JP2000504581A - エキソン１１内のプロトオンコジーンｒｅｔの欠失の典型的ヌクレオチド配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 正常細胞における配列は位置１８４５および隣接ヌクレオチドを包含する位置１８１０および隣接ヌクレオチドによって定義される領域において以下の配列： を有する配列が上記領域において以下の配列： （式中，^*の記号は欠失ヌクレオチドを意味する）を包含することを特徴とするプロトオンコジーンＲＥＴに含まれる変化したヌクレオチド配列が開示される．患者から採取された組織または体液サンプルに見出される変化したヌクレオチド配列に由来する情報は腫瘍のタイプおよび特徴の決定に使用できる．このヌクレオチド配列またはそれに由来する情報は癌の診断用試薬の製造ならびに癌の予防

Description

【発明の詳細な説明】 エキソン１１内のプロトオンコジーンＲＥＴの欠失の 典型的ヌクレオチド配列 本発明は，新規なヌクレオチド配列およびその使用方法に関する．さらに詳し くは，本発明は哺乳動物における癌の診断および処置，分析のための試薬および キットの製造ならびに処置および／または予防のための医薬組成物に使用できる 新規なヌクレオチド配列に関する． 発明の背景 遺伝子の変化は，新生物の発生を伴い，したがって癌の初期診断のマーカーと して機能できる場合がある．癌の処置すべてにおいて，治療方法とは無関係に， 癌組織および細胞を同定する能力がとくに重要である．癌細胞に特異的に結合す る物質の必要性も明らかである．さらに，上記変化の中和またはそれに対する拮 抗の可能性が癌の将来の予防および処置の鍵となる．様々なタイプの癌に伴う特 異的な変化を同定するために長年にわたり研究が行われてきた．各タイプの癌の 背後にある特異的な変化（単数または複数）の知識のみが，診断，予防および／ または処置における選択的方法の使用を可能にする． 従来技術 ＲＥＴプロトオンコジーンは，最近リガンドが，グリア細胞系由来の神経栄養 因子（ＧＤＮＦ）として同定された膜貫通受容体チロシンキナーゼをコードする (Durbecら，1996; Trupp ら，1996) ．常染色体優性遺伝する４種の遺伝疾患： 家族性髄様癌（ＦＭＩＣ）（Farndonら，1986；Jackson & Norman，1989； Lairmore & Wells，1993）；患者は甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）および褐色細胞腫を 発症する多発性内分泌腺腫症２Ａ型（ＭＥＮ２Ａ，Sipple，1961）；骨格異常と 胃腸管神経節性神経腫が接合したこれらの２種の腫瘍を示すＭＥＮ２Ｂ（Carney ら,1976 ；Schimke ら，1968），および腸の不動を生じる腸神経叢神経の先天性 欠落を示すヒルシュスプルング病がＲＥＴ遺伝子の突然変異に関係づけられてい る．ＦＭＴＣでは，ＲＥＴプロトオンコジーンのエキソン１０，１１，１３，１ ４および１６に生殖細胞系の点突然変異が見出されている（Bolinoら，1995；Do nis-Kellerら，1993；Eng ら，1995；Schuffenecker ら，1994）. エキソン１０および１１における点突然変異はＭＥＮ２Ａと関連することが報 告されている一方，ＭＥＮ２Ｂおよび小比率の散発性ＭＴＣにはエキソン１６に おける特異的なミスセンス突然変異が見出されている（Donis-Kellerら，1993； Eng ら，1995 ；Hofstra ら，1994；Mulliganら，1993）．さらに，コドン６３ ０または６３４におけるシステインを除去する６塩基の欠失が散発性ＭＴＣの別 個の２症例に報告されている（S.Dou & H.Donis-Keller，未発表結果；Kimuraら ，1995）. 発明の簡単な説明 本発明者らは，特異的な欠失が神経堤起源の細胞における癌を指示すること， そしてＲＥＴエキソン１１における特異的な従来知られていなかった９塩基対の 欠失が，神経堤起源の細胞における癌たとえば多発性内分泌腺腫症（ＭＥＮ）２ Ａおよび２Ｂ型，褐色細胞腫，腸神経節性神経腫，副甲状腺過形成，神経節性神 経腫ならびに甲状腺髄様癌（ＭＴＣ）を指示することを見出した．本発明者らは ，この欠失の単離および同定に成功し，甲状腺髄様癌の特異的なマーカーとして のその関連を示した．