KR100509902B1 - 핵수용체리간드및리간드결합도메인 - Google Patents

Abstract

본 발명은 핵 수용체 특히, 티로이드 수용체(본원에서는 "TR"로 언급함)의 3차원 구조를 기초로한 핵 수용체 합성 리간드의 생성을 위한 조성물 및 이들의 새로운 방법 특히, 컴퓨터를 사용한 방법을 제공한다. 또한, 결정, 핵 수용체 합성 리간드 및 관련된 방법을 제공한다.

Description

핵 수용체 리간드 및 리간드 결합 도메인

본 발명은 핵 수용체에 결합하는 리간드, 핵 수용체의 결정, 핵 수용체의 합성 리간드를 컴퓨터를 사용해 설계하는 방법 및 합성 리간드를 이용하는 방법에 관한 것이다.

핵 수용체는 호르몬 또는 비타민과 같은 생리학적으로 비교적 작은 분자에 특이적으로 결합하는 단백질의 상과(superfamilly)를 대표한다. 핵 수용체가 비의존적인 전사 작용을 가질 수 있지만, 분자가 핵 수용체에 결합함으로써, 핵 수용체는 DNA를 전사시키는 세포의 능력을 변화시킨다. 즉, 핵 수용체는 DNA의 전사를 조절한다. 내재성 막 수용체 및 막 관련 수용체와는 달리, 핵 수용체는 진핵 세포의 세포질 또는 핵에 존재한다. 따라서, 핵 수용체는 세포내의 가용성인 리간드 조절 전사 인자 부류를 포함한다.

핵 수용체는 글루코코르티코이드에 대한 수용체(GR), 안드로겐에 대한 수용체(AR), 미네랄로코르티코이드에 대한 수용체(MR), 프로게스틴에 대한 수용체(PR), 에스트로젠에 대한 수용체(ER), 티로이드 호르몬에 대한 수용체(TR), 비타민 D에 대한 수용체(VDR) 및 레티노이드에 대한 수용체(RAR 및 RXR)를 포함한다. 또한, 소위 "올팬 수용체(orphan receptor)"는 핵 수용체 상과의 한 부분이며, 스테로이드 및 티로이드 수용체와 같은 전형적인 핵 수용체와 구조적으로 상동성이다. 오늘날까지, 리간드는 올팬 수용체를 갖지 않는 것으로 확인되어 왔으나, 이러한 전사 인자 부류에 대한 소분자 리간드가 조만간에 발견될 것 같다. 일반적으로, 핵 수용체는 높은 친화도로 생리학적으로 비교적 작은 분자와 특이적으로 결합하며, 겉보기 Kd는 일반적으로 0.01 내지 20 nM이며, 핵 수용체/리간드 쌍에 의존한다.

무수한 생리학적 과정 및 고혈압, 염증, 호르몬 의존성 암(예를 들어, 유방암 및 전립선암), 생식 기관의 조절, 갑상선기능항진증, 고콜레스테롤 혈증 및 비만과 같은 질환에서의 핵 수용체의 중요성에도 불구하고, 핵 수용체에 특이적으로 결합하는 합성 리간드의 개발은 많은 약물 설계의 시도 및 오류를 거쳐왔다. 이전에, 핵 수용체에 특이적인 새로운 리간드는 결합된 리간드를 갖는 핵 수용체의 3차원 구조에 대한 정보 없이 발견되었다. 본 발명 이전에, 연구자들은 어떻게 핵 수용체의 아미노산이 리간드를 포획하는지 알 수 없는 상태에서, 그냥 프로빙함으로써 핵 수용체 리간드를 실질적으로 발견하고 있었다.

결론적으로, 핵 수용체에 대한 리간드를 발견하고, 이러한 화합물을 합성하고, 핵 수용체에 의해 조절되는 생리학적 작용을 조절하기 위해 상기 화합물을 생물체에 투여하는 데 필요한 시간을 줄일 수 있는 방법 및 조성물을 고안해내는게 유리할 것이다.

발명의 요약

본 발명은 리간드 결합 도메인(LBD)에 결합된 리간드를 갖는 핵 수용체 리간드 결합 도메인의 결정을 제공한다. 본 발명의 결정은 핵 수용체 리간드 특히, 티로이드 수용체 리간드와 상호작용하는 아미노산의 우수한 원자 분해능을 제공한다. 결합된 리간드를 갖는 핵 수용체 LBD의 3차원 모델은 핵 수용체에 대해 이전에 공지되지 않았던 구조를 밝혔고, 이는 리간드가 핵 수용체의 리간드 결합 도메인의 물이 접근할 수 없는 결합 공동에서 결합됨을 나타낸다.

또한, 본 발명은 핵 수용체 LBD의 결정을 기초로 하여 핵 수용체의 3차원 모델을 컴퓨터를 사용하여 이용하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 핵 수용체 리간드를 컴퓨터를 사용하여 설계하는 방법은, 결합된 리간드를 갖는 핵 수용체 LBD를 포함하는 결정화된 단백질의 3차원 모델을 사용하여 리간드의 화학 잔기(하나 이상)와 상호작용하는 핵 수용체 LBD의 아미노산(들)을 결정하고, 상호작용 아미노산과 천연 호르몬상의 상응하는 화학 잔기 사이의 상호작용에 비해 상호작용 아미노산과 제 2 화학 잔기 사이의 상호작용을 감소시키거나 증가시키는 구조를 갖는 제 2 화학 잔기를 생성시키는 화학 잔기의 화학적 변형(하나 이상)을 선택하는 것이다.

도 1은 핵 수용체 상과의 핵 수용체와 상호작용하는 리간드를 컴퓨터를 사용하여 설계하는 방법을 설명한 도해이다.

도 2는 패밀리 구성원내의 상동 영역 및 다양한 도메인의 기능을 나타낸 핵 수용체 구조의 개략적 도면이다.

도 3은 핵 수용체 상과의 수개의 구성원의 리간드 결합 도메인의 정렬된 아미노산 서열을 도시한 것이다.

도 4는 표지된 2 차 구조 요소를 갖는 래트 TR-α LBD의 리본 도면이다. 리간드(자홍색)는 공간 충전 모델로서 묘사하였다. 알파 헬릭스 및 코일 형태는 노란색이고, 베타 가닥은 청색이다.

도 5는 수용체 내에 꽉 찬 리간드(자홍색)를 노출시킨 래트 TR-α의 공간 충전 모델의 두 개의 횡단면을 도시한 것이다.

도 6은 리간드 결합 공동의 개략도이다. 리간드와 상호작용하는 잔기는 거의 상호작용의 부위에 나타난다. 수소 결합은 결합 상대끼리 점선으로 나타냈고, 각 결합에 대한 거리를 기록하였다. 비결합 접촉은 상호작용하는 원자에 마주한 라디칼 스포크(radical spokes)로서 나타내었다.

도 7은 정제된 래트 TR-α LBD에서 결정학적인 온도 인자의 분포를 도시한 것이다. 분포는 15(암 청색) 미만 내지 35(노랑-녹색) 초과 범위의 색 등급으로서 나타내었다.

도 8은 리간드에 대한 c-말단 활성 도메인을 나타내는 래트 TR-α LBD의 리본 도면이다. c-말단 활성 도메인(Pro393-Phe405)을 포함하는 잔기는 막대로 나타내었다. 소수성 잔기, 특히 Phe401 및 Phe405(청색)는 리간드의 안쪽으로 향하고, Glu403(적색)은 용매 쪽으로 돌출된다.

도 9는 GRAPH를 이용하여 계산된 래트 TR-α LBD의 정전기적 전위 표면이다. 네가티브 정전기적 전위는 적색이며; 포지티브 정전기적 전위는 청색이다. c-말단 활성 도메인은 큰 소수성(흰색)을 형성한다. Glu403은 음전하의 단일 단편으로서 나타내었다.

도 10은 수개의 핵 수용체에 대한 작용제와 길항제를 비교한 다이아그램이다.

도 11은 TS1, TS2, TS3, TS4 및 TS5를 제조하기 위한 합성 개요이다.

도 12는 TS6 및 TS7을 제조하기 위한 합성 개요이다.

도 13은 TS8을 제조하기 위한 합성 개요이다.

도 14는 TS10을 제조하기 위한 합성 개요이다.

도 15는 수개 TR 리간드의 화학적 구조를 도시한 것이다.

도 16은 T₃ 및 트리악(triac)이 사람 TR-α 또는 사람 TR-β에 결합하기 위해 표지된 T₃와 경쟁하는 경쟁 검정을 나타낸 그래프이다.

도 17은 TR-α 및 TR-β에 결합하는 표지된 T₃의 스캐차드 분석을 나타낸 것이다.

도 18은 TRAFα1 리포터 세포에서 검정된 것으로서 T3의 존재 또는 부재하에 DR4-ALP 리포터 유전자의 전사적 조절상에서 TS-10의 영향을 나타낸 차트이다.

도 19는 TRAFβ1 리포터 세포에서 검정된 것으로서 T3의 존재 또는 부재하에 DR4-ALP 리포터 유전자의 전사적 조절상에서 TS-10의 영향을 나타낸 차트이다.

도 20은 HepG2, 즉 간 리포터 세포주에서 검정된 것으로서 T3의 존재 또는 부재하에 DR4-ALP 리포터 유전자의 전사 조절에 대한 TS-10의 영향을 나타낸 차트이다.

도 21은 리간드 결합 공동에서 T3를 갖는 TR-α LBD의 부분적 리본 도면을 도시한 것이다. Ile221, Ile222 및 Ser260, Ala263, Ile299 및 Leu276을 포함하는 선택된 상호작용 아미노산을 표지하였다.

도 22는 리간드 결합 공동에서 포개진 T3 및 디미트(Dimit)를 갖는 TR-α LBD의 부분적 리본 도면을 도시한 것이다. Ile221, Ile222, Ala260, Ile299 및 Leu276과 상호작용을 표지하였다.

도 23은 T3를 갖는 TR-α LBD의 부분적 리본 도면이며, 극성 포켓, 즉 3개의 물 분자 HOH502, HOH503 및 HOH504의 3개의 아르기닌 잔기(Arg228, Arg262 및 Arg266(검은 막대로 표시))를 나타냈고, 점선은 수소 결합을 나타낸다.

도 24는 트리악을 갖는 TR-α LBD의 부분적 리본 도면이며, 극성 포켓, 즉 물 분자(HOH503, HOH504 및 HOH600)의 3개의 아르기닌 잔기(검은 막대로 표시)를 나타냈고, 점선은 수소 결합을 나타낸다.

도 25는 리간드 결합 공동에서 포개진 T3 및 트리악을 갖는 TR-α LBD의 부분적 리본 도면이다. 도면은 T3 또는 트리악이 리간드 결합 공동을 점유하든 안하든 변화하지 않고 그대로 존재하는 극성 포켓에서 수개의 상호작용 아미노산 잔기를 나타낸다: Arg262, Asn179, HOH503 및 HOH504, 및 Ser277. Arg228 및 Arg266 둘 모두는 T3 또는 트리악이 결합하는지에 따라 두 개의 상이한 위치에 점유한다.

도 26은 결합된 디미트를 갖는 TRα LBD를 입체화학적으로 도시한 도면이다.

부록 1은 참고문헌에 대한 부록이다.

부록 2는 디미트, 트리악, IpBr2 및 T3와 복합된 TR에 대한 TR 리간드와 상호작용하는 아미노산의 차트이다.

도입

본 발명은 핵 수용체 특히, 티로이드 수용체(본원에서는 "TR"로 언급됨)의 3차원 구조를 기초로 한 핵 수용체 합성 리간드를 제조하기 위한 새로운 방법 특히, 컴퓨터를 사용한 방법 및 조성물을 제공한다. 이전에, 핵 수용체의 리간드 결합 도메인에 대한 3차원 구조의 정보의 부족, 특히, 결합된 리간드를 갖는 핵 수용체에 관한 3차원 구조의 정보의 부재는 핵 수용체 약물 발견의 분야를 방해하였다.

첫 번째로 본원에 설명된 것은 결합된 리간드를 갖는 핵 수용체의 리간드 결합 도메인(LBD)으로부터의 결정 및 3차원 구조의 정보이다. 이러한 결정은 원자 수준에서 뛰어난 분해능 및 LBD를 포함하는 아미노산에 의한 핵 수용체 리간드의 코디네이션(coordination)를 가시화시키는 능력을 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 결정 및 3차원 구조의 정보를 이용하여 핵 수용체 합성 리간드를 컴퓨터를 사용해 설계하여, 핵 수용체의 LBD의 형태적 변화를 조절하는 합성 리간드를 생성시키는 방법을 제공한다. 이러한 합성 리간드는 본원에 설명되고 일부분이 도 1에 도시된 컴퓨터를 사용한 방법을 이용하여 설계될 수 있다. 이러한 컴퓨터를 사용한 방법은 특히 핵 수용체에 대한 길항제 또는 부분적인 작용제를 설계하는 데 유용하며, 상기 길항제 또는 부분적인 작용제는 작용제와 같은 천연 발생 리간드, 또는 천연 발생 리간드를 의태하는 기타 리간드에 대해 관찰된 활성 도메인의 정상적인 코디네이션을 방해하는 것과 같이 유전자 발현의 조절에 있어서 수용체의 영향을 변형시키는 수많은 리간드 유도된 분자적 사건중 임의의 하나를 방해하는 연장된 잔기를 갖는다. 본원에 기술한 바와 같이, 핵 수용체의 합성 리간드는 다양한 의학 조건에서 핵 수용체 활성을 조절하는 데 유용할 것이다.

핵 수용체에 대한 적용성

본 발명, 특히 컴퓨터를 사용한 방법은 글루코코르티코이드에 대한 수용체(GR), 안드로겐에 대한 수용체(AR), 미네랄로코르티코이드에 대한 수용체(MR), 프로게스틴에 대한 수용체(PR), 에스트로겐에 대한 수용체(ER), 티로이드 호르몬에 대한 수용체(TR), 비타민 D에 대한 수용체(VDR), 레티노이드에 대한 수용체(RAR 및 RXR) 및 퍼옥시좀 프롤리퍼레이터(PPAP)의 수용체와 같은 다양한 핵 수용체에 대한 약물을 설계하는 데 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 "올팬 수용체"에 적용될 수 있으며, 이들은 스테로이드 및 티로이드 수용체와 같은 전형적인 핵 수용체에 대한 모듈러(modular) 도메인 및 일차 구조에 있어서 구조적으로 상동적을 띤다. 예를 들어, 래트 RARα 및 사람 TR-β 수용체와 비교할 경우, 다른 핵 수용체를 갖는 올팬 수용체의 아미노산 상동성은 매우 낮은 수준(<15%) 내지 35%의 범위에 있다. 또한, 본원에 설명된 구조적 분석 및 TR의 X-선 결정학적 구조에 의해 밝혀진 바와 같이, 리간드 결합된 상과 구성원의 전체적인 폴딩(folding)은 유사할 것 같다. 리간드가 올팬 수용체로 확인되지 않더라도, 일단 이러한 리간드가 확인되면 당업자는 이러한 리간드의 설계 및 사용을 위해 본 발명을 적용시킬 수 있을 것이며, 이들의 전체 구조적 모듈러 모티프는 본원에 설명된 다른 핵 수용체와 유사할 것이다.

핵 수용체의 모듈러 작용 도메인

본 발명은 일반적으로 본원에 설명된 모든 핵 수용체, 부분적으로는 상이한 리간드가 결합된 핵 수용체 3차원 구조, 특히 TR-α 및 TR-β에 대한 리간드 결합 도메인의 3차원 구조 또는 결정화된 단백질 구조를 측정한 결과로서 나타난 핵 수용체 활성화, 구조 및 조절의 패턴에 적용될 수 있다. 핵 수용체 상과의 단백질은 본원에 설명되고, 도 2에 나타낸 당분야에 공지된 바와 같이 아미노산 상동의 실질적인 영역을 나타낸다. 이러한 패밀리의 구성원은 3개의 모듈러(modular) 도메인의 전체 구조적 모티프(TR 3개의 모듈러 도메인 모티프와 유사)를 나타낸다:

1) 가변성 아미노 말단 도메인;

2) 고도로 보존된 DNA 결합 도메인(DBD); 및

3) 적게 보존된 카르복실 말단 리간드 결합 도메인(LBD).

이러한 상과의 모듈성은 비록 도메인이 서로 영향을 끼칠수 있다 하더라도, 각각의 단백질의 상이한 도메인이 개별적으로 상이한 작용을 달성하도록 해준다. 도메인의 분리 작용은 일반적으로 특정 도메인이 잔여 단백질로부터 단리될 경우 보존된다. 통상적인 단백질 화학 기술을 사용함으로써, 모듈러 도메인은 때때로 모단백질로부터 분리될 수 있다. 통상적인 분자 생물학 기술을 사용함으로써, 각각의 도메인은 일반적으로 이의 본래의 손상되지 않은 기능을 가지면서 개별적으로 발현될 수 있거나, 두 개의 상이한 핵 수용체의 키메라가 작제될 수 있으며, 상기 키메라는, 키메라가 생성되는 각각의 핵 수용체의 개별적 작용 도메인의 특성을 보유한다.

도 2는 다양한 도메인의 패밀리 구성원 및 작용기내의 상동 영역을 나타내는 패밀리 구성원 구조의 개략도를 제공한다.

아미노 말단 도메인

아미노 말단 도메인은 3개의 도메인중 가장 적게 보존된 것이며, 핵 수용체 상과 구성원의 크기를 현저하게 변화시킨다. 예를 들어, 이러한 도메인은 VDR에서 24개의 아미노산 및 MR에서의 603개의 아미노산을 함유한다. 이러한 도메인은 전사 활성화에 관련되어 있으며, 어떤 경우에, 이들의 유일성은 선택적인 수용체-DNA 결합 및 특이적 수용체 이소폼에 의한 표적 유전자의 활성화를 규정할 수 있다. 이러한 도메인은 LBD의 도메인과의 상승효과적 상호작용 및 길항적 상호작용을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 변이되고/되거나 결실된 수용체의 연구는 아미노 및 카르복시 말단 도메인의 포지티브 상호작용을 나타낸다. 어떤 경우에, 이러한 도메인 중 하나의 결실은 수용체의 전사 활성화 작용을 없앨 것이다.

DNA-결합 도메인

DBD는 핵 수용체 상과에서 가장 많이 보존되는 구조이다. 이들은 일반적으로 두 개의 아연 핑거(zinc finger) 모티프로 폴딩된 약 70개의 아미노산을 함유하며, 상기 아연 이온은 4개의 시스테인과 코디네이팅(coordinating)된다. DBD는 제 1 및 제 2 아연 핑거의 염기로부터 연장된 두 개의 수직 배향된 α-헬릭스를 포함한다. 두 개의 아연 핑거는 비 아연 핑거 잔기와 함께 작용하여, 핵 수용체를 DNA상의 특이적 표적 부위로 유도하여 수용체 호모이량체 또는 헤테로이량체 계면에 정렬시킨다. DBD의 다양한 아미노산은 수용체 이량체 결합을 위한 두 개의 절반 부위(일반적으로 6개 누클레오티드를 포함) 사이의 이격에 영향을 끼친다. 예를 들어, GR 하위과(subfamily) 및 ER 호모이량체는 3개의 누클레오티드에 의해 이격되고 팔린드롬(pallindrom)으로서 배향된 절반 부위에 결합한다. 최적의 이격은 DBD 사이의 협동 상호작용(cooperative interaction)을 촉진하고, D 박스 잔기는 이량체화 계면의 일부이다. DBD의 또 다른 영역은 정방향 반복 요소(direct repeat element)에서 RXR 호모이량체화 및 헤테로이량체화에 필요한 DNA-단백질 및 단백질-단백질 상호작용을 촉진한다.

LBD는 DBD의 DNA 결합에 영향을 끼칠 수 있으며, 이러한 영향은 또한 리간드 결합에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, TR 리간드 결합은 TR이 단량체 또는 이량체로서 DNA에 결합하는 정도에 영향을 끼친다. 이러한 이량체화는 또한 DNA 절반 부위의 이격 및 배향에 의존한다.

핵 수용체 상과는 두 개의 하위과: 즉 DBD 구조를 기준으로 하여 1) GR(GR, AR, MR 및 PR) 및 2) TR(TR, VDR, RAR, RXR 및 대부분의 올팬 수용체)로 나누어지며, 열 쇼크 단백질(hsp)과 상호 작용하며, 헤테로이량체 형성 능력이 있다. GR 서브그룹(subgroup) 구성원은 리간드의 부재하에 hsp에 의해 단단하게 결합되고, 리간드 결합 및 hsp의 해리 후, 이량체화되고, 이들이 결합하는 DNA 절반 부위에서 상동성을 나타낸다. 또한, 이러한 절반 부위는 팔린드롬으로서 배열되는 경향이 있다. TR 서브그룹 구성원은 리간드와 분리될 경우, DNA 또는 다른 염색질 분자에 결합하는 경향이 있으며, 단량체 및 이량체로서 DNA에 결합할 수도 있으나, 헤테로이량체를 형성하며, 다양하게 배향되고 이격되게 절반 부위의 DNA 요소에 결합하며, 또한, 절반 부위의 누클레오티드 서열에 대해 상동성을 나타낸다. ER은 hsp 상호작용에 있어서 GR 하위과와 유사하므로 핵 국부화 및 DNA 결합 특성에 있어서 TR 하위과에 속하지 않는다.

리간드 결합 도메인

LBD는 상기 수용체에서 두 번째로 가장 많이 보존된 도메인이다. 몇몇 상이한 LBD 서브-도메인의 완전성은 리간드 결합에 중요한 반면, 단지 LBD를 함유하는 절두된 분자는 정상적인 리간드 결합 활성을 갖는다. 또한, 이러한 도메인은 본원에 설명된 바와 같이 이량체화, 핵 전위 및 전사 활성을 포함한 다른 기능에 관현한다. 중요하게는, 이러한 도메인은 리간드와 결합하고, 본원에 상세하게 설명된 바와 같이 리간드 유도된 형태적 변화를 겪는다.

올팬 수용체를 포함한 대부분의 상과의 구성원은 두 개 이상의 전사 활동화 서브도메인을 가지며, 이들 중 하나는 구성성분으로서, 아미노 말단 도메인(AF-1)에 존재하며, 이들 중 다른 하나(AF-2(또한 TAU 4로 언급됨))는 활성이 작용제 리간드의 결합에 의해 조절되는 리간드 결합 도메인에 존재한다. AF-2의 작용은 수용체 상과중(약 아미노산 1005 내지 1022)에 고도로 보존되는 활성 도메인(또한 전이활성 도메인이라 불림)을 필요로 한다. 대부분 LBD는 활성 도메인을 포함한다. 이러한 도메인중에서 일부 변이는 AF-2 기능을 폐지시키지만, 리간드 결합은 방치하며, 다른 기능들에도 영향을 미치지 않는다. 리간드 결합은, 활성 도메인이 전사를 자극(또는 어떤 경우에는 억제)하는 필수적인 활성보조인자 단백질에 대한 상호작용 부위로서 작용하도록 한다.

본원에 설명된 바와 같이 카르복시-말단 활성 서브도메인은 리간드에 대한 LBD의 밀접한 3차원적 근접부에 위치하여, 리간드가 활성화 서브도메인에서 아미노산과 코디네이팅(또는 상호작용)되어 LBD에 결합하도록 한다. 본원에 설명된 바와 같이, 핵 수용체의 LBD는 발현되고, 결정화되고, 이들의 3차원 구조는 결합된 리간드(동일한 수용체 또는 상이한 수용체 또는 이들의 조합체로부터의 결정 데이터를 이용하여), 및 LBD에 대한 리간드 특히, 핵 수용체의 활성 도메인과 코디네이팅되는 연장 잔기를 함유하는 리간드를 설계하는데 사용된 컴퓨터를 사용하는 방법에 의해 결정된다.

