JP2004097232A - 核酸リガンドおよびその製造方法 - Google Patents

核酸リガンドおよびその製造方法 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、セレックス方法に基づく改良された核酸リガンドの同定および製造のための方法を含む。ＨＩＶ−ＲＴ、ＨＩＶ−１　Ｒｅｖ、ＨＩＶ−１　ｔａｔ、トロンビン、および塩基性繊維芽細胞増殖因子タンパクに対する核酸リガンドも含まれる。
【解決手段】トロンビンに対する核酸リガンドを同定する方法であって、
ａ）ＲＮＡ核酸の候補混合物を調製し；
ｂ）候補混合物をトロンビンに接触させ、ここでトロンビンに対する増大した親和性を有する核酸は候補混合物の残りのものから分画されてもよく；
ｃ）トロンビンへの親和性に基づき該候補混合物のメンバーを分画し；そして
ｄ）トロンビンに比較的高い親和性を有する候補混合物から選択される分子を増幅して、そのタンパクに対して比較的高い親和性を有する配列が濃縮された核酸の混合物を得ることを含んでなる、上記方法。
【選択図】なし

Description

　本発明に記載されるのは、核酸リガンドを同定および製造するための方法である。核酸リガンドとは、目的の標的分子に特異的に結合する２本鎖または１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ種である。この核酸リガンドの同定は、「指数的濃縮のためのリガンドの系統的進化」（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｆｏｒ　ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）の頭字語である、セレックス（ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法に基づく。
　本発明の方法は、選択された標的に対して改良された核酸リガンドを創製するために、セレックス法から得た情報を分析、応用することよりなる。これらの方法は、コンピューターモデル化、境界測定方法および化学修飾方法を含む。本発明の方法によれば、１）選択された標的への結合に関して、核酸リガンドのどの核酸残基が決定的であるか；２）どの核酸残基が核酸リガンドの構造に影響を及ぼすか；および３）核酸リガンドの３次元構造はどうなっているか、を決めることが可能である。この情報により、構造安定性が向上していると共に標的への結合能力が優れた、改良された核酸リガンドの同定と製造が可能になる。本情報はまた、標的へのリガンドとしても機能する非核酸またはハイブリッド核酸種を製造するために使用することもできる。本発明の方法はさらに、治療方法および／または診断方法の調製に使用される標的種の分析を可能にする。
　具体的には本発明において、ＨＩＶ−ＲＴ、ＨＩＶ−１　Ｒｅｖ、ＨＩＶ−１　ｔａｔ、トロンビン、および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）タンパクに対する、高親和性核酸リガンドが記載される。本発明で同定される核酸リガンドにより特徴付けられる修飾核酸リガンドと模倣リガンドも、本発明の範囲に含まれる。さらに、標的分子の生物活性を修飾することができる核酸リガンド（例えばｂＦＧＦの作用を阻害する核酸リガンド）も、本発明の範囲に含まれる。またさらに、修飾ヌクレオチドを含有する核酸リガンドも本発明に含まれる。
　多くのタンパクまたは低分子は、核酸に特異的に結合することは知られていない。例外である公知のタンパクは、核酸中にコードされている遺伝情報の細胞構造への転移と遺伝物質の複製を引き起こすために生細胞中で機能する、リプレッサー、ポリメラーゼ、アクチベーターなどの制御タンパクである。さらには、ＧＴＰのような低分子は幾つかのイントロンＲＮＡに結合する。
　生物は核酸の機能を、主として情報提供の役割に限定して進化してきた。クリック（Ｃｒｉｃｋ）により提案されたセントラルドグマは、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）は元々の形でも拡大された形でも、鋳型の核酸中の情報を「読み」、そして相補核酸を産生する複製過程を通して、他の核酸の合成のための鋳型として作用することができることを提唱している。遺伝学と遺伝子発現の全ての実験例は、核酸のこれらの性質に依存している：本質的に、塩基対という化学概念のため、そして複製過程は比較的誤りのない方法でその塩基対形成を使用できるため、２本鎖核酸の情報は重複が多い。
　タンパクの個々の成分である２０個の天然アミノ酸は、極めて広範囲の結合活性や触媒活性を提供するのに十分な、化学的相違と活性を有する。しかし核酸は、ウイルスからウイルス、細胞から細胞、および生物から生物へ遺伝情報を伝える遺伝的役割を有する以外は、タンパクに比べてその化学的可能性は狭いと考えられている。この点で核酸成分であるヌクレオチドは、ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対中に情報の重複を可能にする、対の表面のみを有さなければならない。核酸成分は、広範囲の結合または触媒作用に十分な、化学的相違と活性を有する必要はない。
　しかし、天然に見い出された少数の核酸は、ある種の標的分子への結合に関与し、少数の触媒作用の例さえ報告されている。この種の活性の範囲は、タンパク（さらに具体的には抗体）に比較して狭い。例えば、核酸があるタンパク標的に高い親和性と高い特異性で結合することが公知である場合、その結合は、ＤＮＡまたはＲＮＡリガンドからなるヌクレオチドの正確な配列に依存している。例えば、短い２本鎖ＤＮＡ配列は、原核生物と真核生物の両方の転写を抑制または活性化する標的タンパクに結合することが知られている。他の短い２本鎖ＤＮＡ配列は、高い親和性と高い特異性で選択されるタンパク標的である制限エンドヌクレアーゼに結合することが知られている。他の短いＤＮＡ配列は、恐らく染色体の作用機構に関与する特異的タンパクの結合のためのリガンドを生成することにより、染色体上の動原体（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅｓ）と末端小粒（ｔｅｌｏｍｅｒｅｓ）として作用する。例えば、２本鎖ＤＮＡは、ＤＮＡ結合に機能する標的タンパクの隅や裂け目（ｎｏｏｋｓ　ａｎｄ　ｃｒａｎｎｉｅｓ）の中に結合する周知の能力を有する。１本鎖ＤＮＡも高い親和性と高い特異性で少数のタンパクに結合することができるが、そのような例は少ない。２本鎖ＤＮＡ結合タンパクの公知の例から、Ｂ型２本鎖ＤＮＡの大きな溝の中にアミノ酸側鎖を突き出した種々のタンパクのモチーフ（ｍｏｔｉｆ）が関係するものとして、結合相互作用を説明することが可能となり、特異性を与える配列を調べることが可能になった。
　２本鎖ＤＮＡはしばしば、ある蛋白（例えば、大腸菌のエンドヌクレアーゼＲＮａｓｅＩＩＩ）のリガンドとして作用する。１本鎖ＲＮＡに結合する標的タンパクの例が知られているが、これらの場合にその１本鎖ＲＮＡはしばしば、分子内２本鎖の局所領域を含む複雑な３次元形状を形成する。アミノ−アシルｔＲＮＡシンセターゼは、高い特異性でｔＲＮＡ分子に強く結合する。ＲＮＡウイルスのゲノム中の短い領域は、強くそして高い特異性でウイルスの外被タンパクに結合する。ＲＮＡの短い配列は、バクテリオファージＴ４がコードするＤＮＡポリメラーゼに、これも高い親和性と高い特異性で結合する。すなわち、特異的タンパク標的の結合相手となる、２本鎖または１本鎖のＲＮＡおよびＤＮＡリガンドを見つけることが可能である。多くの公知のＤＮＡ結合タンパクは２本鎖ＤＮＡに特異的に結合し、一方多くのＲＮＡ結合タンパクは１本鎖ＲＮＡを認識する。この文献上の統計的偏りは、ＤＮＡを２本鎖ゲノムとして使用し、ＲＮＡをゲノムとしての役割を越えて働く１本鎖物質として使用する、現在の生物圏の統計的傾向を確実に反映している。化学的には、１本鎖ＤＮＡを、特異的なタンパクの相互作用の十分に有能な相手として無視する大きな理由はない。
　ＲＮＡとＤＮＡはまた、より小さい標的分子に結合することが見い出された。２本鎖ＤＮＡは、例えばアクチノマイシンＤのような種々の抗生物質に結合する。特定の１本鎖ＲＮＡは、抗生物質チオストレプトン（ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎｅ）に結合し；特定のＲＮＡ配列と構造は、恐らく他の抗生物質（特にその機能が標的生物のリボソームを不活化するもの）に結合する。進化的に関連するＲＮＡのファミリーは、２０個のアミノ酸の１つと結合する（ヤルス，Ｍ．（Ｙａｒｕｓ，Ｍ．）（１９８８）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１７５１）と同様に、特異的にそして適切な親和性でヌクレオチドやヌクレオシドに結合する（バス，Ｂ．（Ｂａｓｓ，Ｂ．）およびセック，Ｔ．（Ｃｅｃｈ，Ｔ．）（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３０８：８２０）。触媒性　ＲＮＡも公知であるが、これらの化学的可能性の範囲は狭く、これまではおもに核酸のホスホジエステル転移反応や加水分解に関与するとされてきた。
　これらの公知の例にもかかわらず、大多数の主要なタンパクと他の細胞成分は、生理的条件下では核酸に結合しないと考えられ、そのような結合は観察されても非特異的であると考えられている。核酸の他の化合物へ結合する能力は前述の比較的少数の例に限定されているか、または特異結合のための核酸の化学的能力は、天然の構造中で避けられている（に対して選択されている）。本発明は、核酸が化学化合物として事実上無限の配列の形状、サイズおよび配置を形成でき、生物系で示されるよりもはるかに広い範囲の結合と触媒作用を有することができるという、本発明者らの根本的な考え方を前提とする。
　タンパク−核酸結合の幾つかの公知の例において、化学的相互作用が研究されている。例えば、バクテリオファージＲ１７外被タンパク結合のＲＮＡ部位のサイズと配列が、ウーレンベック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）とその共同研究者により同定された。Ｒ１７外被タンパクの最小の天然ＲＮＡ結合部位（２１塩基の長さ）は、ｍＲＮＡのサイズ可変の標識断片を、タンパク−ＲＮＡ断片複合体がフィルターに結合して残る、ニトロセルロースフィルター結合測定法により決定された（キャリー（Ｃａｒｅｙ）ら（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２：２６０１）。個々の核酸のタンパク結合への寄与を測定するために、最小Ｒ１７外被タンパク結合部位の多くの配列変種が、インビトロで作成された（ウーレンベック（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）ら（１９８３）　Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　１：５３９、およびロマニウク（Ｒｏｍａｎｉｕｋ）ら（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６：１５６３）。結合部位のヘアピンループ構造の維持がタンパク結合に必須であるが、加えて結合部位の多くの１本鎖残基のヌクレオチド置換が、ヘアピン軸の隆起したヌクレオチドを含めて、結合に著しく影響することが見い出された。同様の研究で、翻訳オペレーターへのバクテリオファージＱβ外被タンパクの結合が検討された（ウィセレルとウーレンベック（Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌ　ａｎｄ　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８：７１）。Ｑβ外被タンパクＲＮＡ結合部位は、隆起したヌクレオチドと３塩基ループを含む８塩基対のヘアピン構造を有する約２０塩基よりなるという点から、サイズおよび予測される２次構造において、Ｒ１７のものと同様であることが見い出された。Ｒ１７外被タンパク結合部位と異なり、ループの１本鎖残基の１つのみが結合に必須であり、隆起したヌクレオチドの存在は必要ではない。この翻訳制御に関連したタンパク−ＲＮＡ結合相互作用は、かなり高い特異性を示す。
　核酸は溶液中で２次および３次構造を形成することが知られている。２本鎖型のＤＮＡは、いわゆるＢ二重らせん型、Ｚ−ＤＮＡおよびスーパーらせんツイスト構造を含む（リッチ，Ａ．（Ｒｉｃｈ，Ａ．）ら（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　５３：７９１）。１本鎖ＲＮＡは、ヘアピンループやにせ結び目（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔ）構造のような、２次構造の局在化領域を形成する（シメル，Ｐ．（Ｓｃｈｉｍｍｅｌ，Ｐ．）（１９８９）Ｃｅｌｌ　５８：９）。しかし、対になっていないループヌクレオチドのループ構造の安定性、形成と変性の速度論、熱力学に及ぼす影響はほとんど知られておらず、そして３次構造と３次元形状について、また核酸の３次折畳み（ｔｅｒｔｉａｒｙ　ｆｏｌｄｉｎｇ）の速度論と熱力学についてもほぼ何も知られていない（ターク（Ｔｕｅｒｋ）ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：１３６４）。
　ＲＮＡバクテリオファージＱβの複製における、ある型のインビトロの進化が報告されている。ミルズ（Ｍｉｌｌｓ）ら（１９６７）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　５８：２１７；レビンソーンとスピーグルマン（Ｌｅｖｉｎｓｏｈｎ　＆　Ｓｐｉｅｇｌｅｍａｎ）（１９６８）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　６０：８６６；レビンソーンとスピーグルマン（１９６９）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　６３：８０５；サッフヒル（Ｓａｆｆｈｉｌｌ）ら（１９７０）　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　５１：５３１；カシアン（Ｋａｃｉａｎ）ら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　６９：３０３８；ミルズら（１９７３）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１８０：９１６。ファージＲＮＡは、ファージ特異性タンパクの翻訳を指令するポリシストロン性メッセンジャーＲＮＡとして、またＱβＲＮＡレプリカーゼにより触媒されるそれ自体の複製の鋳型としての作用する。このＲＮＡレプリカーゼは、それ自信のＲＮＡ鋳型に対して、高度に特異的であることが示された。インビトロの複製周期の過程で、やはりＱβレプリカーゼにより複製される小さいＲＮＡ変種が単離された。複製周期を行う条件の小さな変更により、異なるＲＮＡが集積したが、これは恐らく変更した条件がそれらの複製により適していたからであろう。これらの実験では、選択されたＲＮＡは、複製を開始するためにレプリカーゼにより有効に結合し、そしてＲＮＡの伸長の間、速度論的に適した鋳型を働かなければならなかった。クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら（１９７４）　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　８９：７１９は、Ｑβレプリカーゼの突然変異ＲＮＡ鋳型の単離を報告し、この複製は天然の鋳型に比べて臭化エチジウムによる阻害に対してより抵抗性であることを報告した。この突然変異体は最初のＲＮＡ集団には存在しないが、Ｑβレプリカーゼでのインビトロ複製周期の間に逐次の突然変異により生成されることが示唆された。選択の間の変異の唯一の起源は、Ｑβレプリカーゼによる伸長の間の内因性のエラー率であった。これらの研究で「選択」と呼ばれるものは、最初は均一なＲＮＡ配列の限られた数の自然発生的な変異体の１つまたはそれ以上の優先的増幅により生じた。目的とした結果の選択はなく、あるのはただＱβレプリカーゼの作用の様式に内在したものであった。
　ジョイスとロバートソン（Ｊｏｙｃｅ　ａｎｄ　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）（ジョイス（１９８９）　ＲＮＡ：触媒、スプライシング、進化（ＲＮＡ：Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，Ｓｐｌｉｃｉｎｇ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）、ベルフォートとシャブ（Ｂｅｌｆｏｒｔ　ａｎｄ　Ｓｈｕｂ）（編）、エルセビア社（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、アムステルダム、８３−８７ページ；およびロバートソンとジョイス（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ　３４４：４６７）は、１本鎖ＤＮＡを特異的に切断するＲＮＡを同定する方法を報告した。触媒活性の選択は、特定の位置で基質ｓｓＲＮＡまたはＤＮＡの切断を触媒し、基質の３’末端をリボザイムの３’末端へ転移するリボザイムの能力に基づいていた。目的の反応の生成物は、触媒反応により形成される結合部を介して完成した生成物にのみ結合できて、リボザイム配列の選択的逆転写を可能にする、オリゴデオキシヌクレオチドプライマーを使用することにより選択された。この選択された触媒配列は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをｃＤＮＡの３’末端へ結合させ、続いてＲＮＡを転写させることにより増幅された。この方法は、少数のリボザイム突然変異体から、選択された基質の切断に対して最も反応性のある突然変異体を同定するために使用された。
　先行技術は、他の物質との相互作用における核酸については、限られた範囲の化学的機能以上には、教えたり示唆したりはしていない（ある種の特定のオリゴヌクレオチド配列に結合するように進化したタンパクの標的として；そしてさらに最近になって、限定された範囲の活性を持った触媒として）。先行の「選択」実験は、既に記載された機能の狭い範囲の突然変異体に限定されてきた。ここで、核酸が非常に広い範囲の機能を有し、この可能性を実現するための方法論が本明細書で開示されることが、初めて理解されるであろう。
　１９９０年６月１１日に出願された、ゴールドとタークの、「指数的濃縮のためのリガンドの系統的進化」（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｆｏｒ　ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）という名称の、合衆国特許出願番号０７／５３６，４２８号と、１９９１年６月１０日に出願された、ゴールドとタークの、「核酸リガンド」（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｌｉｇａｎｄｓ）という名称の、合衆国特許出願番号０７／７１４，１３１号（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０７８号も参照）は、任意の目的の標的に対する核酸リガンドを作るための根本的に新規な方法を記載している。これらの出願はどれも、本明細書ではまとめてセレックス特許出願と呼び、参照により本明細書中に取り組み込まれる。
　セレックス特許出願の方法は、核酸は種々の２次元および３次元構造を形成するのに十分な能力と、事実上任意の化合物（サイズが大きいものまたは小さいものも）とのリガンド（特異的結合対を形成する）として作用する、モノマー内で利用可能な十分な化学的な融通性を有するという独特の洞察に基づく。
　この方法は、結合親和性と選択性の任意の目的基準を事実上達成するために、同一の一般的な選択テーマを使用する、候補の混合物からの選択と、構造改良の段階的な繰り返しを含む。本明細書中でセレックスと呼ばれる方法は、核酸（好ましくはランダム化された配列の切片よりなる）の混合物から出発して、混合物を結合に適する条件下で標的に接触させ、標的分子に結合した核酸から未結合の核酸を分画し、核酸−標的対を解離させ、核酸−標的対から解離した核酸を増幅して、リガンドが濃縮された核酸混合物を生成し、次に結合、分画、解離および増幅の工程を必要な回数繰り返す、工程を含む。
　調製の理論には拘束されないが、セレックスは、多くの可能な配列と構造を含有する核酸混合物中に、目的の標的に対する広い範囲の結合親和性が存在するという、発明者らの洞察に基づく。例えば２０ヌクレオチドのランダム化された切片からなる核酸混合物は、４２０の候補の可能性を有する。標的に対する高い親和性定数を有するものが、最も結合しやすい。分画、解離および増幅後、さらに高い結合親和性の候補を得るために、第２の核酸混合物が生成され濃縮される。生じる核酸混合物が、主にただ１つまたは数種の配列よりなるまで、さらに選択を重ねることにより徐々に最もよいリガンドが得られる。次にこれらはクローン化され、配列を決め、そして純粋なリガンドとしての結合親和性について個々に試験される。
　選択と増幅の周期は、目標が達成されるまで繰り返される。最も一般的なケースでは、周期の繰り返しにより結合強度の著しい改良が見られなくなるまで、選択／増幅は続けられる。この方法は、約１０１８もの多くの異なる核酸種を採取するのに使用できる。試験混合物の核酸は、好ましくは十分な増幅に必要な保存配列と共に、ランダム化された配列部を含む。核酸配列の変種は、ランダム化された核酸配列の合成と、ランダムに切断した細胞性核酸からのサイズ選択を含む、多くの方法で製造することができる。可変配列部は、全部または一部ランダム配列を含有してよく；またランダム配列とともに組み込まれた保存配列の部分も含有してよい。試験核酸の配列変化は、選択／増幅の繰り返しの前またはその間に、突然変異誘発により導入するかまたは増加させてよい。
　セレックス特許出願の方法の１つの実施態様で、選択された標的に最も強力に結合する核酸リガンドを単離するのに、その選択工程は非常に有効であり、ただ１回の選択と増幅が必要なだけである。そのような有効な選択は、例えば、カラムに結合した標的と会合する核酸の能力が、カラムが最も高い親和性の核酸リガンドの分離と単離を可能にするように機能する、クロマトグラフィー型の工程で起きる。
　多くの場合に、単一の核酸リガンドが同定されるまでセレックスの反復工程を行うことは必ずしも望ましいことではない。標的に特異的な核酸リガンド溶液は、多くの保存配列と、標的に対する核酸リガンドの親和性に著しく影響することなく置換または付加される多くの配列を有する、一群の核酸の構造またはモチーフを含む。セレックス工程を完了する前に終結させることにより、多くの核酸リガンド溶液群のメンバーの配列を決定することが可能である。
　種々の核酸の１次、２次および３次構造が存在することが知られている。最も一般的に非ワトソン−クリック型の相互作用に関係することが証明されている構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称的および非対称的な隆起、にせ結び目およびその無数の組み合わせである。ほとんどすべての既知のそのようなモチーフは、それらが３０ヌクレオチド以下の核酸配列内に形成されることを示唆している。この理由のため、隣接するランダム化された切片を扱うセレックス工程は、約２０−５０ヌクレオチドの間のランダム切片を含有する核酸配列で開始するのが、しばしば好ましい。
　セレックス特許出願はまた、標的分子の１つまたはそれ以上の部位に結合する核酸リガンド、および標的の特定部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドに結合する、核酸リガンドを入手する方法を記載している。このセレックス法は、考え得る任意の標的に結合する核酸リガンドを単離し同定する手段を提供する。しかし好適な実施態様において、セレックス法は、標的が蛋白（核酸結合タンパクと、生物学的機能の一部として核酸と結合することが知られていないタンパクの両者を含む）である状況に適用される。
　高解像度でのＲＮＡ構造についてはほとんど知られていない。２本鎖ＲＮＡの基本的なＡ型らせん構造は、繊維回折（ｆｉｂｅｒ　ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ）研究から知られている。Ｘ線結晶学により、少数のｔＲＮＡと短いポリＡＵらせんの構造が与えられた。ｔＲＮＡ／シンセターゼＲＮＡ／タンパク複合体のＸ線構造も解明された。２つのテトラヌクレオチドのヘアピンループと１つのモデルのにせ結び目は、ＮＭＲ研究から明らかになっている。
　構造データの不足の裏には幾つかの理由がある。インビトロのＲＮＡ合成法が出現するまでは、構造研究に十分な量のＲＮＡを単離することは困難であった。触媒性ＲＮＡの発見までは、構造研究に値すると考えられるＲＮＡ分子はほとんどなかった。良質なｔＲＮＡ結晶を得るのが困難であり、他の結晶の研究に水を差した。このサイズの分子のＮＭＲ研究の技術は、ようやく最近になって利用可能となった。
　上述のように、いくつかの触媒性ＲＮＡ構造が公知であり、そして種々の標的分子に強く結合するＲＮＡを選択するセレックス技術が開発されているため、新しい触媒性ＲＮＡ構造も選択することができるかもしれない。これらの作用を正確に知るために、そしてこれらを改良するためにこの知識を利用するために、これらの分子の構造を知ることが重要になった。
　厳密なＮＭＲ、および厳密なＸ線結晶構造解析を用いるよりも少ない努力で、ＲＮＡの構造を予測することを可能にするために、ＲＮＡの折畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）について十分に理解することが好ましい。タンパクとＲＮＡの両者にとって、配列に基づき、限られた（または全然ない）実験データを加味して、構造を推定できるようにしたいという要求が常にあった。
　タンパク構造の予測は、困難であることがよく知られている。まず第一に、タンパクの２次構造と３次構造は協同的に形成し；タンパクの折畳みは、完全に折り畳まれた状態と完全に折り畳まれていない状態の２状態モデルにより熱力学的に近似され得る。このことは、タンパク構造をモデル化するための自由度の数が非常に大きいことを意味し；予測可能な中間物なしに、予測問題をより小さく扱える小問題に分解できない。対照的に、しばしばＲＮＡは、３次相互作用よりも安定性を与える充分に規定された２次構造を作るようである。例えば、ｔＲＮＡの３次構造は、マグネシウムのキレート化によりまたは温度の上昇により、その２次構造を破壊することなしに、破壊され得る。ＲＮＡの２次構造の予測は充分理解されており、小さいＲＮＡ分子についてそれは一般的に非常に正確である。ＲＮＡでは、構造予測は小問題に分解され；最初に２次構造の予測；次に生じたらせんと残った１本鎖が相互にどのように配置されるかを予測する。
　ＲＮＡについて、構造予測の最初の試みはｔＲＮＡについてなされた。規範的なｔＲＮＡクローバー葉の２次構造は比較配列分析から明らかになり、問題は４つの短いＡ型らせんを空間で相互に配置するという１つの問題に絞られた。ｔＲＮＡモデルを作成するために、手作業のＣＰＫのモデル化、たやすく算出できるエネルギーの最小化、および架橋研究と系統発生の共通変化（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｏｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）から得られたいくつかの距離上の制限が使用され、そして数年後フェニルアラニンｔＲＮＡの最初の結晶構造が解決された時、これは不運にも間違いであることが判明した。
　コンピューターによるモデル化が手作業のモデル化に取って代わり、重力と質量により負わされたモデル作成者の困難さを救済した。コンピューターによるモデル化は、例えば相同の構造が公知である場合に付加的な実験データなしに使用することができるのみである；例えばカブ黄色モザイクウイルス（ｔｕｒｎｉｐ　ｙｅｌｌｏｗ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ）のＲＮＡゲノムの３’末端の構造は、ｔＲＮＡの公知の３Ｄ構造と、ＴＹＭＶの３’末端は多くの細胞性ｔＲＮＡ修飾酵素によりｔＲＮＡ様として認識されるという知識に基づいてモデル化された。このモデルはＲＮＡにせ結び目の最初の３Ｄモデルであり；単離されたモデルにせ結び目の基本構造はＮＭＲデータにより確証された。
　幾つかのＲＮＡ分子の構造をモデル化するために、化学的および酵素的保護データを手作業で点検して、コンピューターによるモデル化法が使用された。１つの単離された基礎構造において、単離されたＧＮＲＡヘアピンループのＮＭＲ研究により、ＧＮＲＡの４ヌクレオチドループの形態の１つのモデルが、本質的に正しいことが示された。
　フランソワ・マイケル（Ｆｒａｎｃｏｉｓ　Ｍｉｃｈｅｌ）（（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ　３４２：３９１）は、グループＩイントロンの触媒活性コアのモデルを構築した。ｔＲＮＡのように、グループＩイントロンコアの２次構造は比較配列分析からよく知られているので、問題はらせんと残った１本鎖領域を正しく配置するという１つの問題に絞られる。上記マイケル（１９８９）は、整列させた一組の８７のグループＩイントロン配列を目で分析して、７つの強力な対と２次構造の外側にトリプレットの共通変化を検出し、これを彼は３次接触と解釈して彼のモデルに制限として手作業で組み込んだ。今のところ、マイケルのモデルの独立した確認はない。
　他にも架橋、蛍光遷移、または系統発生の共通変化から距離の制限を扱う自動化方法を案出しようという試みはなされてきた。ＲＮＡは円筒形（Ａ型らせん）とビーズ（１本鎖残基）の集合として処理され、距離幾何学と呼ばれる数学的技術が、一組の距離制限と矛盾しないこれらの要素の配置を作成するのに使用される。フェニルアラニンｔＲＮＡの３次構造の７つの距離制限の小さい一組を使用して、この方法により、約２／３回はありふれたＬ型のｔＲＮＡ構造が作成された。
　ＨＩＶ−１のｔａｔタンパクは、ＨＩＶ−１のウイルスゲノムの長い末端繰り返し（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ）（ＬＴＲ）中の転写を活性化する。カレン（Ｃｕｌｌｅｎ）ら（１９８９）　Ｃｅｌｌ　５８：４２３を参照のこと。活性化の機構は不明確であるか、または少なくとも議論のあるところであるが、転写されたＲＮＡはトリヌクレオチド隆起のある特異なヘアピン構造（ＴＡＲと呼ばれる）を含有することが必要である。図２５に天然のＴＡＲ　ＲＮＡとｔａｔの相互作用の部位が示されている。ｔａｔタンパクの小さい基本ドメインはＴＡＲ　ＲＮＡ配列と直接相互作用することが証明されている。ウィークス（Ｗｅｅｋｓ）ら（１９９０）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：１２８１；ロイ（Ｒｏｙ）ら（１９９０）　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．４：１３６５；カルナン（Ｃａｌｎａｎ）ら（１９９１ａ）Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．５：２０１を参照のこと。この基本ドメイン中のアルギニンは、相互作用に決定的に重要なようである。カルナンら（１９９１ａ）上記；スブラマニアン（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ）ら（１９９１）　ＥＭＢＯ　１０：２３１１−２３１８；カルナンら（１９９１ｂ）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：１１６７−１１７１を参照のこと。アルギニンは単独ではＴＡＲ　ＲＮＡ配列に特異的に結合し、ｔａｔタンパク結合のため競合するようである。タオ（Ｔａｏ）ら（１９９２）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：２７２３−２７２６；パグリシ（Ｐｕｇｌｉｓｉ）ら（１９９２）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：７６−８０を参照のこと。
　Ｔａｔ−ＴＡＲ相互作用だけではトランス活性化を支持するには不足であり；ＴＡＲへのｔａｔタンパクと協同の結合、そして続くインビボまたはインビトロのトランス活性化には、恐らく細胞性因子（６８ｋＤループ結合タンパク）が必要である。マルシニアク（Ｍａｒｃｉｎｉａｋ）ら（１９９０ａ）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：３６２４；マルシニアクら（１９９０ｂ）　Ｃｅｌｌ　６３：７９１を参照のこと。レトロウイルスにより形質転換した細胞株のＴＡＲ配列の過剰発現は、これらをＨＩＶ−１感染に対して高度に抵抗性にしている。スレンジャー（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ）ら（１９９０）Ｃｅｌｌ　６３：６０１を参照のこと。
　トロンビンは、重要な凝血促進活性と抗凝固活性を有する、多官能性のセリンプロテアーゼである。凝血促進酵素として、トロンビンはフィブリノーゲンを凝固させて、血液凝固第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、及び第ＸＩＩＩ因子を活性化し、血小板を活性化する。トロンビンによるフィブリノーゲンの特異的切断は、血液凝固形成の最初の事象であるフィブリンモノマーの重合を開始させる。血小板血栓の形成における主要な事象は、「非結合」から「結合」モードへの血小板の活性化であり、トロンビンは血小板凝集の最も強力な生理学的アクチベーターである（バーントとフィリップス（Ｂｅｒｎｄｔ　ａｎｄ　Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）（１９８１）Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｌ．ゴードン（Ｊ．Ｌ．Ｇｏｒｄｏｎ）（編）（アムステルダム：エルセビア社（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）／北オランダ生物医学出版社（Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ））、４３−７４ページ；ハンセンとハーカー（Ｈａｎｓｅｎ　ａｎｄ　Ｈａｒｋｅｒ）（１９８８）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：３１８４；エイト（Ｅｉｄｔ）ら（１９８９）　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１８）。こうして、凝血促進物質としてトロンビンは、出血の阻止（生理的止血）と血管閉塞性血栓（病的な血栓症）において中心的な役割を演じる。
　抗凝固物質としてトロンビンは、血管内皮細胞の表面に発現するトロンボモジュリン（ＴＭ）に結合する。ＴＭは、活性部位の配置のアロステリックな変化とトロンビン上のＴＭとフィブリノーゲン結合部位の重複の組み合わせにより、基質特異性をフィブリノーゲンと血小板からプロテインＣに変える。リン脂質表面に存在する活性化プロテインＣ、Ｃａ２＋、および第２のビタミンＫ依存性タンパクコファクターであるプロテインＳは、タンパクを分解する第Ｖａ因子と第ＶＩＩＩａ因子による凝固を阻害する。このようにトロンビン−ＴＭ複合体の形成は、トロンビンを凝血促進酵素から抗凝固酵素へと変換し、そしてこれらの対立する活性の間の正常なバランスが止血の制御に決定的に重要である。
　トロンビンはまた、凝固系から遠く離れた生物学的応答にも関与する（シューマン（Ｓｈｕｍａｎ）（１９８６）　Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４８５：３４９に総説；マークス（Ｍａｒｘ）（１９９２）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６：１２７８）。トロンビンは単球の走化性物質であり（バー−シャビト（Ｂａｒ−Ｓｈａｖｉｔ）ら（１９８３）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２０：７２８）、リンパ球（チェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９７６）　Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．１０１：４１）、間充織細胞（チェンとブキャナン（Ｃｈｅｎ　ａｎｄ　Ｂｕｃｈａｎａｎ）（１９７５）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７２：１３１）、および繊維芽細胞（マークス（１９９２）上記）の細胞分裂促進物質である。トロンビンは内皮細胞を活性化して、好中球接着タンパクＧＭＰ−１４０（ＰＡＤＧＥＭ）を発現させ（ハットリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）ら（１９８９）　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６４：７７６８）、血小板由来増殖因子を産生させる（ダニエル（Ｄａｎｉｅｌ）ら（１９８６）　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６１：９５７９）。最近トロンビンが、培養神経細胞による神経突起の収縮を引き起こすことが示された（マークス（１９９２）上記に総説）。
