１本鎖のＡ（Ａ５、Ａ１７、Ａ１ ８、Ａ１９、およびＡ２０）は、ＤＭＳに十分反応性であるが、Ａ５、Ａ１９、 およびＡ２０はＤＥＰＣに対する反応性は減少している。軸１の塩基対は、Ｇ４ −Ｃ１３＞Ｃ３−Ｇ１４＞Ｃ２−Ｇ１５＞Ｕ１−Ｇ１６（ここでＧ４−Ｃ１３は 化学修飾に完全に抵抗性であり、Ｕ１−Ｇ１６は高反応性である）の、修飾に対 する抵抗性の順位を表現しているようである。これは、にせ結び目のこの小さい らせんが一過性の指向性の変性、すなわち「フレイング（ｆｒａｙｉｎｇ）」を 受けていることを示唆する。 ＨＩＶ−ＲＴによる化学修飾からのリガンドＢの保護。図５に示すように、タ ンパクの結合は、らせんＩを安定化するか保護するかによって、らせんＩのフレ イング特性を変化させる。本来は反応性のＵ１も結合により保護される。タンパ クの結合は、塩基対Ａ６−Ｕ２６の感受性を増強し、これは結合状態で対になっ ていないことを示唆している。これは、ＲＴにより認識された非変性にせ結び目 中で結合した軸１を軸２の末端に橋渡しできないため、または非変性状態から配 置を変化させることにより結合がループＩの長さの要求を増大させるため、結合 の間の１本鎖ヌクレオチドループＩの長さが不十分であることを示している。ル ープIIのＡ１７とＡ１９もまたＨＩＶ−ＲＴに対する結合により保護される。さ らに１本鎖塩基の橋のＡ１２は、結合により保護される。 ＲＴリガンドＢの修飾妨害の検討。ＲＮＡリガンドＢを部分的に修飾した（構 造決定のため上述した全ての化学物質により）。この修飾された集団は、種々の 濃度のタンパクと結合し、結合種の修飾された位置を測定した。ここから、修飾 が結合を妨害するところ、修飾がまったくまたはほとんど影響を与えないところ が決定できる。これらの修飾妨害結果を要約する概略図を図６に示す。ここに示 すように、結合に対する有意な妨害の多くは、軸１とループ２を含有するにせ結 び目の左側に集中している。これは、セレックスにより単離された配列の集合中 で高度に保存されていた（１次配列）分子の一部でもあり、そしてここは置換実 験によりＨＩＶ−ＲＴに対する結合親和性が最も劇的に低下したところである。 リガンドＢのリボース上の２’−ヒドロキシルの２’−メトキシによる置換。 通常のヒドロキシル基の代わりにリボースの２’炭素に２’−メトキシが結合し ている「ＲＮＡ」分子は、酵素的および化学的分解に抵抗性である。ＲＴリガン ド中でどの程度広範に２’−メトキシが２’−ＯＨを置換できるかを試験するた めに、図７に示すように４つのオリゴを調製した。全部が２’−メトキシに置換 されたリガンドはほとんど結合しない（リガンドＤ）ため、また大部分の修飾妨 害部位はにせ結び目の１つの末端に集中していることを見い出したため、以下の 置換の試みは、四角ＢとＣに示す非特異的３’らせんに限定した。これらのリガ ンドの両者ともＨＩＶ−ＲＴに高親和性で結合する。次に、図７のＣのように軸 ２のリボースに許容される置換が全ての２’−メトキシであって、残りの１４の 位置で２’−メトキシおよび２’−ＯＨホスホルアミジト試薬で混合合成が行わ れたオリゴヌクレオチドが調製された。これらのオリゴはＨＩＶ−ＲＴにより選 択し、続いて選択されたＲＮＡをアルカリ性加水分解とゲル分離を行った（２’ −メトキシ体は２’−ヒドロキシル体とは異なりアルカリ性加水分解には関与し ない）。フィルムの目視点検（図８参照）と、アンビス検出システム（Ａｍｂｉ ｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いる相対強度の定量測定（以下の 実施例の比較方法を参照のこと）により判定したところ、混合して組み込まれた 集団からＨＩＶ−ＲＴにより選択されたリガンドは、Ｃ１３とＧ１４の位置で加 水分解の著しい上昇を示し、これはこれらの位置での２’−メトキシ による妨害を示している。全ての位置がこの方法で分析された関連実験で、Ｇ４ 、Ａ５、Ｃ１３およびＧ１４は、２’−Ｏ−メチル妨害を示した。 置換実験、定量境界実験および化学探索実験の結果は、ＨＩＶ−ＲＴのにせ結 び目阻害物質の性質について多くの情報を与え、このＲＮＡ上の決定的な接触領 域を強調していた。これらの結果は、以下のヌクレオチド毎に与えられる。 Ｕ１をＡに置換しても親和性の損失はほとんどないが、ＣまたはＧの場合は異 なる。Ｕ１はおそらくＧ１６と一時的な塩基対を生成するが、Ｕ１−Ｎ３をＣＭ ＣＴで修飾してもＨＩＶ−ＲＴへの結合を妨害しない。しかし、ＨＩＶ−ＲＴに よる結合は、多分この位置の立体的または静電的遮蔽により、Ｕ１からＮ３を保 護する。Ｇ１６とより安定な塩基対を形成するＣによる置換は、親和性を低下さ せる。安定なＵ１−Ａ１６対を形成するＡによるＧ１６の置換は、ＨＩＶ−ＲＴ に対する特異的親和性を破壊し、Ｇ１６−Ｎ１の修飾はＨＩＶ−ＲＴへの結合を 強力に妨害する。Ｇ１６−Ｎ１のこの修飾は、タンパクとの非常に重要な接触を 防止するに違いない。なぜＵ１へのＧ置換が親和性を低下させて、Ａ置換はさせ ないかは明白ではない。Ｇ置換は明らかに、ＲＮＡの５’末端が１ヌクレオチド 分短いが、しかしＵ１が５’末端ヌクレオチドである合成ＲＮＡは、２つ余分の Ｇを５’末端に有するインビトロ転写物と変わらない親和性で結合する（図７） 状況にある。おそらくＵ１でのＡは、可能性のあるＵ相互作用を、ＨＩＶ−ＲＴ との同様なまたは異なる相互作用で置換しており、これはこの位置でＣまたはＧ では不可能な置換である。 軸１の次の塩基対（Ｃ２−Ｇ１５）は、ＨＩＶ−ＲＴに対する特異的親和性の 完全な損失なしにはＧ−Ｃ塩基対により置換することはできない。いずれかのヌ クレオチドの塩基対形成面の修飾は、ＨＩＶ−ＲＴへの結合を強力に妨害し、Ｈ ＩＶ−ＲＴとの結合はこれらの修飾から保護する。次の塩基対Ｃ３−Ｇ１４をＧ −Ｃ対で置換する場合、親和性の低下はそれほど劇的ではないが、この位置の修 飾は強力に妨害する。Ｇ４−Ｃ１３のＣ−Ｇ対による置換は結合に影響せず、よ り安定でないＡ−ＵとＵ−Ａ対による置換はいくぶん特異的親和性を可能にする 。これらの位置を塩基対を形成していないＡ−Ｃにより置換すると、特異的結合 を破壊する。これは、この位置の最初のセレックス系統発生でのＣ−Ｇ置換と １つのＡ−Ｕ置換の出現、非変性状態でのこの塩基対の非反応性、およびこれら の塩基に見い出される高度の修飾妨害に相関する。 ループ２の化学修飾データは、最初のセレックス実験で見られた系統発生的な 保存を充分保証している。強力な修飾妨害は、Ａ１７とＡ１９の位置に見られる 。弱い修飾妨害は、この相対位置で削除された最初のセレックスのいくつかのル ープ２の知見に相関するＡ２０に生じる（ただし、実施した化学妨害実験は、塩 基がＨＩＶ−ＲＴと作りうる全ての可能な接触を網羅して試験していない）。Ａ １８は最初のセレックスで保存されておらず、この位置での修飾は妨害しない、 またこの位置はＨＩＶ−ＲＴへの結合により修飾から保護されていない。 前述データを合わせると、軸１の必須成分は、配列をタンパクと特異的に接触 させる１本鎖５’ヌクレオチド（ＵまたはＡ）と、３つの塩基対らせん（Ｃ２− Ｇ１５、Ｃ３−Ｇ１４、Ｇ４−Ｃ１３）（ここで最初の２つの塩基対ではＨＩＶ −ＲＴとの配列特異的相互作用があり、Ｇ４−Ｃ１３の第３のループが閉じる位 置では強力な塩基対（すなわち、Ｃ−ＧまたはＧ−Ｃ）の優先がある）であるこ とを示唆する。ループ２は、Ａ１７とＡ１９のようにおそらく配列特異的方法で ＨＩＶ−ＲＴと相互作用する、Ｇ１６の１本鎖的特性により、より広くはＧＡＸ ＡＡ（１６−２０）と記載されるべきであろう。軸２は、塩基対形成ヌクレオチ ドのパターンと数がかなり変化するが、本明細書に報告された３’削除実験から 、最大の親和性を得るために、軸２に最低３つの塩基対が必要であることが仮説 を立てることができる。軸１のらせんを構成する２つの鎖を連結する８つのヌク レオチドの範囲内で、結合したリガンドのループ１に少なくとも２つのヌクレオ チドが必要である。 本発明の方法に基づいて得られたＨＩＶ−ＲＴの改定されたリガンドを図１１ に記載する。図１に示すもの（これは最初と２次のセレックスコンセンサスに基 づく）との大きな違いは、軸２の長さ、塩基対Ｇ４−Ｃ１３のより退縮した仕様 、ループ１のサイズ（これは軸２のサイズに直接関係する）、およびＵ１とＧ１ ６の１本鎖的特性である。 どのようにこれらの違いを調和させられるか？理論により限定されてはいない が、セレックスの戦略は複製のために５’と３’の固定配列を要する。任意の ＲＮＡ配列において、このような追加の配列は、高親和性リガンドの配置に競合 する他の配置に関して能力を増強させる。その結果、直接親和性に貢献しない追 加的構造要素（例えば、伸ばされた軸２）が、選択される。配列特異的接触のた めに軸１の最初の２塩基対がＣ−Ｇでなければならないならば、最も安定な閉じ ている塩基対は、配置のあいまいさを避けるために再度選択されたＧ４−Ｃ１３ であろう（フレイヤー（Ｆｒｅｉｅｒ）ら（１９８６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９３７３）。Ｕ１とＧ１６の配列特異的選択 は、これらが塩基対を形成する能力に偶然一致することであり；クレノウ断片（ Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）／プライマー−鋳型接合やｔＲＮＡ／ｔＲＮ Ａ合成酵素のような、他の核酸リガンド−タンパク複合体では、本ケースにも生 じるかもしれない、塩基対ヌクレオチドの著しい局所の変性がある（フリーモン ト（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ）ら（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ８５：８９２４；ロナルド（Ｒｏｎａｌｄ）ら（１９８９）Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２４６：１１３５）。 VI．伸張された核酸リガンドを同定するためのＨＩＶ−ＲＴ核酸リガンドを用い るウォーキング実験の実施 。 にせ結び目コンセンサスリガンドの５’に位置する固定配列（２８ヌクレオチ ド）がＨＩＶ−ＲＴに対する親和性を低下させ、リガンドの３’に追加された固 定配列（３１ヌクレオチド）がその親和性を増強することが、すでに見い出され た。従ってＨＩＶ−ＲＴに対するより高親和性のリガンドのコンセンサスが得ら れるか否かを調べるために、セレックス実験を行い、３０ヌクレオチドの可変領 域をリガンドＢ配列の３’に追加した。個々の単離体をクローン化して、１６回 目の後で配列決定した。この配列は、図９に２つのモチーフに分類してリスト化 する（配列ＩＤ番号：１１５−１３５）。各モチーフの２次構造と１次配列の保 存の概略図は図１０に示す。ＨＩＶ−ＲＴのＲＮａｓｅＨとポリメラーゼの触媒 ドメイン間の距離は最近、Ｘ線結晶学から誘導された３．５Å解像度構造のポケ ットに合体した（コンピューターによる）Ａ型ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中の １８塩基対位であることが決定された（コールスタト（Ｋｏｈｌｓｔａｅｄｔ） ら（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１７８３）。にせ結び目と伸長した リガンド配列中に保存される塩基の、この相互作用に非常に重要であると決定さ れた塩基の集中部位からの距離も、約１８塩基対である。従ってにせ結び目は、 ポリメラーゼの触媒部位（この部位でリガンドは、ＲＮＡｓｅＨドメインが欠失 したＨＩＶ−ＲＴに結合することが示された）と相互作用すること、およびにせ 結び目への進化した伸長がＲＮＡｓｅＨドメインと相互作用することが結論され る。一般に、各々のモチーフから試験したリガンドはＨＩＶ−ＲＴに対するリガ ンドＢの親和性を少なくとも１０倍増強する。 VII．ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクの改良された核酸リガンドの解明。 本発明の方法の実施例は、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクの核酸リガンドについ て本明細書中に与えられる。合衆国特許出願番号０７／７１４，１３１号とＰＣ Ｔ特許出願公開ＷＯ９１／１９８１３号には、セレックスをＲｅｖ標的で実施し た時に得られた結果が記載されている。Ｒｅｖに対して高親和性を有することが 見い出された核酸配列を調べると、これらの配列が３つのモチーフ（Ｉ、II、お よびIII）に分類できることが分かった。モチーフＩのリガンドは、モチーフII とIIIにより記載される個々のモチーフの複合物であり、一般にＲｅｖに対して より高親和性で結合しているようである。モチーフＩリガンド配列の１つ（Ｒｅ ｖリガンド配列６ａ）は、クローン化され配列決定された全てのリガンドよりも 著しく高い親和性で結合した。図１２に示すように、６ａ配列は２つのらせん間 に隆起を形成して、この隆起を横切る少数の塩基対を有することが仮説化される 。 本明細書には、提唱された２次構造を確認し、Ｒｅｖタンパクの結合がリガン ドを化学攻撃から保護する場所を見つけ、そしてＲｅｖ相互作用に必須なヌクレ オチドを検出するために設計された、リガンド６ａで実施した化学修飾実験が記 載される。さらに、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクに対して最も高親和性結合のた めのコンセンサスをより包括的に記載するために、６ａリガンド配列の偏ったラ ンダム化により、２次セレックス実験を実施した。 Ｒｅｖリガンドの化学修飾。その可能な２次構造要素を決定し、どの修飾がＲ ｅｖによるリガンドの結合を妨害するかを見い出し、どの位置がタンパク結合へ の修飾から保護されているかを同定し、そして結合により生じるリガンド構造の 可能な変化を検出するために、Ｒｅｖリガンド６ａの化学修飾検討を行った。 修飾用化学物質は、リン酸を修飾するエチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）、塩基対 形成位置ＣのＮ３とアデニンのＮ１を修飾する硫酸ジメチル（ＤＭＳ）、グアニ ンの塩基対形成位置Ｎ１とＮ２を修飾するケトキサール、ウラシルの塩基対形成 位置のＮ３と少量のグアニンのＮ１位置を修飾するカルボジイミド（ＣＭＣＴ） 、およびアデニンのＮ７位置とより少量のグアニンのＮ７を修飾するジエチルピ ロカーボネート（ＤＥＰＣ）を含む。ＥＮＵ修飾は、標識ＲＮＡ鎖の修飾依存性 加水分解により測定され、一方他の全ての修飾剤は伸長されたＲＮＡリガンドに 使用されて、修飾された位置でアニーリングされたオリゴヌクレオチドのプライ マー伸長により明らかになった。 Ｒｅｖリガンドの非変性構造の化学探索は図１３に要約されている。コンピュ ーター予測の２次構造（ズーカー（１９８９）前述；イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ ）ら（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７ ７０６））と非変性修飾データは、大体一致し；このリガンドは３つのらせん領 域、１つの４塩基ヘアピンループ、および３つの「隆起」領域からなる（これら の構造「要素」の定義について図１３を参照のこと）。 リン酸のＥＮＵ修飾は、非変性条件下と変性条件下でリガンドに対して変化が なかったが、これはＲＮＡの２次または３次構造にリン酸基が関与していないこ とを示している。一般に、全てのコンピューター予測の塩基対形成領域は修飾か ら保護されている。