本発明の範囲は，請求の範囲ならびに添付の図面を参照し た説明および実施例から自明の通りである． 図面の簡単な説明 図１は，散発性甲状腺髄様癌の症例１５例（１〜１５），正常組織１例（１６ ）ならびに正常リンパ球ＤＮＡ４例（１７〜２０）のＲＥＴエキソン１１の非放 射性ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析の結果を示す． 図２は，自動シクエンサー上 GeneScan により分析した散発性甲状腺髄様癌の 症例１５例（１〜１５），正常組織１例（１６）ならびに正常リンパ球４例（１ ７〜２０）からの蛍光ＲＥＴプロトオンコジーンＰＣＲ産物の電気泳動像を示す ． 図３は，ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定によって決定した正常エキソン１１お よび突然変異体部分配列を示す． 図４Ａは，９ｂｐの複合欠失を直接囲むＤＮＡ環境を示す． 図４Ｂは，欠失した塩基（星印）を囲む不完全パリンドロームによって形成さ れる推定ヘアピンループを示す． 発明および好ましい実施態様の説明 本発明者らはＲＥＴエキソン11における９塩基対の欠失が神経堤起源の細胞に おける癌，たとえば多発性内分泌腺腫症（ＭＥＮ）２Ａおよび２Ｂ型，褐色細胞 腫，腸神経節性神経腫，副甲状腺過形成，神経節性神経腫および，とくにＭＴＣ を指示することを示した．この欠失は３つのコドン（Ｌｅｕ₆₃₃−Ｃｙｓ₆₃₄−Ａ ｒｇ₆₃₅）の喪失，ならびに２つのコドンの置換（Ｇｌｕ₆₃₂→ＳｅｒおよびＴｈ ｒ₆₃₆→Ｓｅｒ）を生じ，ポリメラーゼチェーン反応に基づいて特徴的な一本鎖 ＤＮＡコンフォメーション多型（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）パターンを生成する（Alem i ら，1997）．さらにこの同じ複合欠失は，ＰＣＲ−ＳＳＣＰ，蛍光フラグメン トサイズ分析，およびＤＮＡ配列決定により明らかにされたように，散発性ＭＴ Ｃの１５例中１４例に存在することが示された． ３つの異なるアプローチ（ＳＳＣＰ，フラグメント分析および直接ＰＣＲ配列 決定）を合わせることによって，９塩基対欠失（塩基1825および1830-7，コドン 632-636，塩基番号は Takahashiら，1988による）の同一性が決定され，それは 驚くべきことに，検討した散発性ＭＴＣ腫瘍の事実上すべて（１５例中１４）に 存在することが見出されたのである．表１から明らかなように，方法の感度はわ ずかに異なるが，それらは若干異なるタイプの情報を与えることによって互いに 他を補足する．ＰＣＲ−ＳＳＣＰでは与えられた配列中の遺伝子変化の完全なス ペクトルを検出できるが，突然変異の本質に関しては情報を与えない． Genescan 分析はフラグメントの正確なサイズに関して重要な情報を与え，この 場合，突然変異エキソン１１ＰＣＲ産物がすべての陽性腫瘍における正常対立遺 伝子より９ｂｐ短いことが証明される．最後に，ＤＮＡ配列決定では突然変異の 限定的な性質を与え，これは４例の無関係の症例の腫瘍において同一であった． 本発明者らは，この欠失が細胞の病的および／または細胞学的挙動に影響し， たとえば細胞の悪性度を増大させるものと予想した．これにより，上記欠失は， 癌の背後にある１つの原因因子および／または増強因子と考えることができる． 予備的な結果もまた，この欠失に由来するプライマーはリンパ腫を有する患者か らのＤＮＡに結合親和性を有することを示している．この欠失の主たる重要性は それが遺伝子療法戦略，たとえばＰＮＡをベースとした遮断法またはアンチセン 法の重要な標的となることである． 表１．ＰＣＲ−ＳＳＣＰ，Gene Scan および配列決定の結果 a）sMTC＝散発性甲状腺髄様癌，NT＝正常甲状腺，NL＝正常リンパ球． b）+９ bp欠失の存在を示唆する結果を示す． c）-正常所見を示す． この付近の欠失の同一の複合性はそれらの存在が無作為な過程で導かれたもの ではないことを示唆している．これが，本発明者らにその原因となった囚子を探 索するため，欠失に隣接するＤＮＡ配列を調べさせることを促すことになった． 