JP2000502086A - 核レセプターのリガンドおよびリガンド結合ドメイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、核レセプター、特に甲状腺レセプター（本明細書において「ＴＲ」と呼ぶ）の三次元構造をベースとする核レセプターの合成リガンドを発生させる新規な方法、特に計算的方法、および組成物を提供する。また、結晶、核レセプター合成リガンド、および関係する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 核レセプターのリガンドおよびリガンド結合ドメイン 承認 本発明は、アメリカ保険協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏ ｆ Ｈｅａｌｔｈ）から認可番号１Ｒ０１ＤＫ４３７８７、および５Ｒ０１ＤＫ ４１８４２の認可により、一部分支持された。アメリカ政府は本発明において権 利を有することができる。 関係する出願に対する相互参照 本出願は下記の暫定的出願の利益を請求する：米国特許出願第６０／００８， ５４０号および第６０／００８，５４３号、１９９５年１２月１３日提出および 米国特許出願第６０／００８，６０６号、１９９５年１２月１４日提出。 序論 技術分野 本発明は、核レセプターに結合するリガンドを設計する計算的方法、核レセプ ターの結晶、核レセプターの合成リガンドおよび合成リガンドを使用する方法に 関する。背景 核レセプター（nucleur receptor）は、生理学的に意味のある小さい分子、た とえば、ホルモンまたはビタミンに特異的に結合するタンパク質のスーパーファ ミリーを表す。ある分子が核レセプターに結合する結果、核レセプターはＤＮＡ を転写する細胞の能力を変化させる、すなわち、核レセプターはＤＮＡの転写を 調節するが、 それらは転写独立の作用（transcription independent action）を有することが できる。一体的膜レセプター（integral membrane receptor）および膜関連レセ プター（membrane associated receptor）と異なり、核レセプターは真核細胞の 細胞質または核の中に存在する。したがって、核レセプターは細胞内の、可溶性 リガンドにより調節される転写因子の１つのクラスを構成する。 核レセプターは、グルココルチコイド（ＧＲ）、アンドロゲン（ＡＲ）、ミネ ラルコルチコイド（ＭＲ）、プロゲスチン（ＰＲ）、エストロゲン（ＥＲ）、甲 状腺ホルモン（ＴＲ）、ビタミンＤ（ＶＤＲ）、レチノイド（ＲＡＲおよびＲＸ Ｒ）を包含する。いわゆる「オーファンレセプター」は古典的核レセプター、た とえば、ステロイドおよび甲状腺のレセプターに構造的に相同であるので、それ らも核レセプターのスーパーファミリーの一部分である。今日まで、リガンドは オーファンレセプターで同定されてきていないが、小さい分子のリガンドはこの クラスの転写因子について近い将来において発見されるであろう。一般に、核レ セプターは高いアフィニティーで生理学的に意味のある小さい分子に特異的に結 合し、そして見掛けのＫｄは、核レセプター／リガンドの対に依存して、通常０ ．０１〜２０ｎＭの範囲である。 核レセプターに特異的に結合する合成リガンドの開発は、無数の生理学的プロ セスおよび医学的症状、たとえば、高血圧症、炎症、ホルモン依存性癌（たとえ ば、乳癌および前立腺癌）、生殖器官の変調、胸腺機能亢進症、高コレステロー ル血症および肥満症における核レセプターの重要性にかかわらず、薬剤設計の手 探り法により大部分誘導されてきている。従来、核レセプターに対して特異的な 新しいリガンドは、結合したリガンドをもつ核レセプターの三次元構造について の情報の不存在下において発見された。本発明以前に おいて、研究者らは、核レセプターのアミノ酸がその握りの中にリガンドをどの ように保持するかを可視化することができなかったが、暗闇の中で探ることによ って、核レセプターのリガンドを本質的に発見した。 従って、核レセプターに対するリガンドを発見し、このような化合物を合成し 、そしてこのような化合物を生物に投与して核レセプターにより調節される生理 的プロセスを変調するために必要な時間を短縮する方法および組成物を案出する ことは有利であろう。 発明の要約 本発明は、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）に結合したリガンドをもつ核レセ プターのリガンド結合ドメインの結晶を提供する。本発明の結晶は、核レセプタ ーのリガンド、特に甲状腺レセプターのリガンドと相互作用するアミノ酸のきわ めてすぐれた原子の分解能を提供する。結合したリガンドをもつ核レセプターＬ ＢＤの三次元モデルは核レセプターの従来未知の構造を明らかにし、そして核レ セプターのリガンド結合ドメインの水がアクセス不可能な空洞の中にリガンドが 結合することを示す。 本発明は、また、核レセプターＬＢＤの結晶をベースとする核レセプターの三 次元モデルを使用する計算的方法を提供する。一般に、核レセプターを設計する 計算的方法は、結合したリガンドをもつ核レセプターＬＢＤを含んでなる結晶化 タンパク質の三次元モデルを使用して、核レセプターのどの１またはそれ以上の アミノ酸分析がリガンドの化学的部分（少なくとも１つ）と相互作用するかを決 定し、化学的部分の化学的修飾（少なくとも１つ）を選択して第２化学的部分を 生成し、第２化学的部分は、相互作用するアミノ酸と天然のホルモン上の対応す る化学的部分との間の相互作用に比較し て、相互作用するアミノ酸と第２化学的部分との間の相互作用を減少または増加 する構造を有する。 図面の簡単な説明 第１図は、核レセプターのスーパーファミリーの核レセプターと相互作用する リガンドを設計する計算的方法を示す流れ図である。 第２図は、ファミリーのメンバー内の相同性および種々のドメインの機能を示 す、核レセプターの構造の概略的表示である。 第３図は、核レセプターのスーパーファミリーのいくつかのメンバーのリガン ド結合ドメインの整列されたアミノ酸配列を示す。 第４図は、標識化された二次構造因子をもつラットＴＲ−αＬＢＤのリボンの 図面である。リガンド（マゼンタ）は空間充填モデルとして描写されている。ア ルファらせんおよびコイルのコンフォメーションはイエローであり、ベータ鎖は ブルーである。 第５図は、レセプター内に緊密に充填されたリガンド（マゼンタ）を暴露する ラットＴＲ−αの空間充填モデルの２つの断面図である。 第６図は、リガンド結合空洞の略図である。リガンドと相互作用する残基は、 ほぼ相互作用部位に出現する。水素結合は結合相手の間において破線で示されて いる；各結合の距離が記載されている。 非結合の接触は、相互作用する原子に向かって面する放射状スポークとして示さ れている。 第７図は、精製されたラットＴＲ−αＬＢＤにおける結晶学的温度の因子の分 布である。この分布は１５（ダークブルー）より小から３５（イエロー−グリー ン）より大の領域のカラーのグラデーションとして表されている。 第８図は、リガンドに対するｃ−末端の活性化ドメインを示すラ ットＴＲ−αＬＢＤのリボンの図面である。ｃ−末端の活性化ドメイン（Ｐｒｏ ３９３−Ｐｈｅ４０５）を含んでなる残基は、スティックの表示として描写され ている。疎水性残基、特にＰｈｅ４０１およびＰｈｅ４０５（ブルー）はリガン ドに向かって内側に面する。Ｇｌｕ４０３（レッド）は溶媒の中に外方に突出す る。 第９図は、ＧＲＡＰＨを使用して計算された、ラットＴＲ−αＬＢＤの静電位 表面である。負の静電位はレッドである；正の静電位はブルーである。ｃ−末端 の活性化ドメインは主として疎水性部分を形成する（ホワイト）。Ｇｌｕ４０３ は負の電荷の単一のパッチとして表されている（レッド）。 第１０図は、いくつかの核レセプターについてのアゴニストおよびアンタゴニ ストを比較するダイヤグラムである。 第１１図は、ＴＳ１、ＴＳ２、ＴＳ３、ＴＳ４およびＴＳ５の製造の合成スキ ームである。 第１２図は、ＴＳ６およびＴＳ７の製造の合成スキームである。 第１３図は、ＴＳ８の製造の合成スキームである。 第１４図は、ＴＳ１０の製造の合成スキームである。 第１５図は、いくつかのＴＲリガンドの化学的構造を描写する。 第１６図は、Ｔ₃およびｔｒｉａｃが標識化Ｔ₃とヒトＴＲ−αまたはヒトＴＲ −βへの結合について競合する競合アッセイを示すグラフである。 第１７図は、ＴＲ−αおよびＴＲ−βへの標識化Ｔ₃の結合のスキャッチャー ド分析を描写する。 第１８図は、ＴＲＡα１リポーター細胞においてアッセイしたＴ３の存在また は非存在におけるＤＲ４−ＡＬＰリポーター遺伝子の転写の調節に対するＴＳ− １０の作用を示すチャートである。 第１９図は、ＴＲＡβ１リポーター細胞においてアッセイしたＴ ３の存在または非存在におけるＤＲ４−ＡＬＰリポーター遺伝子の転写の調節に 対するＴＳ−１０の作用を示すチャートである。 第２０図は、ＨｅｐＧ２、肝臓のリポーター細胞系統においてアッセイしたＴ ３の存在または非存在におけるＤＲ４−ＡＬＰリポーター遺伝子の転写の調節に 対するＴＳ−１０の作用を示すチャートである。 第２１図は、リガンド結合空洞中のＴ３をもつＴＲ−αＬＢＤの部分的リボン の図面である。選択された相互作用するアミノ酸は標識化されており、Ｉｌｅ２ ２１、Ｉｌｅ２２２およびＳｅｒ２６０、Ａｌａ２６３、Ｉｌｅ２９９およびＬ ｅｕ２７６を含む。 第２２図は、リガンド結合空洞の中で重なったＴ３およびＤｉｍｉｔをもつＴ Ｒ−αＬＢＤの部分的リボンの図面である。Ｉｌｅ２２１、Ｉｌｅ２２２、Ａｌ ａ２６０、Ｉｌｅ２９９およびＬｅｕ２７６との相互作用は標識化されている。 第２３図は、Ｔ３をもつＴＲ−αＬＢＤの部分的リボンの図面であり、極性ポ ケットの３つのアルギニン残基（Ａｒｇ２２８、Ａｒｇ２６２およびＡｒｇ２６ ６（暗色スティックの図面））、３つの水分子ＨＯＨ５０２、ＨＯＨ５０３およ びＨＯＨ５０４を示し、水素結合は点線で示されている。 第２４図は、ｔｒｉａｃをもつＴＲ−αＬＢＤの部分的リボンの図面であり、 極性ポケットの３つのアルギニン残基（暗色スティックの図面）、水分子（ＨＯ Ｈ５０３、ＨＯＨ５０４およびＨＯＨ６００）を示し、水素結合は点線で示され ている。 第２５図は、リガンド結合空洞の中で重なったＴ３およびｔｒｉａｃをもつＴ Ｒ−αＬＢＤの部分的リボンの図面である。この図面は、Ｔ３またはｔｒｉａｃ がリガンド結合空洞を占有するかどうかにかかわらず、未変化に止まる極性ポケ ット中のいくつかの相互作 用するアミノ酸残基を示す：Ａｒｇ２６２、Ａｓｎ１７９、ＨＯＨ５０３および ＨＯＨ５０４、およびＳｅｒ２７７。Ａｒｇ２２８およびＡｒｇ２６６の双方は 、Ｔ３またはｔｒｉａｃが結合するかどうかに依存して、２つの異なる位置を占 有する。 第２６図は、結合したＤｉｍｉｔをもつＴＲ−αＬＢＤの立体化学的表示であ る。 付録１は参考文献の付録である。 付録２は、Ｄｉｍｉｔ、Ｔｒｉａｃ、ＩｐＢｒ２、およびＴ３と複合化したＴ Ｒリガンドと相互作用するアミノ酸のチャートである。 発明の詳細な説明 序論 本発明は、核レセプター、特に甲状腺レセプター（本明細書において「ＴＲ」 と呼ぶ）の三次元構造をベースとする核レセプター合成リガンドを発生させる新 規な方法、特に計算的方法、および組成物を提供する。従来、核レセプターのリ ガンド結合ドメインについての三次元構造の情報の欠如、特に結合したリガンド をもつ核レセプターに関係する三次元構造の情報の非存在は、核レセプター薬剤 の発見を妨害した。 結合したリガンドをもつ核レセプターのリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）から の結晶および三次元構造の情報を、本明細書において最初に記載する。このよう な結晶は原子レベルにおいてよりすぐれた分解能、およびＬＢＤを含んでなるア ミノ酸による核レセプターのリガンドの配位結合を可視化する能力を提供する。 本発明は、また、このような結晶および三次元構造の情報を使用して核レセプタ ーの合成リガンドを設計して、核レセプターのＬＢＤのコンフォメーションの変 化を調節する合成リガンドを発生させる計算的方法を 提供する。このような合成リガンドは、本明細書において記載しかつ、一部分、 第１図に示す計算的方法を使用して設計することができる。これらの計算的方法 は核レセプターに対するアンタゴニストまたは部分的アゴニストの設計において 特に有用であり、ここでアンタゴニストまたは部分的アゴニストは拡張部分を有 し、この部分は遺伝子の発現の調節に対するレセプターの影響を変更する多数の リガンド誘発された分子の事象のいずれか１つを妨害する、たとえば、天然に存 在するリガンドまたは天然に存在するリガンドをまねる他のリガンド、たとえば 、アゴニストについて観察される活性化ドメインの正常の配位結合を妨害する。 本明細書において記載するように、核レセプターのリガンドは種々の医学的症状 における核レセプターの活性を調節するとき有用であろう。核レセプターに対する適用の可能性 本発明、特に計算的方法を、種々の核レセプター、たとえば、グルココルチコ イド（ＧＲ）、アンドロゲン（ＡＲ）、ミネラルコルチコイド（ＭＲ）、プロゲ スチン（ＰＲ）、エストロゲン（ＥＲ）、甲状腺ホルモン（ＴＲ）、ビタミンＤ （ＶＤＲ）、レチノイド（ＲＡＲおよびＲＸＲ）およびペルオキシソーム増殖因 子（ＰＰＡＰ）についての薬剤を設計するために使用できる。本発明は、また、 「オーファンレセプター」に適用することができる。なぜなら、オーファンレセ プターはモジュールのドメインおよび一次構造において古典的核レセプター、た とえば、ステロイドおよび甲状腺のレセプターに構造的に相同であるからである 。他の核レセプターとのオーファンレセプターのアミノ酸相同性は非常に低い（ ＜１５％）から、たとえば、ラットＲＡＲαおよびヒトＴＲ−βレセプターに比 較したときの３５％の範囲である。さらに、本明細書において開示するＴＲのＸ 線結晶学の構造および構造解析により明らかなように 、リガンデッド（ｌｉｇａｎｄｅｄ）スーパーファミリーのメンバーの全体のフ ォルディングは同様であるように思われる。リガンドはオーファンレセプターで 同定されてきていないが、いったんこのようなリガンドが同定されると、当業者 はこのようなリガンドの設計および使用に本発明を適用することができる。なぜ なら、それらの全体の構造的モジュールのモチーフは本明細書において記載する 他の核レセプターに類似するであろうからである。核レセプターのモジュールの機能的ドメイン 本発明は、通常、本明細書において議論するように、すべての核レセプターに 適用可能であり、一部分、異なる結合したリガンドをもつ核レセプターの三次元 構造、顕著にはＴＲ−αおよびＴＲ−βについてのリガンド結合ドメインの三次 元構造または結晶化タンパク質の構造を決定した結果として出現した核レセプタ ーの活性化、構造および調節のパターンに適用可能である。核レセプターのスー パーファミリーのタンパク質は、本明細書において記載しかつこの分野において 知られているように、アミノ酸の相同性の実質的な領域を表示する、第２図を参 照のこと。このファミリーメンバーは、３モジュールのドメインの全体の構造的 モチーフを表示する（これはＴＲの３モジュールのドメインのモチーフに類似す る）： １）可変アミノ末端ドメイン； ２）高度に保存されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）；および ３）低度に保存されたカルボキシル末端のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）。 このスーパーファミリーのモジュール性は各ドメインの異なるドメインが別々に 異なる機能を達成できるようにするが、ドメインは互いに影響を及ぼすことがで きる。特定のドメインがタンパク質の残りのドメインから単離されるとき、ドメ インの別々の機能が通常保存される。慣用のタンパク質化学の技術を使用して、 モジュールのドメインを時には親タンパク質から分離することができる。慣用の 分子生物学の技術を使用して、各ドメインのもとの機能を完全なままにして各ド メインを別々に発現させることができるか、あるいは２つの異なる核レセプター のキメラを構築することができ、ここでキメラを発生させたそれぞれの核レセプ ターの個々の機能的ドメインの性質をキメラは保持する。 第２図は、ファミリーのメンバー内の相同性の領域および種々のドメインの機 能を示す、ファミリーのメンバーの構造の概略的表示を提供する。アミノ末端のドメイン アミノ末端のドメインは３つのドメインのうちで保存性が最も低いドメインで あり、そして核レセプターのスーパーファミリーのメンバーの中で大きさが著し く変化する。たとえば、このドメインはＶＤＲ中に２４アミノ酸およびＭＲ中に ６０３アミノ酸を含有する。このドメインは転写活性化に関係し、ある場合にお いて、そのユニーク性は特定のレセプターのイソ型による選択的レセプター−Ｄ ＮＡの結合および標的遺伝子の活性化を支配することができる。このドメインは ＬＢＤのドメインとの相乗的かつアンタゴニストの相互作用を表示することがで きる。たとえば、突然変異したおよび／または欠失したレセプターを使用する研 究は、アミノおよびカルボキシ末端の陽性の共同性を示す。ある場合において、 これらのドメインのいずれかの欠失はレセプターの転写活性化機能を壊滅させる であろう。ＤＮＡ結合ドメイン ＤＢＤは核レセプターのスーパーファミリーにおいて最も保存される構造であ る。それは通常約７０アミノ酸を含有し、これらのアミノ酸は２つの亜鉛フィン ガーモチーフにフォルドし、ここで亜鉛 イオンは４つのシステインを配位結合する。ＤＢＤは２つの垂直に向いたα−ら せんを含有し、これらのらせんは第１および第２の亜鉛フィンガーの基部から延 びる。２つの亜鉛フィンガーは非亜鉛フィンガーと一緒に共同して機能して、核 レセプターをＤＮＡ上の特定の標的部位に向け、そしてレセプターのホモダイマ ーまたはヘテロダイマーの界面を整列させる。ＤＢＤにおける種々のアミノ酸は 、レセプター二量体の結合のための２つのハーフサイト（通常６ヌクレオチドか ら構成されている）の間の間隔に影響を及ぼす。たとえば、ＧＲサブファミリー およびＥＲホモダイマーは、３ヌクレオチドの間隔を置いて位置しかつパリンド ロームとして方向づけられたハーフサイトに結合する。最適な間隔はＤＢＤの間 の共同的相互作用を促進し、そしてＤボックス残基は二量化界面の一部分である 。ＤＢＤの他の領域は、直接的反復因子上のＲＸＲホモダイマー化およびヘテロ ダイマー化に要求されるＤＮＡ−タンパク質およびタンパク質−タンパク質の相 互作用を促進する。 ＬＢＤはＤＢＤのＤＮＡ結合に影響を及ぼすことがあり、そしてこの影響はリ ガンドの結合により調節することもできる。たとえば、ＴＲリガンドの結合は、 ＴＲがモノマーまたは二量体としてＤＮＡに結合する程度に影響を及ぼす。また 、このような二量化はＤＮＡハーフサイトの間隔および向きに依存する。 核レセプターのスーパーファミリーは、ＤＢＤの構造、熱ショックタンパク質 （ｈｓｐ）との相互作用、およびヘテロダイマーを形成する能力に基づいて、２ つのサブファミリーに再分割されてきている：１）ＧＲ（ＧＲ、ＡＲ、ＭＲおよ びＰＲ）および２）ＴＲ（ＴＲ、ＶＤＲ、ＲＡＲ、ＲＸＲ、および大部分のオー ファンレセプター）。ＧＲサブグループのメンバーは、リガンドの非存在におい てｈｓｐにより緊密に結合され、ｈｓｐのリガンド結合および解離 後に二量化し、そしてそれらが結合するＤＮＡハーフサイトにおける相同性を示 す。これらのハーフサイトはパリンドロームとして配置される傾向がある。ＴＲ サブグループのメンバーはＤＮＡまたは他のクロマチン分子に結合する傾向があ り、アンリガンド（ｕｎｌｉｇａｎｄ）するとき、モノマーおよび二量体として ＤＮＡに結合することができるが、ヘテロダイマーを形成する傾向があり、そし てハーフサイトの種々の向きおよび間隔でＤＮＡ因子と結合し、また、ハーフサ イトのヌクレオチド配列に関して相同性を示す。ＥＲはｈｓｐ相互作用において ＧＲサブファミリーに類似し、そして核局在化およびＤＮＡ結合の特性において ＴＲサブファミリーに類似するので、ＥＲはいずれのサブファミリーにも属さな い。リガンド結合ドメイン ＬＢＤはこれらのレセプターにおいて最も高度に保存されたドメインである。 いくつかの異なるＬＢＤサブドメインの完全性はリガンドの結合について重要で あるが、ＬＢＤのみを含有するトランケート分子は正常のリガンド結合活性を保 持する。また、このドメインは、本明細書において記載するように、二量化、核 転位および転写活性化を包含する他の機能に参加する。重要なことには、このド メインは、本明細書において詳述するように、リガンドに結合し、リガンド誘発 コンフォメーション変化を行う。 オーファンレセプターを包含するスーパーファミリーの大部分のメンバーは少 なくとも２つの転写活性化サブドメインを有し、それらの１つは構成的であり、 アミノ末端のドメインに存在し（ＡＦ−１）、そしてそれらの他方（ＡＦ−２（ また、ＴＡＵ４と呼ぶ））はアゴニストのリガンドの結合によりその活性が調節 されるリガンド結合ドメインの中に存在する。ＡＦ−２の機能は、レセプターの スーパーファミリー（ほぼアミノ酸１００５−１０２２）の中に高 度に保存される活性化ドメイン（また、トランスアクチベーションドメインと呼 ぶ）を必要とする。大部分のＬＢＤは活性化ドメインを含有する。このドメイン における多少の突然変異はＡＦ−２の機能を壊滅させるが、リガンドの結合およ び他の機能を影響を受けない状態に残す。リガンドの結合は、転写を剌激する（ またはある場合において、阻害する）機能をする必須のコアクチベータ−タンパ ク質のための相互作用部位として活性化ドメインを働かせる。 活性化サブドメインにおいて１またはそれ以上のアミノ酸と配位結合（または 相互作用）するようにリガンドがＬＢＤに結合できるようにするために、カルボ キシ末端の活性化サブドメインは、本明細書において記載するように、リガンド に対してＬＢＤにおいて密接な三次元の近接性にある。本明細書において記載す るように、核レセプターのＬＢＤを発現させ、結晶化し、結合したリガンドを使 用して（同一レセプターまたは異なるレセプターまたはそれらの組み合わせから の結晶のデータを使用して）その三次元構造を決定し、そして計算的方法を使用 してそのＬＢＤに対するリガンド、特に核レセプターの活性化ドメインと配位結 合するエクステンション部分を含有するリガンドを設計することができる。 本明細書において記載するようにかつこの分野において知られているように、 いったん計算的に設計されたリガンド（ＣＤＬ）が合成されると、本明細書にお いて記載するように、アッセイを使用してそれを試験して、アゴニスト、部分的 アゴニストまたはアンタゴニストとしてその活性、およびアフィニティーを確立 することができる。このような試験後、ＬＢＤに結合したＣＤＬを有するＬＢＤ 結晶を発生させることによって、ＣＤＬをさらに精製することができる。次いで 、三次元モデルについて本明細書において記載する化学的修飾法を使用して、Ｃ ＤＬの構造物をさらに精製して、ＣＤＬ の活性またはアフィニティーを改良し、そして改良された特性、たとえば、本明 細書において記載する超アゴニストまたはアンタゴニストの特性、を有する第２ 世代のＣＤＬを作ることができる。核レセプターのイソ型 本発明は、また、核レセプターのイソ型を区別する新規な合成リガンドを発生 させるために適用可能である。本明細書において記載するように、イソ型を区別 するＣＤＬを発生させ、これにより組織特異的または機能特異的合成リガンドを 発生させることができる。 たとえば、ＧＲサブファミリーのメンバーは通常単一遺伝子によりコードされる １つのレセプターを有するが、ただし異なるＡＵＧコドンからの別の開始により 同一ｍＲＮＡから翻訳された２つのＰＲイソ型、ＡおよびＢ、が存在する。この 方法は、２つの（ＴＲ）または３つの（ＲＡＲ、ＲＸＲ、およびＰＰＡＲ）遺伝 子によりコードされるか、あるいは別のＲＮＡスプライシングを有するいくつか のレセプターを通常有するＴＲサブファミリーに特に適用可能であり、そしてＴ Ｒについてのこのような例を本明細書において記載する。核レセプターの結晶 本発明は、リガンドがレセプターに結合した核レセプターのリガンド結合ドメ インから作られた結晶を提供する。実施例において例示するように、ＴＲにリガ ンドを結合させてＴＲを結晶化させる。 通常細胞培養物、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により発現される核レセプ ターＬＢＤの精製物から結晶は作られる。好ましくは、異なるリガンド、たとえ ば、天然に存在するリガンドと、天然に存在するリガンドの類似体およびアンタ ゴニストとして作用する少なくとも１つのブロモ置換またはヨード置換の合成リ ガンドとを使用して、同一の核レセプターについて異なる結晶（共結晶（ｃｏ− ｃｒｙｓｔａｌｓ））を別々に作る。このようなブロモ置換基またはヨード置換 基は、核レセプターのリガンドおよび核レセプタータンパク質の結晶において、 重い原子の置換体として作用する。この方法は、伝統的重金属誘導体を得ること を必要としないということにおいて、結晶のフェージングにおいて利点を有する 。結合したリガンドをもつ核レセプターＬＢＤについて三次元構造が決定された 後、この三次元構造を計算的方法において使用して核レセプターのための合成リ ガンドを設計することができ、そしてさらに本明細書において記載しかつこの分 野において知られているアッセイを使用する日常的試験により、活性構造の関係 を決定することができる。他の核レセプターＬＢＤ構造物の発現および精製 本明細書において記載する技術および文献に記載されている他の技術により、 核レセプターＬＢＤの高いレベルの発現を得ることができる。ＴＲおよびステロ イド／甲状腺レセプターのスーパーファミリーのメンバー、たとえば、エストロ ゲン（ＥＳ）、アンドロゲン（ＡＲ）、ミネラルコルチコイド（ＭＲ）、プロゲ ステロン（ＰＲ）、ＲＡＲ、ＲＸＲおよびビタミンＤ（ＶＤＲ）を包含する他の 核レセプターのリガンド結合ドメインの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の高いレベル の発現を達成することもできる。酵母および他の真核生物の発現系を熱ショック タンパク質に結合する核レセプターとともに使用することができる。なぜなら、 細菌中で発現させることができるＥＲを除外して、これらの核レセプターは一般 に細菌中の発現がいっそう困難であるからである。代表的な核レセプターまたは それらのリガンド結合ドメインはクローニングおよび配列決定された：ヒトＲＡ Ｒ−α、ヒトＲＡＲ−γ、ヒトＲＸＲ−α、ヒトＲＸＲ−β、ヒトＰＰＡＲ−α 、ヒトＰＰＡＲ−β、ヒトＰＰＡＲ−γ、ヒトＶＤＲ、ヒトＥＲ（Ｓｅｉｅｌｓ ｔａｄ、ｅｔ ａｌ．、Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．９：６４７−６５８ （１９９５）に記載されているように）（引用することによって本明細書の一部 とされる）、ヒトＧＲ、ヒトＰＲ、ヒトＭＲ、およびヒトＡＲ。これらの核レセ プターの各々のリガンド結合ドメインは同定され、そして第３図に示されている 。第３図における情報を本明細書において記載されかつこの分野において知られ ている方法と組み合わせて使用すると、当業者は第３図に示されているものを包 含する核レセプターの任意のもののＬＢＤを発現させ、精製し、それを適当なリ ガンドに結合させ、結合したリガンドをもつ核レセプターＬＢＤを結晶化させる ことができる。 第３図は、適当な発現ベクターの中に含めるべきアミノ酸を示す、ステロイド ／甲状腺ホルモンのレセプターのいくつかのメンバーの整列である。 発現する細胞の抽出物は、選択したレセプターの結晶の精製および調製のため の適当なレセプター源である。このような発現を得るために、ラットＴＲアルフ ァの発現に使用される方法に類似する方法において、ベクターを構築する（Ａｐ ｒｉｌｅｔｔｉ、ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎ ｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、６：３６８−３７０（１９９５）、引用するこ とによって本明細書の一部とされる）。発現すべきレセプターのリガンド結合ド メイン、たとえば、エストロゲンレセプターのリガンド結合ドメイン（ｈＥＲ− ＬＢＤ）（第３図に示すように標準的に整列された位置７２５におけるＲ−位置 １０２５におけるＬに対応する）を包含するアミノ酸をコードするヌクレオチド を、発現ベクター、たとえば、Ａｐｒｉｌｅｔｔｉ、ｅｔ ａｌ．（１９９５） において使用されている発現ベクターの中に挿入する。