JP2000346844A - 免疫測定法及び測定キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 非特異的反応による凝集がなく、希釈しなく
ても広範囲において正確な測定が可能であり、かつ、高
度で迅速な測定が可能な免疫測定法及びその方法を実施
するための測定キットを提供する。 【解決手段】 試料中の測定対象物質を定量するにあた
り、測定対象物質に対する抗体又は抗原を感作した不溶
性担体と上記試料を溶液中で混合して抗原抗体反応によ
る凝集反応を生じさせ、該凝集反応に基づく吸光度変化
量を測定して検量線と照合することよりなる免疫測定法
であって、上記不溶性担体としてラテックス粒子を用
い、上記溶液中に、水溶性高分子からなる増感剤及び抗
免疫グロブリンＭ抗体が含有され、上記凝集反応は、恒
温において、５〜３０分間行うものであり、上記吸光度
変化量は、凝集反応の進行に伴う吸光度の増加量である
免疫測定法及びその測定キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ラテックス凝集法
を利用した、高感度で迅速な測定が可能な免疫測定法及
びその方法を実施するための測定キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、反応系の微量化・感度の向上・反
応時間の短縮等を目的として、ラテックス凝集による免
疫測定法が開発されている。ラテックス凝集による免疫
測定法については、様々なラテックス凝集試薬が上市さ
れているが、非特異的な凝集が見られ、ＥＩＡ法（酵素
免疫測定法）等に比べると、特に低濃度においては、正
確に測定できないという問題点があった。また、一般に
従来の免疫測定法は、至適な測定範囲は広くなく、測定
対象物質が体内において広範囲の濃度をとるものについ
ては多くの場合、測定を行う際に複数回の希釈等煩雑な
操作が必要とされ、極めて不便であると同時に、測定精
度が低下するといった問題点があった。そこで、測定感
度向上のため、増感剤を添加する試みもなされている
（特開平４−２０８５９号公報等）。しかしながら、増
感剤の濃度を増やすにつれ、低濃度域における非特異凝
集により、測定精度及び再現性が低下するという問題点
があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
に鑑み、非特異的反応による凝集がなく、希釈しなくて
も広範囲において正確な測定が可能であり、かつ、高感
度で迅速な測定が可能な免疫測定法及びその方法を実施
するための測定キットを提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】請求項１記載の発明は、
試料中の測定対象物質を定量するにあたり、測定対象物
質に対する抗体又は抗原を感作した不溶性担体と上記試
料を溶液中で混合して抗原抗体反応による凝集反応を生
じさせ、該凝集反応に基づく吸光度変化量を測定して検
量線と照合することよりなる免疫測定法であって、上記
不溶性担体としてラテックス粒子を用い、上記溶液中
に、水溶性高分子からなる増感剤及び抗免疫グロブリン
Ｍ抗体が含有され、上記凝集反応は、恒温において、５
秒〜３０分間行うものであり、上記吸光度変化量は、凝
集反応の進行に伴う吸光度の増加量であることを特徴と
する免疫測定法である。

【０００５】請求項２記載の発明は、 請求項１記載の免
疫測定法であって、前記溶液中における水溶性高分子か
らなる増感剤の濃度が０．１〜５重量％、抗免疫グロブ
リンＭ抗体の濃度が３μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌとさ
れていることを特徴とする免疫測定法である。

【０００６】請求項３記載の発明は、 請求項２記載の免
疫測定法であって、前記溶液中における不溶性担体の濃
度が０．０１〜３重量％、測定対象物質の濃度が１００
ｎｇ／ｄＬ〜８０ｍｇ／ｄＬとされていることを特徴と
する免疫測定法である。

【０００７】請求項４記載の発明は、 測定対象物質に対
する抗体又は抗原を感作したラテックス粒子と、水溶性
高分子からなる増感剤を含有する検体希釈液とからなる
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の免
疫測定法を実施するための測定キットである。

【０００８】本発明においては、試料中の測定対象物質
を測定するにあたり、まず、測定対象物質に対する抗体
又は抗原を感作した不溶性担体と上記試料を溶液中で混
合して抗原抗体反応による凝集反応を生じさせる。