본원에 설명되고 당해분야에 공지된 바와 같이, 일단 컴퓨터를 사용하여 설계된 리간드(CDL)가 합성되면, 검정에 의해 시험하여 본원에 설명된 바와 같이 작용제, 부분 작용제 또는 길항제의 활성 및 친화도를 정립할 수 있다. 이러한 시험 후, CDL은 LBD에 결합된 CDL로 LBD 결정을 유도하므로써 추가로 정제(refine)될 수 있다. 그 후, CDL의 구조를 3차원 모델에 대한 본원에 설명된 화학적 변형 방법을 사용하여 추가로 정제시켜, CDL의 활성 및 친화도를 개선시키고, 본원에 설명된 우수한 작용제 또는 길항제의 특성과 같은 개선된 특성을 갖는 제 2 생성 CDL을 제조하였다.

핵 수용체 이소폼

또한, 본 발명은 핵 수용체 이소폼을 구별하기 위한 새로운 합성 리간드를 제조하는 데 적용될 수 있다. 본원에 설명된 바와 같이, 이소폼들을 구별하는 CDL이 제조되어, 조직 특이적 또는 작용 특이적인 합성 리간드를 제조할 수 있다. 예를 들어, 상이한 AUG 코돈으로부터 교차적인 개시에 의해 동일한 mRNA로부터 번역되는 두 개의 PR 이소폼 A 및 B는 제외하고, GR 하위과 구성원은 일반적으로 단일 유전자에 의해 코드화된 하나의 수용체를 갖는다. 이러한 방법은 특히 두 개(TR) 또는 세 개(RAR, RXR 및 PPAR) 유전자에 의해 코드화되거나 교차적인 RNA 스플라이싱(splicing)을 갖는 수개의 수용체를 갖는 TR 하위과에 적용될 수 있으며, 이러한 TR의 예는 본원에 설명되어 있다.

핵 수용체 결정

본 발명은 수용체에 결합된 리간드를 갖는 핵 수용체 리간드 결합 도메인으로부터 제조된 결정을 제공한다. 실시예에서 예시된 바와 같이, TR은 이에 결합된 리간드와 함께 결정화된다. 결정은 세포 배양, 바람직하게는, 대장균 배양에 의해 일반적으로 발현된 정제된(purified) 핵 수용체 LBD로부터 제조된다. 바람직하게는, 동일한 핵 수용체에 대한 상이한 결정(조결정:cocrystal)은 자연발생 리간드, 및 자연발생 리간드의 유사체 또는 길항제로서 작용하는 하나 이상의 브로모- 또는 요오도- 치환된 합성 리간드와 같은 상이한 리간드를 이용하여 개별적으로 제조된다. 이러한 브로모- 및 요오도- 치환체는 핵 수용체 리간드 및 핵 수용체 단백질의 결정에서 중원자 치환체로서 작용한다. 이러한 방법은 페이싱(phasing) 단계에서 잇점을 가지며, 전형적인 중금속 유도체를 획득하는데 필수적 사항을 회피시킨다. 리간드가 결합된 핵 수용체 LBD에 대한 3차원 구조가 측정될 경우, 3차원 구조는 컴퓨터를 사용한 방법에 이용되어, 핵 수용체에 대한 합성 리간드를 설계할 수 있고, 추가로 활성 구조 관계가 본원에 설명되고 당해분야에 공지된 검정법을 이용한 정기적 시험을 통하여 측정될 수 있다.

다른 핵 수용체 LBD 구조의 발현 및 정제

핵 수용체 LBD의 고수준의 발현은 다른 문헌 뿐만 아니라 본원에 설명된 기술에 의해 획득될 수 있다. 에스트로겐 수용체(ER), 안드로겐 수용체(AR), 미네랄로코르티코이드 수용체(MR), 프로게스테론 수용체(PR), RAR, RXR 및 비타민 D 수용체(VDR)와 같은 스테로이드/티로이드 수용체 상과의 구성원을 포함하는 TR 및 다른 핵 수용체의 리간드 결합 도메인의 대장균에서의 높은 수준의 발현이 또한 달성될 수 있다. 효모 및 다른 진핵 생물 발현 시스템은 열 쇼크 단백질에 결합하는 핵 수용체에 이용될 수 있으며, 그 이유는, 박테리아에서도 발현될 수 있는 ER을 제외하고는 이러한 핵 수용체는 일반적으로 박테리아에서 발현되기 어렵기 때문이다. 하기와 같이 대표적인 핵 수용체 또는 이들의 리간드 결합 도메인이 클론되고 서열화되었다: 사람 RAR-α, 사람 RAR-γ, 사람 RXR-α, 사람 RXR-β, 사람 PPAR-α, 사람 PPAR-β, 사람 PPAR-γ, 사람 VDR, 사람 ER(세이엘스타드(Seielstad)등의 문헌[Molecular Endocrinology, vol 9:647-658(1995)]에 설명되어 있음), 사람 GR, 사람 PR, 사람 MR 및 사람 AR. 이러한 각각의 핵 수용체의 리간드 결합 도메인은 확인되었고, 도 3에 도시되어 있다. 본원에 설명되고 당해분야에 공지된 방법과 함께 도 3의 정보를 이용하여, 당업자는 도 3에 도시된 것을 포함한 핵 수용체 중 임의의 LBD를 발현시키고 정제할 수 있으며, 이들을 적합한 리간드에 결합시키고, 리간드가 결합된 핵 수용체의 LBD를 결정화시킬 수 있다.

도 3은 적합한 발현 벡터에 포함되는 아미노산을 나타내는 스테로이드/티로이드 호르몬 수용체 상과 몇개를 정렬한 것이다.

발현 세포의 추출물은 선택된 수용체의 결정의 정제 및 제조를 위한 수용체의 적합한 공급원이다. 이러한 발현을 획득하기 위해, 벡터는 래트 TR 알파의 발현에 사용된 것과 유사한 방식으로 작제된다[본원에 인용된 참고 문헌: Apriletti et al. Protein Expression and Purification, 6:368-370(1995)]. 발현된 수용체의 리간드 결합 도메인을 둘러싸는 아미노산을 코드화하는 누클레오티드, 예를 들어, 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인(hER-LBD)(도 3에 도시된 바와 것과 정렬된 위치 725에서의 R 내지 위치 1025에서의 L에 상응하는)을 아프릴레티(Apriletti, 1995) 등에 의해 사용된 것과 같은 발현 벡터에 삽입시킨다. 우수한 결정을 산출하는 물질을 획득하기 위해서, 사람 TR-β 위치 725 내지 1025에 상응하는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다. 만약 더 많은 구조적 정보를 원한다면, 인접한 아미노산 서열의 연장된 서열이 포함될 수 있다. 이와 같이, 사람 에스트로겐 수용체에 대한 발현 벡터는 위치 700 내지 c-말단 위치 1017로부터의 아미노산을 코드화하는 누클레오티드를 삽입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 벡터는 대장균에서 고수율의 수용체를 제공하며, 이는 호르몬에 결합할 수 있다[참고 문헌: Seielstad et al. Molecular Endocrinology Vol 9:647-658 (1995)]. 그러나, 위치 1025를 넘어서는 c-말단 영역은 가변성 단백질 가수분해 처리되므로, 유리하게는 작제물로부터 배제될 수 있으며, 가변성 단백질 가수분해를 피하기 위한 이러한 기술은 또한 다른 핵 수용체에 적용될 수 있다.

핵 수용체 LBD 구조의 예로서의 TR-α 및 TR-β, 및 TR 발현, 정제 및 결정화 기능

리간드 결합 도메인의 핵 수용체 구조의 예로서, TR의 α 및 β 이소폼은 발현 작제물, 바람직하게는 대장균에서 발현될 수 있는 작제물로부터 발현된 단백질로부터 결정화된다. 효모 및 다른 진핵 생물 발현 시스템과 같은 다른 발현 시스템이 이용될 수 있다. TR에 있어서, LBD는 DBD 또는 아미노 말단 도메인 부분 없이도 발현될 수 있다. 만약, LBD에 근접한 아미노산의 추가의 구조적 정보를 원한다면, DBD 또는 아미노 말단 부분이 포함될 수 있다. 일반적으로, TR에 있어서, 결정에 사용되는 LBD는 300개 아미노산 길이 미만일 것이다. 바람직하게는, TR LBD는 150개 아미노산 길이 이상일 것이며, 바람직하게는 200개 아미노산 길이 이상, 가장 바람직하게는 250개 아미노산 길이 이상일 것이다. 예를 들어, 결정화에 사용되는 LBD는 래트 TR-α의 Met 122 내지 Val 410, 사람 TR-β의 Glu 202 내지 Asp 461로부터의 아미노산 스패닝을 포함할 수 있다.

통상적으로, 결정화를 위해 TR LBD는 동종성으로 정제된다. TR LBD의 순도는 SDS-PAGE, 질량 분광측정법 및 소수성 HPLC로 측정된다. 결정화를 위해 정제된 TR은 약 97.5% 이상 또는 97.5%의 순도, 바람직하게는 99.0% 이상 또는 99.0%의 순도, 가장 바람직하게는 99.5% 이상 또는 99.5%의 순도를 가져야만 한다.

리간드가 결합되지 않은 수용체의 초기 정제는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HPLC), 이온 교환 크로마토그래피(ion change chromatography) 및 헤파린 친화도 크로마토그래피와 같은 통상적인 기술에 의해 획득될 수 있다.

핵 수용체 특히, TR 하위과 및 TR의 개질된 결정을 위한 더욱 고도의 정제를 획득하기 위해서, 이온 교환 또는 소수성 상호작용 칼럼과 같은 전하에 따라 수용체를 분리하는 칼럼을 사용하여 핵 수용체를 리간드 이동 정제시킨 후, 용출된 수용체를 리간드 특히, 작용제와 결합시키는 것이 바람직하다. 동일한 칼럼상에서 재크로마토그래피된 수용체가 리간드 결합된 수용체의 위치에서 용리될 경우, 수용체는 리간드 결합되지 않는 수용체로 수행한 본래 칼럼에 의해 제거될 정도로 리간드는 수용체의 표면 전하에서의 변화를 유도한다. 일반적으로, 포화농도의 리간드가 칼럼에 이용되고, 단백질은 이들을 칼럼에 걸기전에 리간드와 미리 인큐베이션될 수 있다. 본원에 상세히 설명된 구조 연구는 결정화를 위한 고순도 핵 수용체 LBD를 획득하는데 있어서 이러한 기술의 일반적인 적용성을 나타낸다.

더욱 최근에 개발된 방법은 아미노 말단에서와 같은 단백질의 말단에 위치한 히스티딘과 같은 "태그"를 처리한 후, 니켈 킬레이트화 칼럼을 이용하여 정제하는 것을 포함한다[본원에 인용된 참고 문헌: Janknecht R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol 88:8972-8976(1991)].

핵 수용체 상과의 또 다른 구성원으로부터의 TR LBD 또는 LBD의 3차원 구조를 측정하기 위해, LBD와 상응하는 LBD 리간드를 조결정화시키는 것이 바람직하다. TR LBD의 경우, 이들이 함유하는 중원자가 상이한 T3, IpBr 및 디미트와 같은 리간드와 각각 조결정화시키는 것이 바람직하다. 종래에 공지되어 있고 본원에 설명된 화학식 (Ⅰ)에 포함되는 리간드와 같은 다른 TR 리간드는 또한 TR LBD와 TR 리간드의 조결정을 생성시키는 데 이용된다. 화학식 (Ⅰ)에 포함되는 화합물에서, R₃, R₅, R₃' 또는 R₅'에서 하나 이상의 브로모 또는 요오드 치환체를 갖는 하나 이상의 리간드를 이용하는 것이 일반적으로 바람직하며, 바람직하게는, 이러한 화합물은 2개 이상, 더욱 바람직하게는 3개 이상의 이러한 치환체를 가질 것이다. 본원에 설명된 바와 같이, 이러한 치환체는 유리하게는 TR LBD의 3차원 구조에 대한 페이스 문제(phase problem)를 해결하는 데 도움을 주는 중원자로서 이용되며, 특히 핵 수용체에 대한 할로겐(예를 들어, I 또는 Br) 치환된 리간드를 이용하는 일반화된 페이싱(phasing) 방법으로서 이용될 수 있다.

TR LBD와 같은 통상적으로 정제된 LBD는 단백질의 완전성을 보존할 수 있는 온도에서 리간드의 포화 농도로 균질화된다. 수용체가 2 내지 20℃ 범위내에서 보다 안정한 경향을 보이지만, 리간드 균질화는 2 내지 37℃에서 이루어질 수 있다.

바람직하게는 결정은 본원에 상세하게 기재된 현적(hanging drop) 방법으로 제조된다. 조절된 온도제어는 결정의 안정성 및 질을 개선시키는데 바람직하다. 4 내지 25℃의 온도가 일반적으로 이용되며, 상기 온도범위에 걸친 결정화를 시험하는 것이 바람직하다. TR의 경우에, 18 내지 25℃, 바람직하게는 20 내지 23℃, 및 가장 바람직하게는 22℃의 결정화 온도가 바람직하다.

3,5,3'-트리요오도티로닌(T₃), 3'-이소프로필-3,5-디브로모티로닌(IpBr₂), 3'-이소프로필-3,5-디메틸티로닌(디미트), 및 3,5,3'-트리요오도티로아세트산(트리악)을 포함한 다양한 작용제와 TR-α LBD의 복합체는 본원에 기재된 방법으로 제조된다. 리간드와 미리 결합된 rTR-α LBD의 조결정은 15% 2-메틸-2,4-펜탄디올(MPD)로부터 주위 온도에서 증기 확산법으로 제조된다. 결정은 방사선 민감성을 띠며, 완전한 회절 데이터를 측정하기 위해서는 동결시켜야 한다. 회전하는 양극 X-레이 광원상에서, 결정은 약 3Å로 회절시킨다; 싱크로트론 방사선(syncrotron radiation)은 T₃ 조결정에 대하여 분해한계(resolution limit)를 2.0Å만큼 높게 연장시킨다. 다양한 유사체와 복합된 수용체를 제조하고 조결정화시키는 능력과 조합된 티로이드 호르몬의 조성물은 비정상적인 페이싱 방법을 가능하게 한다. 이러한 페이싱 방법은 상기 리간드의 I 및 Br 치환을 유발시킴으로써 본원에 기술된 핵 수용체의 리간드에 적용될 수 있다. 이러한 방법에서, 3, 5 및 3' 위치에서 상이한 4개의 호르몬 유사체(T₃, IpBr₂, 디미트, 및 트리악)를 함유하는 TR LBD의 조결정은 동형 유도체를 제공한다. 이러한 유사체에 있어서, 할로겐 치환체(2Br 및 3I 원자)는 중원자로 작용하며, 디미트 조결정(3 알킬 그룹)은 모체로서 작용한다. 초기 2.5Å 다중 동형 치환/변형 스캐터링/밀도 변화된 전자 밀도 지도는 LBD가 분자 그래픽 프로그램 05에서 생성된 골격으로부터 추적되게 한다[Jones, T.A. et al., ACTA Cryst, 47:110-119(1991)](본원에서 참조로 인용함). LBD 모델은 4 개의 단편, 즉, Arg157-Gly184, Trp186-Gly197, Ser199-Pro205, 및 Val210-Phe405로 구성되어 있으며, 위치 변환 및 자극된 어닐링 프로토콜을 이용하여 XPLOR에서 개질된다. 손실된 잔기는 상이한 밀도에 의해 형성된다. 최종 모델은 5.0 내지 2.2Å으로부터의 데이터에 대하여 R_결정=21.8% 및 R_유리=24.4%로 정제된다(표 3 참조).

이러한 페이싱 방법은 리간드의 I 및 Br 치환을 유발시킴으로써 본원에 기재된 핵 수용체의 리간드에 적용될 수 있다.

TR LBD의 3 차원 구조

TR LBD의 구조

핵 수용체의 3차원 구조의 예로서, TR-α₁ LBD의 주름이 도 4에 도시되어 있다. TR-α LBD는 열두개의 α-헬릭스, H1-12, 및 4개의 짧은 β스트레인, S1-4로 구성된 세 개의 층에 충전된 단일구조 도메인으로 구성되어, 혼합된 β-시이트를 형성한다. 매몰된 호르몬 및 세 개의 역평행 α-헬릭스, H5-6, H9, 및 H10은 도 4에 도시된 바와 같이 도메인의 중심층을 형성한다. H1, H2, H3 및 S1은 LBD의 한 면을 형성하고 반대면은 H7, H8, H11 및 H12에 의해 형성된다. N-말단(Met122-Gln156)의 처음 35개 아미노산은 전자밀도 맵에서 육안으로 확인할 수 없다. 헤테로이량체 RXR; DNA에 결합된 TR DNA-결합 도매인, TR DBD의 아미노산 Met122-Gln151의 3차원 구조는 DNA8의 작은 그루브와 광범위하게 접촉될 수 있게 한다. TR DBD의 최종 가시화 잔기와 LBD의 최초 가시화 잔기 사이에 존재하는, 무질서한 다섯개의 아미노산(Arg152-Gln156)은 손상되지 않은 수용체에서 LBD와 DBD를 연결시키는 유효한 "힌지(hinge)"를 나타낸다.

대부분의 헬릭스 조성 및 2차 구조의 층화된 배열은 리간드 비결합된 hRXRα의 배열과 동일하여, 두 핵 수용체 사이에 공통의 핵 수용체 주름이 존재한다는 것을 확인시켜준다.

TR LBD는 Arg157에서 시작되고, 연장된 코일 형태로 H1의 시작부분으로 이어진다. α-헬릭스인 H2의 회전은 호르몬 결합공동을 덮고 있으며, S4, 즉, 최외곽의 세 개의 역평행 스트랜드에 평행한 혼합된 β-시트의 에지를 형성하는 짧은 β-스트랜드인 S1을 덮는다. 상기 쇄는 대부분 H1에 역평행인 H3 시작부까지 불규칙적이다. H3은 Ile221 및 Ile222에서 굴곡되고, 리간드와 접촉되어 유지된다.

상기 쇄는 H3의 말단에서 약 90°회전하여 불완전한 α-헬릭스, 즉, H4를 형성한다. 첫번째의 매몰된 코어 헬릭스, H5-6은 Gly 253에서의 리간드 근처에서 비틀림에 의해 변경된 축을 따라 연장된다. 이러한 헬릭스는 두가지의 놀라운 예외적인 방법으로 중단된 대부분의 소수성 측쇄로 구성된다: Arg262는 이용될 수 없는 용매이며 리간드 카르복실레이트(1-치환체)와 상호작용하고, Glu256은 H9로부터의 Arg329 및 H11로부터의 Arg375와 극성 함입으로 만난다. H5-6은 4개의 스트랜드 혼합된 시이트의 짧은 β-스트랜드, 즉 S2에서 종결된다. S3와 S4는 좌회전으로 연결되고, Lys284와 Asp272 사이의 염 브릿지에 의해 추가로 연결된다. S4에 이어서, H7과 H8이 Lys268와 Asp277 사이의 염 브릿지에 의해 안정화된 L을 형성한다. H7과 H8 사이의 회전은 리간드와 이의 글리신 풍부 서열과의 상호작용의 결과로 비정상적인 형태를 취하게 한다. H9는 인접한 H5-6에 역평행인 제 2 코어 헬릭스이다. 또한, 두 개의 매몰된 극성 측쇄, Glu315 및 Gln320이 발견되었다. Glu315는 His358 및 Arg356과 함께 매몰된 염 브릿지를 형성한다. Gln320의 산소는 His175의 매몰된 측쇄와 수소결합을 형성한다. 쇄는 이어서 다시 역전되어 H9에 역평행인 H10을 형성한다. H11은 분자의 전장을 대각으로 가로질러 연장된다. H11 바로 뒤에, 이러한 쇄는 H11에 대하여 약 90°로 제 II형 회전을 형성한다. 이어서 상기 쇄는 다시 회전되어 H12를 형성하고, 이러한 H12는 호르몬 또는 리간드 결합 공동의 일부로서 H3 및 H11에 느슨하게 패킹된다. C-말단에서의 최종 5개의 아미노산, 즉, Glu406-Val410은 무질서하다.

핵 수용체의 매몰된 리간드 공동의 예로서 TR LBD의 리간드 결합 공동

TR LBD의 3차원 구조는, T3 또는 이의 동일입체형(isostere)이 LBD에 결합하는 경우에 LBD의 리간드 결합 공동이 접근불가능한 용제라는 놀라운 발견을 설명한다. 이러한 놀라운 결과는, 특히 본원에 설명된 바와 같이 리간드 설계를 위해 컴퓨터를 사용한 방법 및 활성 도메인의 정상적인 활성화를 억제하는 연장된 위치를 함유하는 핵 수용체 합성 리간드의 설계에 이러한 방법의 적용을 규명하는데 있어서 핵 수용체의 3차원 구조 및 기능의 새로운 모델을 유도하였다.

디미트, 즉, 수용체에 결합된 리간드는 T₃의 동일 입체형이고 티로이드 호르몬 작용제이다. 따라서, 디미트의 결합은 T₃의 결합을 반영해야 하며, 디미트 결합 수용체는 TR의 활성형(active conformation)인 것으로 예측된다. 리간드는 수용체 내에 매몰되어, 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이 단백질의 서브도메인에 대한 소수성 코어를 제공한다. H5-6 및 H9는 나머지 수용체에 대한 소수성 코어를 포함한다.

연장된 결합 공동은 수 개의 구조적 요소로 구성된다. 공동은 상부는 H5-6(Met 256-Arg266)에 의해 둘러쌓이고, 하부는 H7, H8 및 이 사이에 끼워진 루프(Leu287-Ile299)에 의해 둘러쌓이고, 측면은 H2(185-187), S3과 S4(Leu276-Ser277)사이의 회전, H3(Phe215-Arg228), H11(His381-Met388) 및 H12(Phe401-Phe405)에 의해 둘러쌓인다. 이러한 요소들로 형성된 공동의 용적은 GRASP(미국의 콜럼 비아 유니버시티:Columbia University)(600 Å3)로 계산하는 경우 기본적으로 호르몬의 용적(530Å)이다. 나머지 용적은 아미노 프로피온산 치환체를 둘러싸고 있는 물 분자에 의해 충전된다. 도 6은 TR LBD와 리간드 사이의 다양한 접촉부(또는 상호작용부)를 도시하는 도면이다.

리간드의 내외 고리(프라임 고리)의 평면은 서로에 대하여 평면으로부터 약 60°회전되어, 3'-말단 형태(여기서, 외부고리의 3' 치환체는 하향으로 돌출되어 내부 고리로부터 멀어진다)를 형성한다. 아미노-프로피온산 및 외부 페놀 고리는 각각 내부 고리의 양측에서 트랜소이드(transoid) 형태를 취한다. 아미노-프로피온산에 대한 토션각(X₁)은 300°이다.

아미노-프로피온산 치환체는 H2, H4 및 S3으로부터의 측쇄에 의해 형성된 극성 포켓에 느슨하게 패킹된다. 카르복실레이트 그룹은 Arg228의 구아니디늄 그룹 및 Ser277의 아미노 N과 직접적으로 수소결합을 형성한다. 또한, Arg262, Arg266 및 Asn179는 물 중재된 수소결합을 통해 카르복실레이트와 상호작용한다. 세 개의 아르기닌 잔기는 현저하게 양성인 국소 정전기적 전위를 발생시키며, 이러한 전위는 카르복실레이트의 음전하를 안정화시킬 수 있다. 아미노 질소에 의해서는 수소결합이 형성되지 않는다. 아미노-프로피온산 치환체의 상호작용은, 아미노 질소가 결여되어 있는 트리악이 T₃의 결합 친화성과 동일한 결합 친화성을 지니고 있다는 사실과 부합되어, 아미노 질소와 T₃의 지방족 장쇄가 결합 친화성에 크게 기여하지 않는다는 것을 나타낸다.