すぐれた結晶を生ずる材 料を得る目的で、少なくともヒトＴＲ−βの位置７２ ５−１０２５に対応するアミノ酸を含めることが好ましい。より多い構造的情報 を望む場合、隣接するアミノ酸配列のストレッチを含めることができる。したが って、位置７００から位置１０７１のｃ−末端までのアミノ酸配列をコードする ヌクレオチドを挿入することによって、ヒトのエストロゲンレセプターの発現ベ クターを作ることができる。このようなベクターはホルモンに結合できるレセプ ターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で高い収率で与える（Ｓｅｉｅｌｓｔａｄ、ｅ ｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．９： ６４７−６５８（１９９５））。しかしながら、位置１０２５を越えるｃ−末端 の領域は可変タンパク質分解に暴露され、構築物から排除することが有利である ことがある。 可変タンパク質分解を回避するこの技術を他の核レセプターに適用することもで きる。核レセプタ−ＬＢＤの構造および機能のの例としてＴＲ−αおよびＴＲ−β Ｔ Ｒの発現、精製および結晶 リガンド結合ドメインの核レセプターの構造の例として、ＴＲのα−およびβ −イソ型を発現構築物、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させること ができる構築物から発現したタンパク質から結晶化させる。他の発現系、たとえ ば、酵母または他の真核生物の発現系を使用することができる。ＴＲについて、 ＤＢＤまたはアミノ末端のドメインのいずれの部分をももたないＬＢＤを発現さ せることができる。ＬＢＤに隣接するアミノ酸を含むそれ以上の構造的情報を望 む場合、ＤＢＤまたはアミノ末端のドメインの部分を含めることができる。一般 に、ＴＲについて、結晶に使用するＬＢＤは３００アミノ酸より短いであろう。 好ましくは、ＴＲ ＬＢＤは少なくとも１５０アミノ酸、より好ましくは少なく とも２００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸の長さであろう 。たとえば、結晶化に使用するＬＢＤはラットＴＲ−αのＭｅｔ１２２−Ｖａｌ ４１０、ヒトＴＲ−βのＧｌｕ２０２−Ａｓｐ４６１の範囲のアミノ酸を含んで なることができる。 典型的には、ＴＲ ＬＢＤを結晶化のために均質に精製する。ＴＲ ＬＢＤの 純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析および疎水性ＨＰＬＣで測定する。結晶化の ために精製したＴＲは少なくとも９７．５％の純度または９７．５％の純度、好 ましくは少なくとも９９．０％の純度または９９．０％の純度、より好ましくは 少なくとも９９．５％の純度または９９．５％の純度であるべきである。 最初に、慣用技術、たとえば、疎水性相互作用のクロマトグラフィー（ＨＰＬ Ｃ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、およびヘパリンアフィニテ ィークロマトグラフィーにより、アンリガンデッド（ｕｎｌｉｇａｎｄｅｄ）レ セプターを得ることができる。 核レセプター、特にＴＲサブファミリーおよびＴＲの結晶を改良するためによ り高い精製を達成するために、電荷に従いレセプターを分離するカラム、たとえ ば、イオン交換または疎水性相互作用のカラムを使用して核レセプターをリガン ドシフト精製し、次いで溶離されたレセプターをリガンド、特にアゴニストと結 合させることが望ましいであろう。リガンドはレセプター表面の電荷の変化を誘 発し、こうして同一カラムで再クロマトグラフィーにかけたとき、リガンデッド レセプター(liganded receptor)の位置においてレセプターは溶離し、アンリガ ンデッドレセプター(unliganded receptor)で展開されたもとのカラムにより除 去される。通常、リガンドの飽和濃度を使用し、タンパク質をリガンドとともに 前もってインキュベートした後、それをカラムに通過させる。本明細書において 詳述する構造の研究において、結晶化に使用する超純粋な核レセプ ターＬＢＤを得る際のこの技術の一般的適用を示す。 より最近に開発された方法は、タンパク質の末端、たとえば、アミノ末端に配 置されたヒスチジンで「標識」を操作し、次いで精製にニッケルキレート化カラ ムを使用することを含む、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ、Ｒ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．８８：８９７２−８９７６（１９９１）、引 用することによって本明細書の一部とされる。 ＴＲ ＬＢＤまたは核レセプターのスーパーファミリーの他のメンバーからの ＬＢＤの三次元構造を決定するために、対応するＬＢＤリガンドとＬＢＤを共結 晶化（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌｉｚｅ）することが望ましい。ＴＲ ＬＢＤの場合 において、それをリガンド、たとえば、それらが含有する重い原子が異なるＴ３ 、ＩｐＢｒおよびＤｉｍｉｔと別々に共結晶化させることが好ましい。他のＴＲ リガンド、たとえば、本明細書において記載する式１に含まれかつこの分野にお いて知られているリガンドを、ＴＲ ＬＢＤおよびＴＲリガンドの共結晶の発生 に使用することもできる。式１に含まれる化合物のうちで、一般にＲ₃、Ｒ₅、Ｒ₃ ’またはＲ₅’位に少なくとも１つのブロモまたはヨードの置換を有する少なく とも１つのリガンドを使用することが望ましく、好ましくはこのような化合物は 少なくとも２つのこのような置換、より好ましくは少なくとも３つのこのような 置換を有する。本明細書において記載するように、このような置換はＴＲ ＬＢ Ｄの三次元構造についての相の問題の解決を促進する重い原子として好都合に使 用され、そして、特に核レセプターのために、ハロゲン（たとえば、ＩまたはＢ ｒ）置換リガンドを使用するフェージングの一般化された方法として使用するこ とができる。 典型的には、精製されたＬＢＤ、たとえば、ＴＲ ＬＢＤをリガ ンドの飽和濃度でタンパク質の完全性を保存する温度において平衡化される。リ ガンドの平衡化は２〜３７℃において確立することができるが、レセプターは２ 〜２０℃の範囲においていっそう安定である傾向がある。 好ましくは、本明細書において詳述するハンギングドロップ法を使用して結晶 を作る。結晶の安定性および品質を改良するために、調節された温度制御が望ま しい。４〜２５℃の温度を一般に使用し、ある温度範囲にわたって結晶化を試験 することが好ましい。ＴＲの場合において、好ましくは１８〜２５℃、より好ま しくは２０〜２３℃、最も好ましくは２２℃の結晶化温度を使用する。 ＴＲ−αＬＢＤと種々のアゴニスト、例えば、３，５，３’−トリヨードサイ ロニン（Ｔ₃）、３’−イソプロピル−３，５−ジブロモサイロニン（ＩｐＢｒ₂ ）、３’−イソプロピル−３，５−ジメチルサイロニン（Ｄｉｍｉｔ）、および ３，５，３’−トリヨードサイロ酢酸（ｔｒｉａｃ）との複合体を本明細書にお いて記載する方法により製造する。周囲温度において１５％の２−メチル−２， ４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）から蒸気拡散により、前もって結合したリガン ドをもつｒＴＲ−αＬＢＤの結晶を製造する。結晶は放射線感受性であり、完全 な回折データを測定するために凍結を必要とする。回転するアノードＸ線源上で 、結晶は約３オングストロームに回折する；シンクロトロン放射光は分解能の限 界を、Ｔ₃共結晶について２．０Å程度に高く、有意に拡張する。甲状腺ホルモ ンの組成物は、種々の類似体と複合化したレセプターを製造し、共結晶化させる 能力を有すると同時に、異常なフェージング戦略を可能とした。その中に記載さ れる核レセプターのリガンドのＩおよびＢｒの置換を発生させることによって、 このフェージング戦略をこのようなリガンドに適用することができる。この戦略 において、 ３、５および３’位が異なる４つのホルモン類似体（Ｔ₃、ＩｐＢｒ₂、Ｄｉｍｉ ｔ、およびｔｒｉａｃ）を含有するＴＲ ＬＢＤの結晶は同形誘導体を提供した 。類似体のこの組について、ハロゲン置換（２つＢｒおよび３つのＩ原子）は重 い原子として機能するが、Ｄｉｍｉｔ結晶（３つのアルキル基）は親として作用 する。初期の２．５Åの多重同形置換／異常散乱／密度修飾電子密度地図は、分 子グラフィックスプログラムＯ５においてつくられた骨格からＬＢＤのトレース を可能とした（Ｊｏｎｅｓ、Ｔ．Ａ．、ｅｔ ａｌ．、ＡＣＴＡ Ｃｒｙｓｔ、 ４７：１１０−１１９（１９９１）、引用することによって本明細書の一部とさ れる）。ＬＢＤのモデルは４つのフラグメントで製作され、Ａｒｇ１５７−Ｇ１ ｙ１８４、Ｔｒｐ１８６−Ｇｌｙ１９７、Ｓｅｒ１９９−Ｐｒｏ２０５、および Ｖａ１２１０−Ｐｈｅ４０５、そしてＸＰＬＯＲ中で位置精製およびシミュレー トされたアニーリングプロトコールを使用して精製された。欠けている残基は差 密度の助けにより作られた。最終モデルは５．０〜２．２ÅのデータについてＲ_cryst ＝２１．８％およびＲ_free＝２４．４％に精製された、表３を参照のこと 。 このフェージング戦略は、本明細書において記載する核レセプターのリガンド に、このようなリガンドのＩおよびＢｒの置換を発生させることによって適用可 能である。ＴＲ ＬＢＤの三次元構造 ＴＲ ＬＢＤの構成 核レセプターの三次元構造の１例として、ＴＲ−α₁ＬＢＤのフォルディング を第４図に示す。ＴＲ−αＬＢＤは、１２のα−らせん、Ｈ１−１２、および４ つの短いβ−鎖、Ｓ１−４から構成され、混合β−シートを形成する、３層で詰 められた単一の構造的ドメインから成る。埋没ホルモンおよび３つの逆平行α− らせん、Ｈ５ −６、Ｈ９およびＨ１０は、第４図に示すように、ドメインの中央層を形成する 。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３およびＳ１はＬＢＤの１つの面を形成し、反対の面はＨ７、 Ｈ８、Ｈ１１およびＨ１２により形成されている。Ｎ−末端の最初の３５アミノ 酸（Ｍｅｔ１２２−Ｇｌｎ１５６）は電子密度地図において可視ではない。ＤＮ Ａに結合したヘテロダイマーＲＸＲ：ＴＲ ＤＮＡ結合ドメイン、ＴＲ ＤＢＤ のアミノ酸Ｍｅｔ１２２−Ｇｌｎ１５１、の三次元構造は、ＤＮＡ８の小さい溝 と広範な接触を作る。５つの無秩序のアミノ酸（Ａｒｇ１５２−Ｇｌｎ１５６） は、ＴＲ ＤＢＤの最後の可視残基とＬＢＤの最初の可視残基との間に存在し、 完全なレセプター中のＬＢＤおよびＤＢＤに結合する有効な「ヒンジ」を表すで あろう。 二次構造の主としてらせんの組成および層状配置はアンリガンデッドｈＲＸＲ αのそれと同一であり、２つの核レセプターの間の共通の核レセプターのフォル ドの存在を確証する。 ＴＲ ＬＢＤは可視であり、Ａｒｇ１５７において開始し、拡張したコイルコ ンフォメーションでＨ１の開始まで連続する。α−らせんＨ２の回転はホルモン の結合空洞をカバーし、直ちに短いβ−鎖、Ｓ１、が続き、これはＳ４、すなわ ち、３つの逆平行の鎖の最も外部に対して平行である、混合β−シートのへりを 形成する。この鎖はＨ３が開始するまで大部分不規則であり、Ｈ１に対して逆平 行である。Ｈ３はリガンドに接触するＩｌｅ２２１およびＩｌｅ２２２において 曲がる。この鎖はＨ３の終わりにおいてほとんど９０°で回転して、不完全なα −らせん、Ｈ４を形成する。最初の埋没コアらせん、Ｈ５−６は、Ｇｌｙ２５３ におけるリガンドに近いキンクにより変更された、その軸をたどる。このらせん は２つの顕著な例外により中断された主として疎水性の側鎖から構成されている ：Ａｒｇ２６２は溶媒アクセス不可能であり、リガンドのカルボキ シレート（１−置換基）と相互作用し、そしてＧｌｕ２５６はＨ９からのＡｒｇ ３２９およびＨ１１からのＡｒｇ３７５と極性折りたたみで出会う。Ｈ５−６は ４本の鎖の混合シートの短いβ−鎖、Ｓ２において終止する。Ｓ３およびＳ４は 左向き回転により結合し、さらにＬｙｓ２８４とＡｓｐ２７２との間の塩架橋に より結合されている。Ｓ４に引き続いて、Ｈ７およびＨ８はＬｙｓ２６８とＡｓ ｐ２７７との間の塩架橋により安定化されたＬを形成する。Ｈ７およびＨ８の間 の回転は、リガンドおよびそのグリシンに富んだ配列との相互作用の結果である 、異常なコンフォメーションを取る。Ｈ９は第２コアらせんであり、付近のＨ５ −６に対して逆平行である。再び、２つの埋没極性側鎖が見出される、Ｇｌｕ３ １５およびＧｌｎ３２０。Ｇｌｕ３１５はＨｉｓ３５８およびＡｒｇ３５６と埋 没塩架橋を形成する。Ｇｌｎ３２０の酸素はＨｉｓ１７５の架橋側鎖と水素結合 を形成する。次いでこの鎖は再び反転して、またＨ９に対して逆平行であるＨ１ ０を形成する。Ｈ１１はこの分子の全長を対角線的に横切って延びる。Ｈ１１の 直後において、この鎖はＨ１１に対してほぼ９０°でＩＩ型の回転を形成する。 次いでこの鎖は再び回転してＨ１２を形成し、これはホルモンまたはリガンド結 合空洞の一部分としてＨ３およびＨ１１に対してゆるく詰まる。Ｃ−末端におけ る最終の５アミノ酸、Ｇｌｕ４０６−Ｖａ１４１０は無秩序である。核レセプターの埋没リガンド空洞の１例としてのＬＢＤのリガンド結合空洞 ＴＲ ＬＢＤの三次元構造は、Ｔ３またはそのアイソスターがＬＢＤに結合す るとき、ＬＢＤのリガンド結合空洞が溶媒アクセス不可能であるという最初の発 見に導く。この驚くべき結果は核レセプターの三次元構造および機能の新規なモ デルに導く。これについて は、リガンドの設計の計算的方法および、活性化ドメインの活性化を妨害する拡 張位置を含有する核レセプターの合成リガンドを設計するために、このような方 法を適用することを解明する節において、本明細書においてさらに説明する。 Ｄｉｍｉｔ、すなわち、レセプターに結合したリガンドはＴ₃のアイソスター および甲状腺ホルモンのアゴニストである。したがって、Ｄｉｍｉｔの結合はＴ₃ の結合を反映し、そしてＤｉｍｉｔ結合レセプターはＴＲの活性コンフォメー ションであることが期待される。第５ａ図および第５ｂ図に示すように、このリ ガンドはレセプター内に埋没されており、タンパク質のサブドメインに疎水性コ アを提供する。Ｈ５−６およびＨ９はレセプターの残部のためのコアを含んでな る。 広範な結合空洞はいくつかの構造的因子から構築される。この空洞は上からＨ ５−６（Ｍｅｔ２５６−Ａｒｇ２６６）により、下からＨ７およびＨ８および介 在するループ（Ｌｅｕ２８７−Ｉｌｅ２９９）により、側面に沿ってＨ２（１８ ５−１８７）により、Ｓ３およびＳ４の間の回転（Ｌｅｕ２７６−Ｓｅｒ２７７ ）により、Ｈ３（Ｐｈｅ２１５−Ａｒｇ２２８）により、Ｈ１１ （Ｈｉｓ３８ １−Ｍｅｔ３８８）により、そしてＨ１２（Ｐｈｅ４０１−Ｐｈｅ４０５）によ り取り囲まれている。これらの因子により規定され、ＧＲＡＳＰ（Ｃｏｌｕｍｂ ｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡ）計算された空洞の体積（６００Å３）は 、本質的にホルモンの体積（５３０Å）である。残りの体積はアミノ−プロピオ ン酸の置換基を取り囲む水分子により占有されている。第６図はＴＲのＬＢＤと リガンドとの間の種々の接触（または相互作用）を描写する。 リガンドの内側および外側（プライムリング）のリングの平面は互いに関係し て約６０°で平面から回転しており、３’−遠位コン フォメーションを取っている（ここで外側リングの３’置換基は下方に内側リン グから離れる方向に突起する）。アミノ−プロピオン酸および外側フェノールリ ングはトランソイド（ｔｒａｎｓｏｉｄ）コンフォメーションを取り、各々は内 側リングの反対側に存在する。アミノ−プロピオン酸についての捩れ角ｘ₁は３ ００°である。 アミノ−プロピオン酸置換基は、Ｈ２、Ｈ４およびＳ３からの側鎖により形成 された極性ポケット内に収容されている。カルボキシレート基はＡｒｇ２２８の グアジニウム基およびＳｅｒ２７７のアミノＮと直接水素結合を形成する。さら に、Ａｒｇ２６２、Ａｒｇ２６６およびＡｓｎ１７９は水仲介水素結合を通して カルボキシレートと相互作用する。３つのアルギニン残基は有意に正の局所的静 電位を発生させ、これはカルボキシレートの負電荷を安定化することができる。 水素結合はアミノ窒素により形成されない。アミノ−プロピオン酸置換基の相互 作用は、アミノ窒素を欠如するｔｒｉａｃがＴ₃のそれに等しい結合アフィニテ ィーを有するという事実と一致し、アミノ窒素およびＴ₃のより長い脂肪族鎖が 結合アフィニティーに大きく寄与しないことを示す。 ジフェニルエーテルは、対照的に、疎水性コア内に埋没して見出される。内側 リングはＨ３、Ｈ５−６およびＳ３により形成された疎水性ポケットの中にパッ クされる。３−および５−メチル置換基のためのポケットは、期待されるように 、完全に充填されない。なぜなら、Ｄｉｍｉｔについてのメチル置換基のファン デルワールス半径は甲状腺ホルモンＴ₃により提供されるヨウ素置換基よりも小 さいからである。このようなポケットは典型的には２５〜１００立方オングスト ロームであり（置換基のためのより小さい４０〜８０立方オングストロームの範 囲のポケットが考えられるが）本明細書 において記載するように、よりすぐれた適合の化学的置換でいっそう緊密に充填 されることができる。 外側リングは、Ｈ３、Ｈ５−６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ１１およびＨ１２、およびＨ ７とＨ８との間のループにより形成されたポケットの中に緊密に充填されている 。エーテル酸素はＰｈｅ２１８、Ｌｅｕ２８７、Ｌｅｕ２７６およびＬｅｕ２９ ２により定められる疎水性環境の中に見出される。エーテル酸素に対する水素結 合の非存在は、減少したまたは無視可能な水素結合能力を有する構造的に類似す るリンケージをもつホルモン類似体の強い結合により示唆されるように、フェニ ルリングの正しい立体化学の確立におけるその役割と一致する。３’−イソプロ ピル置換基はＧｌｙ２９０および２９１と接触する。ポケット中のこの位置にお けるグリシンの存在は、活性と３’−置換基の大きさとの間の観察された関係を 説明することができる。活性は３’−イソプロピルについて最高であり、そして 嵩が大きくなるほど減少する。疎水性空洞中において水素結合のみがフェノール のヒドロキシルとＨｉｓ３８１Ｎε２との間で形成される。Ｈｉｓ３８１のコン フォメーションは、Ｐｈｅ４０５およびＭｅｔ２５６により提供されるパッケー ジング接触により安定化される。 水素より大きい５’置換基の存在はホルモンの結合アフィニティーに影響を与 える。より豊富な甲状腺ホルモン、３，５，３’，５’−テトラヨード−Ｌ−サ イロニン（Ｔ₄）はこの位置にヨウ素を含有し、そしてＴ₃のアフィニティーの２ ％でレセプターに結合する。この構造が示唆するように、Ｍｅｔ２５６による立 体的コンフリクトと、多分フェノールのヒドロキシルへのＨｉｓ３８１からの水 素結合の形状寸法により付与される拘束との組み合わせを通して、Ｔ₄に対する 区別が達成される。本明細書において記載するよう に、プライムリングからのエクステンションを生成しかつアンタゴニストまたは 部分的アゴニストの発生を生ずるＴ₃および／またはＴＲアゴニストの５’にお けるＣ−Ｈの化学的修飾を導入するために、５’位は好ましい。 欠失および抗体の競合の研究において、リガンドの結合における残基Ｐｒｏ１ ６２−Ｖａｌ２０２の掛かり合いが示唆される。この領域は結合した構造におい てホルモンと直接的に接触しないが、Ｈ２は残基に対してパックしてアミノ−プ ロピオン酸基と相互作用する極性ポケットを形成する。それゆえ、Ｈ２のための １つの役割はこれらの残基を結合した状態で安定化することであり、また、Ｈ２ はβ−鎖Ｓ３およびＳ４とともにリガンドのための優勢な入口点を表すことがで きる。なぜなら、リガンドのアミノ−プロピオン酸はこの領域に向いているから である。Ｔ₃アフィニティーマトリックスへのレセプターの結合の研究において 、アミノ−プロピオン酸に対するリンケージのみが許容されることが証明され、 他のリンケージの中に存在する立体障害が結合を妨害することを示唆する。さら に、結晶学の温度因子は、コイルおよびβ−鎖の領域がドメインの最も柔軟な部 分であることを示唆する、第７図。この領域、すなわち、結合ホルモン中のＤＢ Ｄ（５ＬＢＤとの間のヒンジドメインの部分の参加は、ヒンジドメインの部分は ＤＮＡと接触するので、ＤＮＡの結合に影響を及ぼすリガンドの結合の構造的手 段を提供することができる。核レセプターの活性化ドメインの１例としてＴＲ ＬＢＤの転写活性化らせん リガンドを負荷したとき、リガンド結合空洞が溶媒アクセス不可能であるとい う最初の発見に加えて、ＴＲ ＬＢＤの活性化らせんは少なくとも１つのアミノ 酸と結合したリガンドとの間の相互作用 のための表面をリガンドの空洞に提供する。ＴＲのＣ−末端の１７アミノ酸（活 性化らせんまたはＡＦ−２と呼ぶ）（ＬＢＤ活性化ドメインの１例）は、ホルモ ン依存性転写活性化の仲介に関係づけられる。このドメイン内の主要な残基の突 然変異はリガンド依存性活性化を減少させるが、このような突然変異がリガンド の配位結合に直接的に影響を与えるかどうかは本発明まで不明瞭であった。この ドメインのいくつかの突然変異はリガンドの結合を減少または壊滅させることが 認められたが、ＬＢＤのより遠い部位における他の突然変異は同様な作用を有す る。 核レセプターの中の活性化ドメインは結合空洞に類似する三次元の関係を表示 し、これはリガンドの分子認識ドメインに結合するＬＢＤの領域である、すなわ ち、活性化ドメインは結合空洞（しかし、必然的にリガンドの分子認識ドメイン ）にそれ自体の一部分を提供する。多数の核レセプターはこのようなドメインを 有することが期待され、レチノイドレセプター、ＲＡＲおよびＲＸＲ、グルココ ルチコイドレセプターＧＲ、およびエストロゲンレセプターＥＲを包含する。Ｔ Ｒの配列に基づいて、ドメインは両親媒性らせん構造を取ることが提案されてい る。β−シートまたは混合二次構造は、それほど関係しない核レセプターにおい て活性化ドメインとして存在できるであろう。 活性化ドメイン内において、高度に保存されるモチーフффＸＥфф（ここで фは疎水性残基を表す）は、レセプターと転写コアクチベーターとの間の相互作 用を仲介することが提案されている。ホルモン依存性方式でＴＲに結合する、い くつかのタンパク質が同定されてきている。これらのうちで、Ｔｒｉｐｌは推定 上の酵母のコアクチベーターＳｕｇｌに関係し、また、Ｃ−末端の活性化ドメイ ンおよび基礎的転写機構のサブセットの双方と相互作用し、ＴＲに よるトランスアクチベーションにおける役割を示唆する。他のタンパク質、たと えば、ＲＩＰＩ４０、ＳＲＣ１（Ｏｎａｔｅ、Ｓ．Ａ．、ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２７０：１３５４−１３５７（１９９５））およびＴＦ−１（また、 Ｌｅｄｏｕａｒｉｍ、Ｂ．、ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１４：２０２０−２ ０３３（１９９５）を参照のこと）は、また、リガンド依存的方法においてＣ− 末端のドメインを通して他の核レセプターと相互作用する。これらのタンパク質 の結合は、本明細書において記載するＴＲリガンド、たとえば、高度に保存され たモチーフと他のタンパク質との間の相互作用を立体障害するエクステンション をもつＴＲリガンドを使用して、調節することができる。 ＴＲのＣ−末端の活性化ドメインは両親媒性らせん、Ｈ１２を形成し、このら せんはレセプターに対してゆるく横たわり、ホルモン結合空洞の一部分を形成す る。第８図に示すように、ホルモン結合空洞に向かって内方に面する疎水性残基 と、溶媒の中に延びる、高度に保存されたグルタメートを包含する、帯電した残 基と一緒に、らせんは詰め込まれる。ＴＲ ＬＢＤの活性化らせんはＰｈｅ４０ １をリガンド結合空洞に提供し、ホルモンとの直接的配位結合を可能とする、す なわち、このようなアミノ酸はリガンドと相互作用して、外側フェニルリングの 平面とファンデルワールス接触を形成する。また、Ｐｈｅ４０５はＨｉｓ３８１ と相互作用して、多分その水素結合のコンフォメーション、すなわち、好適な水 素結合の相互作用を安定化する。結合ホルモン中のＰｈｅ４０１およびＰｈｅ４ ０５の参加は、これらの残基の突然変異がホルモン結合アフィニティーを減少す る方法を説明する。さらに、これらの突然変異の活性化に対する衝撃は、双極相 互作用の水素結合相互作用の増加により、結合した構造物中のドメインの安定化 における役割から誘導され るであろう。Ｇｌｕ４０３は溶媒の中に延び、トランスアクチベーションにおけ るその重大な役割を強調する。主として疎水性の表面のバックグラウンドに対し て、規則的な残基として表面上に存在する、その観察されたコンフォメーション において、第９図に示すように、Ｇｌｕ４０３は本明細書において記載するアク チベータータンパク質との相互作用に利用可能である。他の帯電した残基、Ｇｌ ｕ４０５およびＡｓｐ４０６は、らせんがＰｈｅ４０５においてほぐれるので、 無秩序である。 ＴＲ中の２つの他の配列、τ２およびτ３は、ＤＮＡ結合ドメインをもつ融合 タンパク質として発現されるとき、転写を活性化する。ＴＲＢにおいて発見され た配列は、ＴＲ−α残基Ｈ１中のＰｒｏ１５８−Ｉｌｅ１６８（τ２）およびＨ ８およびＨ９中のＧｌｙ２９０−Ｌｅｕ３１９（τ３）に相当する。Ｃ−末端の 活性化ドメインと異なり、τ２およびτ３はラットＴＲ−αＬＢＤ中のモジュー ルの構造単位を提供するように見えず、タンパク質−タンパク質の相互作用のた めの表面を提供しない：τ３の重大なアスパラギン酸塩／グルタミン酸塩残基は ２つの別々のらせん上に位置し、単一の表面を形成しない：τ２の帯電した残基 はＬＢＤの残基とのイオン対の相互作用に携わる。したがって、τ２およびτ３ は全体のレセプターの関係において活性化ドメインとして機能しないことがある 。核レセプターＬＢＤのリガンドを設計する計算的方法 核レセプターのリガンド結合ドメインの三次元構造の解明は、本明細書におい て記載する計算的方法を使用する核レセプターに対するリガンドを設計する重要 かつ有用なアプローチを提供する。図面を検査することによって、核レセプター のリガンドはＬＢＤ中の水がアクセス不可能な結合空洞中で結合し、そして化学 的部分をリガ ンド上の選択した位置に付加できることを決定することができる。 このような化学的部分、通常エクステンションは図面中に表されている結合空洞 をより緊密な適合（またはより少ない水）のために充填することができるか、あ るいは化学的部分がＬＢＤの三次元モデルの図形の中に導入または表示される前 に、リガンドと接触しないアミノ酸との接触を崩壊するか、あるいは作るために 使用することができる。核スーパーファミリーのメンバーと相互作用するリガン ドは、どんなリガンド誘発コンフォメーション変化が起こるかに基づいて、アゴ ニスト、アンタゴニストおよび部分的アゴニストとして作用することができる。 アゴニストはレセプターの中に変化を誘発し、これらの変化はレセプターが転 写に正または負に影響を及ぼすことができるようにさせる活性コンフォメーショ ンでレセプターを配置する。レセプターのコンフォメーションにおいて、いくつ かの異なるリガンド誘発変化が存在することができる。 アンタゴニストはレセプターに結合するが、レセプターの転写調節特性または 生理学的に関係するコンフォメーションを変更するコンフォメーションの変化を 誘発することができない。アンタゴニストの結合は、また、アゴニストの結合を ブロックし、したがってアゴニストの作用をブロックすることができる。 部分的アゴニストはレセプターに結合し、アゴニストにより誘発されるレセプ ター中の変化の一部分のみを誘発する。差は定性的または定量的であることがで きる。したがって、部分的アゴニストはアゴニストにより誘発されるコンフォメ ーションの変化のあるものを誘発することができるが、他のものを誘発すること ができないか、あるいは部分的アゴニストはある種の変化を制限された程度にの み誘発することができる。リガンド誘発コンフォメーション変化 本明細書において記載したように、アンリガンデッドレセプターは不活性であ るか、多少の活性を有するか、あるいはリプレッサー活性を有するコンフォメー ションで存在する。アゴニストリガンドの結合は、レセプターがより活性になり 、遺伝子の発現を刺激または抑制するように、レセプターにおいてコンフォメー ションの変化を誘発する。レセプターは非ゲノムの作用を有することもでき、既 知の型の変化のいくつかおよび／またはこれらの結果を本明細書において列挙す る。