SE510774C2 - Förändrad nukleotidsekvens ur proto-onkogenen RET och dess användning i diagnos respektive medicinska preparat - Google Patents

Description

15 25 30 35 40 510 774 Figur 2 utgör ett diagrarn över resultatet av en DNA-sekvensning enligt den vedertagna så kallade Sanger-metoden vilket diagram visar nukleotidsekvensen i normalt DNA respektive i DNA i den studerade tumören; och Figur 3 utgör ett fotografi av elektroforesmönstret på en agarosgel vilket elektroforesmönster visar resultatet av en så kallad DNA-amplifienng med hjälp av PCR.

På DNA preparerat från tumörvävnad från en patient med cancer av typen sporadisk modullär tyroideacarcinom och från nonnal vävnad vilken vävnad utgjorde ett så kallat kontrollpreparat utanför tumören hos samma patient utfördes bland annat analysen PCR-SSCP med resultat som framgår av Figur 1, som har två elektroforesspår, elektroforesspår l från nomialt DNA, och elektroforesspår 2 från tumörens DNA. Av elektroforesspår l framgår att två enkelsträngskonforrnanter, enkelstrångskonforrnant 3 och enkelsträngskonformant 4, båda från den normala PCR-amplikonen, bildar ett karakteristiskt mönster av mörka så kallade band vilket mönster kan variera beroende av PCR-betingelsema och SSCP-betingelsema. Av elektroforesspår 2 framgår att motsvarande mönster tydligt skiljer sig från mönstret i elektroforesspår 1 på så sätt att det finns två tätt liggande extra band 5 och band 6. Av detta kan man bland annat sluta sig till att nukleotidsekvensen i tumörens DNA avviker från nukleotidsekvensen i normalt DNA vilken avvikelse är upphov till band 5 och band 6.

På DNA preparerat från såväl normal vävnad som tumörvävnad hos samma patient utfördes DNA-sekvensering enligt Sanger-metoden med resultat som redovisas i Figur 2. I figur 2 kan man utläsa att DNA i normal vävnad från och med position 1810 till och med position 1845 har nukleotidsekvens 7 bestående av nukleotidema GAT CCA CTG TGC GAC GAG CTG TGC CGC ACG GTG ATC.

Samma positioner i DNA från tumörvävnad har nukleotidsekvensen 8 bestående av nukleotidema GAT CCA CTG TGC GAC *AGC T * * * * * * * *CG GTG ATG där G står för nukleotiden deoxyriboguanin, A står för nukleotiden deoxyriboadenin, T står för nukleotiden tymin och C står för nukleotiden deoxyribocytosin och asterisk vilket är symbolen * står för det deleterade området. Den nukleotidsekvens som deleterats är alltså G...GTGCCGCA där G står för nukleotiden deoxyriboguanin, A står för nukleotiden deoxyriboadenin, T står för nukleotiden tymin och C står för nukleotiden deoxyribocytosin.

För att ytterligare försäkra oss om att den här beskrivna deletionen är associerad till cancerforrnen sporadisk medullär tyroideacarcinom utfördes PCR-arnpliñering med hjälp av startsekvenser vilka kallas primers som har följande nukleotidsekvenser: primer 14 med PD53327SE00 20 25 30 35 40 3 5 'l 0 7 7 4 sekvensen 5' CCT CAG GAT CCA CTG TGC GAC AGC TCG GT 3' och primer 15 med sekvensen 5' CAC CGG AAG AGG AGT AGC TG 3', varav primer 14 endast kan delta i arnplifiering av DNA från RET-gen i vilken nukleotiden G har deleterats i position 1825 och nukleotidsekvensen GTGCCGCA från och med position 1830 till och med position 1837 har deleterats. Resultatet av denna PCR-amplifiering framgår av Figur 3 som är en bild av en agarosgel som använts vid elektroforesanalys i vilken bild finns fem elektroforesspår. Ljusa band härrörande från DNA-fragment med längden 193 baspar indikerar att amplifiering har skett. Sådana band förekommer i elektroforesspår 9, elektroforesspår ll, elektroforesspår 12 och elektroforesspår 13 vilka elektroforesspår tillförts prov innehållande PCR-produkt från tumör-DNA. Elektroforesspår 10 som tillförts prov innehållande PCR-produkt från normal vävnad uppvisar inget sådant ljust band motsvarande DNA-fragment med längden 193 baspar.

Detta visar att deletionen förekommer i turnörvävnad. I detta fall utgörs tumörvävnaden av sporadisk medullär tyroideacarcinom men deletionen kan även vara inblandad i andra former av tumörsjukdomar eller andra sjukdomstillstånd. Deletionen, som i detta fall omfattar en nukleotid i position 1825 och åtta nukleotider i positionema 1830 till och med 1837 förorsakar förlust av tre kodon, nämligen de som motsvarar aminosyroma leucin, cystein och arginin. Vidare sker substitution av två kodon nämligen ett kodon motsvarande aminosyran glutarninsyra som substitueras till serin och ett kodon motsvarande aminosyran treonin delvis nedströms deletionen vilken aminosyra substitueras till serin. Det är troligt att deletioner omfattande positioner uppströms 1825 och nedströms 1837 och respektive eller i regionen mellan 1825 och 1837 som är både längre eller kortare än den som beskrivs i föreliggande text leder till tumöruppkomst.