반면, 디페닐 에테르는 소수성 코어내에 매몰된다. 내부 고리는 H3, H5-6, 및 S3에 의해 형성된 소수성 포켓에 충전된다. 3-메틸 및 5-메틸 치환체에 대한 포켓은 완전히 충전되지 않으며, 그러한 이유는 디미트에 대한 메틸 치환체의 반 데르 발스 반경이 티로이드 호르몬 T₃에 의해 제공된 요오드 치환체 보다 작기 때문인 것으로 예측된다. 이러한 포켓은 전형적으로 25 내지 100평방 옴스트롱(치환체에 대해 보다 작은 포켓은 40 내지 80평방 옴스트롱 범위이지만)이며, 본원에 기재된 바와 같이 우수하게 들어맞는 화학적 치환체로 보다 조밀하게 충전될 수 있다.

외부 고리는 H3, H5-6, H7, H8, H11 및 H12, 및 H7과 H8 사이의 루프에 의해 형성된 포켓에 조밀하게 충전된다. 에테르 산소는 Phe218, Leu287, Leu276, 및 Leu292에 의해 형성된 소수성 환경에서 발견된다. 에테르 산소에 대한 수소 결합의 부재는, 감소되거나 무시될 만한 수소 결합 능력을 지니는 구조적으로 유사한 결합(linkages)과 호르몬 유사체와의 가능한 결합(binding)에 의해 제시되는 바와 같이, 페닐 고리의 정확한 입체화학을 입증하는 에테르 산소의 역할과 부합된다. 3'-이소프로필 치환체는 Gly290 및 291과 접촉한다. 포켓의 이러한 위치에 글리신이 존재하는 것은 3'-치환체의 활성과 크기 사이에서 관찰된 관계를 설명할 수 있게 한다. 활성은 3'-이소프로필에 대해서 최대이며, 추가되는 양에 의해 감소된다. 소수성 공동에서의 수소 결합만이 페놀성 히드록실과 His381 Ne2 사이에 형성된다. His381 형태는 Phe405와 Met256에 의해 제공된 접촉부를 패킹시킴으로써 안정화된다.

수소보다 큰 5'치환체의 존재는 호르몬에 대한 결합 친화성에 영향을 준다. 보다 광범위한 티로이드 호르몬, 즉, 3,5,3',5'-테트라요오도-L-티로닌(T₄)는 이러한 위치에서 요오드를 함유하고, 수용체를 T₃의 친화성의 2%로 결합시킨다. 구조는 T₄에 대한 구별이 Met256에 의한 입체적 충돌과 His381로부터 페놀성 히드록실로의 수소결합의 기하학적 구조에 의해 부과되는 가능한 제한요소의 조합을 통해 이루어진다는 것을 시사하고 있다. 5'위치는 프라임 고리로부터 연장되며, 길항제 또는 부분적인 작용제를 생성시키는 본원에 기재된 바와 같은 T3 및/또는 TR 작용제의 5'위치에서의 C-H의 화학적 변화를 도입시키기에 바람직한 영역이다.

결실 및 항체 경쟁 연구에서는 리간드 결합에서의 잔기 Pro162 내지 Val202의 관련을 제시하고 있다. 영역은 H2가 아미노-프로피온산기와 상호작용하는 극성 포켓을 형성하는 잔기에 대해 패킹되지만, 상기 영역은 결합된 구조에서 직접적으로 호르몬과 접촉되지 않는다. H2에 대한 한가지 역할은 결합된 상태로 이러한 잔기를 안정화시키는 것이다. β-스트랜드 S3 및 S4를 지니는 H2는 리간드에 대한 우세한 유입점을 나타낼 수 있는데, 그 이유는 리간드의 아미노-프로피온산기가 이러한 영역을 향해 배향되기 때문이다. T₃ 친화성 매트릭스에 대한 결합 수용체 연구는 아미노-프로피온산 기에 대한 결합만이 유지됨을 입증하여, 다른 결합에 존재하는 입체 장애가 결합을 방해한다는 것을 제시한다. 또한, 결정학적 온도 인자는 코일 및 β-스트랜드 영역이 도메인 도 7의 대부분의 유연성 부분이라는 것을 제시하고 있다. 호르몬을 결합시키는데 있어서의 이러한 영역, 즉, DBD와 LBD 사이의 힌지 도메인의 부분 관여는 DNA 결합에 영향을 끼치는 리간드 결합에 대한 구조적인 수단을 제공할 수 있으며, 그러한 이유는 힌지 도메인의 일부가 DNA와 접촉하기 때문이다.

핵 수용체 활성 도메인의 예로서 TR LBD 전사 활성화 헬릭스

리간드 결합 공동이 리간드로 부하된 경우에 접근불가능한 용제라는 놀라운 발견에 추가하여, TR LBD의 활성화 헬릭스는 하나 이상의 아미노산과 결합된 리간드 사이의 상호작용을 위한 리간드 공동에 대한 표면을 나타낸다. 활성화 헬릭스 또는 AF-2(LBD 활성 도메인의 예)로 일컬어지는 TR의 C-말단의 17개 아미노산은 호르몬 의존 전사 활성화를 중재하는데 연루된다. 도메인내의 키이(key) 잔기의 변이가 리간드 의존 활성화를 감소시키지만, 그러한 돌연변이가 리간드 코디네이션에 직접 영향을 주는지는 본 발명에 이르기까지 불분명하였다. 이러한 도메인의 어떠한 돌연변이는 리간드 결합을 감소시키거나 제거하는 것으로 주지되기는 하였지만, LBD의 보다 원거리 부위에서의 다른 돌연변이 또한 유사한 효과를 나타냈다.

핵 수용체중의 활성 도메인은 리간드의 분자 인식 도메인과 결합하는 LBD의 영역인 결합 공동에 유사한 3차원 관계를 나타낸다. 즉, 활성 도메인은 결합 공동(필수적으로는 리간드의 분자 인식 도메인)에 대한 그 자체의 일부를 나타낸다. 많은 핵 수용체는 레티노이드 수용체, RAR, 및 RXR, 글루코코르티코이드 수용체 GR, 및 에스트로겐 수용체 ER을 포함한 도메인을 지니는 것으로 예측된다. TR의 서열을 근거로 하여, 도메인은 양친매성 헬릭스 구조를 수용하도록 제안된다. β-시이트 또는 혼합된 2차 구조는 적게 관련된 핵 수용체에서 활성 도메인으로서 나타낼 수 있다.

활성 도메인내에서, 아주 잘 보존된 모티프 ΦΦXEΦΦ(여기서, Φ는 소수성 잔기를 나타낸다)는 수용체와 전사 활성보조인자 사이의 상호작용을 중재하도록 제안된다. 호르몬 의존 양상으로 TR과 결합하는 수 가지의 단백질이 확인되었다. 이러한 단백질중의 한가지로서 Trip1은 추정의 효모 활성보조인자인 Sug1에 관련되고, C-말단 활성 도메인 및 기본 전사 조직의 서브세트와 상호작용하여, TR에 의한 전이활성에서의 역할을 시사한다. RIP140, SRC1[문헌: Onate, S.A. et. al., Science 270:1354-1357(1995)] 및 TF-1[참조예: Ledouarim, B., et. al., EMBO J. 14:2020-2033(1995)]과 같은 그 밖의 단백질은 C-말단 도메인을 통해 리간드 의존 방법으로 다른 핵 수용체와 상호작용한다. 이러한 단백질의 결합은 본원에 기재된 TR 리간드, 특히, 아주 잘 보존된 모티프와 다른 단백질 사이의 상호작용을 입체적으로 억제하는 연장부를 지닌 TR 리간드를 사용하여 조절될 수 있다.

TR의 C-말단 활성 도메인은 양친매성 헬릭스인 H12를 형성하며, 이러한 H12는 수용체에 대하여 느슨하게 위치하여 호르몬 결합 공동의 일부를 형성한다. 헬릭스는 도 8에 도시된 바와 같이 용매내로 연장되는 고도로 보존된 글루타메이트를 포함한, 호르몬 결합 공동에 대하여 내부로 향하고 있는 소수성 잔기, 및 하전된 잔기로 패킹된다. TR LBD의 활성화 헬릭스는 리간드 결합 공동에 대한 Phe401을 나타내고 호르몬과의 직접적인 코디네이팅을 허용한다. 즉, 그러한 아미노산은 리간드와 상호작용하며, 외부 페닐 고리의 평면과 반 데르 발스 접촉을 형성한다. Phe405는 또한 His381과 상호작용하여, 아마도 이의 수소결합 형태, 즉, 바람직한 수소결합 상호작용을 안정화시킨다. 호르몬을 결합시키는데 있어서의 Phe401 및 Phe405의 관여는 이들 잔기의 돌연변이가 호르몬 결합 친화성을 어떻게 감소시키는지를 설명해 준다. 또한, 활성화시의 이들 돌연변이부의 영향은 쌍극성 상호작용의 증가된 수소 결합 상호작용을 통한 결합 구조내에서 도메인을 안정화시키는 역할로부터 유도되는 듯하다. Glu 403은 용매내로 연장되어 상호작용에서의 이의 중요한 역할을 강화한다. 현저하게 소수성인 표면의 바탕에 대하여 순차적인 잔기로서 표면상에 존재하는 Glu 403의 관찰된 형태에서, Glu 403은 도 9에 도시되고 본원에 기재된 활성화제 단백질과 상호작용할수 있다. 다른 하전된 잔기, Glu 405 및 Asp 406은 Phe 405에서 헬릭스 충돌부로서 불규칙적이다.

TR, γ2 및 γ3에서의 다른 두가지의 서열은 융합 단백질로서 DNA 결합 도메인과 함께 발현되는 경우에 전사를 활성화한다. TRB에서 발견된 이러한 서열은 H1(γ2)에서의 TR-α 잔기 Pro158-Ile168 및 H8과 H9(γ3)에서의 Gly290-Leu319에 상응한다. C-말단 활성 도메인과는 달리, γ2 및 γ3은 래트 TRα LBD에서 모듈러 분자 유닛을 나타내지 않으며, 단백질-단백질 상호작용을 위한 표면을 나타내지 않는다: γ3의 중요한 아스파르테이트/글루타메이트 잔기는 두 개의 별도의 헬릭스상에 위치하며, 단일의 표면을 형성하지 않고; γ2의 하전된 잔기는 LBD의 잔기와 이온쌍 상호작용을 한다. 따라서, γ2 및 γ3은 전체 수용체의 면에서 활성 도메인으로서 작용하지 않는다.

핵 수용체 LBD 리간드를 컴퓨터를 사용하여 설계하는 방법

핵 수용체 리간드 결합 도메인의 3차원 구조를 밝혀내는 것은 본원에 기재된 컴퓨터를 사용한 방법을 이용하여 핵 수용체에 대한 리간드를 설계하는데 있어서 중요하고 유용한 방법을 제공한다. 도면들을 참조하여 보면, 핵 수용체 리간드는 물이 접근할 수 없는 LBD내의 결합 공동내에 결합되고, 화학적 잔기가 리간드상의 소정의 위치에 첨가될 수 있는 것으로 결론내릴 수 있다. 이러한 화학적 변형부, 일반적으로 연장부는 보다 조밀한 충전(또는 보다 적은 물)을 위해 도면들에서 나타내고 있는 결합공동을 충전할 수 있거나, 화학적 변형부는 LBD의 3차원 모델의 도면에 도입되거나 나타내기 전에 리간드와 접촉되는 것이 아니라 아미노산과 접촉되거나 아미노산을 분열시키는데 사용될 수 있다. 핵 상과 구성원과 상호작용하는 리간드는 어떠한 리간드 유도된 형태상의 변화가 수행되는냐에 따라 작용제, 길항제 및 부분 작용제로서 작용할 수 있다.

작용제는 이들을 활성 형태가 되게 하여 양성적으로 또는 음성적으로 전사에 영향을 주게하는 수용체에서 변화를 유도한다. 수용체 형태에서의 몇가지 상이한 리간드 유도된 변화가 있을 수 있다.

길항제는 수용체에 결합되지만 수용체의 전사조절 특성 또는 생리학적으로 관련된 형태를 변화시키는 형태 변화는 유도하지 않는다. 길항제의 결합은 작용제의 결합 및 그에 따른 작용을 차단할 수 있다.

부분 작용제는 수용체에 결합하여 작용제에 의해 유도되는 수용체에서의 부분적인 변화만을 유도한다. 정성적 및 정량적 차이가 있을 수 있다. 따라서, 부분 작용제는 작용제에 의해 유도된 약간의 형태변화를 유도할 수 있지만, 다른 것에 의해 유도된 형태적 변화는 유도하지 않거나, 부분 작용제는 제한된 범위로 특정의 변화를 유도할 수 있다.

리간드 유도된 형태적 변화

본원에 기재된 바와 같이, 리간드가 결합되지 않은 수용체는 불활성이거나 약간 활성인 형태를 하고 있거나 억제제 활성을 나타내는 형태로 존재한다. 작용제 리간드의 결합은 수용체에서의 형태적 변화를 유도함으로써 수용체가 보다 더 활성적이게 하여 유전자의 발현을 자극하거나 억제한다. 수용체는 비-게놈성 작용을 나타낼 수 있으며, 약간의 공지된 형태의 변화 및/또는 이들의 후속형태가 본원에 기재되어 있다.

열 쇼크 단백질 결합

많은 핵 수용체에 있어서 리간드 결합은 열 쇼크 단백질의 분해를 유도하여 수용체가 대부분 이량체를 형성할 수 있게 하며, 그 후에 수용체는 DNA에 결합되고 전사를 조절한다.

핵 수용체는 일반적으로 LBD에 결합하는 영역을 나타내고 리간드를 LBD에 결합시킴으로써 조절될 수 있는 열 쇼크 단백질 결합 도메인을 지닌다. 그 결과, 열 쇼크 단백질 결합 도메인과 LBD의 결합 또는 접촉을 안정화시키는 리간드로부터의 연장된 화학적 잔기(또는 그 이상)가 본원에 기재된 컴퓨터를 사용한 방법을 이용하여 설계되어 부분 작용제 또는 길항제를 생성시킬 수 있다. 전형적으로 이러한 연장된 화학적 잔기는 리간드상의 분자 인식 도메인을 지나 연장될 수 있으며, 일반적으로는 리간드의 매몰된 결합 공동을 지날 수 있다.

이량체화 및 헤테로이량체화

리간드의 부재하에 hsp와 관련되는 수용체에 있어서, hsp의 해리는 수용체를 이량체화한다. 이량체화는 DBD와 LBD내의 수용체 도메인에 기인된다. 이량체화의 주된 자극은 hsp의 해리이지만, 수용체에서의 리간드 유도된 형태적 변화는 추가의 촉진에 영향을 끼칠 수 있다. 리간드의 부재하에 hsp와 관련되지 않는 수용체, 특히 TR에 있어서, 리간드 결합은 이량체화/헤테로이량체화의 패턴에 영향을 줄 수 있다. 이러한 영향은 DNA 결합 부위에 좌우되며, 또한, 수용체와 상호작용할 수 있는 다른 단백질과 관련된 프로모터에 좌우될 수 있다. 공통의 패턴은 DNA상의 이량체 형성에 비해 헤테로이량체 형성을 우선시하면서, 단량체 형성을 억제하는 것이다.

핵 수용체 LBD는 일반적으로 다른 핵 수용체에 결합하는 영역을 제공하고 리간드를 LBD에 결합시킴으로써 조절될 수 있는 이량체화 도메인을 지닌다. 그 결과, 이량체화 도메인의 결합 또는 접촉을 파괴하는 리간드로부터의 연장된 화학적 잔기(또는 그 이상)가 본원에 기재된 컴퓨터를 사용한 방법을 이용하여 설계되어 부분 작용제 또는 길항제를 생성시킬 수 있다. 전형적으로 이러한 연장된 화학적 잔기는 리간드상의 분자 인식 도메인을 지나 멀리 연장될 수 있으며, 일반적으로는 리간드의 매몰된 결합 공동을 지날 수 있다.

DNA 결합

hsp에 결합하는 핵 수용체에서, hsp를 리간드 유도 해리시켜 이량체를 형성시키고, DNA 결합을 촉진시킨다. 관련되지 않은 수용체에 있어서(리간드의 부재하에서와 같이), 리간드 결합은 헤테로이량체 및 이량체의 DNA 결합을 자극하며, DNA로의 단량체 결합을 억제한다. 그러나, 단일의 절반 부위를 함유하는 DNA에 있어서, 리간드는 수용체가 DNA에 결합하는 것을 자극하는 경향이 있다. 이러한 효과는 적당하며, DNA 부위의 특성에 좌우되고, 수용체와 상호작용할 수 있는 다른 단백질의 존재에도 좌우될 수 있다. 핵 수용체는 일반적으로 DNA에 결합하는 영역을 제공하는 DBD(DNA 결합 도메인)를 지니며, 리간드를 LBD에 결합시킴으로써 조절될 수 있다. 그 결과, DBD의 결합 또는 접촉을 파괴하는 리간드로부터 연장된 화학적 잔기(또는 그 이상)가 본원에 기재된 컴퓨터를 사용한 방법으로 설계되어 부분 작용제 또는 길항제를 생성시킬 수 있다. 전형적으로 이러한 연장된 화학적 잔기는 리간드상의 분자 인식 도메인을 지나 연장될 수 있으며, 일반적으로는 리간드의 매몰된 결합 공동을 지날 수 있다.

억제제 결합

리간드의 부재하에 hsp와 관련되지 않은 수용체는 종종 리간드의 부재하에 전사 억제제로서 작용한다. 이러한 작용은 수용체의 LBD에 결합하는 전사 억제제 단백질에 부분적으로 기인되는 듯하다. 작용제 결합은 수용체로부터의 이들 단백질의 해리를 유도한다. 이러한 작용은 전사의 억제를 완화시키고 수용체의 전사 전이활성 기능이 나타나게 한다.

전사 전이활성 기능

리간드 결합은 두가지의 기본적인 방법으로 전사 활성 기능을 유도한다. 첫 번째 방법은 수용체로부터의 hsp의 해리에 의한 것이다. 수용체의 이량체화 및 핵 염색질내의 DNA 또는 다른 단백질에 결합하는 수용체의 결합과 함께 진행되는 이러한 해리는 수용체의 전사 조절 특성이 나타나게 한다. 이는 특히 수용체의 아미노 말단에 대한 작용일 수 있다.

두 번째 방법은 수용체를 변형시켜 전사와 관련된 다른 단백질과 접촉시키는 것이다. 이러한 단백질은 인접한 프로모터의 원소 또는 인접한 프로모터의 단백질과 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 단백질일 수 있다. 또한, 상호작용은 스스로 인접한 프로모터의 단백질과 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 다른 전사 인자를 통해 이루어질 수 있다. 리간드 의존 방법으로 수용체에 결합하는 몇가지의 상이한 단백질이 기재되어 있다. 또한, 어떠한 경우에, 리간드 유도된 형태 변화는 수용체로의 다른 단백질의 결합에 영향을 주지 않지만, 전사를 조절하는 이들의 능력에는 영향을 끼친다.

핵 수용체 또는 핵 수용체 LBD는, 일반적으로 DNA에 결합하는 영역이 존재하고, 리간드를 LBD에 결합시킴으로써 조절될 수 있는 활성 도메인을 지닌다. 그 결과, 활성 도메인의 결합 또는 접촉을 파괴하는 리간드로부터 연장된 화학적 잔기(또는 그 이상)가 본원에 기재된 컴퓨터를 사용한 방법으로 설계되어 부분 작용제 또는 길항제를 생성시킬 수 있다. 전형적으로 연장된 화학적 잔기는 리간드상의 분자 인식 도메인을 지나 연장될 수 있으며, 일반적으로는 리간드의 매몰된 결합 공동을 지나 활성 도메인의 방향으로 연장될 수 있고, 상기 활성 도메인은 종종 지면 또는 더욱 통상적으로는 컴퓨터 스크린상에 2차원으로 도면에 도시된 3차원 모델에서 나타나는 바와 같이 헬릭스이다.

리간드 유도된 형태 변화

혈장 단백질은 단량체들 또는 도메인들 사이에 형성된 정적 결합 포켓을 통한 형태변화가 진행되지 않은채 호르몬과 결합한다. 예를 들어, 사량체 티로이드 결합 혈장 단백질 트랜스트래틴은 올리고머 계면에서 용매 접근 가능한 호르몬 결합 채널을 형성한다. 단백질의 구조는 리간드 결합을 지닌 메몰된 결합 공동의 발생에 있어서 호르몬과 결합시에 변화되지 않는다.

그러나, 래트 TR-α LBD와 같은 핵 수용체 LBD에 결합된 리간드에 대한 구조적 역할은 수용체가 결합된 상태와 비결합된 상태에서 상이할 수 있다는 것을 설명한다. 호르몬의 부재하에서, 수용체는 그의 코어, 즉, 비특정적인 구형의 단백질에 공동을 지닐 수 있다. 리간드(예, 호르몬)는 핵 수용체에 결합된 후에 활성 수용체의 소수성 코어를 형성한다. 수용체에 의한 리간드 결합은 역학적인 과정이고, 변화된 형태를 유도함으로써 수용체 기능을 조절한다.

호르몬 유도된 형태적 변화의 정확한 설명은 리간드 결합된 TR과 리간드 결합되지 않은 TR의 구조를 비교해야 한다. 리간드 결합되지 않은 사람 RXRα의 구조는 리간드 결합되지 않은 TR에 대한 모델을 대신할 수 있다. 래트 TR-α LBD 및 사람 RXRα LBD는 유사한 폴딩을 형성하고, 구조적인 유사성은 리간드 결합 후의 형태적 변화에까지 연장된다.

리간드 결합에 의해 유도된 것으로 여겨지는 두 구조 사이의 3가지의 주요 차이점이 있다. 첫 번째로는, 결합된 래트 TR-α LBD 구조는 보다 조밀하며, 호르몬은 수용체의 소수성 코어내에 조밀하게 패킹된다. 반면, 리간드 결합되지 않은 사람 RXRα LBD는 수개의 내부 소수성 공동을 함유한다. 각각의 공동이 존재하는 것은 폴딩된 단백질에서 일반적인 것이 아니며, 리간드 결합되지 않은 상태의 수용체를 반영하는 것이다. 이들 공동중의 두 공동은 9-시스 레티노산에 대한 가능한 결합부위로서 제안되었으며, 이들의 다중 부위가 리간드 결합된 래트 TR-α LBD에서 관찰된 단일의 매몰된 결합 공동과 부분적으로만 중첩된다.

두 번째 차이는 일부의 호르몬 결합 공동에 기여하는 래트 TR-α LBD에서의 H11과 연관된다. 래트 TR-α LBD에서 연속적인 H11은 RXR내의 Cys 432에서 파괴되어 hRXRα내의 H10과 H11 사이의 루프를 형성한다. 이러한 잔기는 리간드의 외부 고리 히드록실에 수소결합을 제공하는 TR내의 His381에 상응한다. 또한, 래트 TR-α LBD내의 리간드에 의해 충전된 호르몬 결합 공동은 동일한 루프에 의해 hRXRα에서 중단되어 H6 및 H7과 함께 RXR내의 분리된 소수성 포켓을 형성한다. 결합된 래트 TR-α LBD에서, 상응하는 헬릭스 H7 및 H8은 결합 포켓과 인접하고, 아래로부터 호르몬 결합 공동을 둘러싸고 있다.

두 수용체 사이의 세 번째 차이는 C-말단 활성 도메인의 위치이다. C-말단 활성 도메인은 두 수용체 모두에서 α-헬릭스을 형성하지만, 래트 TR-α LBD내의 도메인은 프롤린 풍부한 회전부 이후에 위치하며, 수용체에 반하게 위치하여 결합 공동의 일부에 기여한다. 반면, 리간드가 결합되지 않은 hRXRα내의 활성 도메인은 용매내로 돌출하는 보다 긴 헬릭스의 일부이다.