１つの例外は、中央のらせん（通常はらせん中の保護される 位置）のＮ７（Ｇ¹⁰、Ａ¹¹、Ｇ¹²）のわずかな修飾である。これらの修飾はおそ らくらせんの呼吸の結果であり；中央らせんの塩基対形成面の修飾が存在しない ことは、Ｎ７の接近可能性がＲＮＡの完全な局所の切断よりは、むしろ小さなら せんの歪みによることを示唆する。Ｇ１９−Ｕ２２ヘアピンループは、Ｇ１９の いくらかの部分修飾を除いて、完全に修飾される。 非変性構造で最も興味深い領域は、３つの「隆起」領域のＵ８−Ｕ９、Ａ１３ −Ａ１４−Ａ１５、およびＧ２６−Ｇ２７である。Ｕ８−Ｕ９はＣＭＣＴにより 完全に修飾されるが、これはおそらく塩基の溶媒に対する配向を示している。Ａ １３、Ａ１４、およびＡ１５は全てＤＭＳとＤＥＰＣにより修飾され、中央のＡ １４に生じる修飾が最も強力である。Ａ１３−Ａ１５領域と反対の隆起は、 ＤＭＳによるＧ２６の完全な保護を示し、Ａ２７のわずかな修飾を示す。Ｒｅｖ 結合性ＲＮＡのまた別の研究（バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）ら（１９９１）Ｃｅｌ ｌ ６７：５２９）では、本リガンドのＡ１３：Ａ２７とＡ１５：Ｇ２６に対応 するＡ：ＡとＡ：Ｇの非正規の塩基対形成の存在を主張している。この修飾デー タによりこれらの可能性は除外されないが、バーテルらが示唆する等しい立体の Ａ：Ａ塩基対は、塩基対形成のためにＮＩＡ位置を使用し、従ってＤＭＳ処理に 抵抗性であろう。また、Ａ：Ｇ対も同様に対生成のためにＮ１ＡまたはＮ７Ａの いずれかを使用して、ＡをＤＭＳまたはＤＥＰＣに抵抗性にする。 Ｒｅｖ結合の修飾妨害。修飾妨害検討の結果を図１４に要約する（個々の修飾 剤についての定量的データは図１５から１９に示す）。一般に、リン酸と塩基の 修飾結合妨害は、ＲＮＡリガンドの２つの領域に集中している。第一近似として 、これらの領域は、本検討に先立つセレックス実験に存在する２つの別のモチー フに対応する。リン酸修飾妨害はおそらく最も示唆的なリガンド−タンパク接触 の実際の部位であり、修飾妨害データの領域への分類のための追加的な規準を構 成する。 最初の領域は、Ｕ２４−Ｇ２５−Ｇ２６に集中し、リン酸、塩基対形成面、お よびＮ７修飾による妨害を含む。野生型ＲＲＥに保存されるこれらの同一の３つ のヌクレオチドも、ＲＲＥ ＩＩＢ軸ループ（クジェムス（Ｋｊｅｍｓ）ら（１ ９９２） ＥＭＢＯ Ｊ．１１：１１１９）を含有する短いＲＮＡを使用する修 飾妨害検討で、Ｒｅｖ結合にとって非常に重要であることが見い出された。第２ の領域はＧ１０−Ａ１１−Ｇ１２周辺に集中し、これもリン酸、塩基対形成面、 およびＮ７修飾からの妨害を含む。さらに、Ｃ６−Ａ７−Ｕ８を取り巻くより小 さい「ミニ領域」があり、リン酸と塩基対形成面修飾が結合を妨害している。 リガンド全体に多くの塩基対形成面の修飾が結合妨害を示すが、これはおそら くリガンドの２次構造のゆらぎのためである。２つの「隆起」塩基であるＵ９と Ａ１４は、修飾妨害を示さなかったが、これは両者が特異的塩基対形成相互作用 ／積み重ねや、タンパクとの接触に役割を持たないことを示している。 ＲＮＡがＲｅｖに結合している時の化学修飾保護。「足跡」の化学修飾データ を図２０に要約する。４つの位置、Ｕ８、Ａ１３、Ａ１５、およびＡ２７ は、Ｒｅｖタンパクに結合すると、塩基対形成面の修飾で少なくとも２倍の低下 （およびＡ位置のＮ７修飾で同様な低下）を示した。非変性条件下でのＧ１０− Ａ１１−Ｇ１２のわずかなＮ７修飾は、リガンドがＲｅｖの存在下で修飾された 時には検出されなかった。ＲＮＡ非変性構造の化学探索で修飾されていないＧ３ ２は、Ｒｅｖと複合体化すると、その塩基対形成面とＮ７位置の強力な修飾を示 す。Ｇ３２の５’と３’であるＵ３１とＵ３３は、リガンドがタンパクに結合す ると、わずかなＣＭＣＴ修飾を示す。 鋳型の偏ったランダム化を利用する２次セレックス。Ｒｅｖリガンド６ａ配列 が他の３つのヌクレオチドと各位置で、他の３つのヌクレオチドに対する（６ａ 配列の）比が６２．５対１２．５で混合された、図２１に示すような鋳型を合成 した。この偏った鋳型は、Ｒｅｖタンパクに対するバックグラウンドの親和性（ Ｋｄ＝１０^-7）を有するＲＮＡを与えた。セレックスを６回行うことにより、図 ２１に示す配列のリストが得られた。鋳型合成の間の投入の分布から予想される 分布とは異なる、各位置に見い出されるヌクレオチドと塩基対の頻度分布を図２ ２と２３に示す。これらのデータに基づく新規なコンセンサスは図２４に示す。 Ｒｅｖリガンド６ａとの最も著しい違いは、相対的に弱い塩基対Ａ７−Ｕ３１の Ｇ−Ｃ対による置換、およびＵ９のＣによる、Ａ１４のＵによる、Ｕ２２のＧに よる、許容されるまたは好ましい置換である。絶対的に保存される位置は、部位 Ｇ１０、Ａ１１、Ｇ１２；Ａ１５、Ｃ１６、Ａ１７；Ｕ２４、Ｇ２５；およびＣ ２８、Ｕ２９、Ｃ３０にある。Ｇ２６とＡ２５には置換した塩基は認められなか ったが、これらの位置でそれぞれ１つと３つの欠失が見い出された。１つは単純 なリガンド６ａ同様な配列で、もう１つは図２４に示す著しい選択により置換さ れたものである、２つの標識された転写物を合成した。これらのＲＮＡは全く同 様にＲｅｖタンパクに結合した。 軸領域の多くの置換がその安定性を増強する。５塩基対より長い軸の有意な選 択があるようには見えないが、これは複製（例えば、セレックスの逆転写工程の 間の複製の容易さ）のためには必要な選択かも知れない。１９９１年６月１０日 に出願された合衆国特許出願番号０７／７１４，１３１号と１９９１年１２月２ ６日に公開されたＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９１／１９８１３号で報告された最初 のセレックスでは、Ｕ９に他のヌクレオチドのいくつかのまばらな置換があるが 、本実験はＣによる好ましい置換を示す。その最初のセレックスではＡ２７の欠 失も現れた。驚くべき結果は、Ｃ１８−Ｇ２３の代わりのＣ１８−Ａ対形成の高 頻度の出現である。 測定された結合親和性を改善しない本実験に優先性が見い出される理由は、セ レックスの結合反応とこれらの結合測定法に違いがあるからである。セレックス では、不均一なＲＮＡ配列（必須の固定配列に隣接した）の比較的濃縮されたプ ールがタンパクに結合している。結合測定法では、低濃度の均一なＲＮＡ配列が 結合している。セレックスでは、他のＲＮＡ配列との分子間および分子内接触の 確率の上昇による、より差別的な配置の確実性について選択されるかも知れない 。ＲＮＡリガンドとその修飾された相同物の濃縮された用量の臨床的体内送達に は、これらの２次セレックスに認められる優先性が適切である。 ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパクに対する核酸リガンド。本発明は、セレックス方 法を特定の標的であるＨＩＶ−１ ｔａｔタンパクに適用する。以下の実施例II Iでは、ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパクに対する核酸リガンド溶液を単離し同定す るために使用した実験パラメーターが記載される。図２６は、セレックス工程の １０回の繰り返しの後配列決定された核酸をリストしている。 図２５は、ｔａｔタンパクに対する天然のリガンドであることが見い出された 、天然に存在するＴＡＲ配列を示す。ｔａｔタンパクとＴＡＲ配列間の相互作用 の特異的部位が決定され、これも図２５に記載される。 図２６に与えられた配列は、３つの「モチーフ」に分類される。これらの各モ チーフはＨＩＶ−１ ｔａｔタンパクに対する核酸リガンド溶液を表す。各モチ ーフ内の１次配列保存の領域が点線の四角で囲まれている。モチーフＩとIIは、 保存配列（あるモチーフを作り上げる全てのまたはほぼ全ての核酸配列に見い出 されるこれらの配列）を、らせんの要素に隣接する隆起中に位置させる共通の構 造を含有する。１次配列保存（これは主に各隆起の１本鎖ドメインにある）もモ チーフＩとII間で類似している。第３のモチーフ（III）は大きなループにより 特徴付けられる。この３つのモチーフは図２７に概略図で表される。本明細書で 同定される核酸リガンドと、図２５に与えられるＴＡＲ配列間には明瞭な類似は な い。 境界分析測定は、モチーフIIIのリガンド配列の１つで実施された。認識の境 界は、図２６に実線で四角で囲んで示される。境界測定は、すでに記載した方法 により実施した。ターク（Ｔｕｅｒｋ）ら（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ．２１３：７４９；タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ ＆ Ｇｏｌｄ）（１９９０ ） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５を参照のこと。 図２８では、配列７（モチーフＩ）、２４（モチーフII）２９（モチーフII、 ３１（モチーフIII）および最初の候補混合物の結合親和性が示される。図に見 られるように、各核酸リガンド溶液モチーフからのメンバーは、核酸の候補混合 物に比べてｔａｔタンパクに対する親和性が上昇した。各リガンドはＴＡＲ配列 に比べて、有意に大きなｔａｔタンパクに対する親和性を示す。 薬剤としての使用に求められる核酸を製造するためには、この核酸リガンドは 、１）標的に目的の効果を及ぼすことができる方法で標的に結合し；２）目的の 効果を得られるようにできるだけ小さく；３）できるだけ安定で；そして４）選 択された標的に特異的なリガンドであることが好ましい。全てではないが大抵の 場合に、核酸リガンドが標的に対して可能な限り高い親和性を有することが好ま しい。 本発明は、図２６に示す特異的核酸リガンドと、図２７に概略図で示す核酸リ ガンド溶液を含む。本発明にカバーされるリガンドの範囲は、セレックス方法に より同定されるｔａｔタンパクに対する全てのリガンドまで拡張される。さらに 具体的には、本発明は、１）図２６に示す特異的核酸リガンドと実質的に相同で あって、ｔａｔタンパクに対して質的に同一の結合能力を有するか、または２） 図２７に示す核酸リガンド溶液と実質的に相同であって、ｔａｔタンパクに対し て実質的に同一の結合能力を有する、核酸配列を含む。実質的に相同というのは 、一次配列の相同の程度が７０％以上、最も好ましくは８０％以上であることを 意味する。ｔａｔタンパクに対する実質的に同一の結合能力とは、その親和性が 、本明細書中で記載した実質的に相同の配列の親和性の大きさの２桁の範囲内に あることを意味する。ある配列（本明細書中で記載した配列と実質的に相同であ る）が、ｔａｔタンパクに結合する実質的に同一の能力を有するかどうかを測定 することは、当業者には特別難しいことではない。 モチーフＩ、IIおよびIII、ならびに結合曲線の概要が図２８に示され、１次 配列がほとんどまたは全然相同でない配列が、ｔａｔタンパクに結合する実質的 に同一の能力を有することを示している。もしこれらの各モチーフのリガンドがｔａｔ タンパクの同一の結合部位に結合すると仮定すれば、結合が核酸リガンド の２次または３次構造により制御されていることは明白である。本明細書中では モチーフＩ、IIおよびIIIで表される、ある１次構造は、ｔａｔタンパクの結合 部位に非常に類似している構造をとることができるであろう。これらの理由で本 出願は、本明細書中に与えられたリガンドと実質的に同一の構造型を有し、図２ ６または図２７に示す核酸リガンドと実質的に同一の、ｔａｔタンパクに結合す る能力を有する核酸リガンドをも含む。実質的に同一の構造は、ｔａｔタンパク に対する親和性を導くモチーフＩ、IIおよびIIIの共通構造要素を有する全ての 核酸リガンドを含む。 本発明はまた、リガンドのインビボ安定性を上昇させるために、あるいはリガ ンドの体内送達を促進または媒介するためにある化学修飾を加えられた、上述の リガンドを含む。 本明細書に記載されたＨＩＶ−１ ｔａｔタンパクに対する核酸リガンドと核 酸リガンド溶液は、薬剤としてそして遺伝子治療の一部として有用である。当業 者に公知の方法により、核酸リガンドはＨＩＶウイルスに感染した細胞の中に導 入され、そこで核酸リガンドはｔａｔタンパクに対してＴＡＲ配列と競合する。 こうしてＨＩＶ遺伝子の転写が防止される。 トロンビンに対する核酸リガンド。本発明は図２９に示す特異的核酸リガンド を含む（配列ＩＤ番号：１３７−１５５）。本発明によりカバーされるリガンド の範囲は、セレックス方法により同定されるトロンビンに対する全てのリガンド まで拡張される。さらに具体的には、本発明は、図２９に示す特異的核酸リガン ド（配列ＩＤ番号：１３７−１５５）と実質的に相同であって、トロンビンに対 して実質的に同一の結合能力を有する核酸リガンドを含む。 グループＩとグループIIリガンドについて図３０に示す提唱された構造の概要 は、１次配列がほとんどまたは全然相同でない配列がなお、トロンビンに結合す る実質的に同一の能力を有することを示している。これらの理由で本発明は、本 明細書で与えられたリガンドと実質的に同一の構造を有し、図３０に示しＲＮＡ リガンド（配列ＩＤ番号：１５６−１５９）と実質的に同一のトロンビンに結合 する能力を有するＲＮＡリガンドをも含む。「実質的に同一の構造」とは、図３ ０に示す配列（配列ＩＤ番号：１５６−１５９）の共通の構造要素を有する全て のＲＮＡリガンドを含む。 本発明はまた、リガンドのインビボ安定性を上昇させるため、あるいはリガン ドの体内送達を促進または媒介するためにある化学修飾を加えられた上述のリガ ンドも含む。特に本発明の範囲には、ＲＮＡリガンドのあるリボースの２’−Ｎ Ｈ₂修飾を含有するトロンビンのＲＮＡリガンドを含む。 本明細書で記載したトロンビンに対する核酸リガンドと核酸リガンド溶液は、 薬剤としておよび遺伝子治療の一部として有用である。 アテローム性動脈硬化の開始と進展、急性冠状動脈症候群、静脈移植疾患、お よび冠状動脈血管形成後の再狭窄を含む、種々の血管疾患の病因を理解するには 血管傷害と血栓症の概念は重要である。 本発明の高親和性トロンビン結合ＲＮＡリガンドは、種々の性質を有すること が期待される。これらの特徴は、ヒルジンペプチド阻害剤と、トロンビンの構造 と結合に関する最近の理解に沿って考えることができる。これに沿ってそして理 論に限定されることなく考えると、ＲＮＡリガンドは高度に塩基性のアニオン性 の外側部位に結合している確度が高い。またＲＮＡは、カチオン性のアルギニン 残基に対して高特異性を有する触媒部位に結合していない可能性も高い。ＲＮＡ リガンドはＣ末端ヒルジンペプチドと同一の様式で作用することが予想される。 このようにそれらは小さいペプチド性基質を強く阻害しないが、フィブリノーゲ ン凝固、プロテインＣ活性化、血小板活性化、および内皮細胞活性化は阻害する であろう。もしアニオン性の外側部位でフィブリノーゲン凝固とＴＭ結合活性が 分離可能であれば、異なる高親和性ＲＮＡリガンドがこれらの活性を別々に阻害 することが可能である。さらに、凝固促進性よりも強力な抗凝固物質を生成する ために、何か１つの活性を選択しても良い。 標的に対するリガンドを同定するためのセレックス方法は、標的としてヒトト ロンビンを、そしてランダム化した配列の３０ヌクレオチド領域を有する７６ヌ クレオチドのＲＮＡを含有する候補混合物を使用して実施した（実施例IV）。１ ２回のセレックスの後に、多くの選択されたリガンドの配列を決定し、１次配列 の共通の要素を有する、配列の２つのグループの存在を明らかにした。 