　トロンビンが血小板と内皮細胞を活性化する機構は、これらの細胞に見い出される機能性のトロンビンリセプターを介する。このリセプターの推定されるトロンビン切断部位（ＬＤＲ／Ｓ）は、リセプターのタンパク分解的な切断によりトロンビンリセプターが活性化されることを示唆する。この切断という事象がＮ末端ドメインを「露にし」て、これがリガンドとして作用してリセプターを活性化する（ビュー（Ｖｕ）ら（１９９１）　Ｃｅｌｌ　６４：１０５４）。
　血管傷害と血栓形成は、動脈硬化を含む種々の血管の疾患の病因の中心的な事象である。種々の疾患状態や種々の部位（冠状動脈、心臓内および人工心臓弁）の血栓を導く、血小板および／または凝固系の活性化の発病過程は、異なるようである。従って閉塞した血管を開き、再閉塞を妨げるためには、血栓溶解剤と併用して、血小板阻害剤、抗凝固剤、または両者の組み合わせの使用が必要かも知れない。
　凝固カスケードの化合物による制御されたタンパク分解は、止血のために決定的に重要である。その結果、部分的に一連の特異性の高いプロテアーゼ阻害剤に基づく種々の複雑な制御系が存在する。病的な状態では、活性プロテアーゼの過剰な産生または阻害活性の不活化により、機能的な阻害活性は妨害される。多数の外傷（組織損傷）または感染（敗血症）に応答する炎症の持続は、トロンビンを含む血漿カスケード系と、リソソーム由来の両方のタンパク分解酵素に依存する。これらの場合の多臓器不全（ＭＯＦ）は、併発するプロテアーゼとその阻害性制御物質の不均衡により増強される。脳内のトロンビン活性の不均衡は、神経変性疾患を引き起こす。
　トロンビンは本来、ヘパリン依存性反応でアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）に結合することにより、止血中に阻害される。ヘパリンは、ＡＴＩＩＩの作用を増進する能力によりその効果を発揮する。脳では、プロテアーゼネキシン（ｐｒｏｔｅａｚｅ　ｎｅｘｉｎ）（ＰＮ−１）が、神経突起の生長を制御するトロンビンの天然の阻害剤であろう。
　ヘパリンは、Ｄ−グルコサミンとウロン酸残基が交互に繰り返される鎖からなるグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓｏａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）である。現在ヘパリンは、不安定な狭心症、肺塞栓症、アテローム性動脈硬化症、血栓症、および続く心筋梗塞の治療に抗凝固剤として広範囲に使用されている。その抗凝固効果は、ＡＴＩＩＩとの相互作用により媒介される。ヘパリンがＡＴＩＩＩに結合すると、ＡＴＩＩＩの配置が変化して、著しく増強されたトロンビンの阻害剤となる。ヘパリンは一般にある種の徴候に有効であると考えられているが、ＡＴＩＩＩ・ヘパリン複合体の物理的サイズが体内の多くの生物学的に活性のトロンビンへの接近を防止して、凝血の形成を阻害する能力を減少させている。ヘパリンの副作用には、出血、血小板減少、骨粗鬆症、皮膚の壊死、脱毛症（ａｌｐｅ）、過敏症および低アルドステロン症（ｈｙｐｏａｌｄｏｓｅｒｏｎｉｓｍ）がある。
　ヒルジンは、ヨーロッパの医用ヒルであるヒルディス・メディシナリス
（Ｈｉｒｕｄｉｓ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）由来の、トロンビンの強力なペプチド阻害剤である。ヒルジンは、α−トロンビンの全ての公知の機能を阻害し、２つの別の部位（セリンプロテアーゼ活性の触媒部位またはその近くの高い親和性部位と２番目のアニオン性の外の部位（ａｎｉｏｎｉｃ　ｅｘｏｓｉｔｅ））で速度論的にトロンビンに結合することが示されている。アニオン性の外の部位はまた、フィブリノーゲン、ヘパリン、ＴＭ、および恐らく血小板と内皮細胞の活性化の媒介に関係するリセプターにも結合する。Ｃ末端ヒルジンペプチド（これはトロンビンとの共結晶化によりアニオン性の外の部位で結合することが示された）は、恐らくこの部位での結合に競合することにより、フィブリン形成、血小板と内皮細胞の活性化、およびＴＭ結合を介するプロテインＣの活性化に阻害効果を有する。このペプチドは、トリペプチド発色性基質（ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ　ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）、第Ｖ因子または第Ｘ因子に対してはタンパク分解活性を阻害しない。
　トロンビンの構造は、そのアニオン性の外の部位により、核酸結合の特に望ましい標的になっている。この部位での部位特異的突然変異誘発は、フィブリノーゲン−凝血とＴＭ結合活性が分離可能なものであることを示した。恐らく、トロンビンとどのように相互作用するか（すなわちそれが真似をする基質）に依存して凝血促進および／または抗凝固効果を有するＲＮＡリガンドを選択されるのであろう。
　トロンビンの１本鎖ＤＮＡリガンドは、セレックスと同一の方法により調製された。ボック（Ｂｏｃｋ）ら（１９９２）　Ｎａｔｕｒｅ　３５５：５６４を参照のこと。コンセンサスリガンドは比較的少ない回転のセレックスを実行後に同定され、これはインビトロの凝血形成を妨げる能力を有することが証明された。このリガンドは、本明細書ではＧ１５Ｄ（配列ＩＤ番号：１）と呼ぶ、１５塩基のＤＮＡ　５’ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’である。その１次配列の対称性は、Ｇ１５Ｄが規則的な固定された３次構造を有することを示唆する。トロンビンへのＧ１５ＤのｋＤは、約２×１０−７である。抗凝固物質としての有効なトロンビン阻害のためには、トロンビンへのリガンドの親和性が強いほど良い。
　塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、間充織と神経外胚葉由来の多くの細胞にとっての多官能性エフェクターである（リフキンとモスカテリ（Ｒｉｆｋｉｎ　＆　Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ）（１９８９）　Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１０９：１；ベアードとボーレン（Ｂａｉｒｄ　＆　Ｂｏｈｌｅｎ）（１９９１）　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（スポーン，Ｍ．Ｂ．とロバーツ，Ａ．Ｂ．（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．　＆　Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．）編）；３６９−４１８ページ、スプリンガー社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、ニューヨーク；バシリコとモスカテリ（Ｂａｓｉｌｉｃｏ　＆　Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ）（１９９２）　Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５９：１１５）。これは、酸性ＦＧＦ（ジェイ（Ｊａｙｅ）ら（１９８６）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３：５４１；アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら（１９８６）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３：５４５）、ｉｎｔ−２（ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら（１９８６）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　５：９１９）、ｋＦＧＦ／ｈｓｔ／ＫＳ３（デリ−ボビ（Ｄｅｌｌｉ−Ｂｏｖｉ）ら（１９８７）　Ｃｅｌｌ　５０：７２９；タイラ（Ｔａｉｒａ）ら（１９８７）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：２９８０）、ＦＧＦ−５（ザン（Ｚｈａｎ）ら（１９８８）　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．　８：３４８７）、ＦＧＦ−６（マリックス（Ｍａｒｉｃｓ）ら（１９８９）　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　４：３３５）およびケラチン生成細胞増殖因子／ＦＧＦ−７（フィンチ（Ｆｉｎｃｈ）ら（１９８９）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４５：７５２）をも含む関連タンパクのファミリーの内で、最も検討された、そして最もよく性状解析されたメンバーの１つである。
　インビトロで、ｂＦＧＦは細胞の増殖、遊走、プラスミノーゲンアクチベーターとコラゲナーゼ活性の誘導を刺激する（プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）ら（１９８６）　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．　６：４０６０；モスカテリら（１９８６）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：２０９１；ミグナッチ（Ｍｉｇｎａｔｔｉ）ら（１９８９）　Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１０８：６７１）。インビボで、これは新血管新生の最も強力な誘導物質の１つである。そのインビボの血管新生活性は、組織修復と創傷治癒だけでなく、病的な新血管新生により特徴付けられる疾患の状態（例えば腫瘍の増殖、腫瘍の転移、糖尿病性網膜症および慢性関節リウマチ）においての役割をも示唆する（フォークマンとクラグスブルン（Ｆｏｌｋｍａｎ　＆　Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ）（１９８７）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：４４２；ゴスポダロビッツ（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｔｚ）（１９９１）　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　２５：３０７）。
　ｂＦＧＦは分泌のためのシグナル配列を持たないが、恐らくエキソサイトーシスにより運ばれて原形質膜の両側に見い出される（ブロダブスキー（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ）ら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１６：２６８；ミグナッチとリフキン（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　４７：２０１）。細胞外マトリックスでは、これは典型的には、ヘパラン硫酸プロテオグリカンを含有する分画と会合している。実際ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーは、これと他のヘパリン結合増殖因子の精製に有用な方法である。ｂＦＧＦは、細胞培養では低親和性部位と高親和性部位に結合する。低親和性部位は、ｂＦＧＦが約ナノモルの親和性で結合する、細胞に会合したヘパラン硫酸プロテオグリカンよりなる（モスカテリ（１９８７）　Ｊ．Ｃｅｌｌ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１３１：１２３）。ｂＦＧＦの全ての生物学的効果は、二量体チロシンキナーゼＦＧＦリセプターである高親和性結合部位（１０−１００ｐＭ）との相互作用により媒介される（ウエノ（Ｕｅｎｏ）ら（１９９２）　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６７：１４７０）。現在までに５つのＦＧＦリセプター遺伝子が同定されており、その各々が別のｍＲＮＡスプライシングの結果として数種の構造変異体を産生できる（アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）ら（１９９２）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５２：２００４；ウエノら（１９９２）上記）。これまでに、低親和性結合部位と高親和性結合部位がｂＦＧＦの全体の親和性を決定するのに協同して作用するというかなりの証拠がある。グリコサミノグリカン合成に欠損のある変異体細胞株（ヤヨン（Ｙａｙｏｎ）ら（１９９１）　Ｃｅｌｌ　６４：８４１）またはヘパリチナーゼ（ｈｅｐａｒｉｔｉｎａｓｅ）処理細胞（ラプレーガー（Ｒａｐｒａｅｇｅｒ）ら（１９９１）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：１７０５）を用いた実験は、細胞に会合したヘパラン硫酸またはこれが無い状態で、ｂＦＧＦに外から添加したヘパリンの結合にはチロシンキナーゼリセプターを介してのシグナルが必要であることを証明した。観察されたＫｄを速度論成分に分解した最近の結果は、低親和性部位と高親和性部位へのｂＦＧＦの会合速度は同等であるが、細胞表面リセプターからのｂＦＧＦの解離速度は、細胞に会合したヘパラン硫酸に比べて２３倍遅いことを示している（ヌーゲントとエーデルマン（Ｎｕｇｅｎｔ　＆　Ｅｄｅｌｍａｎ）（１９９２）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１：８８７６）。しかし、遅い解離速度はリセプターが細胞表面に結合している時にのみ観察され、これは両部位への同時結合が全体の高親和性結合に寄与していることを示唆している。これは、最近解けたｂＦＧＦのＸ線結晶構造から決定されたように、ヘパリン結合部位とリセプター結合部位が、分子の近くではあるが分離した領域に位置するという観察結果を考えると、ありうることである（ザング（Ｚｈａｎｇ）ら（１９９１）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：３４４６；エリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）ら（１９９１）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：３４４１；アゴ（Ａｇｏ）ら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１１０：３６０；ズー（Ｚｈｕ）ら（１９９１）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：９０）。
　ｂＦＧＦ拮抗物質が有用な薬剤応用を有するというアイデアは、新規なものではない（ゴスポダロビッツ（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ）（１９９１）上記に総説）。今ではｂＦＧＦは、血管損傷に続く平滑筋細胞の病変の進展に中心的な役割を果たすことが知られている（レイディー（Ｒｅｉｄｙ）らＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、追補ＩＩＩ８６：ＩＩＩ−４３）。ｂＦＧＦ（およびＦＧＦファミリーの他のメンバー）の過剰発現は、多くの悪性疾患に相互に関係し（ハラバン（Ｈａｌａｂａｎ）ら（１９９１）　Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　６３８：２３２；タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ら（１９９０）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：５７１０；フジモト（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ）ら（１９９１）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．　１８０：３８６）、そして最近、中和活性抗ｂＦＧＦ抗体が、腫瘍に関連した血管新生を阻害することによりインビボで固形腫瘍増殖を抑制することが見い出された（ホリ（Ｈｏｒｉ）ら（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　５１：６１８０）。この点に関して注目すべきことは、公知の抗原虫活性を有するポリ硫酸化ナフタレン誘導体であるスラミン（ｓｕｒａｍｉｎ）の、抗腫瘍剤としての最近の治療試験である。スラミンは、ポリアニオン結合部位に結合して、増殖因子のリセプターとの相互作用を破壊することにより、ｂＦＧＦの活性を阻害すると考えられている（ミッドー（Ｍｉｄｄａｕｇｈ）ら（１９９２）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１：９０１６；エリクソンら（１９９２）上記）。多くの副作用と実質的な毒性を有することに加えて、スラミンは他の数種のヘパリン結合増殖因子と相互作用し、これにより有益な臨床効果を特異的薬剤−タンパク相互作用に結びつけることを困難にしている（ラ・ロッカ　（Ｌａ　Ｒｏｃｃａ）ら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌｓ　２：１０６）。あるヘパリン製剤の抗血管新生の性質も観察され（フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）ら（１９８３）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２１：７１９；クルム（Ｃｒｕｍ）ら（１９８５）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５０：１３７５）、これらの効果は恐らく少なくとも一部は、これらのｂＦＧＦシグナルに干渉する能力に基づいている。ｂＦＧＦ結合に寄与する特定のヘパリン画分は、現在部分的に解明されている（イシャイ−ミカエリ（Ｉｓｈａｉ−Ｍｉｃｈａｅｌｉ）ら（１９９２）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３１：２０８０；ターンブル（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ）ら（１９９２）　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６７：１０３３７）が、典型的なヘパリン製剤はサイズ、硫酸化の程度およびイズロン酸（ｉｄｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）含有量の点で不均一である。さらに、ヘパリンは多くの酵素と増殖因子にも影響を及ぼす。従って、モノクローナル抗体を除いて、ｂＦＧＦの特異的拮抗物質は知られていない。
　本発明は、核酸リガンドを同定し産生する方法、およびこうして同定し産生された核酸リガンドを含む。上述のセレックス法は、特定の標的に対する単一の核酸リガンドまたは核酸リガンドのファミリーの同定を可能にする。本発明の方法は、改良された核酸リガンドを同定し産生するための、セレックスにより得られた核酸リガンドまたは核酸リガンドのファミリーの分析を可能にする。
　本発明には核酸リガンドの３次元構造を決定する方法も含まれる。このような方法は、数学的モデル化とセレックス由来のリガンドの構造修飾を含む。さらに本発明には、リガンドの３次元構造を維持するのにどの核酸残基が必要か、そしてどの残基が標的と相互作用してリガンド−標的結合対の形成を促進するかを、決める方法も含まれる。
　本発明の１つの実施態様では、標的の１つまたはそれ以上の生物学的活性を阻害する能力により核酸リガンドが好ましい。このような場合、核酸リガンドが目的の生物学的活性を有効に阻害するかどうかを決めるための方法が与えられる。
　さらに、薬剤または診断目的に使用するための、より強く結合するＲＮＡリガンド、およびより小さく、より安定なリガンドを同定する方法も、本発明に含まれる。
　本発明はＨＩＶ−ＲＴとＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクに対する改良された核酸リガンドを含む。また本発明は、特に本明細書で同定された核酸リガンドと実質的に相同であり、そして実質的にこれと同一のＨＩＶ−ＲＴまたはＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクに結合する能力を有する核酸配列も含む。
　また本発明の範囲には、伸長した核酸リガンドを同定するための連続的なセレックス実験を実施する方法も含まれる。特に、ＨＩＶ−ＲＴに対する伸長した核酸リガンドが開示される。伸長したＨＩＶ−ＲＴ核酸リガンドと実質的に相同であり、そして実質的にこれと同一のＨＩＶ−ＲＴに結合する能力を有する核酸配列もまた、本発明に含まれる。
　本発明の範囲にはＨＩＶ−１　ｔａｔタンパクに対する核酸リガンドが含まれる。さらに具体的には、ｔａｔタンパクに結合できるＲＮＡ配列が同定されている。図２６と２７に示される核酸リガンドの解が、本発明に含まれる。
　さらに、ａ）核酸の候補混合物を調製し；ｂ）該候補混合物のメンバーをｔａｔタンパクに対する親和性に基づいて分画し；そしてｃ）選択された分子を増幅して、ｔａｔタンパクに対して相対的に高い結合親和性を有する核酸配列が濃縮された、核酸の混合物を得る工程よりなる、ＨＩＶ−１　ｔａｔタンパクに対する核酸リガンドとリガンドの解を同定する方法が、本発明に含まれる。
　さらにトロンビンに対する核酸リガンドが、本発明に含まれる。さらに具体的には、トロンビンに結合できるＲＮＡ配列が同定されている。本発明には図２９と３０に示される核酸リガンドの解が含まれる。
　さらに、ａ）核酸の候補混合物を調製し；ｂ）該候補混合物のメンバーをトロンビンに対する親和性に基づいて分画し；そしてｃ）選択された分子を増幅して、トロンビンへの相対的に高い結合親和性を有する核酸配列が濃縮された、核酸の混合物を得る工程よりなる、トロンビンに対する核酸リガンドとリガンドの解を同定する方法が、本発明に含まれる。
　さらに具体的には、本発明は、図２９に示したリガンド（配列ＩＤ番号：１３７−１５５）を含む、上述の方法により同定されたトロンビンに対するＲＮＡリガンドを含む。さらに本発明には、任意の特定のリガンドと実質的に相同であり、そして実質的に同一のトロンビンに結合する能力を有する、トロンビンに対するＲＮＡリガンドも含まれる。さらに本発明には、本明細書に記載されたリガンドと実質的に同一の構造を有し、そして実質的に同一のトロンビンに結合する能力を有する、トロンビンに対するＲＮＡリガンドが含まれる。
　さらに本発明には、ｂＦＧＦに対する核酸リガンドが含まれる。具体的には、ｂＦＧＦに特異的に結合できるＲＮＡ配列が提供される。本発明には表ＩＩ−ＩＶ（配列ＩＤ番号：２７−８９）に示される核酸リガンド配列が含まれる。
　また本発明には、ｂＦＧＦの阻害物質である、ｂＦＧＦの核酸リガンドも含まれる。具体的には、リセプターへのｂＦＧＦの結合を阻害するＲＮＡリガンドが同定され、記載される。
　さらに本発明には、ａ）核酸の候補混合物を調製し；ｂ）該候補混合物のメンバーをｂＦＧＦに対する親和性に基づいて分画し；そしてｃ）選択された分子を増幅して、ｂＦＧＦへの相対的に高い結合親和性を有する核酸配列が濃縮された、核酸の混合物を得る工程よりなる、ｂＦＧＦに対する核酸リガンドとリガンド配列を同定する方法が含まれる。
　さらに具体的には、本発明は表ＩＩ−ＩＶに示したリガンドを含む、上述の方法により同定されたｂＦＧＦに対するＲＮＡリガンドを含む。さらに本発明には任意の特定のリガンドと実質的に相同であり、そして実質的に同一のｂＦＧＦに結合する能力を有する、ｂＦＧＦに対するＲＮＡリガンドも含まれる。さらに本発明には、本明細書に記載されたリガンドと実質的に同一の構造を有し、そして実質的に同一のｂＦＧＦを阻害する能力を有する、ｂＦＧＦに対するＲＮＡリガンドが含まれる。
　本発明はまた、本明細書で同定された核酸リガンド配列に基づく修飾ヌクレオチド配列とその混合物も含む。具体的には、ＲＮＡリガンドのインビボ安定性を増加させるために、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置を修飾した、ＲＮＡリガンドが本発明に含まれる。塩基配列の特異的変化、および核酸または非核酸部分の原化合物への付加を含む、ＲＮＡリガンドに対する他の修飾が本発明に包含される。
発明を実施するための形態
　本出願は、セレックスと呼ばれる核酸リガンドを同定するための方法の拡張と改良である。セレックス法は、「核酸リガンド」という標題で１９９１年６月１０日に出願された合衆国特許出願番号０７／７１４，１３１号、および「指数的濃縮によるリガンドの系統的進化」という標題で１９９０年６月１１日に出願された合衆国特許出願番号０７／５３６，４２８号、および「核酸リガンド」という標題で１９９１年１２月２６日に公開されたＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９１／１９８１３号に詳細に記載されている。これらの出願の全文は、セレックス方法の定義と説明を含めて（しかしこれに制限されない）、参照により具体的に本明細書に取込まれている。
　本出願は、基本的セレックス方法に基づく、改良された核酸リガンドを同定し産生するための方法を含む。本出願は、本発明の下記の実施態様を包含する異なるセクションを含む：Ｉ．セレックス方法；ＩＩ．セレックスを実施した後の改良された核酸リガンドを同定する技術；ＩＩＩ．連続セレックス実験−ウォーキング法（ｗａｌｋｉｎｇ）；ＩＶ．共分散分析によるリガンドの構造の解明；Ｖ．ＨＩＶ−ＲＴの改良された核酸リガンドの解明（実施例１）；ＶＩ．伸張された核酸リガンドを同定するためのＨＩＶ−ＲＴ核酸リガンドを用いるウォーキング法実験の実行；およびＶＩＩ．ＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクの改良された核酸リガンド（実施例２）；ＨＩＶ−１　ｔａｔタンパクに対する核酸リガンド（実施例３）；トロンビンへの核酸リガンド（実施例４）；およびｂＦＧＦに対する核酸リガンド（実施例５）の解明。
　ＨＩＶ−ＲＴとＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクに対する改良された核酸リガンドが、本明細書に開示され、特許請求される。本発明は、本明細書中で同定された特異的核酸リガンドを含む。本発明に包含されるリガンドの範囲は、本明細書中で記載される方法により同定されたＨＩＶ−ＲＴとＲｅｖタンパクの全てのリガンドに拡大される。さらに具体的には、本発明は、本明細書中で同定された核酸リガンドと実質的に相同であり、生理的条件下でＨＩＶ−ＲＴまたはＲｅｖタンパクに結合する、実質的にこれらと同一の能力を有する核酸配列を含む。実質的に相同とは、相同の程度が７０％以上、最も好ましくは８０％以上であることを意味する。実質的に相同とはまた、塩基対形成領域を含む核酸リガンドの領域での塩基対フリップ（ｆｌｉｐｓ）も含む。ＨＩＶ−ＲＴまたはＲｅｖタンパクに結合する実質的に同一の能力とは、親和性が本明細書中で記載された核酸リガンドの親和性の大きさと２桁の範囲内にあり、そして好ましくは１桁の大きさの範囲内にあることを意味する。ある配列が、本明細書中で同定された配列と実質的に相同であり、ＨＩＶ−ＲＴまたはＲｅｖタンパクに結合する実質的にこれらと同一の能力を有するかどうかを決定することは、当業者にとって特別難しいことではない。
Ｉ．セレックス方法．
　最も基本的な形では、セレックス方法は以下の一連の工程により定義される：
　１）異なる配列の核酸の候補混合物を調製する。候補混合物は、一般に固定配列の領域（すなわち、候補混合物の各メンバーは同一位置に同一配列を含有する）とランダム化した配列を含む。固定配列領域は、ａ）以下に記載される増幅工程を援助するため；ｂ）標的に結合することが公知の配列の模倣を促進するため；またはｃ）候補混合物中の、特定の構造配置の核酸の濃度を上昇させるために、選択される。ランダム化された配列は、完全にランダム化（例えば、任意の位置の塩基を見い出す確率が４分の１）されるか、または一部のみがランダム化（例えば、任意の位置の塩基を見い出す確率が０と１００パーセントの間の任意のレベルを選択されうる）されていてよい。
　２）候補混合物を、標的と候補混合物のメンバー間の結合に都合のよい条件下で、選択された標的に接触させる。これらの状況下では、標的と候補混合物の核酸間の相互作用により、標的と、標的に対する最も強力な親和性を有する核酸との間の核酸−標的対を形成すると考えられる。
　３）標的に対して最も高い親和性を有する核酸は、標的に対して低い親和性を有する核酸から分画される。高親和性核酸に相当する極く少数の配列（おそらく１分子の核酸）しか候補混合物中に存在しないため、一般に、分画中かなりの量（約５−５０％）の核酸が候補混合物に残るように、分画の基準を設定することが必要である。
　４）分画中、標的に対して相対的に高い親和性を有するとして選択された核酸は次に、標的に対して比較的に高い親和性を有する核酸中で濃縮される新規な候補混合物を生成させるために増幅される。
　５）前述の分画と増幅工程を繰り返すことにより、新規に形成される候補混合物のユニークな配列の割合は徐々に少なくなり、標的に対する核酸の親和性の平均の程度は一般に上昇する。極言すれば、セレックス方法は、標的分子に対する最も高い親和性を有する、元の候補混合物からの核酸である１つあるいは少数のユニークな核酸を含有する候補混合物を生成する。
　セレックス特許出願は、この方法を非常に詳細に記載している。ここには、この方法に使用することができる標的；最初の候補混合物の調製方法；候補混合物内の核酸を分画する方法；および分画した核酸を増幅して濃縮した候補混合物を生成する方法も含まれる。セレックス特許出願はまた、核酸結合タンパクであるタンパクとそうでないタンパクの両者を含む、多くの標的種に対して得られたリガンド溶液を記載している。
　セレックスは、標的分子の高親和性リガンドを提供する。これは、核酸研究の分野で前例のない、非凡な功績を表す。本発明は、目的の特徴を有する新規な核酸リガンドを開発するために、セレックスによるリガンド溶液を取る方法に関する。特定の核酸リガンドについての目的の特徴は種々である。全ての核酸リガンドは、標的種と複合体を形成することができる。ある場合には、核酸リガンドは標的の１つまたはそれ以上の生物活性を修飾するように作用することが好ましい。他の場合には、核酸リガンドは標的の存在を同定するのに役立ち、そして標的の生物活性に及ぼす効果は無関係である。
ＩＩ．セレックス実施後の改良された核酸リガンドを同定する技術。
　薬剤としての使用に好ましい核酸を産生するために、核酸リガンドは、１）標的に対して目的の効果を達成できる方法で標的に結合し；２）目的の効果を得るために可能な限り小さく；３）可能な限り安定であり；そして４）選択された標的に特異的なリガンドであることが好ましい。全てではないが、ほとんどの状況で、核酸リガンドが標的に対して可能な限り最も高い親和性を有することが好ましい。治療中の分解とその場でのクリアランスに対する抵抗性、種々の組織あるいは細胞膜障壁を超える能力、または標的分子に対する親和性を有意に妨害しない他の付加的な特性を与えるリガンドの修飾または誘導体化も、改良として与えられてよい。本発明は、セレックス実施後の改良された核酸リガンドを入手する方法を含む。
　標的分子機能に及ぼすリガンド効果の測定。セレックスにより得られた核酸リガンドの用途の１つは、標的分子の機能に変化させるリガンドを見い出すことである。リガンド分析はセレックス濃縮の間に遭遇するよりもはるかに多くの作業を要するため、まず標的タンパクの機能の阻害または増強を最初に測定するのは良い方法である。クローニングと配列決定の前に、組み合わせたリガンドプールのこのような機能試験を実行することもできる。選択された標的の生物学的機能についての測定は、一般に当業者に利用可能で公知であり、核酸リガンドの存在下で阻害が起こるかどうか決定することを容易に実施できる。
　リガンドの親和性測定。　セレックス濃縮は、標的分子に対するおそらく種々の親和性を有する多くのクローン化リガンドを与える。配列比較は、モチーフへのリガンドの分類を可能にする、コンセンサス２次構造と１次配列をもたらすかも知れない。クローン化配列の全集団中に単一のリガンド配列（いくらかの変異を有する）がしばしば見い出されるが、リガンドの配列クローン化集団中の単一のリガンド配列の表現の程度は、標的分子の親和性に絶対的には相関しない。従って、ただ多量にあることがセレックス後の「勝者」を判定する唯一の基準ではなく、配列比較により到達するコンセンサスの重要性を重み付けるために、種々のリガンド配列（配列分析により見つけられる各モチーフを適切に定義する）についての結合測定が必要である。配列比較と親和性測定の組み合わせが、さらに拡大したリガンドの性状解析のための候補の選択へと導くはずである。
　情報境界測定。特異的親和性に相当する配列の量を決定するための重要な接近手段は、リガンド配列中のその情報の境界を確立することである。これは便利には、情報の５’と３’境界が見つけられるように、加水分解された目的のリガンドのプールから、末端標識した断片を選択することにより達成される。３’境界を決定するために、ＰＣＲリガンドのインビトロ大規模転写を実施して、増強スクリーン上へのＵＶ遮蔽を使用してＲＮＡをゲル精製し、精製されたＲＮＡをホスファターゼ処理し、充分にフェノール抽出し、３２Ｐでキナーゼにより標識し、そして標識産物をゲル精製する（ガイドとしてゲルのフィルムを使用する）。生じた産物は、次にリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｔ１による予備的部分消化（異なる酵素濃度と時間で、７Ｍ尿素、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．２の緩衝液中で５０℃で）と、アルカリ性加水分解（５０ｍＭＮａＣＯ３で、１Ｍ重炭酸と炭酸溶液を予め混合することによりｐＨ９．０に調整して；９５℃で２０から６０分間の範囲で試験）を行う。一旦アルカリ性加水分解の最適条件が確立すると（従って小断片から大断片まで等しく分散する）、スケールアップして標的による選択のために十分な物質を得ることができる（通常はニトロセルロースフィルターで）。次に、標的タンパク濃度を最も低い飽和タンパク濃度から、リガンドの結合測定により測定された約１０％のＲＮＡが結合するタンパク濃度まで変化させて、結合測定を組み立てる。標的の絶対量を減らすよりは（標的の供給が許すならば）むしろ容量を増やすことにより標的濃度を変化させるべきである；フィルターに結合するＲＮＡの量は標的の絶対量により制限されるため、これは良好なシグナル対ノイズ比を与える。ＲＮＡはセレックスにおけるように溶出され、次にＴ１部分消化物と一緒に変性ゲルに流され、従って加水分解バンドの位置がリガンド配列に関係づけることができる。
　５’境界は同様に決定される。大規模なインビトロ転写物が上述のように精製される。ＲＮＡの３’末端を標識する２つの方法がある。１つの方法は３２ＰでＣｐをキナーゼ処理（または３２Ｐ−Ｃｐを購入する）し、ＲＮＡリガーゼで精製されたＲＮＡに結合させる。次に標識したＲＮＡを前述のとおり精製して、同一の実験を行う。もう１つの方法は、未標識ＲＮＡを部分アルカリ性加水分解して、バンド位置の測定としてアニーリングし、標識したプライマーを逆転写酵素で伸長させることである。ｐＣｐ標識法に対する利点の１つは、方法の簡便性、境界と相互に関連させることができるより完全なラダー配列決定（ジデオキシ鎖終末配列決定による）、および測定可能な産物量が多いことである。不利な点は、溶出したＲＮＡの伸長は、時々人工的な停止を含有することであるため、洗浄なしで出発物質をニトロセルロースフィルター上にスポットし、溶出し、投入ＲＮＡとして測定することにより制御することが重要である。
　その結果、標的に結合する高親和性に要する配列情報の境界を見い出すことが可能である。
　教示的な例は、ＨＩＶ−ＲＴの核酸リガンドに見い出される情報の境界の測定である。（１９９１年６月１０日に出願された合衆国特許出願番号０７／７１４，１３１号と、「核酸リガンド」という標題の１９９１年１２月２６日に公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１９８１３号を参照のこと）。これらの実験は、以下に詳しく記載される。濃縮ＲＮＡの元のプールは、ＨＩＶ−ＲＴへの少数の特異的リガンドをもたらした（１つのリガンドである１．１は全集団の１／４を占め、ニトロセルロース親和性配列は１／２を、そして少数のＲＮＡはそのどちらにも親和性がなかった）。２つの高親和性ＲＴリガンドは、配列．．．ＵＵＣＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＧＧＡＡＡＡ．．．．（配列ＩＤ番号：６）を共有していた。両リガンドの境界実験は、明白な３’境界と、やや明白さに欠ける５’境界を確立した。境界実験と２次セレックス実験から、最も高親和性のリガンドは、必須情報　ＵＣＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＧＧＡＡＡＡＮ’Ｎ’Ｎ’Ｎ’（配列ＩＤ番号：７）（ここでＮ’は、ＵＣＣＧのＣＧＧＧへの対生成により形成されるヘアピンの８塩基ループ配列中のＮに対する塩基対）を含有し、５’Ｕは小さな欠失があっても親和性には重要でないことが推測される。本出願で、モデル化合物の構築により、１つだけの５’Ｕの配列は２つの５’Ｕ’のものに比べて親和性に差がない（２つのリガンドの比較により共有される）こと、両方のＵ’の除去は親和性に５倍の低下をもたらし、次のＣの除去は親和性にさらに劇的な損失をもたらすことが確認された。境界実験で明白に見えた３’境界は、さほど顕著ではなかった。この新規な情報は、３’末端で重要なものは（軸１の２つの鎖間をループする配列に）少なくとも３つの塩基対のヌクレオチドを有することであるということを導き出すために使用できる。２つだけの塩基対ヌクレオチドでは、１２倍の親和性低下をもたらす。３’塩基対ヌクレオチドがない場合（ループ２の末端で切った時）は、親和性は約７０倍低下する。