熱ショックタンパク質の結合 多数の核レセプターについて、リガンドの結合は熱ショックタンパク質の解離 を誘発し、こうしてレセプターはほとんどの場合において二量体を形成すること ができ、その後レセプターはＤＮＡに結合し、転写を調節する。 核レセプターは通常熱ショックタンパク質の結合ドメインを有し、これらの結 合ドメインはＬＢＤに対する結合のドメインを提供し、ＬＢＤへのリガンドの結 合により調節されることができる。結局、熱ショックタンパク質の結合ドメイン とＬＢＤとの結合または接触を安定化するリガンドからの拡張した化学的部分（ またはそれより多い）は、部分的アゴニストまたはアンタゴニストを生成する本 明細書において記載する計算的方法を使用して設計することができる。典型的に は、このような拡張した化学的部分はリガンド上の分子認識ドメインを過ぎてか つそれから離れる方向に、通常リガンドの埋没結合空洞を過ぎて延びるであろう 。二量化およびヘテロ二量化 リガンドの非存在においてｈｓｐとアソシエートするレセプターでは、ｈｓｐ の解離はレセプターの二量化を生ずる。二量化はＤＢ ＤおよびＬＢＤの双方の中のレセプターのドメインのためである。 二量化の主な刺激はｈｓｐの解離であるが、レセプターにおけるリガンド誘発コ ンフォメーション変化は追加の促進的影響を有することがある。リガンドの非存 在においてｈｓｐとアソシエートしないレセプター、特にＴＲでは、リガンドの 結合は二量化／ヘテロ二量化のパターンに影響を与えることができる。影響はＤ ＮＡ結合部位の関係に依存し、また、レセプターと相互作用することがある他の タンパク質に関するプロモーターの関係に依存することがある。普通のパターン はモノマーの形成を低下させることであり、その結果ＤＮＡ上の二量体の形成よ りヘテロ二量体が優先される。 核レセプターＬＢＤは通常二量化ドメインを有し、これらの二量化ドメインは 他の核レセプターに結合する領域を提供し、そしてＬＢＤへのリガンドの結合に より調節されることができる。結局、二量化ドメインの結合または接触を崩壊す るリガンドからの拡張した化学的部分（またはそれより多い）は、部分的アゴニ ストまたはアンタゴニストを生成する本明細書において記載する計算的方法を使 用して設計することができる。典型的には、このような拡張した化学的部分はリ ガンド上の分子認識ドメインを過ぎてかつそれから離れる方向に、通常リガンド の埋没結合空洞を過ぎて延びるであろう。ＤＮＡの結合 ｈｓｐに結合する核レセプターにおいて、結果的に二量体を形成させるｈｓｐ のリガンド誘発解離は、ＤＮＡの結合を可能とし、したがって、それを促進する 。アソシエートしない（リガンドの非存在におけるように）レセプターでは、リ ガンドの結合はヘテロ二量体および二量体のＤＮＡの結合を刺激し、ＤＮＡのモ ノマーの結合を低下させる傾向がある。しかしながら、単一のハーフサイトのみ を含有するＤＮＡでは、リガンドはＤＮＡへのレセプターの結合を刺激する傾向 がある。これらの作用は適度であり、ＤＮＡ部位の特質に依存し、多分レセプタ ーと相互作用することがある他のタンパク質の存在に依存する。核レセプターは 通常ＤＮＡへの結合のための領域を提供するＤＢＤ（ＤＮＡ結合ドメイン）を有 し、そしてこの結合はＬＢＤへのリガンドの結合により調節されることができる 。結局、ＤＢＤの結合または接触を崩壊するリガンドからの拡張した化学的部分 （またはそれより多い）は、部分的アゴニストまたはアンタゴニストを生成する 本明細書において記載する計算的方法を使用して設計することができる。典型的 には、このような拡張した化学的部分はリガンド上の分子認識ドメインを過ぎて かつそれから離れる方向に、通常リガンドの埋没結合空洞を過ぎて延びるであろ う。リプレッサーの結合 リガンドの非存在においてｈｓｐとアソシエートしないレセプターは、リガン ドの非存在において転写リプレッサーとしてしばしば作用する。これは、一部分 、レセプターのＬＢＤに結合する転写リプレッサータンパク質のためであるよう に見える。アゴニストの結合はレセプターからのこれらのタンパク質の解離を誘 発する。これは転写の阻害を緩和し、レセプターの転写トランスアクチベーショ ン機能を発現させるようにする。転写トランスアクチベーション機能 リガンドは２つの基本的方法において転写トランスアクチベーション機能を誘 発する。第１はレセプターからのｈｓｐの解離による。この解離は、レセプター の二量体を生じかつ核のクロマチンの中のＤＮＡまたは他のタンパク質にそれら を結合させ、レセプターの転写調節特性を発現させる。これはレセプターのアミ ノ末端上のこ のような機能について特に真実であろう。 第２の方法は転写に関係する他のタンパク質と相互作用するレセプターを変更 することである。これらは近位のプロモーターまたは近位のプロモーターのタン パク質の因子と直接的または間接的に相互作用するタンパク質であることができ る。また、相互作用はそれら自体近位のプロモーターのタンパク質の因子と直接 的または間接的に相互作用する他の転写因子によることができる。リガンド依存 的方法においてレセプターに結合する、いくつかの異なるタンパク質が記載され てきている。さらに、ある場合において、リガンド誘発コンフォメーション変化 はレセプターへの他のタンパク質の結合に影響を与えず、転写を調節するそれら の能力に影響を与えることがある。 核レセプターまたは核レセプターＬＢＤは、通常、ＤＮＡへの結合のための領 域を提供しかつＬＢＤへのリガンドの結合により調節されることができる活性化 ドメインを有する。結局、活性化ドメインの結合または接触を崩壊するリガンド からの拡張した化学的部分（またはそれより多い）は、部分的アゴニストまたは アンタゴニストを生成する本明細書において記載する計算的方法を使用して設計 することができる。典型的には、このような拡張した化学的部分はリガンド上の 分子認識ドメインを過ぎてかつそれから離れる方向に、通常リガンドの埋没結合 空洞を過ぎて、活性化ドメインの方向に延びるであろう。これは図面に紙上に、 またはより好都合にコンピュータースクリーン上に二次元で示す三次元モデルに おいて見られるように、しばしばらせんである。リガンド誘発コンフォメーション変化 血漿タンパク質は、コンフォメーション変化を行わないで、モノマーまたはド メインの間で形成された静的結合ポケットを通してホ ルモンに結合する。たとえば、四量体の甲状腺結合血漿タンパク質トランスチレ チンは、オリゴマー界面において溶媒アクセス可能なホルモン結合チャンネルを 形成する。タンパク質の構造は、結合したリガンドをもつ埋没結合空洞の出現に 関して結合ホルモン上で未変化である。 しかしながら、核レセプターＬＢＤ、たとえば、ラットＴＲ−αＬＢＤに結合 したリガンドについての構造的役割は、レセプターが結合した状態および非結合 の状態において異なるであろうことを予測させる。ホルモンの非存在において、 レセプターは、球状タンパク質の特色を示さない、そのコアに空洞を有するであ ろう。リガンド（たとえば、ホルモン）は、核レセプターに結合した後、活性レ セプターの疎水性コアを完成する。レセプターによるリガンドの結合は動的プロ セスであり、これは変更されたコンフォメーションを誘発することによってレセ プターの機能を調節する。 ホルモン誘発コンフォメーション変化を正確に説明するために、リガンデッド （ｌｉｇａｎｄｅｄ）ＴＲおよびアンリガンデッド（ｕｎｌｉｇａｎｄｅｄ）Ｔ Ｒの構造を比較することが必要である。 アンリガンデッドヒトＲＸＲαの構造は、モデルとして、アンリガンデッドＴＲ と置換することができる。ラットＴＲ−αＬＢＤおよびヒトＲＸＲαＬＢＤは同 様なフォルドを取り、そして構造的類似性はリガンド結合後のコンフォメーショ ン変化まで拡張するようである。 ２つの構造の間の３つの主要な差が存在し、これらは事実リガンド結合の結果 であるように見える。第１に、結合したラットＴＲ−αＬＢＤの構造はいっそう コンパクトであり、ホルモンはレセプターの疎水性コア内に緊密に詰まっている 。対照的に、アンリガンデッドヒトＲＸＲαＬＢＤはいくつかの内部の疎水性空 洞を含有する 。このような空洞の存在は折りたたまれたタンパク質において異常であり、そし てレセプターのアンリガンデッド状態の反映であるようである。これらの空洞の うちの２つは９−シスレチノイン酸の可能な結合部位として提案されたが、これ らの多重部位はリガンデッドラットＴＲ−αＬＢＤにおいて観察される単一の埋 没結合空洞と部分的にオーバーラップするだけである。 第２の差はラットＴＲ−αＬＢＤにおけるＨ１１を含み、これはホルモン結合 空洞の一部分に寄与する。Ｈ１１はラットＴＲ−αＬＢＤにおいて連続的であり 、ＲＸＲ中のＣｙｓ４３２において破壊し、ｈＲＸＲαにおいてｈＨ１０とＨ１ １との間のループを形成する。この残基はＴＲ中のＨｉｓ３８１に相当し、これ はリガンドの外側リングのヒドロキシルへの水素結合を提供する。さらに、ラッ トＴＲ−αＬＢＤにおけるリガンドで占有されたホルモン結合空洞は同一ループ により中断されていて、Ｈ６およびＨ７をもつＲＸＲ中で隔離された疎水性ポケ ットを形成する。結合したラットＴＲ−αＬＢＤにおいて、対応するらせんＨ７ およびＨ８は結合ポケットと隣接し、ホルモン結合空洞を下から取り囲む。 ２つのレセプターの第３の差は、Ｃ−末端の活性化ドメインの位置である。Ｃ −末端の活性化ドメインは双方のレセプターにおいてα−らせんを形成するが、 ラットＴＲ−αＬＢＤにおけるドメインはプロリンに富んだ回転に従い、レセプ ターに対して横たわって結合空洞の一部分に寄与する。対照的に、アンリガンデ ッドｈＲＸＲαにおけるドメインは、溶媒の中に突起する、より長いらせんの一 部分である。 これらの差は、リガンドの非存在において仮定されたＴＲ ＬＢＤの別のコン フォメーションのモデルに導く。アンリガンデッドＴＲにおいて、ホルモン結合 空洞の回りを取り囲むレセプターのサブ ドメインはゆるく詰められており、結合空洞はレセプターの部分的コアを提供す る部分的に組織化されていないＨ１１により占有されている。 ホルモンを結合すると、非結合レセプター中のコイルを形成する残基はリガン ドとかみ合い、Ｈ１１を続ける。Ｈ１１のオーダーリング（ｏｒｄｅｒｉｎｇ） は疎水性空洞をアンブロックし、Ｈ７およびＨ８をホルモンと相互作用させるで あろう。次いで、拡張した疎水性空洞はホルモンの回りでつぶれ、コンパクトな 結合した構造を発生させる。 リガンドの結合の際に再充填するアンリガンデッドＴＲ中の拡張した構造に部 分的に頼るＣ−末端の活性化ドメインにおける、リガンド誘発コンフォメーショ ン変化を予測することができる。リガンド誘発コンフォメーション変化は微妙で あることがある。なぜなら、回転中のラットＴＲ−αのアミノ酸配列（３９３− ＰＴＥＬＦＰＰ−３９９）はα−らせんを形成するラットＴＲ−αのペプチド鎖 の性向を有意に減少させ、したがって体積の小さい変化で再充填を達成すること ができるからである。 リガンド誘発コンフォメーション変化が起こった後、結合した構造物中のＣ− 末端の活性化ドメインのコンフォメーションは、レセプターの非結合の形態に比 較して、充填を変化させるようである。 リガンドの結合は活性化ドメインの安定性を改良する。全体のＬＢＤについて充 填相互作用の分布により測定して、活性化ドメインは結合した構造物においてさ えゆるく充填する。活性化ドメインの充填密度（４．５Å内の原子数として定義 した）は、平均より１．５標準偏差だけ低い。比較のため、他の表面らせん、Ｈ １、は平均より０．５標準偏差だけ低く、そして構造物の最も低い程度に充填さ れた部分、残基Ｉｌｅ１９６−Ａｓｐ２０６からの不規則なコイル は、平均より２．０標準偏差だけ低い。そのうえ、結合したレセプター中のＣ− 末端のドメインの充填接触の大部分は、リガンドと相互作用する残基、たとえば 、Ｈｉｓ３８１により提供されるか、あるいはリガンドそれ自体により提供され る。これらの残基のコンフォメーションは、結合したレセプターおよび非結合の レセプターにおいて、およびエクステンションにより、これらの相互作用に頼る Ｃ−末端の活性化ドメインのコンフォメーションにおいて異なることが期待され る。結合したリガンドにより安定化されないと、Ｃ−末端の活性化ドメインはホ ルモンの結合前に無秩序化される。 リガンド誘発コンフォメーション変化の相関は、本明細書において記載するよ うに明らかである。たとえば、Ｈ１１からのＨｉｓ３８１およびＨ１２からのＰ ｈｅ４０５は結合した構造物において相互作用して、フェノールのヒドロキシル に結合した特異的水素を提供する。Ｈ１１およびＨ１２に影響を与えるリガンド 誘発変化は強化され、そしてコンパクトな、結合した状態の形成に導く。三次元モデルおよびリガンドのエクステンションを使用する計算的方法 リガンデッドＴＲレセプターの三次元構造は先例がなく、新しい核レセプター の合成リガンド、たとえば、甲状腺レセプターアンタゴニストの開発を大きく促 進するであろう。さらに、このレセプターのスーパーファミリーは、三次元構造 の解明および組合わせの化学、たとえば、欧州特許（ＥＰ）第３３５，６２８号 および米国特許第５，４６３，５６４号明細書（これらは引用することによって 本明細書の一部とされる）に開示されているものを包含する現代の方法に全体的 によく適合する。レセプターの可溶特性のために、Ｘ線結晶学を使用する構造の 決定は可能である。本発明を実施するとき、結晶学的データを使用するコンピュ ータープログラムは、これ らのレセプターに対するリガンドの合理的設計を可能とするであろう。ＲＡＳＭ ＯＬのようなプログラムを本発明の実施により発生した結晶からの原子の配位結 合とともに使用するか、あるいは三次元モデルを発生させおよび／またはリガン ドの結合に関係する構造を決定することによって本発明を実施するために使用す ることができる。ＩＮＳＩＧＨＴおよびＧＲＡＳＰのようなコンピュータープロ グラムは他の操作および新しい構造の導入を可能とする。さらに、本明細書にお いて記載しかつこの分野において知られている精製された組換えタンパク質およ び現代のリポーター遺伝子の転写アッセイを使用して、高い処理量および生物活 性のアッセイを案出して、ＣＤＬの活性を精製することができる。 一般に、核レセプターの合成リガンドを設計する計算的方法は、下記の２つの 工程からなる： １）結合したリガンドをもつ核レセプターＬＢＤを含んでなる結晶化タンパク 質の三次元モデルを使用して、リガンドの少なくとも１つの第１化学的部分と、 核レセプターＬＢＤのどのアミノ酸（少なくとも１つ）が相互作用するかを決定 し、そして ２）第１化学的部分の化学的修飾（少なくとも１つ）を選択して第２化学的部 分を生成し、第２化学的部分は、相互作用するアミノ酸と第１化学的部分との間 の相互作用に比較して、相互作用するアミノ酸と第２化学的部分との間の相互作 用を減少または増加する構造を有する。 本明細書において示すように、相互作用するアミノ酸はリガンドとの接触を形 成し、そして相互作用するアミノ酸の原子の中心はリガンドの原子の中心から通 常２〜４オングストロームだけ離れている。一般に、これらの距離は本明細書お よびＭｃＲｅｅ １９９３において議論されているようにコンピューターにより 決定されるが 、いったん三次元モデルが作られると、距離はマニュアル的に決定することがで きる。相互作用するアミノ酸の例は付録２に記載されている。また、三次元モデ ルの立体化学的図形については、Ｗａｇｎｅｒ、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７８（６５５８）：６７０−６９７（１９９５）を参照のこと。より普通には 、リガンドの原子および相互作用するアミノ酸の原子は３〜４オングストローム だけ離れている。工程１および２を反復して、ＬＢＤに対するリガンドの適合を 洗練し、よりすぐれたリガンド、たとえば、アゴニストを決定することによって 、本発明を実施することができる。図面に示すように、ＴＲの三次元モデルを二 次元で表示して、どのアミノ酸がリガンドと接触するかを決定し、化学的修飾の ためのリガンド上の位置を選択し、そして化学的修飾前のそれに比較して特定の アミノ酸との相互作用を変化させることができる。コンピューターを使用して、 マニュアル的に三次元モデルの二次元表示を使用するか、あるいはリガンドを化 学的に合成することによって、化学的修飾を行うことができる。付録２および図 面を使用して、三次元モデルを作ることができる。追加の工程として、この分野 において知られているように、結晶化タンパク質からの核レセプターＬＢＤの原 子の配位結合を使用して、三次元モデルを作るすることができる、本明細書にお いて引用したＭｃＲｅｅ １９９３を参照のこと。 また、リガンドはリガンドの化学的修飾後に遠いアミノ酸と相互作用して新し いリガンドをつくることができる。一般に、遠いアミノ酸は化学的修飾前のリガ ンドと接触しない。化学的修飾はリガンドの構造を変化させて、リガンドから通 常少なくとも４．５オングストロームだけ離れている遠いアミノ酸と相互作用す る新しいリガンドを作ることができる。しばしば遠いアミノ酸はリガンドのため の結合空洞の表面をライニングしないであろう。なぜなら、遠いア ミノ酸は結合空洞のポケットまたは表面の一部分であるためにはリガンドから離 れ過ぎているからである。 ＬＢＤアミノ酸の原子とＬＢＤリガンドの原子との間の相互作用は、実際に表 示される力または誘引により作ることができる。通常、アミノ酸およびリガンド の原子の間の相互作用は、水素結合の相互作用、電荷の相互作用、疎水性相互作 用、ファンデルワールスの相互作用または双極子の相互作用の結果であろう。疎 水性相互作用の場合において、これはそれ自体アミノ酸とリガンドとの間の相互 作用ではなく、むしろ、一部分、水または疎水性表面からの他の親水性基の反発 の通常の結果であることが認識されている。ＬＢＤとリガンドとの相互作用の減 少または増強は、この分野において知られているように、コンピューター的に、 または熱力学的または反応速度論的方法を使用して、結合エネルギーを計算また は試験することによって測定することができる。 化学的修飾はＬＢＤアミノ酸の原子とＬＢＤリガンドの原子との相互作用をし ばしば増強または減少するであろう。立体障害はＬＢＤ結合空洞と活性化ドメイ ンとの相互作用を変化させる普通の手段であろう。化学的修飾はリガンド中の好 ましくはＣ−Ｈ、Ｃ−およびＣ−ＯＨ位に導入され、ここで炭素は修飾の完結後 に同一に止まるリガンドの構造の一部分である。Ｃ−Ｈの場合において、Ｃは１ 、２または３個の水素を有することができるが、通常ただ１個の水素のみが置換 されるであろう。ＨまたはＯＨは修飾の完結後に除去され、所望の化学的部分で 置換される。 甲状腺レセプターはホルモン結合核レセプターの大きいスーパーファミリーの メンバーであるので、アゴニストおよびアンタゴニストの開発のルールはスーパ ーファミリー全体に対するリガンドの設計において有用であるとして当業者によ り認識されている。エスト ロゲンおよびアンドロゲンのレセプターの既知のアゴニストおよびアンタゴニス トの構造の検査は、第１０図に示すように作用のアゴニストのメカニズムの普遍 性を支持する。 アンリガンデッドＲＸＲの報告された構造と、他のスーパーファミリーのメン バーのアミノ酸配列との比較に基づくレセプターの全体のフォルディングは、ス ーパーファミリーのレセプターの全体のフォルディングが類似することを明らか にする。したがって、その構造から、アゴニストまたはアンタゴニストのリガン ドの回りに核レセプターのフォルディングの一般的パターンが存在することが予 測される。 結合したリガンドをもつ核レセプターの三次元構造は、核レセプターがアゴニ ストのリガンドの回りにフォルドするという明らかでない観測に導く。なぜなら 、結合空洞はアゴニスト、特にアゴニストの分子認識ドメインと適合し、そして アンタゴニストは通常リガンド、特にアゴニストを越えて延びる化学的構造を有 し、そしてこれらの化学的構造は埋没結合空洞または同一作用を有する他の基を 形成するリガンドの回りのレセプターのフォルディングを禁止するであろうから である。このエクステンションの位置は、構造により示される種々の方法におい てフォルディングに影響を与えることがある。アンタゴニスト上のこのようなエ クステンションは、種々のレセプターについて、対応するアゴニストと比較して 、第１０図に示されている。 たとえば、カルボキシ末端の活性化らせんに向かうエクステンションは、レセ プター本体の中へのこのらせんのパッキング／フォルディングに影響を与える。 これは引き続いてレセプターの他のタンパク質または他の部分と相互作用する核 レセプターのこの部分の能力に影響を与えることができ、この能力は線状レセプ ターの反対の 末端上の、またはカルボキシ末端のトランスアクチベーションドメイン（らせん １２を包含する）と直接的または間接的に相互作用することができるレセプター のアミノ末端上の、転写トランスアクチベーション機能を包含する。この方向に おけるエクステンションは、また、レセプター本体の中へのＴＲのらせん１１（ または核レセプター中のその類似のらせん）のパッキングに影響を与え、そして レセプターの二量化またはヘテロ二量化に選択的に影響を与えることができる。 らせん１に向かうエクステンションはレセプターのＤＮＡ結合ドメインおよびヒ ンジ領域とリガンド結合ドメインとの関係に影響を与え、そしてＤＮＡへのレセ プターのレセプターおよび／またはレセプターとレセプターのこの領域と相互作 用するタンパク質との相互作用に選択的またはさらに影響を与えることができる 。らせん１１に向かう他のエクステンションを作って、このらせんおよびらせん １および１０のパッキングに影響を与え、これにより二量化に影響を与えること ができる。本明細書において記載する計算的方法を使用して、このような化学的 修飾を評価することができる。また、ある場合において、そうでなければリガン ドの回りに完全にまたは不完全にフォルドされるレセプターを通して、エクステ ンションは突起することが可能である。このような突起するエクステンションは 、コアクチベーターまたは他のタンパク質との相互作用を立体的にブロックする ことができる。 結合空洞の中に埋没したリガンドをもつ三次元構造は、ヒンジおよび蓋を含有 し、１またはそれ以上の構造的因子から構成され、リガンドを収容しかつ取り囲 むように動く結合空洞を有する核レセプターの簡単な説明を直ちに提供する。Ｔ Ｒに対するリガンドは特定の部位において特定のクラスの化学的基で修飾するこ とができ、このような化学的基は蓋およびヒンジを開いた、部分的に開いた、ま たは閉じた状態にして、部分的アゴニストまたはアンタゴニストの機能を達成す る働きするであろう。これらの状態において、ＴＲの生物学的応答は異なり、そ れゆえ、所望の作用をもつ特定の化合物を設計するためにその構造を使用するこ とができる。 ＴＲ−Ｔ₃複合体の三次元構造の知識は、アゴニストおよびアンタゴニストの 設計のための一般的モデルに導く。構造のデータの重要かつ新規な特徴は、Ｔ₃ リガンドが製造の中央のコア内に完全に埋没されているという事実である。核レ セプターのスーパーファミリーに属する他のリガンド−レセプター複合体は同様 に埋没したリガンド結合部位を有し、したがって、このモデルはスーパーファミ リー全体のアゴニスト／アンタゴニストの設計のために有用であろう。 アンタゴニストの設計を望むとき、天然のホルモンのアゴニストの重要な結合 接触を保存すると同時にリガンド−レセプター複合体の正常の操作を妨害する「 エクステンション基」を組込むことが必要であるか、あるいはレセプターのドメ インとのエクステンションの相互作用を通して要求される結合のアフィニティー を発生させることが必要である。 アンタゴニストの設計に適用されかつ本明細書において記載するモデルを「エ クステンションモデル」と呼ぶ。核レセプターのためのアンタゴニスト化合物は 、レセプターへの高いアフィニティーの結合を促進する同一または類似する基を 含有すべきであり、そしてさらに、このような化合物は大きくおよび／または極 性であることができる側鎖を含有すべきである。この側鎖は実際のエクステンシ ョンであり、それに嵩を与えるか、あるいはそれはアゴニストのリガンドと異な る電荷の機能をもつ側基であることができる。たとえば、コリゾル（ｃｏｒｒｉ ｓｏｌ）の２１位におけるＣＨ₃のＣＨ₂ ＯＨとの置換、および１１位におけるＯＨ基からケト基への変更は、グルココ ルチコイドのアンタゴニスト活性を発生させる（Ｒｏｂｓｓｅａｕ、Ｇ．Ｇ．ｅ ｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６７：９９−１１５（１９７２）。しかし ながら、ほとんどの場合において、有効なアンタゴニストはいっそう嵩高のエク ステンションを有する。したがって、アンチグルココルチコイド（およびアンチ プロゲスチン）ＲＵ４８６は、１１位に嵩高の側基を含有する（Ｈｏｒｗｉｔｚ 、Ｋ． Ｂ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ． １３：１４６−１６３（１９９２ ））。次いでアンタゴニスト化合物は合理的に高いアフィニティー（１００ｎＭ ）でレセプターの埋没リガンド結合部位内に結合するが、エクステンションの機 能は転写因子の機能に要求される必要なコンフォメーションをレセプター−リガ ンド複合体が取るのを妨害するであろう。拮抗作用（これはアゴニストまたはア ンタゴニストにおいてであることができる）は多数の方法において分子レベルで それ自体発現することがあり、このような方法はＨＲＥにおけるレセプターのホ モ／ヘテロ二量体の形成の妨害、レセプターのモノマー、ホモ二量体またはホモ ／ヘテロ二量体へのコアクチベーターの結合の妨害、またはそうでなければＨＲ Ｅへのリガンド誘発作用により仲介されるホルモン応答性遺伝子の転写の妨害を 包含する。それらのアンタゴニスト機能をエクステンションの仮説で説明できる 、核レセプターについてのいくつかのアンタゴニスト化合物が先行技術において 存在する（また、Ｈｏｒｗｉｔｚ、Ｋ．Ｂ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．１ ３：１４６−１６３（１９９２）、Ｒａｕｎｎａｕｄ、Ｊ．Ｐ．、ｅｔ ａｌ． 、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５：８１１−８３３（１９８６） 、Ｋｅｉｅｌ）Ｓ．、ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １４：２ ８７−２９８（１９９４）を参照のこと）。これ らの化合物はそれらのアゴニストの相手と一緒に第１０図に示されている。これ らのアンタゴニストの各々は、アゴニストまたはアゴニスト類似体のコア構造に 結合した、大きいエクステンション基を含有する。重要なことには、これらのア ンタゴニスト化合物は偶然に発見され、そして構造−機能の仮説、たとえば、エ クステンションの原理を使用して設計されなかった。 エクステンションの仮説を使用する甲状腺アンタゴニストを設計する１つの方 法は、教示の例として下記に提供されている。ＴＲ−αＤｉｍｉｔ複合体の三次 元構造を、先行技術、特に本明細書において引用された先行技術において発表さ れた構造−活性データと組み合わせて使用して、高いアフィニティーのリガンド の結合について最も重要である、下記のリガンド−レセプターの相互作用を確立 することができる。これらの相互作用の物理的図形を第６図に示す。この図形は リガンドの結合についての隔離された必須の接触を記載する。リガンドはレセプ ターの中心に埋没されているので、これらの隔離された相互作用の間の構造的間 隔もまた重要である。したがって、この系についての我々の現在の知識は、この 例について、レセプターについて新しく設計されたリガンドがサイロニンの構造 的骨格、または１原子のスペーサーにより結合された２つの置換アリール基を含 有しなくてはならないことを示す。 エクステンションの仮説により設計されたアンタゴニストの一般的構造は、Ｔ Ｒアンタゴニストの置換基の下記の一般的記載において例示される（式１を参照 する）：Ｒ１はアニオン基、たとえば、カルボキシレート、ホスホネート、ホス フェート、サルフェートまたはサルファイトを有することができ、そして０〜３ 原子のリンカーをもち、１または２以上のＣ、Ｏ、Ｎ、Ｓ原子を含んでなり、好 ましくは２炭素のリンカーをもつ環に接続されている。このような Ｒ１は必要に応じてアミン（たとえば、−ＮＨ₂）で置換されることができる。 Ｒ３およびＲ５は小さい疎水性基、たとえば、−Ｂｒ、−Ｉまたは−ＣＨ₃であ る。Ｒ３およびＲ５は同一置換基であるか、あるいは異なることができる。