이러한 차이는 리간드의 부재하에 가정된 TR LBD의 또다른 형태에 대한 모델을 유도한다. 리간드가 결합되지 않은 TR에서, 호르몬 결합 공동을 둘러싸고 있는 수용체의 서브도메인은, 수용체에 대한 부분적인 코어를 제공하는 부분적으로 구성되지 않은 H11에 의해 폐색된 결합 공동에 느슨하게 패킹된다.

호르몬과 결합되는 경우에, 비결합된 수용체내의 코일을 형성하는 잔기는 리간드와 결합되고, H11로 이어진다. H11의 정렬(ordering)은 소수성 공동을 차단하지 않아서, H7 및 H8이 호르몬과 상호작용하게 한다. 이어서 연장된 소수성 공동은 호르몬 주위를 파괴하여 조밀하게 결합된 구조를 생성시킨다.

리간드 결합시에 재패킹되는 리간드 비결합된 TR내의 연장된 구조에 부분적으로 좌우되는 C-말단 활성 도메인에서의 리간드 유도된 형태변화를 예측할 수 있을 것이다. 리간드 유도된 형태변화는 회전(393-PTELFPP-399)에서의 래트 TR-α의 아미노산 서열이 래트 TR-α의 펩티드 쇄의 성향을 현저하게 감소시켜 α-헬릭스를 형성시키고, 그 결과 재충전이 용적에 있어서 보다 작은 변화만을 갖는 재패킹이 수행될수 있기 때문에 구별하기 어려울 수 있다.

리간드 유도된 형태변화가 발생된 후에, 결합된 구조에서의 C-말단 활성 도메인의 형태는 비결합된 형태의 수용체에 비해 패킹을 변화시킨다. 리간드의 결합은 활성 도메인의 안정성을 개선시킨다. 활성 도메인은 전체 LBD에 대한 패킹 상호작용의 분포에 의해 측정되는 바와 같이 결합된 구조에서도 느슨하게 패킹된다. 4.5Å내의 원자수로 정의된 활성 도메인의 패킹 밀도는 평균 미만의 1.5 표준편차이다. 비교 설명하면, 또 다른 표면 헬릭스, H1은 평균 미만의 0.5 표준편차이고, 이러한 구조의 가장 불량하게 패킹된 부분, 즉, 잔기 Ile196-Asp206으로부터의 불규칙 코일은 평균 미만에서 2.0 표준편차를 나타낸다. 또한, 결합된 수용체에서의 C-말단 도메인에 대한 주요 패킹 접촉부는 His381과 같이 리간드와 상호작용하는 잔기 또는 리간드 그 자체에 의해 제공된다. 이들 잔기의 형태는 결합 수용체 및 비결합된 수용체 사이에 차이가 있는 것으로 예측될 수 있고, 이들의 상호작용에 좌우되는 C-말단 활성 도메인의 형태를 신장시킴으로써 상이하게 되는 것으로 예측된다. 결합된 리간드에 의해 부여된 안정화가 없으면, C-말단 활성 도메인은 호르몬 결합 전에 무질서하게 된다.

리간드 유도된 형태 변화의 상호관련은 본원에 기재된 바와 같이 명백하다. 예를 들어, H11로부터의 His381과 H12로부터의 Phe405는 결합된 구조내에서 상호작용하여 페놀성 히드록실로의 특이적 수소결합을 제공한다. H11과 H12에 영향을 주는 리간드 유도된 변화는 강화되어 조밀하게 결합된 상태를 형성시킨다.

리간드의 신장과 3차원 모델을 이용한 컴퓨터 이용 방법

티로이드 수용체 길항제와 같은 새로운 핵 수용체 합성 리간드의 개발에 큰 도움이 될, 리간드 결합된 TR 수용체의 3차원구조는 제시된 바가 없다, 또한, 이러한 수용체의 상과는 본원에서 참조로 인용하고 있는 EP 335 628호, 미국특허 제5,463,564호에 개시된 것과 같은 3차원구조 규명 및 조합적인 화학분석을 포함한 통상의 방법에 전반적으로 매우 적합하다. 수용체의 가용성으로 인해 X-선 크리스탈로그래피를 이용한 구조 측정이 가능하다. 본 발명을 수행하는 경우에 크리스탈로그래피 데이터를 이용하는 컴퓨터 프로그램은 이들 수용체에 대한 리간드의 회전 설계를 가능하게 할 것이다. 라스몰(RASMOL)과 같은 프로그램은 발명을 수행함으로써 생성되는 결정으로부터의 원자 코디네이트에 이용되거나, 3차원 모델을 형성시키고/거나 리간드 결합과 관련된 구조를 측정함으로써 발명을 수행하는데 이용될 수 있다. 인사이트(INSIGHT)와 그라스프(GRASP)와 같은 컴퓨터 프로그램은 새로운 구조를 도입시키는 추가의 조작 및 가능성을 실현시킬 수 있다. 또한, 많은 양의 결합 및 생활성 검정이, CDL의 활성을 측정하기 위한 본원에 기재되어 있고 본 기술분야에 공지되어 있는 정제된 재조합 단백질 및 새로운 리포터 유전자 전사 검정을 이용함으로써 유도될 수 있다.

일반적으로 핵 수용체 합성 리간드를 설계하는 컴퓨터를 이용한 방법은 하기 2 단계를 포함한다:

1) 리간드가 결합된 핵 수용체 LBD를 포함하는 결정화된 단백질의 3차원 모델을 사용하여 리간드의 제 1 화학 잔기(하나 이상)와 상호작용하는 핵 수용체 LBD의 아미노산(들)을 결정하는 단계; 및

2) 제 1 화학 잔기의 화학적 변형(하나 이상)을 선택하여, 상호작용 아미노산과 제 1 화학 잔기 사이의 상호작용과 비교하여, 상호작용 아미노산과 제 2 화학 잔기 사이의 상호작용을 감소시키거나 증강시키는 구조를 갖는 제 2 화학 잔기를 생성시키는 단계.

본원에 제시된 바와 같이, 상호작용 아미노산은 리간드와의 접촉부를 형성하고 상호작용하는 아미노산의 원자의 중심은 일반적으로 리간드의 원자의 중심으로부터 2 내지 4 Å(옹스트롬) 떨어져 있다. 일반적으로 이 거리는 본원 및 매크리(McRee, 1993)에 설명된 바와 같이, 컴퓨터에 의해 결정되지만, 거리는 일단 3차원 모델이 제조되면 수동적으로 결정될 수 있다. 상호작용 아미노산의 예는 부록 2에 기술되어 있다. 또한 3차원 모델의 입체 화학도에 있어서 하기 문헌을 참조한다[참조 문헌: Wagner et al., Nature 378(6558):670-697 (1995)]. 더욱 통상적으로, 리간드의 원자와 상호작용 아미노산의 원자는 3 내지 4 Å 떨어져 있다. 본 발명은 단계 1 및 2를 반복하여 LBD에 리간드의 맞춤부를 정제시키고 작용제와 같은 더 좋은 리간드를 결정함으로써 실시될 수 있다. 도면에 제시된 바와 같이 TR의 3차원 모델은 2차원으로 표현되어 리간드와 접촉하는 아미노산을 결정하고, 화학적 변형을 위한 그리고, 화학적 변형전의 상호작용과 비교하여 특정 아미노산과의 상호작용의 변화에 대한 리간드상의 위치를 선택할 수 있다. 화학적 변형은 컴퓨터를 사용하거나, 수동적으로 3차원 모델의 2차원 표현을 사용하거나 화학적으로 리간드를 합성시킴으로써 제조될 수 있다. 3차원 모델은 부록 2 및 도면을 사용하여 제조될 수 있다. 추가 단계에서와 같이, 3차원 모델은 당해 분야에 공지된 결정화된 단백질로부터 핵 수용체 LBD의 원자 코디네이트를 사용하여 제조될 수 있다. 본원의 참고 문헌인 매크리(1993)을 참조한다.

리간드는 또한 리간드의 화학적 변형 후에 원거리 아미노산과 상호작용하여 새로운 리간드를 형성시킬 수 있다. 원거리 아미노산은 일반적으로 화학적 변형전에 리간드와 접촉하지 않는다. 화학적 변형은 리간드로부터 일반적으로 4.5Å 이상 떨어져 있는 원거리 아미노산과 상호작용하는 새로운 리간드로서 제조하기 위해 리간드의 구조를 변화시킬 수 있다. 종종 원거리 아미노산은 결합 공동의 포켓 또는 표면의 일부가 되기에는 리간드로부터 너무 떨어져 있기 때문에, 리간드에 대한 결합 공동의 표면을 정렬시키지 않을 것이다.

LBD 아미노산의 원자와 LBD 리간드의 원자간의 상호작용은 자연적으로 발생하는 어떠한 힘 또는 인력에 의해 성립될 수 있다. 일반적으로 아미노산의 원자와 리간드 원자간의 상호작용에 의해 수소 결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 쌍극자 상호작용이 일어날 것이다. 소수성 상호작용의 경우에 이것은 아미노산과 리간드간의 상호작용 자체라기 보다는, 오히려 소수성 표면으로부터 다른 친수성기 또는 물의 반발력의 일부인 것으로 인식된다. LBD 및 리간드의 상호작용의 감소 및 증강은 전산적으로 결합 에너지를 계산하거나 시험함으로써 또는 당해 분야에 공지된 열역학 또는 반응속도론적 방법을 사용하여 측정될 수 있다.

화학적 변형은 종종 LBD 아미노산의 원자와 LBD 리간드의 원자간의 상호작용을 증강시키거나 감소시킬 것이다. 입체 장애는 LBD 결합 공동과 활성 도메인과의 상호작용을 변화시키는 통상적인 수단일 것이다. 화학적 변형은 바람직하게는, 리간드의 C-H, C- 및 C-OH 위치에서 유도되고, 여기에서 탄소는 개질이 완료된 후에 동일하게 유지되는 리간드 구조의 부분이다. C-H의 경우에, C는 1, 2 또는 3개의 수소를 가질 수 있으며, 일반적으로 단지 하나의 수소가 대체될 것이다. H 또는 OH는 개질이 완료된 후에 제거되고 원하는 화학 잔기로로 대체된다.

티로이드 수용체는 호르몬 결합 핵 수용체의 더 큰 상과의 구성원이기 때문에, 작용제 및 길항제 발달에 있어서의 규칙은 전체 상과에 대한 리간드를 설계하는데 유용한 것으로서 당업자에게 인식될 것이다. 에스트로겐 및 안드로겐 수용체의 공지된 작용제 및 길항제의 구조를 조사하면 도 10에 제시된 바와 같이 작용의 대부분의 길항제 메카니즘을 지지한다.

리간드 결합되지 않은 RXR의 보고된 구조와 다른 상과 구성원의 아미노산 서열과의 비교를 기초로 한 수용체의 전체 폴딩은 상과의 수용체의 전반적인 폴딩이 유사하다는 것을 나타낸다. 이와 같이, 작용제 또는 길항제 리간드 주위에 핵 수용체의 폴딩의 일반적인 패턴이 있는 구조로부터 예상된다.

리간드가 결합된 핵 수용체의 3차원 구조는, 핵 수용체가 작용제 리간드 주위에서 폴딩되고, 결합 공동이 작용제, 특히 작용제 분자 인식 도메인에 맞춰지기 때문에, 길항제는 공통적으로 리간드, 특히 작용제를 지나 확장된 화학 구조를 갖고, 리간드 주위의 수용체의 폴딩을 억제하여 동일한 효과를 갖는 매립된 결합 공동 또는 다른 기를 형성한다는 비명백한 관찰을 초래한다. 확장 위치는 구조에 의해 지시된 바와 같이 다양한 방식으로 폴딩에 영향을 줄 수 있다. 길항제상에서 이러한 확장은 상응하는 작용제와 비교하여 다양한 수용체에 대해 도 10에 제시되어 있다.

예를 들어, 카르복시 말단 활성화 헬릭스로의 확장은 수용체 체내로 상기 헬릭스의 충전/폴딩에 영향을 준다. 이는 카르복시 말단 전이활성 도메인(헬릭스 12 포함)과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용할 수 있는 수용체의 아미노 말단, 또는 선형 수용체의 반대 말단상의 전사 전이활성 작용을 포함하여, 수용체의 다른 부분 또는 다른 단백질과 상호작용하는 핵 수용체의 상기 부분의 능력에 영향을 줄 수 있다. 이 방향으로의 확장은 또한 수용체의 체내로 TR의 헬릭스 11( 또는 핵 수용체에서 이것과 유사한 헬릭스)의 패킹에 영향을 줄 수 있고 선택적으로 수용체의 이량체화 및 헤테로 이량체화에 영향을 줄 수 있다. 헬릭스 1을 향하는 확장은 DNA 결합 도메인과 리간드 결합 도메인을 갖는 수용체의 힌지 영역과의 관계에 영향을 줄 수 있고 선택적으로 또는 부가적으로 DNA에 대한 수용체 결합 및/또는 수용체의 상기 영역과 상호작용하는 단백질과 수용체의 상호작용에 영향을 줄 수 있다. 헬릭스 11을 향한 다른 확장은 헬릭스 11 및 헬릭스 1과 10의 충전에 영향을 줌으로써 이량체에 영향을 줄 수 있다. 상기 화학적 변형은 본원에 설명된 컴퓨터를 사용한 방법을 통해 평가될 수 있다. 또한 일부 경우에, 확장부는 리간드 주위에서 다른 방식으로 완전하게 또는 불완전하게 폴딩되는 수용체를 통해 돌출될 수 있다. 상기 돌출 확장부에는 활성보조인자 또는 다른 단백질과의 상호작용에 대한 입체적 차단이 존재할 수 있다.

결합 공동에 매립된 리간드를 갖는 3차원 구조는 리간드를 축적시키고 둘러싸기 위해 이동하는 하나 이상의 구조적 요소로 이루어지는 힌지 및 리드(lid)를 함유하는 결합 공동을 갖는 핵 수용체를 간단하게 설명한다. TR에 대한 리간드는 열린 상태, 부분적으로 열리거나 닫힌 상태에서 리드 및 힌지 영역이 이탈하도록 작용하여 부분적인 작용제 또는 길항제 작용을 달성하는 특이적 부류의 화학 그룹을 갖는 특정 부위상에서 개질될 수 있다. 이러한 상태에서, TR의 생물학적 반응은 상이하여, 구조는 원하는 효과를 갖는 특정 화합물을 설계하는데 사용될 수 있다.

TR-T₃ 복합체의 3차원 구조의 지식은 작용제 및 길항제 설계에 대한 일반적인 모델을 유도한다. 구조 자료의 중요한 신규 특징은 T₃ 리간드가 단백질의 중심 소수성 코어내에 완전하게 매립된다는 점이다. 핵 수용체 상과에 속하는 다른 리간드-수용체 복합체는 유사하게 매립된 리간드 결합 부위를 가져서 이 모델은 전체 상과에 대한 작용제/길항제 설계에 유용할 것이다.

길항제의 설계가 요구되는 경우, 리간드-수용체 복합체의 정상적인 작업부를 간섭하는 "확장 그룹"을 혼입시키는 동안 천연 호르몬 작용제의 주요한 결합 접촉을 보존시키거나 수용체 도메인과 확장부의 상호작용을 통해 필수적인 결합 친화도를 발생시킬 필요가 있다.

길항제 설계에 적용되고 본원에 설명된 모델은 "확장 모델(Extension Model)"이라고 한다. 핵 수용체에 대한 길항제 화합물은 수용체에 대한 고친화성 결합을 촉진시키는 동일하거나 유사한 그룹을 함유하여야 하고, 부가적으로, 상기 화합물은 거대하고/거나 극성일 수 있는 측쇄를 함유하여야 한다. 이 측쇄는 실제 확장부이여서, 거대한 상태로 주어지거나, 작용제 리간드와 상이한 하전 작용을 갖는 사이드 그룹(side group)일 수 있다. 예를 들어 21번 위치에서 CH₂OH를 CH₃로 치환, 및 11번 위치에서 OH기로부터 코르티솔의 케토 그룹으로의 변성은 글루코코르티코이드 길항제 활성을 일으킨다 [참조 문헌: Robsseau, G.G., et al., J. Mol. Biol. 67:99-115 (1972)]. 그러나, 대부분의 경우에 효과적인 길항제는 더욱 거대한 확장부를 갖는다. 이와 같이, 안티글루코코르티코이드( 및 안티프로게스틴) RU486은 11번 위치에서 거대한 사이드 그룹을 함유한다 [참고 문헌: Horwitz, K.B. Endocrine Rev. 13:146-163 (1992)]. 그 후 길항제 화합물은 합당한 고친화도(100nM)로 수용체의 매립된 리간드 결합 부위내에 결합될 것이지만, 확장 작용은 수용체-리간드 복합체가 전사 인자 작용에 필요한 필수적인 형태에 채택되는 것을 방지할 것이다. 길항 작용(작용제 또는 길항제중에서 일어날 수 있음)은 HRE에서 수용체 호모/헤테로 이량체 형성을 방지하거나, 수용체 단량체, 호모 이량체 또는 호모/헤테로 이량체에 대한 활성보조인자 결합을 방지하거나, HRE에 대한 리간드 유도 효과에 의해 매개된 호르몬 반응성 유전자의 전사를 다르게 방지하는 이들 효과의 조합에 의한 것을 포함하는 여러 가지 방식으로 분자 수준에서 그 자체를 명시할 수 있다. 길항 작용이 확장 가설에 의해 설명될 수 있는 종래 기술에서 핵 수용체에 대한 수가지 길항 화합물이 있다 [참고 문헌: Horwitz, K.B., Endocrine Rev., 13:146-163 (1992), Raunnaud J.P. et al., J. Steroid Biochem. 25:811-833 (1986), Keiel S., et al., Mol. Cell. Biol. 14:287-298 (1994)]. 이들 화합물은 이들의 작용제 대조물과 함께 도 10에 제시되어 있다. 이들 길항제 각각은 작용제 또는 작용제 유사 코어 구조에 부착된 거대 확장기를 함유한다. 중요하게는, 이들 길항제 화합물은 우연히 발견되었으며 확장 원리와 같은 구조 작용 가설을 이용하여 설계되지 않았다.

확장 가설을 사용하는 티로이드 길항제를 설계하는 한 가지 방법은 교습 실시예로서 하기에 제공된다. 종래 기술, 특히 본원의 참고 문헌에 공개된 구조 활성 자료와 조합된 TR-α디미트 복합체의 3차원 구조는 고친화성 리간드 결합에 가장 중요하게 수반되는 하기 리간드-수용체 상호작용을 체계화하는데 사용될 수 있다. 이들 상호작용의 물리적 사진은 도 6에 제시되어 있다. 도면은 리간드 결합을 위한 단리된 필수 접촉을 설명하고 있다. 리간드는 수용체의 중심에 매립되기 때문에, 이들 단리된 상호작용물 사이에 공간을 두고 있는 구조가 또한 중요하다. 이와 같이, 이러한 시스템의 발명자의 현 지식은 예를 들어, 수용체에 대해 새롭게 설계된 리간드가 티로닌 구조 골격, 또는 하나의 원자 스페이서에 의해 결합된 2개의 치환된 아릴을 함유해야 하는 것으로 규정하고 있다.

확장 가설에 의해 설계된 길항제에 대한 일반적인 구조는 하기의 TR 길항제(화학식(1)과 관련됨)의 치환기의 일반적 설명으로 예시된다: R1은 카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트, 설페이트 또는 설파이트와 같은 음이온기를 가질 수 있고 하나 이상의 C, O, N, S 원자를 포함하는 0 내지 3개 원자 링커, 바람직하게는 2개의 탄소 링커로 고리에 연결된다. 상기 R1은 임의로 아민(예를 들어 -NH₂)으로 치환될 수 있다. R3 및 R5는 -Br, -I, 또는 -CH₃와 같은 작은 소수성기이다. R3 및 R5는 동일하거나 상이한 치환기일 수 있다. R₃'는 -I, -CH₃, -이소프로필, -페닐, -벤질, 5 및 6 고리 헤테로시클릭과 같은 R3 및 R5의 경우보다 더 클 수 있는 소수성기일 수 있다. R₄'는 공여체 또는 수용체로서 수소 결합에 기여할 수 있는 그룹이다. 상기 그룹은 -OH, -NH₂, 및 -SH를 포함한다. R₅'는 이 화합물을 길항제로 만들 수 있는 중요한 확장 그룹이다. R₅'는 장쇄 알킬(예를 들어, 탄소수가 1 내지 9인 직쇄 또는 측쇄), 아릴(벤질, 페닐 및 치환된 벤질 및 페닐 고리(예를 들어, 할로겐, 알킬(탄소수 1 내지 5)을 갖고, -CH₂-에 의해 고리에 연결되거나 연결되지 않음), 헤테로사이클(예를 들어, 5 또는 6개의 원자, 바람직하게는 5개의 탄소 및 1개의 질소, 또는 5개의 탄소)일 수 있고, 이들은 극성(예를 들어, -OH, NH₂ 및 -SH), 양이온(예를 들어, -NH₃, -N(CH₃)₃), 및 음이온(카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트 또는 설페이트) 그룹을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. R₅'는 또한 극성(예를 들어, -OH, NH₂ 및 -SH), 양이온(예를 들어, -NH₃, -N(CH₃)₃), 및 음이온(카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트 또는 설페이트) 그룹일 수 있다. X는 적당하게 2개의 방향족 고리에 위치하는 스페이서 그룹이다. 이 그룹은 일반적으로 O, S, SO, SO₂, NH, NZ(여기에서, Z는 알킬, CH₂, CHOH, CO, C(CH₃)OH 및 C(CH₃)(CH₃) 이다)와 같은 1개 원자의 스페이서이다. R2, R6, R2' 및 R6'은 -F, 및 -Cl 일 수 있고 바람직하게는 H이다.

TR 리간드는 또한 치환된 R5' 및 R3' 그룹을 갖는 치환된 페닐화된 3,5 디요도 티로신으로서 설명될 수 있다. R5'는 장쇄 알킬(예를 들어, 탄소수가 4 내지 9인 직쇄 또는 측쇄), 아릴(벤질, 페닐 및 치환된 벤질 및 페닐 고리(예를 들어, 할로겐, 알킬(탄소수 1 내지 5)을 갖고, -CH₂-에 의해 고리에 연결되거나 연결되지 않음), 헤테로사이클(예를 들어, 5 또는 6개의 원자, 바람직하게는 5개의 탄소 및 1개의 질소, 또는 5개의 탄소)일 수 있고, 이들은 극성(예를 들어, -OH, NH₂ 및 -SH), 양이온(예를 들어, -NH₃, -N(CH₃)₃), 및 음이온(카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트 또는 설페이트) 그룹일 수 있다. R5'는 또한 극성(예를 들어, -OH, NH₂ 및 -SH), 양이온(예를 들어, -NH₃, -N(CH₃)₃), 및 음이온(카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트 또는 설페이트) 그룹일 수 있다. R3'는 -IsoPr, 할로겐, -CH₃, 알킬(탄소수 1 내지 6) 또는 아릴(벤질, 페닐 및 치환된 벤질 및 페닐 고리(예를 들어, 할로겐, 알킬(탄소수 1 내지 5)을 갖고, -CH₂-에 의해 고리에 연결되거나 연결되지 않음), 헤테로사이클(예를 들어, 5 또는 6개의 원자, 바람직하게는 5개의 탄소 및 1개의 질소, 또는 5개의 탄소)일 수 있고, 이들은 극성(예를 들어, -OH, NH₂ 및 -SH), 양이온(예를 들어, -NH₃, -N(CH₃)₃), 및 음이온(카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트 또는 설페이트) 그룹일 수 있다.

TR 길항제는 또한 개질된 T₃ 작용제(디페닐 구조를 가짐)일 수 있으며, 여기에서 R₅'는 알킬, 아릴, 5원 또는 6원 헤테로시클릭 방향족, 헤테로알킬, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 알킬, 폴리방향족, 폴리헤테로방향족, 극성 또는 하전된 그룹이고, 상기 R₅'는 극성 또는 하전된 그룹으로 치환될 수 있다. R₅'는 본원에 설명된 바와 같이 정의된다.