　親和性への個々のヌクレオチドの貢献度の定量的および定性的評価。
　２次セレックス。一旦最小の高親和性リガンド配列が同定されると、それは標的分子との相互作用に決定的な境界内のヌクレオチドを同定するのに有用である。１つの方法は、高親和性リガンド配列の全てのヌクレオチドが部分的にランダム化されているか、またはランダム化が異なるブロックに完全にランダムなブロックが散在している、新規ランダム鋳型を作ることである。このような「２次」セレックスは、決定的なヌクレオチドまたは構造が絶対的に保存されていて、さほど決定的でない特徴は優先され、そして重要でない位置は不偏である、リガンド配列のプールを生成する。こうして２次セレックスは、比較的少数のリガンド配列に基づくコンセンサスをさらに精巧に作り上げるのを助ける。さらに、元のセレックスでは未定の配列を有する高親和性リガンドでさえ、提供されることもある。
　本出願で我々は、ＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクのリガンドのこのような偏ったランダム化を示す。１９９１年６月１０日に出願された合衆国特許出願番号０７／７１４，１３１号と、「核酸リガンド」という標題の１９９１年１２月２６日に公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１９８１３号で、ＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクに対する核酸リガンドが記載された。これらのリガンド配列の１つは、他の全てのリガンド配列よりも高い親和性で結合した（図１２に示されるＲｅｖリガンド配列６ａ）が、クローンされ配列決定された５３単離体中２つだけのコピーとして存在した。本出願で、６ａ配列の（ＲｅｖリガンドモチーフＩの他のものへの相同性により定義されるＲｅｖタンパク結合部位からなる部分の配列に限定された）各ヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド合成の間に他の３つのヌクレオチドと６２．５：１２．５：１２．５：１２．５の比で混合された、２次セレックス実験に、この配列は組み込まれた。例えば、オリゴ合成中に位置Ｇ１にこの配列が組み込まれると、Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣの試薬は６２．５：１２．５：１２．５：１２．５の比で混合される。Ｒｅｖタンパクを使用して６回のセレックスの後に、さらに包括的なコンセンサスした記述が得られるように、この混合物からリガンドをクローン化した。
　ヌクレオチド置換。別の方法は、セレックスのコンセンサスが混乱する場合に、オリゴ転写した変異体を試験することである。前述のとおり、これは、ＨＩＶ−ＲＴを結合するのに必要な情報の５’と３’境界の性質を理解する助けとなった。添付した実施例に示すように、これは、ＨＩＶ−ＲＴにせ結び目の軸１内でヌクレオチドのコンセンサスを定量する助けとなった。
　化学修飾。別の１組の有用な技術が、化学修飾実験として包括的に記載される。このような実験は、変性した状態の修飾パターンと非変性のものを比較することにより、ＲＮＡの非変性構造を探るために使用される。次に標的分子に結合されることになるＲＮＡリガンドの化学修飾パターンは、非変性パターンとは異なり、標的分子の結合による構造の変化、または標的分子による基の保護を示している。さらに、リガンドの結合構造に決定的な位置でまたは標的分子との相互作用に決定的な位置で修飾されると、標的分子はＲＮＡリガンドに結合しない。これらの位置が同定されるこのような実験は、「化学修飾妨害」実験として記載される。
　当業者に公知の、このような実験を行うための種々の利用可能な試薬がある（アーレスマン（Ｅｈｒｅｓｍａｎｎ）ら（１９８７）　Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．　１５：９１０９を参照のこと）。塩基を修飾する化学物質は、リガンドＲＮＡを修飾するために使用できる。リガンドのプールは種々の濃度で標的に結合し、結合したＲＮＡは（ほとんど境界実験の場合のように）回収され、溶出されたＲＮＡは修飾について分析される。測定は、逐次の修飾依存性の塩基の脱離および塩基のない位置でのアニリン切断であるか、あるいは感受性のある（修飾された）位置の逆転写測定法による。このような測定法では、標的タンパクで選択したＲＮＡ中の他のバンドに対して消失する未選択のＲＮＡ中の（修飾された塩基を示す）バンドが、現れたりする。エチルニトロソ尿素による同様の化学修飾、または混合した化学的合成、あるいは例えばリボースの２’−メトキシまたはホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）による酵素的合成が、基本骨格上の必須な原子団を同定するために使用できる。２’−メトキシ対２’−ＯＨ混合物を用いる実験では、本質的なＯＨ基の存在は、標的により厳しく選択された分子の他の位置に関して加水分解の増大をもたらす。
　リガンドに関する有用な情報を得、その機能的安定性を改良する努力を助けるための化学修飾の利用の例を、ＨＩＶ−ＲＴについて以下に示す。エチルニトロソ尿素修飾妨害により、修飾が結合を妨害した５つの位置と、劇的に妨害したこれらの位置の２つが同定された。リガンドの塩基上の種々の原子団の修飾もまた、ＨＩＶ−ＲＴとの相互作用に決定的であるとして同定された。これらの位置は主に５’らせん中、およびセレックス系統発生で高度に保存される架橋ループ配列（ｂｒｉｄｇｉｎｇ　ｌｏｏｐ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（図１の軸Ｉとループ２）にあった。これらの実験は系統発生の有効性を確認しただけでなく、さらに安定なＲＮＡを作るための進行中の試みに情報を与えた。基本骨格のリボース部分に全ての位置で２’−メトキシを有するＲＴリガンドが合成された。結合したこの分子はＨＩＶ−ＲＴに対する親和性が劇的に低下した。先の修飾妨害実験とセレックス系統発生比較に基づいて、３’らせん（図１の軸ＩＩ）は本質的にこの分子の構造成分であることが決定された。次にそのらせんの１２のリボース残基が２’−メトキシであるリガンドが合成され、これはＨＩＶ−ＲＴに高親和性で結合した。残る１４残基の２’−ＯＨのいずれかが結合に特に必要であるかを調べるために、全てのリボースがにせ結び目である分子を２’−ＯＨと２’−メトキシ形成のための混合等モル（経験的に最適と決定した）試薬で合成した。この混合物からＨＩＶ−ＲＴを選択した後、アルカリ性加水分解により、これらの位置に２’ヒドロキシルが支配的であることを示す増強された加水分解のバンドが現れる。この実験の解析により、ＨＩＶ−ＲＴへの高親和性結合のためには、残基（Ｇ４、Ａ５、Ｃ１３およびＧ１４）は２’−ＯＨを有さなければならないという結論が導かれた。
　結合リガンドと未結合リガンドのバンドの強度の比較により、結合を妨害する修飾だけでなく、結合を増強する修飾も明らかになるかも知れない。正確にこの修飾でリガンドを作成し、親和性の増強について試験する。こうして化学修飾実験は、ちょうど「ウォーキング」（下記を参照のこと）が隣接ドメインとの追加的なヌクレオチドレベルの接触のためであるように、標的分子との追加的な局所的接触を探索する方法でありえる。
　セレックス方法の生成物の１つは、そのコンセンサスに基づく設計のオリゴヌクレオチドの化学合成または酵素的合成を可能にする、１次と２次構造のコンセンサスである。セレックスの複製機構はサブユニットレベル（例えばリボヌクレオチド）で、いくぶん変動が制限されていることが必要なため、このようなリガンドは標的分子の結合表面の利用可能な原子空間を不完全に満たす。しかしこれらのリガンドは、標的分子と追加的に接触するように誘導体化できる高親和性の骨格として考えることができる。さらに、コンセンサスは、結合に直接関係のある原子団記述子と、関係のある原子団相互作用に符合する原子団記述子を含有する。例えば、ＨＩＶ−ＲＴのにせ結び目リガンドの各リボヌクレオチドは、リボース上に２’ヒドロキシル基を含有するが、にせ結び目リガンドのリボースの２つだけはこの位置で２’−メトキシで置換できない。リボヌクレオチド混合物を有するデオキシリボヌクレオチド混合物を用いる同様な実験（２’−メトキシと２’ヒドロキシ混合物で行ったように）により、ＨＩＶ−ＲＴ結合にとって重要でないリボースおよびその数が明らかになる。２’位をさらに極端な置換をした同様な実験により、２’位の許容される置換も明らかになる。この方法により、ＨＩＶ−ＲＴに対して高親和性を与えるにせ結び目リガンドの誘導体を見つけることができると予測される。このような誘導体化は、標的タンパクへ直接的な共有結合を特異的に可能にする架橋剤の使用を除外しない。このような誘導体化分析はリボースの２’位に限定されず、ヌクレオチドリガンドの塩基または基本骨格の任意の位置の誘導体化を含有する。
　この分析を論理的に拡張すると、ポリマー性リガンドの１つまたは少数のヌクレオチドが、化学的誘導体探索のための部位として使用される状況になる。リガンドの残りの部分は、結合に対する非妨害性と親和性の増強が試験されるモノマー（またはモノマー群）を、きちんと繋ぎ止めるのに役立つ。このような探索により、最初のリガンドの骨組の構造をまね、その核酸の骨組とは独立の標的分子に対して有意で特異的な親和性を有する低分子が得られるであろう。大量生産、臨床上の投与経路、体内送達、クリアランスまたは分解の面で最初のセレックスリガンドに比べて利点を有する、このような誘導体化されたサブユニットは、治療薬になり元のリガンドの痕跡をほとんど残さない。すなわちこのアプローチはセレックスの追加的な有用性である。セレックスリガンドは、標的機能に重要であることが知られている標的分子上の定義された部位に向けられた化学探索を可能にしている。
　構造決定。これらの努力は、ＨＩＶ−ＲＴに対するリガンドの配列と構造依存性会合を確認し評価する助けになった。リガンド／標的分子複合体の原子レベルでの解析を可能にするために、別の方法が実施される。これらは、ＮＭＲ分光学とＸ線結晶学である。そのような構造を手にして、次に、セレックスにより供給された進化したリガンドの改良として、合理的な設計をすることができる。核酸構造のコンピューターモデル化は以下に記載される。
　化学修飾。本発明は、リガンドのインビボの安定性を増強するために、あるいはリガンドの体内送達を促進または媒介するために、いくつかの化学修飾をされた核酸リガンドを含む。このような修飾の例は、特定のＲＮＡ配列のリボースおよび／またはリン酸位置での化学置換を含む。例えば、クック（Ｃｏｏｋ）らのＰＣＴ出願ＷＯ９２０３５６８号；シナジ（Ｓｃｈｉｎａｚｉ）らの合衆国特許５，１１８，６７２号；ホッブス（Ｈｏｂｂｓ）ら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１２：５１３８；グシュルバウアー（Ｇｕｓｃｈｌｂａｕｅｒ）ら（１９７７）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　４：１９３３；シバハル　（Ｓｈｉｂａｈａｒｕ）ら（１９８７）　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１５：４４０３；ピーケン（Ｐｉｅｋｅｎ）ら（１９９１）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５３：３１４を参照のこと（これらは各々参考のため本発明に特に引用されている）。
ＩＩＩ．連続セレックス実験　−　ウォーキング法
　本発明の１つの実施態様では、ある標的について最小コンセンサスリガンド配列が決定された後に、この最小コンセンサスリガンド配列にランダム配列を追加して、標的とさらに（おそらく分離してはいるが隣接したドメインに）接触させることが可能である。この方法はセレックス特許出願では「ウォーキング法」と呼ばれている。ＨＩＶ−ＲＴに対する結合が増強されたリガンドを開発するため、ウォーキング法プロトコールの使用の成功例を以下に示す。
　ウォーキング法実験は、連続して実施される２つのセレックス実験を含む。この候補混合物の各メンバーが、セレックス由来の核酸リガンドに対応する固定された核酸領域を有するように、新しい候補混合物が生成される。候補混合物の各メンバーはまた、配列のランダム化された領域も含有する。本方法により「伸長した」核酸リガンドと呼ばれるもの（これは標的の２つ以上の結合ドメインに結合する領域を含有する）を同定することが可能である。
ＩＶ．共分散分析によるリガンドの構造の解明
　本発明は、核酸の３次元構造の決定のための経験的方法と共に、核酸リガンドの構造の決定のためのコンピューターモデル化方法を含む。
　２次構造予測は、配列の整合を修正するための有用なガイドである。またこれは、Ａ型らせんの外形中にいくつかの塩基を無理に入れることにより、３Ｄ構造予測を修正するための有用な手段である。
　２次構造の安定性を計算するためのエネルギーパラメーターの表が存在する。初期の２次構造予測プログラムは、配列により形成される塩基対の数を単に最大にすることを試みたが、最も最近のプログラムは、これらの熱力学パラメーターにより計算される最小の自由エネルギーを有する構造を見い出そうとしている。このアプローチには２つの問題がある。第１に、熱力学の規則は、（典型的には１０％位まで）本質的に不正確であって、全体の最小エネルギーの１０％以内に多くの異なる可能な構造が存在する。第２に、実際の２次構造は、配列の折り畳みと合成の動力学に依存しており、全体の最小エネルギー状態に存在しない。それにも拘らず短い配列については、形成できる可能な構造が非常に限られているため、これらの警告はさして重要ではない。
　力ずくの予測方法がドット−プロットである：それ自体に対して配列のＮ×Ｎプロットを作り、塩基対が可能なところ全部にＸの印をつける。Ｘの斜行路が、可能ならせんの位置を示す。次に包括的枝分かれ検索方法は、長さＬまたはそれ以上の融和性のある（すなわち重複のない）らせんのすべての可能性の形態を検索して；これらの構造についてエネルギー計算をして、可能性の程度をランク付けする。この方法の利点は、にせ結び目配置を含む全ての可能な形（トポロジー）が試験され、そしていくつかの次善の構造が自動的に生成されることである。この方法の欠点は、これが最悪の場合には、配列のサイズの指数関数因子に時間比例して作動して、全体の最小値を見い出す程深くは見えない（配列のサイズと使用された実際の枝分かれ検索方法に依存して）ことである。
　賢明な（そして現在最も使用されている）予測方法は、ズーカー（Ｚｕｋｅｒ）のプログラム（ズーカー（１９８９）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：４８）である。元々はルス・ヌシノフ（Ｒｕｔｈ　Ｎｕｓｓｉｎｏｖ）により開発されたアルゴリズムに基づいて、ズーカープログラムは、にせ結び目配置は許容しないという大きな簡素化仮定をしている。これによりわずかＮ３からＮ４（ここでＮは配列の長さである）に比例する時間に作動する、動的なプログラム法の使用が可能になる。このズーカープログラムは、数百以上のヌクレオチドの配列を厳密に扱うことができる唯一のプログラムであるため、生物学者により最も一般的に使用されるようになった。しかし、いくつかの異なるセレックス実験において、いくつかのにせ結び目になったＲＮＡ構造が得られた（そしてそれは目で認識された）という点で、ズーカープログラムがにせ結び目になった配置を予測できないということは、致命的な欠陥である。にせ結び目になった配置を予測できる、力ずくの方法を使用しなければならない。
　本発明の比較配列分析の主要な要素は、配列共分散である。共分散は、１つの位置の本体が別の位置の本体に依存している時である；例えば、必要なワトソン−クリック塩基対は、２つの位置の１つの情報が、もう１つの位置の絶対的な情報を与えるという点において、強力な共分散を示す。共分散分析は以前、共通構造を有する多くの関連配列（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびグループＩイントロン）が存在するＲＮＡの２次構造を予測するために使用された。今や共分散分析が、３次の接触にも使用できることが明白となった。
　ストルモとグーテル（Ｓｔｏｒｍｏ　ａｎｄ　Ｇｕｔｅｌｌ）は、整列した配列のセット中の２つの位置間の共分散の量を正確に測定するアルゴリズムを設計し実行した。このプログラムは「ミキシー」（ＭＩＸＹ）（位置ＸとＹでの相互情報（Ｍｕｔｕａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｔ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　Ｘ　ａｎｄ　Ｙ））と呼ばれる。
　整列した配列のセットを考える。各カラムまたは位置で、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、およびギャップの出現の頻度が計算される。これを頻度ｆ（ｂｘ）、すなわち塩基ｂのカラムｘでの頻度と呼ぶ。次に１度に２つのカラムを考える。ある塩基ｂがカラムｘに現れる頻度はｆ（ｂｘ）、そしてある塩基ｂがカラムｙに現れる頻度はｆ（ｂｙ）である。もし位置ｘと位置ｙが他方に関係ない（すなわちこれらの位置が独立である）ならば、共分散はなく、どの配列でも位置ｘとｙに塩基ｂｘとｂｙを観察する頻度は、ｆ（ｂｘｂｙ）＝ｆ（ｂｘ）ｆ（ｂｙ）のはずである。観察される対の頻度に、予想される頻度からの実質的な偏差があるならば、これらの位置は共分散すると言われる。期待値からの偏差の量は、情報尺度Ｍ（ｘ，ｙ）（ｘとｙの相互情報）で定量化される：
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｆ（ｂｘｂｙ）
Ｍ（ｘ，ｙ）＝Σｆ（ｂｘｂｙ）Ｉｎ―――――――――――
　　　　　　ｂｘｂｙ　　　　　　　　　ｆ（ｂｘ）ｆ（ｂｙ）
　Ｍ（ｘ，ｙ）は、位置ｘの本体を認識することから位置ｙを認識することから、位置ｙに関する情報のビット数として記述される。もし共分散がないなら、Ｍ（ｘ，ｙ）はゼロであり；Ｍ（ｘ，ｙ）の大きな値は強い共分散を示す。
　本方法はｔＲＮＡ配列のデータセットに適用された時に、これらの数は３次構造中の密接な物理接触の確率に極めてよく相関した。２次構造は、Ｍ（ｘ，ｙ）値のピークとして極めて明白であり、結晶構造から知られた多くの３次接触もまたピークとして現れる。
　これらの共分散値は３次元構造予測を開発するのに使用できるかもしれない。
　いくつかの面で、この問題はＮＭＲによる構造決定の問題に似ている。最後に実際の電子密度地図が得られる結晶学とは異なり、ＮＭＲは一連の原子間距離を与える。得られる原子間距離の数により、それらが一致する１つ、少数、または多くの３Ｄ構造が現れる。原子間距離のマトリックスを３Ｄ空間の構造に変換するために、数学的手法を開発する必要があった。使用される２つの主要な技術は、距離幾何学と制御された分子動力学である。
　距離幾何学は、より形式的な純粋に数学的手法である。原子間距離は、Ｎ次元空間（ここでＮは原子の数である）中の座標と考えられる。言い換えると、原子の「位置」は、我々が普通に考える３つ（ｘ，ｙ，ｚ）の代わりに、他の全ての原子へのＮ個の距離により特定される。全原子間の原子間距離は、Ｎ×Ｎ距離マトリックスに記録される。完全で正確な距離マトリックスは、行列代数演算を使用して、容易に３×Ｎデカルト座標に変換される。ＮＭＲに適用した距離幾何学の要領は、不完全（少数の原子間距離のみが知られている）で不正確なデータ（距離はせいぜい数オングストロームの確度まで知られている）を扱うことである。このように距離幾何学に基づく構造計算の多くの時間は、距離マトリックスを前処理し、未知の距離値の範囲を既知のものに基づいて計算し、既知のものの範囲を限定することに費される。通常、一連のＮＭＲデータに一致する距離マトリックスから多数の構造が抽出され；もしこれらがすべてうまく重複していれば、このデータは唯一の構造を決めるのに十分であった。ＮＭＲ構造決定とは異なり、共分散は不正確な距離値だけを与えるが、しかしこれはある距離の制約が適用されるかどうかに関して、絶対的な知識よりは見込みがある。
　制御された分子動力学は、より特別な方法である。全ての原子が感じる力（ファンデルワールス力、共有結合長と結合角、静電力）を記述することを試みる実験的な力の場では、すべての原始にランダム速度（ある温度でのボルツマン分布から）を割り当てて、ニュートン動力学方程式を使用してフェムト秒間の各原子の運動を計算することにより、多くのフェムト秒時間工程の分子運動の模擬実験ができる；これが「分子動力学」である。制御された動力学において、原子が特定の距離範囲を越える時に、原子に対して余分の特別な力を割り当てる。
　本件では、制御された分子動力学を用いてデータの確率の性質を扱うのはかなり容易である。共分散値は、ある原子間のある距離範囲での人工的な力の制御に変換され；共分散の大きさに従い力の大きさを変える。
　ＮＭＲと共分散分析は、原子または位置間の距離制限を生成し、そしてそれは距離幾何学または制御された分子動力学により構造へと容易に変換される。核酸の３次元構造を決定するために利用される実験データの別の源は、化学的または酵素的保護実験であり、これらは個々の原子または位置に溶媒接近の制限を生成する。
Ｖ．ＨＩＶ−ＲＴの改良された核酸リガンドの解明
　本発明の方法の例は、ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＨＩＶ−ＲＴ）の核酸リガンドについて本明細書に示される。合衆国特許出願番号０７／７１４，１３１号と、「核酸リガンド」という標題の１９９１年１２月２６日に公開されたＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９１／１９８１３号には、ＨＩＶ−ＲＴ標的でセレックスを実施した時に得られた結果が記載されている。ＨＩＶ−ＲＴに対して高親和性を有することが見い出された核酸配列を調べることにより、核酸リガンド溶液はにせ結び目として配置されていると結論された。
　本明細書では、境界の検討により核酸リガンド溶液を表すために必要な最小数の配列を確立する実験が記載される。リガンド溶液のＨＩＶ−ＲＴへの結合に対する、溶液中の個々のヌクレオチドの寄与を評価するために使用される、リガンド溶液の変異体の構築も記載される。さらに１）予測されるにせ結び目構造を確認するため；２）ＨＩＶ−ＲＴに結合した時に、どの修飾可能な基が化学攻撃から保護される（または結合により非保護になる）かを決定するため；および３）どんな修飾がＨＩＶ−ＲＴへの結合を妨害する（おそらくリガンド溶液の３次元の修飾により）か、従っておそらく標的との近傍の接触に関与しているものを決定するために、リガンド溶液の化学修飾も記載される。
　以前に決定された核酸リガンド溶液は、図１に示される。軸１（標識されて）が保存され、軸２が比較的非保存であるＲＮＡにせ結び目（ここでＸは非保存であり、Ｘ’はＸに対して塩基対を形成する）が示される。最初のセレックスのコンセンサスでは、Ｕ１が好ましかった（コンセンサスに寄与する１８配列の内の１１でこの相対位置に存在している）が、Ａ１もしばしば（１８配列の内の６で）見い出された。Ｇ４−Ｃ１３の塩基対にＣ−Ｇが置換したものと、Ａ−Ｕが置換したものの２つの配列があった。軸１の２本の鎖に連結しているヌクレオチドの好ましい数は、８（１８配列の内の８で）であった。軸２よりなる塩基対を形成したヌクレオチドの数とパターン、およびＡ５とＡ１２の選択は、下記のようにランダム領域が構築された２次セレックスのコンセンサスから得られた：ＮＮＵＵＣＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＧＧＡＡＡＡＮＮＮＮ（配列ＩＤ番号：８）（Ｎはランダム化されている）。リガンドの１つは、ＨＩＶ−ＲＴを著しく阻害し、ＡＭＶまたはＭＭＬＶの逆転写酵素を阻害しないことが見い出された。
　情報境界の改良　３２のヌクレオチド位置がランダム化された最初の２回のセレックス実験は、軸１の５’末端に可変長のある高親和性リガンドを与えた；すなわちあるリガンドは、ＣＧＧＧＡと塩基対を形成できるＵＵＣＣＧ、ＣＧＧＧと塩基対を形成できるＵＣＣＧ、またはＣＧＧと塩基対を形成できるＣＣＧを有していた。ＨＩＶ−ＲＴとの相互作用に高親和性を供与する配列の境界の決定は、末端標識したクローン化ＲＮＡの部分アルカリ性加水分解物からの選択により達成できた。これは、高親和性リガンドは必須情報ＵＣＣＧＮＮＮＮＮＮＮＮＣＧＧＧＡＡＡＡＮＮ’Ｎ’Ｎ’（配列ＩＤ番号：７）（ここでＮ’は、ＵＣＣＧのＣＧＧＧへの対生成により形成されるヘアピンの８塩基ループ配列中のＮへの塩基対）を含有し、５’Ｕはなくても親和性の損失は小さいであろうということを示唆する、迅速で定性的な分析である。均一な状況で５’配列をより厳密に試験するために、図２に示す結合実験を実施した。オリゴヌクレオチド鋳型から転写されたＲＮＡは、左端に並ぶ四角Ａ−Ｅに示すように５’末端が変化していることを除き、図の右上隅に示す完全な配列と同じであった。その結果、ＨＩＶ−ＲＴとの最も高親和性結合のために１つの５’Ｕで十分であり（四角ＡとＢ）、Ｕがないと結合が低下し（四角Ｃ）、そしてさらに５’配列を除去すると非特異性配列なみに結合を低下させた（四角Ｄ）。本明細書で記載される残りの実験には、１つの５’Ｕ（Ｕ１）だけを有する設計（本明細書では以後リガンドＢと呼ぶ）が使用された。
　リガンドＢの３’末端で種々の３’切片を作ることにより、軸２の長さへの依存性も試験した。３’末端から３つのヌクレオチド（Ａ２４−Ｕ２６）を削除してもＨＩＶ−ＲＴに対する分子の親和性に変化はなかった。３’末端の４つのヌクレオチド（Ｃ２３−Ｕ２６）の削除は、結合を７倍低下させ、５つ（Ｇ２２−Ｕ２６）では約１２倍の低下、そして６ヌクレオチド（Ｕ２１−Ｕ２６、すなわち３’らせんなし）では約７０倍親和性の低下をもたらした。このような低下は、以下に報告される単塩基置換で見い出された低下に比べてそれほど劇的ではなく、これは（以下に報告される他のデータと共に）このらせんが、主にループ２中で非常に重要な基の位置づけを支援する構造上の役割を担うことを示唆している。
　軸１についてのセレックスコンセンサスの試験。保存される軸１中の種々のヌクレオチド置換を調製し、ＨＩＶ−ＲＴに対するこれらの親和性を測定した。図３に示すように、モデルＲＮＡでのＵ１のＡによる置換はＨＩＶ−ＲＴに対する親和性にほとんど変化を起こさなかった。この位置のＣ（これは軸１の安定性を増強する）またはＧ（前述のＵ欠失実験により表される）は、約２０倍の親和性の低下をもたらした。Ｇ１６のＡによる置換（これはＵ１と塩基対を形成する）は、特異的結合を破壊した。Ｃ２−Ｇ１５の代わりにＧ−Ｃ対を使用すると、これも結合を破壊し、Ｃ３−Ｇ１４の代わりに使用すると約１０倍結合を低下させた。これらの２つの位置はセレックスリガンドの系統発生に高度に保存されていた。種々の組み合わせでＧ４−Ｃ１３塩基対を置換した。親和性に影響したこれらの順序は、Ｇ４−Ｃ１３＝Ｃ−Ｇ＞Ｕ−Ａ＞Ａ−Ｕ＞＞＞＞Ａ−Ｃ（ここでＡ−ＵはＧ４−Ｃ１３に比べて約２０倍親和性を低下させ、Ａ−Ｃは少なくとも１００倍低下させた）であった。これらの結果は、以前測定したセレックスコンセンサスと矛盾しない。
　にせ結び目構造の化学探索。リガンドｂの非変性構造を探索するため、リガンドＢのＨＩＶ−ＲＴに対する親和性を著しく低下させる化学修飾を同定するため、そしてＨＩＶ−ＲＴによる結合に付随する構造の変化を発見するために、多くの化学修飾実験が行った。使用した化学物質は、リン酸を修飾するエチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）、Ｃ（Ｎ３で）とＡ（Ｎ１で）の塩基対形成面を修飾する硫酸ジメチル（ＤＭＳ）、Ｕ（Ｎ３で）と少量のＧ（Ｎ１で）の塩基対形成面を修飾するカルボジイミド（ＣＭＣＴ）、ＡのＮ７と少量のＧのＮ７を修飾するジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）、およびＧのＮ１とＮ２の塩基対を修飾するケトキサールである。大部分の化学修飾の測定は、標識プライマーがアニーリングされ、ＡＭＶ逆転写酵素で伸長されることができる配列を含むように長く伸ばされたリガンドＢ配列で行われた。ＥＮＵまたはＤＥＰＣで修飾された位置の測定は、各々の修飾依存性加水分解、または修飾された塩基の除去とそれに続くこの部位での基本骨格のアニリン切断を用いて、リガンドＢに行われた。
　変性リガンドＢの修飾と比較した非変性構造の探索の結果を、図４に要約する。ＥＮＵ修飾のパターンは、リガンドの変性状態と非変性状態の間に差はなく、これはにせ結び目の溶液構造には、リン酸またはプリンのＮ７位置の安定な関与がないことを示唆している。他の修飾データは、軸２はどちらかというと安定に形成されていて、示された塩基対に影響するいかなる化学修飾にも抵抗性であるが、末端Ａ６−Ｕ２６は、この位置で塩基対状態と変性状態間に平衡状態を示す修飾にいくぶん感受性であることを示唆する。１本鎖のＡ（Ａ５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、およびＡ２０）は、ＤＭＳに十分反応性であるが、Ａ５、Ａ１９、およびＡ２０はＤＥＰＣに対する反応性は減少している。軸１の塩基対は、Ｇ４−Ｃ１３＞Ｃ３−Ｇ１４＞Ｃ２−Ｇ１５＞Ｕ１−Ｇ１６（ここでＧ４−Ｃ１３は化学修飾に完全に抵抗性であり、Ｕ１−Ｇ１６は高反応性である）の、修飾に対する抵抗性の順位を表現しているようである。これは、にせ結び目のこの小さいらせんが一過性の指向性の変性、すなわち「フレイング（ｆｒａｙｉｎｇ）」を受けていることを示唆する。
　ＨＩＶ−ＲＴによる化学修飾からのリガンドＢの保護。図５に示すように、タンパクの結合は、らせんＩを安定化するか保護するかによって、らせんＩのフレイング特性を変化させる。本来は反応性のＵ１も結合により保護される。タンパクの結合は、塩基対Ａ６−Ｕ２６の感受性を増強し、これは結合状態で対になっていないことを示唆している。これは、ＲＴにより認識された非変性にせ結び目中で結合した軸１を軸２の末端に橋渡しできないため、または非変性状態から配置を変化させることにより結合がループＩの長さの要求を増大させるため、結合の間の１本鎖ヌクレオチドループＩの長さが不十分であることを示している。ループＩＩのＡ１７とＡ１９もまたＨＩＶ−ＲＴに対する結合により保護される。さらに１本鎖塩基の橋のＡ１２は、結合により保護される。
　ＲＴリガンドＢの修飾妨害の検討。ＲＮＡリガンドＢを部分的に修飾した（構造決定のため上述した全ての化学物質により）。この修飾された集団は、種々の濃度のタンパクと結合し、結合種の修飾された位置を測定した。ここから、修飾が結合を妨害するところ、修飾がまったくまたはほとんど影響を与えないところが決定できる。これらの修飾妨害結果を要約する概略図を図６に示す。ここに示すように、結合に対する有意な妨害の多くは、軸１とループ２を含有するにせ結び目の左側に集中している。これは、セレックスにより単離された配列の集合中で高度に保存されていた（１次配列）分子の一部でもあり、そしてここは置換実験によりＨＩＶ−ＲＴに対する結合親和性が最も劇的に低下したところである。
　リガンドＢのリボース上の２’−ヒドロキシルの２’−メトキシによる置換。通常のヒドロキシル基の代わりにリボースの２’炭素に２’−メトキシが結合している「ＲＮＡ」分子は、酵素的および化学的分解に抵抗性である。ＲＴリガンド中でどの程度広範に２’−メトキシが２’−ＯＨを置換できるかを試験するために、図７に示すように４つのオリゴを調製した。全部が２’−メトキシに置換されたリガンドはほとんど結合しない（リガンドＤ）ため、また大部分の修飾妨害部位はにせ結び目の１つの末端に集中していることを見い出したため、以下の置換の試みは、四角ＢとＣに示す非特異的３’らせんに限定した。これらのリガンドの両者ともＨＩＶ−ＲＴに高親和性で結合する。次に、図７のＣのように軸２のリボースに許容される置換が全ての２’−メトキシであって、残りの１４の位置で２’−メトキシおよび２’−ＯＨホスホルアミジト試薬で混合合成が行われたオリゴヌクレオチドが調製された。これらのオリゴはＨＩＶ−ＲＴにより選択し、続いて選択されたＲＮＡをアルカリ性加水分解とゲル分離を行った（２’−メトキシ体は２’−ヒドロキシル体とは異なりアルカリ性加水分解には関与しない）。フィルムの目視点検（図８参照）と、アンビス検出システム（Ａｍｂｉｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）を用いる相対強度の定量測定（以下の実施例の比較方法を参照のこと）により判定したところ、混合して組み込まれた集団からＨＩＶ−ＲＴにより選択されたリガンドは、Ｃ１３とＧ１４の位置で加水分解の著しい上昇を示し、これはこれらの位置での２’−メトキシによる妨害を示している。全ての位置がこの方法で分析された関連実験で、Ｇ４、Ａ５、Ｃ１３およびＧ１４は、２’−Ｏ−メチル妨害を示した。
　置換実験、定量境界実験および化学探索実験の結果は、ＨＩＶ−ＲＴのにせ結び目阻害物質の性質について多くの情報を与え、このＲＮＡ上の決定的な接触領域を強調していた。これらの結果は、以下のヌクレオチド毎に与えられる。
　Ｕ１をＡに置換しても親和性の損失はほとんどないが、ＣまたはＧの場合は異なる。Ｕ１はおそらくＧ１６と一時的な塩基対を生成するが、Ｕ１−Ｎ３をＣＭＣＴで修飾してもＨＩＶ−ＲＴへの結合を妨害しない。しかし、ＨＩＶ−ＲＴによる結合は、多分この位置の立体的または静電的遮蔽により、Ｕ１からＮ３を保護する。Ｇ１６とより安定な塩基対を形成するＣによる置換は、親和性を低下させる。安定なＵ１−Ａ１６対を形成するＡによるＧ１６の置換は、ＨＩＶ−ＲＴに対する特異的親和性を破壊し、Ｇ１６−Ｎ１の修飾はＨＩＶ−ＲＴへの結合を強力に妨害する。Ｇ１６−Ｎ１のこの修飾は、タンパクとの非常に重要な接触を防止するに違いない。なぜＵ１へのＧ置換が親和性を低下させて、Ａ置換はさせないかは明白ではない。Ｇ置換は明らかに、ＲＮＡの５’末端が１ヌクレオチド分短いが、しかしＵ１が５’末端ヌクレオチドである合成ＲＮＡは、２つ余分のＧを５’末端に有するインビトロ転写物と変わらない親和性で結合する（図７）状況にある。おそらくＵ１でのＡは、可能性のあるＵ相互作用を、ＨＩＶ−ＲＴとの同様なまたは異なる相互作用で置換しており、これはこの位置でＣまたはＧでは不可能な置換である。
　軸１の次の塩基対（Ｃ２−Ｇ１５）は、ＨＩＶ−ＲＴに対する特異的親和性の完全な損失なしにはＧ−Ｃ塩基対により置換することはできない。いずれかのヌクレオチドの塩基対形成面の修飾は、ＨＩＶ−ＲＴへの結合を強力に妨害し、ＨＩＶ−ＲＴとの結合はこれらの修飾から保護する。次の塩基対Ｃ３−Ｇ１４をＧ−Ｃ対で置換する場合、親和性の低下はそれほど劇的ではないが、この位置の修飾は強力に妨害する。Ｇ４−Ｃ１３のＣ−Ｇ対による置換は結合に影響せず、より安定でないＡ−ＵとＵ−Ａ対による置換はいくぶん特異的親和性を可能にする。これらの位置を塩基対を形成していないＡ−Ｃにより置換すると、特異的結合を破壊する。これは、この位置の最初のセレックス系統発生でのＣ−Ｇ置換と１つのＡ−Ｕ置換の出現、非変性状態でのこの塩基対の非反応性、およびこれらの塩基に見い出される高度の修飾妨害に相関する。
　ループ２の化学修飾データは、最初のセレックス実験で見られた系統発生的な保存を充分保証している。強力な修飾妨害は、Ａ１７とＡ１９の位置に見られる。弱い修飾妨害は、この相対位置で削除された最初のセレックスのいくつかのループ２の知見に相関するＡ２０に生じる（ただし、実施した化学妨害実験は、塩基がＨＩＶ−ＲＴと作りうる全ての可能な接触を網羅して試験していない）。Ａ１８は最初のセレックスで保存されておらず、この位置での修飾は妨害しない、またこの位置はＨＩＶ−ＲＴへの結合により修飾から保護されていない。
　前述データを合わせると、軸１の必須成分は、配列をタンパクと特異的に接触させる１本鎖５’ヌクレオチド（ＵまたはＡ）と、３つの塩基対らせん（Ｃ２−Ｇ１５、Ｃ３−Ｇ１４、Ｇ４−Ｃ１３）（ここで最初の２つの塩基対ではＨＩＶ−ＲＴとの配列特異的相互作用があり、Ｇ４−Ｃ１３の第３のループが閉じる位置では強力な塩基対（すなわち、Ｃ−ＧまたはＧ−Ｃ）の優先がある）であることを示唆する。ループ２は、Ａ１７とＡ１９のようにおそらく配列特異的方法でＨＩＶ−ＲＴと相互作用する、Ｇ１６の１本鎖的特性により、より広くはＧＡＸＡＡ（１６−２０）と記載されるべきであろう。軸２は、塩基対形成ヌクレオチドのパターンと数がかなり変化するが、本明細書に報告された３’削除実験から、最大の親和性を得るために、軸２に最低３つの塩基対が必要であることが仮説を立てることができる。軸１のらせんを構成する２つの鎖を連結する８つのヌクレオチドの範囲内で、結合したリガンドのループ１に少なくとも２つのヌクレオチドが必要である。
　本発明の方法に基づいて得られたＨＩＶ−ＲＴの改定されたリガンドを図１１に記載する。図１に示すもの（これは最初と２次のセレックスコンセンサスに基づく）との大きな違いは、軸２の長さ、塩基対Ｇ４−Ｃ１３のより退縮した仕様、ループ１のサイズ（これは軸２のサイズに直接関係する）、およびＵ１とＧ１６の１本鎖的特性である。