細菌システムにおいて逆方向反復配列（パリンドローム）が優先して自然に欠失 することが証明され（Albertini ら，1982; Brunier ら，1988; DasGuta ら，19 87; Galas，1978; Schaaper ら，1986），一方，直列反復配列は，多数のウイル スシステムにおいて欠失の存在に関連づけられてきた（Singer & Westly,1988） ．ＬＤＬ受容体遺伝子内の複合ヌクレオチド欠失−置換の領域の周辺の数個の逆 方向反復配列は，Yamakawa-Kobayashiらによって，家族性高コレステロール血症 に関連することが発見されている（Yamakawa-Kobayashiら，1993）．この複合突 然変異の発生機構として，彼らは，これらの逆方向反復配列が複製時にへアピン −ループ構造を形成し，この構造内で欠失現象が起こることを提案している． 遺伝性および散発性のヒト疾患に関連する小さな欠失の局部的なＤＮＡ配列環 境（１〜２０ｂｐ）における数種の因子は，短い直列反復配列（２〜８ｂｐ）， 逆方向反復配列，対称エレメント（たとえば，Ｃの喪失が中心のＧの周囲に対称 な配列を残すＡＧＴＧＣＴＧＡ）および特定のコンセンサス配列（ＴＧＡ／ＧＡ ／ＧＧ／ＴＡ／Ｃ）の存在を包含して，欠失に関連することが示されている （Krawczak & Cooper，1991）． これらの因子の多くが，図４Ａに示すように，９ｂｐ ＲＥＴ複合欠失の近傍 にも存在する．８ｂｐ欠失自体はパリンドロームであり，生理的条件下に比較的 高い熱力学的安定性（ΔＧ＝−１３．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有するヘアピン− ループを産生できる大きな不完全パリンドロームの一部である（図４Ｂ）．８ｂ ｐ欠失の最初の塩基も６ｂｐ直列反復配列（ＣＴＧＴＧＣ）の一部であり，４個 の塩基は６塩基コンセンサス配列（ＴＧＣＣＧＣ）にフィットする．位置１８２ ５における単一塩基対欠失は２つの中間直列反復配列（ＣＧＡ ＣＧＡ）の後者 内にあり，欠失した場合，７ｂｐの対称エレメント（ＣＧＡＣＡＧＣ，図４）を 残す． では何故，両欠失が，このように大きな比率の腫瘍に見られるのであろうか？ これらの２つの欠失のいずれも単独ではフレームシフトを伴う突然変異を生じ， そのためＲＥＴタンパク質機能の喪失を伴い，新生物表現型を生じない．しかし ながら，同一の対立遺伝子内に両者が起こると，突然変異は再びインフレームと なり，突然変異ｍＲＮＡおよびタンパク質の形成が可能になる．Ｃｙｓ₆₃₄コド ンにおける非保存的点突然変異はＲＥＴチロシンキナーゼの構成的活性化を生じ ，Ｃｙｓ₆₃₄−突然変異構造を有する線維芽細胞のトランスフェクションはトラ ンスフォームされた表現型を与えることが証明されている（Santoro ら，1995） ．したがって，欠失によるこのシステインコドンの喪失もまた，構成的活性化お よび新生物，現在検討中の可能性を生じることはあり得ることと思われる． 以前の研究で数種のＲＥＴ突然変異は散発性ＭＴＣと関連することが証明され たが，大部分の症例で異常は見出されていなかった（Takahashi，1995）．最も 共通して見られる突然変異は，それぞれ低率の症例におけるコドン９１８，８８ ３または７６８の変化である（Donis-Keller，1995; Lloyd，1995）．しかしな がら，２つの報告にはコドン６３０または６３４を含む６ｂｐの欠失がそれぞれ 単一の散発性ＭＴＣ症例で記載されている（Donis-Keller，1995; Kimuraら，1 995）． 本発明のヌクレオチド配列またはその部分は癌および前癌細胞の存在の診断に ＤＮＡ−プライマーおよび核酸プローブとして有用である．このようなプローブ は適当な慣用のマーカーと組合わせてたとえば術後のモニタリングおよび転移の 追跡に適用できる．新しい配列に基づくＤＮＡ−プライマーおよび核酸プローブ はまた遺伝子スクリーニングのキットおよび方法に容易に適用できる． 核酸配列はまた，診断テストにおける標準もしくは試薬としておよび／または ワクチン成分として有用なポリペプチドの製造を可能にする．この配列またはそ のエピトープに向けられた抗体，モノクローナルおよび精製ポリクローナル抗体 の両者はまた，診断テストにまたは受動免疫のための治療剤として有用である． 本発明の配列を用いて製造される上記診断テストの利用は，癌および前癌細胞の 早期および高感度の検出を可能にする． 