大量の３０Ｎ ＲＮＡに比べて、ＲＮＡ集団の結合の劇的な変化が、セレック スの１２回の後に観察された。１２回後の大量のＲＮＡの配列決定も、非ランダ ム配列の側面を示した。ＲＮＡを逆転写し、増幅し、クローン化して２８の個々 の分子の配列を決定した（図２９）。１次配列の相同性に基づき、２２ＲＮＡが クラスＩに分類され、６ＲＮＡがクラスIIに分類された。クラスＩの２２配列の 内、１６配列（その内の８は同一）は同一の配列モチーフＧＧＡＵＣＧＡＡＧ（ Ｎ）₂ＡＧＵＡＧＧＣ（配列ＩＤ番号：９）を含有したが、一方残りの６配列は その限定された領域に１または２ヌクレオチドの変化、あるいはＮ＝２からＮ＝ ５の少しの変動を含有した。この保存されたモチーフは、３０Ｎ領域中でその位 置を変化させた。クラスIIでは、６ＲＮＡの内の３つが同一であり、これら全て が、５’固定領域の末端から３番目のヌクレオチドから始まる、保存モチーフＧ ＣＧＧＣＵＵＵＧＧＧＣＧＣＣＧＵＧＣＵＵ（配列ＩＤ番号：１０）を含有した 。 クラスＩからの３つの配列変異体ＲＮＡリガンド（６、１６、および１８）と 、クラスIIから１つ（２７）（配列決定された順により同定された）を、個々の 結合分析のために使用した。クラスＩＲＮＡは、ｋＤ約３０ⁿＭのクローン１６ を例にとり、クラスIIＲＮＡクローン２７のｋＤは約６０ⁿＭであった。 ５’および３’固定配列に隣接する可変３０Ｎ領域を含む７６ヌクレオチドの ＲＮＡの、特異的高親和性結合に要する最小配列を同定するために、５’および ３’境界実験を実施した。５’境界実験のために、ＲＮＡの３’末端を標識し、 加水分解して、種々の５’末端を有するＲＮＡのプールを得た。３’境界実験の ために、ＲＮＡの５’末端を標識し、加水分解して種々の３’末端を有するＲＮ Ａのプールを得た。必要な最小ＲＮＡ配列は、ニトロセルロースに対するＲＮＡ タンパク結合と、ゲル電気泳動による標識ＲＮＡの同定により決定した。 ３’境界実験により、図３０Ａに示す各４つの配列（配列ＩＤ番号：１５６− １５９）の境界が得られた。これらの境界は、すべてのタンパク濃度で一貫性が あった。５’境界実験により、低いタンパク濃度で大きな境界を与えたＲＮＡ１ ６を除いては、図３１に示す境界プラスまたはマイナス１ヌクレオチドの境界が 得られた。これらの境界実験に基づく、トロンビンリガンドの可能な２次構造を 図３０Ｂに示す。 結合分析のために、クラスＩのクローン１６（２４および３９ヌクレオチド） の最も小さいおよび最も大きいヘアピンとクラスIIのクローン２７（３３ヌクレ オチド）のヘアピンに対応するＲＮＡｑｏ、合成または転写した（図３０Ｂ参照 ）。結果は、ＲＮＡ２７ヘアピンは、固定および可変領域を有する全７２ヌクレ オチド転写物と等しい親和性（約６０ⁿＭのｋＤ）で結合することを示す（図３ １ＡのＲＮＡ２７を図３１ＣのＲＮＡ３３Ｒを比較）。一方クラスＩのクローン １６ＲＮＡヘアピンのｋＤは、３０ⁿＭから２００ⁿＭへ大きさで上昇した。 ＲＮＡ分子のピリミジン残基の２ＮＨ₂−リボースの修飾は、血清中のＲＮＡ の安定性（ＲＮａｓｅによる分解に対する抵抗性）を少なくとも１０００倍上昇 させることが証明された。クラスＩおよびクラスIIの２ＮＨ₂−ＣＴＰ／ＵＴＰ 修飾ＲＮＡを用いる結合実験は、未修飾ＲＮＡに比べて結合の著しい低下を示し た（図３２）。しかし大量の３０Ｎ ＲＮＡによる結合は、修飾された時に親和 性のわずかな上昇を示した。 １５ヌクレオチドのコンセンサス５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３ ’（Ｇ１５Ｄ）（配列ＩＤ番号：１）を有するｓｓＤＮＡ分子は、インビトロで ヒトトロンビンに結合してフィブリン凝固形成を阻害することが証明された（ボ ックら（１９９２）、前述）。Ｇ１５Ｄと本発明のＲＮＡヘアピンリガンド間の 、トロンビン結合についての競合実験の結果を図３３に示す。これらの実験Ａ） の始めに、³²Ｐ標識Ｇ１５Ｄを、濃度の上昇する非標識ＲＮＡまたは非標識Ｇ１ ５Ｄと共に、トレーサーとして使用した。予想どおり、Ｇ１５Ｄをそれ自体の結 合に競合するために使用すると、標識ＤＮＡの結合は標識および非標識競合ＤＮ Ａの等モル濃度（１μＭ）で５０％に減少した。クラスＩのクローン１６合成Ｒ ＮＡ２４と３９、およびクラスIIのクローン２７合成ＲＮＡ３３は、この濃度で Ｇ１５Ｄの結合に競合することができた。Ｂ）では、高親和性のクラスIIの ヘアピンＲＮＡ３３（ｋＤ≒６０ⁿＭ）を³²Ｐ標識して、濃度の上昇する非標識 ＲＮＡまたは非標識Ｇ１５Ｄ ＤＮＡ（ｋＤ≒２００ⁿＭ）と共に、トレーサー として使用した。これらの実験で、ＲＮＡ３３自体の競合よりもＧ１５Ｄは高濃 度でＲＮＡ３３に効果的に競合でき（結合の右に対する変化）、これは３−４倍 の高親和性のリガンドと競合するときに予想されることである。クラスIIのヘア ピンＲＮＡ３３（ｋＤ≒６０ⁿＭ）は、クラスＩのヘアピンＲＮＡ２４（ｋＤ≒ ２００ⁿＭ）により、弱く競合されたのみであり、これはいくらかの重複がある かもしれないが、これら２つのクラスのＲＮＡは、異なっているが隣接するかま たは重複する部位に高親和性で結合することを示唆している。これら両方のＲＮ ＡがＧ１５Ｄ結合に競合できるため、このＤＮＡ１５量体はおそらくクラスＩと クラスIIヘアピン間重複の領域に結合している。 発色基質Ｓ２２３８の切断。本発明のＲＮＡリガンドの存在下でおよび非存在 下で、ペプチド発色性基質Ｓ２２３８（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐニ トロアニリン）（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）（カビ・ファルマ シア）を切断するトロンビンの能力を、測定した。この切断反応に、トロンビン １０^-8ＭとＲＮＡ１０^-8Ｍ、トロンビン１０^-9ＭとＲＮＡ１０^-8Ｍまたはトロン ビン１０^-8ＭとＲＮＡ１０^-7Ｍで、ＲＮＡは阻害効果を及ぼさなかった（図３４ Ａ）。これらの結果は、ＲＮＡリガンドが酵素の触媒部位に結合しないことを示 唆している。 フィブリノーゲンのフィブリンへの切断と凝固形成。フィブリノーゲンのフィ ブリンへの切断により凝固形成を触媒するトロンビンの能力を、本発明のＲＮＡ リガンドの存在下でおよび非存在下で測定した。ＲＮＡがＫｄ（クラスＩのＲＮ Ａは３０ⁿＭ、そしてクラスIIのＲＮＡは６０ⁿＭ）に等しい濃度で存在したとき （この濃度はトロンビンの５から１０倍過剰である）、凝固時間は１．５倍上昇 した（図３４Ｂ）。 トロンビン結合の特異性。クラスＩとクラスIIからの代表的リガンドは、これ らのリガンドは１μＭの高濃度でも、ＡＴIIIに対する親和性は低いことを示し た。これらのリガンドは大量の３０Ｎ３ ＲＮＡに比べて低い親和性を示したが 、これは非特異的結合に対する選択があったことを示唆している。ＡＴIIIはポ リアニ オン性高分子であるヘパリンに高親和性を示す、多量に存在する血漿タンパクで あるため、これは特に重要である。これらの結果は、クラスＩおよびクラスIIの ＲＮＡに存在する別個の構造の進化がトロンビン結合に対して特異的であり、そ のポリアニオン性の組成にも関わらず、高親和性ヘパリン結合タンパクには結合 しないことを示す。これらのトロンビン特異的ＲＮＡリガンドは、活性トロンビ ンの不活性な生化学前駆体であって、血漿中に高レベル（≒１μＭ）で循環して いるプロトロンビンには親和性をもたないことも特記すべきである（図３５Ｂ） 。 塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に対する核酸リガンド。本発明はセレ ックス方法を特異的標的ｂＦＧＦに適用する。以下の実施例の項に、ｂＦＧＦに 対する核酸リガンド溶液を単離し同定するために使用した実験パラメーターを記 載する。 本発明は表II−IVに示す特異的核酸リガンドを含む。本発明でカバーされるリ ガンドの範囲は、セレックス方法により同定されるｂＦＧＦに対する全てのリガ ンドまで拡大される。さらに具体的には、本発明は、表II−IVに示す特異的核酸 リガンドと実質的に相同であって、ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有 する核酸配列を含む。 ファミリ−１および２のリガンドに関して、図４１に示す提唱される構造形成 の概要は、１次配列にほとんどまたは全然相同性を有さない配列がなお、ｂＦＧ Ｆに結合する実質的に同一の能力を有することを示す。本発明は、本明細書中に 与えられたリガンドと実質的に同一の構造を有し、表IIおよびIIIに示すＲＮＡ リガンドとｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有する、ＲＮＡリガンドも 含む。「実質的に同一の構造」は、表IIおよびIIIに示す配列（配列ＩＤ番号： ２７−６７）の共通の要素を有する全てのＲＮＡリガンドを含む。 本発明はまた、リガンドのインビボ安定性を上昇させ、リガンドの体内送達を 促進または媒介し、あるいは体内からのクリアランス速度を低下させるために、 ある化学修飾を加えられた上述のリガンドも含む。特にＲＮＡリガンドのあるリ ボースの２’−ＮＨ₂修飾を含有するｂＦＧＦのＲＮＡリガンドが、本発明の範 囲に含まれる。 本明細書に記載されたｂＦＧＦに対する核酸リガンドと核酸リガンド溶液は、 薬剤として、および遺伝子治療の一部として有用である。さらに本明細書に記載 されたｂＦＧＦに対する核酸リガンドは診断目的に有利に使用され得る。 本発明の高親和性核酸リガンドはまた、ｂＦＧＦの生物活性を阻害する能力を 含む、種々の性質を有する。配列ファミリー１および２からの代表的リガンドは 、ｂＦＧＦの低−および高−親和性細胞表面リセプターの両者に対する結合を阻 害することが見い出された。これらの核酸リガンドは、インビボのｂＦＧＦ活性 の特異的で強力な中和剤として有用でありうる。 実施例Ｉ：ＨＩＶ−ＲＴに対する改良された核酸リガンド溶液の解明ＲＮＡ合 成 。オリゴヌクレオチド鋳型でのインビトロ転写を、ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａ ｎ）ら（１９８７）（前述）に記載のように実施した。全ての合成核酸は、標準 プロトコールを使用して、アプライド・バイオシステムズ・モデル３９４−０８ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏ ｄｅ１ ３９４−０８ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて作 成した。デオキシリボヌクレオチドホスホラミジトおよびＤＮＡ合成用の溶媒と 試薬は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ）から購入した。リボヌクレオチドと２’−メトキシ−リボヌクレオチドホス ホラミジトは、グレン・リサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎ）から購入した。混合塩基位置については、０．１Ｍホスホラミジ ト溶液を、指示された容量比で混合した。塩基の脱保護は、水酸化アンモニウム ：エタノール３：１の中で５５℃で６時間実施した。ｔ−ブチル−ジメチルシリ ル保護基は、フッ化テトラブチルアンモニウム中で一晩処理することにより合成 ＲＮＡの２’−ＯＨ基から脱離させた。次に脱保護したＲＮＡは、フエノール抽 出して、エタノール沈殿させゲル電気泳動により精製した。 標識したＲＮＡとＨＩＶ−ＲＴを用いる親和性測定。５’および３’境界の改 良と置換の効果の測定のためのモデルＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼでの転 写の間に、０．５ｍＭのＣ、Ｇ、およびＵＴＰと０．０５ｍＭのＡＴＰの反応中 で、α−³²Ｐ−ＡＴＰを使用したことを除いて、タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ ＆ Ｇｏｌｄ）（１９９０）（前述）が記載するように、標識した。合成オリ ゴヌクレオチドとリン酸化された転写物（タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ ＆ Ｇｏｌｄ）（１９９０）（前述）は、ガウス（Ｇａｕｓｓ）ら（１９８７）Ｍｏ ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６：２４が記載したようにキナーゼ処理した。全 てのＲＮＡ−タンパク結合反応は、以下に注記した化学保護実験を例外として、 ２００ｍＭのＫＯＡｃ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．７、１０ｍＭのジ チオスレイトールからなる「結合緩衝液」中で行った。ＲＮＡおよびタンパクの 希釈物を混合して、氷上に３０分間保存して、次に５分間３７℃に移行させた。 結合測定では反応容積は６０μｌで、その内５０μｌを測定した。各反応物は、 予め（結合緩衝液で）湿したニトロセルロースフィルターを通して吸引して、３ ｍｌの結合緩衝液ですすぎ、次に乾燥させて測定のために数えるか、または溶出 して化学修飾について測定した。結合親和性の比較では、結果をプロットして、 グラフから、最大の半分の結合が起こるタンパク濃度（タンパク過剰の条件下で およそＫｄ）を決定した。 ＨＩＶ−ＲＴによる修飾ＲＮＡの選択。結合反応は、反応物に添加するＨＩＶ −ＲＴの量を変えるよりはむしろ、反応物の容量を増加させて低濃度にすること を除いては、前述のとおりであった。変性条件下で修飾したＲＮＡは、２０、４ および０．８ナノモルの濃度のＨＩＶ−ＲＴ（結合緩衝液の容量で１、５および ２５ｍｌ）で選択した。各反応物に添加したＲＮＡの量は、各実験について同等 であった（約１−５ピコモル）。ＲＮＡは、タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ ＆ Ｇｏｌｄ）（１９９０）（前述）に記載されるようにフィルターから溶出して 、修飾した位置について測定した。各実験には、選択したＲＮＡと平行に未選択 のＲＮＡをフィルター上にスポットし、溶出して修飾した位置について測定する 、対照を含めた。選択したＲＮＡと未選択のＲＮＡの化学修飾での変化は、以下 の例外を除き電気泳動した測定生成物の露出したフィルムを目視により試験する ことにより行った。ＥＮＵによる修飾妨害の程度は、ＬＫＢレーザーデンシトメ ーターを使用して、フィルムの密度の走査により測定した。各位置での修飾妨害 の指数（Ｍ．Ｉ．）は以下のように計算した： Ｍ．Ｉ．＝（Ｏ．Ｄ．未選択／Ｏ．Ｄ．未選択Ａ２０）／（Ｏ．Ｄ．選択／Ｏ． Ｄ．選択Ａ２０） 式中、選択された修飾ＲＮＡについて測定した各位置の値（Ｏ．Ｄ．選択）を、 位置Ａ２０についての値（Ｏ．Ｄ．選択Ａ２０）で割り、同様に未選択レーンに ついて割って標準化値とした。２．０以上の全てのＭ．Ｉ．値は妨害するとして 、４．０以上は強力に妨害するとして報告される。２’ヒドロキシル（各ヌクレ オチドのリボース上）の２’−メトキシによる混合置換の効果の測定において、 電気泳動した加水分解生成物のゲルを、アンビス検出系（Ａｍｂｉｓ ｄｅｔｅ ｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）で直接計測した。レーン内の各バンドに関連したカ ウントは、位置Ａ１７について前述のように標準化した。さらに、以下に記載す るようにレーザーデンシトメーターにより測定した。 ＲＮＡの化学修飾。