　どのようにこれらの違いを調和させられるか。理論により限定されてはいないが、セレックスの戦略は複製のために５’と３’の固定配列を要する。任意のＲＮＡ配列において、このような追加の配列は、高親和性リガンドの配置に競合する他の配置に関して能力を増強させる。その結果、直接親和性に貢献しない追加的構造要素（例えば、伸ばされた軸２）が、選択される。配列特異的接触のために軸１の最初の２塩基対がＣ−Ｇでなければならないならば、最も安定な閉じている塩基対は、配置のあいまいさを避けるために再度選択されたＧ４−Ｃ１３であろう（フレイヤー（Ｆｒｅｉｅｒ）ら（１９８６）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：９３７３）。Ｕ１とＧ１６の配列特異的選択は、これらが塩基対を形成する能力に偶然一致することであり；クレノウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）／プライマー−鋳型接合やｔＲＮＡ／ｔＲＮＡ合成酵素のような、他の核酸リガンド−タンパク複合体では、本ケースにも生じるかもしれない、塩基対ヌクレオチドの著しい局所の変性がある（フリーモント（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ）ら（１９８８）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：８９２４；ロナルド（Ｒｏｎａｌｄ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１１３５）。
ＶＩ．伸張された核酸リガンドを同定するためのＨＩＶ−ＲＴ核酸リガンドを用いるウォーキング実験の実施。
　にせ結び目コンセンサスリガンドの５’に位置する固定配列（２８ヌクレオチド）がＨＩＶ−ＲＴに対する親和性を低下させ、リガンドの３’に追加された固定配列（３１ヌクレオチド）がその親和性を増強することが、すでに見い出された。従ってＨＩＶ−ＲＴに対するより高親和性のリガンドのコンセンサスが得られるか否かを調べるために、セレックス実験を行い、３０ヌクレオチドの可変領域をリガンドＢ配列の３’に追加した。個々の単離体をクローン化して、１６回目の後で配列決定した。この配列は、図９に２つのモチーフに分類してリスト化する（配列ＩＤ番号：１１５−１３５）。各モチーフの２次構造と１次配列の保存の概略図は図１０に示す。ＨＩＶ−ＲＴのＲＮａｓｅＨとポリメラーゼの触媒ドメイン間の距離は最近、Ｘ線結晶学から誘導された３．５Å解像度構造のポケットに合体した（コンピューターによる）Ａ型ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中の１８塩基対位であることが決定された（コールスタト（Ｋｏｈｌｓｔａｅｄｔ）ら（１９９２）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６：１７８３）。にせ結び目と伸長したリガンド配列中に保存される塩基の、この相互作用に非常に重要であると決定された塩基の集中部位からの距離も、約１８塩基対である。従ってにせ結び目は、ポリメラーゼの触媒部位（この部位でリガンドは、ＲＮＡｓｅＨドメインが欠失したＨＩＶ−ＲＴに結合することが示された）と相互作用すること、およびにせ結び目への進化した伸長がＲＮＡｓｅＨドメインと相互作用することが結論される。一般に、各々のモチーフから試験したリガンドはＨＩＶ−ＲＴに対するリガンドＢの親和性を少なくとも１０倍増強する。
ＶＩＩ．ＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクの改良された核酸リガンドの解明。
　本発明の方法の実施例は、ＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクの核酸リガンドについて本明細書中に与えられる。合衆国特許出願番号０７／７１４，１３１号とＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９１／１９８１３号には、セレックスをＲｅｖ標的で実施した時に得られた結果が記載されている。Ｒｅｖに対して高親和性を有することが見い出された核酸配列を調べると、これらの配列が３つのモチーフ（Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ）に分類できることが分かった。モチーフＩのリガンドは、モチーフＩＩとＩＩＩにより記載される個々のモチーフの複合物であり、一般にＲｅｖに対してより高親和性で結合しているようである。モチーフＩリガンド配列の１つ（Ｒｅｖリガンド配列６ａ）は、クローン化され配列決定された全てのリガンドよりも著しく高い親和性で結合した。図１２に示すように、６ａ配列は２つのらせん間に隆起を形成して、この隆起を横切る少数の塩基対を有することが仮説化される。
　本明細書には、提唱された２次構造を確認し、Ｒｅｖタンパクの結合がリガンドを化学攻撃から保護する場所を見つけ、そしてＲｅｖ相互作用に必須なヌクレオチドを検出するために設計された、リガンド６ａで実施した化学修飾実験が記載される。さらに、ＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクに対して最も高親和性結合のためのコンセンサスをより包括的に記載するために、６ａリガンド配列の偏ったランダム化により、２次セレックス実験を実施した。
　Ｒｅｖリガンドの化学修飾。その可能な２次構造要素を決定し、どの修飾がＲｅｖによるリガンドの結合を妨害するかを見い出し、どの位置がタンパク結合への修飾から保護されているかを同定し、そして結合により生じるリガンド構造の可能な変化を検出するために、Ｒｅｖリガンド６ａの化学修飾検討を行った。
　修飾用化学物質は、リン酸を修飾するエチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）、塩基対形成位置ＣのＮ３とアデニンのＮ１を修飾する硫酸ジメチル（ＤＭＳ）、グアニンの塩基対形成位置Ｎ１とＮ２を修飾するケトキサール、ウラシルの塩基対形成位置のＮ３と少量のグアニンのＮ１位置を修飾するカルボジイミド（ＣＭＣＴ）、およびアデニンのＮ７位置とより少量のグアニンのＮ７を修飾するジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）を含む。ＥＮＵ修飾は、標識ＲＮＡ鎖の修飾依存性加水分解により測定され、一方他の全ての修飾剤は伸長されたＲＮＡリガンドに使用されて、修飾された位置でアニーリングされたオリゴヌクレオチドのプライマー伸長により明らかになった。
　Ｒｅｖリガンドの非変性構造の化学探索は図１３に要約されている。コンピューター予測の２次構造（ズーカー（１９８９）前述；イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ）ら（１９８９）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：７７０６））と非変性修飾データは、大体一致し；このリガンドは３つのらせん領域、１つの４塩基ヘアピンループ、および３つの「隆起」領域からなる（これらの構造「要素」の定義について図１３を参照のこと）。
　リン酸のＥＮＵ修飾は、非変性条件下と変性条件下でリガンドに対して変化がなかったが、これはＲＮＡの２次または３次構造にリン酸基が関与していないことを示している。一般に、全てのコンピューター予測の塩基対形成領域は修飾から保護されている。１つの例外は、中央のらせん（通常はらせん中の保護される位置）のＮ７（Ｇ１０、Ａ１１、Ｇ１２）のわずかな修飾である。これらの修飾はおそらくらせんの呼吸の結果であり；中央らせんの塩基対形成面の修飾が存在しないことは、Ｎ７の接近可能性がＲＮＡの完全な局所の切断よりは、むしろ小さならせんの歪みによることを示唆する。Ｇ１９−Ｕ２２ヘアピンループは、Ｇ１９のいくらかの部分修飾を除いて、完全に修飾される。
　非変性構造で最も興味深い領域は、３つの「隆起」領域のＵ８−Ｕ９、Ａ１３−Ａ１４−Ａ１５、およびＧ２６−Ｇ２７である。Ｕ８−Ｕ９はＣＭＣＴにより完全に修飾されるが、これはおそらく塩基の溶媒に対する配向を示している。Ａ１３、Ａ１４、およびＡ１５は全てＤＭＳとＤＥＰＣにより修飾され、中央のＡ１４に生じる修飾が最も強力である。Ａ１３−Ａ１５領域と反対の隆起は、ＤＭＳによるＧ２６の完全な保護を示し、Ａ２７のわずかな修飾を示す。Ｒｅｖ結合性ＲＮＡのまた別の研究（バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）ら（１９９１）Ｃｅｌｌ６７：５２９）では、本リガンドのＡ１３：Ａ２７とＡ１５：Ｇ２６に対応するＡ：ＡとＡ：Ｇの非正規の塩基対形成の存在を主張している。この修飾データによりこれらの可能性は除外されないが、バーテルらが示唆する等しい立体のＡ：Ａ塩基対は、塩基対形成のためにＮ１Ａ位置を使用し、従ってＤＭＳ処理に抵抗性であろう。また、Ａ：Ｇ対も同様に対生成のためにＮ１ＡまたはＮ７Ａのいずれかを使用して、ＡをＤＭＳまたはＤＥＰＣに抵抗性にする。
　Ｒｅｖ結合の修飾妨害。修飾妨害検討の結果を図１４に要約する（個々の修飾剤についての定量的データは図１５から１９に示す）。一般に、リン酸と塩基の修飾結合妨害は、ＲＮＡリガンドの２つの領域に集中している。第一近似として、これらの領域は、本検討に先立つセレックス実験に存在する２つの別のモチーフに対応する。リン酸修飾妨害はおそらく最も示唆的なリガンド−タンパク接触の実際の部位であり、修飾妨害データの領域への分類のための追加的な規準を構成する。
　最初の領域は、Ｕ２４−Ｇ２５−Ｇ２６に集中し、リン酸、塩基対形成面、およびＮ７修飾による妨害を含む。野生型ＲＲＥに保存されるこれらの同一の３つのヌクレオチドも、ＲＲＥ　ＩＩＢ軸ループ（クジェムス（Ｋｊｅｍｓ）ら（１９９２）　ＥＭＢＯ　Ｊ．１１：１１１９）を含有する短いＲＮＡを使用する修飾妨害検討で、Ｒｅｖ結合にとって非常に重要であることが見い出された。第２の領域はＧ１０−Ａ１１−Ｇ１２周辺に集中し、これもリン酸、塩基対形成面、およびＮ７修飾からの妨害を含む。さらに、Ｃ６−Ａ７−Ｕ８を取り巻くより小さい「ミニ領域」があり、リン酸と塩基対形成面修飾が結合を妨害している。
　リガンド全体に多くの塩基対形成面の修飾が結合妨害を示すが、これはおそらくリガンドの２次構造のゆらぎのためである。２つの「隆起」塩基であるＵ９とＡ１４は、修飾妨害を示さなかったが、これは両者が特異的塩基対形成相互作用／積み重ねや、タンパクとの接触に役割を持たないことを示している。
　ＲＮＡがＲｅｖに結合している時の化学修飾保護。「足跡」の化学修飾データを図２０に要約する。４つの位置、Ｕ８、Ａ１３、Ａ１５、およびＡ２７は、Ｒｅｖタンパクに結合すると、塩基対形成面の修飾で少なくとも２倍の低下（およびＡ位置のＮ７修飾で同様な低下）を示した。非変性条件下でのＧ１０−Ａ１１−Ｇ１２のわずかなＮ７修飾は、リガンドがＲｅｖの存在下で修飾された時には検出されなかった。ＲＮＡ非変性構造の化学探索で修飾されていないＧ３２は、Ｒｅｖと複合体化すると、その塩基対形成面とＮ７位置の強力な修飾を示す。Ｇ３２の５’と３’であるＵ３１とＵ３３は、リガンドがタンパクに結合すると、わずかなＣＭＣＴ修飾を示す。
　鋳型の偏ったランダム化を利用する２次セレックス。Ｒｅｖリガンド６ａ配列が他の３つのヌクレオチドと各位置で、他の３つのヌクレオチドに対する（６ａ配列の）比が６２．５対１２．５で混合された、図２１に示すような鋳型を合成した。この偏った鋳型は、Ｒｅｖタンパクに対するバックグラウンドの親和性（Ｋｄ＝１０−７）を有するＲＮＡを与えた。セレックスを６回行うことにより、図２１に示す配列のリストが得られた。鋳型合成の間の投入の分布から予想される分布とは異なる、各位置に見い出されるヌクレオチドと塩基対の頻度分布を図２２と２３に示す。これらのデータに基づく新規なコンセンサスは図２４に示す。Ｒｅｖリガンド６ａとの最も著しい違いは、相対的に弱い塩基対Ａ７−Ｕ３１のＧ−Ｃ対による置換、およびＵ９のＣによる、Ａ１４のＵによる、Ｕ２２のＧによる、許容されるまたは好ましい置換である。絶対的に保存される位置は、部位Ｇ１０、Ａ１１、Ｇ１２；Ａ１５、Ｃ１６、Ａ１７；Ｕ２４、Ｇ２５；およびＣ２８、Ｕ２９、Ｃ３０にある。Ｇ２６とＡ２５には置換した塩基は認められなかったが、これらの位置でそれぞれ１つと３つの欠失が見い出された。１つは単純なリガンド６ａ同様な配列で、もう１つは図２４に示す著しい選択により置換されたものである、２つの標識された転写物を合成した。これらのＲＮＡは全く同様にＲｅｖタンパクに結合した。
　軸領域の多くの置換がその安定性を増強する。５塩基対より長い軸の有意な選択があるようには見えないが、これは複製（例えば、セレックスの逆転写工程の間の複製の容易さ）のためには必要な選択かも知れない。１９９１年６月１０日に出願された合衆国特許出願番号０７／７１４，１３１号と１９９１年１２月２６日に公開されたＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９１／１９８１３号で報告された最初のセレックスでは、Ｕ９に他のヌクレオチドのいくつかのまばらな置換があるが、本実験はＣによる好ましい置換を示す。その最初のセレックスではＡ２７の欠失も現れた。驚くべき結果は、Ｃ１８−Ｇ２３の代わりのＣ１８−Ａ対形成の高頻度の出現である。
　測定された結合親和性を改善しない本実験に優先性が見い出される理由は、セレックスの結合反応とこれらの結合測定法に違いがあるからである。セレックスでは、不均一なＲＮＡ配列（必須の固定配列に隣接した）の比較的濃縮されたプールがタンパクに結合している。結合測定法では、低濃度の均一なＲＮＡ配列が結合している。セレックスでは、他のＲＮＡ配列との分子間および分子内接触の確率の上昇による、より差別的な配置の確実性について選択されるかも知れない。ＲＮＡリガンドとその修飾された相同物の濃縮された用量の臨床的体内送達には、これらの２次セレックスに認められる優先性が適切である。
　ＨＩＶ−１　ｔａｔタンパクに対する核酸リガンド。本発明は、セレックス方法を特定の標的であるＨＩＶ−１　ｔａｔタンパクに適用する。以下の実施例ＩＩＩでは、ＨＩＶ−１　ｔａｔタンパクに対する核酸リガンド溶液を単離し同定するために使用した実験パラメーターが記載される。図２６は、セレックス工程の１０回の繰り返しの後配列決定された核酸をリストしている。
　図２５は、ｔａｔタンパクに対する天然のリガンドであることが見い出された、天然に存在するＴＡＲ配列を示す。ｔａｔタンパクとＴＡＲ配列間の相互作用の特異的部位が決定され、これも図２５に記載される。
　図２６に与えられた配列は、３つの「モチーフ」に分類される。これらの各モチーフはＨＩＶ−１　ｔａｔタンパクに対する核酸リガンド溶液を表す。各モチーフ内の１次配列保存の領域が点線の四角で囲まれている。モチーフＩとＩＩは、保存配列（あるモチーフを作り上げる全てのまたはほぼ全ての核酸配列に見い出されるこれらの配列）を、らせんの要素に隣接する隆起中に位置させる共通の構造を含有する。１次配列保存（これは主に各隆起の１本鎖ドメインにある）もモチーフＩとＩＩ間で類似している。第３のモチーフ（ＩＩＩ）は大きなループにより特徴付けられる。この３つのモチーフは図２７に概略図で表される。本明細書で同定される核酸リガンドと、図２５に与えられるＴＡＲ配列間には明瞭な類似はない。
　境界分析測定は、モチーフＩＩＩのリガンド配列の１つで実施された。認識の境界は、図２６に実線で四角で囲んで示される。境界測定は、すでに記載した方法により実施した。ターク（Ｔｕｅｒｋ）ら（１９９０）　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１３：７４９；タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ　＆　Ｇｏｌｄ）（１９９０）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：５０５を参照のこと。
　図２８では、配列７（モチーフＩ）、２４（モチーフＩＩ）、２９（モチーフＩＩ）、３１（モチーフＩＩＩ）および最初の候補混合物の結合親和性が示される。図に見られるように、各核酸リガンド溶液モチーフからのメンバーは、核酸の候補混合物に比べてｔａｔタンパクに対する親和性が上昇した。各リガンドはＴＡＲ配列に比べて、有意に大きなｔａｔタンパクに対する親和性を示す。
　薬剤としての使用に求められる核酸を製造するためには、この核酸リガンドは、１）標的に目的の効果を及ぼすことができる方法で標的に結合し；２）目的の効果を得られるようにできるだけ小さく；３）できるだけ安定で；そして４）選択された標的に特異的なリガンドであることが好ましい。全てではないが大抵の場合に、核酸リガンドが標的に対して可能な限り高い親和性を有することが好ましい。
　本発明は、図２６に示す特異的核酸リガンドと、図２７に概略図で示す核酸リガンド溶液を含む。本発明にカバーされるリガンドの範囲は、セレックス方法により同定されるｔａｔタンパクに対する全てのリガンドまで拡張される。さらに具体的には、本発明は、１）図２６に示す特異的核酸リガンドと実質的に相同であって、ｔａｔタンパクに対して質的に同一の結合能力を有するか、または２）図２７に示す核酸リガンド溶液と実質的に相同であって、ｔａｔタンパクに対して実質的に同一の結合能力を有する、核酸配列を含む。実質的に相同というのは、一次配列の相同の程度が７０％以上、最も好ましくは８０％以上であることを意味する。ｔａｔタンパクに対する実質的に同一の結合能力とは、その親和性が、本明細書中で記載した実質的に相同の配列の親和性の大きさの２桁の範囲内にあることを意味する。ある配列（本明細書中で記載した配列と実質的に相同である）が、ｔａｔタンパクに結合する実質的に同一の能力を有するかどうかを測定することは、当業者には特別難しいことではない。
　モチーフＩ、ＩＩおよびＩＩＩ、ならびに結合曲線の概要が図２８に示され、１次配列がほとんどまたは全然相同でない配列が、ｔａｔタンパクに結合する実質的に同一の能力を有することを示している。もしこれらの各モチーフのリガンドがｔａｔタンパクの同一の結合部位に結合すると仮定すれば、結合が核酸リガンドの２次または３次構造により制御されていることは明白である。本明細書中ではモチーフＩ、ＩＩおよびＩＩＩで表される、ある１次構造は、ｔａｔタンパクの結合部位に非常に類似している構造をとることができるであろう。これらの理由で本出願は、本明細書中に与えられたリガンドと実質的に同一の構造型を有し、図２６または図２７に示す核酸リガンドと実質的に同一の、ｔａｔタンパクに結合する能力を有する核酸リガンドをも含む。実質的に同一の構造は、ｔａｔタンパクに対する親和性を導くモチーフＩ、ＩＩおよびＩＩＩの共通構造要素を有する全ての核酸リガンドを含む。
　本発明はまた、リガンドのインビボ安定性を上昇させるために、あるいはリガンドの体内送達を促進または媒介するためにある化学修飾を加えられた、上述のリガンドを含む。
　本明細書に記載されたＨＩＶ−１　ｔａｔタンパクに対する核酸リガンドと核酸リガンド溶液は、薬剤としてそして遺伝子治療の一部として有用である。当業者に公知の方法により、核酸リガンドはＨＩＶウイルスに感染した細胞の中に導入され、そこで核酸リガンドはｔａｔタンパクに対してＴＡＲ配列と競合する。こうしてＨＩＶ遺伝子の転写が防止される。
　トロンビンに対する核酸リガンド。本発明は図２９に示す特異的核酸リガンドを含む（配列ＩＤ番号：１３７−１５５）。本発明によりカバーされるリガンドの範囲は、セレックス方法により同定されるトロンビンに対する全てのリガンドまで拡張される。さらに具体的には、本発明は、図２９に示す特異的核酸リガンド（配列ＩＤ番号：１３７−１５５）と実質的に相同であって、トロンビンに対して実質的に同一の結合能力を有する核酸リガンドを含む。
　グループＩとグループＩＩリガンドについて図３０に示す提唱された構造の概要は、１次配列がほとんどまたは全然相同でない配列がなお、トロンビンに結合する実質的に同一の能力を有することを示している。これらの理由で本発明は、本明細書で与えられたリガンドと実質的に同一の構造を有し、図３０に示しＲＮＡリガンド（配列ＩＤ番号：１５６−１５９）と実質的に同一のトロンビンに結合する能力を有するＲＮＡリガンドをも含む。「実質的に同一の構造」とは、図３０に示す配列（配列ＩＤ番号：１５６−１５９）の共通の構造要素を有する全てのＲＮＡリガンドを含む。
　本発明はまた、リガンドのインビボ安定性を上昇させるため、あるいはリガンドの体内送達を促進または媒介するためにある化学修飾を加えられた上述のリガンドも含む。特に本発明の範囲には、ＲＮＡリガンドのあるリボースの２’−ＮＨ２修飾を含有するトロンビンのＲＮＡリガンドを含む。
　本明細書で記載したトロンビンに対する核酸リガンドと核酸リガンド溶液は、薬剤としておよび遺伝子治療の一部として有用である。
　アテローム性動脈硬化の開始と進展、急性冠状動脈症候群、静脈移植疾患、および冠状動脈血管形成後の再狭窄を含む、種々の血管疾患の病因を理解するには血管傷害と血栓症の概念は重要である。
　本発明の高親和性トロンビン結合ＲＮＡリガンドは、種々の性質を有することが期待される。これらの特徴は、ヒルジンペプチド阻害剤と、トロンビンの構造と結合に関する最近の理解に沿って考えることができる。これに沿ってそして理論に限定されることなく考えると、ＲＮＡリガンドは高度に塩基性のアニオン性の外側部位に結合している確度が高い。またＲＮＡは、カチオン性のアルギニン残基に対して高特異性を有する触媒部位に結合していない可能性も高い。ＲＮＡリガンドはＣ末端ヒルジンペプチドと同一の様式で作用することが予想される。このようにそれらは小さいペプチド性基質を強く阻害しないが、フィブリノーゲン凝固、プロテインＣ活性化、血小板活性化、および内皮細胞活性化は阻害するであろう。もしアニオン性の外側部位でフィブリノーゲン凝固とＴＭ結合活性が分離可能であれば、異なる高親和性ＲＮＡリガンドがこれらの活性を別々に阻害することが可能である。さらに、凝固促進性よりも強力な抗凝固物質を生成するために、何か１つの活性を選択しても良い。
　標的に対するリガンドを同定するためのセレックス方法は、標的としてヒトトロンビンを、そしてランダム化した配列の３０ヌクレオチド領域を有する７６ヌクレオチドのＲＮＡを含有する候補混合物を使用して実施した（実施例ＩＶ）。１２回のセレックスの後に、多くの選択されたリガンドの配列を決定し、１次配列の共通の要素を有する、配列の２つのグループの存在を明らかにした。
　大量の３０Ｎ　ＲＮＡに比べて、ＲＮＡ集団の結合の劇的な変化が、セレックスの１２回の後に観察された。１２回後の大量のＲＮＡの配列決定も、非ランダム配列の側面を示した。ＲＮＡを逆転写し、増幅し、クローン化して２８の個々の分子の配列を決定した（図２９）。１次配列の相同性に基づき、２２ＲＮＡがクラスＩに分類され、６ＲＮＡがクラスＩＩに分類された。クラスＩの２２配列の内、１６配列（その内の８は同一）は同一の配列モチーフＧＧＡＵＣＧＡＡＧ（Ｎ）２ＡＧＵＡＧＧＣ（配列ＩＤ番号：９）を含有したが、一方残りの６配列はその限定された領域に１または２ヌクレオチドの変化、あるいはＮ＝２からＮ＝５の少しの変動を含有した。この保存されたモチーフは、３０Ｎ領域中でその位置を変化させた。クラスＩＩでは、６ＲＮＡの内の３つが同一であり、これら全てが、５’固定領域の末端から３番目のヌクレオチドから始まる、保存モチーフＧＣＧＧＣＵＵＵＧＧＧＣＧＣＣＧＵＧＣＵＵ（配列ＩＤ番号：１０）を含有した。
　クラスＩからの３つの配列変異体ＲＮＡリガンド（６、１６、および１８）と、クラスＩＩから１つ（２７）（配列決定された順により同定された）を、個々の結合分析のために使用した。クラスＩＲＮＡは、ｋＤ約３０ｎＭのクローン１６を例にとり、クラスＩＩＲＮＡクローン２７のｋＤは約６０ｎＭであった。
　５’および３’固定配列に隣接する可変３０Ｎ領域を含む７６ヌクレオチドのＲＮＡの、特異的高親和性結合に要する最小配列を同定するために、５’および３’境界実験を実施した。５’境界実験のために、ＲＮＡの３’末端を標識し、加水分解して、種々の５’末端を有するＲＮＡのプールを得た。３’境界実験のために、ＲＮＡの５’末端を標識し、加水分解して種々の３’末端を有するＲＮＡのプールを得た。必要な最小ＲＮＡ配列は、ニトロセルロースに対するＲＮＡタンパク結合と、ゲル電気泳動による標識ＲＮＡの同定により決定した。
　３’境界実験により、図３０Ａに示す各４つの配列（配列ＩＤ番号：１５６−１５９）の境界が得られた。これらの境界は、すべてのタンパク濃度で一貫性があった。５’境界実験により、低いタンパク濃度で大きな境界を与えたＲＮＡ１６を除いては、図３１に示す境界プラスまたはマイナス１ヌクレオチドの境界が得られた。これらの境界実験に基づく、トロンビンリガンドの可能な２次構造を図３０Ｂに示す。
　結合分析のために、クラスＩのクローン１６（２４および３９ヌクレオチド）の最も小さいおよび最も大きいヘアピンとクラスＩＩのクローン２７（３３ヌクレオチド）のヘアピンに対応するＲＮＡｑｏ、合成または転写した（図３０Ｂ参照）。結果は、ＲＮＡ２７ヘアピンは、固定および可変領域を有する全７２ヌクレオチド転写物と等しい親和性（約６０ｎＭのｋＤ）で結合することを示す（図３１ＡのＲＮＡ２７を図３１ＣのＲＮＡ３３Ｒを比較）。一方クラスＩのクローン１６ＲＮＡヘアピンのｋＤは、３０ｎＭから２００ｎＭへ大きさで上昇した。
　ＲＮＡ分子のピリミジン残基の２ＮＨ２−リボースの修飾は、血清中のＲＮＡの安定性（ＲＮａｓｅによる分解に対する抵抗性）を少なくとも１０００倍上昇させることが証明された。クラスＩおよびクラスＩＩの２ＮＨ２−ＣＴＰ／ＵＴＰ修飾ＲＮＡを用いる結合実験は、未修飾ＲＮＡに比べて結合の著しい低下を示した（図３２）。しかし大量の３０Ｎ　ＲＮＡによる結合は、修飾された時に親和性のわずかな上昇を示した。
　１５ヌクレオチドのコンセンサス５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’（Ｇ１５Ｄ）（配列ＩＤ番号：１）を有するｓｓＤＮＡ分子は、インビトロでヒトトロンビンに結合してフィブリン凝固形成を阻害することが証明された（ボックら（１９９２）、前述）。Ｇ１５Ｄと本発明のＲＮＡヘアピンリガンド間の、トロンビン結合についての競合実験の結果を図３３に示す。これらの実験Ａ）の始めに、３２Ｐ標識Ｇ１５Ｄを、濃度の上昇する非標識ＲＮＡまたは非標識Ｇ１５Ｄと共に、トレーサーとして使用した。予想どおり、Ｇ１５Ｄをそれ自体の結合に競合するために使用すると、標識ＤＮＡの結合は標識および非標識競合ＤＮＡの等モル濃度（１μＭ）で５０％に減少した。クラスＩのクローン１６合成ＲＮＡ２４と３９、およびクラスＩＩのクローン２７合成ＲＮＡ３３は、この濃度でＧ１５Ｄの結合に競合することができた。Ｂ）では、高親和性のクラスＩＩのヘアピンＲＮＡ３３（ｋＤ≒６０ｎＭ）を３２Ｐ標識して、濃度の上昇する非標識ＲＮＡまたは非標識Ｇ１５Ｄ　ＤＮＡ（ｋＤ≒２００ｎＭ）と共に、トレーサーとして使用した。これらの実験で、ＲＮＡ３３自体の競合よりもＧ１５Ｄは高濃度でＲＮＡ３３に効果的に競合でき（結合の右に対する変化）、これは３−４倍の高親和性のリガンドと競合するときに予想されることである。クラスＩＩのヘアピンＲＮＡ３３（ｋＤ≒６０ｎＭ）は、クラスＩのヘアピンＲＮＡ２４（ｋＤ≒２００ｎＭ）により、弱く競合されたのみであり、これはいくらかの重複があるかもしれないが、これら２つのクラスのＲＮＡは、異なっているが隣接するかまたは重複する部位に高親和性で結合することを示唆している。これら両方のＲＮＡがＧ１５Ｄ結合に競合できるため、このＤＮＡ１５量体はおそらくクラスＩとクラスＩＩヘアピン間重複の領域に結合している。
　発色基質Ｓ２２３８の切断。本発明のＲＮＡリガンドの存在下でおよび非存在下で、ペプチド発色性基質Ｓ２２３８（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐニトロアニリン）（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）（カビ・ファルマシア）を切断するトロンビンの能力を、測定した。この切断反応に、トロンビン１０−８ＭとＲＮＡ１０−８Ｍ、トロンビン１０−９ＭとＲＮＡ１０−８Ｍまたはトロンビン１０−８ＭとＲＮＡ１０−７Ｍで、ＲＮＡは阻害効果を及ぼさなかった（図３４Ａ）。これらの結果は、ＲＮＡリガンドが酵素の触媒部位に結合しないことを示唆している。
　フィブリノーゲンのフィブリンへの切断と凝固形成。フィブリノーゲンのフィブリンへの切断により凝固形成を触媒するトロンビンの能力を、本発明のＲＮＡリガンドの存在下でおよび非存在下で測定した。ＲＮＡがＫｄ（クラスＩのＲＮＡは３０ｎＭ、そしてクラスＩＩのＲＮＡは６０ｎＭ）に等しい濃度で存在したとき（この濃度はトロンビンの５から１０倍過剰である）、凝固時間は１．５倍上昇した（図３４Ｂ）。
　トロンビン結合の特異性。クラスＩとクラスＩＩからの代表的リガンドは、これらのリガンドは１μＭの高濃度でも、ＡＴＩＩＩに対する親和性は低いことを示した。これらのリガンドは大量の３０Ｎ３　ＲＮＡに比べて低い親和性を示したが、これは非特異的結合に対する選択があったことを示唆している。ＡＴＩＩＩはポリアニオン性高分子であるヘパリンに高親和性を示す、多量に存在する血漿タンパクであるため、これは特に重要である。これらの結果は、クラスＩおよびクラスＩＩのＲＮＡに存在する別個の構造の進化がトロンビン結合に対して特異的であり、そのポリアニオン性の組成にも関わらず、高親和性ヘパリン結合タンパクには結合しないことを示す。これらのトロンビン特異的ＲＮＡリガンドは、活性トロンビンの不活性な生化学前駆体であって、血漿中に高レベル（≒１μＭ）で循環しているプロトロンビンには親和性をもたないことも特記すべきである（図３５Ｂ）。
　塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に対する核酸リガンド。本発明はセレックス方法を特異的標的ｂＦＧＦに適用する。以下の実施例の項に、ｂＦＧＦに対する核酸リガンド溶液を単離し同定するために使用した実験パラメーターを記載する。
　本発明は表ＩＩ−ＩＶに示す特異的核酸リガンドを含む。本発明でカバーされるリガンドの範囲は、セレックス方法により同定されるｂＦＧＦに対する全てのリガンドまで拡大される。さらに具体的には、本発明は、表ＩＩ−ＩＶに示す特異的核酸リガンドと実質的に相同であって、ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有する核酸配列を含む。
　ファミリー１および２のリガンドに関して、図４１に示す提唱される構造形成の概要は、１次配列にほとんどまたは全然相同性を有さない配列がなお、ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有することを示す。本発明は、本明細書中に与えられたリガンドと実質的に同一の構造を有し、表ＩＩおよびＩＩＩに示すＲＮＡリガンドとｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有する、ＲＮＡリガンドも含む。「実質的に同一の構造」は、表ＩＩおよびＩＩＩに示す配列（配列ＩＤ番号：２７−６７）の共通の要素を有する全てのＲＮＡリガンドを含む。
　本発明はまた、リガンドのインビボ安定性を上昇させ、リガンドの体内送達を促進または媒介し、あるいは体内からのクリアランス速度を低下させるために、ある化学修飾を加えられた上述のリガンドも含む。特にＲＮＡリガンドのあるリボースの２’−ＮＨ２修飾を含有するｂＦＧＦのＲＮＡリガンドが、本発明の範囲に含まれる。
　本明細書に記載されたｂＦＧＦに対する核酸リガンドと核酸リガンド溶液は、薬剤として、および遺伝子治療の一部として有用である。さらに本明細書に記載されたｂＦＧＦに対する核酸リガンドは診断目的に有利に使用され得る。
　本発明の高親和性核酸リガンドはまた、ｂＦＧＦの生物活性を阻害する能力を含む、種々の性質を有する。配列ファミリー１および２からの代表的リガンドは、ｂＦＧＦの低−および高−親和性細胞表面リセプターの両者に対する結合を阻害することが見い出された。これらの核酸リガンドは、インビボのｂＦＧＦ活性の特異的で強力な中和剤として有用でありうる。
　実施例Ｉ：ＨＩＶ−ＲＴに対する改良された核酸リガンド溶液の解明ＲＮＡ合成。オリゴヌクレオチド鋳型でのインビトロ転写を、ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）ら（１９８７）（前述）に記載のように実施した。全ての合成核酸は、標準プロトコールを使用して、アプライド・バイオシステムズ・モデル３９４−０８ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｍｏｄｅｌ　３９４−０８　ＤＮＡ／ＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を用いて作成した。デオキシリボヌクレオチドホスホラミジトおよびＤＮＡ合成用の溶媒と試薬は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から購入した。リボヌクレオチドと２’−メトキシ−リボヌクレオチドホスホラミジトは、グレン・リサーチ社（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から購入した。混合塩基位置については、０．１Ｍホスホラミジト溶液を、指示された容量比で混合した。塩基の脱保護は、水酸化アンモニウム：エタノール３：１の中で５５℃で６時間実施した。ｔ−ブチル−ジメチルシリル保護基は、フッ化テトラブチルアンモニウム中で一晩処理することにより合成ＲＮＡの２’−ＯＨ基から脱離させた。次に脱保護したＲＮＡは、フェノール抽出して、エタノール沈殿させゲル電気泳動により精製した。
　標識したＲＮＡとＨＩＶ−ＲＴを用いる親和性測定。５’および３’境界の改良と置換の効果の測定のためのモデルＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼでの転写の間に、０．５ｍＭのＣ、Ｇ、およびＵＴＰと０．０５ｍＭのＡＴＰの反応中で、α−３２Ｐ−ＡＴＰを使用したことを除いて、タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ　＆　Ｇｏｌｄ）（１９９０）（前述）が記載するように、標識した。合成オリゴヌクレオチドとリン酸化された転写物（タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ　＆　Ｇｏｌｄ）（１９９０）（前述）は、ガウス（Ｇａｕｓｓ）ら（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６：２４が記載したようにキナーゼ処理した。全てのＲＮＡ−タンパク結合反応は、以下に注記した化学保護実験を例外として、２００ｍＭのＫＯＡｃ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．７、１０ｍＭのジチオスレイトールからなる「結合緩衝液」中で行った。ＲＮＡおよびタンパクの希釈物を混合して、氷上に３０分間保存して、次に５分間３７℃に移行させた。結合測定では反応容積は６０μｌで、その内５０μｌを測定した。各反応物は、予め（結合緩衝液で）湿したニトロセルロースフィルターを通して吸引して、３ｍｌの結合緩衝液ですすぎ、次に乾燥させて測定のために数えるか、または溶出して化学修飾について測定した。結合親和性の比較では、結果をプロットして、グラフから、最大の半分の結合が起こるタンパク濃度（タンパク過剰の条件下でおよそＫｄ）を決定した。
　ＨＩＶ−ＲＴによる修飾ＲＮＡの選択。結合反応は、反応物に添加するＨＩＶ−ＲＴの量を変えるよりはむしろ、反応物の容量を増加させて低濃度にすることを除いては、前述のとおりであった。変性条件下で修飾したＲＮＡは、２０、４および０．８ナノモルの濃度のＨＩＶ−ＲＴ（結合緩衝液の容量で１、５および２５ｍｌ）で選択した。各反応物に添加したＲＮＡの量は、各実験について同等であった（約１−５ピコモル）。ＲＮＡは、タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ　＆　Ｇｏｌｄ）（１９９０）（前述）に記載されるようにフィルターから溶出して、修飾した位置について測定した。各実験には、選択したＲＮＡと平行に未選択のＲＮＡをフィルター上にスポットし、溶出して修飾した位置について測定する、対照を含めた。選択したＲＮＡと未選択のＲＮＡの化学修飾での変化は、以下の例外を除き電気泳動した測定生成物の露出したフィルムを目視により試験することにより行った。ＥＮＵによる修飾妨害の程度は、ＬＫＢレーザーデンシトメーターを使用して、フィルムの密度の走査により測定した。各位置での修飾妨害の指数（Ｍ．Ｉ．）は以下のように計算した：
Ｍ．Ｉ．＝（Ｏ．Ｄ．未選択／Ｏ．Ｄ．未選択Ａ２０）／（Ｏ．Ｄ．選択／Ｏ．Ｄ．選択Ａ２０）
式中、選択された修飾ＲＮＡについて測定した各位置の値（Ｏ．Ｄ．選択）を、位置Ａ２０についての値（Ｏ．Ｄ．選択Ａ２０）で割り、同様に未選択レーンについて割って標準化値とした。２．０以上の全てのＭ．Ｉ．値は妨害するとして、４．０以上は強力に妨害するとして報告される。２’ヒドロキシル（各ヌクレオチドのリボース上）の２’−メトキシによる混合置換の効果の測定において、電気泳動した加水分解生成物のゲルを、アンビス検出系（Ａｍｂｉｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）で直接計測した。レーン内の各バンドに関連したカウントは、位置Ａ１７について前述のように標準化した。さらに、以下に記載するようにレーザーデンシトメーターにより測定した。