Genom att utnyttja nukleinsyrebaserad diagnostik av någon typ, antingen direkt eller efter amplifiering av den region i RET proto-onkogenen som i exon 11 omfattar området uppströms position 1825 och nedströms exon position 1837 eller helt eller delvis områdena medan dessa positioner kan man alltså avgöra exempelvis vilken tumörtyp som en viss patient har och utifrån detta utföra terapi av olika typer och upprätta prognos för patienten. Nukleinsyrebaserad diagnostik för detta ändamål kan exempelvis utföras med hjälp av så kallad probning, det vill säga hybridisering med en oligonukleotid med vissa särskiljande kännetecken. Detta kan ske före, efter eller i samband med någon typ av nukleinsyraamplifiering. Nukleinsyrebaserad diagnostik i detta sammanhang kan också ske i form av PCR med för deletionen specifika primers, i form av annan typ av nukleinsyrearnpliñering, i form av sekvensning av DNA eller RNA eller genom olika typer av elektrofores, till exempel så kallad SSCP. Även immunologiska tekniker och olika kombinationer av metoder beskrivna här kan användas för detta ändamål.

Direkta eller indirekta genprodukter eller kemiska derivat av genprodukter som motsvarar den region i RET proto-onkogenen som i exon ll omfattar området uppströms position 1825 och nedströms position 1837 eller helt eller delvis områdena medan dessa positioner, kan också användas för att avgöra tumörförekomst och tumörtyp. Även immunologiska tekniker och olika kombinationer av metoder beskrivna här kan användas för detta ändamål.

PD53327SE00 510 774 4 I korthet är uppfinningen ett sätt att bota patienter med cancer genom att utnyttja kännedomen av nukleotidsekvensen i exon 11 i RET proto-onkogenen som omfattas av deletionen enligt föreliggande beskrivning och områdena närmast uppströms och nedströms denna deletion, för att ställa adekvat diagnos, utfärda prognos och utföra terapeutiska insatser.

PD53327SEO0

Claims (10)

10 15 20 25 30 35 510 774 5 Patentkrav
1. l. Förändrad och preparerad nukleotidsekvens ur proto-onkogenen RET, vilken i normala celler har följande sekvens i området definierat av position 18 l 0 och intilliggande nukleotider till och med position 1845 och intilliggande nukleotider: GAT CC A CTG TGC GAC GAG CTG TGC CGC ACG GTG ATC k ä n n e t e c k n a d av att nämnda område innefattar följande sekvens: GAT CCA CTG TGC GAC*AGC T********CG GTG ATG där symbolen * avser en deleterad nukleotid.
2. 2. Förfarande vid diagnos av human cancer in vitro, k ä n n e t e c k n a t av att förekomst eller frånvaro av en nukleotidsekvens enligt krav 1 undersöks i prover, tagna ur människokroppen, varvid förekomst av nämnda sekvens tas som indikation på cancer.
3. 3. Förfarande vid diagnos av human cancer in vitro, k ä n n e t e c k n at av att förekomst eller frånvaro av en nukleotidsekvens enligt krav 1 undersöks i prover, tagna ur människokroppen, varvid förekomst av nämnda sekvens tas som indikation på ett förstadium till cancer.
4. 4. Förfarande vid diagnos av human cancer in vitro, k ä n n e te c k n at av att nukleotidsekvensen enligt krav l används för att ge en indikation på vilken typ av tumör som föreligger.
5. 5. Förfarande enligt något av krav 2-3, k ä n n e t e c k n a t av att nämnda prover underkastas en behandling som innefattar ett förfarande, valt ur gruppen PCR, DNA- sekvensering, RNA-sekvensering, elektrofores eller en kombination av dessa.
6. 6. Användning av nukleotidsekvens enligt krav l för frarnställning av ett medicinskt preparat.
7. 7. Användning av nukleotidsekvens enligt krav l för framställning av ett preparat för genterapeutisk behandling av cancer.
8. 8. Användning av nukleotidsekvens enligt krav l för framställning av reagens för påvisning av nämnda sekvens.
9. 9. Användning enligt något av krav 6-8, k ä n n e t e c k n a d av att mRNA motsvarande nämnda nukleotidsekvens utnyttjas.
10. 10. Användning enligt något av krav 6-8, k ä n n e t e c k n a d av att aminosyrasekvenser motsvarande nämnda nukleotidsekvens utnyttjas. PD53327SEOO