ＲＮＡの化学修飾の型とその特異性および測定の方法につ いては、アーレスマン（Ｅｈｒｅｓｍａｎｎ）ら（１９８７）（前述）の有用な 概説がある。未変性の条件下でのＲＮＡの修飾は、２００ｍＭのＫＯＡｃ、５０ ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．７で３７℃、でエチルニトロソ尿素（ＥＮＵ） （室温のＥＮＵ飽和エタノールの１／５ｖ／ｖ希釈物）により１−３時間、硫酸 ジメチル（ＤＭＳ）（１／７５０倍ｖ／ｖ希釈物）により８分間、ケトキサール （０．５ｍｇ／ｍｌ）により８分間、カルボジイミド（ＣＭＣＴ）（８ｍｇ／ｍ ｌ）により２０分間、そしてジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）（未変性の 条件下の１／１０のｖ／ｖ希釈物または変性条件下の１／１００の希釈物）によ り４５分間行い、同一条件下で１ｍＭのＤＴＴを添加してＨＩＶ−ＲＴに結合さ せた。修飾化学試薬の濃度は、変性条件で同一であった（ＤＥＰＣについて記載 される部分を除く）；ＥＮＵによる修飾を７Ｍの尿素の非存在下で行う場合を除 き、これらの条件は、７Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．７、１ ｍＭのＥＤＴＡで９０℃で１−５分間であった。 化学修飾の測定。伸長したリガンドＢのＲＮＡ、５’−ＧＧＵＣＣＧＡＡＧＵ ＧＣＡＡＣＧＧＧＡＡＡＡＵＧＣＡＣＵＡＵＧＡＡＡＧＡＡＵ−ＵＵＵＡＵＡＵ ＣＵＣＵＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’ （配列ＩＤ番号：１１）（リガンドＢ配列は下線で表す）上の、ＤＭＳ、ケトキ サールおよびＣＭＣＴについて、化学修飾の位置を逆転写により測定した；ここ にオリゴヌクレオチドプライマー ５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＣＡＡＴＡ ＧＡＧ−ＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：１２）をアニーリング させて；逆転写産物（ガウス（Ｇａｕｓｓ）ら、１９８７ 前述 のように得た ）を、１０％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離した。ＥＮＵとＤ ＥＰＣ修飾の位置は、それぞれブラソフ（Ｖｌａｓｓｏｖ）ら（１９８０）ＦＥ ＢＳ Ｌｅｔｔ．１２０：１２、およびピーティーとギルバート（Ｐｅａｔｔｉ ｅ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ）（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ ７７：４６７９のように（２０％アクリルアミドゲル上の電気泳 動により分離）測定した。種々の位置のリボースに対する２’−メトキシリボー スの測定は、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．０）中で９０℃で４５分間ア ルカリ性加水分解により測定した。 ＨＩＶ−ＲＴの存在下でのＲＮＡの修飾。使用した条件は、未変性のＲＮＡの 修飾と同じであった。ＨＩＶ−ＲＴの濃度は、ＲＮＡ濃度の約１０倍過剰であっ た。一般にタンパク濃度は、５０ｎＭから１μＭの範囲であった。 ＨＩＶ−ＲＴとの付帯的接触のセレックス単離。出発物質のＲＮＡは、以下の オリゴヌクレオチドから合成した、ＰＣＲ反応をさせた鋳型から転写した： （５’プライマー）（配列ＩＤ番号:１３）、 （３’プライマー）（配列ＩＤ番号:１４）、 （可変鋳型）（配列ＩＤ番号:１５）。 セレックスは、以下の例外を除いて、ＨＩＶ−ＲＴについてすでに記載したよ うに実施した。１回目のセレックスの結合反応のＨＩＶ−ＲＴの濃度は、４ｍｌ の結合緩衝液中１３ナノモル、ＲＮＡは１０マイクロモルであり、２から９回目 は２０ｍｌの緩衝液中２．６ナノモルのＨＩＶ−ＲＴ、１．８マイクロモルのＲ ＮＡで選択を行い、１０−１４回目は５０ｍｌ中１ナノモルのＨＩＶ−ＲＴ、 ０．７マイクロモルのＲＮＡを使用し、そして１５と１６回目は５０ｍｌの結合 緩衝液中０．５ナノモルのＨＩＶ−ＲＴ、０．７マイクロモルのＲＮＡを使用し た。 実施例Ｉの参照文献： 実施例II：ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクに対する改良された核酸リガンド溶液の 評価 化学修飾に使用したＲｅｖリガンド配列を、図１２（以後は、番号を付けた概 略図が使用される）に示す。修飾のためのＲＮＡは、合成オリゴヌクレオチド鋳 型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写から得た。ＥＮＵ修飾は、図１２に示すリガン ド配列について実施した。ＤＭＳ、ケトキサール、ＣＭＣＴ、およびＤＥＰＣ修 飾を、伸長したリガンド配列について実施し、図１２に示す合成オリゴヌクレオ チドプライマーを用いて逆転写により分析した。 ＲＮＡの化学修飾。核酸の化学修飾技術は、一般的にアーレスマン（Ｅｈｒｅ ｓｍａｎｎ）ら（１９８７）（前述）に記載されている。未変性の条件下でのＲ ＮＡの修飾は、２００ｍＭのＫＯＡｃ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ７．７、 １ｍＭのＥＤＴＡ中で３７℃で実施した。変性条件下での修飾は、７Ｍの尿素、 ５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．７中で９０℃で行った。修飾試薬の濃度と インキュベーション時間は以下のとおりである：エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ） −ＥＮＵ飽和エタノールの１／５ｖ／ｖ希釈物、未変性１−３時間、変性５分間 ；硫酸ジメチル（ＤＭＳ）−１／７５０倍ｖ／ｖ希釈物、未変性８分間、変性１ 分間；ケトキサール−０．５ｍｇ／ｍｌ、未変性５分間、変性２分間；カルボジ イミド（ＣＭＣＴ）−１０ｍｇ／ｍｌ、未変性３０分間、変性３分間；ジエチル ピロカーボネート（ＤＥＰＣ）−１／１０のｖ／ｖ希釈物、未変性１０分間、変 性１分間。 Ｒｅｖ結合の修飾妨害。変性条件下で化学修飾したＲＮＡは、フィルター分画 によりＲｅｖ結合について選択した。選択は、Ｒｅｖの濃度３０、６、および１ ．２ナノモルで実施した（結合緩衝液（２００ｍＭのＫＯＡｃ、５０ｍＭのトリ ス−ＨＣｌ ｐＨ７．７、および１０ｍＭのジチオスレイトール）の容量１、５ 、 および２５ｍｌに相当する）。各タンパク溶液に約３ピコモルの修飾されたＲＮ Ａを添加し、混合して氷上で１５分間保存し、次に１０分間３７℃に移行させた 。結合溶液は、予め湿したニトロセルロースフィルターに通し、５ｍｌの結合緩 衝液ですすいだ。ＲＮＡは、タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ ＆ Ｇｏｌｄ）（ １９９０）（前述）が記載したようにフィルターから溶出して、残った修飾位置 について測定した。修飾ＲＮＡはまたフィルターにスポットし、溶出液して修飾 ＲＮＡの均一な回収について溶出した。 修飾妨害の程度は、ＬＫＢ（ＥＮＵ）およびモレキュラー・ダイナミクス（Ｄ ＭＳ、ケトキサール、ＣＭＣＴ、およびＤＥＰＣ）のレーザーデンシトメーター を使用して、オートラジオグラフの密度走査により測定した。修飾したリン酸と 塩基についての値は、選択したおよび未選択のレーンとも、選ばれた修飾位置で 標準化した；次に選択した方のレーンの修飾位置についての値は、未選択のレー ンの対応する位置により割った（特定の標準化位置については図１５−１９を参 照）。修飾した塩基とリン酸について４．０以上の値は強力に妨害していると判 定し、２．０以上の値はわずかに妨害していると判定した。 Ｒｅｖの存在下でのＲＮＡの修飾。Ｒｅｖタンパクの存在下でのＲＮＡリガン ドの修飾であるＲｅｖリガンドの「足跡」は、２００ｍＭのＫＯＡｃ、５０ｍＭ のトリス−Ｃｌ ｐＨ７．７、１ｍＭのＤＴＴ、および５ｍＭのＭｇＣｌ₂中で 実施した。タンパクの濃度は５００ナノモル、そしてＲＮＡ濃度の約３倍モル過 剰であった。エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）を除く前述した全ての修飾試薬を用 いてで、タンパク存在下での修飾を試みた。 化学修飾したＲＮＡの測定。ＥＮＵ修飾の位置は、ブラソフ（Ｖｌａｓｓｏｖ ）ら（１９８０）（前述）のように検出し、２０％変性アクリルアミドゲルによ る電気泳動により分離した。ＤＭＳ、ケトキサール、ＣＭＣＴ、およびＤＥＰＣ は、放射標識したオリゴヌクレオチドプライマー（図１２）による伸長したＲｅ ｖリガンドの逆転写により測定し、８％変性アクリルアミドゲル上の電気泳動に より分離した。 偏ったランダム化によるセレックス。インピトロの転写のための鋳型は以下の オリゴヌクレオチドからＰＣＲにより調製した： （鋳型オリゴ）（配列ＩＤ番号:１６） （５’プライマー）（配列ＩＤ番号:１７） （３’プライマー）（配列ＩＤ番号:１８） ここで鋳型オリゴの小文字は、各位置で６２．５％の量の小文字と各１２．５％ の他の３つのヌクレオチドの試薬の混合物を合成に使用したことを示す。 セレックスは、以下の例外を除きすでに記載したように実施した。最初と２回 目の結合反応のＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクの濃度は、１０ｍｌの容量（２００ ｍＭの酢酸カリウム、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．７、１０ｍＭのＤＴ Ｔの）中で７．２ナノモルであり、ＲＮＡは４マイクロモルであった。３から６ 回目で、４０ｍｌの容量中に、Ｒｅｖタンパクの濃度は１ナノモルであり、ＲＮ Ａは１マイクロモルであった。ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクは、アメリカン・バ イオテクノロジーズ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）から購入した。実施例III：ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパクに対する核酸リガンド 。 ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパクのセレックス。ｔａｔタンパクはアメリカン・バ イオ−テクノロジーズ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ，Ｉｎｃ．）から購入した。インビトロ転写のための鋳型は、以下のオリゴヌ （５’プライマ）（配列ＩＤ番号:１８） （可変鋳型）（配列ＩＤ番号:１９） （３’プライマー）（配列ＩＤ番号:２０） セレックス回転は、以下の条件下でターク（Ｔｕｅｒｋ）ら（１９９２ａ）（前 述）、およびセレックス出願に記載したように実施した：結合反応は、１および ２回目は２ｍｌの容量中の、１３ナノモルのｔａｔタンパクと１．３マイクロモ ルのＲＮＡで行い、３−１０回目は４ｍｌ中の６．５ナノモルのｔａｔタンパク と０．６５マイクロモルのＲＮＡで行った。 ＲＮＡ合成。オリゴヌクレオチド鋳型でのインビトロ転写は、ミリガン（Ｍｉ ｌｌｉｇａｎ）ら（１９８７）（前述）が記載したように実施した。全ての合成 核酸は、標準プロトコールを使用して、アプライド・バイオシステムズ・モデル ３９４−０８ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ３９４−０８ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ）で作成した。デオキシリボヌクレオチドホスホラミジトおよびＤＮＡ合成用の 溶媒と試薬は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ）から購入した。 標識したＲＮＡとＨＩＶ−１ｔａｔタンパクとの親和性測定。５’および３’ 境界の改良と置換の効果の測定のためのモデルＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラー ゼでの転写の間に、０．５ｍＭのＣ、Ｇ、およびＵＴＰと０．０５ｍＭのＡＴＰ との反応にα−³²Ｐ−ＡＴＰを使用したことを除いて、セレックス出願に記載し たように標識した。全てのＲＮＡ−タンパク結合反応は、２００ｍＭのＫＯＡｃ 、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．７、１０ｍＭのジチオスレイトールから なる「結合緩衝液」中で行った。ＲＮＡおよびタンパクの希釈物は、混合して氷 上に３０分間保存して、次に５分間３７℃に移行させた。結合測定では反応容量 は６０μｌで、その内５０μｌを測定した。各反応物は、予め湿した（結合緩衝 液で）ニトロセルロースフィルターを通して吸引し、３ｍｌの結合緩衝液ですす ぎ、次に乾燥させて測定のために計測するか、または溶出し、化学修飾について 測定した。結合親和性の比較では、結果をプロットし、最大の半分の結合が生じ たタンパク濃度（タンパク過剰の条件下でおよそＫｄ）を、グラフから決定した 。結合測定の結果を図２７に示す。実施例IV：トロンビンに対する核酸リガンド トロンビンに対する高い親和性のＲＮＡリガンドを、セレックスにより単離し た。最初の候補混合物に使用したランダムＲＮＡ分子は、ランダムカセット３０ ヌクレオチド（３０Ｎ）長を含有する１０２ヌクレオチドの２本鎖ＤＮＡ鋳型か ら、インビトロの転写により作成した。１０¹³の３０ＮのＤＮＡ鋳型の集団は、インビトロ の転写のためにＴ７プロモーター、およびクローニングのため５’お よび３’プライマーの両方に制限部位を含有する５’プライマーを使用して、Ｐ ＣＲにより作成した。 セレックスの各回転でのＲＮＡ濃度は、約２−４×１０^-7Ｍであり、トロンビ ン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、１０００単位）の濃度は、１回目の１．０×１０^-6 から２および３回目の４．８×１０^-7、そして４−１２回目の２．４×１０^-7で あった。ＲＮＡとタンパクの結合緩衝液は、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭの トリス／Ｃｌ、ｐＨ７．７、１ｍＭのＤＴＴ、および１ｍＭのＭｇＣ¹²であった 。結合は、３７℃で５分間、１−７回目では全容量１００μｌ、そして８−１２ 回目では２００μｌ中で行った。各結合反応物は、ミリポアフィルター結合装置 中で、予め湿した（５０ｍＭのトリス／Ｃｌ、ｐＨ７．７で）ニトロセルロース フィルター（２．５ｃｍミリポア、０．４５μＭ）で濾過して、すぐに５ｍｌの 同一の緩衝液ですすいだ。ＲＮＡは、記載した（ターク（Ｔｕｅｒｋ）ら（１９ ９０）前述）ように、４００μｌのフェノール（０．１ＭのＮａｏＡｃ ｐＨ５ ．２で平衡化させた）、新たに調製した２００μｌの７Ｍの尿素でフィルターか ら溶出した。ＲＮＡは２０μｇのｔＲＮＡと共に沈殿させ、ｃＤＮＡ合成の鋳型 として使用し、次にＰＣＲを行い、とインビトロで転写して、次の回のＲＮＡを 調製した。１−８回目に、ＲＮＡを³²Ｐ−ＡＴＰで放射標識して結合がモニター できるようにした。各回のセレックスの時間を早めるために、９−１２回目には ＲＮＡは標識しなかった。ＲＮＡは、非特異的ニトロセルロース結合についての 選択を除外するために、３、４、５、８、１１、および１２回目の前に、ニトロ セルロースフィルター（１．