　ＲＮＡの化学修飾。ＲＮＡの化学修飾の型とその特異性および測定の方法については、アーレスマン（Ｅｈｒｅｓｍａｎｎ）ら（１９８７）（前述）の有用な概説がある。未変性の条件下でのＲＮＡの修飾は、２００ｍＭのＫＯＡｃ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．７で３７℃、でエチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）（室温のＥＮＵ飽和エタノールの１／５ｖ／ｖ希釈物）により１−３時間、硫酸ジメチル（ＤＭＳ）（１／７５０倍ｖ／ｖ希釈物）により８分間、ケトキサール（０．５ｍｇ／ｍｌ）により８分間、カルボジイミド（ＣＭＣＴ）（８ｍｇ／ｍｌ）により２０分間、そしてジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）（未変性の条件下の１／１０のｖ／ｖ希釈物または変性条件下の１／１００の希釈物）により４５分間行い、同一条件下で１ｍＭのＤＴＴを添加してＨＩＶ−ＲＴに結合させた。修飾化学試薬の濃度は、変性条件で同一であった（ＤＥＰＣについて記載される部分を除く）；ＥＮＵによる修飾を７Ｍの尿素の非存在下で行う場合を除き、これらの条件は、７Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．７、１ｍＭのＥＤＴＡで９０℃で１−５分間であった。
　化学修飾の測定。伸長したリガンドＢのＲＮＡ、５’−ＧＧＵＣＣＧＡＡＧＵＧＣＡＡＣＧＧＧＡＡＡＡＵＧＣＡＣＵＡＵＧＡＡＡＧＡＡＵ−ＵＵＵＡＵＡＵＣＵＣＵＡＵＵＧＡＡＡＣ−３’
（配列ＩＤ番号：１１）（リガンドＢ配列は下線で表す）上の、ＤＭＳ、ケトキサールおよびＣＭＣＴについて、化学修飾の位置を逆転写により測定した；ここにオリゴヌクレオチドプライマー　５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＣＡＡＴＡＧＡＧ−ＡＴＡＴＡＡＡＡＴＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：１２）をアニーリングさせて；逆転写産物（ガウス（Ｇａｕｓｓ）ら、１９８７前述のように得た）を、１０％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離した。ＥＮＵとＤＥＰＣ修飾の位置は、それぞれブラソフ（Ｖｌａｓｓｏｖ）ら（１９８０）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．１２０：１２、およびピーティーとギルバート（Ｐｅａｔｔｉｅ　ａｎｄ　Ｇｉｌｂｅｒｔ）（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：４６７９のように（２０％アクリルアミドゲル上の電気泳動により分離）測定した。種々の位置のリボースに対する２’−メトキシリボースの測定は、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．０）中で９０℃で４５分間アルカリ性加水分解により測定した。
　ＨＩＶ−ＲＴの存在下でのＲＮＡの修飾。使用した条件は、未変性のＲＮＡの修飾と同じであった。ＨＩＶ−ＲＴの濃度は、ＲＮＡ濃度の約１０倍過剰であった。一般にタンパク濃度は、５０ｎＭから１μＭの範囲であった。
　ＨＩＶ−ＲＴとの付帯的接触のセレックス単離。出発物質のＲＮＡは、以下のオリゴヌクレオチドから合成した、ＰＣＲ反応をさせた鋳型から転写した：
Figure 2004097232
（５’プライマー）（配列ＩＤ番号：１３）、
　
Figure 2004097232
（３’プライマー）（配列ＩＤ番号：１４）、
Figure 2004097232
（可変鋳型）（配列ＩＤ番号：１５）。
　セレックスは、以下の例外を除いて、ＨＩＶ−ＲＴについてすでに記載したように実施した。１回目のセレックスの結合反応のＨＩＶ−ＲＴの濃度は、４ｍｌの結合緩衝液中１３ナノモル、ＲＮＡは１０マイクロモルであり、２から９回目は２０ｍｌの緩衝液中２．６ナノモルのＨＩＶ−ＲＴ、１．８マイクロモルのＲＮＡで選択を行い、１０−１４回目は５０ｍｌ中１ナノモルのＨＩＶ−ＲＴ、０．７マイクロモルのＲＮＡを使用し、そして１５と１６回目は５０ｍｌの結合緩衝液中０．５ナノモルのＨＩＶ−ＲＴ、０．７マイクロモルのＲＮＡを使用した。
実施例Ｉの参照文献：
　
Figure 2004097232
実施例ＩＩ：ＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクに対する改良された核酸リガンド溶液の評価
　化学修飾に使用したＲｅｖリガンド配列を、図１２（以後は、番号を付けた概略図が使用される）に示す。修飾のためのＲＮＡは、合成オリゴヌクレオチド鋳型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写から得た。ＥＮＵ修飾は、図１２に示すリガンド配列について実施した。ＤＭＳ、ケトキサール、ＣＭＣＴ、およびＤＥＰＣ修飾を、伸長したリガンド配列について実施し、図１２に示す合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆転写により分析した。
　ＲＮＡの化学修飾。核酸の化学修飾技術は、一般的にアーレスマン（Ｅｈｒｅｓｍａｎｎ）ら（１９８７）（前述）に記載されている。未変性の条件下でのＲＮＡの修飾は、２００ｍＭのＫＯＡｃ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．７、１ｍＭのＥＤＴＡ中で３７℃で実施した。変性条件下での修飾は、７Ｍの尿素、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．７中で９０℃で行った。修飾試薬の濃度とインキュベーション時間は以下のとおりである：エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）−ＥＮＵ飽和エタノールの１／５ｖ／ｖ希釈物、未変性１−３時間、変性５分間；硫酸ジメチル（ＤＭＳ）−１／７５０倍ｖ／ｖ希釈物、未変性８分間、変性１分間；ケトキサール−０．５ｍｇ／ｍｌ、未変性５分間、変性２分間；カルボジイミド（ＣＭＣＴ）−１０ｍｇ／ｍｌ、未変性３０分間、変性３分間；ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）−１／１０のｖ／ｖ希釈物、未変性１０分間、変性１分間。
　Ｒｅｖ結合の修飾妨害。変性条件下で化学修飾したＲＮＡは、フィルター分画によりＲｅｖ結合について選択した。選択は、Ｒｅｖの濃度３０、６、および１．２ナノモルで実施した（結合緩衝液（２００ｍＭのＫＯＡｃ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．７、および１０ｍＭのジチオスレイトール）の容量１、５、および２５ｍｌに相当する）。各タンパク溶液に約３ピコモルの修飾されたＲＮＡを添加し、混合して氷上で１５分間保存し、次に１０分間３７℃に移行させた。結合溶液は、予め湿したニトロセルロースフィルターに通し、５ｍｌの結合緩衝液ですすいだ。ＲＮＡは、タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ　＆　Ｇｏｌｄ）（１９９０）（前述）が記載したようにフィルターから溶出して、残った修飾位置について測定した。修飾ＲＮＡはまたフィルターにスポットし、溶出液して修飾ＲＮＡの均一な回収について溶出した。
　修飾妨害の程度は、ＬＫＢ（ＥＮＵ）およびモレキュラー・ダイナミクス（ＤＭＳ、ケトキサール、ＣＭＣＴ、およびＤＥＰＣ）のレーザーデンシトメーターを使用して、オートラジオグラフの密度走査により測定した。修飾したリン酸と塩基についての値は、選択したおよび未選択のレーンとも、選ばれた修飾位置で標準化した；次に選択した方のレーンの修飾位置についての値は、未選択のレーンの対応する位置により割った（特定の標準化位置については図１５−１９を参照）。修飾した塩基とリン酸について４．０以上の値は強力に妨害していると判定し、２．０以上の値はわずかに妨害していると判定した。
　Ｒｅｖの存在下でのＲＮＡの修飾。Ｒｅｖタンパクの存在下でのＲＮＡリガンドの修飾であるＲｅｖリガンドの「足跡」は、２００ｍＭのＫＯＡｃ、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ　ｐＨ７．７、１ｍＭのＤＴＴ、および５ｍＭのＭｇＣｌ２中で実施した。タンパクの濃度は５００ナノモル、そしてＲＮＡ濃度の約３倍モル過剰であった。エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）を除く前述した全ての修飾試薬を用いて、タンパク存在下での修飾を試みた。
　化学修飾したＲＮＡの測定。ＥＮＵ修飾の位置は、ブラソフ（Ｖｌａｓｓｏｖ）ら（１９８０）（前述）のように検出し、２０％変性アクリルアミドゲルによる電気泳動により分離した。ＤＭＳ、ケトキサール、ＣＭＣＴ、およびＤＥＰＣは、放射標識したオリゴヌクレオチドプライマー（図１２）による伸長したＲｅｖリガンドの逆転写により測定し、８％変性アクリルアミドゲル上の電気泳動により分離した。
　偏ったランダム化によるセレックス。インビトロの転写のための鋳型は以下のオリゴヌクレオチドからＰＣＲにより調製した：
　
Figure 2004097232
（鋳型オリゴ）（配列ＩＤ番号：１６）
Figure 2004097232
（５’プライマー）（配列ＩＤ番号：１７）
Figure 2004097232
（３’プライマー）（配列ＩＤ番号：１８）
ここで鋳型オリゴの小文字は、各位置で６２．５％の量の小文字と各１２．５％の他の３つのヌクレオチドの試薬の混合物を合成に使用したことを示す。
　セレックスは、以下の例外を除きすでに記載したように実施した。最初と２回目の結合反応のＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクの濃度は、１０ｍｌの容量（２００ｍＭの酢酸カリウム、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．７、１０ｍＭのＤＴＴの）中で７．２ナノモルであり、ＲＮＡは４マイクロモルであった。３から６回目で、４０ｍｌの容量中に、Ｒｅｖタンパクの濃度は１ナノモルであり、ＲＮＡは１マイクロモルであった。ＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクは、アメリカン・バイオテクノロジーズ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）から購入した。
実施例ＩＩＩ：ＨＩＶ−１　ｔａｔタンパクに対する核酸リガンド。
　ＨＩＶ−１　ｔａｔタンパクのセレックス。ｔａｔタンパクはアメリカン・バイオ−テクノロジーズ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）から購入した。インビトロ転写のための鋳型は、以下のオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲにより製造した：
Figure 2004097232
（５’プライマー）（配列ＩＤ番号：１８）
Figure 2004097232
（可変鋳型）（配列ＩＤ番号：１９）
Figure 2004097232
（３’プライマー）（配列ＩＤ番号：２０）
セレックス回転は、以下の条件下でターク（Ｔｕｅｒｋ）ら（１９９２ａ）（前述）、およびセレックス出願に記載したように実施した：結合反応は、１および２回目は２ｍｌの容量中の、１３ナノモルのｔａｔタンパクと１．３マイクロモルのＲＮＡで行い、３−１０回目は４ｍｌ中の６．５ナノモルのｔａｔタンパクと０．６５マイクロモルのＲＮＡで行った。
　ＲＮＡ合成。オリゴヌクレオチド鋳型でのインビトロ転写は、ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）ら（１９８７）（前述）が記載したように実施した。全ての合成核酸は、標準プロトコールを使用して、アプライド・バイオシステムズ・モデル３９４−０８ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｍｏｄｅｌ　３９４−０８　ＤＮＡ／ＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で作成した。デオキシリボヌクレオチドホスホラミジトおよびＤＮＡ合成用の溶媒と試薬は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から購入した。
　標識したＲＮＡとＨＩＶ−１　ｔａｔタンパクとの親和性測定。５’および３’境界の改良と置換の効果の測定のためのモデルＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼでの転写の間に、０．５ｍＭのＣ、Ｇ、およびＵＴＰと０．０５ｍＭのＡＴＰとの反応にα−３２Ｐ−ＡＴＰを使用したことを除いて、セレックス出願に記載したように標識した。全てのＲＮＡ−タンパク結合反応は、２００ｍＭのＫＯＡｃ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７．７、１０ｍＭのジチオスレイトールからなる「結合緩衝液」中で行った。ＲＮＡおよびタンパクの希釈物は、混合して氷上に３０分間保存して、次に５分間３７℃に移行させた。結合測定では反応容量は６０μｌで、その内５０μｌを測定した。各反応物は、予め湿した（結合緩衝液で）ニトロセルロースフィルターを通して吸引し、３ｍｌの結合緩衝液ですすぎ、次に乾燥させて測定のために計測するか、または溶出し、化学修飾について測定した。結合親和性の比較では、結果をプロットし、最大の半分の結合が生じたタンパク濃度（タンパク過剰の条件下でおよそＫｄ）を、グラフから決定した。結合測定の結果を図２７に示す。
実施例ＩＶ：トロンビンに対する核酸リガンド
　トロンビンに対する高い親和性のＲＮＡリガンドを、セレックスにより単離した。最初の候補混合物に使用したランダムＲＮＡ分子は、ランダムカセット３０ヌクレオチド（３０Ｎ）長を含有する１０２ヌクレオチドの２本鎖ＤＮＡ鋳型から、インビトロの転写により作成した。１０１３の３０ＮのＤＮＡ鋳型の集団は、インビトロの転写のためにＴ７プロモーター、およびクローニングのため５’および３’プライマーの両方に制限部位を含有する５’プライマーを使用して、ＰＣＲにより作成した。
　セレックスの各回転でのＲＮＡ濃度は、約２−４×１０−７Ｍであり、トロンビン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、１０００単位）の濃度は、１回目の１．０×１０−６から２および３回目の４．８×１０−７、そして４−１２回目の２．４×１０−７であった。ＲＮＡとタンパクの結合緩衝液は、１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス／Ｃｌ、ｐＨ７．７、１ｍＭのＤＴＴ、および１ｍＭのＭｇＣ１２であった。結合は、３７℃で５分間、１−７回目では全容量１００μｌ、そして８−１２回目では２００μｌ中で行った。各結合反応物は、ミリポアフィルター結合装置中で、予め湿した（５０ｍＭのトリス／Ｃｌ、ｐＨ７．７で）ニトロセルロースフィルター（２．５ｃｍミリポア、０．４５μＭ）で濾過して、すぐに５ｍｌの同一の緩衝液ですすいだ。ＲＮＡは、記載した（ターク（Ｔｕｅｒｋ）ら（１９９０）前述）ように、４００μｌのフェノール（０．１ＭのＮａｏＡｃ　ｐＨ５．２で平衡化させた）、新たに調製した２００μｌの７Ｍの尿素でフィルターから溶出した。ＲＮＡは２０μｇのｔＲＮＡと共に沈殿させ、ｃＤＮＡ合成の鋳型として使用し、次にＰＣＲを行い、とインビトロで転写して、次の回のＲＮＡを調製した。１−８回目に、ＲＮＡを３２Ｐ−ＡＴＰで放射標識して結合がモニターできるようにした。各回のセレックスの時間を早めるために、９−１２回目にはＲＮＡは標識しなかった。ＲＮＡは、非特異的ニトロセルロース結合についての選択を除外するために、３、４、５、８、１１、および１２回目の前に、ニトロセルロースフィルター（１．３ｃｍミリポア、０．４５μＭ）で予め濾過した。
　大量のＲＮＡのｋＤの変化を推定するため、５、８、および１２回目の後に結合曲線を描いた。これらの実験は、１．２×１０−５から２．４×１０−９Ｍの濃度のタンパク過剰で、ＲＮＡの最終濃度２×１０−９Ｍで行った。これらの結合曲線のためのＲＮＡは、３２Ｐ−ＡＴＰまたは３２Ｐ−ＵＴＰで高い特異的活性が得られるように標識した。ニトロセルロースフィルターへの結合は、フィルターに結合したＲＮＡが乾燥し、フィルター上で直接計測される以外は、各回のセレックスについて記載したとおりであった。
　ＲＮＡ配列決定。１２回目のセレックスに続いて、３２Ｐ５’末端標識した３’相補的ＰＣＲプライマーを使用して、ＲＮＡを逆転写酵素（ＡＭＶ、ライフ・サイエンス社（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．））により配列決定した。
　個々のＲＮＡのクローニングと配列決定。１２回目からのＲＮＡはＤＮＡに逆転写して、ＰＣＲにより増幅した。５’および３’固定領域での制限酵素部位で消化した物を、３０Ｎ領域を取り出すために使用し、次にこの領域を大腸菌クローニングベクターｐＵＣ１８の相補部位に連結した。連結したプラスミドＤＮＡはＪＭ１０３細胞に形質転換して、青／白コロニー形成により選別した。独特の配列を含有するコロニーを増殖させ、ミニプレップＤＮＡ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ＤＮＡ）を調製した。シーケナーゼ・キット・バージョン２．０（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　ｋｉｔ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０）と３５Ｓ−ｄＡＴＰ（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を用いて、ジデオキシ配列決定のために、２本鎖プラスミドＤＮＡを使用した。
　末端標識したＲＮＡ。末端標識のために、Ｔ７ポリメラーゼで転写したＲＮＡを、ＵＶ遮蔽によりゲル精製した。３７℃で３０分間、アルカリ性ホスファターゼ１単位で、５’末端を脱リン酸化することにより、ＲＮＡの５’末端を標識した。フェノール：クロロホルム抽出により、アルカリ性ホスファターゼ活性を破壊した。次に、３７℃で３０分間ポリヌクレオチドキナーゼとの反応で、ＲＮＡをγ３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識した。
　ＲＮＡを、３７℃で３０分間（５’−３２Ｐ）ｐＣｐとＲＮＡリガーゼを用いて、３’末端を標識した。５’および３’末端標識したＲＮＡは、８＆の８Ｍの尿素のポリアクリルアミドゲルで、ゲルバンド精製した。
　５’および３’境界の決定。各々５’または３’境界実験のために３’または５’末端標識した２ピコモルのＲＮＡを、１０μｌの反応物中の５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３（ｐＨ９．０）と１ｍＭのＥＤＴＡ中で、９０℃で１０分間加水分解した。１／５容量の３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を添加することにより、反応を停止させて、−２０℃で凍結した。１×の結合緩衝液と２ピコモルのＲＮＡを含有する、３つの容量（タンパクの量は一定に保持して、１００μｌ、４００μｌ、および１６００μｌ）中の３つのタンパク濃度（４０ｎＭ、１０ｎＭおよび２．５ｎＭ）で、結合反応を行った。反応物は３７℃で１０分間インキュベートして、予め湿したニトロセルロース膜で濾過し、５ｍｌの洗浄緩衝液ですすいだ。フィルターを賽の目に切り、それを２００μｌの７Ｍの尿素と４００μｌのフェノール（ｐＨ８．０）中で、２０℃で１５分間振盪することにより、フィルターからＲＮＡを溶出した。２００μｌのＨ２Ｏを添加後、相を分離し、水相をクロロホルムで１回抽出した。ＲＮＡを、１／５容量の３ＭのＮａＯＡｃ、２０μｇの担体ｔＲＮＡ、および２．５容量のエタノールと共に沈殿させた。このペレットを７０％のエタノールで１回洗浄し、乾燥させて、５μｌのＨ２Ｏと５μｌのホルムアミド展開色素中に再懸濁した。アルカリ性加水分解反応の残りの物は、１：１０に希釈して、等容量の展開色素を添加した。配列はしご（ｌａｄｄｅｒ）上のどこに境界が存在するかを捜し当てるために、アルカリ性加水分解反応と結合反応と並行して、リガンドのＲＮａｓｅ　Ｔ１消化物を電気泳動した。この消化を、７Ｍの尿素、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）および１ｍＭのＥＤＴＡ中の５００フェントモルの末端標識したＲＮＡと、１０単位のＲＮａｓｅ　Ｔ１を含有する１０μｌの反応物中で行った。ＲＮＡは、酵素なしで５０℃で１０分間インキュベートして、次に酵素を添加後さらに１０分間インキュベートした。１０μｌの展開色素を添加し４℃でインキュベートすることにより、この反応を遅くした。消化後すぐに、５μｌの各消化物、加水分解物、および３つの結合反応物を、１２％の配列決定ゲルで電気泳動した。
　ＵＴＰおよびＣＴＰのＲＮＡの２−ＮＨ ２ リボース誘導体のインビトロ転写。ＡＴＰ、ＧＴＰ、２−ＮＨ２−ＵＴＰおよび２−ＮＨ２−ＣＴＰを含有する反応物中で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｐＵＣ１８プラスミド・ミニプレップｄｓＤＮＡ鋳型から、ＲＮＡを直接転写した。３２Ｐ−標識したＲＮＡのために、３２Ｐ−ＡＴＰを反応物中に含めた。ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、およびＣＴＰを含有する混合物中で、未修飾ＲＮＡを転写した。
　ＲＮＡの合成。境界実験（図３０Ｂ）により決定した、トロンビンに対する高い親和性の結合のために必要なヌクレオチド配列の下限に対応するＲＮＡ分子を、アプライド・バイオシステムズ３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３９４　ＤＮＡ／ＲＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で合成した。これらのＲＮＡ分子は、２４ヌクレオチド（２４Ｒ）と３９ヌクレオチド（３９Ｒ）のクラスＩのクローン１６ヘアピン構造と、３３ヌクレオチド（３３Ｒ）のクラスＩＩのクローン２７ヘアピンを含む。
　個々のＲＮＡ分子の結合。インビトロ転写のために、独特の３０Ｎ配列を有する４つのＤＮＡプラスミドを選択した。３２Ｐ−標識したＲＮＡは、従来のヌクレオチド、ならびにＣＴＰとＵＴＰの２−ＮＨ２誘導体で転写した。これら個々のＲＮＡの結合曲線は、結合緩衝液と濃度１．０×１０−５から１．０×１０−１０Ｍのトロンビン（１０００単位、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を使用して確立した。ヒトαトロンビン（エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ、ＥＲＬ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＥＲＬ）はまた、濃度１．０×１０−６から１．０×１０−１０ＭでＲＮＡの結合親和性を測定するために使用した。ボック（Ｂｏｃｋ）ら（１９９２）（前述）が記載した５’末端標識した１本鎖１５量体ＤＮＡ　５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’（Ｇ１５Ｄ）（配列ＩＤ番号：１）の結合は、本明細書に記載した結合条件下でＥＲＬトロンビンで測定して、上述の放射標識したＲＮＡヘアピン構造による結合と比較した。
　競合実験。記載したＲＮＡリガンドがトロンビンに対するＤＮＡ１５量体Ｇ１５Ｄの結合に対して競合できるか否かを検出するために、等モル濃度（１μＭ）のトロンビンと５’末端標識したＤＮＡ１５量体Ｇ１５Ｄを、濃度を１０ｎＭから１μＭまで変化させた「冷たい」非標識のＲＮＡまたはＤＮＡリガンドの存在下でおよび非存在下で、フィルター結合条件下（約２００ｎＭのｋＤ）でインキュベートした。競合の非存在下では、ＲＮＡ結合は３０％であった。結合への競合が起きるように、最後にタンパクを添加した。競合について試験したＲＮＡリガンドは、クラスＩのクローン１６合成ＲＮＡ２４量体（２４Ｒ）と３９量体ヘアピン（３９Ｒ）、およびクラスＩＩの２７合成ＲＮＡ３３量体（３３Ｒ）であった。結果は、冷たい競合物の濃度に対する、結合したＧ１５Ｄの相対分画（競合物のある時のＧ１５／競合物のない時のＧ１５）として表される。
　クラスＩＲＮＡがクラスＩＩＲＮＡとの結合に競合できるか決定するため、そしてＧ１５Ｄ　ＤＮＡとの競合を確認するために、等モル濃度（３００ｎＭ）のトロンビンと５’末端標識したクラスＩＩのＲＮＡ３３ヘアピンを、濃度を１００ｎＭから３２μＭまで変化させた「冷たい」非標識のＲＮＡ２４またはＤＮＡ　Ｇ１５Ｄの存在下または非存在下で、フィルター結合条件下でインキュベートした。結果は、冷たい競合物の濃度に対する、結合したＲＮＡ３３の相対分画（競合物のある時のＲＮＡ３３／競合物のない時のＲＮＡ３３）として表される（図３３）。
　トロンビンの活性の発色測定とＲＮＡリガンドによる阻害。トロンビンによる発色性基質Ｓ−２２３８（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐニトロアニリン［Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ］）（カビ・ファルマシア）の加水分解を、基質からのｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）の放出による４０５ｎｍで光学的に測定した。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　トロンビン
Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ　＋　Ｈ２Ｏ　――――――――＞
　　　　　Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ＯＨ　＋　ｐＮＡ
トロンビンを最終濃度１０−８または１０−９Ｍになるように、２５０μＭのＳ２２３８基質を含有する反応緩衝液（５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＰＥＧ）に３７℃で添加した。阻害測定のために、トロンビンとＲＮＡ（等モルまたは１０倍過剰で）を、反応混合物に添加する前に、３７℃で３０秒間プレインキュベートした（図３４Ａ）。
　フィブリノーゲン凝固。３７℃で３０ｎＭのＲＮＡクラスＩまたは６０nＭのＲＮＡクラスＩＩがありまたはなしで、０．２５ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンと１ｕ／λのＲＮＡｓｅ阻害剤（ＲＮＡアシン（ＲＮＡａｓｉｎ）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を含有する、４００μｌのインキュベーション緩衝液（２０ｍＭのトリス−酢酸塩、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２）に、トロンビンを最終濃度が２．５ｎＭになるように添加した。トロンビンの添加から凝固形成までの時間を、傾斜試験により秒単位で測定した（図３４Ｂ）。
　トロンビン結合の特異性。血清タンパクのアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）とプロトロンビンに対する、全長のクラスＩＲＮＡ１６、クラスＩＩＲＮＡ２７および大量の３０Ｎ３　ＲＮＡの結合親和性を、高親和性のＲＮＡリガンドの進化に関する上述のとおり、フィルター結合により測定した。これらの実験は、最終ＲＮＡ濃度２×１０−９Ｍで、濃度１×１０−５から５×１０−１０Ｍのタンパク過剰で行った（図３５）。
実施例Ｖ：ｂＦＧＦに対する核酸リガンド。
　材料。ｂＦＧＦは、バッケム・カリフォルニア（Ｂａｃｈｅｍ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）（分子量１８，０００ダルトン、１５４アミノ酸）から入手した。組織培養等級のヘパリン（平均分子量１６，０００ダルトン）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入した。低分子量ヘパリン（５，０００ダルトン）は、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から得た。他の全ての化学物質は、少なくとも試薬等級であって市販のものを購入した。
　セレックス。セレックスプロトコールの基本的な特徴は、前述の報告に詳しく記載されている（タークとゴールド（Ｔｕｅｒｃｋ　＆　Ｇｏｌｄ）（１９９０）（前述）；タークら（１９９２ａ）（前述）；タークら（１９９２ｂ）ポリメラーゼ・チェーン反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（フェレ，Ｆ．、ムリス，Ｋ．、ギブス，Ｒ．およびロス，Ａ．（Ｆｅｒｒｅ，Ｆ．、Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．、Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．＆　Ｒｏｓｓ，Ａ．）編）バークハウサー社（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ）、ニューヨーク州）。簡単に述べると、インビトロの転写のためのＤＮＡの鋳型（これは、定常配列領域に隣接する３０のランダム位置の領域を含有する）と、対応するＰＣＲプライマーを化学的に合成した（オペロン）。オリゴヌクレオチド合成中に４つのヌクレオチドの等モル混合物を使用することにより、ランダム領域を作成した。２つの定常領域は、ＰＣＲプライマーのアニーリング部位、ｃＤＮＡ合成のためのプライマーのアニーリング部位、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域、およびベクターへのクローニングを可能にする制限酵素部位を含有するように設計した（表Ｉ参照のこと）。
　ＲＮＡ分子の最初のプールは、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、約２００ピコモル（ｐｍｏｌ）（１０１４分子）の２本鎖ＤＮＡ鋳型のインビトロの転写により調製した。転写混合物は、１００−３００ｎＭの鋳型、５単位／μｌのＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ、１２ｍＭのＭｇＣ１２を含有する４０ｍＭのトリス−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのスペルミジン、０．００２％のトリトンＸ−１００、および４％のＰＥＧよりなる。転写混合物は、３７℃で２−３時間インキュベートした。これらの条件により、典型的には１０から１００倍の転写増幅が得られた。
　高い親和性のＲＮＡリガンドのための選択は、５０μｌのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（１０．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）中で、ｂＦＧＦ（１０−１００ｐｍｏｌ）をＲＮＡ（９０−３００ｐｍｏｌ）と共に、３７℃で１０分間インキュベートし、未結合種からタンパク−ＲＮＡ複合体を、ニトロセルロースフィルター分画により分離することにより行った（タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ　＆　Ｇｏｌｄ）（１９９０）前述）。次に選択したＲＮＡ（これは典型的には全投入ＲＮＡの０．３−８％の量になる）を、フィルターから抽出して、トリ骨髄芽球増加症ウイルス（ａｖｉａｎ　ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＡＭＶ　ＲＴ、ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））によりｃＤＮＡに逆転写した。逆転写は、４８℃（３０分間）で５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．３）、６０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２、１０ｍＭのＤＴＴ、および１単位／μｌのＡＭＶ　ＲＴ中で行った。標準条件下でのＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅により、次の回のインビトロ転写のための充分な量の２本鎖ＤＮＡが得られた。
　ニトロセルロースフィルター結合測定。タンパクに結合したオリゴヌクレオチドは、ニトロセルロース膜フィルターによる濾過により効果的に、非結合種から分離される（ヤルスとバーグ（Ｙａｒｕｓ　＆　Ｂｅｒｇ）（１９７０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４５０；ロワリーとウーレンベック（Ｌｏｗａｒｙ　＆　Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ）（１９８７）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１５：１０４８３；タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ　＆　Ｇｏｌｄ）（１９９０）（前述）。ニトロセルロースフィルター（ミリポア、０．４５μｍの孔サイズ、ＨＡ型）は、フィルターマニホルドに固定して、４−１０ｍｌの緩衝液で洗浄した。３７℃で０．０１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する緩衝液（ＰＢＳ）中で、タンパクの逐次希釈物と共に３２Ｐ標識したＲＮＡでインキュベート（５−１０分間）した後、溶液を４５μｌずつ低真空下でフィルターに適用して、５ｍｌのＰＢＳで洗浄した。次にこのフィルターは、赤外ランプの下で乾燥してシンチレーションカウンターで計測した。
　クローニングと配列決定。濃縮したプールの個々のメンバーを、ｐＵＣ１８ベクターにクローン化して、記載されているように配列決定した（シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら（１９９２）（前述）；タークとゴールド（Ｔｕｅｒｋ　＆　Ｇｏｌｄ）（１９９０）前述）。
　ｂＦＧＦを標的としたセレックス実験。上述の工程に続いて、ランダム化したＲＮＡの別々のプール（各プールは約１０１４分子からなる）を用いて、ｂＦＧＦを標的とした２つのセレックス実験（実験ＡおよびＢ）を開始した。ランダム化領域に隣接する定常配列領域は、対応するプライマーと共に、各実験で異なっていた。使用した２つの鋳型／プライマーの組み合わせは表Ｉに示される。
　選択はＰＢＳ中で３７℃で実施した。実験Ｂで実施した選択を、モル比１／１００（ヘパリン／ｂＦＧＦ）のヘパリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、分子量５，０００−３２，０００ダルトン、平均分子量１６，０００ダルトン）の存在下で、選択緩衝液中で行った。ヘパリンは、ランダム化したＲＮＡのｂＦＧＦへの結合とヘパリンの量に競合する。使用したヘパリンの量は、ｂＦＧＦへのＲＮＡの結合を著しく低下させたが、排除はしなかった（データは示していないし）。ヘパリンを使用する根拠は、２つあった。第１に、ヘパリンはタンパクの小さな配置の変化を誘導し、温度変性に対してｂＦＧＦを安定化させることが知られている。第２に、ｂＦＧＦに対するランダム化ＲＮＡとのヘパリンの結合の、明らかに競合する性質が、ヘパリン結合部位についての選択の緊縮性を上昇させるか、またはＲＮＡリガンドの結合を別の部位に向けさせることが期待された。
　ｂＦＧＦへのＲＮＡリガンドの親和性の著しい改良は、実験Ａで１０回転後、実験Ｂで１３回転後に観察された。ＲＮＡリガンドのこれらの濃縮したプールの配列決定により、ランダム性からの明確な離脱が明らかになり、これはプールに残る分子の数が実質的に低下したことを示していた。次に濃縮したプールの個々のメンバーを、ｐＵＣ１８ベクターにクローン化して、前述したように配列決定した。
　実施例Ａから４９クローンを、実施例Ｂから３７クローンを配列決定した。全部で８６配列の内、７１配列は独特（ｕｎｉｑｕｅ）であった。配列相同性の重複領域に基づいて、２つの別個のファミリーを同定した（表ＩＩおよびＩＩＩ）。予想された（アービン（Ｉｒｖｉｎｅ）ら（１９９１）　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：７３９）ように、２つのファミリーのいずれのメンバーにも明白な相同性を持たない多くの配列が存在し、これらは表ＩＶに示される。
　ファミリー１リガンドからのコンセンサス配列（表ＩＩ）は、９塩基（ＣＵＡＡＣＣＡＧＧ（配列ＩＤ番号：２７））の隣接範囲により定義される。これは、強くに保存されたＡＡＣＣ配列と隆起した軸を含む、４−５ヌクレオチドループよりなる最小構造を示唆する（図４１と表ＶＩ）。ファミリー２リガンドのコンセンサス配列（表ＩＩＩ）は、さらに伸長しており、それほど保存されていない領域、ＲＲＧＧＨＡＡＣＧＹＷＮＮＧＤＣＡＡＧＮＮＣＡＣＹＹ（配列ＩＤ番号：４３）を含有する。ここで、大部分の強く保存された位置は、大きな（１９−２１ヌクレオチド）ループ内に存在している（図４１と表ＶＩＩ）。ループ内に追加の構造も可能である。