이러한 방법을 사용하여 본 실시예의 리간드는 하기 성질들을 갖는 것이 바람직하다:

1. 화합물은 고친화도(예를 들어 100nM)로 TR에 결합되어야 한다.

2. 화합물은 천연 호르몬과 동일한 기본 배향에서 수용체와 결합하여야 한다.

3. 확장 기 R5'는 수용체의 활성화 헬릭스(C 말단 헬릭스)를 향하여 돌출되어야 한다.

4. R₅'에서 적당한 치환기는 매개 전사에 필요한 이것의 최적 국부 구조로부터 활성화 헬릭스을 교란시켜야 한다.

길항제는 또한 어느때나 폴딩의 한 일면 보다 많이 차단하기 위해 다수의 확장부로 설계될 수 있다.

TR 리간드(예를 들어, 초 작용제)는 리간드 분자 인식 도메인상의 하나 이상의 화학 잔기와 하나 이상의 아미노산의 상호작용을 증강시키도록 설계( 및 합성)될 수 있다. 하나의 방법은 T₃(R1 위치)의 카르복실레이트를 포스포네이트, 포스페이트, 설페이트 또는 설파이트로 대체함으로써 하전 및 극성 상호작용을 증강시키는 것이다. 이것은 Arg 262, Arg 266 및 Arg 228과의 상호작용을 증강시킨다. 리간드 분자 인식 도메인상의 하나 이상의 화학 잔기와 하나 이상의 아미노산의 상호작용은 또한 디미트가 결합되는 경우(R1과 관련됨) 물에 의해 점유된 공간을 충전시키기 위해 R1 그룹의 크기를 증가시킴으로써 증강될 수 있다. 바람직하게는 그룹은 상보 하전 및 결합 공동에 대한 소수성을 갖는다.

리간드 분자 인식 도메인상의 하나 이상의 화학 잔기와 하나 이상의 아미노산의 상호작용을 개선시키는 또 다른 방법은 용액중의 티로닌 리간드의 2개의 페닐 고리 사이의 2면각의 형태를 제한하는 것이다. 용액중에서 2개의 페닐 고리의 평면은 2면각이 90°인 직각이다. TR 디미트 구조에서, 2면각은 60°에 가깝다. 2개의 페닐 고리간의 각도를 고정시키는 TR 리간드는 결합을 더 단단하게 할 것이다. 상기 리간드는 티로닌 또는 치환된 티로닌형 디페닐의 R6' 및 R5 위치를 연결시킴으로써 제조될 수 있다. 고리형 연결의 크기는 2개의 페닐 고리간의 각도를 고정시킬 수 있다. 구체적으로 화학식(1)에 관하여, 하기 사이클릭 변형이 바람직하다: 1) R₅는 R₆'에 연결되고, 2) R₃는 R₂'에 연결되거나 3) R₅는 R₆'에 연결되고 R₃는 R₂'에 연결된다. 연결은 1 내지 6개의 원자 및 바람직하게는 2 내지 4개의 탄소 원자 또는 다른 원자를 갖는 알킬 또는 헤테로알킬 쇄에 의해 이루어질 수 있다. 헤테로알킬 쇄의 모든 위치는 N, O, P 또는 S 일 수 있다. 상기 헤테로 알킬 쇄에 따른 S 및 P 헤테로 원자는 이들의 가능한 산화 상태 중 어느 하나이다. 알킬 또는 헤테로알킬 쇄에 따른 N 헤테로 원자 또는 탄소는 하나 이상의 Z 치환기를 가질 수 있으며, 여기에서 Z는 알킬, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 5원 또는 6원 헤테로사이클릭 방향족이다. 이러한 화합물은 청구될 수 있으면, 단 화학식(1)이 이 출원의 출원일에 대한 종래의 기술에서의 화합물을 전혀 포함하지 않는 것을 조건으로 한다.

리간드 분자 인식 도메인상의 하나 이상의 화학 잔기와 하나 이상의 아미노산의 상호작용은 또한 브릿징 산소의 영역(예컨대 T3, 트리악 또는 디미트에서의 산소)에서 TR 리간드와 LBD 사이의 충전되지 않은 공간을 충전시키는 화학적 변형을 선택함으로써 증강될 수 있다. 이와 같이, 에테르 산소를 대체하는 다소 더 큰 잔기는 결합을 증강시킬 수 있다. 상기 링커는 모노- 또는 제미날- 이치환 탄소 그룹일 수 있다. 이치환된 탄소에 대해 작고, 소수성인 그룹 이외에도, 산소와 크기가 거의 같지만 소수성이 더 큰 그룹이 바람직하다.

티로이드 호르몬 수용체에 대한 TR-α 및 TR-β 선택성

본원에 설명된 방법을 사용하여 베타 TR 보다 알파 TR에 선택적으로 결합하는 리간드가 설계될 수 있다. 래트의 TR-α LBD의 X-선 크리스탈로그래피 구조는 상기 리간드의 설계로 식별을 가능하게 한다.

3차원 구조는 리간드 결합 공동에서 TR-α와 TR-β 사이의 주요 차이가 래트의 TR-α에서 아미노산 Ser 277(사이드 그룹 -CH₂OH를 가짐)에 존재하고 이것의 상응하는 잔기는 사람 TR-β에서 아스파라긴 331(사이드 그룹 -CH₂CONH₂를 가짐)이다. 사람 TR-β에서 측쇄는 더 크고, 하전되고, 상기 차이를 구별하는 화합물을 합성시키는 상이한 수소 결합 전위를 갖는다.

예를 들어, TR-α와 트리악의 복합체에서, Ser 277은 리간드 결합에 관여하지 않는다. Ser 277(베타에서는 Asn 331)에 대한 역할의 부재는 알파 및 베타 이소폼에 대한 트리악의 균등한 친화도와 일치하고, 간접적으로 알파/베타 선택도가 Ser 277에서 Asn 331의 아미노산 치환 및 Arg 228과의 상호작용에 존재한다는 주장을 지지한다.

리간드 설계의 용어에서, 이들 차이는 β-선택 리간드에 있어서, 하기 차이점의 일부 또는 전부가 이용되어야 하는 것을 의미한다:

1. 더 큰 측쇄 아스파라긴의 존재.

2. 강한 수소 결합 공여체를 제공하는, 측쇄상의 카르보닐 그룹의 능력.

3. 2개의 수소 결합 수용체를 제공하는, 측쇄상의 아미노산의 능력.

4. T3 포켓내에 트랩된 물을 재유기화시키기 위한 극성의 조정.

약제학적 설계의 용어에서, 이들 차이는 α-선택 리간드에 있어서, 하기 차이점의 일부 또는 전부가 이용되어야 하는 것을 의미한다:

1. 더 작은 사이드 그룹의 존재.

2. 약한 수소 공여체를 제공하는, -CH₂OH 사이드 그룹상의 히드록실 그룹, 측쇄상의 카르보닐 그룹의 능력.

3. T3 포켓내에 트랩된 물을 재유기화시키기 위한 극성의 조정.

2가지 경우에서 이들 차이는 여러 가지 방식으로 이용될 수 있다. 예를 들어, 이들은 또한 비오심(Biosym)-MSI와 같은 신규 유기 분자의 구성을 위해 제작된 소프트웨어를 이용하여 사용될 수 있다.

처리 방법

화학식(1)의 화합물은 의학적 처리에 유용할 수 있고 하기 시험에서 증명될 수 있는 생물학적 활성도를 나타낸다:

(i) 미토콘드리아 α-글리세로포스페이트 디히드로게나아제(GPDH:EC 1.1.99.5)의 유도. 이 검정은 일부 종, 특히 래트에서, 미토콘드리아 α-글리세로포스페이트 디히드로게나아제가 반응성 조직, 예를 들어 간, 신장 및 심장에서 근접하게 관련된 방식으로 티로이드 호르몬 및 티로미메틱(thyromimetics)에 의해 구체적으로 유도되기 때문에 특히 유용하다 [참고 문헌: Westerfield, W.W., Richert, D.A. and Ruegamer, W.R., Endocrinology, 1965, 77, 802]. 이 검정은 화합물의 티로이드 호르몬형 효과를 래트에서 직접 측정케 하고 특히 심장에서의 직접적인 티로이드 호르몬형 효과의 측정을 가능케 한다;

(ii) 전체 체내 산소 소모의 증가에 의해 측정한 기초 대사 속도의 상승 [참고 문헌: Barker et al., Ann, N.Y. Acad. Sci., 86:545-562 (1960)];

(iii) 사전에 티로미메틱을 투여한 동물로부터 단리된 심방의 박동 속도 자극 [참조 문헌: Stephan et al., Biochem, Pharmacol, (1992) 13:1969-1974; Yokoyama et al., J. Med. Chem. 38:695-707 (1995)];

(iv) 콜레스테롤 산화제 키트(예컨대, Merck CHOD 요오드 색채계 키트)을 사용하여 결정하는 전체 플라즈마 콜레스테롤 수준의 변화 [참고 문헌: Stephan et al. (1992)];

(v) 초원심분리에 의해 분리되는 리포단백질 분획에서 LDL(저밀도 리포단백질) 및 HDL(고밀도 리포단백질) 콜레스테롤의 측정; 및

(vi) 효소 색상 시험, 예를 들어 Merck 시스템 GPO·PAP 방법을 사용하여 측정된 전체 플라즈마 트리글리세라이드 수준의 변화.

화학식(1)의 화합물은 이러한 시험에서

(a) 심장 GPDH 수준을 그다지 개질시키지 않는 투여량으로, 시험 동물의 대사 속도를 증가시키고, 간장 GPDH 수준을 증가시키고,

(b) 심장 GPDH 수준을 그다지 개질시키지 않는 투여량으로, 플라즈마 콜레스테롤과 트리글리세라이드 수준, 및 LDL 대 HDL 콜레스테롤의 비를 낮춤으로써, 선택적인 티로미메틱 활성을 나타내는 것으로 밝혀질 수 있다.

그러므로 화학식(1)의 화합물은 특정 조직에서 티로이드 호르몬의 효과를 선택적으로 모방하는 반면 심장에서의 직접적인 티로미메틱 효과가 거의 없거나 전혀 없는 화합물에 의해 완화될 수 있는 질환의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 심장 GPDH 수준을 그다지 개질시키지 않는 투여량으로 간장 GPDH 및 대사 속도를 상승시키는 화학식(1)의 화합물은 비만의 치료에 제시된다.

심장 GPDH 수준을 그다지 개질시키지 않는 투여량으로 전체 플라즈마 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤에 대한 LDL-콜레스테롤의 비 및 트리글리세라이드 수준을 낮추는 화학식(1)의 작용제는 일반적인 과지혈 방지제(과지질단백질증 방지제)로서 사용하도록, 즉 플라즈마 지질(콜레스테롤 및 트리글리세라이드) 수준이 증가된 환자를 치료하는데 제시된다. 부가적으로, 플라즈마 콜레스테롤 및 트리글리세라이드에 대한 이러한 효과에 있어서, 이러한 작용제는 또한 특정 과콜레스테롤 방지제 및 과트리글리세라이드 방지제로서 사용하도록 제시된다.

플라즈마 지질 수준이 증가된 환자는 이들의 높은 플라즈마 콜레스테롤 및/또는 트리글리세라이드 농축의 결과로서 관상 동맥 질환 또는 다른 아테롬성 동맥 경화증의 징후가 발생할 위험이 있는 것으로 고려된다. 추가로, LDL-콜레스테롤은 아테롬성 동맥 경화증을 유도하는 리포단백질인 것으로 여겨지고, HDL-콜레스테롤은 혈관벽으로부터 간에 콜레스테롤을 이동시키고 아테롬성 동맥 경화증 플라크의 제조를 방해하는 것으로 여겨지기 때문에, LDL-콜레스테롤 대 HDL-콜레스테로의 비를 낮추는 과지혈성 방지제는 참고 문헌으로 본원에 인용된 U.S. 특허 제 4,826,876 호 및 제 5,466,861 호에서 아테롬성 동맥 경화증 방지제로서 지적된다.

본 발명은 또한 심장을 제외한 일부 조직에 선택적인 티로미메틱 활성을 유도하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 활성을 유도하기 위해 동물에 유효량의 화학식(1)의 화합물 또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 플라즈마 지질 수준을 저하시키는 방법 및 본 발명의 화합물 또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염을 적합하게 투여함으로써 HDL-콜레스테롤 수준에 대한 LDL-콜레스테롤의 비를 낮추는 방법에 관한 것이다.

부가적으로, 화학식(1)의 화합물은 절충된 심장 작용이 이루어지는 환자의 티로이드 호르몬 대체 치료에 제시될 수 있다.

본 발명의 화합물의 치료적 사용에서 표준 약제 조성물이 일반적으로 투여된다.

그러므로, 추가의 양태에서 본 발명은 화학식(1)의 화합물 또는 이것의 약제학적으로 허용가능한 염 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여에 적합한 화합물을 포함한다.

약제 조성물

경구적으로 제공되는 경우에 활성인 화학식(1)의 화합물 및 이것의 약제학적으로 허용가능한 염은 액체, 예컨대 시럽, 현탁액 또는 에멀션, 정제, 캡슐 및 로젠지 정제로서 제형화될 수 있다.

액체 조성물은 일반적으로 적합한 액체 담체, 예를 들어 에탄올, 글리세린, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비수성 용매, 오일 또는 물중의, 현탁제, 방부제, 계면활성제, 습윤제, 향미제 또는 착색제와의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 현탁액 또는 용액으로 이루어질 것이다. 대안적으로, 액체 제형은 재구성가능한 분말로부터 제조될 수 있다.

예를 들어, 활성 화합물, 현탁제, 수크로오스 및 감미제를 함유하는 분말은 물을 사용하여 재구성되어 현탁액을 형성할 수 있고, 시럽은 활성 성분, 수크로오스 및 감미제를 함유하는 분말로부터 제조될 수 있다.

정제 형태의 조성물은 고체 조성물을 제조하는데 일상적으로 사용되는 적합한 약제학적 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 담체의 예로는 마그네슘 스테아레이트, 녹말, 락토오스, 수크로오스, 미정질 셀룰로오스 및 결합제, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈이 포함된다. 정제는 또한 유색 필름 피복물, 또는 담체의 일부로서 포함되는 색상으로 제공될 수 있다. 부가적으로, 활성 화합물은 친수성 또는 소수성 매트릭스를 포함하는 정제로서 조절된 방출 투여 형태로 제형화될 수 있다.

캡슐 형태의 조성물은 일정한 캡슐화 방법을 사용하여, 예를 들어 경질의 겔라틴 캡슐내로 활성 화합물 및 부형제를 혼입시키므로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 반고체 매트릭스의 활성 화합물 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜이 제조되어 경질의 겔라틴 캡슐내로 충전되거나; 폴리에틸렌 글리콜중의 활성 화합물 용액 또는 식용유중의 현탁액, 예를 들어 액체 파라핀 또는 분별화된 코코넛유가 제조되어 연질의 겔라틴 캡슐내로 충전될 수 있다. 비경구적으로 제공되는 경우, 활성인 화학식(1)의 화합물 및 이것의 약제학적으로 허용가능한 염은 근내 또는 정맥내 투여를 위해 제형화될 수 있다.

근내 투여를 위한 전형적인 조성물은 오일, 예를 들어 아라키스유 또는 참깨유중의 활성 성분의 현탁액 또는 용액으로 이루어질 것이다. 정맥내 투여를 위한 보편적인 조성물은 예를 들어 활성 성분, 덱스트로스, 염화나트륨, 보조 용매, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 및 임의의 킬레이트화제, 예를 들어 에틸렌디아민 테트라아세트산 및 산화방지제, 예를 들어 나트륨 메타비설파이트를 함유하는 무균 등장성 수용액으로 이루어질 것이다. 대안적으로, 용액은 결빙 건조된 후 투여전에 적합한 용매와 함께 재구성될 수 있다.

직장 투여시에 활성인 화학식(1)의 화합물 및 이것의 약제학적으로 허용가능한 염은 좌약으로서 제형화될 수 있다. 보편적인 좌약 제형물은 일반적으로 결합제 및/또는 윤활제, 예컨대 겔라틴 또는 코코아 버터 또는 다른 녹는점이 낮은 식물성 또는 합성 왁스 또는 지방과 함께 활성 성분으로 이루어질 것이다.

국부 투여시에 활성인 화학식(1)의 화합물 및 이것의 약제학적으로 허용가능한 염은 경피용 조성물로서 제형될 수 있다. 상기 조성물로는 예를 들어 베이킹(backing), 활성 화합물 저장기, 조절 막, 선상 및 접촉성 접착제가 포함된다.

화학식(1)의 화합물의 보편적인 일일 투여량은 개개인의 요구량, 치료하려는 질환 및 투여 경로에 따라 변한다. 적합한 투여량은 일반적으로 하루에 수혈자 체중당 0.001 내지 10mg/kg이다.

이러한 일반적인 투여 범위내에서, 투여량은 화학식(1)의 화합물이 심장에 직접적으로 영향을 거의 또는 전혀 끼치지 않으면서, 플라즈마 콜레스테롤 수준을 낮추고 대사 속도를 상승시키도록 선택될 수 있다. 일반적으로, 비배타적으로, 상기 투여량의 범위는 0.5 내지 10 mg/kg일 것이다.

또한, 일반적인 투여 범위내에서, 투여량은 화학식(1)의 화합물이 대사 속도를 증가시키지 않으면서 심장에 전혀 또는 거의 영향을 끼치지 않으면서, 플라즈마 콜레스테롤 수준을 낮추도록 선택될 수 있다. 일반적으로, 비배타적으로, 이러한 투여량은 0.001 내지 0.5mg/kg일 것이다.

상기에 언급된 2 하위 범위는 서로 배제되지 않고 특정 투여량으로 이루어지는 특정 활성이 사용된 화학식(1)의 화합물의 특징에 따라 변하는 것으로 이해되어야 한다.

바람직하게는, 화학식(1)의 화합물은 단위 투여 형태, 예를 들어 정제, 또는 캡슐로 존재하여, 환자가 일회 용량으로 자가 투여할 수 있다. 일반적으로, 단위 투여량은 화학식(1)의 화합물 0.05 내지 100mg을 함유한다. 바람직한 단위 투여량은 화학식(1)의 화합물의 005 내지 10mg을 함유한다.

활성 성분은 하루에 1 내지 6회 투여될 수 있다. 이와 같이 일일 투여량은 일반적으로 하루에 0.05 내지 600mg 이다. 바람직하게는, 일일 투여 용량은 1일 당 0.05 내지 100㎎ 범위이다. 가장 바람직하게는 1일 당 0.05 내지 5㎎ 범위이다.

실시예 1 - TR 리간드의 합성

T4(티록신), T3, T2 및 TS-9를 포함하여, 많은 TR 리간드가 당해기술분야에 공지되어 있다[참고문헌: Jorgensen Thyroid Hormones and Analogs, in 6 Hormonal Proteins and Peptides, Thyroid Hormones 107-204(Choh Hao Li ed., 1978)](본원에 참조로 인용됨).

수 개의 TR 리간드를 합성하는 방법을 이하에 기술하였다.

TS1, TS2, TS3, TS4 및 TS5의 합성

TS1, TS2, TS3, TS4 및 TS5 및 이들의 유사체 모두를 T3(3,5,3'-트리요오드-L-티로닌), T4(티록신) 및 3,5-디요오도티로닌을 포함하는 티로신 유사체의 질소 원자를 단순히 아실화시키므로써 제조할 수 있다. T3를 Ph₂CHCO₂NHS(N-히드록시 숙신이미드-2,2-디페닐아세테이트) 및 C₁₆H₃₃CO₂NHS와 반응시켜서 TS1 및 TS2를 각각 합성하였다. T3를 FMOC-Cl(플루오레닐메틸옥시카르보닐클로라이드)와 반응시켜서 TS3를 합성하였다. T3를 tBOC₂O(tBOC 무수물 또는 디-t-부틸디카보네이트)와 반응시켜서 TS4를 합성하였다. 3,5-디요오도티로닌을 tBOC₂O와 반응시켜서 TS5를 합성하였으며, 이러한 TS5는 R¹ ₃ 위치에서 -I 대신에 -H를 갖기 때문에 TS1-4와는 상이하다. TS1, TS2, TS3, TS4 및 TS5에 대한 일반 반응 설계는 도 11에 도시하였다. 반응 설계에 있어 TS5 및 이의 전구체 둘 모두는 R¹ ₃ 위치에서 요오드 대신에 수소를 갖는다는 것을 주목해야 한다.

TS6 및 TS7의 합성

TS5를 파라니트로페닐이소시아네이트와 반응시켜서 TS6을 합성하였다. TS6을 TFA(트리플루오로아세트산)과 반응시켜서 TS7을 합성하였으며, 이는 tBOC 그룹을 절단한다. 이들 반응은 당업자라면 누구든지 수행할 수 있는 단순한 유기 합성 반응이다. TS6 및 TS7에 대한 합성 설계는 도 12에 도시하였다.

TS8의 합성

트리에틸아민, 및 TBTU(히드록시벤즈트리아졸레우로늄 테트라플루오로보레이트) 또는 HBTU(히드록시벤즈트리아졸레우로늄 헥사플루오로포스페이트)와 같은 아미드 생성 축합 시약의 존재하에 TS5를 Ph₂CHNH₂(디페닐메틸아민)와 반응시켜서 TS8을 합성하였다. TS8에 대한 합성 설계는 도 13에 도시하였다.

3,5-디요오도-3'이소프로필티로닌 유도체의 합성

길항제를 설계하기 위해서는, 3' 위치에서의 소수성 그룹 및 5' 위치에서 소수성 그룹을 갖는 것이 중요하다. 3' 위치에서의 바람직한 소수성 그룹으로는 메틸, 벤질, 페닐, 요오드 및 헤테로시클릭 구조물이 있다. 3,5-디요오도-3'-이소프로필-5'-치환된 티로닌의 합성은 이하에 기술하였다. 제공된 실시예는 TS10 화합물을 합성하기 위한 특정 단계를 기술하고 있지만, 이러한 일반 반응 설계는 당업자에게는 어떠한 수의 3,5-디요오도-3'-이소프로필-5'-치환된 티로닌 유도체라도 합성하는데 사용될 수 있으며, 5' 위치에서 연장부를 가짐을 특징으로 한다. 공지된 유기 합성 기술을 사용하여 이러한 부류의 추가의 화합물을 합성할 수 있다.

TS10의 합성을 이하에 기술하였으며, 도 14에 도시하였다. 각 단계에 대하여 반응 생성물을 나타내는 TS10에 대한 반응 설계에서 사용된 부재는 괄호안에 표시하였다.

2-포밀-6-이소프로필아니솔(1): (본원에 참조로 인용된 문헌[Casiraghi, et al. JCS Perkin I, 1862(1980)]에 따라 제조한) 2-포밀-6-이소프로필아니솔(10.0g, 61mmol)을 둥근바닥 플라스크중의 50mL THF 및 50mL DMF 중의 나트륨 무수물(3.7g, 153mmol) 현탁액에 한방울씩 첨가하였다. 이러한 첨가는 발열반응을 발생시키며, 회색의 고형물을 형성시킨다. 그런 후, 메틸 요오드(26.0g, 183mmol)를 한방울씩 첨가하고 반응 혼합물을 5시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 20mL의 물로 켄칭시키고, 500mL 물중으로 붓고, 에테르(2x300mL)로 추출하였다. 에테르 층을 합체하고, 물(5x1000mL)로 세척하고, 황산마그네슘상에서 건조하고 진공중에서 농축시켜서 표제 화합물 10.2g(94%)을 수득하였으며, ¹H NMR(CDCl₃) 특성은 다음과 같다: d 10.30(s,1H), 7.63(d,1H,J=3Hz), 7.50(d, 1H, J=3Hz), 7.13(t,1H,J=3Hz), 3.81(s,3H), 3.31(heptet,1H,J=7.5Hz), 1.19(d,6H,J=7.5Hz).