Ｒ₃ ’はＲ３およびＲ５の基より大きいことができる疎水性基、たとえば、−Ｉ、− ＣＨ₃、−イソプロピル、−フェニル、−ベンジル、５および６環のヘテロサイ クルであることができる、Ｒ₄’はドナーまたはアクセプターとして水素結合に 参加することができる基である。このような基は−ＯＨ、−ＮＨ₂、および−Ｓ Ｈ含める。Ｒ₅’はこの化合物をアンタゴニストとする重要なエクステンション 基である。Ｒ₅’は長いアルキル（たとえば、１〜９炭素の、直鎖状もしくは分 枝鎖状の）、アリール（ベンジル、フェニルおよび置換ベンジルおよび置換フェ ニル環（たとえば、ハロゲン、アルキル（１および５炭素）および必要に応じて この環に−ＣＨ₂−により接続されている）、ヘテロサイクル（たとえば、５も しくは６原子の、好ましくは５炭素および１窒素、または５炭素）であることが でき、これは必要に応じて極性（たとえば、−ＯＨ、−ＮＨ₂、および−ＳＨ） 、カチオン性（たとえば、−ＮＨ₃、Ｎ（ＣＨ）₃）、またはアニオン性（カルボ キシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェート）基を包含するこ とができる。Ｒ₅’は、また、極性（たとえば、−ＯＨ、−ＮＨ₂、および−ＳＨ ）、カチオン性（たとえば、−ＮＨ₃、Ｎ（ＣＨ₃）₃）、およびアニオン性（カ ルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェート）基であるこ とができる。Ｘは２つの芳香族環を適当に位置決めするスペーサー基である。こ の基は通常１原子のスペーサー、たとえば、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ₂、ＮＨ、ＮＺ （ここでＺはアルキルである）、ＣＨ₂、ＣＨＯＨ、ＣＯ、Ｃ（ＣＨ₃）ＯＨ、お よびＣ（ＣＨ₃）（ＣＨ₃）で ある。Ｒ２、Ｒ６、Ｒ２’およびＲ６’は−Ｆ、および−Ｃｌであることができ 、好ましくはＨである。 ＴＲリガンドは、また、置換Ｒ５’およびＲ３’基をもつ置換フェニル化２， ５ジヨードチロシンとして記載することができる。Ｒ５’は長鎖アルキル（たと えば、４〜９炭素の、直鎖状もしくは分枝鎖状の）、アリール（ベンジル、フェ ニルおよび置換ベンジルおよび置換フェニル環（たとえば、ハロゲン、アルキル （１および５炭素）および必要に応じてこの環に−ＣＨ₂−により接続されてい る）、ヘテロサイクル（たとえば、５もしくは６原子の、好ましくは５炭素およ び１窒素、または５炭素）であることができ、これは必要に応じて極性（たとえ ば、−ＯＨ、−ＮＨ₂、および−ＳＨ）、カチオン性（たとえば、−ＮＨ₃、Ｎ（ ＣＨ）₃）、またはアニオン性（カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェー トまたはサルフェート）基を包含するすることができる。Ｒ₅’は、また、極性 （たとえば、−ＯＨ、−ＮＨ₂、および−ＳＨ）、カチオン性（たとえば、−Ｎ Ｈ₃、Ｎ（ＣＨ）₃）、およびアニオン性（カルボキシレート、ホスホネート、ホ スフェートまたはサルフェート）基であることができる。Ｒ３’は−イソプロピ ル、ハロゲン、−ＣＨ₃、アルキル（１〜６炭素）またはアリール（ベンジル、 フェニルおよび置換ベンジルおよび置換フェニル環（たとえば、ハロゲン、アル キル（１および５炭素）および必要に応じてこの環に−ＣＨ₂−により接続され ている）、ヘテロサイクル（たとえば、５もしくは６原子の、好ましくは５炭素 および１窒素、または５炭素）であることができ、これは必要に応じて極性（た とえば、−ＯＨ、−ＮＨ₂、および−ＳＨ）、カチオン性（たとえば、−ＮＨ₃、 Ｎ（ＣＨ）₃）、またはアニオン性（カルボキシレート、ホスホネート、ホスフ ェートまたはサルフェート）基を包含するすることができる 。 ＴＲアンタゴニストは、また、修飾されたＴ₃アゴニスト（ジフェニル構造を 有する）であることができ、ここでＲ₅’はアルキル、アリール、５もしくは６ 員のヘテロサイクル芳香族、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アリールアルキ ル、ヘテロアリールアルキル、ポリ芳香族、ポリヘテロ芳香族、極性または帯電 した基であり、ここで前記Ｒ₅’は極性または帯電した基で置換されることがで きる。Ｒ５’基は本明細書において記載するように定義される。 これらの方法を使用すると、この例のリガンドは好ましくは下記濃特性を有す る： １．これらの化合物は高いアフィニティー（たとえば、１００ｎＭ）でＴＲに 結合すべきである。 ２．これらの化合物は天然のホルモンと同一の基本的向きでレセプターに結合 すべきである。 ３．エクステンション基Ｒ５’はレセプターの活性化らせん（Ｃ−末端のらせ ん）に向かって突起すべきである。 ４．適当な置換基Ｒ５’は転写を仲介するために必要なその最適な局所的構造 から活性化らせんを混乱させるべきである。 アンタゴニストは、また、いずれの時においてもフォルディングの２以上の面 をブロックするために多重エクステンションを使用して設計することができる。 ＴＲリガンド（たとえば、超アゴニスト）は、リガンドの分子認識ドメイン上 の少なくとも１つの化学的部分と少なくとも１つのアミノ酸との相互作用を増強 するように設計（および合成）することができる。１つの方法は、Ｔ₃のカルボ キシレート（Ｒ１位）をホスホネート、ホスフェート、サルフェートまたはサル ファイトで置換することによって、電荷および極性の相互作用を増強することで ある。これはＡｒｇ２６２、Ａｒｇ２６６およびＡｒｇ２２８との相互作用を増 強する。Ｄｉｍｉｔが結合するとき（Ｒ１について言及する）水が占有する空間 をＲ１基の大きさの増加により充填することによって、リガンドの分子認識ドメ イン上の少なくとも１つの化学的部分と少なくとも１つのアミノ酸との相互作用 を増強することもできる。好ましくは、この基は結合空洞に対して補足的電荷お よび疎水性を有する。 リガンドの分子認識ドメイン上の少なくとも１つの化学的部分と少なくとも１ つのアミノ酸との相互作用を改良する他の方法は、溶液中のサイロニンリガンド の２つのフェニル環の間の二平面から成る角度のコンフォメーションを制限する ことである。溶液中で、二平面から成る角度が９０°である場合、２つのフェニ ル環の平面は直交する。ＴＲ Ｄｉｍｉｔ構造において、二平面から成る角度は ６０°に近い。２つのフェニル環の間の角度を固定するＴＲリガンドの設計は、 より緊密な結合に導くであろう。このようなリガンドは、サイロニンまたは置換 サイロニン様ジフェニルのＲ６’またはＲ５位を接続することによって、作るこ とができる。環状接続の大きさは２つのフェニル環の間の角度を固定することが できる。式１について詳しく言及すると、下記の環の修飾が好ましい：１）Ｒ₅ をＲ₆’に接続し、２）Ｒ₃をＲ₂’に接続するか、あるいは３）Ｒ₅をＲ₆’に接 続しかつＲ₃をＲ₂’に接続する。１〜６個の原子、好ましくは２〜４個の炭素原 子または他の原子を有するアルキルまたはヘテロアルキルにより、接続を作るこ とができる。ヘテロアルキル鎖の任意の位置はＮ、Ｏ、ＰまたはＳであることが できる。前記ヘテロアルキル鎖に沿ったＳおよびＰヘテロ原子は、それらの可能 な任意の酸化状態である。アルキルまたはヘテロアルキル鎖に沿ったＮヘテロ原 子または任意の炭素は、１または２以上のＺ置 換基を有することができ、ここでＺはアルキル、ヘテロアルキル、アリール、ヘ テロアリール、５もしくは６員のヘテロサイクル芳香族である。これらの化合物 は特許請求することができるが、ただし式１はこの出願の提出日における先行技 術の化合物を包含しない。 また、架橋酸素の区域におけるＴＲリガンドとＬＢＤとの間の未充填空間を充 填する化学的修飾を選択することによって、リガンドの分子認識ドメイン上の少 なくとも１つの化学的部分と少なくとも１つのアミノ酸との相互作用を増強させ ることができる（たとえば、Ｔ３、ｔｒｉａｃまたはＤｉｍｉｔにおいて）。し たがって、エーテル酸素を置換する、より軽い、より大きい部分は結合を増強す ることができる。このようなリンカーはモノ−またはｇｅｍ−二置換炭素基であ ることができる。酸素とほぼ同一の大きさであるが、より大きい疎水性をもつ基 、ならびに小さい、疎水性基は、二置換炭素について好ましい。サイロニンホルモンレセプターについてのＴＲ−αおよびＴＲ−βの選択性 本明細書において記載する方法を使用して、ベータＴＲよりもアルファに選択 的に結合するリガンドを設計することができる。ラットＴＲ−αＬＢＤのＸ線結 晶学的構造は、このような設計の洞察を提供する。 三次元構造はリガンド結合空洞におけるＴＲ−αとＴＲ−βとの間の主要な差 がＴＲ−αにおいてアミノ酸Ｓｅｒ２７７（側基−ＣＨ₂ＯＨをもつ）にあるこ とを明らかにし、そしてその対応する残基はヒトＴＲ−βにおいて３３１、アス パラギン（側基−ＣＨ₂ＣＯＮＨ₂をもつ）である。ヒトＴＲ−β中の側鎖はより 大きく、帯電しており、異なる水素結合ポテンシャルを有し、これによりこの差 を区別する化合物の合成が可能である。 たとえば、ＴＲαとｔｒｉａｃとの複合体において、Ｓｅｒ２７７はリガンド の結合に参加しない。Ｓｅｒ２７７（ベータにおいてＡｓｎ３３１）についての 役割の非存在は、アルファおよびベータイソ型に対するｔｒｉａｃの等しいアフ ィニティーと一致し、アルファ／ベータ選択性がＳｅｒ２７７のＡｓｎ３３１へ のアミノ酸の置換およびＡｒｇ２２８との相互作用にあるという論点を支持する 。 リガンドの設計により、これらの差はβ−選択的リガンドについて、下記の差 のいくつかまたはすべてを利用すべきであることを意味する： １．より大きい側鎖アスパラギンの存在。 ２．強い水素結合アクセプターを提供する側鎖上のカルボニル基の能力。 ３．２つの水素結合ドナーを提供する側鎖上のアミド基の能力。 ４．Ｔ３ポケットの中に捕捉された水を認識する極性の調節。 薬学的設計により、これらの差はα−選択的リガンドについて、下記の差のい くつかまたはすべてを利用すべきであることを意味する： １．より小さい側鎖の存在。 ２．弱い水素結合ドナーを提供する−ＣＨ₂ＯＨ側基上のヒドロキシル側鎖上 のカルボニル基の能力。 ３．Ｔ３ポケットの中に捕捉された水を認識する極性の調節。 双方の場合において、これらの差を多数の方法において利用することができる 。たとえば、新規な有機分子、たとえば、Ｂｉｏｓｙｍ−ＭＳＩからのＬＵＤＩ の構築のためのソフトウェアセットとともに、それらの差を使用することもでき る。治療方法 式Ｉの化合物は医学的治療において有用であり、下記の試験において証明する ことができる生物学的活性を示す： （ｉ） ミトコンドリアα−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ Ｈ：ＥＣｌ．１．９９．５）の誘導。このアッセイは特に有用である。なぜなら 、ある種、例えば、ラットにおいて、それは応答性組織、たとえば、肝臓、腎臓 および心臓において密接に関係する方法で甲状腺ホルモンおよび甲状腺類似性物 質により特異的に誘導されるからである（Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄｃ，．Ｗ．Ｗ ．、Ｒｉｃｈｅｒｔ、Ｄ．Ａ．およびＲｕｅｇａｍｅｒ、Ｗ．Ｒ．、Ｅｎｄｏｃ ｒｉｎｏｌｏｇｙ、 １９６５、７７、８０２）。このアッセイは化合物の甲状 腺ホルモン様作用のラットにおける直接的測定を可能とし、特に心臓に対する直 接的甲状腺ホルモン様作用の測定を可能とする； （ｉｉ） 全身体酸素消費の増加により測定した、基礎代謝速度の増加（たと えば、Ｂａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６ ：５４５−５６２（１９６０）を参照のこと）； （ｉｉｉ） 前もって甲状腺類似性物質を投与された動物から単離した心房の 拍動速度の刺激（たとえば、Ｓｔｅｐｈａｎ ｅｔａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐ ｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９２）１３：１９６９−１９７４；Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：６９５−７０７（１９９５）を 参照のこと）； （ｉｖ） コレステロールオキシダーゼキットを使用して測定した、合計の血 漿コレステロールレベルの変化（たとえば、ｔｈｅＭｅｒｃｋ ＣＨＯＤヨウ素 比色キット。また、Ｓｔｅｐｈａｎｅｔ ａｌ．（１９９２）を参照のこと）。 （ｖ） 超遠心により分離されたリポタンパク質画分中のＬＤＬ（低密度リポ タンパク質）およびＨＤＬ（高密度リポタンパク質）コレステロールの測定；お よびｐ（ｖｉ）酵素的色試験、たとえば、Ｍｅｒｃｋ Ｓｙｓｔｅｍ ＧＰＯ− ＰＡＰ法を使用して測定した、合計の血漿トリグリセリドのレベルの変化。 式Ｉの化合物は、これらの試験において選択的甲状腺類似活性を示すことを見 出すことができる。 （ａ） 心臓ＧＰＤＨレベルを有意に変更しない投与量において被験動物の代 謝速度を増加させ、そして肝臓ＧＰＤＨレベルを上昇させることによる。 （ｂ） 心臓ＧＰＤＨレベルを有意に変更しない投与量において血漿コレステ ロールおよびトリグリセリドのレベル、およびＬＤＬ／ＨＤＬコレステロールの 比を低下させることによる。 したがって、治療において、ある組織における甲状腺ホルモンの作用を選択的 に模擬すると同時に、心臓に対する直接的甲状腺類似作用をほとんどまたはまっ たくもたない化合物により軽減することができる症状の治療において、式Ｉの化 合物を使用することができる。たとえば、心臓ＧＰＤＨレベルを有意に変更しな い投与量において肝臓ＧＰＤＨレベルおよび代謝速度を上昇させる式Ｉの化合物 は、肥満症の治療において適用される。 式１のアゴニストは、心臓ＧＰＤＨレベルを有意に変更しない投与量において 合計の血漿コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール／ＨＤＬ−コレステロール の比およびトリグリセリドのレベルを低下させ、一般的抗高脂血症（抗高リポタ ンパク質血症）剤として使用するために、すなわち、血漿脂質（コレステロール およびトリグリセリド）レベルが増加した患者の治療において適用される。さら に、血漿コレステロールおよびトリグリセリドに対するこの作用に かんがみて、それらは特異的抗高コレステロール血症剤および抗高トリグリセリ ド血症剤として使用するために適用される。 血漿脂質レベルが高い患者は、血漿コレステロールおよび／またはトリグリセ リドの濃度が高い結果、冠状心臓疾患またはアテローム性動脈硬化症の他の発現 を発生させる危険にあると考えられる。 さらに、ＬＤＬ−コレステロールはアテローム性動脈硬化症を誘発するリポタン パク質であると考えられ、そしてＨＤＬ−コレステロールはコレステロールを血 管壁から肝臓に輸送し、アテローム性動脈硬化症のプラークの蓄積を防止すると 考えられるので、ＬＤＬ−コレステロール／ＨＤＬ−コレステロールの比を低下 させる抗高脂血症剤は、抗アテローム性動脈硬化症剤として適用される（米国特 許第４，８２６，８７６号および米国特許第５，４６６，８６１号明細書は引用 することによって本明細書の一部とされる）。 本発明は、また、治療を必要とする動物に、選択的甲状腺類似活性を生成する ために有効量の式Ｉの化合物またはその薬学上許容される塩を投与することから なる、心臓を除外するある組織において選択的甲状腺類似活性を生成する方法を 提供する。 本発明は、また、本発明の化合物またはその薬学上許容される塩を適当に投与 することによって、血漿脂質のレベルを低下する方法およびＬＤＬ−コレステロ ール／ＨＤＬ−コレステロールの比を低下する方法に関する。 さらに、式Ｉの化合物は、心臓機能が弱化した患者において甲状腺ホルモンの 置換する治療において適用することができる。 治療的使用において、本発明の化合物は通常標準的医薬組成物の形態で投与さ れる。 したがって、本発明は、他の面において、式Ｉの化合物またはその薬学上許容 される塩と、薬学上許容される担体とを含んでなる医 薬組成物を提供する。このような組成物は、経口、非経口または経直腸投与に適 当な組成物を包含する。医薬組成物 経口的に投与したとき活性である式Ｉの化合物およびそれらの薬学上許容され る塩は、液体、たとえば、シロップ剤、懸濁液または乳濁液、錠剤、カプセル剤 およびロゼンジとして処方することができる。 液状組成物は、一般に、１または２以上の適当な液状担体、たとえば、エタノ ール、グリセリン、ソルビトール、非水性溶媒、たとえば、ポリエチレングリコ ール、油または水中の化合物または薬学上許容される塩の懸濁液または溶液から 成り、懸濁剤、保存剤、界面活性剤、湿潤剤、香味剤または着色剤を含むであろ う。また、液状処方物を再構成粉末から調製することができる。 たとえば、活性化合物、懸濁剤、スクロースおよび甘味剤を含有する粉末を水 で再構成して懸濁液を形成することができ、そしてシロップ剤は活性成分、懸濁 剤、スクロースおよび甘味剤を含有する粉末から調製することができる。 錠剤の形態の組成物は、固体状組成物を調製するために日常的に使用されてい る１または２以上の任意の薬学上許容される担体を使用して調製することができ る。このような担体の例は、ステアリン酸マグネシウム、澱粉、ラクトース、ス クロース、微結晶質セルロースおよび結合剤、たとえば、ポリビニルピロリドン を包含する。 また、錠剤は着色薄膜コーティングを有するか、あるいは１または２以上の担体 の一部分として着色剤を含有することができる。さらに、活性化合物を親水性ま たは疎水性マトリックスを含んでなる錠剤として調節放出性投与形態で処方する ことができる。 カプセルの形態の組成物は、日常的カプセル化法を使用して、た とえば、活性化合物および賦形剤を硬質ゼラチンカプセルの中に入れることによ って製造することができる。また、活性化合物および高分子量ポリエチレングリ コールの半固体状マトリックスを製造し、硬質ゼラチンカプセルの中に充填する ことができるか、あるいはポリエチレングリコール中の活性化合物の溶液または 食用油、たとえば、液状パラフィンまたは精留ヤシ油中の懸濁液を製造し、軟質 ゼラチンカプセルの中に充填することができる。非経口的に投与したとき活性で ある式Ｉの化合物およびそれらの薬学上許容される塩を、筋肉内または静脈内投 与のために処方することができる。 筋肉内投与のために典型的な組成物は、油、たとえば、落花生油またはゴマ油 中の活性成分の懸濁液または溶液から成るであろう。 静脈内投与のために典型的な組成物は、たとえば、活性成分、デキストロース、 塩化ナトリウム、補助溶媒、たとえば、ポリエチレングリコールおよび、必要に 応じて、キレート剤、たとえば、エチレンジアミン四酢酸および酸化防止剤、た とえば、メタ重亜硫酸ナトリウムを含有する無菌の等張水溶液から成るであろう 。また、この溶液を凍結乾燥し、次いで投与直前に適当な溶媒で再構成すること ができる。 経直腸投与したとき活性である構造（１）の化合物およびそれらの薬学上許容 される塩は、坐剤として処方することができる。典型的な坐剤処方物は、一般に 、活性成分および結合剤および／または滑剤、たとえば、ゼラチンまたはカカオ バターまたは他の低融点の植物油または合成ワックスまたは脂肪から成るであろ う。 局所的に投与したとき活性である式Ｉの化合物およびそれらの薬学上許容され る塩は、経皮用組成物として処方することができる。 このような組成物は、たとえば、裏装、活性化合物の溜、コントロール膜、ライ ナーおよび接圧接着剤を含む。 式Ｉの化合物の典型的な１日量は、個々の要求、治療すべき症状および投与の ルートに従い変化する。適当な投与量は、一般に０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇの 受容体の体重／日の範囲である。 この一般的投与量範囲内で、式Ｉの化合物が、心臓にほとんどまたはまったく 直接的に作用しないで、血漿コレステロールのレベルを低下させかつ代謝ラット を上昇させる投与量を選択することができる。一般に、しかち非限定的に、この ような投与量は０．５〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。 さらに、この一般的投与量範囲内で、式Ｉの化合物が、代謝ラットを上昇させ ないで、血漿コレステロールのレベルを低下させかつ心臓にほとんどまたはまっ たく直接的に作用しない投与量を選択することができる。一般に、しかち非限定 的に、このような投与量は０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。 前述の２サブ範囲は相互に排除されないこと、および特定の投与量において直 面する特定の活性は使用する式Ｉの化合物の特質に依存するであろうことを理解 すべきである。 好ましくは、式Ｉの化合物は単位投与形態、たとえば、錠剤またはカプセル剤 であるので、患者は単一の投与量を自己投与することができる。一般に、単位投 与量は０．０５〜１００ｍｇの範囲の式Ｉの化合物を含有する。好ましい単位投 与量は０．０５〜１０ｍｇの式Ｉの化合物を含有する。 活性成分は１日１〜６回投与することができる。したがって、１日量は一般に ０．０５〜６００ｍｇ／日の範囲である。 好ましくは、１日量は０．０５〜１００ｍｇ／日の範囲である。 最も好ましくは、０．０５〜５ｍｇ／日である。 実施例 実施例１−ＴＲリガンドの合成 多数のＴＲリガンドはこの分野において知られており、Ｔ４（サイロキシン） 、Ｔ３、Ｔ２およびＴＳ−９を包含する。Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ、 ｉｎ６ Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄＰｅｐｔｉｄｅｓ，Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ ｓ １０７−２０４（Ｃｈｏｈ Ｈａｏ Ｌｉ編、１９７８） （引用すること によって本明細書の一部とされる）を参照のこと。 いくつかのＴＲリガンドの合成を後述する。ＴＳ１、ＴＳ２、ＴＳ３、ＴＳ４、ＴＳ５の合成 ＴＳ１、ＴＳ２、ＴＳ３、ＴＳ４およびＴＳ５およびそれらの類似体のすべて は、Ｔ３（３，５，３’−トリヨード−Ｌ−サイロニン）、Ｔ４（サイロキシン ）および３，５−ジヨードサイロニンを包含する任意のサイロニン類似体の窒素 原子の簡単なアシル化により製造することができる。ＴＳ１およびＴＳ２は、Ｔ ３を、それぞれ、Ｐｈ₂ＣＨＣＯ₂ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−２， ２−ジフェニルアセテート）およびＣ₁₆Ｈ₃₃ＣＯ₂ＮＨＳと反応させることによ って合成される。ＴＳ３はＴ３をＦＭＯＣ−Ｃｌ（フルオレニルメチルオキシカ ルボニルクロライド）と反応させることによって合成される。ＴＳ４はＴ３をｔ ＢＯＣ₂Ｏ（ｔＢＯ無水物またはジ−ｔ−ブチルジカーボネート）と反応させる ことによって合成される。ＴＳ５は、Ｒ¹ ₃位に−Ｉの代わりに−Ｈを有すること によってＴＳ１−４と異なり、３，５−ジヨードサイロニンをｔＢＯＣ₂Ｏと反 応させることによって合成される。ＴＳ１、ＴＳ２、ＴＳ３、ＴＳ４およびＴＳ ５についての一般的反応スキームは第１１図に描写されている。この反応スキー ムにおいて、ＴＳ５およびその前駆体の双方はＲ¹ ₃位にヨウ素の代わりに水素を 有すること に注意すべきである。ＴＳ６およびＴＳ７の合成 ＴＳ６はＴＳ５をパラニトロフェニルイソシアネートと反応させることによっ て合成される。ＴＳ７はＴＳ６をＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）（これはｔＢＯＣ 基を切り放す）と反応させることによって合成される。これらの反応は、当業者 の誰によっても実施できる簡単な有機合成反応である。ＴＳ６およびＴＳ７の合 成スキームは第１２図に要約されている。ＴＳ８の合成 ＴＳ８はトリエチルアミンおよび任意のアミド形成縮合試薬、たとえば、ＴＢ ＴＵ（ヒドロキシベンズトリアゾレウロニウムテトラフルオロボレート）または ＨＢＴＵ（ヒドロキシベンズトリアゾレウロニウムヘキサフルオロホスフェート ）の存在において、ＴＳ５およびＰｈ₂ＣＨＮＨ₂（ジフェニルメチルアミン）と 反応させることによって合成される。ＴＳ８の合成スキームは第１３図に描写さ れている。３，５−ジヨード−３’イソプロピルサイロニン誘導体の合成 アンタゴニストのあるクラスを設計するために、３’位における疎水性基なら びに５’位におけるエクステンションを有することが重要である。３’位におけ る好ましい疎水性基は、メチル、ベンジル、フェニル、ヨード、およびヘテロサ イクルの構造を包含する。 ３，５−ジヨード−３’−イソプロピル−５’−置換サイロニンの合成を後述す る。提供される実施例にＴＳ１０化合物を合成する特定の工程を記載するが、当 業者はこの一般的反応スキームを使用して、５’位にエクステンションを有する ことによって特性決定される３，５−ジヨード−３’−イソプロピル−５’−置 換サイロニン誘導体を合成することができる。既知の有機合成技術を使用して、 このクラスの追加の化合物を合成することができる。 ＴＳ１０の合成を後述し、第１４図に描写する。ＴＳ１０の反応スキームにお いて使用する数字は、各工程についての反応生成物を示し、括弧内に記載されて いる。 ２−ホルミル−６−イソプロピルアニソール（１）： ２−ホルミル−６−イ ソプロピルアニソール（１０．０ｇ、６１ｍｍｏｌ）［Ｃａｒｓｉｒａｇｈｉ、 ｅｔ ａｌ．ＪＣＳ Ｐｅｒｋｉｎ Ｉ、１８６２（１９８０）（引用すること によって本明細書の一部とされる）により製造された］を、丸底フラスコ内の５ ０ｍｌのＴＨＦおよび５０ｍｌのＤＭＦ中の水素化ナトリウム（３．７ｇ、１５ ３ｍｍｏｌ）の懸濁液に滴下する。この添加は発熱反応を発生させ、灰色固体状 物を形成させる。次いでヨウ化メチル（２６．０ｇ、１８３ｍｍｏｌ）を滴下し 、反応混合物を室温において５時間撹拌する。反応混合物を２０ｍｌの水で急冷 し、次いで５００ｍｌの水中に注ぎ、エーテル（２×３００ｍｌ）で抽出する。 エーテル層を一緒にし、水（５×１０００ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで 乾燥し、真空濃縮すると、１０．２ｇ（９４％）の標題化合物が得られ、これは 下記の¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）特性を有する：ｄ１０．３０（ｓ、１Ｈ）、７ ．６３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３Ｈｚ）、７．５０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３Ｈｚ）、７．１ ３（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝３Ｈｚ）、３．１８（ｓ、３Ｈ）、３．３１（ｈｅｐｔｅｔ 、１Ｈ、J＝７．５Ｈｚ）、１．１９（ｄ、６Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）。 ２−（２−ヒドロキシノニル）−６−イソプロピルアニソール（スキームに示 されていない）： 塩化オクチルマグネシウム（８．４ｍｌ、 １６．９ｍｍｏ ｌ、 ２．０Ｍ）を、−７８℃において１０ｍｌのＴＨＦ中のＩ（１．５ｇ、８ ．４ｍｍｏｌ）の溶液に滴下する。反応混合物を室温に加温しながら２時間撹拌 する。反応混合物 を５０ｍｌのエーテルで希釈し、５０ｍｌの水中に注ぐ。エーテル層をブライン （１×５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空濃縮する。フラッシ ュクロマトグラフィー（シリカゲル、１０％エーテル／ヘキサン→１５％エーテ ル／ヘキサン）は７３４ｍｇ（３０％）の標題化合物が得られ、これは下記の¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）特性を有する：ｄ７．３３−７．１０（ｍ、３Ｈ）、 ５．００（ｂｒ、ｓ、１Ｈ）、３．８１（ｓ、３Ｈ）、３．３３（ｈｅｐｔｅｔ 、１Ｈ、Ｊ＝７Ｈｚ）、１．９０−１．１９（ｍ、１４Ｈ）、０．８６（ｔ、３ Ｈ、Ｊ＝６．５Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（ＥＩ）、実測値：２９２．２４０４；計算値 ：２９２．２４０２。 ２−ノニル−６−イソプロピルアニソール（２）： 化合物２（６６３ｍｇ、 ２．３ｍｍｏｌ）を５ｍｌのエタノールおよび５ｍｌの酢酸の溶液中に溶解し、 スパチュラ先端の炭素担持パラジウム触媒を添加する。