　ＲＮＡの濃縮プールの２つの別個の配列ファミリーの存在は、ｂＦＧＦへの高い親和性の結合のための２つの収束性の溶液があることを示唆する。セレックス実験Ａは、メンバーを両方の配列に関係づけた（表ＩＩ）。一方、セレックス実験Ｂからの全ての配列（ヘパリンの存在下で選択された）は、ファミリー２（表ＩＩＩ）か「その他の配列」ファミリー（表ＩＶ）に属するが、ファミリー１には見い出されなかった。これは、選択の間ｂＦＧＦがヘパリンの１００倍のモル量過剰で存在したという事実から見て驚くべきことである。しかし、ヘパリンに対するｂＦＧＦの有効モル過剰量は、おそらくはるかに小さかった。選択に使用したヘパリンの平均分子量は１６，０００ダルトンであった。各糖単位は３２０ダルトンの重さであり、少なくとも８糖単位がｂＦＧＦへの高い親和性の結合に必要であるため、平均６分子のｂＦＧＦがヘパリン分子に結合できる。このことはｂＦＧＦに対するヘパリンの比を１：１６に低下させる。実際、この量のヘパリンは、ｂＦＧＦに対する未選択のＲＮＡプールの観察された親和性を、５倍低下させるのに十分である（データは示していない）。選択緩衝液中の相対的に少量のヘパリンの存在による、観察された全リガンドファミリーの排除は、ヘパリンにより誘導されたタンパクの配置の変化の結果であろう。選択に使用したヘパリンとｂＦＧＦの相対量のため、このモデルは、タンパク−ヘパリン複合体が解離した後もヘパリンが誘導した配置が存続し、この配置の寿命はＲＮＡリガンドと平衡化できるに足る長さであることを必要とする。
　ファミリー２配列は、両方のセレックス実験から誘導したクローンからなる。これは、隣接する定常領域が典型的には、これらのリガンドの親和性を測定する時に相対的に重要でない役割を演じていることを示唆し、このファミリーのコンセンサス配列がｂＦＧＦへの高い親和性結合の主要な決定基であるという前提を支持する。
ｂＦＧＦに対する結合親和性の測定。
　平衡解離定数。最も単純な場合に、ｂＦＧＦへのＲＮＡの平衡結合は、方程式１により記述される：
　　　　ＲＮＡ・ｂＦＧＦ　⇔　ＲＮＡ　＋　ｂＦＧＦ　　　　（１）
結合したＲＮＡの分画（ｑ）は、遊離タンパクの濃度［Ｐ］に比例する（方程式２）：
　　　　ｑ　＝　ｆ［Ｐ］／（［Ｐ］　＋　Ｋｄ）　　　　　　（２）
ここでＫｄは平衡解離定数であり、ｆはニトロセルロースフィルター上のタンパク−ＲＮＡ複合体の保持の効率を反映する。ｂＦＧＦについてｆの平均値は０．８２であった。
　より高次の構造を除外するために、タンパクとのインキュベーションの前に全てのＲＮＡ溶液はＰＢＳ中で９０℃で２−３分間加熱して氷上で冷却した。この処理の後、全てのＲＮＡクローンの唯一の単一バンドが、非変性ポリアクリルアミドゲル上で検出された。
　ｂＦＧＦに対する個々のリガンドの相対結合親和性は、配列情報から予測できない。従って、４および４０ｎＭのタンパクとのインキュベーション後に、ニトロセルロースフィルターに結合した放射標識したＲＮＡの分画を測定することにより、ｂＦＧＦに結合する能力について独特の配列クローンが選別した。このスクリーニング法は、ナノモル範囲の解離定数を有する少数のクローンを同定できるほど、十分に正確であった。次にこれらの選択クローンの結合をさらに詳細に分析した。
　ｂＦＧＦに対する高親和性のＲＮＡリガンドは、両方の配列ファミリーに見い出された（表ＶＩおよびＶＩＩ）。どちらのファミリーにも属さなかったクローンの親和性は一般的に低かった（データは示していない）。
　元々の未選択のＲＮＡプールは、３００ｎＭ（セットＡ）および５６０ｎＭ（セットＢ）の親和性でｂＦＧＦに結合した（図３６）。従ってセレックスは、ｂＦＧＦに対する少なくとも２桁高い親和性を有するリガンドの単離を可能にした。
　特異性の問題に取り組むために、ｂＦＧＦに対する高親和性のリガンドの代表的なセット（ファミリー１から５Ａと７Ａ；ファミリー２から１２Ａと２６Ａ）を、他の４つのヘパリン結合タンパクへの結合について試験した。酸性ＦＧＦ、トロンビン、アンチトロンビンＩＩＩ、および血管内皮増殖因子に対する、これらのリガンドの親和性は比較的弱い（Ｋｄ＞０．３μＭ）（データは示していない）ことが見い出された。
　ｂＦＧＦリセプター結合のＲＮＡリガンド阻害。同一の４つの高い親和性のＲＮＡリガンドを、ｂＦＧＦの低いおよび高い親和性の細胞表面リセプターへの結合を阻害する能力についても試験した。
　リセプター結合の検討。ｂＦＧＦを、モスカテリ（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ）（１９８７）（前述）が記載したヨウド−ゲン（Ｉｏｄｏ−Ｇｅｎ）（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）方法により１２５Ｉで標識した。コンフルエントなベビー・ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞を大量のＰＢＳで洗浄して、次にＰＢＳ中の１０ｎｍ／ｍｌの１２５Ｉ−ｂＦＧＦ、０．１％ＨＳＡ、１単位／ｍｌのＲＮアセイン（ＲＮａｓｅｉｎ）、および高い親和性のＲＮＡの逐次希釈物を含有するαＭＥＭ培地と共に、４℃で２時間インキュベートした。別の実験で、この条件下ではＲＮＡは有意に分解していないことが確立された。低および高親和性のリセプター部位に結合した１２５Ｉ−ｂＦＧＦの量は、モスカテリ（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ）（１９８７）（前述）が記載したように測定した。
　４つ全てのリガンドは低親和性のリセプター部位に競合したが、一方未選択の（ランダム）ＲＮＡは競合しなかった（図３７Ａ）。低親和性のリセプターからｂＦＧＦの半分の置換を起こすのに要するＲＮＡの濃度は、リガンド５Ａ、７Ａおよび２６Ａについては５−２０ｎＭであり、リガンド１２Ａについては＞１００ｎＭであった。高親和性部位からの半分の置換は、リガンド５Ａ、７Ａおよび２６Ａについては１μＭ近いＲＮＡの濃度であり、リガンド１２Ａについては＞１μＭで観察された。また、ランダムＲＮＡは高親和性のリセプターとも競合しなかった。低および高親和性のリセプターからｂＦＧＦを置換するのに要するＲＮＡの濃度の観察された差は、ｂＦＧＦに対する２つのリセプタークラスの親和性の差（低親和性部位については２−１０ｎＭで、高親和性部位については１０−１００ｐＭ）の反映と予想される。
　ヘパリンは、両方の配列ファミリーからのＲＮＡリガンドを競合的に置換した（図３８）が、ｂＦＧＦからファミリー２のメンバーを置換するには、より高濃度のヘパリンを必要とした。
　セレックス方法により得られる選択的な利点は、ｂＦＧＦへの親和性に基づく。ＲＮＡリガンドは、原則としてタンパクの任意の部位に結合でき、従って適切な機能測定でリガンドの活性を試験することが重要である。選択した高親和性のリガンドについての適切な機能実験は、細胞表面リセプターへのｂＦＧＦの結合を阻害する能力の試験である、というのはｂＦＧＦはこうしてその生物活性を発揮するためである。いくつかの代表的な高親和性のＲＮＡリガンドが、ｂＦＧＦの両方のリセプタークラス（相対的結合親和性による）への結合を阻害したという事実は、これらのリガンドがリセプター結合部位でまたはその近傍で結合することを示唆する。さらにヘパリンがこれらのリガンドのｂＦＧＦへの結合に対して競合するという観察からも、この概念は支持される。ファミリー１とファミリー２からの高親和性のリガンドは、ｂＦＧＦ上の異なる部位に結合する。本発明は、２つのリガンドのファミリーからの成分を共有結合させて、ｂＦＧＦの単一のより強力な阻害剤にすることも含む。
表Ｉ．セレックス実験ＡおよびＢに使用したオリゴヌクレオチド。
　
Figure 2004097232
表ＩＩ．セレックス実験ＡおよびＢからのランダム領域のファミリー１配列。
　
Figure 2004097232
表ＩＩＩ．セレックス実験ＡおよびＢからのランダム領域のファミリー２配列。
　
Figure 2004097232
表ＩＶ．セレックス実験ＡおよびＢからのランダム領域のその他の配列。
　
Figure 2004097232
表Ｖ．セレックス実験ＡおよびＢからのランダム領域の繰り返し配列。
　
Figure 2004097232
表ＶＩ．ファミリー１からの高親和性リガンドの代表的なセットについての２次構造と解離定数（Ｋｄ）。
　
Figure 2004097232
ａ強く保存された位置は太字で示される。定常領域のヌクレオチドは小文字で示される。
表ＶＩＩ．ファミリー２からの高親和性リガンドの代表的なセットについての２次構造と解離定数（Ｋｄ）。
　
Figure 2004097232
ａ強く保存された位置は太字で示される。定常領域のヌクレオチドは小文字で示される。
配列表
（１）一般情報：
　　（ｉ）出願人：ラリー・ゴールド（Ｌａｒｒｙ　Ｇｏｌｄ）
　　　　　　　　　クレイグ・ターク（Ｃｒａｉｇ　Ｔｕｅｒｋ）
　　　　　　　　　ダイアン・タセット（Ｄｉａｎｅ　Ｔａｓｓｅｔ）
　　　　　　　　　ネボジャ・ジャンジク（Ｎｅｂｏｊｓａ　Ｊａｎｊｉｃ）
　（ｉｉ）発明の名称：核酸リガンドとその製造方法
　（ｉｉｉ）配列の数：１５９
　（ｉｖ）連絡先：
　　（Ａ）名宛人：ビートンとスワンソン特許事務所（Ｂｅａｔｏｎ　＆　Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｐ．Ｃ．）
　　（Ｂ）通り：４５３２　サウス　アルスター　ストリート　パークウェイ、スイート４０３号（４５３２　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｌｓｔｅｒ　Ｓｔｒｅｅｔ　Ｐａｒｋｗａｙ，　Ｓｕｉｔｅ　＃４０３）
　　（Ｃ）市：デンバー
　　（Ｄ）州：コロラド
　　（Ｅ）国：アメリカ合衆国
　　（Ｆ）郵便番号：８０２３７
　（ｖ）コンピューターで読める形式：
　　（Ａ）媒体型：ディスケット、３．５０インチ、記憶容量８００キロバイト
　　（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ
　　（Ｃ）オペレーティング・システム：ＭＳ−ＤＯＳ
　　（Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト　５．１
　（ｖｉ）現出願データ：
　　（Ａ）出願番号：
　　（Ｂ）出願日：
　　（Ｃ）分類：
　（ｖｉｉ）前出願データ：
　　（Ａ）出願番号：０７／７１４，１３１号
　　（Ｂ）出願日：１９９１年６月１０日
　（ｖｉｉ）前出願データ：
　　（Ａ）出願番号：０７／５３６，４２８号
　　（Ｂ）出願日：１９９０年６月１１日
　（ｖｉｉ）前出願データ：
　　（Ａ）出願番号：０８／０６１，６９１号
　　（Ｂ）出願日：１９９３年４月２２日
　（ｖｉｉ）前出願データ：
　　（Ａ）出願番号：０７／９７３，３３３号
　　（Ｂ）出願日：１９９２年１１月６日
　（ｖｉｉ）前出願データ：
　　（Ａ）出願番号：０７／９６４，６２４号
　　（Ｂ）出願日：１９９２年１０月２１日
　（ｖｉｉ）前出願データ：
　　（Ａ）出願番号：０７／９５３，６９４号
　　（Ｂ）出願日：１９９２年９月２９日
　（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報：
　　（Ａ）氏名：バリー・Ｊ・スワンソン（Ｂａｒｒｙ　Ｊ．Ｓｗａｎｓｏｎ）
　　（Ｂ）登録番号：３３，２１５
　　（Ｃ）照会／整理番号：ＮＥＸ０３／ＰＣＴ
　（ｉｘ）電話回線情報：
　　（Ａ）電話番号：（３０３）８５０−９９００
　　（Ｂ）ファックス番号：（３０３）８５０−９４０１
（２）配列ＩＤ番号：１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：１５塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１
GGTTGGTGTG GTTGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　15
（３）配列ＩＤ番号：２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３１塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２
AAAAAUCCGA AGUGCAACGG GAAAAUGCAC U　　　　　　　　　　　　　　　　　　31
（４）配列ＩＤ番号：３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：８５塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３
CCCGGATCCT CTTTACCTCT GTGTGAGATA CAGAGTCCAC AAACGTGTTC TCAATGCACC　　 60
CGGTCGGAAG GCCATCAATA GTCCC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 85
（５）配列ＩＤ番号：４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：４９塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：４
CCGAAGCTTA ATACGACTCA CTATAGGGAC TATTGATGGC CTTCCGACC　　　　　　　　 49
（６）配列ＩＤ番号：５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：２５塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５
CCCGGATCCT CTTTACCTAT GTGTG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 25
（７）配列ＩＤ番号：６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：２１塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６
UUCCGNNNNN NNNCGGGAAA A　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 21
（８）配列ＩＤ番号：７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：２４塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７
UCCGNNNNNN NNCGGGAAAA NNNN　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　24
（９）配列ＩＤ番号：８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：２７塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８
NNUUCCGNNN NNNNNCGGGA AAANNNN　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 27
（１０）配列ＩＤ番号：９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：１７塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：９
GGAUCGGAAN NAGUAGGC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 18
（１１）配列ＩＤ番号：１０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：２１塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１０
GCGGCUUUGG GCGCCGUGCU U　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 21
（１２）配列ＩＤ番号：１１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：５７塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１１
GGUCCGAAGU GCAACGGGAA AAUGCACUAU GAAAGAAUUU UAUAUCUCUA UUGAAAC　　　　57
（１３）配列ＩＤ番号：１２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３１塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１２
CCGGATCCGT TTCAATAGAG ATATAAAATT C　　　　　　　　　　　　　　　　　　31
（１４）配列ＩＤ番号：１３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：５５塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１３
GGGCAAGCTT TAATACGACT CACTATAGGT CCGAAGTGCA ACGGGAAAAT GCACT　　　　　55
（１５）配列ＩＤ番号：１４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３１塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１４
GTTTCAATAG AGATATAAAA TTCTTTCATA G　　　　　　　　　　　　　　　　　　31
（１６）配列ＩＤ番号：１５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：８９塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５
GTTTCAATAG AGATATAAAA TTCTTTCATA GNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN　　 60
NAGTGCATTT TCCCGTTGCA CTTCGGACC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 89
（１７）配列ＩＤ番号：１６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：８３塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１６
CCCGGATCCT CTTTACCTCT GTGTGAGATA CAGAGTCCAC AACGTGTTCT CAATGACCCG　　 60
GTCGGAAGGC CATCAATAGT CCC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 83
（１８）配列ＩＤ番号：１７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：５０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１７
CCGAAGCTTA ATACGACTCA CTATAGGGAC TATTGATGGG CCTTCCGACC　　　　　　　　50
（１９）配列ＩＤ番号：１８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：４８塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１８
CCGAAGCTTA ATACGACTCA CTATAGGGAG CTCAGAATAA ACGCTCAA　　　　　　　　　48
（２０）配列ＩＤ番号：１９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：８７塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１９
GCCGGATCCG GGCCTCATGT CGAANNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN　　 60
NNNNTTGAGC GTTTATTCTG AGCTCCC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 87
（２１）配列ＩＤ番号：２０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：２４塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２０
GCCGGATCCG GGCCTCATGT CGAA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　24
（２２）配列ＩＤ番号：２１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７７塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２１
GGGAGCUCAG AAUAAACGCU CAANNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNUUCGACA　　 60
UGAGGCCCGG AUCCGGC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　77
（２３）配列ＩＤ番号：２２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：４８塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２２
CCGAAGCTTA ATACGACTCA CTATAGGGAG CTCAGAATAA ACGCTCAA　　　　　　　　　48
（２４）配列ＩＤ番号：２３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：２４塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２３
GCCGGATCCG GGCCTCATGT CGAA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　24
（２５）配列ＩＤ番号：２４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７９塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２４
GGGAGAUGCC UGUCGAGCAU GCUGNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNGUAGCU　　 60
AAACAGCUUU GUCGACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　79
（２６）配列ＩＤ番号：２５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：５０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２５
CCCGAAGCTT AATACGACTC ACTATAGGGA GATGCCTGTC GAGCATGCTG　　　　　　　　50
（２７）配列ＩＤ番号：２６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：２５塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２６
CCCGTCGACA AAGCTGTTTA GCTAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 25
（２８）配列ＩＤ番号：２７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：９塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２７
CUAACCNGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　9
（２９）配列ＩＤ番号：２８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２８
UGCUAUUCGC CUAACUCGGC GCUCCUACCU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（３０）配列ＩＤ番号：２９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：２９
AUCUCCUCCC GUCGAAGCUA ACCUGGCCAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（３１）配列ＩＤ番号：３０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３０
UCGGCGAGCU AACCAAGACA CUCGCUGCAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（３２）配列ＩＤ番号：３１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３１
GUAGCACUAU CGGCCUAACC CGGUAGCUCC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（３３）配列ＩＤ番号：３２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３２
ACCCGCGGCC UCCGAAGCUA ACCAGGACAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（３４）配列ＩＤ番号：３３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３３
UGGGUGCUAA CCAGGACACA CCCACGCUGU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（３５）配列ＩＤ番号：３４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３４
CACGCACAGC UAACCAAGCC ACUGUGCCCC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（３６）配列ＩＤ番号：３５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３５
CUGCGUGGUA UAACCACAUG CCCUGGGCGA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（３７）配列ＩＤ番号：３６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３６
UGGGUGCUUA ACCAGGCCAC ACCCUGCUGU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（３８）配列ＩＤ番号：３７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３７
CUAGGUGCUA UCCAGGACUC UCCCUGGUCC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（３９）配列ＩＤ番号：３８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３８
UGCUAUUCGC CUAGCUCGGC GCUCCUACCU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（４０）配列ＩＤ番号：３９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：３９
AGCUAUUCGC CCAACCCGGC GCUCCCGACC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（４１）配列ＩＤ番号：４０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：２９塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：４０
ACCAGCUGCG UGCAACCGCA CAUGCCUGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 29
（４２）配列ＩＤ番号：４１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：４１
CAGGCCCCGU CGUAAGCUAA CCUGGACCCU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（４３）配列ＩＤ番号：４２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：４２
UGGGUGCUAA CCACCACACA CUCACGCUGU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（４４）配列ＩＤ番号：４３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：２６塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：４３
RRGGHAACGY WNNGDCAAGN NCACYY　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　26
（４５）配列ＩＤ番号：４４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：４４
GGGUAACGUU GUGACAAGUA CACCUGCGUC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（４６）配列ＩＤ番号：４５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：４５
GGGGCAACGC UACAGACAAG UGCACCCAAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（４７）配列ＩＤ番号：４６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：４６
CGUCAGAAGG CAACGUAUAG GCAAGCACAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（４８）配列ＩＤ番号：４７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：４７
CCUCUCGAAG ACAACGCUGU GACAAGACAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（４９）配列ＩＤ番号：４８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：４８
AGUGGGAAAC GCUACUUGAC AAGACACCAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（５０）配列ＩＤ番号：４９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：４９
GGCUACGCUA AUGACAAGUG CACUUGGGUG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（５１）配列ＩＤ番号：５０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５０
CUCUGGUAAC GCAAUGUCAA GUGCACAUGA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（５２）配列ＩＤ番号：５１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５１
AGCCGCAGGU AACGGACCGG CGAGACCAUU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（５３）配列ＩＤ番号：５２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５２
ACGAGCUUCG UAACGCUAUC GACAAGUGCA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（５４）配列ＩＤ番号：５３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５３
AAGGGGAAAC GUUGAGUCCG GUACACCCUG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（５５）配列ＩＤ番号：５４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５４
AGGGUAACGU ACUGGCAAGC UCACCUCAGC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（５６）配列ＩＤ番号：５５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５５
GAGGUAACGU ACGACAAGAC CACUCCAACU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（５７）配列ＩＤ番号：５６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５６
AGGUAACGCU GAGUCAAGUG CACUCGACAU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（５８）配列ＩＤ番号：５７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５７
GGGAAACGCU AUCGACGAGU GCACCCGGCA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（５９）配列ＩＤ番号：５８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５８
CCGAGGGUAA CGUUGGGUCA AGCACACCUC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（６０）配列ＩＤ番号：５９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：５９
UCGGGGUAAC GUAUUGGCAA GGCACCCGAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（６１）配列ＩＤ番号：６０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６０
GGUAACGCUG UGGACAAGUG CACCAGCUGC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（６２）配列ＩＤ番号：６１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６１
AGGGUAACGU ACUGGCAAGC UCACCUCAGC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（６３）配列ＩＤ番号：６２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６２
AGGGUAACGU AUAGUCAAGA CACCUCAAGU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（６４）配列ＩＤ番号：６３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６３
GGGUAACGCA UUGGCAAGAC ACCCAGCCCC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（６５）配列ＩＤ番号：６４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６４
GAGGAAACGU ACCGUCGAGC CACUCCAUGC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（６６）配列ＩＤ番号：６５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６５
AGGUAACGCU GAGUCAAGUG CACUCGACAU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（６７）配列ＩＤ番号：６６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６６