本発明の他の実施態様は，本発明の配列の使用，精製タンパク質の使用または 欠失を示す全細胞の使用によるポリペプチドの発現工程の一つを包含するワクチ ン組成物の製造である．ワクチン組成物は血液系の悪性腫瘍，たとえばリンパ腫 および白血病の処置に特異的な可能性を有する．開示されたような本発明に基づ くワクチン組成物の製造は本出願の時点で利用可能な定常的実験および慣用技術 の適用を要するのみである． とくに重要な実施態様は，アンチセンスＤＮＡ法またはＰＮＡベースの遮断法 を用いて上記領域またはそのエピトープを遮断または永久置換するための，本発 明のヌクレオチド配列またはその部分に由来する情報の使用である． さらに他の実施態様は，癌の治療のための，プローブをベースとした放射性ま たは化学療法用医薬の製造である． 実施例 ＭＴＣの典型的な形態学的特徴を示す，ホルマリン固定，パラフィン包埋腫瘍 （１５例）を病理部門の記録から収集し，患者の臨床記録を縦覧して散発性腫瘍 を選択した．腫瘍細胞をＣ−細胞マーカー，クロモグレインＡおよびカルシトニ ン（Boehringer Mannheim）により定常的な免疫組織学的手法で染色した．これ らのブロックからの対応切片を用いてＤＮＡを抽出した． 各腫瘍組織ブロックの１０−μｍ厚の切片からゲノムＤＮＡを単離した．切片 をキシレンで脱パラフィンし無水エタノールで洗浄した．乾燥サンプルを２００ μｌの消化緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８． ３）中５０℃で一夜５００μｇ／ｍｌのプロティナーゼＫで処理し，ついで１０ 分間煮沸して酵素を不活性化した．正常な甲状腺組織，他の甲状腺腫瘍および正 常血中リンパ球から抽出したＤＮＡを対照として用いた． ＲＥＴプロト−オンコジーンのエキソン１１の増幅のためのオリゴヌクレオチ ドプライマーは既報のデータ（Donis-Keller，1993）から選択した．ＰＣＲフラ グメントは０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，０．５μＭの各プライマー，１．５ｍＭＭｇ²⁺ ，５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３，０．５単位 のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含有する混合物３０μｌ中５ μｌのゲノム腫瘍もしくは対照ＤＮＡから増幅した．最初の変性を９５℃におい て１分間，アニーリングを６５℃で１分間，伸長を７２℃で１分間行ったのち， 最後の伸長を７２℃で１０分間実施した．増幅産物に期待されるサイズは１ ９２ｂｐである． 実施例１： １．１．ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析 ＰＣＲ産物のアリコート１μｌを変性溶液（ホルムアミド中０．０５％ブロモ フエノールブルー，０．０５％キシレンシアノール）中で９５℃に５分間加熱し ，ついで氷上で急速に冷却した．変性サンプル１μｌを Phast Gelシステム電気 泳動装置（Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden）を用い，非変性条 件下，予め調製された４〜１５％勾配ポリアクリルアミドゲル上で分離した．こ の装置はプレラン１００Ｖｈ，ついで５０Ｖｈ，１６℃にプログラムされた．ゲ ルは，製造業者（Pharmacia LKB Biotechnology）の説明書に従い銀染色した． エキソン１１に前述の９ｂｐ複合欠失を示すＰＣＲ−ＳＳＣＰパターンは散発 性ＭＴＣ症例１５例中１４例に見出された．非放射性ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析の代 表的な結果を図１に示す．腫瘍サンプル（レーン１〜６，８〜１５）は１例の患 者の正常甲状腺組織および正常リンパ球細胞（それぞれレーン１６およびレーン １７〜２０）と比較して著しく異なるヘテロ接合ＳＳＣＰパターンを示した． １．２．Genescan によるＰＣＲ産物の蛍光フラグメントサイズ分析 自動化蛍光フラグメント分析用に，エキソン１１ＰＣＲ産物を順方向プライマ ーは５’末端を６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフル オレセンスで標識した上述のプライマー対を用いて発生させた．