３ｃｍミリポア、０．４５μＭ）で予め濾過した。 大量のＲＮＡのｋＤの変化を推定するため、５、８、および１２回目の後に結 合曲線を描いた。これらの実験は、１．２×１０^-5から２．４×１０^-9Ｍの濃度 のタンパク過剰で、ＲＮＡの最終濃度２×１０^-9Ｍで行った。これらの結合曲線 のためのＲＮＡは、³²Ｐ−ＡＴＰまたは³²Ｐ−ＵＴＰで高い特異的活性が得られ るように標識した。ニトロセルロースフィルターへの結合は、フィルターに結合 したＲＮＡが乾燥し、フィルター上で直接計測される以外は、各回のセレックス について記載したとおりであった。 ＲＮＡ配列決定。１２回目のセレックスに続いて、³²Ｐ５’末端標識した３’ 相補的ＰＣＲプライマーを使用して、ＲＮＡを逆転写酵素（ＡＭＶ、ライフ・サ イエンス社（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．））により配列決定した。 個々のＲＮＡのクローニングと配列決定。１２回目からのＲＮＡはＤＮＡに逆 転写して、ＰＣＲにより増幅した。５’および３’固定領域での制限酵素部位で 消化した物を、３０Ｎ領域を取り出すために使用し、次にこの領域を大腸菌クロ ーニングベクターｐＵＣｌ８の相補部位に連結した。連結したプラスミドＤＮＡ はＪＭ１０３細胞に形質転換して、青／白コロニー形成により選別した。独特の 配列を含有するコロニーを増殖させ、ミニプレップＤＮＡ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ）を調製した。シーケナーゼ・キット・バージョン２．０（Ｓｅｑｕｅｎ ａｓｅ ｋｉｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）と³⁵Ｓ−ｄＡＴＰ（アマーシャム（ Ａｍｅｒｓｈａｍ））を用いて、ジデオキシ配列決定のために、２本鎖プラスミ ドＤＮＡを使用した。 末端標識したＲＮＡ。末端標識のために、Ｔ７ポリメラーゼで転写したＲＮＡ を、ＵＶ遮蔽によりゲル精製した。３７℃で３０分間、アルカリ性ホスファター ゼ１単位で、５’末端を脱リン酸化することにより、ＲＮＡの５’末端を標識し た。フェノール：クロロホルム抽出により、アルカリ性ホスファターゼ活性を破 壊した。次に、３７℃で３０分間ポリヌクレオチドキナーゼとの反応で、ＲＮＡ をγ³²Ｐ−ＡＴＰで末端標識した ＲＮＡを、３７℃で３０分間（５’−³²Ｐ）ｐＣｐとＲＮＡリガーゼを用いて 、３’末端を標識した。５’および３’末端標識したＲＮＡは、８＆の８Ｍの尿 素のポリアクリルアミドゲルで、ゲルバンド精製した。 ５’および３’境界の決定。各々５’または３’境界実験のために３’または ５’末端標識した２ピコモルのＲＮＡを、１０μｌの反応物中の５０ｍＭの Ｎａ₂ＣＯ₃（ｐＨ９．０）と１ｍＭのＥＤＴＡ中で、９０℃で１０分間加水分解 した。１／５容量の３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を添加することにより、反 応を停止させて、−２０℃で凍結した。１×の結合緩衝液と２ピコモルのＲＮＡ を含有する、３つの容量（タンパクの量は一定に保持して、１００μｌ、４００ μｌ、および１６００μｌ）中の３つのタンパク濃度（４０ｎＭ、１０ｎＭおよ び２．５ｎＭ）で、結合反応を行った。反応物は３７℃で１０分間インキュベー トして、予め湿したニトロセルロース膜で濾過し、５ｍｌの洗浄緩衝液ですすい た。フィルターを賽の目に切り、それを２００μｌの７Ｍの尿素と４００μｌの フェノール（ｐＨ８．０）中で、２０℃で１５分間振盪することにより、フィル ターからＲＮＡを溶出した。２００μｌのＨ₂Ｏを添加後、相を分離し、水相を クロロホルムで１回抽出した。ＲＮＡを、１／５容量の３ＭのＮａＯＡｃ、２０ μｇの担体ｔＲＮＡ、および２．５容量のエタノールと共に沈殿させた。このペ レットを７０％のエタノールで１回洗浄し、乾燥させて、５μｌのＨ₂Ｏと５μ ｌのホルムアミド展開色素中に再懸濁した。アルカリ性加水分解反応の残りの物 は、１：１０に希釈して、等容量の展開色素を添加した。配列はしご（ｌａｄｄ ｅｒ）上のどこに境界が存在するかを捜し当てるために、アルカリ性加水分解反 応と結合反応と並行して、リガンドのＲＮａｓｅ Ｔ１消化物を電気泳動した。 この消化を、７Ｍの尿素、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）および １ｍＭのＥＤＴＡ中の５００フェントモルの末端標識したＲＮＡと、１０単位の ＲＮａｓｅ Ｔ１を含有する１０μｌの反応物中で行った。ＲＮＡは、酵素なし で５０℃で１０分間インキュベートして、次に酵素を添加後さらに１０分間イン キュベートした。１０μｌの展開色素を添加し４℃でインキュベートすることに より、この反応を遅くした。消化後すぐに、５μｌの各消化物、加水分解物、お よび３つの結合反応物を、１２％の配列決定ゲルで電気泳動した。 ＵＴＰおよびＣＴＰのＲＮＡの２−ＮＨ₂リボース誘導体のインビトロ転写。 ＡＴＰ、ＧＴＰ、２−ＮＨ₂−ＵＴＰおよび２−ＮＨ₂−ＣＴＰを含有する反応物 中で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｐＵＣ１８プラスミド・ミニプレップ ｄｓＤＮＡ鋳型から、ＲＮＡを直接転写した。³²Ｐ−標識したＲＮＡのために、³² Ｐ−ＡＴＰを反応物中に含めた。ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、およびＣＴＰを含 有する混合物中で、未修飾ＲＮＡを転写した。 ＲＮＡの合成。境界実験（図３０Ｂ）により決定した、トロンビンに対する高 い親和性の結合のために必要なヌクレオチド配列の下限に対応するＲＮＡ分子を 、アプライド・バイオシステムズ３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（Ａｐｐ ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉ ｚｅｒ）で合成した。これらのＲＮＡ分子は、２４ヌクレオチド（２４Ｒ）と３ ９ヌクレオチド（３９Ｒ）のクラスＩのクローン１６ヘアピン構造と、３３ヌク レオチド（３３Ｒ）のクラスIIのクローン２７ヘアピンを含む。 個々のＲＮＡ分子の結合。インビトロ転写のために、独特の３０Ｎ配列を有す る４つのＤＮＡプラスミドを選択した。³²Ｐ−標識したＲＮＡは、従来のヌクレ オチド、ならびにＣＴＰとＵＴＰの２−ＮＨ₂誘導体で転写した。これら個々の ＲＮＡの結合曲線は、結合緩衝液と濃度１．０×１０^-5から１．０×１０^-10Ｍ のトロンビン（１０００単位、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を使用して確立した。ヒ トαトロンビン（エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ、ＥＲＬ（Ｅｎｚｙｍ ｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＥＲＬ）はまた、濃度１． ０×１０^-6から１．０×１０^-10ＭでＲＮＡの結合親和性を測定するために使用 した。ボック（Ｂｏｃｋ）ら（１９９２）（前述）が記載した５’末端標識した １本鎖１５量体ＤＮＡ ５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’（Ｇ１５ Ｄ）（配列ＩＤ番号：１）の結合は、本明細書に記載した結合条件下でＥＲＬト ロンビンで測定して、上述の放射標識したＲＮＡヘアピン構造による結合と比較 した。 競合実験。記載したＲＮＡリガンドがトロンビンに対するＤＮＡ１５量体Ｇ１ ５Ｄの結合に対して競合できるか否かを検出するために、等モル濃度（１μＭ） のトロンビンと５’末端標識したＤＮＡ１５量体Ｇ１５Ｄを、濃度を１０ｎＭか ら１μＭまで変化させた「冷たい」非標識のＲＮＡまたはＤＮＡリガンドの存在 下でおよび非存在下で、フィルター結合条件下（約２００ⁿＭのｋＤ）でインキ ュベートした。競合の非存在下では、ＲＮＡ結合は３０％であった。結合への競 合が起きるように、最後にタンパクを添加した。競合について試験したＲＮＡリ ガンドは、クラスＩのクローン１６合成ＲＮＡ２４量体（２４Ｒ）と３９量体ヘ アピン（３９Ｒ）、およびクラスIIの２７合成ＲＮＡ３３量体（３３Ｒ）であっ た。結果は、冷たい競合物の濃度に対する、結合したＧ１５Ｄの相対分画（競合 物のある時のＧ１５／競合物のない時のＧ１５）として表される。 クラスＩＲＮＡがクラスIIＲＮＡとの結合に競合できるか決定するため、そし てＧ１５Ｄ ＤＮＡとの競合を確認するために、等モル濃度（３００ⁿＭ）のト ロンビンと５’末端標識したクラスIIのＲＮＡ３３ヘアピンを、濃度を１００ⁿ Ｍから３２μＭまで変化させた「冷たい」非標識のＲＮＡ２４またはＤＮＡ Ｇ １５Ｄの存在下または非存在下で、フィルター結合条件下でインキュベートした 。結果は、冷たい競合物の濃度に対する、結合したＲＮＡ３３の相対分画（競合 物のある時のＲＮＡ３３／競合物のない時のＲＮＡ３３）として表される（図３ ３）。 トロンビンの活性の発色測定とＲＮＡリガンドによる阻害。トロンビンによる 発色性基質Ｓ−２２３８（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐニトロアニリン ［Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ］）（カビ・ファルマシア）の加水 分解を、基質からのｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）の放出による４０５ｎｍで光 学的に測定した。 トロンビンを最終濃度１０^-8または１０^-9Ｍになるように、２５０μＭのＳ２２ ３８基質を含有する反応緩衝液（５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、 １５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＰＥＧ）に３７℃で添加した。阻害測定のた めに、トロンビンとＲＮＡ（等モルまたは１０倍過剰で）を、反応混合物に添加 する前に、３７℃で３０秒間プレインキュベートした（図３４Ａ）。 フィブリノーゲン凝固。３７℃で３０ｎＭのＲＮＡクラスＩまたは６０ｎＭの ＲＮＡクラスIIがありまたはなしで、０．２５ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンと １ｕ／λのＲＮＡｓｅ阻害剤（ＲＮＡアシン（ＲＮＡａｓｉｎ）、プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ））を含有する、４００μｌのインキュベーション緩衝液（２ ０ｍＭのトリス−酢酸塩、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ 、１ｍＭのＣａＣｌ₂、１ｍＭのＭｇＣｌ₂）に、トロンビンを最終濃度が２．５ ｎＭになるように添加した。トロンビンの添加から凝固形成までの時間を、傾斜 試験により秒単位で測定した（図３４Ｂ）。 トロンビン結合の特異性。血清タンパクのアンチトロンビンIII（ＡＴIII）と プロトロンビンに対する、全長のクラスＩＲＮＡ１６、クラスIIＲＮＡ２７およ び大量の３０Ｎ３ ＲＮＡの結合親和性を、高親和性のＲＮＡリガンドの進化に 関する上述のとおり、フィルター結合により測定した。これらの実験は、最終Ｒ ＮＡ濃度２×１０^-9Ｍで、濃度１×１０^-5から５×１０^-10Ｍのタンパク過剰で 行った（図３５）。実施例Ｖ：ｂＦＧＦに対する核酸リガンド 。 材料。ｂＦＧＦは、バッケム・カリフォルニア（Ｂａｃｈｅｍ Ｃａｌｉｆｏ ｒｎｉａ）（分子量１８，０００ダルトン、１５４アミノ酸）から入手した。組 織培養等級のヘパリン（平均分子量１６，０００ダルトン）は、シグマ（Ｓｉｇ ｍａ）から購入した。低分子量ヘパリン（５，０００ダルトン）は、カルバイオ ケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から得た。他の全ての化学物質は、少なくとも試 薬等級であって市販のものを購入した。 セレックス。セレックスプロトコールの基本的な特徴は、前述の報告に詳しく 記載されている（タークとゴールド（Ｔｕｅｒｃｋ ＆ Ｇｏｌｄ）（１９９０ ）（前述）；タークら（１９９２ａ）（前述）；タークら（１９９２ｂ）ポリメ ラーゼ・チェーン反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ）（フェレ，Ｆ．、ムリス，Ｋ．、ギブス，Ｒ．およびロス，Ａ．（Ｆｅｒｒｅ ，Ｆ．、Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．、Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．＆ Ｒｏｓｓ，Ａ．）編）バー クハウサー社（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ）、ニューヨーク州）。簡単に述べると、 インビトロの転写のためのＤＮＡの鋳型（これは、定常配列領域に隣接する３０ のランダム位置の領域を含有する）と、対応するＰＣＲプライマーを化学的に合 成した（オペロン）。オリゴヌクレオチド合成中に４つのヌクレオチドの等モル 混合物を使用することにより、ランダム領域を作成した。２つの定常 領域は、ＰＣＲプライマーのアニーリング部位、ｃＤＮＡ合成のためのプライマ ーのアニーリング部位、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域、および ベクターへのクローニングを可能にする制限酵素部位を含有するように設計した （表Ｉ参照のこと）。 ＲＮＡ分子の最初のプールは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングラ ンド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、 約２００ピコモル（ｐｍｏｌ）（１０¹⁴分子）の２本鎖ＤＮＡ鋳型のインビトロ の転写により調製した。転写混合物は、１００−３００ｎＭの鋳型、５単位／μ ｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、１２ｍＭのＭｇＣ₁₂を含有する４０ｍＭのトリ ス−Ｃ１緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのスペルミジン、０． ００２％のトリトンＸ−１００、および４％のＰＥＧよりなる。転写混合物は、 ３７℃で２−３時間インキュベートした。これらの条件により、典型的には１０ から１００倍の転写増幅が得られた。 高い親和性のＲＮＡリガンドのための選択は、５０μｌのリン酸緩衝化食塩水 （ＰＢＳ）（１０．１ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、１．８ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、１３７ｍ ＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）中で、ｂＦＧＦ（１０−１０ ０ｐｍｏｌ）をＲＮＡ（９０−３００ｐｍｏｌ）と共に、３７℃で１０分間イン キュベートし、未結合種からタンパク−ＲＮＡ複合体を、ニトロセルロースフィ ルター分画により分離することにより行った（タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ ＆ Ｇｏｌｄ）（１９９０）前述）。