GGGUAACGUG UGACAAGAUC ACCCAGUUUG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（６８）配列ＩＤ番号：６７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６７
CACAGGGCAA CGCUGCUGAC AAGUGCACCU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（６９）配列ＩＤ番号：６８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６８
ACGCCAAGUG AGUCAGCAAC AGAGCGUCCG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（７０）配列ＩＤ番号：６９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：６９
CCAGUGAGUC CUGGUAAUCC GCAUCGGGCTU　　　　　　　　　　　　　　　　　　 30
（７１）配列ＩＤ番号：７０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７０
CUUCAGAACG GCAUAGUGGU CGGCCGCGCC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（７２）配列ＩＤ番号：７１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７１
AGGUCACUGC GUCACCGUAC AUGCCUGGCC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（７３）配列ＩＤ番号：７２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７２
UCCAACGAAC GGCCCUCGUA UUCAGCCACC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（７４）配列ＩＤ番号：７３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７３
ACUGGAACCU GACGUAGUAC AGCGACCCUC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（７５）配列ＩＤ番号：７４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：２９塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７４
UCUCGCUGCG CCUACACGGC AUGCCGGGA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 29
（７６）配列ＩＤ番号：７５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７５
GAUCACUGCG CAAUGCCUGC AUACCUGGUC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（７７）配列ＩＤ番号：７６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７６
UCUCGCUGCG CCUACACGGC AUGCCCGGGA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（７８）配列ＩＤ番号：７７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７７
UGACCAGCUG CAUCCGACGA UAUACCCUGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（７９）配列ＩＤ番号：７８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７８
GGCACACUCC AACGAGGUAA CGUUACGGCG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（８０）配列ＩＤ番号：７９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：７９
AGCGGAACGC CACGUAGUAC GCCGACCCUC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（８１）配列ＩＤ番号：８０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８０
ACCCACGCCC GACAACCGAU GAGUUCUCGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（８２）配列ＩＤ番号：８１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８１
UGCUUUGAAG UCCUCCCCGC CUCUCGAGGU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（８３）配列ＩＤ番号：８２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８２
AUGCUGAGGA UAUUGUGACC ACUUCGGCGU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（８４）配列ＩＤ番号：８３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：２９塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８３
ACCCACGCCC GACAACCGAU GAGCUCGGA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 29
（８５）配列ＩＤ番号：８４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８４
AGUCCGGAUG CCCCACUGGG ACUACAUUGU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（８６）配列ＩＤ番号：８５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８５
AAGUCCGAAU GCCACUGGGA CUACCACUGA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（８７）配列ＩＤ番号：８６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８６
ACUCUCACUG CGAUUCGAAA UCAUGCCUGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（８８）配列ＩＤ番号：８７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８７
AGGCUGGGUC ACCGACAACU GCCCGCCAGC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（８９）配列ＩＤ番号：８８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８８
AGCCGCAGGU AACGGACCGG CGAGACCACU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（９０）配列ＩＤ番号：８９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：８９
GCAUGAAGCG GAACUGUAGU ACGCGAUCCA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（９１）配列ＩＤ番号：９０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：９０
GGGUAACGUU GUGACAAGUA CACCUGCGUU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（９２）配列ＩＤ番号：９１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：９１
GGGUAACGUU GUGACAAGUA CACCUGCGUC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（９３）配列ＩＤ番号：９２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：９２
GGGUAACGUU GUGACAAGUA CACCUGCGUC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（９４）配列ＩＤ番号：９３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：９３
GGGUAACGUU GUGACAACUA CACCUGCGUC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（９５）配列ＩＤ番号：９４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：９４
GGGUAACGUU GUGACAACUA CACCUGCGUC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（９６）配列ＩＤ番号：９５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：９５
GGGUAACGUU GUGACAACUA CACCUGCGUC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（９７）配列ＩＤ番号：９６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：９６
CGUCAGAAGG CAACGUAUAG GCAAGCACAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（９８）配列ＩＤ番号：９７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：９７
GUAGCACUAU CGGCCUAACC CGGUAGCUCC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（９９）配列ＩＤ番号：９８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：９８
ACCCGCGGCC UCCGAAGCUA ACCAGGACAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１００）配列ＩＤ番号：９９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：９９
AGGUCACUGC GUCACCGUAC AUGCCUGGCC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１０１）配列ＩＤ番号：１００の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１００
AGGUCACUGC GUCACCGUAC AUGCCUGGCC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１０２）配列ＩＤ番号：１０１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１０１
GGCACACUCC AACGAGGUAA CGUUACGGCG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１０３）配列ＩＤ番号：１０２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１０２
GGGGCAACGC UACAGACAAG UGCACCCAAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１０４）配列ＩＤ番号：１０３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１０３
GGGGCAACGC UACAGACAAG UGCACCCAAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１０５）配列ＩＤ番号：１０４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１０４
GGGGCAACGC UACAGACAAG UGCACCCAAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１０６）配列ＩＤ番号：１０５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１０５
UGGGUGCUAA CCAGGACACA CCCACGCUGU　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１０７）配列ＩＤ番号：１０６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１０６
CCGAGGGUAA CGUUGGGUCA AGCACACCUC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１０８）配列ＩＤ番号：１０７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１０７
GGGAAACGCU AUCGACGAGU GCACCCGGCA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１０９）配列ＩＤ番号：１０８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１０８
GGGAAACGCU AUCGACGAGU GCACCCGGCA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１１０）配列ＩＤ番号：１０９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１０９
ACUCUCACUG CGAUUCGAAA UCAUGCCUGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１１１）配列ＩＤ番号：１１０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１１０
GCAUGAAGCG GAACUGUAGU ACGCGAUCCA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１１２）配列ＩＤ番号：１１１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１１１
GCAUGAAGCG GAACUGUAGU ACGCGAUCCA　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１１３）配列ＩＤ番号：１１２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１１２
AGGGUAACGU ACUGGCAAGC UCACCUCAGC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１１４）配列ＩＤ番号：１１３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１１３
AGGGUAACGU ACUGGCAAGC UCACCUCAGC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１１５）配列ＩＤ番号：１１４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３０塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１１４
GGUAACGCUG UGGACAAGUG CACCAGCUGC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　30
（１１６）配列ＩＤ番号：１１５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３２塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１１５
UAGCUCGUGA GGCUUUCGUG CUGUUCCGAG CU　　　　　　　　　　　　　　　　　 32
（１１７）配列ＩＤ番号：１１６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３１塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１１６
UGCAUGUGAG GCGGUAACGC UGUUCCGUGC U　　　　　　　　　　　　　　　　　　31
（１１８）配列ＩＤ番号：１１７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３３塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１１７
UGGUGAGUGA GGCCGAUGCU GUUCCUCGCC GCU　　　　　　　　　　　　　　　　　33
（１１９）配列ＩＤ番号：１１８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３５塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１１８
UGACGCGCGA GGUCUUGGUA CUGUUCCGUG GCUCU　　　　　　　　　　　　　　　　35
（１２０）配列ＩＤ番号：１１９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３３塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１１９
UCUGGGUGAG ACUUGAAGUC GUUCCCCAGG UCU　　　　　　　　　　　　　　　　　33
（１２１）配列ＩＤ番号：１２０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３３塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１２０
UCCCGGUGAA GCAUAAUGCU GUUCCUGGGG UCU　　　　　　　　　　　　　　　　　33
（１２２）配列ＩＤ番号：１２１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３３塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１２１
UGGGAGUGAG GUUCCCCGUU CCUCCCGCAC CCU　　　　　　　　　　　　　　　　　33
（１２３）配列ＩＤ番号：１２２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３３塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１２２
UAGCGAUGUG AAGUGAUACU GGUCCAUCGU GCU　　　　　　　　　　　　　　　　　33
（１２４）配列ＩＤ番号：１２３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３２塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１２３
UCACAGUGAG CCUUCUGGUG GUCCUGUGUG CU　　　　　　　　　　　　　　　　　 32
（１２５）配列ＩＤ番号：１２４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３３塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１２４
UUGUUGUGAG UGGUUGAUUC CAUGGUCCAA CCU　　　　　　　　　　　　　　　　　33
（１２６）配列ＩＤ番号：１２５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３３塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１２５
UGCCUGUGAG CUGUUUAGCG GUCCAGGUCG UCU　　　　　　　　　　　　　　　　　33
（１２７）配列ＩＤ番号：１２６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３２塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１２６
UCAAGGCGAA GACUUAGUCU GCUCCCUGUG CU　　　　　　　　　　　　　　　　　 32
（１２８）配列ＩＤ番号：１２７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３２塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１２７
UUGCGUCGAA GUUAAUUCUG GUCGAUGCCA CU　　　　　　　　　　　　　　　　　 32
（１２９）配列ＩＤ番号：１２８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３４塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１２８
UUUCAAUGAG GUAUGUAAUG AUGGUCGUGC GCCU　　　　　　　　　　　　　　　　 34
（１３０）配列ＩＤ番号：１２９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３３塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１２９
UGCGGGAGAG UCUUUUGACG UUGCUCCUGC GCU　　　　　　　　　　　　　　　　　33
（１３１）配列ＩＤ番号：１３０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３６塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１３０
UCAUGGGAGC CCAUCGAUUC UGGGUGUUGC CUAUGA　　　　　　　　　　　　　　　 36
（１３２）配列ＩＤ番号：１３１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３２塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１３１
UUGCACAGAG CCAAAUUUGG UGUUGCUGUG CU　　　　　　　　　　　　　　　　　 32
（１３３）配列ＩＤ番号：１３２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３３塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１３２
UGGCCAGAGC UUAAAUUCAA GUGUUGCUGG CCU　　　　　　　　　　　　　　　　　33
（１３４）配列ＩＤ番号：１３３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３７塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１３３
UCAUAGCAGU CCUUGAUACU AUGGAUGGUG GCUAUGA　　　　　　　　　　　　　　　37
（１３５）配列ＩＤ番号：１３４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３３塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１３４
UGGAUGCAAG UUAACUCUGG UGGCAUCCGU CCU　　　　　　　　　　　　　　　　　33
（１３６）配列ＩＤ番号：１３５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：３４塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１３５
UCAGUGGAGA UUAAGCCUCG CUAGGGGCCG CUAU　　　　　　　　　　　　　　　　 34
（１３７）配列ＩＤ番号：１３６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：２８塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１３６
GGUCCGAAGU GCAACGGGGAA AAUGCAC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　27
（１３８）配列ＩＤ番号：１３７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７６塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１３７
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GAGGAUCGAA GUUAGUAGGC UUUGUGUGCU　　　　　　　　50
CGUAGCUAAA CAGCUUUGUC GACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　76
（１３９）配列ＩＤ番号：１３８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７４塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１３８
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GUACUGGAUC GAAGGUAGUA GGCAGUCACG　　　　　　　　50
UAGCUAAACA GCUUUGUCGA CGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　74
（１４０）配列ＩＤ番号：１３９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７４塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１３９
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GAUAUCACGG AUCGAAGGAA GUAGGCGUGG　　　　　　　　50
UAGCUAAACA GCUUUGUCGA CGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　74
（１４１）配列ＩＤ番号：１４０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７５塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１４０
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GCCUUUCCCG GGUUCGAAGU CAGUAGGCCG　　　　　　　　50
GGUAGCUAAA CAGUUUGUCG ACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 75
（１４２）配列ＩＤ番号：１４１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７５塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１４１
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GCACCCGGAU CGAAGUUAGU AGGCGUGAGU　　　　　　　　50
GUAGCUAAAC AGCUUUGUCG ACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 75
（１４３）配列ＩＤ番号：１４２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７６塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１４２
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GUGUACGGAU CGAAGGUAGU AGGCAGGUUA　　　　　　　　50
CGUAGCUAAA CAGCUUUGUC GACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　76
（１４４）配列ＩＤ番号：１４３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７６塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１４３
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GCAUACGGAU CGAAGUUAGU AGGCCGAGGU　　　　　　　　50
GGUAGCUAAA CAGCUUUGUC GACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　76
（１４５）配列ＩＤ番号：１４４の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７６塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１４４
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GAUUGUUGCG GAUCGAAGUG AGUAGGCGCU　　　　　　　　50
AGUAGCUAAA CAGCUUUGUC GACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　76
（１４６）配列ＩＤ番号：１４５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７６塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１４５
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GUGUACUGGA UCGAAGGUAG UAGGCAGUCA　　　　　　　　50
CGUAGCUAAA CAGCUUUGUC GACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　76
（１４７）配列ＩＤ番号：１４６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：６９塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１４６
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GAUCGAAGUU AGUAGGAGCG UGUGGUAGCU　　　　　　　　50
AAACAGCUUU GUCGACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　69
（１４８）配列ＩＤ番号：１４７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：８１塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１４７
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GACGCUGGAG UCGGAUCGAA AGGUAAGUAG　　　　　　　　50
GCGACUGUAG CUAAACAGCU UUGUCGACGG G　　　　　　　　　　　　　　　　　　81
（１４９）配列ＩＤ番号：１４８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７５塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１４８
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GGGGUCGGAU CGAAAGGUAA GUAGGCGACU　　　　　　　　50
GUAGCUAAAC AGCUUUGUCG ACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 75
（１５０）配列ＩＤ番号：１４９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７４塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１４９
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GAUAUCACGG AUCGAAAGAG AGUAGGCGUG　　　　　　　　50
UAGCUAAACA GCUUUGUCGA CGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　74
（１５１）配列ＩＤ番号：１５０の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７６塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５０
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GUGUACUGGA UCGAAGGUAG UAGGCAGGCA　　　　　　　　50
CGUAGCUAAA CAGCUUUGUC GACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　76
（１５２）配列ＩＤ番号：１５１の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７５塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５１
AGAUGCCUGU CGDGCAUGCU GAUAUCACGG AUCGAAGGAA AGUAGGCGUG　　　　　　　　50
GUAGCUAAAC AGCUUUGUCG ACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 75
（１５３）配列ＩＤ番号：１５２の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７２塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５２
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GGUGCGGCUU UGGGCGCCGU GCUUGGCGUA　　　　　　　　50
GCUAAACAGC UUUGUCGACG GG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　72
（１５４）配列ＩＤ番号：１５３の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７１塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５３
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GGUGCGGCUU UGGGCGGCCGU GCUUACGUAG　　　　　　　 50