次いで反応混合物に水素 ガス（簡単なバルーンおよび針を使用する）を供給し、この混合物を室温におい て一夜撹拌する。次の日に、反応混合物をエーテル（１００ｍｌ）中に注ぎ、エ ーテル層を飽和重亜硫酸ナトリウム溶液（３×１００ｍｌ）で抽出する。エーテ ル層ｗｏ硫酸ナトリウムで乾燥し、真空濃縮すると、５８１ｍｇ（９１％）の（ ２）が得られ、これは下記の¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）特性を有する：ｄ７．１ ４−７．００（ｍ、３Ｈ）、３．７５（ｓ、３Ｈ）、３．３６（ｈｅｐｔｅｔ、 １Ｈ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、２．６３（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）、１．６８− １．１５（ｍ、１４Ｈ）、０．８６（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝５．５Ｈｚ）；ＨＲＭＳ（ ＥＩ）、質量、実測値：２７６．２４５９；計算値：２７６．２４５３。 サイロニン付加物（４）： 発煙硝酸（０．０７１ｍｌ）を−５℃に冷却した ０．１８４ｍｌの無水酢酸に添加する。ヨウ素（６６ ｍｇ）をこの混合物に添加し、次いでトリフルオロ酢酸（０．１２４ｍｌ）を添 加する。この混合物を室温に加温しながら１時間撹拌し、この時点においてヨウ 素のすべては溶解する。次いで反応混合物を真空濃縮すると、油状半固体状物が 得られる。残留物を０．７ｍｌの無水酢酸中に溶解し、−２０℃に冷却する。１ ．２ｍｌの無水酢酸および０．５８ｍｌのＴＦＡ中のアニソール（２）（５８１ ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）の溶液を滴下する。反応混合物を−２０℃において１時 間撹拌し、次いで室温に加温しながら一夜撹拌する。この混合物を水と塩化メチ レンとの間に分配する。塩化メチレン層を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空濃縮す ると、ヨードニウム塩（３）が油状物として得られる。この物質を精製または特 性決定せず、カップリング反応に直接導入する。 Ｎ．ＬｅｗｉｓおよびＰ．Ｗａｌｌｂａｎｋ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １１０３ （１９８７）（引用することによって本明細書の一部とされる）に従い製造され たＮ−トリフルオロアセチル−３，５−ジヨードチロシンメチルエステル（５５ ２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）および上記からの粗製ヨードニウム塩（３）のすべて を５ｍｌの無水エタノール中に溶解する。ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデ カン（ＤＢＵ）（１８３ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびスパチュラ先端の銅−青 銅を添加し、生ずる混合物を室温において一夜撹拌する。次の日に、反応混合物 を濾過し、濾液を真空濃縮する。粗残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シ リカゲル、１０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製すると、３０ｍｇ（４％） の保護されたサイロニン付加物（４）が得られる。 脱保護されたサイロニン（ＴＳ１０）： 脱保護されたサイロニン４（３０ｍ ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を２．２５ｍｌの酢酸と２．２５ｍｌの４９％臭化水素 酸との混合物中に溶解する。反応混合物 を５時間加熱還流させる。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を真空除去する。水 を添加して油状残留物を粉砕して灰色固体状物にする。この固体状物質を濾過し 、水で洗浄し、Ｐ₂Ｏ₅で真空乾燥すると、２４ｍｇ（８１％）の標題化合物、Ｔ Ｓ１０、が得られ、これは下記の¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）特性を有する：ｄ７ ．５７（ｓ、１Ｈ）、６．８６（ｓ、１Ｈ）、６．４５（ｓ、１Ｈ）、６．３４ （ｓ、１Ｈ）、４．８１（ｍ、１Ｈ）、３．８６（ｓ、３Ｈ）、３．７１（ｓ、 ３Ｈ）、３．３３−３．０５（ｍ、３Ｈ）、２．５８−２．４７（ｍ、２Ｈ）、 １．６２−０．７６（ｍ、２３Ｈ）；ＭＳ（ＬＳＩＭＳ）：Ｍ⁺＝８１７．０。 前述したように、当業者はこの反応スキームを変更して、３，５−ジヨード− ３’イソプロピルサイロニン誘導体により特徴づけられる化合物のクラスを合成 することができ、ここで（１）３’イソプロピル基をメチル、ベンジル、フェニ ル、ヨード、およびヘテロサイクルの構造を包含する疎水性基で置換することが でき、そして（２）広範な種類のアルキル基、平らなアリール、ヘテロサイクル 基、または極性および／または帯電した基を包含する化学的構造物を５’位に組 込むことができる。 上記反応スキームにおけるアルデヒド（１）は融通性のある合成中間体であり 、これは最終のサイロニン誘導体の５’位に種々の化学的部分の取り付けを可能 とする。さらに、種々の化学的反応を使用して化学的部分を取り付けることがで きる。これらの反応はこの分野においてよく知られており、アルデヒドへの有機 金属の付加（グリニヤール試薬、オルガノリチウム、およびその他を包含する） 、第一級または第二級アミンとのアルデヒドの還元的アミド化反応、およびリン イリドまたは安定化ホスフェートアニオンとのウィッティッヒオレフィン化反応 を包含する。他の可能性は、５’位にお けるエーテル化反応を可能とするアルデヒドのベンジルアルコールへの還元を包 含する。前述したように、これらの方法により、最終サイロニン誘導体の５’位 に広範な種類のアルキル基、平らなアリール、ヘテロサイクル基、または極性お よび／または帯電した基を包含する化学的構造物を５’位に組込むことができる 。３，５−ジブロモ−４−（３’，５’−ジイソプロピル−４’−ヒドロキシフェ ノキシ）安息香酸（化合物１１）の合成 （ａ）２，６−ジイソプロピルフェノール（２０ｇ、０．１１ｍｏｌ）、炭酸 カリウム（６２ｇ、０．４５ｍｏｌ）、アセトン（１６０ｍｌ）およびヨウ化メ チル（２８ｍｌ、０．４５ｍｏｌ）の混合物を３日間還流させる。反応混合物を セライトを通して濾過し、蒸発させ、エーテル中に溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウ ムで２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮すると、１５．１ｇ（０．０ ８ｍｌ、７０％）の２，６−ジイソプロピルアニソールがわずかに黄色の油状物 として得られる。 （ｂ）発煙硝酸（１２．４ｍｌ、２６５ｍｍｏｌ）を、ドライアイス／四塩化 炭素浴中で冷却する３１．４ｍｌの無水酢酸に滴下する。ヨウ素（１１．３ｇ、 ４４．４ｍｍｏｌ）を一度に添加し、次いでトリフルオロ酢酸（２０．５ｍｌ、 ２６６ｍｍｏｌ）を滴下する。ヨウ素が溶解するまで、反応混合物を室温におい て撹拌する。 容器の中に窒素をフラッシュすることによって、窒素酸化物を除去 する。反応混合物を濃縮し、残留物を１２６ｍｌの無水酢酸中に溶解し、ドライ アイス／四塩化炭素浴中で冷却する。撹拌した溶液に、１５０ｍｌの無水酢酸お よび２２．６ｍｌのトリフルオロ酢酸中の２，６−ジイソプロピルアニソール（ ５１ｇ、２６６ｍｍｏｌ）を滴下する。反応混合物を室温において一夜放置し、 次いで濃縮する。残留物を１５０ｍｌのメタノール中に取り、１５０ｍｌの１０ ％水性重亜硫酸ナトリウム溶液および１リットルの２Ｍ四フッ化ホウ素ナトリウ ム溶液で処理する。沈澱が凝集した後、石油エーテルを添加し、上清をデカント する。沈澱を石油エーテルで粉砕し、濾過し、石油エーテルで洗浄し、室温にお いて真空乾燥する。これにより、３４ｇ（５７ｍｍｏｌ、６５％）のビス（３， ５−ジイソプロピル−４−メトキシフェニル）ヨードニウムテトラフルオロボレ ートが白色固体状物として得られる。 （ｃ）２５０ｍｌのメタノール中の３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシ安息香 酸（１２ｇ、４０．５ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に、塩化チオニル（３ｍｌ）を 滴下する。反応混合物を５日間還流させ、水を添加し、沈澱した生成物を濾過す る。残留物を酢酸エチル中に溶解する。水相から、メタノールを濃縮により除去 する。次いで水相を塩化ナトリウムで飽和させ、酢酸エチルで抽出する。一緒に した有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮する。これにより、１２ ．５ｇ（４０．５ｍｍｏｌ、１００％）の３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシメ チルベンゾエートが白色結晶質固体状物として得られる。 （ｄ）工程ｂおよびｃにおいて得られた生成物を、下記のプロトコールに従い 互いに反応させる。０℃の７ｍｌのジクロロメタン中のビス（３，５−ジイソプ ロピル−４−メトキシフェニル）ヨードニウムテトラフルオロボレート（２．８ ６ｇ、４．８ｍｍｏｌ）お よび銅青銅（０．４２ｇ、６．４ｍｍｏｌ）に、５ｍｌのジクロロメタン中の３ ，５−ジブロモ−４−ヒドロキシメチルベンゾエート（１．０ｇ、３．２ｍｍｏ ｌ）およびトリエチルアミン（０．３６ｇ、３．５ｍｍｏｌ）の溶液を滴下する 。反応混合物を暗所で８日間撹拌し、次いでセライトを通して濾過する。濾液を 濃縮し、残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、９７：３石油エーテ ル／酢酸エチル）により精製すると、０．６２ｇ（１．２ｍｍｏｌ、３９％）の ３，５−ジブロモ−４−（３’，５’−ジイソプロピル−４’−メトキシフェノ キシ）メチル安息香酸が固体状物として得られる。 （ｅ）工程ｄからの生成物（０．２ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を２ｍｌのジクロロ メタン中に溶解し、窒素雰囲気下に置き、−４０℃に冷却する。撹拌した溶液に 、１ＭのＢＢｒ₃（１．２ｍｌ、１．２ｍｍｏｌ）を滴下する。反応混合物を室 温に到達させ、次いで一夜放置する。それを０℃に冷却し、次いで水で加水分解 する。濃縮によりジクロロメタンを除去し、水相を酢酸エチルで抽出する。有機 相を１Ｍ塩酸およびブラインで洗浄する。次いでそれを硫酸マグネシウムで乾燥 し、濾過し、濃縮する。残留物をクロマトグラフィー（シリカ、９６：３．６： ０．４ジクロロメタン／メタノール／酢酸）にかけると、９３ｍｇ（０．２ｍｍ ｏｌ、５１％）の３，５−ジブロモ−４−（３’，５’−ジイソプロピル−４’ −ヒドロキシフェノキシ）安息香酸が白色固体状物として得られる。¹Ｈ ｎｍ ｒ（ＣＤＣｌ₃）δ１．２３（ｄ、１２Ｈ、メチル）、３．１１（ｍ、２Ｈ、Ｃ Ｈ）、６．５０（ｓ、２Ｈ、２，６−Ｈ）、８．３３（ｓ、２Ｈ、２’，６’− Ｈ）。 いくつかのＴＲリガンドの構造を表１および第１５図に示す。 式１ ＊ ＳＫＦからの先行技術の化合物 −Φ フェニル −ΦｐＮＯ₂ パラニトロフェニル実施例２−ＴＲリガンドのレセプターの結合のアッセイ 合成されたＴＲリガンドが甲状腺レセプター（ＴＲ）に結合する能力を試験す るために、下記の文献に記載されているラット肝臓核 および１２５₁およびＴ₃から製造されたＴＲを使用して、ＴＲに対するＴＲリガ ンドの結合アフィニティーをアッセイする：Ｊ．Ｄ．Ａｐｒｉｌｅｔｔｉ、Ｊ． Ｂ．ＢａｘｔｅｒおよびＴ．Ｎ．Ｌａｖｉｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３ ：９４０９−９４１７（１９８８）。Ａｐｒｉｌｅｔｔｉ（ｌ９９５）およびＡ ｐｒｉｌｅｔｔｉ（１９８８）により記載されている方法を使用して、見掛けの Ｋｄを計算する。見掛けのＫｄは表２に表示されている。見掛けのＫｄ（Ａｐｐ ．Ｋｄ）は、０．２１ｍｌの体積の緩衝液Ｅ（４００ｍＭのＫＣｌ、２００ｍＭ のリン酸カリウム、ｐＨ８．０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、 １０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ）中において、１ｎＭのアッセイすべき 試料、[¹²⁵Ｉ］Ｔ₃、および５０μｇ／ｍｌのコアヒストンの存在において測定 される。４℃において一夜インキュベートした後、０．２ｍ１のインキュベーシ ョン混合物を緩衝液Ｅと平衡化したＱｕｉｃｋ−Ｓｅｐ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −２５カラム（２．７×０．９ｃｍ、１．７ｍｌのべッド体積）上に負荷する。 タンパク質結合［¹²⁵Ｉ］Ｔ₃の排除されたピークを１ｍｌの緩衝液Ｅで溶離し、 試験管中に集め、計数する。合計の結合から非特異的結合を減ずることによって 、比Ｔ₃結合を計算する。＋： ＲＩＰ−１４０結合 −： ＲＩＰ−１４０結合 ｎｄ： 測定せず実施例３−ＴＲリガンドによる核タンパク質のコアクチベーションの増加 核活性化タンパク質ＲＩＰ−１４０（核レセプターに結合できる核タンパク質 、たとえば、エストロゲンレセプター）へのＴＲの結合能力を試験するために、 ＴＲリガンドをＴＲにリガンドさせ、次いでＶ．Ｃａｖａｉｌｌｅｓ ｅｔ ａ ｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１４（１５）：３７４１−３７５１（１９９５）（これは 引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されているようにＲＩＰ −１４０とインキュベートした。このアッセイにおいて、３５₅− ＲＩＰ−１４０タンパク質はリガンデッドＴＲに結合するが、アンリガンデッド ＴＲに結合しない。多数のＴＲ−３５₅リガンドは表２に示すようにＲＩＰ−１ ４０を活性化することができる。実施例４−培養した細胞におけるＴＲリガンドの結合およびＴＲ活性化 細胞の環境における転写のＴＲ活性化を試験するために、作用可能に連鎖され たＴＲ ＤＮＡ結合配列を有するレセプター遺伝子、すなわち、クロラムフェニ コールトランスフェラーゼ（「ＣＡＴ」）を活性化する能力について、ＴＲリガ ンドをアッセイする。それぞれ、ＣＣまたはＬ９３７細胞（ＡＴＣＣから入手可 能である）を使用することができる。このようなアッセイにおいて、ＴＲリガン ドは細胞膜を横切り、ＴＲに結合し、ＴＲを活性化し、引き続いてＴＲはＣＡＴ 遺伝子から上流のＴＲ ＤＮＡ結合領域に結合することによって、ＣＡＴの遺伝 子転写を活性化する。本明細書および文献に記載されているように種々の濃度に おけるＣＡＴ遺伝子の活性化を評価することによって、半最大遺伝子活性化の有 効濃度（ＥＣ₅₀）を決定する。ＣＡＴ遺伝子活性化実験の結果を表２に示す。ＣＡＴ遺伝子活性アッセイ ラット下垂体細胞系統、ＧＣ細胞（内因性甲状腺ホルモンレセプター（ＴＲ） を含有する）またはＵ９３７細胞（この分野において知られているように発現さ れた外因性ＴＲを含有する）において、甲状腺ホルモン（３，５，３’−トリヨ ード−Ｌ−サイロニン、Ｔ₃）およびＴＲリガンドに対する機能的応答を評価す る。１０ｃｍの皿において１０％の新生児ウシ血清、２ｍＭのグルタミン、５０ 単位／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する ＲＰＭＩ １６４０中でＧＣ細胞を増殖させる。トランスフェクションのために 、細胞をトリプシン処理し、緩衝液（Ｐ ＢＳ、０．１％のグルコース）中に再懸濁させ、０．５ｍｌの緩衝液（１５±５ ×１０⁶細胞）中のＴＲＥｔｋＣＡＴ血漿（ｌ０ｍｇ）またはファージと混合し 、０．３３ｋＶおよび９６０ｍＦにおいてＢｉｏ−Ｒａｄ遺伝子パルサーを使用 してエレクトロポレートする。ＴＲＥｔｋＣＡＴ血漿は、ＣＡＴ（ｔｋＣＡＴ） コーディング配列に連鎖した最小（−３２／＋４５）チミジンキナーゼプロモー ターから直ぐ上流のｐＵＣｌ９ポリリンカーのＨｉｎｄＩＩＩ部位においてクロ ーニングされたＴ₃応答要素（ＡＧＧＴＣＡｃａｇｇＡＧＧＴＣＡ）の２コピー を含有する。エレクトロポレーション後、細胞を成長培地（１０％木炭処理し、 ホルモン除去した、新生児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ）の中にプールし、６ウ ェルの皿の中にプレートし、エタノールまたはホルモンで処理する。下記の文献 に記載されているように、ＣＡＴ活性を２４時間後に測定する：Ｄ．Ｃ．Ｌｅｉ ｔｍａｎ、Ｒ．Ｃ．Ｊ．Ｒｉｂｅｉｒｏ、Ｅ．Ｒ．Ｍａｃｋｏｗ、Ｊ．Ｄ．Ｂａ ｘｔｅｒ、Ｂ．Ｌ．Ｗｅｓｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、９３４３（１ ９９１）、これは引用することによって本明細書の一部とされる。Ｔ３の存在または非存在におけるＤＲ４−ＡＬＰリポーター遺伝子の転写調節に 対するＴＳ−１０の作用 ＴＲＡＦ細胞の特性： ＴＲＡＦａ１は、ヒト甲状腺ホルモンレセプターα１を コードする発現ベクターおよびＤＲ４−ＡＬＰリポーターベクターで安定に形質 転換されたＣＨＯＫ１細胞である；ＴＲＡＦｂ１は、ヒト甲状腺ホルモンレセプ ターβ１をコードする発現ベクターおよびＤＲ４−ＡＬＰリポーターベクターで 安定に形質転換されたＣＨＯＫ１細胞である。Ｔ３の存在または非存在におけるＤＲ４−ＡＬＰリポーター遺伝子の転写調節に 対する化合物ＴＳ−１０の作用の解釈 ＴＲＡＦａ１リポーター細胞： ＴＳ−１０単独（白抜き円）は、Ｔ３による最 大作用のほぼ２７％のまでの、ＡＬＰリポータータンパク質の発現の部分的活性 化を誘発する。Ｔ３の存在において（充填した円）、ＴＳ−１０は弱いアンタゴ ニスト作用を有する。ＴＳ−１０のアゴニスト作用についてのＥＣ５０濃度およ びそのＴ３アンタゴニスト作用についてのＥＣ５０濃度は、それぞれ、第１８図 に示されている。第１８図において 、点線を有する白抜きおよび充填の円は、光学密度として右の ｙ軸に表示された、毒性マーカー（ＭＴＳ／ＰＭＳ）に対するＴＳ−１０／Ｔ３ の投与量依存性作用、ミトコンドリア中のテトラゾリウム塩の減少を示す。ＭＴ Ｓ−ＰＭＳマーカーに対するＴＳ−１０の明らかな毒性作用は存在しないが、そ れぞれ、Ｔ３の非存在および存在の双方においてＴＳ−１０の最高濃度（３２ｍ Ｍ）において、光学顕微鏡下に見ることができるように、細胞の形態に対する明 瞭な作用が存在する（図示せず）。ＴＲＡＦｂ１リポーター細胞： ＴＳ−１０単独（白抜き円）は、天然の甲状腺 ホルモンＴ３による最大作用のほぼ３５％までの、ＡＬＰリポータータンパク質 の発現の部分的活性化を誘発する。ＴＳ−１０のアゴニスト作用についてのＥＣ ５０濃度は第１９図に示されている。Ｔ３の存在において（充填した円）、ＴＳ −１０は、いずれかと言えば、ＡＬＰリポータータンパク質の発現に対してＴ３ のわずかな増強を示す。使用した最高濃度（３２ｍＭ）におけるＴＳ−１０のＴ ３阻害作用は、Ｔ３拮抗作用よりむしろ毒性作用である。第１９図において 、点線を有する白抜きおよび充填の円は、光学密度として右の ｙ軸に表示された、毒性マーカー（ＭＴＳ／ＰＭＳ）に対するＴＳ−１０／Ｔ３ の投与量依存性作用、ミトコンドリア中 のテトラゾリウム塩の減少を示す。ＭＴＳ−ＰＭＳマーカーに対するＴＳ−１０ の明らかな毒性作用は存在しないが、それぞれ、Ｔ３の非存在および存在の双方 においてＴＳ−１０の最高濃度（３２ｍＭ）において、光学顕微鏡下に、細胞の 形態に対する明瞭な作用を観察することができる（図示せず）。ＨｅｐＧ２（ＨＡＦ１８）リポーター細胞： ＴＳ−１０単独（白抜き円）は、 Ｔ３による最大作用の５０％よりわずかに高い、ＡＬＰリポータータンパク質の 発現の部分的活性化を誘発する。ＴＳ−１０のアゴニスト作用についてのＥＣ５ ０濃度は第２０図に示されている。Ｔ３の存在において（充填した円）、ＴＳ− １０は作用を示さない、すなわち、Ｔ３拮抗作用およびＴ３に対する増強／加法 的作用を示さない。点線を有する白抜きおよび充填の円は、光学密度として右の ｙ軸に表示された、毒性マーカー（ＭＴＳ／ＰＭＳ）に対するＴＳ−１０／Ｔ３ の投与量依存的作用、ミトコンドリア中のテトラゾリウム塩の減少を示す。使用 したＴＳ−１０／Ｔ３のいずれの濃度においても、光学顕微鏡下に観察できるよ うに、ＭＴＳ／ＰＭＳマーカーまたは細胞の形態に対するＴＳ−１０の明らかな 毒性作用は存在しない。実施例５−Ｔ₃およびｔｒｉａｃによるＴＲ ＬＢＤへの［¹²⁵Ｉ］Ｔ₃の結合に ついてのヒトＴＲ−αおよびヒトＴＲ−βの競合の比較 薬剤ｔｒｉａｃは甲状腺ホルモンのアゴニストである。ｔｒｉａｃは３，５， ３’−トリヨードサイロ酢酸であり、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈ ｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ ｉｎ ６ Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒ ｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ 、１５０−１５１（１９７８）に記載されている。ｔｒｉａｃの代わりに使用で きる他の化合物は、３，５−ジヨード−３’−イソプロピルサイロ酢酸である。 競合アッセイを実施して、非標識化Ｔ₃またはｔｒｉａｃによるヒトＴＲ−αま たはヒトＴＲ−βとの結合からの、［¹²⁵Ｉ］Ｔ₃の置換を比較する。このような アッセイの結果を第１６図に描写する。 １ｎＭの［¹²⁵Ｉ］Ｔ₃、３０ｆｍｏｌのヒトＴＲ−α（白抜きの記号）または ＴＲ−β（充実の記号）、および種々の濃度の競合する非標識化Ｔ₃（円）また はｔｒｉａｃ（三角形）を含有する標準的結合反応物を調製する。アッセイは二 重反復実験において実行する。 ＴＲに結合する［¹²⁵Ｉ］Ｔ₃のスキャッチャード分析 ヒトＴＲ−α（左のパネル）またはヒトＴＲ−β（右のパネル）を、増加する 濃度の［¹²⁵Ｉ］Ｔ₃の存在においてＴ₃の結合についてアッセイする。見掛けの 平衡の解離定数（αについて２０ｐＭおよびβについて６７ｐＭ）を線形回帰分 析により計算し、第７図に描写する。 ３，５−ジブロモ−４−（３’，５’−ジイソプロピル−４’−ヒドロキシフ ェノキシ）安息香酸はＴＲ−α選択的合成リガンドである。 ３，５−ジブロモ−４−（３’，５’−ジイソプロピル−４’−ヒドロキシフ ェノキシ）安息香酸（化合物１１）（その構造は上に 描写されている）をＴＲの２つの異なるイソ型、ＴＲ−αおよびＴＲ−βへの結 合についてアッセイする。化合物１１はＴＲαに対する結合について１．６μＭ のＩＣ５０およびＴＲβに対する結合について０．９１μＭのＩＣ５０を示す。 ＴＲαまたはＴＲβのＬＢＤに対する選択的結合を測定するアッセイは、本明細 書において載するように、リポーターのアッセイを包含することができる。また 、Ｈｏｌｌｅｎｂｒｇ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２４ ）４２７４−１４２８０（１９９５）を参照のこと。実施例６−ＴＲ−αＬＢＤの製造および精製 ラットＴＲ−αＬＢＤ、残基Ｍｅｔ１２２−Ｖａｌ４１０を大腸菌（Ｅ．ｃｏ ｌｉ）（″ＬＢＤ−１２２／４１０″）から精製する。ラットＴＲ−αＬＢＤを コードする発現ベクターを新しく大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株 の中にトランスフェクトし、５０リットルの発酵槽中で２×ＬＢ培地を使用して ２２℃において増殖させる。２．５〜３のＡ₆₀₀において、ＩＰＴＧを０．５ｍ Ｍに添加し、増殖を３時間続けた後、収獲する。細菌ペレットを液体窒素中で急 速に凍結させ、プロセスするまで−７０℃において貯蔵する。抽出および精製の 工程を４℃において実施する。細菌を抽出緩衝液（２０ＭＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＭＴＧ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、および１ ０％グリセロール）中で１０ｍｌの緩衝液／ｇの細菌の比で融解する。細菌を０ ．２ｍｇ／ｍｌのリゾチームと１５分間インキュベートして溶解し、最大電力で 超音波処理すると同時にＢｒｉｎｋｍａｎホモジナイザー（発電機ＰＴＡ３５／ ２を装備するＰＴ１０／３５型）で溶液がその粘度を失うまで均質化する。１０ ，０００ｇにおいて１０分間遠心した後、上清を０．４ＭのＫＣ１に調節し、０ ．６％のＰＥＩで処理してＤＮＡを沈降させ、１０，０００ｇにおいて１０分間 遠心する。次いで上清中のＴＲ−αＬＢＤを５０％の硫酸アンモニウムで沈降さ せ、１０，０００ｇにおいて１０分間遠心する。沈降物を緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ Ｐ ＭＳＦ、０．０１％ルブロールおよび１０％グリセロール）で９ｍＳ／ｃｍ（ほ ぼ０．７Ｍの硫酸アンモニウム）の伝導度に再懸濁させ、１００，０００ｇにお いて１時間遠心する。上清を液体窒素中で凍結させ、−７０℃において貯蔵する 。 粗製抽出物を融解し、トレーサー量の［¹²⁵Ｉ］Ｔ₃を結合させ、フェニル−ト ヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）疎水性相互作用カラム（２．６×１８ｃｍ、９ ５ｍｌのベッド体積）上に１．５ｍｌ／分で直接負荷する。このカラムを緩衝液 Ｃ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、 ０．２ｍＭ ＰＭＳＦ）中の０．７硫酸アンモニウム、０％のグリセロールから ０％の塩、２０％のグリセロールまでの２時間の勾配で溶離する。トレーサー［¹²⁵ Ｉ］Ｔ₃に前もって結合したラットＴＲ−αＬＢＤ（合計のラットＴＲ−αＬ ＢＤの０．００５％より少ない）を貫流ガンマ放射検出器で検出するが、アンリ ガンデッドラットＴＲ−αＬＢＤをポストカラム［¹²⁵Ｉ］Ｔ₃結合アッセイ（本 明細書において記載する）によりアッセイする。 フェニル−トヨパールアンリガンデッドラットＴＲ−αＬＢＤのピーク画分を プールし、緩衝液Ｂで０．５ｍＳ／ｃｍ（ほぼ２０ｍＭの硫酸アンモニウムに等 しい）の伝導度に希釈し、ＴＳＫ−ＤＥＡＥアニオン交換カラム（２×ｌ５ｃｍ 、４７ｍｌベッド体積）上に４ｍｌ／分で負荷し、緩衝液Ｂ中の５０から２００ ｍＭのＮａＣｌの６０分の勾配で溶離する。 ＴＳＫ−ＤＥＡＥからのアンリガンデッドラットＴＲ−αＬＢＤ ピーク画分をプールし、緩衝液Ｂで２倍に希釈し、０．７５ｍｌ／分でＴＳＫ− ヘパリンＨＰＬＣカラム（０．８×７．５ｃｍ）３ｍｌベッド体積）上に負荷し 、緩衝液Ｂ中の５０から４００ｍＭのＮａＣｌで溶離する。 ＴＳＫ−ヘパリンカラムからのアンリガンデッドラットＴＲ−αＬＢＤピーク 画分のプールを０．７Ｍの硫酸アンモニウムに調節し、０．７５ｍｌ／分でＴＳ Ｋ−ヘパリンＨＰＬＣカラム（０．８×７．５ｃｍ、３ｍｌベッド体積）上に負 荷し、緩衝液Ｃ中の０．７Ｍの硫酸アンモニウム、０％のグリセロールから０％ の塩、２０％のグリセロールの６０分の勾配で溶離する。アンリガンデッドラッ トＴＲ−αＬＢＤを含有する画分をプールし、５倍過剰のホルモンと１時間イン キュベートし、塩濃度を０．７Ｍの硫酸アンモニウムに調節し、試料を前述と同 一のカラムに再負荷し、クロマトグラフィーにかける。実施例７−リガンデッドＴＲ−αＬＢＤの結晶化 単一のＬＢＤ−１２２／４１０の製造からの材料をバッチに分割し、下記のリ ガンドの１つと定量的に結合させる：Ｄｉｍｉｔ、Ｔ₃、またはｔｒｉａｃＩｐ Ｂｒ₂（３，５ジブロモ−３’イソプロピルサイロニン）最終精製工程について 。 ラットＴＲ−αＬＢＤをリガンドで完全に飽和させて維持し、かつ結晶化のた めの複合体を製造するために、リガンド結合ラットＴＲ−αＬＢＤを濃縮し、ア メリカン・セントリコン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−１０マイ クロコンセントレーター（ＭｃＧｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ、７：２４６−２４７（１９８９）、引用することによって本明細書の 一部とされる）中で１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、３．