2-(2-히드록시노닐)-6-이소프로필아니솔(설계에 도시하지 않음):

염화옥틸마그네슘(8.4mL, 16.9mmol, 2.0M)을 -78℃에서 10mL THF 중의 화합물(1)(1.5g, 8.4mmol) 용액에 한방울씩 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 가온시키면서 2시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 50mL 에테르로 희석시키고 50mL 물중로 부었다. 에테르 층을 염수(1x50mL)로 세척하고, 황산나트륨상에서 건조하고, 진공중에서 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카겔, 10% 에테르/헥산→15% 에테르/헥산)를 수행하여 표제 화합물 734㎎(30%)을 수득하였으며, ¹H NMR (CDCl₃) 특성은 다음과 같다: d 7.33-7.10(m, 3H), 5.00(br,s,1H), 3.81(s,3H), 3.33(heptet, 1H, J=7Hz), 1.90-1.19(m,14H), 0.86(t,3H,J=6.5Hz); HRMS(EI), 측정치: 292.2404; 이론치: 292.2402.

2-노닐-6-이소프로필아니솔(2): 화합물(2)(663㎎, 2.3mmol)을 5mL 에탄올과 5mL 아세트산의 용액 중에 용해시키고, 탄소상 팔라듐 촉매를 약주걱 팁으로 첨가하였다. 그런 후, 반응 혼합물을 (단순한 벌룬 및 니들을 사용하여) 수소 가스로 충전시키고, 상기 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음 날, 반응 혼합물을 에테르(100mL)에 붓고, 에테르 층을 포화 중탄산나트륨(3x100mL)으로 추출해냈다. 에테르 층을 황산나트륨상에서 건조시키고 진공중에서 농축시켜서 화합물(2) 581㎎(91%)을 수득하였으며, ¹H NMR (CDCl₃) 특성은 다음과 같다: d 7.14-7.00(m, 3H), 3.75(s,3H), 3.36(heptet, 1H, J=6.8Hz), 2.63(t,2H,J=7.5Hz), 1.68-1.15(m,14H), 0.86(t,3H,J=5.5Hz); HRMS(EI), 측정치: 276.2459; 이론치: 276.2453.

티로닌 부가 생성물(4): 발연 질산(0.071mL)을 -5℃로 냉각시킨 0.184mL 아세트산 무수물에 첨가하였다. 요오드(66㎎)를 상기 혼합물에 첨가하고, 이어서 트리플루오로아세트산(0.124mL)을 첨가하였다. 이 혼합물을 1시간 동안 교반시키면서 실온으로 가온시켰는데, 어느 지점에서든 모든 요오드가 용해되었다. 그런 후, 반응 혼합물을 진공중에서 농축시켜서 오일성 반고형물을 수득하였다. 잔류물을 아세트산 무수물 0.7mL에 용해시키고 -20℃로 냉각시켰다. 1.2mL의 아세트산 무수물 및 0.58mL의 TFA 중의 아니솔(2)(581㎎, 2.1mmol) 용액을 한방울씩 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 -20℃에서 교반시킨 후, 밤새 교반하면서 실온으로 가온시켰다. 반응 혼합물을 물과 염화메틸렌 사이에서 분배시켰다. 염화메틸렌 층을 황산나트륨상에서 건조시키고 진공중에서 농축시켜서 오일로서 요오드늄 염(3)을 수득하였다. 이 물질을 정제하거나 특성화시키지 않은 채로 커플링 반응으로 직접 도입시켰다.

(본원에 참조로 인용된)문헌[N. Lewis and P. Wallbank, Synthesis 1103(1987)]의 방법에 따라 제조된 N-트리플루오로아세틸-3,5-디요오도티로신 메틸 에스테르(552㎎, 1.0mmol), 및 상기로부터 모든 미정제 요오드늄 염(3)을 5mL 무수 메탄올중에 용해시켰다. 디아자비시클로[5.4.0]운데칸(DBU)(183㎎, 1.2mmol) 및 청동구리를 약주걱 팁으로 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음 날, 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 진공중에서 농축시켰다. 미정제 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(실리카겔, 10% 에틸 아세테이트/헥산)로 정제하여 보호된 티로닌 부가 생성물(4) 30㎎(4%)을 수득하였다.

탈보호된 티로닌(TS10): 보호된 티로닌(4)(30㎎, 0.04mmol)을 2.25mL 아세트산과 2.25mL 49% 히드로브롬산의 혼합물 중에 용해시켰다. 반응 혼합물을 가열하여 5시간 동안 역류시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 진공중에서 용매를 제거하였다. 물을 첨가하여 오일성 잔류물을 회색의 고형물로 분쇄시켰다. 이러한 고형물을 여과하고, 물로 세척하고, 진공중에서 P₂O₅상에서 건조하여 표제 화합물 TS10 24㎎(81%)을 수득하였으며, ¹H NMR (CDCl₃) 특성은 다음과 같다: d 7.57(1s,1H), 6.86(s,1H), 6.45(s,1H), 6.34(s,1H), 4.81(m,1H), 3.86(s,3H), 3.71(s,3H), 3.33-3.05(m,3H), 2.58-2.47(m,2H), 1.62-0.76(m,23H); MS(LSIMS): M⁺=817.0.

이상에서 언급된 바와 같이, 당업자라면 누구든지 반응 설계를 변화시켜서 3,5-디요오도-3' 이소프로필티로닌 유도체에 의해 특성화되는 부류의 화합물을 합성할 수 있으며, 상기 화합물에서 (1) 3' 이소프로필 그룹은 메틸, 벤질, 페닐, 요오드 및 헤테로시클릭 구조물을 포함하는 소수성 그룹으로 대체시킬 수 있으며, (2) 알킬 그룹, 2차원 아릴, 헤테로시클릭 그룹, 또는 극성 그룹 및/또는 하전된 그룹을 포함한 광범위한 화학 구조물이 5' 위치에 혼입될 수 있다.

상기 반응 설계에서 알데히드(1)는 최종 티로닌 유도체의 5' 위치에 다양한 화학 잔기를 부착시키는 다용도의 합성 중간체이다. 또한, 다양한 화학 반응을 사용하여 화학 잔기를 부착시키는데 사용될 수 있다. 이들 반응은 당해기술분야에 널리 공지되어 있으며, (그리그나드 시약, 유기리튬 등을 포함하여) 알데히드로의 유기 금속 첨가반응, 1차 또는 2차 아민과 알데히드의 환원성 아민화 반응, 포스포러스 일리드 또는 안정화된 포스포네이트 음이온과의 위티그 올레핀화 반응이 있다. 그 밖의 가능한 반응으로는 5' 위치에서 에테르화 반응을 허용하는 벤질 알코올로의 알데히드의 환원반응이 있다. 상기된 바와 같이, 이들 방법은 알킬 그룹, 2차원 아릴, 헤테로시클릭 그룹 또는 극성 그룹 및/또는 하전된 그룹을 포함하는, 광범위한 화학 구조물을 최종 티로닌 유도체의 5' 위치에 혼입시킬 수 있다.

3,5-디브로모-4-(3',5'-디이소프로필-4'-히드록시페녹시)벤조산의 합성(화합물 11).

(a) 2,6-디이소프로필 페놀(20g, 0.11mol), 탄산칼륨(62g, 0.45mol), 아세톤(160mL) 및 요오드화메틸(28mL, 0.45mol)의 혼합물을 3일 동안 역류시켰다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 증발시키고, 에테르중에 용해시키고, 1M 수산화나트륨으로 두 번 세척하고, 황산마그네슘상에서 건조하고 농축시켜서 연황색 오일로서 2,6-디이소프로필 아니솔 15.1g(0.08mol, 70%)을 수득하였다.

(b) 발연 질산(12.4mL, 265mmol)을 드라이아이스/사염화탄소욕중에서 냉각시킨 아세트산 무수물 31.4mL에 한방울씩 첨가하였다. 요오드(11.3g, 44.4mmol)를 소량 첨가한 후, 트리플루오로아세트산(20.5mL, 266mmol)을 한방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 모든 요오드가 용해될 때까지 실온에서 교반하였다. 질소를 용기중으로 플러싱시킴으로써 산화질소를 제거하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 126mL의 아세트산 무수물 중에 용해시키고 드라이아이스/사염화탄소 욕중에서 냉각시켰다. 교반된 용액에 150mL의 아세트산 무수물 및 22.6mL 트리플루오로아세트산 중의 2,6-디이소프로필아니솔(51g, 266mmol)을 한반울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 방치시킨 후, 농축시켰다. 잔류물을 150mL의 메탄올중에 용해시키고, 10% 수성의 아황산나트륨 용액 150mL 및 2M 나트륨 보로테트라플루오라이드 용액 1ℓ로 처리하였다. 응집물을 침전시킨 후, 석유에테르를 첨가하고 상청액을 경사분리하였다. 침전물을 석유 에테르로 분쇄시키고, 여과하고, 석유 에테르로 세척하고 진공중의 실온에서 건조하였다. 이렇게 하여 백색의 고형물로서 비스(3,5-디이소프로필-4-메톡시페닐)요오드늄 테트라플루오로보레이트 34g(57mmol, 65%)을 수득하였다.

(c) 250mL 메탄올중의 3,5-디브로모-4-히드록시벤조산(12g, 40.5mmol)의 교반 용액에 염화티오닐(3mL)을 한방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 5일 동안 환류시키고, 물을 첨가하여 침전된 생성물을 여과해냈다. 잔류물을 에텔 아세테이트 중에 용해시켰다. 수성상으로부터, 농축에 의해 메탄올을 제거하였다. 그런 후, 수성상을 염화나트륨으로 포화시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합체된 유기상을 황산마그네슘상에서 건조하고, 여과하고 농축시켰다. 이렇게 하여 백색의 결정상 고형물로서 3,5-디브로모-4-히드록시메틸 벤조산염 12.5g(40.5mmol, 100%)을 수득하였다.

(d) 단계 (b) 및 (c)에서 수득된 생성물을 하기의 프로토콜에 따라 서로 반응시켰다. 0℃에서 디클로로메탄 7mL중의 비스(3,5-디이소프로필-4-메톡시페닐)요오드늄 테트라플루오로보레이트(2.86g, 4.8mmol) 및 청동구리(0.42g, 6.4mmol)에 디클로로메탄 5mL중의 3,5-디브로모-4-히드록시메틸 벤조에이트(1.0g, 3.2mmol) 및 트리에틸아민(0.36g, 3.5mmol)을 한방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 빛이 없는 곳에서 8일 동안 교반시킨 후, 셀라이트를 통해 여과하였다. 여과물을 농축시키고, 잔류물을 칼럼 크로마토그래피(실리카겔, 97:3 석유 에테르/에틸 아세테이트)로 정제하여 고형물로서 3,5-디브로모-4-(3',5'-디이소프로필-4'-메톡시페녹시)메틸 벤조에이트 0.62g(1.2mmol, 39%)을 수득하였다.

(e) 단계 (d)로부터 생성물(0.2g, 0.4mmol)을 2mL의 디클로메탄중에 용해시키고, 질소하에 방치시키고, -40℃로 냉각시켰다. 교반된 용액에 1M BBr₃(1.2mL, 1.2mmol)을 한방울씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에 도달되게 한 후 밤새 방치하였다. 0℃로 냉각시키고 물로 가수분해하였다. 농축에 의해 디클로메탄을 제거하고 수성상을 에틸 아세테이트로 추출해냈다. 유기상을 1M 염산 및 염수로 세척하였다. 그런 후, 황산마그네슘상에서 건조하고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물에 크로마토그래피(실리카, 96:3.6:0.4 디클로로메탄/메탄올/아세트산)하여 백색 고형물로서 3,5-디브로모-4-(3',5'-디이소프로필-4'-히드록시페녹시)벤조산 93㎎(0.2mmol, 51%)을 수득하였다. ¹H NMR(CDCl₃) δ1.23(d, 12H, 메틸), 3.11(m, 2H, CH), 6.50(s, 2H, 2.6-H), 8.33(s, 2H, 2',6'-H).

표 1 및 도 15에는 수개의 TR 리간드의 구조가 도해되어 있다.

실시예 2 - TR 리간드의 수용체 결합 검정

티로이드 수용체(TR)에 결합하는 합성된 TR 리간드의 능력을 시험하기 위해서, 문헌[J.D. Apriletti, J.B. Baxter, and T.N. Lavin, J. Biol. Chem., 263: 9409-9417(1988)]에 기술된 바와 같이 125₁ T₃ 및 래트의 간 핵으로부터 제조된 TR를 사용하여 TR에 대한 TR 리간드의 결합 친화도를 검정하였다. 아프릴레티(Apriletti)(1995) 및 아프릴레티(1988)에 의해 기술된 방법을 사용하여 겉보기 Kd를 계산하였다. 겉보기 Kd는 표 2에 기재하였다. 0.21mL의 용적으로 완충액 E(400mM KCl, 200mM 인산칼륨, pH 8.0, 0.5mM EDTA, 1mM MgCl₂, 10% 글리세롤, 1mM DDT)중에 1nM[¹²⁵I]T₃, 및 50㎍/mL 코어 히스톤을 사용하여 검정하고자 하는 샘플의 존재하에 겉보기 Kd(App.Kd)를 결정하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후, 0.2mL의 인큐베이션 혼합물을 완충액 E로 평형이 유지된 퀵-셉 세파덱스 지-25 칼럼(Quick-Sep Sephadex G-25 column)(2.7x0.9cm, 1.7mL 베드 용적)상으로 로딩시켰다. 단백질 결합된 [¹²⁵I]T₃의 배제된 피크를 1mL의 완충액 E로 용리시키고, 시험관에 수집하고, 그 수를 세었다. 전체 결합으로부터 비특이적 결합을 감함으로써 특이적 T₃ 결합을 계산하였다.

실시예 3 - TR 리간드에 의해 증가된 핵단백질 공동 활성화

핵 활성화 단백질 RIP-140(에스트로겐 수용체와 같은 핵 수용체에 결합할 수 있는 핵단백질)로의 TR의 결합을 활성화시키는 TR 리간드의 능력을 시험하기 위해서, TR 리간드를 TR에 결합시킨 후, 본원에 참조로 인용된 문헌[V. Cavailles, et al., EMBO J., 14(15):3741-3751(1995)]에 기술된 바와 같이 RIP-140으로 인큐베이션시켰다. 이러한 검정법에서, 35_S-RIP-140 단백질은 리간드 결합된 TR에 결합하지만, 리간드 비결합된 TR에는 결합하지 않았다. 많은 TR 35_S 리간드는 표 2에 기재된 바와 같이 RIP-140 결합을 활성화시켰다.

실시예 4 - 배양된 세포에서 TR 리간드 결합 및 TR 활성화

세포 환경에서 전사의 TR 활성화를 시험하기 위해서, 작동가능하게 연결된 TR DNA 결합 서열을 갖는 리포터 유전자, 즉 클로람페니콜 트랜스퍼라아제("CAT")를 활성화시키는 이들의 능력에 대해 TR 리간드를 검정하였다. GC 또는 L937 세포(ATCC에서 시판)를 각각 사용할 수 있다. 이와 같은 검정법에서, TR 리간드는 세포막을 교차하고, TR에 결합하고, TR을 활성화시키며, 이것은 바꾸어 말하면 TR DNA 결합 영역을 CAT 유전자의 업스트림에 결합시킴으로써 CAT의 유전자 전사를 활성화시킨다. 본원 및 문헌에 기술된 바와 같이 다양한 농도에서 CAT 유전자 활성화를 검정하여 절반의 최대 유전자 활성화에 대한 유효한 농도(EC₅₀)를 측정하였다. CAT 유전자 활성화 실험의 결과는 표 2에 기재하였다.

CAT 유전자 활성화 검정

래트(래트)의 놔하수체 세포주 즉, 내인성 티로이드 호르몬 수용체(TR)를 함유하는 GC 세포, 또는 당해기술분야에 공지된 바와 같이 발현된 외인성 TR를 함유하는 U937 세포에서 티로이드 호르몬(3,5,3'-트리요오도-L-티로신, T₃) 및 TR 리간드에 대한 작용성 반응을 검정하였다. 10% 신생 우혈청, 2mM 글루타민, 50유닛/mL 페니실린 및 50㎍/mL 스트렙토마이신으로 RPMI 1640중의 10cm 디쉬 중에서 GC 세포를 배양하였다. 트랜스펙션시키기 위해, 세포를 트립신으로 처리하고, 완충액(PBS, 0.1% 글루코오스)중에서 재현탁시키고, 0.5mL 완충액(15±5백만 세포)중에서 TREtkCAT 플라스미드(10㎎) 또는 파아지와 혼합시키고, 0.33kv 및 960mF에서 바이오-라드(Bio-Rad) 유전자 펄스기를 사용하여 일렉트로포레이션시켰다. TREtkCAT 플라스미드는 CAT(tkCAT) 코딩 서열에 결합된 최소(-32/+45) 티미딘 키나아제 프로모터의 업스트림에 있는 pUC19 폴리링커의 힌드(Hind) III 부위에서 클로닝된 T₃ 반응 요소(AGGTCAcaggAGGTCA)의 두 개의 복제물을 함유한다. 일렉트로포레이션을 수행한 후에, 세포를 성장 배지(10% 목탄 처리되고, 호르몬 제거된 신생 우혈청을 갖는 PRMI)에 고이게 하고, 6 웰 디쉬에 플레이팅시키고, 에탄올 또는 호르몬으로 처리하였다. 문헌[D.C. Leitman, R.C.J. Ribeiro, E.R. Mackow, J.D.Baxter, B.L. West, J. Biol, Chem. 266, 9343(1991)]에 기술된 바와 같이 24시간 후에 CAT 활성을 측정하였으며, 상기 문헌은 본원에 참조로 인용된다.

T3의 존재 또는 부재하에 DR4-ALP 리포터 유전자의 전사 조절에 관한 TS-10의 효과.

TRAF 세포의 특성: TRAFal은 사람의 티로이드 호르몬 수용체 α1 및 DR4-ALP 리포터 벡터를 코드화시키는 발현 벡터로 안정하게 형질전환된 CHO K1 세포이고; TRAFb1은 사람의 티로이드 호르몬 수용체 β1 및 DR4-ALP 리포터 벡터를 코드화시키는 발현 벡터로 안정하게 형질전환된 CHO K1 세포이다.

T3의 존재 또는 부재하에 DR4-ALP 리포터 유전자의 전사 조절에 관한 화합물 TS-10의 효과의 해석.

TRAFa1 리포터 세포: TS-10은 단독(개방 원)으로 천연 티로이드 호르몬 T3에 의해 최대 효과의 약 27%에 달하는 ALP 리포터 단백질의 발현을 부분 활성화시킨다. T3(채워진 원)이 존재하는 경우에, TS-10은 약한 길항 효과를 갖는다. TS-10의 길항 효과에 대한 EC50 농도 및 T3 길항 효과에 대한 EC50 농도는 각각 도 18에 도시하였다.

도 18에서, 개방 원 및 점선으로 채워진 원은 독성 마아커(MTS/PMS)에 관한 TS-10/T3의 용량 의존 효과를 나타내며, 미토콘드리아에서 테트라졸륨 염의 감소는 광학 밀도로서 오른쪽 Y-축상에 나타냈다. T3의 부재 및 존재 둘 모두에 경우에 TS-10의 가장 높은 농도(32mM)에서, 광학 현미경하에서 볼 수 있듯이, MTS-PMS 마아커에 대한 TS-10의 어떠한 분명한 독성 효과가 없었으며, 세포의 형태에 관해서는 분명한 효과가 있다(도면에 도시하지 않음).

TRAFb1 리포터 세포: TS-10 단독(개방 원)으로 T3에 의해 최대 효과의 약 35%에 달하는 ALP 리포터 단백질의 발현을 부분 활성화시킨다. TS-10의 길항 효과에 대한 EC50 농도는 도 19에 도시되어 있다. T3이 존재하는 경우(채워진 원)에, TS-10은 ALP 리포터 단백질의 발현에 관한 T3 효과에 있어 오히려 약간의 증가를 보여준다. 사용된 가장 높은 농도(32mM)에서 TS-10의 T3 억제 효과는 T3 길항 보다 오히려 독성 효과를 띤다.

도 19에서, 개방된 원 및 점선으로 채워진 원은 독성 마아커(MTS/PMS)에 대한 TS-10/T3의 용량 의존 효과를 나타내며, 미토콘드리아에서 테트라졸륨 염의 감소는 광학 밀도로서 오른쪽 Y 축상에 나타냈다. T3의 부재 및 존재 둘 모두에 경우에 TS-10의 가장 높은 농도(32mM)에서, 광학 현미경에 의해 볼 수 있듯이, MTS-PMS 마아커에 대한 TS-10의 어떠한 분명한 독성 효과가 없었으며, 세포의 형태에 관해서는 분명한 효과가 있다(도면에 도시하지 않음).

HepG2 (HAF18) 리포터 세포: TS-10(개방 원)은 단독으로 T3에 의해 최대 효과의 약 50% 보다 약간 높은 정도에 달하는 ALP 리포터 단백질의 발현을 부분 활성화시킨다. TS-10의 길항 효과를 위한 EC50 농도는 도 20에 도시하였다. T3이 존재하는 경우(채워진 원)에, TS-10은 어떠한 효과, 즉 어떠한 T3 길항 또는 T3에 대한 증대/증가 효과도 나타내지 않는다. 개방된 원 및 점선으로 채워진 원은 독성 마아커(MTS/PMS)에 관한 TS-10/T3의 용량 의존 효과를 나타내며, 미토콘드리아에서 테트라졸륨염의 감소는 광학 밀도로서 오른쪽 Y 축상에 나타냈다. 사용된 TS-10/T3의 어떠한 농도에서도, 광학 현미경에 의해 관찰될 수 있듯이, MTS-PMS 마아커에 대한 어떠한 분명한 독성 효과도 나타내지 않는다.

실시예 5 - T ₃ 및 트리악에 의해 TR LBD에 결합하는 [ ¹²⁵ I]T ₃ 에 대한 사람 TR-α와 사람 TR-β 경쟁의 비교

약제, 즉, 트리악은 티로이드 호르몬 길항제이다. 트리악은 3,5,3'-트리요오도티로아세트산이며, 문헌[Jorgensen, Thyroid Hormones and analogs in 6 Hormonal Proteins and Peptides, Thyroid Hormones at 150-151(1978)]에 기술되어 있다. 트리악 대신에 사용될 수 있는 또 다른 화합물은 3,5-디요오도-3'-이소프로필티로아세트산이다. 경쟁 검정을 수행하여 비표지된 T₃ 또는 트리악에 의해 사람의 TR-α LBD 또는 사람의 TR-β LBD와의 결합으로부터 [¹²⁵I]T₃의 대체를 비교하였다. 상기 검정의 결과는 도 16에 도시하였다.

1nM [¹²⁵I]T₃, 30fmol의 사람 TR-α(흰색 심벌) 또는 β(검은색 심벌), 및 다양한 농도의 비표지된 경쟁 T₃(원) 또는 트리악(삼각형)을 함유하는 표준 결합 반응물을 제조하였다. 이와 같은 검정을 두 번 수행하였다.

TR에 결합하는 [ ¹²⁵ I]T ₃ 의 표준 검정

[¹²⁵I]T₃의 농도를 증가시키면서 T₃ 결합에 대한 사람의 TR-α(좌측 패널) 또는 사람의 TR-β(우측 패널)를 검정하였다. 선형 회귀 검정을 사용하여 평형해리 상수(α에 대해서는 20pM이고, β에 대해서는 67pM임)를 계산하고, 도 17에 도시하였다.