CUAAACAGCU UUGUCGACGG G　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 71
（１５５）配列ＩＤ番号：１５４の情報：
　（ｉ）配列の特徴
　　（Ａ）長さ：７２塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５４
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GGUGCGGCUU UGGGCGCCGU GCUUGACGUA　　　　　　　　50
GCUAAACAGC UUUGUCGACG GG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　72
（１５６）配列ＩＤ番号：１５５の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７２塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５５
AGAUGCCUGU CGAGCAUGCU GGGGCGGCUU UGGGCGCCGU GCUUGACGUA　　　　　　　　50
GCUAAACAGC UUUGUCGACG GG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　72
（１５７）配列ＩＤ番号：１５６の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７９塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５６
GGGAGAUGCC UGUCGAGCAU GCUGAGGAUC GAAGUUAGUA GGCUUUGUGU　　　　　　　　50
GCUCGUAGCU AAACAGCUUU GUCGACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 79
（１５８）配列ＩＤ番号：１５７の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７９塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５７
GGGAGAUGCC UGUCGAGCAU GCUGCAUCCG GAUCGAAGUU AGUAGGCCGA　　　　　　　　50
GGUGGUAGCU AAACAGCUUU GUCGACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 79
（１５９）配列ＩＤ番号：１５８の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７９塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５８
GGGAGAUGCC UGUCGAGCAU GCUGAUUGUU GCGGAUCGAA GUGAGUAGGC　　　　　　　　50
GCUAGUAGCU AAACAGCUUU GUCGACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 79
（１６０）配列ＩＤ番号：１５９の情報：
　（ｉ）配列の特徴：
　　（Ａ）長さ：７５塩基対
　　（Ｂ）型：核酸
　　（Ｃ）鎖の数：１本鎖
　　（Ｄ）トポロジー：直鎖状
　（ｘｉ）配列の記載：配列ＩＤ番号：１５９
GGGAGAUGCC UGUCGAGCAU GCUGGUGCGG CUUUGGGCGC CGUGCUUGAC　　　　　　　　50
GUAGCUAAAC AGCUUUGUCG ACGGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 75
図１は、ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＨＩＶ−ＲＴ）の高親和性阻害性リガンドを記載する、１次および２次セレックス実験によるコンセンサスにせ結び目を示す。コンセンサス２次構造はにせ結び目であり；このにせ結び目の５’らせん（軸１）は１次配列のレベルで保存され、３’らせん、すなわち軸２は保存されていない。Ｘは、非保存のヌクレオチドの位置を示し；Ｘ−Ｘ’は好ましい塩基対を示す。ここに示すように２６のヌクレオチドに番号がつけられている。 図２は、５’情報の境界の改良を示す。一連のモデルリガンドは、鋳型オリゴからＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した（ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）ら（１９８７）　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１５：８７８３）。左上に描いたのは完全なリガンドＢである。右端には、四角で囲まれた領域に生じる個々のリガンドＡからＥの変動を示す。これらのモデルリガンドの個々の結合曲線を、グラフに示す。 図３は、ＨＩＶ−ＲＴへの結合に及ぼす、リガンドＢ配列内の種々のヌクレオチド置換の効果を示す。種々の置換と、リガンドＢの結合への割合で表現された、その結果としてのＨＩＶ−ＲＴへの親和性が記載される。リガンドＢは、各実験で試験された対照であり；リガンドＢの親和性を１．０として標準化して、相対親和性を示す（リガンドＢのＫｄを各リガンドのＫｄで割る）。種々の末端を切り取ったリガンドＢの親和性も示す。Ｕ１−Ｇ１６を置換するアステリスク付のＧ−Ｇに関連する値は、図２のリガンドＣに由来する。 図４は、リガンドＢの変性したコンフォメーションに対する非変性コンフォメーションの化学プローブを示す。リガンドＢの種々のヌクレオチドを、非変性および変性した条件下で化学物質と反応させて、修飾した位置を測定し、電気泳動にかけ、比較のために可視化して比較した。■はその位置の塩基の反応性の高い塩基対形成基を示し、□は部分的反応性を示す；▲はプリンＮ７位の強力な反応性を示し、△は部分的反応性を示す（ＤＥＰＣでの修飾に対して）。クエスチョンマークは、Ｇ（−２）とＧ（−１）上のこれらの位置は、ゲル上のバンドの密集により区別できなかったことを示す。 図５は、ＨＩＶ−ＲＴに結合した時のリガンドＢの修飾可能な基の反応性を示す。ＨＩＶ−ＲＴに結合した時に、非変性コンフォメーションの反応性に比較して変化した反応性を示した基を図に示す。 図６は、ＨＩＶ−ＲＴと複合体を形成するリガンドＢの修飾妨害結果を示す。修飾についての記号は、四角で囲まれた凡例にあるとおりである。ＨＩＶ−ＲＴへの結合（選択される集団中でその位置で低下する修飾に反映される）に対して、強く（黒の記号）または部分的に（白の記号）選択される修飾を示す。 図７は、右上に示されるリガンドＢ配列のリボース上のヒドロキシルの代わりの２’−メトキシの置換を示す。白丸は示される位置でのヒドロキシル基を示し、黒丸はメトキシ置換を示す。 図８は、Ｕ１からＡ５とＡ１２からＡ２０の位置での２’−ヒドロキシルに対する２’−メトキシリボースの混合集団からのＨＩＶ−ＲＴによる選択を示す。下記の配列（配列ＩＤ番号：２）：５’−（ＡＡＡＡＡ）ｄ（ＵＣＣＧＡ）ｘ（ＡＧＵＧＣＡ）ｍ（ＡＣＧＧＧＡＡＡＡ）ｘ（ＵＧＣＡＣＵ）ｍ−３（ここで、下付文字の「ｄ」は２’−デオキシを示し、下付文字の「ｘ」はこれらのヌクレオチドがホスホラミジト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）試薬と５０−５０混合されてリボース上の２’−メトキシまたは２’−ヒドロキシルが生じることを示し、そして下付文字の「ｍ」はこれらのヌクレオチドが全てリボース上の２’−メトキシであることを示す）を有するオリゴヌクレオチドを合成した。 図９は、出発物質のＲＮＡと、実験の一部としてＨＩＶ−ＲＴを用いてセレックスから得られた配列の集合（配列ＩＤ番号：１１５−１３５）を示す。 図１０は、図９に示される配列のリストから得られた、コンセンサス伸長ＨＩＶ−ＲＴリガンド（配列ＩＤ番号：１３６）を示す。 図１１は、ＨＩＶ−ＲＴのにせ結び目リガンドの改定した記述を示す。図１の標識に関する約束に加えて、Ｓ−Ｓ’はこの位置での好ましいＣ−ＧまたはＧ−Ｃ塩基対を示す。 図１２は、セレックス実験から得られたＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクの高い親和性ＲＮＡリガンドの配列を示す。このＲＮＡの特定の塩基に関して使用される番号付きの概略図を示す。この配列はＥＮＵを用いる化学修飾に使用された。図１２はまた、ａ）でＤＭＳ、ケトキサール（ｋｅｔｈｏｘａｌ）、ＣＭＣＴ、およびＤＥＰＣを用いた化学修飾実験に使用された伸長したＲＮＡ配列も示す。伸長したリガンド配列の１次伸長に使用されたオリゴヌクレオチドの配列をｂ）に示す。 図１３は、非変性条件下でのＨＩＶ−１　ＲｅｖリガンドＲＮＡの化学修飾の結果を示す。ａ）には化学修飾試薬、その特異性および部分的および全面的修飾を示す記号をリストしている。修飾された塩基毎に表示された修飾の程度とタイプと一緒に、ＲＮＡ配列を示す。ｂ）には、修飾とコンピューター構造予測データに対応する、ＨＩＶ−１　Ｒｅｖ　ＲＮＡリガンドのらせん、隆起、およびヘアピン構造要素を示す。 図１４は、ＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクへの結合を妨害するリガンドＲＮＡの化学修飾の結果を示す。タンパク結合を妨害する修飾を記載し、強い妨害と弱い妨害に分類した。記号は、塩基対形成修飾、Ｎ７修飾、またはリン酸修飾のいずれかを意味する。 図１５は、リン酸アルキル化の修飾妨害値（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｖａｌｕｅ）を示す。データはＡ１７の３’リン酸に対して標準化してある。 図１６は、Ｎ３ＣとＮ１ＡのＤＭＳ修飾の修飾妨害値を示す。データはＣ３６；Ａ３４に対して標準化してある。 図１７は、Ｎ１ＧとＮ２Ｇのケトキサール修飾の修飾妨害値を示す。データはＧ５に対して標準化してある。 図１８は、Ｎ３ＵとＮ１ＧのＣＭＣＴ修飾の修飾妨害値を示す。データはＵ３８に対して標準化してある。 図１９は、Ｎ７ＡとＮ７ＧのＤＥＰＣ修飾の修飾妨害値を示す。データはＧ１９；Ａ３４に対して標準化してある。 図２０は、ＨＩＶ−１　Ｒｅｖタンパクの存在下でのＲＮＡリガンドの化学修飾を示す。非変性条件下であるがタンパクの存在しない条件下での修飾に比較して、タンパクの存在下での修飾の低下または修飾の増強のいずれかを示した位置を示す。 図２１（図２１−１及び図２１−２）は、セレックスで使用された「６ａ」の偏ったランダム領域の隣接する５’と３’配列を示す。最初のＲＮＡ集団を産生する鋳型は、下記のオリゴヌクレオチド：
Figure 2004097232
（ここで、鋳型オリゴの小文字は、各位置で６２．５％の小文字のものと各１２．５％の他の３つのヌクレオチドの量での試薬の混合物を合成に使用したことを示す）から作成された。６ａ配列の下に記載したのは、このＲＮＡの集団を有するＲｅｖタンパクを用いてセレックスを６回実施した後にクローン化した３８単離体の配列である。これらの単離体に見い出される６ａ配列との差は太字で示してある。下線部は、モチーフＩ　Ｒｅｖリガンドの隆起に隣接する軸を包含する予測された塩基対である。５’と３’の固定隣接配列から含まれる塩基は小文字である。
図２１−２は図２１−１の続きである。 図２２（図２２−１及び図２２−２）は：Ａ）図２１に見い出された配列の集合中の、Ｒｅｖ　６ａリガンド配列の対応する位置に見い出された各ヌクレオチドの数；Ｂ）これらの位置に見い出された各ヌクレオチドの小数で示した頻度（ｘ÷３８、ここでｘは１からの数）；そしてＣ）Ｂ）の小数で示した頻度と、鋳型合成の間の投入したオリゴヌクレオチドの混合物に基づく予測頻度との差［「野生型」の位置については、（ｘ÷３８）−０．６２５、そして代替配列については、（ｘ÷３８）−０．１２５］、を含む３セットの表を示す。 図２２−２は図２２−１の続きである。 図２３（図２３−１及び図２３−２）は：Ａ）図２１に見い出された配列の集合中の、Ｒｅｖ　６ａリガンド配列の対応する位置に見い出された各ヌクレオチドの数；Ｂ）これらの位置に見い出された各ヌクレオチドの小数で示した頻度（ｘ÷３８、ここでｘはＡからの数）；そしてＣ）Ｂ）の小数で示した頻度と、鋳型合成の間の投入したオリゴヌクレオチドの混合物に基づく予測頻度との差［「野生型」の位置については、（ｘ÷３８）−０．３９５；１つの代替ヌクレオチドと１つの野生型ヌクレオチドを含有する塩基対については、（ｘ÷３８）−０．０７８；そして２つの代替ヌクレオチドの塩基対については（ｘ÷３８）−０．０１６］、を含む３セットの表を示す。値はプリンとピリミジン対のみが示され、他の８つのピリミジンとプリン対は集合的に数えて「その他」として示し、セクションＣ）に（ｘ÷３８）−０．２５２として計算してある。 図２３−２は図２３−１の続きである。 図２４は、あらかじめ決定されたＲｅｖタンパクリガンドモチーフＩコンセンサス（１９９１年６月１０日に出願した、合衆国特許出願番号０７／７１４，１３１号；ＷＯ９１／１９８１３号）を示す。同じ出願から６ａ配列、および好ましいコンセンサスは、図２２と２３に与えられるデータから解釈されるように、偏ったランダム化セレックスにより誘導される。好ましいコンセンサス中の絶対的に保存される位置は太字で示し、そしてＳ−Ｓ’はＣ−ＧまたはＧ−Ｃ塩基対を示す。 図２５は、ｔａｔタンパクと相互作用するＨＩＶ−１からの天然ＲＮＡ配列（すなわちＴＡＲ　ＲＮＡ）を示す。配列の四角で囲んだ領域は、ｔａｔ−ＴＡＲ相互作用において重要であることが見い出されたヌクレオチドである。 図２６は、ＨＩＶ−１　ｔａｔタンパクに対する核酸リガンドとして本発明により単離されたリガンドの配列を示す。これらの配列は、３つのモチーフ（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）中の共通の２次構造と１次配列により分類される。ＲＮＡらせんを予測させる逆繰り返し配列を、矢印で示す。各モチーフ中の一次配列の相同の領域は、破線の四角で囲まれている。高い親和性結合に必須の配列情報の境界は、実線の四角で示してある。配列１と１７は、３つの同定されたモチーフのいずれにも適合しない。 図２７は、図２６に示す各リガンドモチーフのコンセンサス２次構造と一次配列の概略図を示す。Ｘは非保存ヌクレオチドの位置を示す。Ｘ’はらせん中のその位置でのＸに相補的な塩基対を示し、Ｒはプリンを、そしてＹはピリミジンを示す。モチーフＩＩＩ中の破線は、そのループの部分での可変数のヌクレオチドを示す。 図２８は、図２６から選択されたリガンドＲＮＡ、および４０ｎ　ＲＮＡ候補混合物のニトロセルロースフィルターへの、ｔａｔタンパク濃度依存性の結合を示す。 図２９は、セレックスにより単離されたヒト・トロンビン・タンパク（シグマ（Ｓｉｇｍａ））に対するＲＮＡリガンドのヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１３７−１５５）を示す。各配列は、左から右へ３つのブロック：１）５’固定領域、２）３０Ｎ可変領域、および３）３’固定領域に分画される。個々の配列は、下線付の太字で示すように、３０Ｎ可変領域内の保存配列モチーフにより、クラスＩとクラスＩＩに分類される。 図３０（図３０−１及び図３０−２）は、ＲＮＡリガンド（配列ＩＤ番号：１５６−１５９）の提案される２次構造を示す。（Ａ）は、７６ヌクレオチドのクラスＩＲＮＡクローン６、１６、および１８の配列、そしてクラスＩＩの７２ヌクレオチドのクローン２７の配列を示す。境界位置（［は５’境界を意味し、そして］は３’境界を意味する）も、示してある。境界実験から決定された、各ＲＮＡの可能な２次構造が、（Ｂ）に示してある。境界は下線で示される。（Ａ）と（Ｂ）には５’と３’の固定領域を小文字で示し、３０Ｎランダム領域は大文字で、そして保存領域は太字の大文字で示してある。合成されたヘアピン構造は、記載したヌクレオチドの総数と一緒に四角で囲んである。 図３０−２は図３０−１の続きである。 図３１は、トロンビンのリガンドの結合曲線を示す。ヒト・トロンビン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））との結合分析のために、（Ａ）で、クラスＩから３つ：ＲＮＡ６、ＲＮＡ１６、およびＲＮＡ１８、およびクラスＩＩから１つ：ＲＮＡ２７を含む、ユニークな３０Ｎ配列モチーフを有するＲＮＡを選択した。３０Ｎ３候補混合物の大量のＲＮＡ配列の結合も、示してある。（Ｂ）では、クラスＩ　ＲＮＡクローン６、１６、１８、およびクラスＩＩＲＮＡクローン２７の結合を示すが、エンザイムリサーチラボラトリーズ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からのヒト・トロンビンとの結合を示す。（Ｃ）では、（Ｂ）と同一の条件下での、１５塩基のｓｓＤＮＡ５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’（Ｇ１５Ｄ）（配列ＩＤ番号：１）、クラスＩクローン１６ヘアピン構造（２４Ｒ、３９Ｄ）およびクラスＩＩクローン２７ヘアピン構造（３３Ｒ）の結合を示す（図３０Ｂ参照）。ＲＮＡヘアピン構造の場合は、ＲはＲＮＡ合成を意味し、そしてＤはＤＮＡ鋳型からの転写を意味する。 図３２は、未修飾ＲＮＡと、２’−ＮＨ２リボースヌクレオチドを含有するように修飾されたピリミジンを有するＲＮＡとの間の、ＲＮＡリガンドの結合比較を示す。（Ａ）大量ＲＮＡ３０Ｎ候補混合物と２−ＮＨ２修飾３０Ｎ候補混合物、（Ｂ）クラスＩＲＮＡ１６と２−ＮＨ２修飾ＲＮＡ１６、および（Ｃ）クラスＩＩＲＮＡ２７と２−ＮＨ２修飾ＲＮＡ２７の結合比較が示してある。 図３３は、本発明の１５塩基のｓｓＤＮＡ　Ｇ１５ＤとＲＮＡヘアピンリガンド間の、ヒト・トロンビンへの結合に関する競合実験を示す。Ａ）では、トレーサーＧ１５Ｄの濃度はタンパク濃度１μＭに等しい。結合の競合物は、Ｇ１５Ｄ自体、クラスＩＲＮＡ１６からの２４と３９ヌクレオチドのＲＮＡヘアピン構造、およびクラスＩＩＲＮＡ２７からの３３ヌクレオチドＲＮＡヘアピン構造を含む（図３０参照）。結合は、結合したＧ１５Ｄの相対割合として表してあり、これは競合物のある時のＧ１５Ｄ結合と、競合物のない時のＧ１５Ｄ結合との比である。Ｂ）では、ＲＮＡ３３はトレーサーであり、このトレーサーの濃度はプロテアーゼの濃度３００ｎＭに等しい。結合の競合物は、ｓｓＤＮＡ　Ｇ１５ＤとＲＮＡ２４を含む。 図３４は、記載されたＲＮＡリガンド阻害剤の存在下および非存在下での、トロンビンの機能の測定の結果を示す。Ａ）では、記載したトロンビンとＲＮＡ濃度での、発色性基質Ｓ−２２３８（Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐニトロアニリン）のトロンビンによる加水分解を、ＯＤ４０５での変化により測定した。Ｂ）では、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換と、その結果生じる凝固形成を、記載されたＲＮＡリガンド阻害剤の存在下および非存在下での傾斜試験（ｔｉｌｔ　ｔｅｓｔ）により測定した。 図３５は、トロンビンのリガンドに対する結合の特異性を示す。Ａ）ヒト・アンチトロンビンＩＩＩ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、およびＢ）ヒト・プロトロンビン（シグマ）との結合分析のために、クラスＩＲＮＡ１６、クラスＩＩＲＮＡ２７、および大量の３０Ｎ３　ＲＮＡを選択した。 図３６は、ファミリー１リガンド７Ａ（△）、ファミリー２リガンド１２Ａ（□）、セレックス実験ＡのランダムＲＮＡ（＋）およびセレックス実験ＢのランダムＲＮＡ（×）の結合曲線を示す。ニトロセルロースフィルターに結合したＲＮＡの画分を、遊離のタンパク濃度の関数としてプロットして、データの点を式２に適合させた。以下の濃度のＲＮＡを使用した：７Ａと１２Ａでは＜１００ｐＭ、ランダムＲＮＡでは１０ｎＭ。結合反応は、０．０１％ヒト血清アルブミンを含有するリン酸緩衝化生理食塩水中で３７℃で行った。 図３７（図３７−１及び図３７−２）は、低親和性（パネルＡ）と高親和性（パネルＢ）細胞表面リセプターへの１２５Ｉ−ｂＦＧＦの結合に及ぼす、リガンド５Ａ（○）、７Ａ（△）、１２Ａ（□）、２６Ａ（◇）、セレックス実験ＡのランダムＲＮＡ（＋）およびセレックス実験ＢのランダムＲＮＡ（×）の効果を示す。実験は、基本的にログハニとモスカテリ（Ｒｏｇｈａｎｉ　＆　Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉ）（１９９２）　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２２１５６に記載されたように行った。 図３７−２は図３７−１の続きである。 図３８は、３２Ｐ−標識ＲＮＡリガンド５Ａ（○）、７Ａ（△）、１２Ａ（□）および２６Ａ（◇）の、ヘパリン（平均分子量５，０００Ｄａ）による競合置換を示す。ニトロセルロースフィルターに結合した全体の投入ＲＮＡのパーセントを、ヘパリン濃度の関数としてプロットする。実験は、０．０１％ヒト血清アルブミン、０．３μＭのＲＮＡ、および３０ｎＭのｂＦＧＦを含有するリン酸緩衝化生理食塩水中で３７℃で行った。 図３９は、高い親和性でｂＦＧＦに結合するファミリー１リガンドの提唱された２次構造を示す。矢印は、保存ループに隣接する２本鎖（軸）領域を示す。小文字は、定常領域にあるヌクレオチドを示す。 図４０は、ファミリー１リガンドの提唱された二次構造を示す。 図４１は、ファミリー１とファミリー２リガンドのコンセンサス構造を示す。Ｙ＝ＣまたはＵ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｗ＝ＡまたはＵ；Ｈ＝Ａ、Ｕ、またはＣ；Ｄ＝Ａ、Ｇ、またはＵ；Ｎ＝任意の塩基である。相補塩基がプライムされる。カッコ内の記号は、その位置で下付文字で示した境界範囲内の可変数の塩基または塩基対を示す。

Claims (35)

  1. 　トロンビンに対する核酸リガンドを同定する方法であって、
    ａ）ＲＮＡ核酸の候補混合物を調製し；
    ｂ）候補混合物をトロンビンに接触させ、ここでトロンビンに対する増大した親和性を有する核酸は候補混合物の残りのものから分画されてもよく；
    ｃ）トロンビンへの親和性に基づき該候補混合物のメンバーを分画し；そして
    ｄ）トロンビンに比較的高い親和性を有する候補混合物から選択される分子を増幅して、そのタンパクに対して比較的高い親和性を有する配列が濃縮された核酸の混合物を得ることを含んでなる、上記方法。
  2. ｅ）工程ｂ）、ｃ）およびｄ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　ＲＮＡ核酸の候補混合物は１本鎖核酸よりなる、請求項１に記載の方法。
  4. 　請求項１に記載の方法により同定されるトロンビンに対するＲＮＡ核酸リガンド。
  5. 　１本鎖核酸である、請求項４に記載の核酸リガンド。
  6. 　精製され単離された天然には存在しない、トロンビンに対するＲＮＡリガンド。
  7. 　リガンドは、図２９（配列ＩＤ番号：１３７−１５４）に示される配列よりなる群から選択される、請求項６に記載のＲＮＡリガンド。
  8. 　リガンドは、図２９（配列ＩＤ番号：１３７−１５４）に示される配列よりなる群から選択されるリガンドと実質的に相同であって、トロンビンに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項６に記載のＲＮＡリガンド。
  9. 　リガンドは、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置で化学的に修飾されている、請求項６に記載のＲＮＡリガンド。
  10. 　リガンドは、図２９（配列ＩＤ番号：１３７−１５４）に示される配列と、実質的に同一の構造を有し、トロンビンに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項６に記載のＲＮＡリガンド。
  11. 　ＲＮＡ配列（配列ＩＤ番号：９）：
    ５’−ＧＧＡＵＣＧＡＡＧ（Ｎ）２ＡＧＵＡＧＧＣ−３’
    よりなる、請求項６に記載のＲＮＡリガンド。
  12. 　ＲＮＡ配列（配列ＩＤ番号：１０）：
    ５’−ＧＣＧＧＣＵＵＵＧＧＧＣＧＣＣＧＵＧＣＵＵ−３’
    よりなる、請求項６に記載のＲＮＡリガンド。
  13. 　リガンドは、請求項１１に記載のリガンドと、実質的に相同であって、トロンビンに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項６に記載のＲＮＡリガンド。
  14. 　リガンドは、請求項１１に記載のリガンドと実質的に同一の構造を有し、トロンビンに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項６に記載のＲＮＡリガンド。
  15. 　リガンドは、請求項１２に記載のリガンドと実質的に相同であって、トロンビンに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項６に記載のＲＮＡリガンド。
  16. 　リガンドは、請求項１２に記載のリガンドと実質的に同一の構造を有し、トロンビンに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項６に記載のＲＮＡリガンド。
  17. 　請求項１に記載の方法により調製される、請求項６に記載のＲＮＡリガンド。
  18. 　塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）に対する核酸リガンドを同定する方法であって、
    ａ）ＲＮＡ核酸の候補混合物を調製し；
    ｂ）候補混合物をｂＦＧＦに接触させ、ここでｂＦＧＦに対する増大した親和性を有する核酸は候補混合物の残りのものから分画されてもよく；
    ｃ）ｂＦＧＦへの親和性に基づき該候補混合物のメンバーを分画し；そして
    ｄ）ｂＦＧＦに比較的高い親和性を有する候補混合物から選択される分子を増幅して、ｂＦＧＦに対して比較的高い親和性を有する配列が濃縮された核酸の混合物を得ることを含んでなる、上記方法。
  19. ｅ）工程ｂ）、ｃ）およびｄ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 　ＲＮＡ核酸の候補混合物は１本鎖核酸よりなる、請求項１８に記載の方法。
  21. 　請求項１８に記載の方法により同定されたｂＦＧＦに対するＲＮＡ核酸リガンド。
  22. 　１本鎖核酸である、請求項２１に記載の核酸リガンド。
  23. 　精製され単離された天然には存在しない、ｂＦＧＦに対するＲＮＡリガンド。
  24. 　リガンドは、表ＩＩおよびＩＩＩ（配列ＩＤ番号：２８−６７）に示される配列よりなる群から選択される、請求項２３に記載のＲＮＡリガンド。
  25. 　リガンドは、表ＩＩおよびＩＩＩ（配列ＩＤ番号：２８−６７）に示される配列よりなる群から選択されるリガンドと、実質的に相同であって、ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項２３に記載のＲＮＡリガンド。
  26. 　リガンドはリボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置で化学的に修飾されている、請求項２３に記載のＲＮＡリガンド。
  27. 　リガンドは、表ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ（配列ＩＤ番号：２８−８９）に示される配列と、実質的に同一の構造を有し、ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項２３に記載のＲＮＡリガンド。
  28. 　ＲＮＡ配列（配列ＩＤ番号：２７）：
    ５’−ＣＵＡＡＣＣＮＧＧ−３’
    よりなる、請求項２３に記載のＲＮＡリガンド。
  29. 　ＲＮＡ配列（配列ＩＤ番号：４３）：
    ５’−ＲＲＧＧＨＡＡＣＧＹＷＮＮＧＤＣＡＡＧＮＮＣＡＣＹＹ−３’
    よりなる、請求項２３に記載のＲＮＡリガンド。
  30. 　リガンドは、請求項２８に記載のリガンドと、実質的に相同であって、ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項２３に記載のＲＮＡリガンド。
  31. 　リガンドは、請求項２８に記載のリガンドと、実質的に同一の構造を有し、ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項２３に記載のＲＮＡリガンド。
  32. 　リガンドは、請求項２９に記載のリガンドと、実質的に相同であって、ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項２３に記載のＲＮＡリガンド。
  33. 　リガンドは、請求項２９に記載のリガンドと、実質的に同一の構造を有し、ｂＦＧＦに結合する実質的に同一の能力を有する、請求項２３に記載のＲＮＡリガンド。
  34. 　リガンドは、ｂＦＧＦの阻害剤である、請求項２３に記載のＲＮＡリガンド。
  35. 　リガンドは、表ＩＩ（配列ＩＤ番号：２７−４２）に示される配列よりなる群から選択される、請求項２３に記載のＲＮＡリガンド。
    　
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Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5705337A (en) * 1990-06-11 1998-01-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US6465189B1 (en) 1990-06-11 2002-10-15 Gilead Sciences, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended selex
US5853984A (en) * 1990-06-11 1998-12-29 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Use of nucleic acid ligands in flow cytometry
JPH09502354A (ja) * 1993-09-08 1997-03-11 ネクスター ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド 核酸リガンドと、同リガンドを製造するための改良された方法
US7153948B2 (en) 1994-04-25 2006-12-26 Gilead Sciences, Inc. High-affinity oligonucleotide ligands to vascular endothelial growth factor (VEGF)
CA2219119C (en) * 1995-05-04 2012-10-23 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US8071737B2 (en) 1995-05-04 2011-12-06 Glead Sciences, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5834184A (en) * 1995-05-17 1998-11-10 Harada; Kazuo In vivo selection of RNA-binding peptides
EP2325337A1 (en) 2000-09-26 2011-05-25 Duke University RNA aptamers and methods for identifying the same
IL159053A0 (en) 2001-05-25 2004-05-12 Univ Duke Modulators of pharmacological agents
US8030465B2 (en) 2001-06-29 2011-10-04 Medimolecular Pty Ltd Nucleic acid ligands to complex targets
US8853376B2 (en) 2002-11-21 2014-10-07 Archemix Llc Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
EP2460811A1 (en) 2004-04-22 2012-06-06 Regado Biosciences, Inc. Improved modulators of coagulation factors
KR20080036595A (ko) 2005-07-05 2008-04-28 가부시키가이샤 리보믹 면역글로불린 ｇ에 결합하는 핵산과 그 이용법
FR2920024B1 (fr) 2007-08-14 2012-12-14 Lfb Biotechnologies Procede de purification ou de detection d'une proteine cible
CA2730796C (en) 2008-07-14 2015-11-03 The University Of Tokyo Aptamer against il-17 and use thereof
ES2543222T3 (es) 2008-09-24 2015-08-17 Ribomic Inc. Aptámero para NGF y uso del mismo
FR2942232B1 (fr) 2009-02-19 2015-03-13 Lfb Biotechnologies Moyens pour la purification d'une proteine de la coagulation et procedes pour sa mise en oeuvre
TWI532842B (zh) 2009-06-11 2016-05-11 力博美科股份有限公司 針對凝乳酶之適體及其用途
FR2948665B1 (fr) 2009-07-31 2011-09-23 Lfb Biotechnologies Procede pour la purification de proteines de la coagulation a domaine gla actives
FR2948664B1 (fr) 2009-07-31 2013-11-01 Lfb Biotechnologies Procede pour la purification de proteines de la coagulation a domaine gla
WO2011099576A1 (ja) 2010-02-12 2011-08-18 国立大学法人 東京大学 Ｆｇｆ２に対するアプタマー及びその使用
WO2011118682A1 (ja) 2010-03-24 2011-09-29 株式会社リボミック Ｎｇｆに対するアプタマー及びその使用
WO2013024763A1 (ja) 2011-08-12 2013-02-21 独立行政法人理化学研究所 核酸アプタマーの作製方法
CA2850346C (en) 2011-09-28 2020-02-18 Ribomic Inc. Ngf aptamer and application thereof
JP6307675B2 (ja) 2011-11-18 2018-04-11 タグシクス・バイオ株式会社 標的タンパク質に結合する核酸断片
FR2983212A1 (fr) 2011-11-28 2013-05-31 Lfb Biotechnologies Aptameres anti-fh, procede pour leur obtention et utilisations
WO2014148638A1 (ja) 2013-03-22 2014-09-25 国立大学法人東京大学 Ｉｌ－１７に対するアプタマー及びその使用
EP3124611B1 (en) 2014-03-24 2019-11-06 Ribomic Inc. Aptamer for fgf2 and use thereof
JPWO2019093497A1 (ja) 2017-11-09 2021-01-21 株式会社リボミック Ａｄａｍｔｓ５に対するアプタマー及びその使用
US11639503B2 (en) 2017-11-30 2023-05-02 Ribomic Inc. Anti-chymase aptamer and use for same
IL299193A (en) 2020-06-17 2023-02-01 Ribomic Inc Aptamer for IL-21 and its use

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2763958B2 (ja) * 1990-06-11 1998-06-11 ネクスター ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド 核酸リガンド
CA2104698A1 (en) * 1991-02-21 1992-08-22 John J. Toole Aptamers specific for biomolecules and methods of making
AU2547592A (en) * 1991-08-23 1993-03-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthetic unrandomization of oligomer fragments

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