０ｍＭのＤＴＴ および１．０ｎＭ〜１０ｎＭのリガンドを使用して脱 塩する。 選択したリガンドに結合したラットＴＲ−αＬＢＤについて１７℃においてハ ンギング−ドロップ蒸気拡散を使用して、階乗結晶化スクリーニング試験（Ｊａ ｎｃａｒｉｋおよびＫｉｍ、Ｊ．Ａｐｐ．Ｃｒｙｓｔｌｌｏｇｒ．２４：４０９ −４１１（１９９１）引用することによって本明細書の一部とされる）を実施す る（１μｌのタンパク質溶液、１μｌの沈澱剤溶液および０．５ｍｌの溜を使用 し、シラン化カバースリップを用いる（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｐｒｅｐａｒａｔ ｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｓ （１９８２）、引用することによって本明細書の一部とされる）。ラットＴＲ− αＬＢＤは４℃において安定ではなく、−８０℃において貯蔵し、ここでそれは ホルモンについてその結合活性およびその結晶化能力をほぼ２〜３カ月間維持す る。これらの手順はＭｃＧｒａｔｈ、Ｍ．Ｅ．、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ ｉｏｌ．２３７：２３６−２３９ （１９９４）（引用することによって本明細 書の一部とされる）に記載されているように実施される。結晶はスクリーニング 試験の条件２１において得られ（ＪａｎｃａｒｉｋおよびＫｉｍ １９９１）次 いで条件を最適化する。くさび形結晶が２２℃においてハンギング−ドロップ蒸 気融合で１５％の２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、０．２Ｍ の酢酸アンモニウムおよび０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．７）、３ ｍＭのＤＴＴを使用し、２μｌのタンパク質溶液、１μｌの沈澱剤溶液および０ ．６ｍｌの溜を使用し、シラン化カバースリップを使用し、そして８．７ｍｇ／ ｍｌ（Ｄｉｍｉｔ）、５．５ｍｇ／ｍｌ（ＩｐＢｒ₂）、５ｍｇ／ｍｌ（ｔｒｉ ａｃ）、または（Ｔ₃）を使用して、３日の期間にわたって、結晶は再現的に得 られる。これらの条件下に、回折品質の結晶（寸法０ ．５×０．２×０．００７５ｍｍ₃）を周囲温度（２２℃）において成長させる ことができる。最良の結晶はほぼ１００μｍの制限寸法を有し、３ｍＭのＤＴＴ の存在において２．３〜８．７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度において得られる。 結晶は単斜晶系の空間群Ｃ２を有し、１つのモノマーは非対称単位にある。実施例８−Ｔ₃またはＴｒｉａｃと複合化したヒトＴＲ−βＬＢＤの結晶化 ラットＴＲ−αＬＢＤについて前述したのと同一の手順に従い、下記の変更を 加えて、Ｔ₃と複合化したヒトＴＲ−βＬＢＤおよびｔｒｉａｃと複合化したヒ トＴＲ−βＬＢＤを精製する。 第３図に描写されている種々の核レセプターについてのアミノ酸のナンバリン グスキームに従い、ヒトＴＲ−βＬＢＤ残基は位置７１６のアミノ酸から位置１ ０２２のアミノ酸まで延びることにおいて、ヒトＴＲ−βＬＢＤの表現はラット ＴＲ−αＬＢＤと異なる。 列挙する核レセプターのすべて、ならびに任意の追加の相同性核レセプターに適 用可能なナンバリングスキームを、第３図に図解する。第３図上の位置７２５お よび位置１０２５における垂直線は、リガンドの適切な結合を得るために必要な 、好ましい最小アミノ酸配列を描写する。第３図のナンバリングスキームに従う 位置７１６から位置１０２２までのアミノ酸配列は、公衆に入手可能なヒトＴＲ −βのアミノ酸配列の慣用のナンバリングに従う位置２０２から位置４６１まで のアミノ酸配列に対応する。また、ヒトＴＲ−βＬＢＤは、Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３１： ３７１−３８７（１９９４）（引用することによって本明細書の一部とされる） に記載されているように、ヒスチジンの標識で表される。 ヒトＴＲ−βＬＢＤの精製は、下記を除外して、ラットＴＲ−α ＬＢＤについて記載した精製と同一である。第１に、疎水性相互作用カラムを使 用する精製工程の前に、ニッケルＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア 州チャツワース、から商業的に入手可能である）を製造業者のインストラクショ ンに従いを使用して、発現されたヒトＴＲ−βＬＢＤを精製し、２００ｍＭのイ ミダゾールで溶離する工程を加える。第２の差は、ヒトＴＲ−βＬＢＤの精製に おいて、ヘパリンカラムを使用する精製工程を省略する。 Ｔ₃またはＴ₃に結合したヒトＴＲ−βＬＢＤの結晶化は下記の通りである。Ｊ ａｎｃａｒｉｋおよびＫｉｍ（１９９１）の階乗結晶化スクリーニング試験を使 用し、かつＨａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（リバーサイド）から商業的に入 手可能な生成物を使用して周囲温度（２２℃）において、前述のハンギングドロ ップを使用して、階乗スクリーンの条件７において結晶を得る。下記は最適条件 である：１．０〜１．２Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ未調節）および０．１Ｍのカ コジル酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、３ｍＭのＤＴＴを含有するハンギングドロ ップから、７〜１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度において、１μｌのタンパク質 溶液、１μｌの沈澱剤溶液または２μｌのタンパク質溶液、１μｌの沈澱剤溶液 および０．６ｍｌの溜を使用して、シラン化カバースリップを使用して、六方両 錐体の結晶を４℃において２〜３日間成長させる。最良の結晶は２００μｍの制 限寸法を有する。 Ｔ₃またはｔｒｉａｃに結合したヒトＴＲ−βＬＢＤについての結晶系は、空 間群ｐ３_i２１をもつ偏六面体である。単位格子寸法は、結晶格子長さａ＝結晶 格子長さｂ＝６８．４４８オングストローム、結晶格子長さｃ＝１３０．５９９ オングストロームである。 角度はα＝９０°、β＝９０°、ガンマ＝１２０°である。実施例９−リガンデッドＴＲ−αＬＢＤ結晶構造の決定 スタンフォード・シンクロトロン・タディエイション・ラボラトリー（Ｓｔａ ｎｆｏｒｄ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ）ビームライン７−１（λ＝１．０８オングストローム）において１．２^a の振動を使用してＭａｒ面積検出器で、３つの共結晶（Ｄｉｍｉｔ、Ｔ３および ＩｐＢｒ₂をもつラットＴＲ−αＬＢＤ）の各々からのデータを測定する。 スピンドルとほぼ平行のｂ＊軸で、Ｔ₃共結晶からのデータを測定する。ＭＰ 共結晶溶媒として働くＭＰＤ母液を使用して窒素気体流中で−１７８℃において 、結晶をフラッシュ凍結させる。ＲＥＦＩＸを使用して、各結晶のオリエンテー ションマトリックスを測定する（Ｋａｂｓｃｈ、Ｗ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ ａｌｌｏｇｒ．２６：７９５−８００（１９９３）、引用することによって本明 細書の一部とされる）。反射をＤＥＮＺＯ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｔｒｕｃｔｕ ｒｅ Ｃｏｒｐ．、テキサス州ザウッドランズ、から商業的に入手可能である） で積分し、ＳＣＡＬＥＰＡＣＫで目盛り定めする（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ、Ｚ、 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｔｕｄｙ Ｗｅｅｋｅｎ ｄ：″Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，″５ ６−６２（ＳＥＲＣ Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、英国ワリン トン、１９９３、引用することによって本明細書の一部とされる、に記載されて いるように）。 Ｔ₃のデータの組について、Ｂｉｊｖｏｅｔ対を分離して保持し、ＭＡＤＳＹ Ｓ（Ｗ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ（コロンビア大学）およびＷ．Ｗｅｉｓ（スタ ンフォード大学））を使用して局所的に目盛り定めする。 ３つの活性中心のリガンドから製造した共結晶は同形である。ＣＣＰ４組から のプログラムを使用して、ＭＩＲ分析を実行する（Ｃ ｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｎ． Ｒ．、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：７６０−７６３（１９９４ ）、引用することによって本明細書の一部とされる）。Ｄｉｍｉｔ共結晶を親と して取って、差パターソン（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎｓ）を 計算する。Ｔ₃の差パターソンにおける３つのヨウ素原子の位置は、密度地図の ハーカー（Ｈａｒｋｅｒ）区画から、バックグラウンドより１１σ上のピークと して明瞭に決定される。ＩｐＢｒ₂共結晶中の２つの臭素原子の位置は、雑音レ ベルより８σ上のピークとして、独立に位置する。ＬＢＤ−１２２／４１０につ いての相をＩｐＢｒ₂差パターソンに対する解から計算し、Ｔ₃共結晶のユニーク な第３ヨウ素の位置を確証するために使用する。ハロゲンの位置をＭＬＰＨＡＲ Ｅで洗練し、これらはヨウ素原子からの例外的な寄与を包含する（Ｏｔｗｉｎｏ ｗｓｋｉ、Ｚ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｔｕｄｙ Ｗｅｅｋｅｎｄ ８０−８６（ＳＥＲＣ Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ、英国ワリントン、１９９３））。ＭＩＲＡＳ相はＤＭを使用する溶媒 平坦化／ヒストグラム合致により改良される（Ｃｏｗｔａｎ、Ｋ．、Ｊｏｉｎｔ ＣＣＰ４ ａｎｄ ＥＳＦ−ＥＡＣＢＭ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ ｏｎ Ｐｒ ｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ３１：３４−３８（１９９４） 、引用することによって本明細書の一部とされる）。 溶媒平坦化ＭＩＲＡＳ２．５オングストローム電子密度地図からのプログラム Ｏを使用して、Ｄｉｍｉｔが結合したＬＢＤ−１２２／４１０のモデルを構築す る（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４７： １１０−１１９（１９９１）、引用することによって本明細書の一部とされる） 。ＸＰＬＯＲ を使用する最小二乗プロトコールにより、リガンドをもたない初期のモデル（Ｒ ｃｒｙｓｔ＝４０．１％）を洗練する。下記のラウンドの間に、Ｄｉｍｉｔリガ ンドを明瞭なＦｏ−Ｆｃ差密度地図の中に組入れる。引き続く洗練において、Ｘ ＰＬＯＲを使用する最小二乗プロトコールおよびシミュレートしたアニーリング プロトコールの双方を使用する（Ｂｒｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ２３５：４５８−４６０（１９８７）、引用することによって本明細書の一 部とされる）。個々の原子のＢ因子を等方的に洗練する。ＰＲＯＣＨＥＣＫにお いて規定されているように、すべての残基はＬａｓｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． 、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２６：２８３−２９１（１９９３） （引用することによって本明細書の一部とされる）に記載されているように許容 された主鎖捩れ角度範囲の中に存在する。現在のモデルはＮ−末端において３４ 残基（Ｍｅｔ₁₂₂−Ｇｌｎ₁₅₆）を欠如し、そしてＣ−末端において５残基（Ｇｌ ｕ₄₀₆−Ｖａｌ₄₁₀）を欠如する。 さらに、下記の残基は密度が低いためにＣβを越えてモデル化されない：１８ ４、１８６、１９０、１９８、２０６、２０９、２４０、３０１、３３０、３３ ７、３４０、３４３、３５９、および３９５。タンパク質原子についての平均Ｂ 値は３４．５Åである。最終モデルは下記のものから成る：ＬＢＤ−１２２／４ １０、Ａｒｇ₁₅₇−Ｓｅｒ₁₈₃、Ｔｒｐ₁₈₅−Ｇｌｙ₁₉₇、Ｓｅｒ₁₉₉−Ａｓｐ₁₀₆お よびＡｓｐ₂₀₈−Ｐｈｅ₄₀₅；３つのカコディレート修飾システイン：Ｃｙｓ₃₃₄ 、Ｃｙｓ₃₇₀およびＣｙｓ₃₉₂；および水としてモデル化された７３の溶媒分子（ ２００３原子）。＊Ｒ_rym =１００Σ_hklΣ_i ｜Ｉ_i−Ｉ｜／Σ_hklΣ_iＩ_i ２つの臭素部位の占有は３５個の電子に設定される。ヨウ素部位 の占有はこの値に関係する。 §フェージング力＝〈ＦＨ〉／〈ｅ〉、ここで〈ＦＨ〉は平均の計算された重 い原子の構造因子の振幅であり、そして〈ｅ〉は平均の推定された閉鎖の欠如で ある。 IIＲｃｕｌｌｉｓ＝〈ε〉／〈ｉｓｏ〉、ここで〈ε〉は平均の推定された閉 鎖の欠如であり、そして〈ｉｓｏ〉は同形の差である。 ｜、ここでＦ_oおよびＦ_cは観測されかつ計算された構造因子の振幅である（デー タＦ／σ＞２について）。Ｒｆｒｅｅをデータの３％を使用して計算し、ランダ ムに選択し、そして洗練から省略する。 §相関係数＝Σ_hkl（｜F_o｜−｜Ｆ_c｜）×（｜Ｆ_c｜−｜Ｆ_c｜）／Σ_hkl （｜Ｆ_o｜−｜Ｆ_o｜）²×Σ_hkl（｜Ｆ_c｜−｜Ｆ_c｜）² 実施例１０．ｒＴＲ−αＬＢＤとＴｒｉａｃとの複合体のフェージング ｒＴＲ−αＬＢＤとＴｒｉａｃとの複合体の非同形の可能性のために、出発モ デルからＡＭＯＲＥ（Ｎａｖａｚａ、Ｊ．、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ−Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃｒｙ ｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ５０：１５７−６３（１９９４））を使用して、分 子の置換を決定し、ここで出発モデルはｒＴＲ−αＬＢＤとＴ₃との複合体から 成るが、リガンド、すべての分子、および下記の残基が省略されている：Ａｓｎ １７９、Ａｒｇ２２８、Ａｒｇ２６２、Ａｒｇ２６６、およびＳｅｒ２７７。強 いピークが回転および並進の双方の探索において得られ、有意な（＞０．５×上 部のピーク）誤った解は観測されなかった（表３）。異常および普通の双方の差 フーリエ地図 の中に存在する強い正の密度はこの解を確証する。１５サイクルの最大確度洗練 後、ＲＥＦＭＡＣ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｃ ｅｔ ａｌ．、″Ａｐｐｌｉｃａｔｉ ｏｎ ｏｆ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔｓ ，″ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃ ｔｕｒｅｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ Ｓｔｕｄｙ Ｗｅｅｋｅｎｄ（１９９６））によるシグマ−Ａ加重係数出力を使用して地図 を計算する。Ｏ（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．）を使用して生ずる差密度の中に、 Ｔｒｉａｃ、省略された残基、および水分子５０３、５０４、５３４（Ｔ３との ＴＲ複合体についてのナンバリングコンベンションに従う）を組入れる；これら の残基のコンフォメーションはシミュレートアニーリング省略地図においてさら に確証される（Ｂｒｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．）。次いでＸＰＬＯＲにおいて位 置の最小二乗、シミュレートアニーリング、および拘束、グループ化Ｂ因子の洗 練を使用して、完全なモデルを２３．６％のＲｃｒｙｓｔおよび２４．１％のＲ ｆｒｅｅに洗練する。実施例１１．甲状腺ホルモンレセプターにおけるＱＳＡＲと構造物との接続 古典的甲状腺ホルモンレセプターの定量的構造−活性の関係の結論は下記の通 りである： １）Ｒ₄’のヘキシル基は水素結合ドナーとして機能する； ２）アミノ−プロピオン酸は、カルボキシレートアニオンを通してレセプター からの正に帯電した残基と静電的に相互作用する； ３）Ｒ₃／Ｒ₅置換基の優先性はＩ＞Ｂｒ＞Ｍｅ＞＞Ｈである； ４）Ｒ₃’置換基の優先性はＩｐｒ＞Ｉ＞Ｂｒ＞Ｍｅ＞＞Ｈである。 アゴニスト３，５，３’−トリヨードサイロニン（Ｔ₃）、３，５ −ジブロモ−３’−イソプロピルサイロニン（ＩｐＢｒ₂）、３，５−ジメチル −３’−イソプロピルサイロニン（Ｄｉｍｉｔ）、および３，５，３’−トリヨ ードサイロ酢酸（Ｔｒｉａｃ）の構造は、本発明において提供されるように、下 記のことを可能とする： １）水素結合のレベルにおける結合のレセプターの決定因子の同定; ２）これらの決定因子と古典的甲状腺ホルモンレセプターＱＳＡＲの予測との 関連；および ３）リガンドおよびレセプターの双方について、結合の決定因子が剛性である かどうか、およびどれが柔軟性であるかに関する予測。 型（Ｒ₁＝アミノ−プロピオン酸、アミノ酸；Ｒ₃、Ｒ₅＝Ｉ、Ｂｒ、Ｍｅ；Ｒ₃’ ＝Ｉｐｒ、Ｉ）のアゴニストについてのこの分類を下に記載する（代表的なリガ ンドＴ₃について）。 Ｆ＝基準（常に満足される） Ａ＝調節可能 本明細書において記載する方法およびデータに基づいて、下記は本発明の計算 的方法の１態様であり、これはレセプターＬＢＤのアミノ酸残基の構造と、本明 細書において記載する４つの異なるリガンドとの間の相互作用に基づく核レセプ ターの設計を可能とする。リガンドの小さい分子構造はケンブリッジ構造データ ベース（ＣＳＤ）から得ることができ、そしてこの明細書を通じて記載されてい る方法を使用して、三次元モデルを構築することができる。下記は 合成リガンドの設計において考察すべき因子である。 １）ヒスチジン３８１はＲ₄’ヒドロキシルの水素結合アクセプターとして作 用し、最適な互変異性体は水分子により維持される。 第２３図および第２４図を参照のこと。ヒスチジンは、Ｒ₄’置換基を取り囲む 、この疎水性ポケットにおける唯一の親水性残基である。ヒスチジンは、その互 変異性の状態に依存して、水素結合のアクセプターまたはドナーであることがで きる。それは好ましくは水素結合のドナーであるが、たとえば、リガンドのＲ₄ ’にメトキシが存在するとき、水素結合のアクセプターであることを許容するこ とができる。 ２）アルギニン２２８、２６２および２６６は、Ｒ₁置換基と直接的におよび 水仲介水素結合を通して相互作用し、静電的相互作用はアルギニン２６６により 提供される（Ｔｒｉａｃ複合体におけるように）。この極性ポケットは第２３図 〜第２５図に図解されている。ＴＲαリガンドの結合空洞中のＴ₃は第２３図に 描写されており、ここでＴ３のアミノ−プロピオン酸のＲ１置換基はＡｒｇ２２ ８、ＨＯＨ５０２、ＨＯＨ５０３およびＨＯＨ５０４と水素結合を介して相互作 用する。リガンド結合空洞におけるｔｒｉａｃは第２４図に描写されており、そ のＲ₁の−ＣＯＯＨ置換基は極性ポケットの中に存在する。第２４図において、 Ａｒｇ２２８はリガンドと水素結合をもはや共有しないが、Ｒ₁の−ＣＯＯＨ置 換基はＡｒｇ２６６と水素結合を形成する。第２５図はリガンド結合空洞におい てＴ₃およびｔｒｉａｃを重ね、そしていくつかの位置的に未変化のアミノ酸お よび水分子、および選択した変化した相互作用するアミノ酸および水分子を示す 。３つの図面は、変化することができる極性ポケットの部分、および異なるリガ ンドが結合したとき動かない部分を図解する。たとえば、極性ポケットの上部に おけるＡｒｇ ２６２は、Ｒ₁置換基が−ＣＯＯＨからアミノ−プロピオン酸基に変化したとき でさえ、動かない。しかしながら、他の２つのアルギニン、Ａｒｇ２２８および Ａｒｇ２６６は、極性ポケットにおいてＲ₁置換基の大きさまたは化学的特質の 変化に応答する柔軟性を示す。 ３）Ｒ₃／Ｒ₅置換基のための内側および外側ポケットは、それぞれ、Ｓｅｒ２ ６０、Ａｌａ２６３、Ｉｌｅ２９９；およびＰｈｅ２１８、Ｉｌｅ２２ｌ、Ｉｌ ｅ２２２により形成されている。第２１図および第２２図を参照のこと。内側ポ ケットは、置換基の大きさに無関係に、Ｒ₃またはＲ₅置換基により充填されてお り、そしてレセプターの中にリガンドを位置決めすることによって結合決定因子 として作用することができる。最適には、内側ピークのアミノ酸は、ヨード基よ り長くないＲ₃またはＲ₅置換基と相互作用する。内側ポケットがＲ₃置換基によ り充填されている場合、外側ポケットはＲ₅置換基と相互作用しそして、また、 その逆である。外側ポケットはらせん３（Ｌｙｓ２２０−Ｉｌｅ２２１）におい て破壊の中心となる主鎖の動きを通してその置換基の大きさに調節することがで き、Ｈ３の結合、およびＨ３のＮ−末端部分の動きはリガンドの結合に対して誘 発されたコンフォメーション変化を表すことができることを示唆する。外側ポケ ットは、より大きい置換基を収容することにより、内側ポケットよりも大きい柔 軟性を有する。 ４）Ｒ₃’置換基のためのポケットは、Ｐｈｅ２１５、Ｇｌｙ２９０、Ｍｅｔ ３８８により形成される。このポケットはＲ₃’ヨード置換基により不完全に充 填され、そして柔軟なＭｅｔ３８８側鎖およびＨ７／Ｈ８ループの動きにより、 わずかにより大きい３’−イソプロピル置換基を収容する。このポケットは、イ ソプロピルよりもさらに大きいＲ₃’置換基、たとえば、フェニル基を収容する ことができる。 上記の情報は、自動化ＱＳＡＲ法を改良し、かつ製剤学的鉛化合物のマニュア ルモデル化を教えることによって、高いアフィニティーのアゴニストおよびアン タゴニストの設計を促進するであろう。たとえば、離散水分子を中に含めること により、薬作用発生団の開発とともに使用するための極性ポケット中の水素結合 が完全に説明される；また、レセプター内の移動性および非移動性残基の同定は 、分子の力学的／動力学的計算において使用するための物理的に合理的な拘束を 示唆する。実施例１２．アフィニティーが増加したリガンドの設計 レセプターとリガンドとの間の直接的相互作用は、Ｒ₁置換基と相互作用する 極性ポケットにおいて制限される。相補性の欠如は生物学的調節を暗示すること があるが、それは、また、極性ポケットのアミノ酸と合成リガンドのＲ₁置換基 との間の相互作用を最適化することによって、アフィニティーを増加する機会を 提供する。本明細書において記載するレセプター−リガンドの相互作用の構造は 、２つの相補的修飾を有する、アフィニティーが増加した合成リガンドの設計を 可能とする： １）正に帯電したアミンを除去する。極性ポケットについて予測された強く正 の静電位は、アミノ−プロピオン酸のＲ₁置換基の正に帯電したアミンが結合に 有害であろうことを示唆する。置換に適当な基は近くの水素結合のパターンの特 質により示唆される：たとえば、Ｔｈｒ２７５ＯまたはＳｅｒ２７７Ｎ。たとえ ば、付録２中の表を参照のこと。たとえば、いかなる任意の負に帯電した置換基 も極性ポケットのアミノ酸との相互作用に適合するであろう。これらの置換基は 、０〜４個の炭素を含むカルボキシレート、カルボニル、ホスホネート、および サルフェートを包含する。Ｒ₁置換基の 他の例は、天然に存在するリガンドのアミンを１またはそれ以上のカルボニル基 で置換するオキサミン酸である。 ２）水素結合のアクセプターおよびドナーの基をＲ₁置換基の中に組込んで、 極性ポケットの骨格とのより広い相互作用を提供する。Ｒ₁置換基の中に組込ま れた、このような水素結合のアクセプターおよびドナーの基は、そうでなければ 極性ポケット中の水分子とで起こる相互作用を可能とするであろう。特定の水分 子は下記のものを包含する：ＨＯＨ５０４（Ａｌａ２２５ＯおよびＡｒｇ２６２ ＮＨとの水素結合）；およびＨＯＨ５０３（Ａｓｎ１７９ＯＤ１、Ａｌａ１８０ Ｎとの水素結合）、それらの双方はすべての４つの複合体において存在する（Ｔ ３と複合化したＴＲ ＬＢＤ、ＩｐＢｒ₂と複合化したＴＲ ＬＢＤ、Ｄｉｍｉ ｔと複合化したＴＲ ＬＢＤおよびＴｒｉａｃと複合化したＴＲ ＬＢＤ）。極 性ポケット中の水素結合のネットワークの分析は、ＨＯＨ５０４と水素結合アク セプターとの置換、およびＨＯＨ５０３と水素結合ドナーとの置換を示唆する（ アスパラギンの化学的特質はこの部位における柔軟性を多分可能とするが）。し たがって、ＨＯＨ５０４を置換できるＲ１置換基中の水素結合アクセプターの組 込みまたは位置的にＨＯＨ５０３を置換することができるＲ１置換基中の水素結 合アクセプターの組込み、またはそれらの組み合わせは、新規な合成ＴＲリガン ドを合成する方法である。 これらの２つの設計のアプローチは、表４（下記）中のものを包含する合成リ ガンドを設計するために、別々にまたは組合わせで使用することができる。 このアプローチの必然的な結果は、残基Ａｒｇ２６２およびＡｓｎ１７９に対 する特定の相互作用を設計することである。この目標は、極性ポケット中の水分 子または帯電した残基と水素結合を形成 するＲ₁置換基を有するリガンドを設計することによって、これらの残基に相互 作用を組入れることである。 上に示したビフェニルエーテル骨格構造中の上記置換基の任意の組合わせは、 甲状腺ホルモンレセプターに潜在的に薬理学的に有用なリガンドを生ずることが できる。これらの新規なリガンドは甲状腺レセプターのアンタゴニストであるこ とができる。 本明細書において記載する計算的方法を使用する合成リガンドを 設計する戦略を下記に要約する： たとえば、 Ａ＝水素結合アクセプター Ｄ＝水素結合ドナー Ｏ＝−ＯＨ、−ＣＯ Ｒ１０は−ＯＨ、−ＣＯであることができる。 Ｒ２０は−ＣＯであることができる。 Ｒ３０は−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２であることができる。 また、合成ＴＲリガンドの表を参照のこと。 この明細書に記載したすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物およ び特許出願が特定的にかつ個々に引用することによって本明細書の一部とされる べきであること示すのと同じ程度に、引用することによって本明細書の一部とさ れる。これらの参考文献のレセプターのリガンド、特にＴＲリガンドは引用する ことによって本明細書の一部とされ、そして必要に応じて条件付きで特許請求し て化合物から必要に応じて排除することができる。 題目および副題は読者の便利さのためにのみ提示され、このような題目および 副題の範囲内で使用される用語の意味を解釈するために使用すべきではない。 本発明は完全に記載されたが、明らかなように、本発明の精神および範囲から 逸脱しないで種々の変化および変更が可能である。 付録１ Ａｎｄｒｅａ、Ｔ．Ａ．、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２２、２２ １−２３２（１９７９）。 Ａｎｄｒｅｗｓ、ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，７４１，８９７号、１９８９ 年５月３日発行。 Ａｐｒｉｌｅｔｔ、Ｊ．Ｗ．、Ｂａｘｔｅｒ、Ｊ．Ｄ．、Ｌａｕ、Ｋ．Ｈ．お よびＷｅｓｔ、Ｂ．Ｉ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐ ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ６、３６３−３７０（１９９５）。 Ａｐｔｉｌｅｔｔｉ、Ｊ．Ｗ．、Ｂａｘｔｅｒ、Ｊ．Ｄ．およびＬａｖｉｎ、 Ｔ．Ｎ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、９４０９−９４１７（１９８８） 。 