次に選択したＲＮＡ（これは典型的には全 投入ＲＮＡの０．３−８％の量になる）を、フィルターから抽出して、トリ骨髄 芽球増加症ウイルス（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ）逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴ、ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｓ））によりｃＤＮＡに逆転写した。逆転写は、４８℃（３０分間）で５０ｍＭ のトリス緩衝液（ｐＨ８．３）、６０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）₂ 、１０ｍＭのＤＴＴ、および１単位／μｌのＡＭＶ ＲＴ中で行った。標準条 件下でのＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅により、次の回のインビトロ転写のための 充分な量の２本鎖ＤＮＡが得られた。 ニトロセルロースフィルター結合測定。タンパクに結合したオリゴヌクレオチ ドは、ニトロセルロース膜フィルターによる濾過により効果的に、非結合種から 分離される（ヤルスとバーグ（Ｙａｒｕｓ ＆ Ｂｅｒｇ）（１９７０）Ａｎａ ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４５０；ロワリーとウーレンベック（Ｌｏｗａｒｙ ＆ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）（１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．１５：１０４８３；タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ ＆Ｇｏｌｄ）（１９９ ０）（前述）。ニトロセルロースフィルター（ミリポア、０．４５μｍの孔サイ ズ、ＨＡ型）は、フィルターマニホルドに固定して、４−１０ｍｌの緩衝液で洗 浄した。３７℃で０．０１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する緩衝液（ ＰＢＳ）中で、タンパクの逐次希釈物と共に³²Ｐ標識したＲＮＡでインキュベー ト（５−１０分間）した後、溶液を４５μｌずつ低真空下でフィルターに適用し て、５ｍｌのＰＢＳで洗浄した。次にこのフィルターは、赤外ランプの下で乾燥 してシンチレーションカウンターで計測した。 クローニングと配列決定。濃縮したプールの個々のメンバーを、ｐＵＣ１８ベ クターにクローン化して、記載されているように配列決定した（シュナイダー（ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら（１９９２）（前述）；タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ ＆ Ｇｏｌｄ）（１９９０）前述）。 ｂＦＧＦを標的としたセレックス実験。上述の工程に続いて、ランダム化した ＲＮＡの別々のプール（各プールは約１０¹⁴分子からなる）を用いて、ｂＦＧＦ を標的とした２つのセレックス実験（実験ＡおよびＢ）を開始した。ランダム化 領域に隣接する定常配列領域は、対応するプライマーと共に、各実験で異なって いた。使用した２つの鋳型／プライマーの組み合わせは表Ｉに示される。 選択はＰＢＳ中で３７℃で実施した。実験Ｂで実施した選択を、モル比１／１ ００（ヘパリン／ｂＦＧＦ）のヘパリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、分子量５，０ ００−３２，０００ダルトン、平均分子量１６，０００ダルトン）の存在下で、 選択緩衝液中で行った。ヘパリンは、ランダム化したＲＮＡのｂＦＧＦへの結合 とヘパリンの量に競合する。使用したヘパリンの量は、ｂＦＧＦへのＲＮＡの結 合を著しく低下させたが、排除はしなかった（データは示していないし）。ヘパ リンを使用する根拠は、２つあった。第１に、ヘパリンはタンパクの小さな配置 の変化を誘導し、温度変性に対してｂＦＧＦを安定化させることが知られている 。 第２に、ｂＦＧＦに対するランダム化ＲＮＡとのヘパリンの結合の、明らかに競 合する性質が、ヘパリン結合部位についての選択の緊縮性を上昇させるか、また はＲＮＡリガンドの結合を別の部位に向けさせることが期待された。 ｂＦＧＦへのＲＮＡリガンドの親和性の著しい改良は、実験Ａで１０回転後、 実験Ｂで１３回転後に観察された。ＲＮＡリガンドのこれらの濃縮したプールの 配列決定により、ランダム性からの明確な離脱が明らかになり、これはプールに 残る分子の数が実質的に低下したことを示していた。次に濃縮したプールの個々 のメンバーを、ｐＵＣ１８ベクターにクローン化して、前述したように配列決定 した。 実施例Ａから４９クローンを、実施例Ｂから３７クローンを配列決定した。全 部で８６配列の内、７１配列は独特（ｕｎｉｑｕｅ）であった。配列相同性の重 複領域に基づいて、２つの別個のファミリーを同定した（表IIおよびIII）。予 想された（アービン（Ｉｒｖｉｎｅ）ら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２ ２２ ：７３９）ように、２つのファミリーのいずれのメンバーにも明白な相同性 を持たない多くの配列が存在し、これらは表IVに示される。 ファミリー１リガンドからのコンセンサス配列（表II）は、９塩基（ＣＵＡＡ ＣＣＡＧＧ（配列ＩＤ番号：２７））の隣接範囲により定義される。これは、強 くに保存されたＡＡＣＣ配列と隆起した軸を含む、４−５ヌクレオチドループよ りなる最小構造を示唆する（図４１と表VI）。ファミリー２リガンドのコンセン サス配列（表III）は、さらに伸長しており、それほど保存されていない領域、 ＲＲＧＧＨＡＡＣＧＹＷＮＮＧＤＣＡＡＧＮＮＣＡＣＹＹ（配列ＩＤ番号：４３ ）を含有する。ここで、大部分の強く保存された位置は、大きな（１９−２１ヌ クレオチド）ループ内に存在している（図４１と表VII）。ループ内に追加の構 造も可能である。 ＲＮＡの濃縮プールの２つの別個の配列ファミリーの存在は、ｂＦＧＦへの高 い親和性の結合のための２つの収束性の溶液があることを示唆する。セレックス 実験Ａは、メンバーを両方の配列に関係づけた（表II）。一方、セレックス実験 Ｂからの全ての配列（ヘパリンの存在下で選択された）は、ファミリー２（表II I）か「その他の配列」ファミリー（表IV）に属するが、ファミリー１には見い 出されなかった。これは、選択の間ｂＦＧＦがヘパリンの１００倍のモル量過剰 で存在したという事実から見て驚くべきことである。しかし、ヘパリンに対する ｂＦＧＦの有効モル過剰量は、おそらくはるかに小さかった。選択に使用したヘ パリンの平均分子量は１６，０００ダルトンであった。各糖単位は３２０ダルト ンの重さであり、少なくとも８糖単位がｂＦＧＦへの高い親和性の結合に必要で あるため、平均６分子のｂＦＧＦがヘパリン分子に結合できる。このことはｂＦ ＧＦに対するヘパリンの比を１：１６に低下させる。実際、この量のヘパリンは 、ｂＦＧＦに対する未選択のＲＮＡプールの観察された親和性を、５倍低下させ るのに十分である（データは示していない）。選択緩衝液中の相対的に少量のヘ パリンの存在による、観察された全リガンドファミリーの排除は、ヘパリンによ り誘導されたタンパクの配置の変化の結果であろう。選択に使用したヘパリンと ｂＦＧＦの相対量のため、このモデルは、タンパク−ヘパリン複合体が解離した 後もヘパリンが誘導した配置が存続し、この配置の寿命はＲＮＡリガンドと平衡 化できるに足る長さであることを必要とする。 ファミリー２配列は、両方のセレックス実験から誘導したクローンからなる。 これは、隣接する定常領域が典型的には、これらのリガンドの親和性を測定する 時に相対的に重要でない役割を演じていることを示唆し、このファミリーのコン センサス配列がｂＦＧＦへの高い親和性結合の主要な決定基であるという前提を 支持する。ｂＦＧＦに対する結合親和性の測定 。 平衡解離定数。最も単純な場合に、ｂＦＧＦへのＲＮＡの平衡結合は、方程式 １により記述される： ＲＮＡ・ｂＦＧＦ ⇔ ＲＮＡ ＋ ｂＦＧＦ （１） 結合したＲＮＡの分画（ｑ）は、遊離タンパクの濃度［Ｐ］に比例する（方程式 ２）： ｑ ＝ ｆ［Ｐ］／（［Ｐ］ ＋ Ｋｄ） （２） ここでＫｄは平衡解離定数であり、ｆはニトロセルロースフィルター上のタンパ ク−ＲＮＡ複合体の保持の効率を反映する。ｂＦＧＦについてｆの平均値は０． ８２であった。 より高次の構造を除外するために、タンパクとのインキュベーションの前に全 てのＲＮＡ溶液はＰＢＳ中で９０℃で２−３分間加熱して氷上で冷却した。この 処理の後、全てのＲＮＡクローンの唯一の単一バンドが、非変性ポリアクリルア ミドゲル上で検出された。 ｂＦＧＦに対する個々のリガンドの相対結合親和性は、配列情報から予測でき ない。従って、４および４０ｎＭのタンパクとのインキュベーション後に、ニト ロセルロースフィルターに結合した放射標識したＲＮＡの分画を測定することに より、ｂＦＧＦに結合する能力について独特の配列クローンが選別した。このス クリーニング法は、ナノモル範囲の解離定数を有する少数のクローンを同定でき るほど、十分に正確であった。次にこれらの選択クローンの結合をさらに詳細に 分析した。 ｂＦＧＦに対する高親和性のＲＮＡリガンドは、両方の配列ファミリーに見い 出された（表VIおよびVII）。どちらのファミリーにも属さなかったクローンの 親和性は一般的に低かった（データは示していない）。 元々の未選択のＲＮＡプールは、３００ｎＭ（セットＡ）および５６０ｎＭ（ セットＢ）の親和性でｂＦＧＦに結合した（図３６）。従ってセレックスは、ｂ ＦＧＦに対する少なくとも２桁高い親和性を有するリガンドの単離を可能にした 。 特異性の問題に取り組むために、ｂＦＧＦに対する高親和性のリガンドの代表 的なセット（ファミリー１から５Ａと７Ａ；ファミリー２から１２Ａと２６Ａ） を、他の４つのヘパリン結合タンパクへの結合について試験した。酸性ＦＧＦ、 トロンビン、アンチトロンビンIII、および血管内皮増殖因子に対する、これら のリガンドの親和性は比較的弱い（Ｋｄ＞０．３μＭ）（データは示していない ）ことが見い出された。 ｂＦＧＦリセプター結合のＲＮＡリガンド阻害。同一の４つの高い親和性のＲ ＮＡリガンドを、ｂＦＧＦの低いおよび高い親和性の細胞表面リセプターへの結 合を阻害する能力についても試験した。 リセプター結合の検討。ｂＦＧＦを、モスカテリ（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ）（ １９８７）（前述）が記載したヨウド−ゲン（Ｉｏｄｏ−Ｇｅｎ）（ピアース （Ｐｉｅｒｃｅ）方法により¹²⁵Ｉで標識した。コンフルエントなベビー・ハム スター腎（ＢＨＫ）細胞を大量のＰＢＳで洗浄して、次にＰＢＳ中の１０ｎｍ／ ｍｌの¹²⁵Ｉ−ｂＦＧＦ、０．１％ＨＳＡ、１単位／ｍｌのＲＮアセイン（ＲＮ ａｓｅｉｎ）、および高い親和性のＲＮＡの逐次希釈物を含有するαＭＥＭ培地 と共に、４℃で２時間インキュベートした。別の実験で、この条件下ではＲＮＡ は有意に分解していないことが確立された。低および高親和性のリセプター部位 に結合した¹²⁵Ｉ−ｂＦＧＦの量は、モスカテリ（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ）（１ ９８７）（前述）が記載したように測定した。 ４つ全てのリガンドは低親和性のリセプター部位に競合したが、一方未選択の （ランダム）ＲＮＡは競合しなかった（図３７Ａ）。低親和性のリセプターから ｂＦＧＦの半分の置換を起こすのに要するＲＮＡの濃度は、リガンド５Ａ、７Ａ および２６Ａについては５−２０ｎＭであり、リガンド１２Ａについては＞１０ ０ｎＭであった。高親和性部位からの半分の置換は、リガンド５Ａ、７Ａおよび ２６Ａについては１μＭ近いＲＮＡの濃度であり、リガンド１２Ａについては＞ １μＭで観察された。また、ランダムＲＮＡは高親和性のリセプターとも競合し なかった。低および高親和性のリセプターからｂＦＧＦを置換するのに要するＲ ＮＡの濃度の観察された差は、ｂＦＧＦに対する２つのリセプタークラスの親和 性の差（低親和性部位については２−１０ｎＭで、高親和性部位については１０ −１００ｐＭ）の反映と予想される。 ヘパリンは、両方の配列ファミリーからのＲＮＡリガンドを競合的に置換した （図３８）が、ｂＦＧＦからファミリー２のメンバーを置換するには、より高濃 度のヘパリンを必要とした。 セレックス方法により得られる選択的な利点は、ｂＦＧＦへの親和性に基づく 。ＲＮＡリガンドは、原則としてタンパクの任意の部位に結合でき、従って適切 な機能測定でリガンドの活性を試験することが重要である。選択した高親和性の リガンドについての適切な機能実験は、細胞表面リセプターへのｂＦＧＦの結合 を阻害する能力の試験である、というのはｂＦＧＦはこうしてその生物活性を発 揮するためである。いくつかの代表的な高親和性のＲＮＡリガンドが、ｂＦＧＦ の両方のリセプタークラス（相対的結合親和性による）への結合を阻害したとい う 事実は、これらのリガンドがリセプター結合部位でまたはその近傍で結合するこ とを示唆する。さらにヘパリンがこれらのリガンドのｂＦＧＦへの結合に対して 競合するという観察からも、この概念は支持される。ファミリー１とファミリー ２からの高親和性のリガンドは、ｂＦＧＦ上の異なる部位に結合する。本発明は 、２つのリガンドのファミリーからの成分を共有結合させて、ｂＦＧＦの単一の より強力な阻害剤にすることも含む。 配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人：ラリー・ゴールド（Ｌａｒｒｙ Ｇｏｌｄ） クレイグ・ターク（Ｃｒａｉｇ Ｔｕｅｒｋ） ダイアン・タセット（Ｄｉａｎｅ Ｔａｓｓｅｔ） ネボジャ・ジャンジク（Ｎｅｂｏｊｓａ Ｊａｎｊｉｃ） （ｉｉ）発明の名称：核酸リガンドとその製造方法 （ｉｉｉ）配列の数：１５９ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）名宛人：ビートンとスワンソン特許事務所（Ｂｅａｔｏｎ ＆ Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｐ．Ｃ．） （Ｂ）通り：４５３２ サウス アルスター ストリート パークウェイ、 スイート４０３号（４５３２ Ｓｏｕｔｈ Ｕｌｓｔｅｒ Ｓｔｒｅｅｔ Ｐａｒｋｗａｙ，Ｓｕｉｔｅ ＃４０３） （Ｃ）市：デンバー （Ｄ）州：コロラド （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：８０２３７ （ｖ）コンピューターで読める形式： （Ａ）媒体型：ディスケット、３．５０インチ、記憶容量８００キロバイト （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ （Ｃ）オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト ５．１ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）前出願データ： （Ａ）出願番号：０７／７１４，１３１号 （Ｂ）出願日：１９９１年６月１０日 （ｖｉｉ）前出願データ： （Ａ）出願番号：０７／５３６，４２８号 （Ｂ）出願日：１９９０年６月１１日 （ｖｉｉ）前出願データ： （Ａ）出願番号：０８／０６１，６９１号 （Ｂ）出願日：１９９３年４月２２日 （ｖｉｉ）前出願データ： （Ａ）出願番号：０７／９７３，３３３号 （Ｂ）出願日：１９９２年１１月６日 （ｖｉｉ）前出願データ： （Ａ）出願番号：０７／９６４，６２４号 （Ｂ）出願日：１９９２年１０月２１日 （ｖｉｉ）前出願データ： （Ａ）出願番号：０７／９５３，６９４号 （Ｂ）出願日：１９９２年９月２９日 （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：バリー・Ｊ・スワンソン（Ｂａｒｒｙ Ｊ．Ｓｗａｎｓｏｎ） （Ｂ）登録番号：３３，２１５ （Ｃ）照会／整理番号：ＮＥＸ０３／ＰＣＴ （ｉｘ）電話回線情報： （Ａ）電話番号：（３０３）８５０−９９００ （Ｂ）ファックス番号：（３０３）８５０−９４０１ （２）配列ＩＤ番号：１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１ （３）配列ＩＤ番号：２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２ （４）配列ＩＤ番号：３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３ （５）配列ＩＤ番号：４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：４ （６）配列ＩＤ番号：５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５ （７）配列ＩＤ番号：６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６ （８）配列ＩＤ番号：７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７ （９）配列ＩＤ番号：８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８ （１０）配列ＩＤ番号：９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：９ （１１）配列ＩＤ番号：１０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１２）配列ＩＤ番号：１１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１１ （１３）配列ＩＤ番号：１２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１２ （１４）配列ＩＤ番号：１３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１３ （１５）配列ＩＤ番号：１４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１４ （１６）配列ＩＤ番号：１５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５ （１７）配列ＩＤ番号：１６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１６ （１８）配列ＩＤ番号：１７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１７ （１９）配列ＩＤ番号：１８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１８ （２０）配列ＩＤ番号：１９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１９ （２１）配列ＩＤ番号：２０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２０ （２２）配列ＩＤ番号：２１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２１ （２３）配列ＩＤ番号：２２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２２ （２４）配列ＩＤ番号：２３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２３ （２５）配列ＩＤ番号：２４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２４ （２６）配列ＩＤ番号：２５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２５ （２７）配列ＩＤ番号：２６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２６ （２８）配列ＩＤ番号：２７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２７ （２９）配列ＩＤ番号：２８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２８ （３０）配列ＩＤ番号：２９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２９ （３１）配列ＩＤ番号：３０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３０ （３２）配列ＩＤ番号：３１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３１ （３３）配列ＩＤ番号：３２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３２ （３４）配列ＩＤ番号：３３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３３ （３５）配列ＩＤ番号：３４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３４ （３６）配列ＩＤ番号：３５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３５ （３７）配列ＩＤ番号：３６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３６ （３８）配列ＩＤ番号：３７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３７ （３９）配列ＩＤ番号：３８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３８ （４０）配列ＩＤ番号：３９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３９ 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（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５０ （５２）配列ＩＤ番号：５１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５１ （５３）配列ＩＤ番号：５２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５２ （５４）配列ＩＤ番号：５３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５３ （５５）配列ＩＤ番号：５４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５４ （５６）配列ＩＤ番号：５５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５５ （５７）配列ＩＤ番号：５６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５６ （５８）配列ＩＤ番号：５７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５７ （５９）配列ＩＤ番号：５８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５８ （６０）配列ＩＤ番号：５９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５９ （６１）配列ＩＤ番号：６０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６０ （６２）配列ＩＤ番号：６１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６１ （６３）配列ＩＤ番号：６２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６２ （６４）配列ＩＤ番号：６３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６３ （６５）配列ＩＤ番号：６４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６４ （６６）配列ＩＤ番号：６５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６５ （６７）配列ＩＤ番号：６６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６６ （６８）配列ＩＤ番号：６７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６７ （６９）配列ＩＤ番号：６８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６８ （７０）配列ＩＤ番号：６９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６９ （７１）配列ＩＤ番号：７０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７０ （７２）配列ＩＤ番号：７１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７１ （７３）配列ＩＤ番号：７２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７２ （７４）配列ＩＤ番号：７３の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７３ （７５）配列ＩＤ番号：７４の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７４ （７６）配列ＩＤ番号：７５の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７５ （７７）配列ＩＤ番号：７６の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７６ （７８）配列ＩＤ番号：７７の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７７ （７９）配列ＩＤ番号：７８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７８ （８０）配列ＩＤ番号：７９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７９ （８１）配列ＩＤ番号：８０の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８０ （８２）配列ＩＤ番号：８１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８１ （８３）配列ＩＤ番号：８２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８２ （８４）配列ＩＤ番号：８３の情報： （ｉ）配列の特徴： 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（Ａ）長さ：７９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５７ （１５９）配列ＩＤ番号：１５８の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５８ （１６０）配列ＩＤ番号：１５９の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５９

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０７／９７３，３３３ (32)優先日 1992年11月６日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／０６１，６９１ (32)優先日 1993年４月22日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者 タセット，ダイアン アメリカ合衆国 80301 コロラド州ボウ ルダー，ナンバー 36，カルミア アベニ ュ 2954 (72)発明者 ジャンジク，ネボジサ アメリカ合衆国 80026 コロラド州ラフ ァイエット，ロンドン アベニュー 539