3,5-디브로모-4-(3',5'-디이소프로필-4'-히드록시페녹시) 벤조산은 TR-α 선택적 합성 리간드이다.

TR, TR-α 및 TR-β의 두 개의 상이한 이소폼에 결합하는 3,5-디브로모-4-(3',5-디이소프로필-4'-히드록시페녹시)벤조산(화합물 11)(위에 도시된 구조를 가짐)을 검정하였다. 화합물(11)은 TR-α에 결합하는데 있어서 1.6μM의 IC50을 나타내었으며, TR-β에 결합하는데 있어서는 0.91μM의 IC50을 나타내었다. TR-α 또는 TR-β LBD에 대한 선택적인 결합을 검정하기 위한 검정은 본원에 기술된 바와 같이 리포터 검정을 포함할 수 있다. [참고문헌: Hollenberg, et al., J. Biol. Chem., 270(24) 14274-14280(1995)].

실시예 6 - TR-α LBD의 제조 및 정제

래트의 TR-α LBD, 잔기 Met122 - Val410을 대장균(E. coli)("LBD-122/410")으로부터 정제하였다. 래트의 TR-α LBD를 코드화화는 발현 벡터를 대장균 균주 BL21(DE3)으로 새로이 트랜스펙션시키고, 2xLB 배지를 사용하여 50 리터(ℓ) 발효조에서 22℃에서 배양시켰다. 2.5-3의 A₆₀₀에서, IPTG를 0.5mM에 첨가하고, 채취하기 전 3시간 동안 계속해서 배양시켰다. 박테리아 펠릿을 액체 질소중에서 빠르게 동결시키고 처리하기 전까지 -70℃에서 저장하였다. 추출 및 정제 단계를 4℃에서 수행하였다. 박테리아를 10mL 완충액/g 박테리아 비율로 추출 완충액(20MM Hepes, pH 8.-, 1mM EDTA, 0.1% MTG, 0.1mM PMSF, 및 10% 글리세롤)중에서 해빙시켰다. 박테리아를 0.2㎎/mL 리소자임으로 15분 동안 인큐베이션시킴으로써 용해시키고, 최대 출력으로 초음파처리하고, 동시에 용액이 그 점성을 상실할 때까지 브린크만 호모제나이저(Brinkmann homogenizer)(발생기 PTA 35/2를 구비한 모델 PT10/35)로 균질화시켰다. 10,000g에서 10분 동안 원심분리한 후, 상청액을 0.4M KCl로 조절하고, 0.6% PEI로 처리하여 단편화된 DNA를 침전시키고, 10,000g에서 10분 동안 원심분리하였다. 그런 후, 상청액중의 래트의 TR-α LBD를 50% 황산암모늄으로 침전시키고, 10,000g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상기 침전물을 완충액 B(20mM Hepes, pH 8.0, 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1mM PMSF, 0.01% 루브롤(Lubrol) 및 10% 글리세롤)로 재현탁시켜 최종 전도도가 9mS/cm(약 0.7M 황산암모늄)가 되게 하고 100,000g에서 1시간 동안 원심분리하였다. 상청액을 액체 질소중에서 동결시키고 -70℃에서 저장하였다.

미정제 추출물을 해빙시키고, 표지량의 [¹²⁵I]T₃와 결합시키고, 1.5mL/분의 속도로 페닐-토요펄(Toyopearl) 소수성 상호작용 칼럼(2.6x18cm, 95mL 베드 용적)상으로 직접 로딩시켰다. 칼럼을 완충액 C(20mM Hepes, pH 8.0, 0.5mM EDTA, 1mM DDT, 0.2mM PMSF)중에서 글리세롤 비함유 0.7 황산암모늄으로부터 염 비함유 20% 글리세롤로 2시간 구배로 용리시켰다. 플로우-쓰루우 감마 에미션(flow-through gamma emission) 검출기를 사용하여 (전체 래트 TR-α LBD의 0.005% 보다 작은) 표지 [¹²⁵I]T₃에 사전 결합된 래트의 TR-α LBD를 검출한 반면에, 리간드 결합되지 않은 래트의 TR-α LBD는 (본원에 기술된 바와 같이) 포스트칼럼 [¹²⁵I]T₃ 결합 검정을 사용하여 검정하였다.

페닐-토요펄 리간드 결합되지 않은 래트의 TR-α LBD 피크 분획을 푸울링시키고, 완충액 B로 희석시켜 전도도 0.5mS/cm(약 20mM 황산암모늄과 상응)가 되게 하고, TSK-DEAE 음이온 교환 칼럼(2x15cm, 47ml 베드 용적)으로 4mL/분의 속도로 로딩시키고, 완충액 B 중에서 50에서 200mM NaCl로 60분 구배로 용리시켰다.

TSK-DEAE로부터 리간드 비결합된 래트의 TR-α LBD 피크 분획을 푸울링시키고, 완충액 B로 2배 희석시키고, TSK-헤파린 HPLC 칼럼(0.8x7.5cm, 3ml 베드 용적)상으로 0.75mL/분의 속도로 로딩시키고, 완충액 B 중에서 50 내지 400mM NaCl 구배로 용리시켰다.

TSK-헤파린 칼럼으로부터 리간드 비결합된 래트의 TR-α LBD 피크 분획의 푸울을 0.7M 황산암모늄으로 조절하고, TSK-페닐 HPLC 칼럼(0.8x7.5cm, 3ml 베드 용적)상으로 0.75mL/분의 속도로 로딩시키고, 완충액 C 중에서 글리세롤 비함유 0.7M 황산암모늄 내지 염 비함유 20% 글리세롤 구배로 60분 동안 용리시켰다. 리간드 비결합된 래트의 TR-α LBD를 함유하는 분획을 푸울링시키고 1시간 동안 호르몬의 5배 이상으로 인큐베이션시키고, 염 농도를 0.7M 황산암모늄으로 조정하고, 상기 샘플을 재로딩시키고 상기된 바와 같은 동일한 칼럼상에서 크로마토그래피를 수행하였다.

실시예 7 - 리간드 결합된 TR-α LBD의 결정화

단일의 LBD-122/410 제제로부터 물질을 배치로 분할하고, 다음과 같은 리간드 중의 한 리간드와 양적으로 결합되게 하였다: 디미트(Dimit), T₃, 또는 최종의 정제 단계를 위한 트리악 IpBr₂(3,5-디브로모-3' 이소프로필티로닌).

리간드로 래트의 TR-α LBD의 완전한 포화상태를 유지시키고, 결정화하기 위한 복합체를 제조하기 위해서, 리간드 결합된 래트의 TR-α LBD를 농축시키고, 10mM Hepes (pH 7.0), 3.0mM DTT, 및 1.0nM 내지 10nM 리간드를 사용하여 아미콘 센트리콘-10 마이크로콘센트레이터(Amicon Centricon-10 microconcentrator)[참고문헌: McGrath et al, Biotechniques, 7:246-247 (1989)](상기 문헌은 본원에 참조로 인용됨)에서 탈염시켰다.

본원에 참조로 인용된 문헌[McPherson, Preparation and Analysis of Protein Crystals(1982)]에서와 같이 (1㎕ 단백질 용액, 1㎕ 침전제 용액 및 실란으로 처리된 커버슬립을 사용하는 0.5mL 저장기를 갖는) 17℃에서 현적(hanging drop) 증기 확산을 사용하여 선택된 리간드에 결합된 래트의 TR-α LBD를 위해 계승 결정화 스크리닝 연구(Factorial crystallization screening trials)[참고문헌: Jancarik & Kim, J. Appl. Crystallogr. 24:409-411 (1991)](상기 문헌은 본원에 참조로 인용됨)를 수행하였다. 래트의 TR-α LBD는 4℃에서는 안정하지 못하기 때문에 -80℃에서 저장하였으며, 여기에서 2 내지 3개월 동안 호르몬에 대한 이의 총 친화력(avidity) 및 이의 결정화도를 유지시켰다. 본원에 참조로 인용된 문헌[McGrath, M.E. et al., J. Mol Biol. 237:236-239(1994)]에 기술된 바와 같이 이들 과정을 수행하였다. 스크리닝 연구[참조예: Jancarik & Kim 1991]의 조건(21)에서 결정을 수득한 후, 조건을 최적화하였다. 쐐기형 결정을 3일 동안 15% 2-메틸-2,4-펜탄디올(MPD), 0.2M 암모늄 아세테이트 및 0.1M 나트륨 카코딜레이트(pH 6.7), 3mM DDT로, 2㎕ 단백질 용액, 1㎕ 침전제 용액 및 실란으로 처리한 커버슬립을 사용하는 0.6mL 저장기로, 및 8.7㎎/mL(디미트), 5.5㎎/mL(IpBr₂), 5㎎/mL(트리악), 또는 2.3㎎/mL(T₃)로 22℃에서 현적 증기 확산으로 재현성있게 수득하였다. 이들 조건하에서, 회절 특성 결정(치수 0.5x0.2x0.0075mm³)은 주위 온도(22℃)에서 성장될 수 있다. 최고의 결정은 약 100㎛의 제한적인 치수를 가지며, 3mM DTT의 존재시에 2.3 내지 8.7㎎/mL의 단백질 농도에서 수득된다. 결정은 비대칭 단위의 하나의 단량체를 갖는 단사정계 공간 그룹 C2이다.

실시예 8 - T ₃ 또는 트리악과 복합된 사람의 TR-β LBD의 결정화

T₃와 복합된 사람의 TR-β LBD 및 트리악과 복합된 사람 TR-β LBD를 하기와 같이 변형시키면서 래트 TR-α LBD에 대해 상기된 방법과 동일한 방법에 따라서 정제하였다.

도 3에 도시된 다양한 핵 수용체 LBD에 대해 아미노산 넘버링 설계에 따르면, 사람 TR-β LBD의 발현은, 사람 TR-β LBD 잔기가 위치 716의 아미노산으로부터 위치 1022의 아미노산을 통해 연장된다는 점에 있어서 래트의 TR-α LBD와 상이하다. 도 3에는 수록된 핵 수용체 모두 및 어떠한 추가의 동족성 핵 수용체에 적용될 수 있는 넘버링 설계가 도시되어 있다. 도 3에서, 위치 725 및 위치 1025에서의 수직선은 리간드의 적합한 결합을 얻는데 필요한 바람직한 최소 아미노산 서열을 서술하고 있다. 도 3의 넘버링 설계에 따른 위치 716 내지 위치 1022의 아미노산 서열은 공공연하게 구입 가능한 사람 TR-β의 아미노산 서열의 통상적인 넘버링에 따른 아미노산 위치 202 내지 461과 상응한다. 또한, 사람의 TR-β LBD를 본원에 참조로 인용된 문헌[Crowe et al., Methods in Molecular Biology 31:371-387(1994)]에 기술된 바와 같이 히스티딘 태그로 발현시켰다.

사람의 TR-β LBD의 정제는 하기의 예외를 수반하면서 래트 TR-α LBD에 대해 상기된 바와 동일한 방식으로 수행하였다. 먼저, 소수성 상호작용 칼럼을 사용하는 정제 단계 이전에, 제조업자의 지시에 따라 (캘리포니아주 캐츠워쓰에 소재하는 퀴아겐(Qiagen)에서 시판하는) 니켈 NTA 칼럼을 사용하여 발현된 사람의 TR-β LBD를 정제하고 200mM 이미다졸로 용리시키는 단계를 추가하였다. 두 번째 차이는 사람의 TR-β LBD의 정제시에, 헤파린 칼럼을 사용하는 정제 단계를 생략하였다는 것이다.

T₃ 또는 트리악에 결합된 사람의 TR-β LBD의 결정화는 다음과 같다. 주위 온도(22℃)에서, 잔카리크(Jancarik) & 김(Kim)(1991)의 계승 결정화 스크리닝 연구를 이용하고, 리버사이드에 소재하는 햄프턴 리서치(Hampton Research)에서 시판하는 제품을 사용하여 이전과 같이 현적을 사용하여 계승 스크린의 조건 7에서 결정을 수득하였다. 최적 조건은 다음과 같다: 7-10㎎/mL의 단백질 농도에서, 1.0-1.2M 나트륨 아세테이트(pH 조정되지 않음) 및 0.1M 나트륨 카코딜레이트(pH 7.4)을 함유하는 현적으로부터 3mM DTT, 1㎕ 단백질 용액, 1㎕ 침전제 용액 또는 2㎕ 단백질 용액, 1㎕ 침전제 용액 및 실란으로 처리한 커버슬립을 사용하는 0.6mL 저장기로 2 내지 3일 동안 4℃에서 육각 이중피라밋 결정(hexagonal bipyrimidal crystaal)을 성장시켰다. 최고의 결정는 200㎛의 제한적인 치수를 갖는다.

T₃ 또는 트리악에 결합된 사람 TR-β LBD에 대한 결정 시스템은 공간 그룹 p3₁21을 갖는 삼방정계이다. 단위 세포의 치수는 세포 길이 a = 세포 길이 b = 68.448Å, 세포 길이 c=130.559Å이다. 각도는 각각 α=90°, β=90°, γ=120°이다.

실시예 9 - 리간드 결합된 TR-α LBD 결정 구조의 측정

1.2" 진동을 사용하는 스탠포드 신크로트론 레디에이션 래버러토리 빔라인 7-1(λ=1.08Å)에서 마아(Mar) 영역 검출기상에서 세 개의 동결정(디미트, T3 및 IpBr₂를 갖는 래트 TR-α LBD) 각각으로부터의 데이터를 측정하였다.

축과 거의 나란한 b^* 축으로 T₃ 조결정로부터의 데이터를 측정하였다. 크리소용매(crysosolvent)로서 작용하는 MPD 모액으로 질소 가스 스트림에서 -178℃에서 결정을 플래시 동결시켰다. REFIX를 사용하여 각 결정에 대한 배향 매트릭스를 결정하였다[참고문헌:Kabsch, W., J. Appl. Crystallogr. 26:795-800(1993)](본원에 참조로 인용됨). (텍사스 우드랜드에 소재하는 몰레큘라 스트럭처 코포레이션(Molecular Structure Corp.)이 시판하는) 덴조(DENZO)로 반사광을 모아서, (본원에 참조로 인용된 문헌[Otwinowski, Z, Proceedings of the CCP4 Study Weekend; "Data Collection and Processing." 56-62(SERC Darebury Laboratory, Warrington, UK 1993)]에 기술된 바와 같이) SCALEPACK로 반사율을 평가하였다.

T₃ 데이터 세트에 대하여, 비즈부트(Bijvoet) 쌍을 따로 따로 보관하고, (더블류. 헨드릭슨(W. Hendrickson)(콜롬비아 대학) 및 더블류. 바이스(W. Weis)(스탠포드 대학)의) MADSYS을 사용하여 국부적으로 평가하였다.

세 개의 동일입체형 리간드로부터 제조한 동결정은 동형이다. CCP4 슈트(suite)로부터 프로그램을 사용하여 MIR 분석을 수행하였다[참고문헌: Collaborative Computational Project, N.R. Acta Crystallogr. D50:760-763(1994)](본원에서 참조로 인용됨). 모체로서 디미트 동결정을 취하여, T₃ 및 IpBr₂ 둘 모두에 대해서 디퍼런스 파터슨(difference Patterson)을 계산하였다. 바탕 위의 피크 11σ로서 밀도맵의 하커(Harker) 섹션으로부터 T₃ 디퍼런스 파터슨에서 세 개의 요오드 원자의 위치를 명확하게 결정하였다. IpBr₂ 동결정에서의 두 개의 브롬 원자에 대한 위치는, 잡음 수준을 초과하는 피크 8σ로서 독립적으로 위치한다. 용액부터 IpBr₂ 디퍼런스 파터슨까지 LBD-122/410에 대한 상을 계산하고, T₃ 동결정의 유일한 제 3 요오드의 위치를 확인하는데 사용하였다. 요오드 원자로부터의 이례적인 기여를 포함하여 MLPHARE로 할로겐 위치를 구별하였다[참고문헌: Otwinowski, Z. Proceedings of the CCPR study Weekend 80-86(SERC Darebury Laboratory, Warrington, UK 1991)]. MIRAS상을 DM을 사용하여 용매 플래트닝(flattening)/막대그래프 매칭을 통해 개선하였다[참고문헌: Cowtan, K., Joint CCP4 and ESF-EACBM Newsletter on Protein Crystallography 31:34-38(1994)](상기 문헌은 본원에 참조로 인용됨).

디미트가 결합된 LBD-122/410 모델은 용매 플래트닝된 MIRAS 2.5Å 전자 밀도 지도로부터 프로그램 O를 사용하여 제작하였다[참고문헌: Jones et al., Acta Crystallogr. A 47:110-119 (1991)](상기 문헌은 본원에 참조로 인용됨). 리간드가 없는 초기의 모델(Rcryst=40.1%)는 XPLOR로 최소 제곱 프로토콜을 사용하여 정제하였다. 디미트 리간드는 하기의 횟수 동안 불명확한 F_O-F_C 차이 밀도로 만들어졌다. 후속하는 정제는 XPLOR로 최소 제곱 및 모의 실험된 어닐링 프로토콜 둘 모두를 사용하였다[참고문헌: Brunger et al., Science 235:458-460 (1987)](상기 문헌은 본원에 참조로 인용됨). 개개의 원자 B-인자를 등방적으로 정제하였다. PROCHECK에 정의된 바와 같이, 모든 잔기는 본원에 참조로 인용된 문헌[Laskowski et al., J. Appl. Crystallogr. 26:283-291(1993)]에 기술된 바와 같이 허용된 주쇄 토션 영역내에 있다. 현재의 모델은 N-말단에서 34개의 잔기(Met₁₂₂-Gln₁₅₆)가 빠져있으며, C-말단에서는 5 잔기(Glu406 - Val410)가 빠져있다.

또한, 하기의 잔기는 불량한 밀도 때문에 Cβ를 넘어서 모델링되어 있지 않다: 184, 186, 190, 198, 206, 209, 240, 301, 330, 337, 340, 343, 359 및 395. 단백질 원자에 대한 평균 B값은 34.5Ų이다. 최종 모델은 LBD-122/410, 잔기 Arg₁₅₇-Ser₁₈₃, Trp₁₈₅-Gly₁₉₇, Ser₁₉₉-Asp₂₀₆ 및 Asp₂₀₈-Phe₄₀₅; 세 개의 카코딜레이트 개질된 시스테인: Cys₃₃₄, Cys₃₈₀ 및 Cys₃₉₂; 및 물로 모델링된 73개의 용매 분자(2003개의 원자)로 구성된다.

*R_sym=100xΣ_hklΣ_i｜I_i-I｜/Σ_hklΣ_iI_i

†R_der=100xΣ_hkl｜F_PH-F_H｜/Σ_hkl｜F_P｜

두 개의 브롬 자리에 대한 점유는 35개의 전자로 고정된다. 요오드 자리의 점유는 이 값에 비례한다.

§페이싱 파워(Phasing power)=<FH>/<ε>, 여기에서 <FH>는 평균적으로 계산된 중원자 구조 인자 크기이고, <ε>는 폐쇄부의 평균 추정된 부족분이다.

∥R_cullis=<ε>/<iso>, 여기에서 <ε>는 폐쇄부의 평균 추정된 부족분이고, <iso>는 동형의 차이이다.

¶R_cryst=100xΣ_hkl｜F_O-F_C｜/Σ_hkl｜F_O｜, 여기에서 F_O 및 F_C는 (데이터 F/σ>2에 대하여) 관찰되고, 계산된 구조 인자 크기이다. R_free는 데이터의 3%를 사용하여 계산되었고, 임의로 선택되었으며, 정제에 의해 생략되었다.

§상관 계수= Σ_hkl(｜F_O｜-｜F_O｜)x(｜F_C｜-｜F_C｜)/Σ_hkl(｜F_O｜-｜F_O｜)²x Σ_hkl(｜F_C｜-｜F_C｜)²

실시예 10 - 트리악과 rTRα LBD 복합체의 페이싱

트리악과 rTRα LBD 복합체의 가능한 비이소폼에 기인하여, T₃과 rTRα LBD 복합체로 구성된 출발 모델로부터 AMORE[참고문헌: Navaza, J., Acta Crystallographica Section A-Fundamentals of Crystallography 50:157-63 (1994)를 사용하여 분자 대체 용액을 결정하였지만, 리간드와의 복합체에서, 모든 물 분자, 및 하기 잔기들이 생략되었다: Asn179, Arg228, Arg262, Arg266 및 Ser 277. 회전 및 병진 운동 연구 둘 모두에서 강한 피크를 수득하였으며, 어떠한 상당한(> 정상 피크의 0.5배) 거짓 용액도 관찰되지 않았다(표 3 참조). 이례적인 및 통상적인 차동 푸리에 맵(Fourier map) 둘 모두에서 강한 양성 밀도 퍼센트는 용액을 확신시킨다. 최대 가능한 정제의 15 사이클 후, REFMAC[참고문헌: Murshudov, et al. "Application of Maximum Likelihood Refinement," in the Refinement of Protein Structures, Proceedings of Daresbury Study Weekend (1996)]에 의한 시그마-A 가중 계수 출력을 사용하여 맵을 계산하였다. 트리악, 생략된 잔기, 및 물 분자 503, 504, 534(T3와 TR 복합체에 대한 넘버링 협약에 따름)는 존스(Jones) 등의 O를 사용하여 생성된 차이 밀도로 만들어졌으며; 이들 잔기의 형태는 모의 실험의 어닐링 생략 맵(브렁거(Brunger) 등)에서 추가로 확인되었다. 이후, 위치의 최소 제곱, 모의 실험의 어닐링, 및 XPLOR에서 방해되어 그룹화된 B 인자 정제를 사용하여 완전한 모델을 정제하여 R_cryst가 23.6%, R_free가 24.1%가 되게 하였다.

실시예 11 - 티로이드 호르몬 수용체에서 구조와 QSAR의 관게

티로이드 호르몬 수용체 양적 구조-활성 관계의 결론을 다음과 같이 요약할 수 있다:

1) R₄'-히드록실 그룹은 수소 결합 공여체로서 작용함;

2) 아미노 프로피온산은 카르복실레이트 음이온을 통해 수용체로부터 양으로 하전된 잔기와 정전기적으로 상호작용함;

3) R₃/R₅ 치환체의 선호도는 I>Br>Me>>H임;

4) R₃'-치환체의 선호도는 Ipr>I>Br>Me>>H임.

길항제 3,5,3'-트리요오도티로닌(T₃), 3,5-디브로모-3'-이소프로필티로닌(IpBr₂), 3,5-디메틸-3'-이소프로필티로닌(디미트), 및 3,5,3'-트리요오도티로아세트산(트리악)과 복합된 티로이드 호르몬 수용체 리간드 결합 도메인의 구조는 본원에 제공된 바와 같이

1) 수소 결합 수준에서 결합의 수용체 결정인자의 동정;

2) 예상 클래식 티로이드 호르몬 수용체 QSAR과 이들 결정인자의 결합; 및

3) 결합의 결정인자가 단단하고, 리간드 및 수용체 둘 모두에 대해 가요적이라는 것에 대한 예상을 가능하게 한다.

형태(R₁=아미노-프로피온산, 아세트산; R₃, R₅=I, Br, Me; R₃'=Ipr, I)를 갖는 길항제에 대한 분류는 (대표적인 리간드 T₃에 대해서는) 하기에 제시된 바와 같다:

F = 기준(항상 만족)

A = 조정 가능

본원에 기술된 방법 및 데이터를 기초로 하여, 본 발명의 컴퓨터를 사용한 방법의 구체예는 다음과 같으며, 수용체 LBD의 아미노산 잔기의 구조와 본원에 기술된 네 개의 상이한 리간드 사이의 상호작용에 기초한 핵 수용체 리간드의 설계를 가능하게 한다. 리간드에 대한 작은 분자 구조는 캠브리지 구조 데이터베이스(CSD)로부터 입수할 수 있으며, 3차원 모델은 명세서 전반에 걸쳐서 기술된 방법을 사용하여 구성될 수 있다. 합성 리간드를 설계함에 있어 고려해야 할 요소는 다음과 같다:

1) 히스티딘 381은 물 분자에 의해 유지된 최적의 토토머를 갖는 R₄' 히드록실에 대한 수소 결합 수용체로서 작용한다. 도 23 및 도 24를 참조하기 바란다. 히스티딘은 R₄' 치환체를 둘로싸는 이러한 소수성 포켓에서 유일한 친수성 잔기이다. 히스티딘은 토토머 상태에 따라서 수소 결합 수용체 또는 공여체일 수 있다. 수소 결합 공여체가 바람직하지만, 예를 들어 리간드의 R₄' 위치에 메톡시가 존재하는 경우, 수소 결합 수용체인 것도 용인될 수 있다.