Ａｕ−Ｆｌｉｅｇｎｅｒ、Ｍ．、Ｈｅｌｍｅｒ、Ｅ．、Ｃａｓａｎｏｖａ、Ｊ ．、Ｒａａｋａ、Ｂ．Ｍ．およびＳａｍｕｅｌｓ、Ｈ．Ｈ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ．Ｂｉｏｌ．１３、５７２５−５７３７（１９９３）。 Ｂａｎｉａｈｍａｄ、Ａ．、ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１ ５、７６−８６（１９９５）。 Ｂａｒｅｔｔｉｏｎ、Ｄ．、Ｖｉｖａｎｃｏ Ｒｕｉｚ、Ｍ．Ｍ．およびＳｔ ｕｎｎｅｎｂｅｒｇ、Ｈ．Ｇ．Ｅｍｂｏ Ｊ．１３、３０３９−３０４９（１９ ９４）。 Ｂｅｃｋ−Ｐｅｃｃｏｚ、Ｐ．、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ ｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７８、９９０−９９３（１９９４）。 Ｂｈａｔ、Ｍ．Ｋ．、ＭｃＰｈｉｅ、Ｐ．およびＣｈｅｎｇ、Ｓ．Ｙ．、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１０、４６４−４７１ （１９９５）。 Ｂｌａｋｅ、Ｃ．Ｃ．およびＯａｔｌｅｙ、Ｓ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ ２６８ 、１１５−１２０（１９７７）。 Ｂｌａｋｅ、Ｃ．Ｃ．、Ｇｃｉｓｏｗ、Ｍ．Ｊ．、Ｏａｔｌｃｙ、Ｓ．Ｊ．、 Ｒｅｒａｔ、Ｂ．およびＲｅｒａｔ、Ｃ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２１、３ ３９−３５６（１９７８）。 Ｂｏｕｒｇｕｅｔ、Ｗ．、Ｒｕｆｆ、Ｍ．、Ｃｈａｍｂｏｎ、Ｐ．、Ｇｒｏｎ ｅｍｅｙｅｒ、Ｈ．およびＭｏｒａｓ、Ｄ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７５、３７７− ３８２（１９９５）。 Ｂｒｅｎｔ、Ｇ．Ａ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１、８４７−８５３ （１９９４）。 Ｂｒｕｎｇｅｒ、Ａ．Ｔ．、Ｋｕｒｉｙａｎ、Ｊ．およびＫａｒｐｌｕｓ、Ｍ ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５、４５８−４６０（１９８７）。 Ｃａｓａｎｏｖａ、Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４ 、５７５６−５７６５（１９９４）。 Ｃａｖａｏｌｌｅｓ、Ｖ．、ｅｔ ａｌ．、Ｅｍｂｏ Ｊ．１４、３７４１− ３７５１（１９９５）。 Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２８４，９９９号、１９９４年２月 ８日発行。 Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ ，Ｎ．４、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０、７６０−７６３（１９ ９４）。 Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ、Ｔ．Ｎ．、Ａｄａｍｓ，Ｍ．、Ｔｏｎｅ、Ｙ．およ びＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ、Ｖ．Ｋ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８、１２ ６２−１２７７（１９９４）。 Ｃｏｗｔａｎ、Ｋ．、Ｊｏｉｎｔ ＣＣＰ４ ａｎｄ ＥＳＦ− ＥＡＣＢＭ Ｎｅｗｓｌｅｔｅｒ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙ ｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ３１、 ３４−３８（１９９４）。 Ｄａｍｍ、Ｋ．およびＥｖａｎｓ、Ｒ．Ｍ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、１０６６８−１０６７２（１９９３）。 Ｄａｎｉｅｌｉａｎ、Ｐ．Ｓ．、Ｗｈｉｔｅ、Ｒ．、Ｌｅｅｓ、Ｊ．Ａ．およ びＰａｒｋｅｒ、Ｍ．Ｇ．、Ｅｍｂｏ Ｊ．１１、１０２５−１０３３（１９９ ２）。 Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，３２２，９３３号、１９９４年 ６日２１日発行。 Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，４６６，８６１号、１９９５年 １１月１４日発行。 ＤｅＧｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，４３８，１２６号、１９９５ 年８月１日発行。 Ｄｉｅｔｒｉｃｈ、Ｓ．Ｗ．、Ｂｏｌｇｅｒ、Ｍ．Ｂ．、Ｋｏｌｌｍａｎ、Ｐ ．Ａ．およびＪｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ｅ．Ｃ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０、８ ６３−８８０（１９９７）。 Ｄｕｒａｎｄ、Ｂ．、ｅｔ ａｌ．、Ｅｍｂｏ Ｊ．１３、５３７０−５３８ ２（１９９４）。 Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，７６６，１２１号、１９８８年８ 月２３日発行。 Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８２６，８７６号、１９８９年５ 月２日発行。 Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，９１０，３０５号、１９９０年３ 月２０日発行。 Ｅｍｍｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，０６１，７９８号、１９９１ 年１０月２９日発行。 Ｅｖａｎｓ、Ｒ．Ｍ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、８８９−８９ ５（１９８８）。 Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，１７１，６７１号、１９９２年１ ２月１５日発行。 Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，３１２，７３２号、１９９４年５ 月１７日発行。 Ｆａｗｅｌｌ、Ｓ．Ｅ．、Ｌｅｅｓ、Ｊ．Ａ．、Ｗｈｉｔｅ、Ｒ．およびＰａ ｒｋｅｒ、Ｍ．Ｇ．、Ｃｅｌｌ ６０、９５３−９６２（１９９０）。 Ｆｏｒｍａｎ、Ｂ．Ｍ．およびＳａｍｕｅｌｓ、Ｈ．Ｈ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ ｃｒｉｎｏｌ．４、１２９３−１３０１（１９９０）。 Ｇｅｗｉｔｈ、Ｄ．Ｔ．およびＳｉｇｌｅｒ、Ｐ．Ｂ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔ ｒｕｃｔｕｒａ１ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２、３８６−３９４（１９９５）。 Ｇｌａｓｓ、Ｃ．Ｋ．、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１５、３９１−４０７（１９ ９４）。 Ｈａｙａｓｈｉ、Ｙ．、Ｓｕｎｔｈｏｒｎｔｈｅｐｖａｒａｋｕｌ、Ｔ．およ びＲｅｆｅｔｏｆｆ、Ｓ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４、６０７−６１ ５（１９９４）。 Ｊｏｎｅｓ、Ｔ．Ａ．、Ｚｏｕ、Ｊ．Ｙ．、Ｃｏｗａｎ、Ｓ．Ｗ．およびＫｊ ｅｌｄｇａａｒｄ、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ａ４７、１１０−１１ ９（１９９１）。 Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、Ｅ．Ｃ．、ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｌｉ．Ｃ．Ｈ．編）１０７−２０４（Ａｃａｄｅ ｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８）。 Ｋａｂｓｃｈ、Ｗ．、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ２６、７９５−８００（１９９３）。 Ｋａｂｓｃｈ、Ｗ．およびＳａｎｄｅｒ、Ｃ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２ 、２５７７−２６３７（１９８３）。 Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ、 Ｒ．Ａ．、Ｍａｃａｒｔｈｕｒ、Ｍ．Ｗ．、Ｍｏｓｓ 、Ｄ．Ｓ．およびＴｈｏｒｎｔｏｎ、Ｊ．Ｍ．、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｌｏｇｒ．２６、２８３−２９１〔１９９３）。 Ｌａｔｈａｍ、Ｋ．Ｒ．、Ａｐｒｉｌｅｔｔｉ、Ｊ．Ｗ．、Ｅｂｅｒｈａｒｄ ｔ、Ｎ．Ｌ．およびＢａｘｔｅｒ、Ｊ．Ｄ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６ 、１２０８８−１２０９３（１９８１）。 Ｌａｕｄｅｔ、Ｖ．、Ｈａｎｎｉ、Ｃ．、Ｃｏｌｌ、Ｊ．、Ｃａｔｚｅｆｌｉ ｓ、Ｆ．およびＳｔｅｈｅｌｉｎ、Ｄ．、ＥｍｂｏＪ．１１、１００３−１０１ ３（１９９２）。 ＬｅＤｏｕａｒｉｎ、Ｂ．、ｅｔ ａｌ．、Ｅｍｂｏ Ｊ．１４、２０２０− ２０３３（１９９５）。 Ｌｅｅ、Ｊ．Ｗ．、Ｒｙａｎ、Ｆ．、Ｓｗａｆｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ｃ．、Ｊｏｈ ｎｓｔｏｎ、Ｓ．Ａ．およびＭｏｏｒｅ、Ｄ．Ｄ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７４、９ １−９４（１９９５）。 Ｌｅｅ、Ｊ．Ｗ．、Ｃｈｏｉ、Ｈ．Ｓ．、Ｇｙｕｒｉｓ、Ｊ．、Ｂｒｅｎｔ、 Ｒ．およびおよびＭｏｏｒｅ、Ｄ．Ｄ．、Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ９、２４３−２５４（１９９５）。 Ｌｅｅｓｏｎ、Ｐ．Ｄ．、Ｅｍｍｅｔｔ、Ｊ．Ｃ．、Ｓｈａｈ、Ｖ．Ｐ．、Ｓ ｈｏｗｅｌｌ、Ｇ．Ａ．、Ｎｏｖｅｌｌｉ、Ｒ．、Ｐｒａｉｎ、Ｈ．Ｄ．、Ｂｅ ｎｓｏｎ、Ｍ．Ｇ．、Ｅｌｌｉｓ、Ｄ．、Ｐｅａｒｃｅ、Ｎ．Ｊ．およびＵｎｄ ｅｒｗｏｏｄ、Ａ．Ｈ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２、３２０−３３６（１９ ８９）。 Ｌｅｅｓｏｎ、Ｐ． Ｄ．、Ｅｌｌｉｓ、Ｄ．、Ｅｍｍｅｔｔ、Ｊ．Ｄ．、Ｓ ｈａｈ、Ｖ．Ｐ．、Ｓｈｏｗｅｌｌ、Ｇ．Ａ．およびＵｎｄｅｒｗｏｏｄ、Ａ． Ｈ．、Ｊ．Ｌｅｎｇ、Ｘ．、ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５ 、２５５−２６３（１９９５）。 Ｌｅｎｇ、Ｘ．、Ｔｓａｉ、Ｓ．Ｙ．、Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ、Ｂ．Ｗ．およびＴ ｓａｉ、Ｍ．Ｊ．、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４６、６４３−６６１（１９９３）。 Ｌｉｎ、Ｋ．Ｈ．、Ｐａｒｋｉｓｏｎ、Ｃ．、ＭｃＰｈｉｅ、Ｐ．およびＣｈ ｅｎｇ、Ｓ．Ｙ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５、４８５−４９２（１９ ９１）。 Ｌｕｉｓｉ、Ｂ．Ｆ．、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３５２、４９７−５０ ５（１９９１）。 ＭｃＧｒａｔｈ、Ｍ．Ｅ．、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３７、 ２３６−２３９（１９９４）。 ＭｃＲｅｅ、Ｄ．Ｅ．、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ＰｒｏｔｅｉｎＣｒｙｓｔａｌ ｌｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９ ３）、特にｃｈａｐｔｅｒｓｌ、２および３。 Ｍｅｉｅｒ、Ｃ．Ａ．、ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６、 ２４８−２５８（１９９２）。 Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，１１６，８２８号、１９９２年５ 月２６日発行。 Ｍｏｎａｃｏ、Ｈ．Ｌ．、Ｒｉｚｚｉ、Ｍ．およびＣｏｄａ、Ａ．Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２６８、１０３９−１０４１（１９９５）。 Ｎｉｃｈｏｌｌｓ、Ａ．、Ｓｈａｒｐ、Ｋ．Ａ．およびＨｏｎｉｇ、Ｂ．、Ｐ ｒｏｔｅｉｎｓ １１、２８１−２９６（１９９１） 。 Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、Ａ．Ｌ．、Ｒｏｓｅｎ、Ｅ．Ｄ．、Ｄａｒｌｉｎｇ、Ｄ ．Ｓ．およびＫｏｅｎｉｇ、Ｒ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５、９ ４−９９（１９９１）。 Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ、Ｚ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆｔｈｅ ＣＣＰ ４ Ｓｔｕｄｙ Ｗｅｅｋｅｎｄ ８０−８６（ＳＥＲＣ Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｕ．Ｋ．１９９１）。 Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ、Ｚ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆｔｈｅ ＣＣ Ｐ４ Ｓｔｕｄｙ Ｗｅｅｋｅｎｄ：″Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎ ｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ″５６−６２（ＳＥＲＣ Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｕ．Ｋ．１９９３）。 Ｏｚａｔｏ、米国特許第５，４０３，９２５号、１９９５年４月４日発行。 Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄ、Ｒ．、Ｐｅｒｉｍａｎｎ、Ｔ．、Ｅｖａｎｓ、Ｒ．Ｍ ．およびＳｉｇｌｅｒ、Ｐ．Ｂ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７５、２０３−２１１（１ ９９５）。 Ｒｅｆｅｔｏｆｆ、Ｓ．、Ｗｅｉｓｓ、Ｒ．Ｅ．およびＵｓａｌａ、Ｓ．Ｊ． 、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１４、３４８−３９９（１９９３）。 Ｒｉｂｅｉｒｏ、Ｒ．Ｃ．Ｊ．、Ｋｕｓｈｎｅｒ、Ｐ．Ｊ．およびＢａｘｔｅ ｒ、Ｊ．Ｄ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４６、４４３−４５３（１９９５） 。 Ｒｉｂｅｉｒｏ、Ｒ．Ｃ．Ｊ．、ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．７５８、３６６−３８９（１９９５）。 Ｒｉｂｅｉｒｏ、Ｒ．Ｃ．Ｊ．、Ｋｕｓｈｎｅｒ、Ｐ．Ｊ．、Ａ ｐｒｉｌｅｔｔｉ、Ｊ．Ｗ．、Ｗｅｓｔ、Ｂ．Ｌ．およびＢａｘｔｅｒ、Ｍｏｌ ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６、１１４２−１１５２（１９９２）。 Ｓａａｔｃｉｏｇｌｕ、Ｆ．、Ｂａｒｔｕｎｅｋ、Ｐ．、Ｄｅｎｇ．Ｔ．、Ｚ ｅｎｋｅ、Ｍ．およびＫａｒｉｎ、Ｍ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３、 ３６７５−３６８５（１９９３）。 Ｓｃｈｗａｂｅ、Ｊ．Ｗ．、Ｃｈａｐｍａｎ、Ｌ．、Ｆｉｎｃｈ、Ｊ．Ｔ．お よびＲｈｏｄｅｓ、Ｄ．、Ｃｅｌｌ ７５、５６７−５７８（１９９３）。 Ｓｔｅｍｉ、Ｓ．およびＳａｍｕｅｌｓ、Ｈ．Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ．２６６、１１５８９−１１５９３（１９９１）。 Ｓｗａｆｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ｃ．、Ｍｅｌｃｈｅｒ、Ｋ．およびＪｏｈｏｎｓｔ ｏｎ、Ｓ．Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７４、８８−９１（１９９５）。 Ｔｏｎｅｙ、Ｊ．Ｈ．、ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２、２ −６（１９９３）。 Ｔｓａｉ、Ｍ．Ｊ．およびＯ’Ｍａｌｌｅｙ、Ｂ．Ｗ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３、４５１−４８６（１９９４）。 Ｚｅｎｋｅ、Ｍ．、Ｍｕｎｏｚ、Ａ．、Ｓａｐ．Ｊ．、Ｖｅｎｎｓｔｒｏｍ、 Ｂ．およびＢｅｕｇ、Ｈ．、Ｃｅｌｌ ６１、１０３５−１０４９（１９９０） 。 付録２ Ｄｉｍｉｔと甲状腺ホルモンレセプターのアミノ酸との相互作用 表ＸＸに対する凡例。この表にはＤｉｍｉｔ（ＤＭＴ）との相互作用が列挙され ている。列の題目は下記の通りである： ＃１ レセプターのアミノ酸と相互作用するＤｉｍｉｔの原子。また、これらに は第１０図において番号が付されている。 ＃２ リガンドと相互作用する全長のｒＴＲα中のアミノ酸。 ＃３ 相互作用が起こるアミノ酸中の原子の名称（標準的命名法）。 ＃４ Ｄｉｍｉｔとタンパク質の原子との間の距離（Å）。 表ＸＸに対する凡例。この表にはｔｒｉａｃとの相互作用が列挙されている。列 の題目は下記の通りである： ＃１ レセプターのアミノ酸と相互作用するｔｒｉａｃの原子。また、これらに は第１０図において番号が付されている。 ＃２ リガンドと相互作用する全長のｒＴＲα中のアミノ酸。 ＃３ 相互作用が起こるアミノ酸中の原子の名称（標準的命名法）。 ＃４ ｔｒｉａｃとタンパク質の原子との間の距離（Å）。 表ＸＸに対する凡例。この表にはＩｐＢｒ₂との相互作用が列挙されている。列 の題目は下記の通りである： ＃１ レセプターのアミノ酸と相互作用するＩｐＢｒ₂の原子。また、これらに は第１０図において番号が付されている。 ＃２ リガンドと相互作用する全長のｒＴＲα中のアミノ酸。 ＃３ 相互作用が起こるアミノ酸中の原子の名称（標準的命名法）。 ＃４ ＩｐＢｒ₂とタンパク質の原子との間の距離（Å）。 表ＸＸに対する凡例。この表にはＴ３との相互作用が列挙されている。列の題目 は下記の通りである： ＃１ レセプターのアミノ酸と相互作用するＴ３の原子。また、これらには第１ ０図において番号が付されている。 ＃２ リガンドと相互作用する全長のｒＴＲα中のアミノ酸。 ＃３ 相互作用が起こるアミノ酸中の原子の名称（標準的命名法）。 ＃４ Ｔ３とタンパク質の原子との間の距離（Å）。 甲状腺ホルモンおよびＤｉｍｉｔの配位結合構造甲状腺ホルモンおよびＴｒｉａｃの配位結合構造甲状腺ホルモンおよびＩｐＢｒ₂の配位結合構造甲状腺ホルモンおよびＴ３の配位結合構造

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バクスター，ジョン ディー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94127, サンフランシスコ，サン パブロ アベニ ュー 131 (72)発明者 フレッテリック，ロバート ジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94131, サンフランシスコ，クリストファー アベ ニュー 15 (72)発明者 ワグナー，リチャード エル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94117, サンフランシスコ，ウォーラー ストリー ト 1704 (72)発明者 クッシュナー，ピーター ジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94122, サンフランシスコ，シックスス アベニュ ー 1362 (72)発明者 アプリレティ，ジェイムス エル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94702, バークレー，バージニア ガーデンズ 11 (72)発明者 ウエスト，ブライアン エル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94110, サンフランシスコ，アンダーソン ストリ ート 142 (72)発明者 シオウ，アンドリュー ケイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94122, サンフランシスコ，ヒューゴ ストリート 34

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１）ＴＲ ＬＢＤおよびＴＲ ＬＢＤリガンドまたは ２）ＴＲ ＬＢＤリガンドを含まないＴＲ ＬＢＤ、 を含んでなるＴＲ ＬＢＤの結晶であって、前記結晶は少なくとも２．０〜３． ０オングストロームの分解能で回折し、そしてその単位セルディメンジョンの５ ％以内の結晶安定性を有するＴＲ ＬＢＤの結晶。 ２．前記ＴＲ ＬＢＤが少なくとも２００アミノ酸を有する、請求項１に記載 の結晶。 ３．前記ＴＲ ＬＢＤがラットＴＲ−αのＴＲアミノ酸配列１２０−４１０、 ラットＴＲ−αのＴＲアミノ酸配列１５７−４１０およびヒトＴＲ−βのＴＲア ミノ酸配列２０２−４６１から成る群より選択されるＴＲタンパク質からのもの である、請求項２に記載の結晶。 ４．ＴＲ ＬＢＤリガンドが下記式で表される請求項２に記載の結晶： 式中、 Ｒ₁は−Ｏ−ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ、−ＮＨＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ 、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ（ＮＨ₂、Ｃ Ｏ₂Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨＣＯＣＨφ₂］ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨＣＯ（Ｃ Ｈ₂）₁₅ＣＨ₃］ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨ−ＦＭＯＣ］ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ ［ＮＨ−ｔＢＯＣ］ＣＯ₂Ｈ、または０〜３炭素の リンカーで環に接続したカルボキシレート、−ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂、− ＣＨ₂ＣＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ＣＨＮＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨＣＯＣＨ φ₂］ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₁₅ＣＨ₃］ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ ＣＨ［ＮＨ−ＦＭＯＣ］ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨ−ｔＢＯＣ］ＰＯ₃Ｈ₂、 または０〜３炭素のリンカーで環に接続したホスフェートまたはホスホネート、 −ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨ₂ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨＮＨ₂ＳＯ₃Ｈ 、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨＣＯＣＨφ₂］ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）_{1 5} ＣＨ₃］ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨ−ＦＭＯＣ］ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨ −ｔＢＯＣ］ＳＯ₃Ｈ、または０〜３炭素のリンカーで環に接続したサルフェー トまたはサルファイトであるか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメイン におけるＴ３のＣＨ₂ＣＨ（ＮＨ₂）ＣＯ₂Ｈの機能的同等物として作用し、ここ で前記Ｒ₁はアミンで置換されることができ、 Ｒ₂は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＨ、−ＣＨ₃または− Ｅｔであるか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメインにおけるＨの機能 的同等物として作用し、 Ｒ₃は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｎ₃、−ＳＨ、−ＣＨ₃ または−Ｅｔであるか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメインにおける Ｉの機能的同等物として作用し、 Ｒ₅は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｎ₃、−ＳＨ、−ＣＨ₃ または−Ｅｔであるか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメインにおける Ｉの機能的同等物として作用し、そしてＲ₃はＲ₅と同一であることができ、 Ｒ₆は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＨまたは−ＣＨ₃であ るか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメ インにおけるＨの機能的同等物として作用し、そしてＲ₂はＲ₆と同一であること ができ、 Ｒ₂’は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｎ₃、−ＳＨ、−ＣＨ₃ または−Ｅｔであるか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメインにおけ るＨの機能的同等物として作用し、 Ｒ₃’は任意の疎水性基であり、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＳＨ、アルキル、アリ ール、５もしく６員のヘテロサイクルまたはシアノを包含するか、あるいはＴＲ に結合するとき分子認識ドメインにおけるＩの機能的同等物として作用し、 Ｒ₄’は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨ₃、−Ｎ（ＣＨ₃ ）₃、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェート、− ＳＨ、−ＣＨ₃、−Ｅｔ、またはアルキル、アリールまたはＲ₄’位においてＯも しくはＮもしくはＳに尿素もしくはカルバメート結合を通して結合した５もしく ６員のヘテロサイクル芳香族であるか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ド メインにおけるＯＨの機能的同等物として作用し、 Ｒ₅’は−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｎ（ＣＨ₃）₂、−ＳＨ、−ＮＨ₃、−Ｎ（ ＣＨ₃）₂、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェート、サルフェート、ｌ 〜９個の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは直鎖状のアルキル、置換もしくは非 置換のアリール（ここで前記置換アリールはハロゲンまたは１〜５個の炭素を有 するアルキルで置換されており、そして前記アリールは環に−ＣＨ₂−により接 続されていてもよい）、５〜６個の炭素原子を有する芳香族ヘテロサイクル（こ こで前記ヘテロサイクルは−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＨ、−ＮＨ₃、−Ｎ（ＣＨ₃）₃ 、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェート、サルフェート、ヘテロアル キル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ポリ芳香族またはポリヘテ ロ 芳香族から選択される１または２以上の基で置換されることができる）、ヘテロ アルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ポリ芳香族、またはポ リヘテロ芳香族（ここで前記Ｒ₅’は極性基または帯電した基で置換されること ができる）であり、 Ｒ₆’は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＨ、−ＣＨ₃または −Ｅｔであるか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメインにおけるＨの機 能的同等物として作用し、 ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ₂、ＮＨ、ＮＲ₇、ＣＨ₂、ＣＨＲ₇またはＣＲ₇Ｒ₇であり、こ こでＲ₇はアルキル、アリールまたは５もしくは６員のヘテロサイクル芳香族で あり、そして 前記ＴＲ ＬＢＤリガンドは１μＭまたはそれより小さいＴＲＬＢＤへの結合 の見掛けＫｄを有する。 ５．ＴＲ ＬＢＤリガンドの前記結晶が下記の単位セルディメンジョン（オン グストローム）を有する、請求項２に記載の結晶：１２０．００±２％度のβ角 および単斜晶系空間群Ｃ２において、ａ＝１１７．００±２％、ｂ＝８０．００ ±２％、ｃ＝６３．００±２％。 ６．前記結晶が前記ＴＲ ＬＢＤリガンドを配位結合し、そして前記結晶が下 記の性質の組の１つを有する、請求項５に記載の結晶： １）単位セルディメンジョン（オングストローム）：１２０．５８度のβ角お よび単斜晶系空間群Ｃ２、２．２オングストロームの分解能および８７．０％の 完全性値において、ａ＝１１７．１６、ｂ＝８０．５２、ｃ＝６３．２１、 ２）単位セルディメンジョン（オングストローム）：１２０．６０度のβ角お よび単斜晶系空間群Ｃ２、２．０オングストロームの分解能および８２．４％の 完全性値において、ａ＝１１７．１９、 ｂ＝８０．２０、ｃ＝６３．２３、および ３）単位セルディメンジョン（オングストローム）：１２０．６９度のβ角お よび単斜晶系空間群Ｃ２、２．２オングストロームの分解能および９３．７％の 完全性値において、ａ＝１１７．１８、ｂ＝８０．１２、ｃ＝６３．１３。 ７．前記結晶がヒトタンパク質をさらに含んでなる、請求項２に記載の結晶。 ８．前記結晶が下記の単位セルディメンジョン（オングストローム）：９０． ００°のα角、９０．００°のβ角および１２０．００°のγ角において、ａ＝ ｂ＝６８．４４８±２％およびｃ＝１３０．５５９±２％を有し、そして三方空 間群ｐ３（１）２１を有する、請求項７に記載の結晶。 ９．前記結晶がヒトタンパク質をさらに含んでなる、請求項８に記載の結晶。 １０．下記工程： １）結合したリガンドをもつ核レセプターＬＢＤを含んでなる結晶化タンパク 質の三次元モデルを使用して、前記結合したリガンドの少なくとも１つの第１化 学的部分と相互作用する核レセプターＬＢＤの少なくとも１つの相互作用するア ミノ酸を決定し、そして ２）前記第１化学的部分の少なくとも１つの化学的修飾を選択して第２化学的 部分を生成する、前記第２化学的部分は、前記相互作用するアミノ酸と前記第１ 化学的部分との間の前記相互作用に比較して、前記相互作用するアミノ酸と前記 第２化学的部分との間の相互作用を減少または増加する構造を有する、 を含んでなる核レセプター合成リガンドを設計する計算的方法。 １１．工程１および２を反復する、請求項１０に記載の方法。 １２．結合したＴＲリガンドをもつＴＲ ＬＢＤを含んでなる前 記結晶化タンパク質の前記三次元モデルを発生させることをさらに含む、請求項 １０に記載の方法。 １３．同形(isomorphous)リガンド誘導体を比較して改良されたフェージング を生成することによって、前記三次元モデルを発生させる、請求項１２に記載の 方法。 １４．サイロニン誘導体のＲ５、Ｒ３、’Ｒ５および’Ｒ３位の少なくとも１ つのをＢｒまたはＩで置換することによって、前記同形(isomorphous)リガンド 誘導体を形成する、請求項１３に記載の方法。 １５．前記第１化学的部分の化学的修飾後において、前記相互作用するアミノ 酸と前記リガンドとの間の相互作用の変化を決定することをさらに含む、請求項 １４に記載の方法。 １６．前記選択において、付録２に列挙する前記相互作用するアミノ酸の少な くとも１つのと相互作用する前記第１化学的部分を使用する、請求項１２に記載 の方法。 １７．前記化学的修飾が、前記第１化学的部分および前記相互作用するアミノ 酸と比較して前記第２化学的部分と前記相互作用するアミノ酸との間の水素結合 の相互作用、電荷の相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールスの相互作用 または双極子相互作用を増強する、請求項１６に記載の方法。 １８．前記化学的修飾が、前記第１化学的部分および前記相互作用するアミノ 酸と比較して前記第２化学的部分と前記相互作用するアミノ酸との間の水素結合 の相互作用、電荷の相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールスの相互作用 または双極子相互作用を減少させる、請求項１７に記載の方法。 １９．前記第１化学的部分が少なくとも１つの遠いアミノ酸から少なくとも４ ．５オングストロームだけ離れており、そして前記遠 いアミノ酸が請求項１７に列挙する前記相互作用するアミノ酸のいずれでもない 、請求項１８に記載の方法。 ２０．前記第１化学的部分が遠いアミノ酸から６〜１２オングストロームだけ 離れている、請求項１８に記載の方法。 ２１．前記化学的修飾が前記遠いアミノ酸に向かって延びており、そして前記 第２化学的部分と前記遠いアミノ酸との間の水素結合の相互作用、電荷の相互作 用、疎水性相互作用、ファンデルワールスの相互作用または双極子相互作用を生 成する、請求項１９に記載の方法。 ２２．前記化学的修飾が前記遠いアミノ酸と他のアミノ酸との結合を立体障害 するが、前記相互作用するアミノ酸を立体障害しない、請求項１９に記載の方法 。 ２３．前記化学的修飾後において前記相互作用するアミノ酸と前記リガンドと の間の相互作用を決定することをさらに含み、ここで前記相互作用するアミノ酸 およびリガンドの化学的構造を表すコンピュータープログラムを使用して、前記 決定および修飾を実行する、請求項１７または１９に記載の方法。 ２４．前記化学的修飾はサイロニン誘導体のＲ₅’位に存在する、請求項２２ に記載の方法。 ２５．前記化学的修飾が活性化らせん機能を立体障害する、請求項２４に記載 の方法。 ２６．前記化学的修飾が前記相互作用するアミノ酸と前記リガンドのＲ１〜６ 位の原子との間の相互作用を妨害しない、請求項２５に記載の方法。 ２７．前記活性化らせんがらせんＨ１２である、請求項２６に記載の方法。 ２８．前記化学的修飾が平面構造を含み、前記平面構造は前記サ イロニン誘導体の主要なリングの平面から少なくとも３０°で突出する少なくと も３個の炭素原子のアルキルに等しい長さを有する、請求項２７に記載の方法。 ２９．前記核レセプターのＬＢＤアミノ酸配列を使用し、かつ結合したＴＲ ＬＢＤリガンドをもつＴＲ ＬＢＤを含んでなる前記結晶化タンパク質を使用し て、ＴＲ以外の核レセプターの前記三次元モデルを発生させることをさらに含む 、請求項１０に記載の方法。 ３０．前記化学的修飾が、前記第１化学的部分および前記相互作用するアミノ 酸と比較して前記第２化学的部分と前記相互作用するアミノ酸との間の水素結合 の相互作用、電荷の相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールスの相互作用 または双極子相互作用を増強する、請求項２９に記載の方法。 ３１．前記化学的修飾が、前記第１化学的部分および前記相互作用するアミノ 酸と比較して前記第２化学的部分と前記相互作用するアミノ酸との間の水素結合 の相互作用、電荷の相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールスの相互作用 または双極子相互作用を減少させる、請求項３０に記載の方法。 ３２．前記化学的修飾が前記第１化学的部分のみを有し、前記第１化学的部分 が少なくとも１つの遠いアミノ酸から少なくとも３オングストロームだけ離れて おり、そして前記遠いアミノ酸が前記相互作用するアミノ酸と異なる、請求項３ １に記載の方法。 ３３．前記第１化学的部分が遠いアミノ酸から４〜１２オングストロームだけ 離れている、請求項３２に記載の方法。 ３４．前記化学的修飾が前記遠いアミノ酸に向かって延びており、そして前記 第２化学的部分と前記遠いアミノ酸との間の水素結合の相互作用、電荷の相互作 用、疎水性相互作用、ファンデルワール スの相互作用または双極子相互作用を生成する、請求項３３に記載の方法。 ３５．前記化学的修飾が前記遠いアミノ酸と他のアミノ酸との結合を立体障害 するが、前記相互作用するアミノ酸を立体障害しない、請求項３４に記載の方法 。 ３６．前記第１化学的部分がＣ−ＨまたはＣ−ＯＨを含んでなる、請求項３５ に記載の方法。 ３７．前記第２化学的部分が少なくとも４個の二重結合した炭素の長さおよび 少なくとも４個の二重結合した炭素の体積に等しい最長の実在物を含んでなる、 請求項３６に記載の方法。 ３８．下記工程： １）核レセプターＬＢＤを含んでなる結晶化タンパク質の三次元モデルを使用 して、核レセプターのアゴニストの分子認識ドメインの構造を決定し、そして ２）前記アゴニストの結合部位を越えて延びかつ核レセプター機能において重 要な少なくとも１つのタンパク質の方向に延びるリガンド構造を提供する前記ア ゴニストの少なくとも１つの化学的修飾を選択する、からなる核レセプターのア ゴニストを設計する計算的方法。 ３９．前記タンパク質ドメインが、 ａ）前記ＬＢＤの転写活性化ドメイン、 ｂ）前記ＬＢＤのレセプター結合ドメイン、 ｃ）前記核レセプターのＤＮＡ結合ドメイン、 ｄ）前記核レセプターの熱ショックタンパク質結合ドメイン、 ｅ）前記ＬＢＤの二量化ドメイン、または ｆ）前記ＤＮＡ結合ドメインに対するヒンジ領域、 である、請求項３８に記載の方法。 ４０．前記結晶化タンパク質が核レセプターのリガンドに結合した前記核レセ プターＬＢＤを含んでなる、請求項３８に記載の方法。 ４１．結合したＴＲリガンドをもつＴＲ ＬＢＤを含んでなる前記結晶化タン パク質の前記三次元モデルを発生させることをさらに含む、請求項４０に記載の 方法。 ４２．前記三次元モデルがＴＲ ＬＢＤについてものである、請求項４０に記 載の方法。 ４３．前記核レセプターのＬＢＤアミノ酸配列を使用して、ＴＲ以外の核レセ プターの前記三次元モデルを発生させることをさらに含む、請求項４１に記載の 方法。 ４４．前記三次元モデルがＥＲ ＬＢＤのモデルである、請求項３９に記載の 方法。 ４５．ＬＢＤがグルココルチコイドのレセプター、エストロゲンのレセプター 、レチノイドのレセプターおよびビタミンＤのレセプターから成る群より選択さ れる、請求項４２に記載の方法。 ４６．前記化学的修飾が、アゴニストの前記分子認識ドメインとの水素結合の 相互作用、電荷の相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールスの相互作用ま たは双極子相互作用に比較して、前記分子認識ドメインと前記アンタゴニストと の間の水素結合の相互作用、電荷の相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワー ルスの相互作用または双極子相互作用の喪失を最小とする、請求項３９に記載の 方法。 ４７．前記化学的修飾が、アゴニストの前記分子認識ドメインとの水素結合の 相互作用、電荷の相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールスの相互作用ま たは双極子相互作用に比較して、前記分子認識ドメインと前記アンタゴニストと の間の水素結合の相互作用 、電荷の相互作用、疎水性相互作用または双極子相互作用を減少させるが、前記 化学的修飾は１００ｎＭのＫｄまたはそれより小さいアフィニティーで前記アン タゴニストが前記核レセプターと結合するのをなお可能とする、請求項３９に記 載の方法。 ４８．前記分子認識ドメインが少なくとも１つの遠いアミノ酸から少なくとも ３オングストロームだけ離れており、そして前記遠いアミノ酸が前記分子認識ド メインの結合に対して有意に寄与しない、請求項３９または４７に記載の方法。 ４９．前記第１分子認識ドメインが遠いアミノ酸から４〜１２オングストロー ムだけ離れている、請求項４８に記載の方法。 ５０．前記化学的修飾が前記遠いアミノ酸に向かって延びており、そして前記 遠いアミノ酸と前記分子認識ドメインとの間の水素結合の相互作用、電荷の相互 作用、疎水性相互作用、ファンデルワールスの相互作用または双極子相互作用を 生成する、請求項４９に記載の方法。 ５１．前記化学的修飾が前記遠いアミノ酸と他のアミノ酸との結合を立体障害 するが、前記分子認識ドメインに結合するアミノ酸を立体障害しない、請求項５ ０に記載の方法。 ５２．前記リガンドの前記化学的修飾がＣ−ＨまたはＣ−ＯＨに存在する、請 求項５１に記載の方法。 ５３．前記第２化学的部分が少なくとも４個の二重結合した炭素の長さに等し い実在物から成り、そして少なくとも４個の二重結合した炭素の長さの体積を有 する、請求項５２に記載の方法。 ５４．前記三次元モデルが二次元で表される、請求項４４に記載の方法。 ５５．下記工程： １）結合したリガンドをもつ核レセプターＬＢＤを含んでなる結 晶化タンパク質の三次元モデルを使用して、前記リガンドの少なくとも１つの第 １化学的部分と相互作用する核レセプターＬＢＤの少なくとも１つの相互作用す るアミノ酸を決定し、そして ２）前記第１化学的部分の少なくとも１つの化学的修飾を選択して第２化学的 部分を生成する、前記第２化学的部分は、前記相互作用するアミノ酸と前記第１ 化学的部分との間の前記相互作用に比較して、前記相互作用するアミノ酸と前記 第２化学的部分との間の相互作用を減少または増強する構造を有する、からなる 核レセプター超アゴニストまたはアンタゴニストを設計する計算的方法。 ５６．前記化学的修飾が、前記第１化学的部分および前記相互作用するアミノ 酸と比較して前記第２化学的部分と前記相互作用するアミノ酸との間の水素結合 の相互作用、静電相互作用、電荷の相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワー ルスの相互作用または双極子相互作用を増強する、請求項５５に記載の方法。 ５７．前記化学的修飾が前記第１化学的部分のカルボキシレート部分をホスホ ネートまたはホスフェートに変化させて前記第２化学的部分を作る、請求項５５ に記載の方法。 ５８．前記核レセプターがＴＲであり、そして前記化学的修飾が前記第２化学 的部分と下記のアルギニンの少なくとも１つのとの間の前記相互作用を増強する 、請求項５５に記載の方法：ラットα−ＴＲのＡｒｇ２６２、Ａｒｇ２６６また はＡｒｇ２２８、または前記三次元モデル中の三次元の位置において前記アルギ ニン：Ａｒｇ２６２、Ａｒｇ２６６またはＡｒｇ２２８のいずれかに相当するヒ トα−ＴＲまたはβ−ＴＲのアルギニン。 ５９．アゴニストまたは天然に存在するリガンドが前記ＬＢＤに結合するとき 、前記化学的修飾が側基を変化させて、通常水で占有されている空間を充填する 、請求項５８に記載の方法。 ６０．前記化学的修飾が前記ＬＢＤの結合空洞のポケットまたは表面によく適 合し、前記ポケットまたは表面の電荷または疎水性または双方を補足する、請求 項５９に記載の方法。 ６１．前記化学的修飾が、前記第１化学的部分の１）Ｔ３のＲ１における第１ フェニルまたは２）Ｔ３カルボキシレート基をもつＴ３アゴニストのＲ１におけ る第１フェニルに結合した第１炭素を、第２化学的部分の２炭素の空間基に変化 させる、請求項６０に記載の方法。 ６２．前記化学的修飾が、前記第１化学的部分の１）Ｔ３のＲ４における第１ フェニルをＴ３の第２フェニルに結合する炭素または２）Ｔ３アゴニストのＲ４ における第１フェニルを前記Ｔ３アゴニストの第２フェニル環と結合させる炭素 を、第２化学的部分のモノ−またはｇｅｍ−置換炭素基に変化させる、請求項５ ５に記載の方法。 ６３．前記化学的修飾が、前記第１化学的部分の１）Ｔ３のＲ４における第１ フェニルをＴ３の第２フェニルに結合する炭素または２）Ｔ３アゴニストのＲ４ における第１フェニルを前記Ｔ３アゴニストの第２フェニル環と結合させる炭素 を変化させる、請求項５５に記載の方法。 ６４．下記式の化合物： 式中、 Ｒ₁は−Ｏ−ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ、−ＮＨＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ 、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ（ＮＨ₂）Ｃ Ｏ₂Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ ［ＮＨＣＯＣＨφ₂］ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₁₅ＣＨ₃］ＣＯ₂ Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨ−ＦＭＯＣ］ＣＯ₂Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨ−ｔＢＯＣ］ ＣＯ₂Ｈ、または０〜３炭素のリンカーで環に接続したカルボキシレート、−Ｐ Ｏ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ＣＨＮＨ₂ＰＯ₃Ｈ₂ 、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨＣＯＣＨφ₂］ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₁₅ ＣＨ₃］ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨ−ＦＭＯＣ］ＰＯ₃Ｈ₂、−ＣＨ₂ＣＨ［ ＮＨ−ｔＢＯＣ］ＰＯ₃Ｈ₂、または０〜３炭素のリンカーで環に接続したホスフ ェートまたはホスホネート、−ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨ₂ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ₂ＳＯ₃Ｈ 、−ＣＨ₂ＣＨＮＨ₂ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨＣＯＣＨφ₂］ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨ₂ ＣＨ［ＮＨＣＯ（ＣＨ₂）₁₅ＣＨ₃］ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨ−ＦＭＯＣ］ ＳＯ₃Ｈ、−ＣＨ₂ＣＨ［ＮＨ−ｔＢＯＣ］ＳＯ₃Ｈまたは０〜３炭素のリンカー で環に接続したサルフェートまたはサルファイトであるか、あるいはＴＲに結合 するとき分子認識ドメインにおけるＴ３のＣＨ₂ＣＨ（ＮＨ₂）ＣＯ₂Ｈの機能的 同等物として作用し、ここで前記Ｒ₁はアミンで置換されることができ、 Ｒ₂は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＨ、−ＣＨ₃または− Ｅｔであるか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメインにおけるＨの機能 的同等物として作用し、 Ｒ₃は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｎ₃、−ＳＨ、−ＣＨ₃ または−Ｅｔであるか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメインにおける Ｉの機能的同等物として作用し、 Ｒ₅は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｎ₃、−ＳＨ、−ＣＨ₃ または−Ｅｔであるか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメインにおける Ｉの機能的同等物として作用し、そ してＲ₃はＲ₅と同一であることができ、 Ｒ₆は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＨまたは−ＣＨ₃であ るか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメインにおけるＨの機能的同等物 として作用し、そしてＲ₂はＲ₆と同一であることができ、 Ｒ₂’は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｎ₃、−ＳＨ、−ＣＨ₃ または−Ｅｔであるか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメインにおけ るＨの機能的同等物として作用し、 Ｒ₃’は任意の疎水性基であり、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＳＨ、アルキル、アリ ール、５もしく６員のヘテロサイクルまたはシアノを包含するか、あるいはＴＲ に結合するとき分子認識ドメインにおけるＩの機能的同等物として作用し、 Ｒ₄’は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＮＨ₃、−Ｎ（ＣＨ₃ ）₃、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェート、− ＳＨ、−ＣＨ₃、−Ｅｔ、またはアルキル、アリールまたはＲ₄’位においてＯも しくはＮもしくはＳに尿素またはカルバメート結合を通して結合した５もしく６ 員のヘテロサイクル芳香族であるか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメ インにおけるＯＨの機能的同等物として作用し、 Ｒ₅’は−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｎ（ＣＨ₃）₂、−ＳＨ、−ＮＨ₃、−Ｎ（ ＣＨ₃）₃、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェート、サルフェート、１ 〜９個の炭素原子を有する分枝鎖状もしくは直鎖状のアルキル、置換もしくは非 置換のアリール（ここで前記置換アリールはハロゲンまたは１〜５個の炭素原子 を有するアルキルで置換されており、そして前記アリールは環に−ＣＨ₂ −により接続されていてもよい）、５〜６個の炭素原子を有する芳香族ヘテロサ イクル（ここで前記ヘテロサイクルは−ＯＨ、−ＮＨ₂ 、−ＳＨ、−ＮＨ₃、−Ｎ（ＣＨ₃）₃、カルボキシレート、ホスホネート、ホス フェート、サルフェート、ヘテロアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリール アルキル、ポリ芳香族またはポリヘテロ芳香族から選択される１または２以上の 基で置換されることができる）、ヘテロアルキル、アリールアルキル、ヘテロア リールアルキル、ポリ芳香族、またはポリヘテロ芳香族（ここで前記Ｒ₅’は極 性基または帯電した基で置換されることができる）であり、 Ｒ₆’は−Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ₃、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＨ、−ＣＨ₃または −Ｅｔであるか、あるいはＴＲに結合するとき分子認識ドメインにおけるＨの機 能的同等物として作用し、 ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ₂、ＮＨ、ＮＲ₇、ＣＨ₂、ＣＨＲ₇またはＣＲ₇Ｒ₇であり、こ こでＲ₇はアルキル、アリールまたは５もしくは６員のヘテロサイクル芳香族で あり、そして 前記ＴＲ ＬＢＤリガンドは１μＭまたはそれより小さいＴＲ ＬＢＤへの結合 の見掛けＫｄを有する。 ６５．式中、 Ｒ₁がカルボキシレート、ホスホネート、ホスフェートまたはサルフェートで あり、そして０〜３炭素のリンカーで環に接続しており、 Ｒ₂が−Ｈであり、 Ｒ₃が−Ｉ、−Ｂｒ、または−ＣＨ₃であり、 Ｒ₅が−Ｉ、−Ｂｒ、または−ＣＨ₃であり、 Ｒ₆が−Ｈであり、 Ｒ₂’が−Ｈであり、 Ｒ₃’が−Ｉ、−Ｂｒ、−ＣＨ₃、−ｉＰｒ、−フェニル、ベンジルまたは５も しくは６員のヘテロサイクルであり、 Ｒ₄’が−ＯＨ、−ＮＨ₂、および−ＳＨであり、 Ｒ₅’が−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ₂、−Ｎ（ＣＨ₃）₂、−ＳＨ、−ＮＨ₃、−Ｎ（ ＣＨ₃）₃、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェート、サルフェート、１ 〜９を有する分枝鎖状もしくは直鎖状のアルキル、置換もしくは非置換のアリー ル（ここで前記置換アリールはハロゲンまたは１〜５炭素のアルキルで置換され ており、そして前記アリールは環に−ＣＨ₂−により接続されていてもよい）、 ５〜６個の炭素原子を有する芳香族ヘテロサイクル（ここで前記ヘテロサイクル は−ＯＨ、−ＮＨ₂、−ＳＨ、−ＮＨ₃、−Ｎ（ＣＨ₃）₃、カルボキシレート、ホ スホネート、ホスフェートまたはサルフェートから選択される１または２以上の 基で置換されることができる）、ヘテロアルキル、アリールアルキル、ヘテロア リールアルキル、ポリ芳香族、またはポリヘテロ芳香族（ここで前記Ｒ₅’は極 性基または帯電した基で置換されることができる）であり、そして Ｒ₆’が−Ｈである、 請求項６４に記載の組成物。 ６６．前記化合物が請求項１３に記載の方法により製造された、請求項６５に 記載の組成物。 ６７．前記化合物が請求項３９に記載の方法により製造された、請求項６５に 記載の組成物。 ６８．前記化合物がＴＲアンタゴニストである、請求項６５に記載の化合物。 ６９．前記化合物がＴＲアゴニストである、請求項６５に記載の化合物。 ７０．前記化合物がＴＲα選択的リガンドである、請求項６５に記載の化合物 。 ７１．前記化合物がＴＲβ選択的リガンドである、請求項６５に 記載の化合物。 ７２．請求項６５に記載の化合物と、医薬として有効な担体とを含んでなる、 選択的甲状腺類似活性を有する医薬組成物。 ７３．Ｒ₅’が１〜９個の炭素原子を有するアルキルであり、そして直鎖状ま たは分枝鎖状である、請求項７２に記載の組成物。 ７４．有効量の請求項６５に記載の化合物を投与することからなる、ＬＤＬ− コレステロール／ＨＤＬ−コレステロールのレベル比を低下させる方法。 ７５．血漿脂質のレベルの低下を必要とする哺乳動物に有効量の請求項６５に 記載の化合物を投与することからなる、血漿脂質のレベルを低下させる方法。 ７６．有効量の請求項６５に記載の化合物を投与することからなる、心臓機能 が弱化した患者における甲状腺ホルモンの欠乏を治療する方法。