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸の候補混合物から、ある標的のリガンドである、改良された核酸リガ ンドを製造する方法であって、 ａ）候補混合物を標的に接触させ、ここで、候補混合物に比較して標的に対する 増大した親和性を有する核酸は候補混合物の残りの物から分画されてもよく； ｂ）親和性の増大した核酸を候補混合物の残りのものから分画し； ｃ）親和性の増大した核酸を増幅して、核酸のリガンド濃縮混合物を得； ｄ）必要であれば工程ａ）−ｃ）を繰り返して核酸リガンドを同定し； ｅ）該標的に結合するために必須である核酸リガンドの核酸残基を測定し；そし て ｆ）該測定に基づく該改良された核酸リガンドを製造することを含んでなる、上 記方法。 ２．測定は、 ａ）単一の残基の置換を除いて核酸リガンドと同一である修飾核酸を調製し；そ して ｂ）核酸リガンドに比較して修飾核酸リガンドの結合親和性を評価することを含 む、請求項１に記載の方法。 ３．測定は、 ａ）１つまたはそれ以上の末端残基の欠如を除いて核酸リガンドと同一である修 飾核酸を調製し；そして ｂ）核酸リガンドに比較して修飾核酸の結合親和性を評価することを含む、請求 項１に記載の方法。 ４．測定は、 ａ）核酸リガンドを化学的に修飾することにより修飾核酸を調製し；そして ｂ）核酸リガンドに比較して修飾核酸の結合親和性を評価することを含む、請求 頃１に記載の方法。 ５．測定は、 ａ）該標的の存在下で該核酸リガンドを化学的に修飾し；そして ｂ）どの核酸残基が修飾されていないかを測定することを含む、請求項１に記載 の方法。 ６．核酸の候補混合物から、ある標的のリガンドである、改良された核酸リガ ンドを製造する方法であって、 ａ）候補混合物を標的に接触させ、ここで候補混合物に比較して標的に対する増 大した親和性を有する核酸は候補混合物の残りのものから分画されてもよく； ｂ）親和性の増大した核酸を候補混合物の残りのものから分画し； ｃ）親和性の増大した核酸を増幅して、核酸のリガンド濃縮混合物を得； ｄ）必要であれば工程ａ）−ｃ）を繰り返して該核酸リガンドを同定し； ｅ）該核酸リガンドの３次元構造を測定し；そして ｆ）該測定に基づく該改良された核酸リガンドを製造することを含んでなる、上 記方法。 ７．測定は、 ａ）核酸リガンドを変性し； ｂ）変性および非変性核酸リガンドを化学的に修飾し；そして ｃ）非変性核酸リガンド中では修飾されない、どの核酸残基が変性核酸リガンド 中で修飾されるかを測定することを含む、請求項６に記載の方法。 ８．測定は、 ａ）該核酸リガンドに共分散分析を実施することを含む、請求項６に記載の方法 。 ９．複数の核酸リガンドから、ある標的に対する改良された核酸リガンドを製 造する方法であって、 ａ）該標的に結合するのに必須である該核酸リガンドの核酸残基を測定し；そし て ｂ）該核酸リガンドの３次元構造を測定することを含んでなる、上記方法。 １０．核酸の候補混合物から、ある標的のリガンドである、伸長された核酸リ ガンドを同定する方法であって、 ａ）候補混合物を標的に接触させ、ここで候補混合物に比較して標的に対する増 大した親和性を有する核酸は候補混合物の残りのものから分画される； ｂ）親和性の増大した核酸を候補混合物の残りのものから分画してもよく； ｃ）親和性の増大した核酸を増幅して、核酸のリガンド濃縮混合物を得； ｄ）必要であれば工程ａ）−ｃ）を繰り返して該核酸リガンドを同定し； ｅ）固定領域とランダム化領域を有する核酸よりなる２次候補混合物を作成し、 ここで該固定領域は上記ｄ）で同定された該核酸リガンドに対応する； ｆ）２次候補混合物を標的に接触させ、ここで候補混合物に比較して標的に対す る増大した親和性を有する核酸は候補混合物の残りのものから分画されてもよく ； ｇ）親和性の増大した核酸を増幅して、核酸のリガンド濃縮混合物を得；そして ｈ）必要であれば工程ｅ）−ｇ）を繰り返して該核酸リガンドを同定することを 含んでなる、上記方法。 １１．ＨＩＶ−ＲＴタンパクに対する天然には存在しない核酸リガンド。 １２．請求項１に記載の方法により製造される、請求項１１に記載の核酸リガ ンド。 １３．請求項１２に記載の核酸リガンドであって、 ｄ）必要であれば工程ａ）−ｃ）を繰り返して該核酸リガンドを同定し； ｅ）該ＨＩＶ−ＲＴに結合するのに必須である核酸リガンドの核酸残基を測定し ；そして ｆ）該測定に基づく該改良された核酸リガンドを製造する、追加の工程を含む、 上記リガンド。 １４．請求項２に記載の方法により製造される、請求項１１に記載の核酸リガ ンド。 １５．請求項３に記載の方法により製造される、請求項１１に記載の核酸リガ ンド。 １６．請求項４に記載の方法により製造される、請求項１１に記載の核酸リガ ンド。 １７．請求項５に記載の方法により製造される、請求項１１に記載の核酸リガ ンド。 １８．配列： （配列中、Ｘ−Ｘ’は好ましい塩基対を示す）を有する、請求項１１に記載の核 酸リガンド。 １９．配列： （配列中、Ｘ−Ｘ’は好ましい塩基対を示す）と実質的に相同であって、ＨＩＶ −ＲＴに結合する実質的に同一の能力を有する配列を有する、請求項１１に記載 の核酸リガンド。 ２０．請求項１０に記載の方法により同定される、請求項１１に記載の核酸。 ２１．配列： （配列中、Ｚは図９（配列ＩＤ番号：１１５−１３５）［１０］に示される配列 よりなる群から選択される）を有する、請求項２０に記載の核酸リガンド。 ２２．配列： （配列中、Ｚは図９（配列ＩＤ番号：１１５−１３５）に示される配列よりなる 群から選択される）と実質的に相同であって、ＨＩＶ−ＲＴに結合する実質的に 同一の能力を有する配列を有する、請求項２０に記載の核酸リガンド。 ２３．Ｚは、各々図９（配列ＩＤ番号：１１５−１３５）に示される伸長モチ ーフＩおよび伸長モチーフIIよりなる群から選択される、請求項２１に記載の核 酸リガンド。 ２４．Ｚは、各々図９（配列ＩＤ番号：１１５−１３５）に示される伸長モチ ーフＩおよび伸長モチーフIIよりなる群から選択される、請求項２２に記載の核 酸リガンド。 ２５．ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクの、天然には存在しない核酸リガンド。 ２６．請求項１に記載の方法により製造される、請求項２５に記載の核酸リガ ンド。 ２７．請求項２に記載の方法により製造される、請求項２５に記載の核酸リガ ンド。 ２８．請求項３に記載の方法により製造される、請求項２５に記載の核酸リガ ンド。 ２９．請求項４に記載の方法により製造される、請求項２５に記載の核酸リガ ンド。 ３０．請求項５に記載の方法により製造される、請求項２５に記載の核酸リガ ンド。 ３１．配列： を有する、請求項２５に記載の核酸リガンド。 ３２．配列： と実質的に相同であって、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖタンパクに結合する実質的に同一 の能力を有する配列を有する、請求項２５に記載の核酸リガンド。 ３３．ある標的に対する改良されたリガンドを製造する方法であって、 （ａ）核酸の候補混合物を調製し； （ｂ）候補混合物を標的に接触させ、ここで候補混合物に比較して標的に対する 増大した親和性を有する核酸は候補混合物の残りのものから分画されてもよく； （ｃ）親和性の増大した核酸を候補混合物の残りのものから分画し； （ｄ）親和性の増大した核酸を増幅して、核酸のリガンド濃縮混合物を得； （ｅ）必要であれば工程（ｂ）−（ｄ）を繰り返して該核酸リガンドを同定し； （ｆ）該標的に結合するのに必須である核酸リガンドの核酸残基を測定し； （ｇ）該核酸リガンドの３次元構造を測定し；そして （ｈ）該測定に基づく該改良されたリガンドを設計することを含んでなる、上記 方法。 ３４．ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパクに対する核酸リガンドを同定する方法であ って、 ａ）核酸の候補混合物を調製し、 ｂ）該タンパクへの親和性に基づき該候補混合物のメンバーを分画し；そして ｃ）該タンパクに比較的高い親和性を有する候補混合物から選択される分子を増 幅して、タンパクに対して比較的高い親和性を有する配列が濃縮された核酸の混 合物を得ることを含んでなる、上記方法。 ３５．ｄ）工程ｂ）およびｃ）をさらに繰り返すことを含む、請求項３４に記 載の方法。 ３６．核酸の該候補混合物は１本鎖核酸よりなる、請求項３４に記載の方法。 ３７．該候補混合物はＲＮＡよりなる、請求項３６に記載の方法。 ３８．請求項３４に記載の方法により同定される、ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパ クに対する核酸リガンド。 ３９．１本鎖核酸である、請求項３８に記載の核酸リガンド。 ４０．１本鎖ＲＮＡ配列である、請求項３８に記載の核酸リガンド。 ４１．ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパクに対する、精製され単離された、天然には 存在しない核酸リガンド。 ４２．該リガンドは図２６に示される配列よりなる群から選択される、請求項 ４１に記載の核酸リガンド。 ４３．リガンドは、図２６に示される配列よりなる群から選択されるリガンド と、実質的に相同であって、ｔａｔタンパクに結合する実質的に同一の能力を有 する、請求項４１に記載の核酸リガンド。 ４４．リガンドは、図２７に示されるモチーフＩ、モチーフIIおよびモチーフ IIIよりなる群から選択される、請求項４１に記載の核酸リガンド。 ４５．リガンドは、図２７に示されるモチーフＩ、モチーフIIおよびモチーフ IIIよりなる群から選択されるリガンドと、実質的に相同であって、ｔａｔタン パクに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項４１に記載の核酸リガンド 。 ４６．リガンドは、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置 で化学的に修飾されている、請求項４１に記載の核酸リガンド。 ４７．リガンドは、図２６に示される配列よりなる群から選択されるリガンド と、実質的に同一構造を有し、ｔａｔタンパクに結合する実質的に同一の能力を 有する、請求項４１に記載の核酸リガンド。 ４８．リガンドは、図２７に示されるモチーフＩ、モチーフIIおよびモチーフ IIIよりなる群から選択されるリガンドと、実質的に同一の構造を有し、ｔａｔ タンパクに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項４１に記載の核酸リガ ンド。 ４９．トロンビンに対する核酸リガンドを同定する方法であって、 ａ）ＲＮＡ核酸の候補混合物を調製し； ｂ）候補混合物をトロンビンに接触させ、ここでトロンビンに対する増大した親 和性を有する核酸は候補混合物の残りのものから分画されるてもよく； ｃ）トロンビンへの親和性に基づき該候補混合物のメンバーを分画し；そして ｄ）トロンビンに比較的高い親和性を有する候補混合物から選択される分子を増 幅して、そのタンパクに対して比較的高い親和性を有する配列が濃縮された核酸 の混合物を得ることを含んでなる、上記方法。 ５０．ｅ）工程ｂ）、ｃ）およびｄ）を繰り返すことをさらに含む、請求項４ ９に記載の方法。 ５１．ＲＮＡ核酸の候補混合物は１本鎖核酸よりなる、請求項４９に記載の方 法。 ５２．請求項４９に記載の方法により同定されるトロンビンに対するＲＮＡ核 酸リガンド。 ５３．１本鎖核酸である、請求項５２に記載の核酸リガンド。 ５４．精製され単離された天然には存在しない、トロンビンに対するＲＮＡリ ガンド。 ５５．リガンドは、図２９（配列ＩＤ番号：１３７−１５４）に示される配列 よりなる群から選択される、請求項５４に記載のＲＮＡリガンド。 ５６．リガンドは、図２９（配列ＩＤ番号：１３７−１５４）に示される配列 よりなる群から選択されるリガンドと実質的に相同であって、トロンビンに結合 する実質的に同一の能力を有する、請求項５４に記載のＲＮＡリガンド。 ５７．リガンドは、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置 で化学的に修飾されている、請求項５４に記載のＲＮＡリガンド。 ５８．リガンドは、図２９（配列ＩＤ番号：１３７−１５４）に示される配列 と、実質的に同一の構造を有し、トロンビンに結合する実質的に同一の能力を有 する、請求項５４に記載のＲＮＡリガンド。 ５９．ＲＮＡ配列（配列ＩＤ番号：９）： ５’−ＧＧＡＵＣＧＡＡＧ（Ｎ） ₂ＡＧＵＡＧＧＣ−３’ よりなる、請求項５４に記載のＲＮＡリガンド。 ６０．ＲＮＡ配列（配列ＩＤ番号：１０）： ５’−ＧＣＧＧＣＵＵＵＧＧＧＣＧＣＣＧＵＧＣＵＵ−３’ よりなる、請求項６に記載のＲＮＡリガンド。 ６１．リガンドは、請求項５９に記載のリガンドと、実質的に相同であって、 トロンビンに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項５４に記載のＲＮＡ リガンド。 ６２．リガンドは、請求項５９に記載のリガンドと実質的に同一の構造を有し 、トロンビンに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項５４に記載のＲＮ Ａリガンド。 ６３．リガンドは、請求項６０に記載のリガンドと実質的に相同であって、ト ロンビンに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項５４に記載のＲＮＡリ ガンド。 ６４．リガンドは、請求項６０に記載のリガンドと実質的に同一の構造を有し 、トロンビンに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項５４に記載のＲＮ Ａリガンド。 ６５．請求項４９に記載の方法により調製される、請求項５４に記載のＲＮＡ リガンド。 ６６．塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に対する核酸リガンドを同定す る方法であって、 ａ）ＲＮＡ核酸の候補混合物を調製し； ｂ）候補混合物をｂＦＧＦに接触させ、ここでｂＦＧＦに対する増大した親和性 を有する核酸は候補混合物の残りのものから分画されてもよく； ｃ）ｂＦＧＦへの親和性に基づき該候補混合物のメンバーを分画し；そして ｄ）ｂＦＧＦに比較的高い親和性を有する候補混合物から選択される分子を増幅 して、ｂＦＧＦに対して比較的高い親和性を有する配列が濃縮された核酸の混合 物を得ることを含んでなる、上記方法。 ６７．ｅ）工程ｂ）、ｃ）およびｄ）を繰り返すことをさらに含む、請求項６ ６に記載の方法。 ６８．ＲＮＡ核酸の候補混合物は１本鎖核酸よりなる、請求項６６に記載の方 法。 ６９．請求項６６に記載の方法により同定されたｂＦＧＦに対するＲＮＡ核酸 リガンド。 ７０．１本鎖核酸である、請求項６９に記載の核酸リガンド。 ７１．精製され単離された天然には存在しない、ｂＦＧＦに対するＲＮＡリガ ンド。 ７２．リガンドは、表IIおよびIII（配列ＩＤ番号：２８−６７）に示される 配列よりなる群から選択される、請求項７１に記載のＲＮＡリガンド。 ７３．リガンドは、表IIおよびIII（配列ＩＤ番号：２８−６７）に示される 配列よりなる群から選択されるリガンドと、実質的に相同であって、ｂＦＧＦに 結合する実質的に同一の能力を有する、請求項７１に記載のＲＮＡリガンド。 ７４．リガンドはリボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置で 化学的に修飾されている、請求項７１に記載のＲＮＡリガンド。 ７５．リガンドは、表II、IIIおよびIV（配列ＩＤ番号：２８−８９）に示さ れる配列と、実質的に同一の構造を有し、ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能 力を有する、請求項７１に記載のＲＮＡリガンド。 ７６．ＲＮＡ配列（配列ＩＤ番号：２７）： ５’−ＣＵＡＡＣＣＮＧＧ−３’ よりなる、請求項７１に記載のＲＮＡリガンド。 ７７．ＲＮＡ配列（配列ＩＤ番号：４３）： ５’−ＲＲＧＧＨＡＡＣＧＹＷＮＮＧＤＣＡＡＧＮＮＣＡＣＹＹ−３’ よりなる、請求項７１に記載のＲＮＡリガンド。 ７８．リガンドは、請求項７６に記載のリガンドと、実質的に相同であって、 ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項７１に記載のＲＮＡリ ガンド。 ７９．リガンドは、請求項７６に記載のリガンドと、実質的に同一の構造を有 し、ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項７１に記載のＲＮ Ａリガンド。 ８０．リガンドは、請求項７７に記載のリガンドと、実質的に相同であって、 ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項７１に記載のＲＮＡリ ガンド。 ８１．リガンドは、請求項７７に記載のリガンドと、実質的に同一の構造を有 し、ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項７１に記載のＲＮ Ａリガンド。 ８２．リガンドは、ｂＦＧＦの阻害剤である、請求項７１に記載のＲＮＡリガ ンド。 ８３．リガンドは、表II（配列ＩＤ番号：２７−４２）に示される配列よりな る群から選択される、請求項７１に記載のＲＮＡリガンド。