2) 아르기닌 228, 262 및 266은 직접 및 R₁-치환체와의 물 중재된 수소 결합을 통해 (트리악 복합체에서와 같이) 아르기닌 266에 의해 제공된 정전기적 상호작용으로 상호작용한다. 극성 포켓은 도 23 내지 도 25에 도시되어 있다. 도 23에는 TRα 리간드 결합 공동에서의 T₃가 도시되어 있는데, T₃의 아미노-프로피온 R1-치환체는 Arg228, HOH502, H9H503 및 HOH504와 수소 결합에 의해 상호작용한다. 도 24에는 리간드 결합 공동에서의 트리악이 도시되어 있는데, -COOH R₁ 치환체는 극성 포켓에 존재한다. 도 24에서, Arg228은 리간드와 수소 결합을 더 이상 공유하지 않지만, -COOH R₁ 치환체는 Arg266과 수소 결합을 형성한다. 도 25는 T₃ 및 트리악을 리간드 결합 공동에 포개 놓여져 있으며, 수개의 위치적으로 불변화된 아미노산 및 물 분자, 및 선택적으로 변화된 상호작용 아미노산 및 물 분자를 도시하고 있다. 세 도면은 변할 수 있는 극성 포켓의 부분 및 상이한 리간드의 결합시에 이동하지 않는 이들 부분을 도시하고 있다. 예를 들어, 극성 포켓의 상부에 있는 Arg 262는 R₁ 치환체가 -COOH로부터 아미노프로피온산 그룹으로 변화된 경우에도 이동하지 않는다. 그러나, 나머지 두 아르기닌, Arg228 및 Arg266은 크기에서의 변화 또는 R₁ 치환체의 화학 특성에 반응하는 극성 포켓에서 가요성을 갖는다는 것을 입증하였다.

3) R₃/R₅ 치환체에 대한 내부 및 외부 포켓은 Ser260, Ala263, Ile299; 및 Phe218, Ile221, Ile222에 의해서 각각 형성된다. 도 21 및 22를 참조하기 바란다. 내부 포켓은 치환체의 크기와 관계없이 R₃ 또는 R₅ 치환체에 의해 채워지며, 리간드를 수용체내에 위치시킴으로써 결합 결정인자로서 작용할 수 있다. 최적으로는, 내부 포켓 아미노산은 요오드 그룹 보다 크지 않은 R₃ 또는 R₅ 치환체와 상호 작용한다. 내부 포켓이 R₃ 치환체에 의해 채워지는 경우, 외부 포켓은 R₅ 치환체와 상호작용하고, 그 역도 마찬가지이다. 외부 포켓은 헬릭스 3(Lys220-Ile221)의 브레이크 지점에서 중심에 있는 주쇄 모션을 통해 치환체의 크기로 조정될 수 있는데, 이는 H3의 벤딩, 및 H3의 N-말단 부분의 모션이 리간드 결합에 유발된 형태적 변화를 나타낼 수 있다는 것을 암시한다. 외부 포켓은 보다 큰 치환체 그룹을 수용한다는 점에 있어서 내부 포켓에서 보다 큰 가요성을 갖는다.

4) R₃'-치환체의 포켓은 Phe215, Gly290, Met388에 의해 형성된다. 포켓은 R₃'-요오드 치환체에 의해 불완전하게 채워지며, 가요성 Met388 측쇄 및 H7/H8 루프의 이동에 의해 다소 큰 3'-이소프로필 치환체를 수용한다. 이러한 포켓은 이소프로필 보다 훨씬 큰 R₃'-치환체, 예를 들어 페닐 그룹을 수용할 수 있다.

상기 정보는 자동화된 QSAR 방법론 및 약제학적 납 화합물의 안내 매뉴얼 모델을 개선시킴으로써 고친화도의 작용제 및 길항제의 설계를 용이하게 할 것이다. 예를 들어, 이산성 물 분자의 포함은 약물류 개발을 다루기 위한 극성 포켓에서 수소 결합의 완전한 설명을 제공하며; 또한, 수용체내에서의 이동성 및 비이동성 잔기의 동정은 분자 역학/동력학 계산에 사용하기 위한 물리적으로 합리적인 한계를 제시한다.

실시예 12 - 친화도가 증가된 리간드의 설계

수용체와 리간드 사이의 직접 상호작용은 극성 포켓에 국한되며, R₁ 치환체와 상호작용한다. 상보성의 부족은 생물학적인 조절을 위한 관계를 함유할 수 있으며, 또한 극성 포켓의 아미노산과 합성 리간드의 R₁ 치환체 사이의 상호작용을 최적화시킴으로써 친화도를 증가시키는 기회를 제공한다. 본원에 기술된 수용체-리간드 상호 작용 구조는 하기의 두 가지 상보적인 변화를 갖는 합성 리간드가 증가된 친화도를 갖도록 설계되는 것을 가능하게 한다:

1) 양으로 하전된 아민을 제거한다. 극성 포켓에 대해 예상된 강한 양성 정전기 전위는 아미노프로피온산 R₁ 치환체 중의 양으로 하전된 아민이 결합에 불리할 수 있다는 것을 제시한다. 치환에 적합한 그룹은 인접한 수소 결합 파트너; 예를 들어, Thr 275 O 또는 Ser 277 N의 특성에 의해 제시된다(부록 2의 표 참조). 예를 들어, 탄소수가 0 내지 4인 카르복실레이트, 카르보닐, 포스포네이트 및 설페이트를 포함하는, 임의의 음으로 하전된 치환체라도 극성 포켓의 아미노산과 상호작용하는데 적합할 것이다. R₁ 치환체의 또 다른 예는 하나 이상의 카르보닐 그룹으로 천연 리간드의 아민을 대체하는 옥삼산이다.

2) 수소 결합 수용체 및 공여체 그룹을 R₁ 치환체에 혼입시켜 극성 포켓 골격과의 광범위한 상호작용을 제공한다. R₁ 치환체로 혼입된 상기 수소 결합 수용체 및 공여체 그룹은, 그렇지 않으면 발생하게될, 극성 포켓에서 물 분자와의 상호작용을 허용한다. 특이적인 물은 HOH 504(Ala 225 O 및 Arg 262 NH와 수소 결합); 및 HOH503(Asn 179 OD1, Ala 180 N과 수소 결합)을 포함하며, 이 둘 모두 네 개의 모든 복합체(T3과 복합된 TR LBD, IpBr₂와 복합된 TR LBD, 디미트와 복합된 LBD 및 트리악과 복합된 TR LBD)에 존재한다. 극성 포켓에서의 수소 결합 네트웍 분석은 (아스파라긴의 화학 특성이 각 자리에서 가요성을 허용하겠지만) HOH 504를 수소 결합 수용체로 대체 및 HOH 503을 수소 결합 공여체로 대체를 제시한다. 이와 같이, 수소 결합 수용체를 HOH 504를 대신할 수 있는 R₁ 치환체에 혼입시키는 것 또는 수소 결합 수용체를 HOH 503을 위치상 대신할 수 있는 R₁ 치환체에 혼입시키는 것, 또는 이들의 조합은 신규한 TR 리간드를 합성하는 방법이다.

이들 두 가지 설계 방법은 하기 표 4의 방법을 포함하여, 합성 리간드를 설계하는데 별도로 또는 조합하여 사용될 수 있다.

이러한 접근법에 대한 결론은 잔기 Arg262 및 Asn179에 특이적인 상호작용을 설계하는 것이다. 목표는 극성 포켓에서 물 분자 또는 하전된 잔기와의 수소 결합을 형성하는 R₁ 치환체를 갖는 리간드를 설계함으로써 이들 잔기에 대한 상호작용을 완성하는 것이다.

표 4.합성 TR 리간드

상기 기재된 비페닐 에테르 골격 구조에서 상기 치환기들의 결합은 티로이드 호르몬 수용체에 대해 약물학적으로 유용한 리간드를 형성할 수 있다. 이들 신규한 리간드는 티로이드 수용체의 길항제일 수 있다.

본원에서 기재된 컴퓨터를 사용하는 방법으로 합성 리간드를 구성하는 방법이 하기에 요약되어 있다:

상기 식에서

A는 수소 결합 수용체이고,

D는 수소 결합 공여체이고,

O는 -OH, -CO이고,

R₁₀은 -OH, -CO일 수 있고,

R₂₀은 -CO일 수 있고,

R₃₀은 -COOH, -CONH₂일 수 있다.

또한, 합성 TR 리간드에 대한 표를 참조한다.

표 3. LBD-122/410

본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌 및 특허 출원은 각각의 개별적인 공개문헌 또는 특허 출원이 참고 문헌으로 인용되는 것으로 특별하게 그리고 개별적으로 나타내는 것과 동일하게 참고 문헌으로 인용된다. 이들 문헌중에서 핵 수용체 리간드, 특히 TR 리간드는 본원에서 참고로 인용되며, 단, 청구된 화합물로부터 선택적으로 배제될 수 있다.

상단부와 상단부 아래는 독자의 편의상 제공되는 것이며, 이러한 상단부 및 상단부 아래에 사용된 용어의 의미를 설명하기 위해 사용되어서는 안된다.

본 발명은 이제 완전하게 기재되어 있으며, 당업자에게는 첨부된 청구범위의 내용 또는 범위를 벗어남이 없이 많은 변화 및 변경이 이루어질 수 있음이 자명할 것이다.

부록 2

디미트와 티로이드 호르몬 수용체 아미노산과의 상호작용

표 XX에 대한 설명. 상기 표는 디미트(DMT)와의 상호작용을 기재한 것이다. 칼럼 상단부는 하기와 같다:

#1 : 수용체의 아미노산과 상호작용하는 디미트의 원자. 이들은 또한 도 X에서 번호로 매겨진다.

#2: 리간드와 상호작용하는 전체길이 γTRα에서의 아미노산.

#3: 상호작용이 발생하는 아미노산에서의 원자의 명명(표준 명명법)

#4: 디미트와 단백질 원자 간의 A에서의 거리

표 XX에 대한 설명. 상기 표는 트리악과의 상호작용을 기재한 것이다. 칼럼 상단부는 하기와 같다:

#1 : 수용체의 아미노산과 상호작용하는 트리악의 원자. 이들은 또한 도 X에서 번호로 매겨진다.

#2: 리간드와 상호작용하는 전체길이 γTRα에서의 아미노산.

#3: 상호작용이 발생하는 아미노산에서의 원자의 명명(표준 명명법)

#4: 트리악과 단백질 원자 간의 A에서의 거리

표 XX에 대한 설명. 상기 표는 IpBr₂와의 상호작용을 기재한 것이다. 칼럼 상단부는 하기와 같다:

#1 : 수용체의 아미노산과 상호작용하는 IpBr₂의 원자. 이들은 또한 도 X에서 번호로 매겨진다.

#2: 리간드와 상호작용하는 전체길이 γTRα에서의 아미노산.

#3: 상호작용이 발생하는 아미노산에서의 원자의 명명(표준 명명법)

#4: IpBr₂와 단백질 원자 간의 A에서의 거리

표 XX에 대한 설명. 상기 표는 T3와의 상호작용을 기재한 것이다. 칼럼 상단부는 하기와 같다:

#1 : 수용체의 아미노산과 상호작용하는 T3의 원자. 이들은 또한 도 X에서 번호로 매겨진다.

#2: 리간드와 상호작용하는 전체길이 γTRα에서의 아미노산.

#3: 상호작용이 발생하는 아미노산에서의 원자의 명명(표준 명명법)

#4: T3와 단백질 원자 간의 A에서의 거리

티로이드 호르몬 수용체와 디미트의 코디네이션(coordination) 구조

티로이드 호르몬 수용체와 트리악의 코디네이션 구조

티로이드 호르몬 수용체와 IpBr₂의 코디네이션 구조

티로이드 호르몬 수용체와 T₃의 코디네이션 구조

Claims (34)

1. (i) 본원명세서 부록 2에 따른 TR 리간드와 TR 수용체 아미노산의 상호작용 데이터, 및 이러한 데이터로부터 리간드가 결합된 결정화된 TR 수용체 LBD(티로이드 수용체 리간드 결합 도메인: Tyroid Receptor Ligand Binding Domain)의 3차원 모델을 생성시키도록 프로그래밍된 컴퓨터를 이용하여 리간드가 결합된 결정화된 TR 수용체 LBD의 3차원 모델을 생성시키는 단계;

   (ii) 상기 3차원 모델에서 결합된 리간드의 하나 이상의 제 1 화학 잔기와 상호작용하는 TR 수용체 LBD의 하나 이상의 상호작용 아미노산을 결정하는 단계;

   (iii) 제 1 화학 잔기의 하나 이상의 화학적 변형을 선택하여 제 2 화학 잔기를 생성시키는 단계;

   (iv) 제 1 화학 잔기와 상호작용 아미노산과의 상호작용과 비교하여 제 2 화학 잔기와 상호작용 아미노산과의 상호작용의 감소 또는 증강을 측정하는 단계; 및

   (v) 제 1 화학 잔기가 제 2 화학 잔기로 치환된 설계된 TR 수용체 합성 리간드를 생성시키는 단계를 포함하여, TR 수용체 합성 리간드를 설계하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 단계 (ii), (iii) 및 (iv)를 반복함을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 3차원 모델이, 개선된 페이싱(phasing)을 생성시키기 위해 동형 리간드 유도체(isomorphous ligand derivatives)를 비교함으로써 생성됨을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 하기 화학식의 티로닌 유도체의 R₅, R₃, 'R₅ 및 'R₃ 위치중 하나 이상을 Br 또는 I로 치환하므로써 동형 리간드 유도체를 생성시킴을 특징으로 하는 방법:
5. 제 1 항에 있어서, 선택 단계 iii)가 부록 2에 기재된 상호작용 아미노산 중의 하나 이상의 아미노산과 상호작용하는 제 1 화학 잔기를 사용함을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 화학적 변형이 제 2 화학 잔기와 상호작용 아미노산 사이의 수소 결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 쌍극자 상호작용을, 제 1 화학 잔기와 상호작용 아미노산 사이의 상호작용에 비해 증강시킴을 특징으로 하는 방법.
7. 제 5 항에 있어서, 화학적 변형이 제 2 화학 잔기와 상호작용 아미노산 사이의 수소 결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 쌍극자 상호작용을, 제 1 화학 잔기와 상호작용 아미노산 사이의 상호작용에 비해 감소시킴을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 제 1 화학 잔기가 하나 이상의 원거리 아미노산으로부터 4.5Å 이상 떨어져 있음을 특징으로 하는 방법.
9. 제 7 항에 있어서, 제 1 화학 잔기가 원거리 아미노산으로부터 6 내지 12Å 떨어져 있음을 특징으로 하는 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 화학적 변형이 원거리 아미노산 쪽으로 연장되고, 제 2 화학 잔기와 원거리 아미노산 사이의 수소 결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 쌍극자 상호작용을 생성시킴을 특징으로 하는 방법.
11. 제 8 항에 있어서, 화학적 변형이 원거리 아미노산이 다른 아미노산에 결합하는 것을 입체적으로 방해하지만, 상호작용 아미노산을 입체적으로 방해하지 않음을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 화학적 변형이 하기 화학식의 티로닌 유도체의 R₅' 위치에서 이루어짐을 특징으로 하는 방법:
13. 제 11 항에 있어서, 화학적 변형이 활성화 헬릭스 작용을 입체적으로 방해함을 특징으로 하는 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 화학적 변형이 상호작용 아미노산과 리간드의 R₁ 내지 R₆ 위치로부터의 원자 사이의 상호작용을 간섭하지 않음을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 활성화 헬릭스가 헬릭스 H12임을 특징으로 하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 화학적 변형이, 티로닌 유도체의 프라임 고리의 평면으로부터 30^o 이상 돌출하는 적어도 탄소수 3개인 알킬에 상응하는 길이의 평면 구조를 포함함을 특징으로 하는 방법.
17. (i) 본원명세서 부록 2에 따른 TR 리간드와 TR 수용체 아미노산의 상호작용 데이터, 및 이를 입력 데이터로서 공급할 경우 TR 수용체 LBD의 3차원 모델을 생성시키도록 프로그래밍된 컴퓨터로부터 생성된 TR 수용체 LBD의 3차원 모델을 이용하여 TR 수용체 작용제의 분자 인식 도메인 구조를 결정하는 단계;

    (ii) 제 1 화학 잔기의 하나 이상의 화학적 변형을 선택하여, 상기 작용제에 대한 결합 부위를 지나, LBD의 전사 활성화 도메인, LBD의 리프레서 결합 도메인, TR 수용체의 DNA 결합 도메인, TR 수용체의 열충격 단백질 결합 도메인, LBD의 이량체화 도메인, 및 상기 DNA 결합 도메인에 대한 힌지 영역으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 도메인 방향으로 연장되는 제 2 화학적 잔기를 생성시키는 단계; 및

    (iii) 제 1 화학 잔기가 제 2 화학 잔기로 치환된 설계된 TR 수용체 길항제를 생성시키는 단계를 포함하여, TR 수용체 작용제로부터 TR 수용체 길항제를 설계하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 화학적 변형이 분자 인식 도메인과 작용제 사이의 수소결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용 또는 쌍극자 상호작용에 비해, 분자 인식 도메인과 길항제 사이의 수소 결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 쌍극자 상호작용의 손실을 최소화시킴을 특징으로 하는 방법.
19. 제 17 항에 있어서, 화학적 변형이 분자 인식 도메인과 작용제 사이의 수소결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 쌍극자 상호작용에 비해, 분자 인식 도메인과 길항제 사이의 수소 결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용 또는 쌍극자 상호작용을 감소시키지만, 화학적 변형이 길항제가 100 nM Kd 이하의 친화도로 TR 수용체에 결합하는 것을 허용함을 특징으로 하는 방법.
20. 제 17 항 또는 제 19 항에 있어서, 분자 인식 도메인이 하나 이상의 원거리 아미노산으로부터 3Å 이상 떨어져 있고, 원거리 아미노산이 분자 인식 도메인과 결합하는 데에 현저하게 기여하지 않음을 특징으로 하는 방법.
21. 제 20 항에 있어서, 제 1 분자 인식 도메인이 원거리 아미노산으로부터 4 내지 12Å 떨어져 있음을 특징으로 하는 방법.
22. 제 21 항에 있어서, 화학적 변형이 원거리 아미노산 쪽으로 연장되고, 원거리 아미노산과 분자 인식 도메인 사이의 수소 결합 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 쌍극자 상호작용을 생성시킴을 특징으로 하는 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 화학적 변형이 원거리 아미노산이 다른 아미노산에 결합하는 것을 입체적으로 방해하지만, 분자 인식 도메인에 결합하는 아미노산을 입체적으로 방해하지 않음을 특징으로 하는 방법.
24. 제 23 항에 있어서, 리간드의 화학적 변형이 C-H 또는 C-OH에서 일어남을 특징으로 하는 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 제 2 화학적 변형이 길이면에서 이중 결합 탄소 4개 이상에 상응하고 부피면에서 이중 결합 탄소 4개 이상에 상응하는 최장 구성요소로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
26. (i) 본원명세서 부록 2에 따른 TR 리간드와 TR 수용체 아미노산의 상호작용 데이터, 및 이러한 데이터로부터 리간드가 결합된 결정화된 TR 수용체 LBD의 3차원 모델을 생성시키도록 프로그래밍된 컴퓨터를 이용하여, 리간드가 결합된 결정화된 TR 수용체 LBD의 3차원 모델을 생성시키는 단계;

    (ii) 상기 3차원 모델에서 결합된 리간드의 하나 이상의 제 1 화학 잔기와 상호작용하는 TR 수용체 LBD의 하나 이상의 상호작용 아미노산을 결정하는 단계;

    (iii) 제 1 화학 잔기의 하나 이상의 화학적 변형을 선택하여 제 2 화학 잔기를 생성시키는 단계;

    (iv) 제 1 화학 잔기와 상호작용 아미노산과의 상호작용과 비교하여 제 2 화학 잔기와 상호작용 아미노산과의 상호작용의 감소 또는 증강을 측정하는 단계; 및

    (v) 제 1 화학 잔기가 제 2 화학 잔기로 치환된 설계된 TR 수용체 초작용제 또는 초길항제를 생성시키는 단계를 포함하여, TR 수용체 초작용제 또는 초길항제를 설계하는 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 화학적 변형이 제 2 화학 잔기와 상호작용 아미노산 사이의 수소결합 상호작용, 정전기 상호작용, 전하 상호작용, 소수성 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 또는 쌍극자 상호작용을, 제 1 화학 잔기와 상호작용 아미노산 사이의 상호작용에 비해 증강시킴을 특징으로 하는 방법.
28. 제 26 항에 있어서, 화학적 변형이 제 1 화학 잔기의 카르복실레이트 잔기를 포스포네이트 또는 포스페이트로 변화시켜 제 2 화학 잔기를 생성시킴을 특징으로 방법.
29. 제 26 항에 있어서, 화학적 변형이 래트 α-TR의 Arg262, Arg266 또는 Arg228, 또는 3차원 모델 중의 3차원 위치에서 Arg262, Arg266 또는 Arg228에 상응하는 사람 α-TR 또는 β-TR의 아르기닌 중 하나 이상의 아르기닌과 제 2 화학 잔기 사이의 상호작용을 증강시킴을 특징으로 하는 방법.
30. 제 29 항에 있어서, 화학적 변형이 작용제 또는 천연 리간드가 LBD에 결합되는 경우 물에 의해 정상적으로 점유되는 공간을 채우도록 사이드 그룹(side group)을 변화시킴을 특징으로 하는 방법.
31. 제 30 항에 있어서, 화학적 변형이 LBD의 결합 공동(cavity)의 포켓 또는 표면 내에 적합하게 맞춰지고, 포켓 또는 표면의 전하, 소수성 또는 이 둘 모두를 보충함을 특징으로 하는 방법.
32. 제 31 항에 있어서, 화학적 변형이, 제 1 화학잔기인 (1) T3의 R1에 있는 제 1 페닐에 결합된 제 1 탄소 또는 (2) T3 카르복실레이트기를 갖는 T3 작용제의 R1에 있는 제 1 페닐에 결합된 제 1 탄소를 제 2 화학 잔기인 C2 공간 그룹으로 변화시킴을 특징으로 하는 방법.
33. 제 26 항에 있어서, 화학적 변형이, 제 1 화학잔기인 (1) T3의 R4에 있는 제 1 페닐을 T3의 제 2 페닐 고리에 결합시키는 탄소 또는 (2) T3 작용제의 R4에 있는 제 1 페닐을 T3 작용제의 제 2 페닐 고리에 결합시키는 탄소를 제 2 화학 잔기인 단일 또는 이중 치환된 탄소 그룹으로 변화시킴을 특징으로 하는 방법.
34. 제 26 항에 있어서, 화학적 변형이 (1) T3의 R4에 있는 제 1 페닐을 T3의 제 2 페닐 고리에 결합시키는 탄소 또는 (2) T3 작용제의 R4에 있는 제 1 페닐을 T3 작용제의 제 2 페닐 고리에 결합시키는 탄소인 제 1 화학 잔기를 변화시킴을 특징으로 하는 방법.