ＰＣＲ産物を蒸 留水で１：４に希釈し，０．５μｌを，１２μｌのホルムアミド，および０．５ μｌのモルキュラーサイズ標準（GS350，Applied Biosystems Inc.）の混合物に 添加した．サンプルを９０℃で２分間変性し，氷の上に置いたのち，ABI 373AＤ ＮＡシーケンサー（Applied Biosystems Inc．）中尿素含有６％ポリアクリルア ミドゲル上に負荷した．電気泳動は１４時間実施し，ＤＮＡ鎖の塩基長をサイズ マーカーと比較して帰属させるGene Scan 672 ソフトウエアパッケージ （Applied Biosystems Inc．）を用いて蛍光シグナルを分析した．この方法の分 解能は製造業者により２塩基と報告されている． この新規アプローチの有用性は２０種のＤＮＡサンプル（１５例のＭＴＣ腫瘍 と５例の対照）のアンプリコンを用いて評価した．Genescan 分析のクロマトグ ラムを図２に示す．正常甲状腺組織に由来する産物は１９２ｂｐの正常な対立遺 伝子に相当する蛍光の１個の鋭いピークを示し（図２，例１６），一方，１５例 の散発性ＭＴＣ症例中１４例からのアンプリコンは正常なｌ９２ｂｐのピークお よび９ｂｐ短い１８３ｂｐフラグメントの両者を生じた（図２，１〜１４および 表１）．ＭＴＣの１例および正常なリンパ球対照は正常なフラグメントパターン を示した（図２の症例７および１７〜２０）． 実施例２：ヌクレオチドの配列決定 増幅したエキソン１１ＤＮＡを１％アガロースゲル上で電気泳動分離し，つい で切り出した約１９２ｂｐのバンドからのイオン交換単離により精製した （Jetsorb,Genomed Inc．N.C，）．精製されたＤＮＡを１００μｌの蒸留水で希 釈し，８μｌを鋳型として使用した．蛍光ベースのジデオキシターミネーターサ イクル配列決定は，製造業者のプロトコールに従いＴａｑポリメラーゼベースの キット（Applied Biosystems Inc．FosterCity），ならびに自動型ＤＮＡシーケ ンサー（373型，Applied Biosystems Inc．）を用いて実施した．ＰＣＲ産物の センスおよびアンチセンス両鎖の配列を決定した． Genescan の結果を確認するため，本発明者らはついで無作為に選択した４例 および１例の正常な甲状腺対照からのＰＣＲ産物の配列を決定した．エキソン１ １ＰＣＲ産物のセンスおよびアンチセンス鎖の配列決定はＣｙｓに富む細胞外ド メイン内の位置１８２５および１８３０−７に９個の塩基の欠失が明らかにされ た（図３）．この変化は，ＭＥＮ２Ａにミスセンス突然変異を示すことが報告さ れている 634のＣｙｓを含めてコドン６３３〜６３５（Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ ）の喪失を生じる（Mulliganら，1993）．さらにコドン６３２のＧｌｕおよびコ ドン６３６のＴｈｒはいずれもSerに変化する（図３）．正常な対立遺伝子の配 列は，欠失領域に始まりそのフラグメントの末端まで続く不一致の背景クロマト グラムの９個の塩基として認められる．患者の正常な組織にはエキソン１１の欠 失は見出されなかった． 以上，本発明を，現時点で本発明者らの知る限りの最良の様式を構成するその 好ましい実施態様に関連して説明したが，本技術分野の通常の熟練者には自明の ように，以下の請求の範囲に記載する本発明の範囲から逸脱することなく様々な 改変および修飾が可能であることを理解すべきである．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ， (72)発明者 ヴィランデル，エリック スウェーデン国 エス―756 46 ウプサ ラ，ムルケルベーゲン 31

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 正常細胞における配列が位置１８４５および隣接ヌクレオチドを包含する 位置１８１０および隣接ヌクレオチドによって定義される領域において以下の配 列： を有する配列が上記領域において以下の配列： （式中，^*の記号は欠失ヌクレオチドを意味する）を包含することを特徴とする プロトオンコジーンＲＥＴに含まれる変化したヌクレオチド配列． 2. ヒト生体から採取されたサンプル中の「請求項１」に記載のヌクレオチド 配列の存在または不存在を決定し，その配列の存在を癌の指示とするヒト癌の診 断方法． 3. ヒト生体から採取されたサンプル中の「請求項１」に記載のヌクレオチド 配列の存在または不存在を決定し，その配列の存在を神経堤起源の細胞における 癌の指示とするヒト癌の診断方法． 4. ヒト生体から採取されたサンプル中の「請求項１」に記載のヌクレオチド 配列の存在または不存在を決定し，その配列の存在を前癌状態の指示とするヒト 癌の診断方法． 5. ヒト生体から採取されたサンプル中の「請求項１」に記載のヌクレオチド 配列の存在または不存在を決定し，その配列の存在を神経堤起源の細胞における 前癌状態の指示とするヒト癌の診断方法． 6. 「請求項１」に記載のヌクレオチド配列に由来する情報を存在する腫瘍の タイプに関する指示の提供に使用することを特徴とするヒト癌の診断方法． 7. サンプルを，ＤＮＡ増幅，ＲＮＡ増幅，ＤＮＡライゲーション，ＰＣＲ， ＤＮＡ配列決定，ＲＮＡ配列決定，核酸ハイブリダイゼーション電気泳動または これらの組合わせからなる群より選択される処置に付すことを特徴とするヒト癌 の診断方法． 8. 正常細胞における配列が位置１８４５および隣接ヌクレオチドを包含する 位置１８１０および隣接ヌクレオチドによって定義される領域において以下の配 列： を有する配列が上記領域において以下の配列： （式中，^*の記号は欠失ヌクレオチドを意味する）を包含することを特徴とする プロトオンコジーンＲＥＴに含まれる変化したヌクレオチド配列またはそれから 得られる情報の医薬の製造のための使用． 9. 正常細胞における配列が位置１８４５および隣接ヌクレオチドを包含する 位置１８１０および隣接ヌクレオチドによって定義される領域において以下の配 列： を有する配列が上記領域において以下の配列： （式中，^*の記号は欠失ヌクレオチドを意味する）を包含することを特徴とする プロトオンコジーンＲＥＴに含まれる変化したヌクレオチド配列またはそれから 得られる情報の癌の遺伝子療法用医薬の製造のための使用． 10．正常細胞における配列は位置１８４５および隣接ヌクレオチドを包含する 位置１８１０および隣接ヌクレオチドによって定義される領域において以下の配 列： を有する配列が上記領域において以下の配列： （式中，^*の記号は欠失ヌクレオチドを意味する）を包含することを特徴とする プロトオンコジーンＲＥＴに含まれる変化したヌクレオチド配列まはたはそれか ら得られる情報の，アンチセンスＤＮＡ法，ＰＮＡベースの遮断法，リボザイム をベースとする方法，抗体もしくはペプチドに基づく遮断方法およびこれらの任 意の組合わせの１種を包含する癌の遺伝子療法用医薬の製造のための使用． 11．正常細胞における配列は位置１８４５および隣接ヌクレオチドを包含する 位置１８１０および隣接ヌクレオチドによって定義される領域において以下の配 列： を有する配列が上記領域において以下の配列： （式中，^*の記号は欠失ヌクレオチドを意味する）を包含することを特徴とする プロトオンコジーンＲＥＴに含まれる変化したヌクレオチド配列またはそれから 得られる情報の上記配列またはその同族配列の決定用試薬の製造のための使用． 12. 上記ヌクレオチド配列に相当するｍＲＮＡに由来する情報を使用すること を特徴とする「請求項８〜１１」のいずれかに記載の使用． 13. 上記ヌクレオチド配列に相当するアミノ酸配列に由来する情報を使用する ことを特徴とする「請求項８〜１１」のいずれかに記載の使用． 14. 「請求項１」に記載の配列に基づくＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用する 再発および／または転移の術後モニタリング方法． 15. 「請求項１」に記載の配列に基づくＤＮＡプローブおよび／または核酸プ ライマーを使用するＲＥＴプロトオンコジーン中の欠失によって生じる癌の素因 または存在の遺伝子スクリーニング方法． 16. 「請求項１」に記載の配列に由来する情報を使用して調製されるワクチン 組成物を用いる悪性腫瘍の処置方法． 17. 「請求項１」に記載の配列に基づくＤＮＡプローブおよび／または核酸オ リゴヌクレオチドを使用する癌の処置用のプローブベースの化学療法のための方 法．