【０００９】上記試料としては、例えば、血清、血漿等
が挙げられるが、これらのみに限定されるのもではな
く、各種の生体試料、非生体試料に適用することも可能
である。

【００１０】上記測定対象物質としては、抗原または抗
体、例えば、ＡＦＰ（ヒトアルファ−フェトプロテイ
ン）等の癌マーカー、ＰＬＧ（ヒトプラスミノーゲ
ン）、α₂−ＰＩ（ヒトアルファ２−プラスミンインヒ
ビター）、ＡＴIII （ヒトアンチトロンビンIII ）等の
血液凝固・線溶系酵素、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗原、フェ
リチン等が挙げられる。

【００１１】上記測定対象物質が、ＡＦＰ、ＰＬＧ、α
₂ −ＰＩ、ＡＴIII のいずれかである場合には、該測定
対象物質の上記溶液中における濃度は、１００ｎｇ／ｄ
Ｌ〜８０ｍｇ／ｄＬとするのがよい。これは、１００ｎ
ｇ／ｄＬ未満であると、濃度が低いため正確な定量がで
きず、８０ｍｇ／ｄＬを超えると、非特異的反応による
凝集が生じて正確な測定ができないためである。

【００１２】本発明においては、上記不溶性担体とし
て、粒径が比較的一定であり、また、工業的に一定の品
質、性能のものを大量生産することができるラテックス
粒子が用いられる。上記ラテックス粒子としては特に限
定されず、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニ
トリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル
酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合
体；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレ
ート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等
の微粒子等が挙げられる。これらのうち、抗体又は抗原
の吸着性に優れており、かつ、生物学的活性を長期間安
定に保持できる等の理由から、ポリスチレン系のラテッ
クス粒子が好適に用いられる。

【００１３】上記ラテックス粒子の粒径は、０．０２〜
１μｍが好ましく、より好ましくは、０．０５〜０．６
μｍである。これは、小さすぎると、必要な感度を得る
ことが困難となり、大きすぎると、自己凝集が進み、分
散性が低下するためである。

【００１４】上記不溶性担体には、上記測定対象物質に
対する抗体又は抗原が感作される。不溶性担体への抗体
又は抗原の感作は、物理的又は化学的に吸着させる方法
等により行うことができる。

【００１５】上記測定対象物質に対する抗体又は抗原と
しては、測定対象物質がＡＦＰ、ＰＬＧ、α₂ −ＰＩ、
ＡＴIII 、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、フェリチンのいず
れかである場合、それぞれ、抗ＡＦＰ抗体、抗ＰＬＧ抗
体、抗α₂ −ＰＩ抗体、抗ＡＴIII 抗体、ＨＢｓ抗体、
ＨＢｓ抗原、抗フェリチン抗体を用いる。

【００１６】上記測定対象物質に対する抗体又は抗原
の、上記溶液中における濃度は、０．１〜１００μｇ／
ｍｌとするのがよい。これは、０．１μｇ／ｍｌ未満で
あると、感度が低いため、低濃度域での正確な定量がで
きず、１００μｇ／ｍｌをこえると、非特異的な凝集を
生じ、正確な測定ができないためである。なお測定対象
物質が、ＡＦＰ、ＰＬＧ、α₂ −ＰＩ、ＡＴIII のいず
れかである場合には、 測定対象物質に対する抗体の、上
記溶液中における濃度は、１〜１０μｇ／ｍｌとするの
がより好ましい。

【００１７】上記測定対象物質に対する抗体としては、
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使
用することができる。上記ポリクローナル抗体として
は、ヒト、ウサギ、ヤギ等の由来の動物種、グロブリン
画分、アフィニティ精製画分等の純度、Ｆａｂ′、Ｆ
（ａｂ）₂ 等の処理方法等は制限されるものではない。
また、測定対象物質がフェリチンである場合、免疫源で
あるフェリチンの由来は、肝臓、 脾臓、 胎盤等のいずれ
であってもよい。

【００１８】上記測定対象物質に対する抗原の純度や処
理方法は特に限定されず、 例えば、ＨＢｓ抗原の場合に
おいては、既知の方法でＨＢｓ抗原陽性ヒト血清から精
製されたもの、遺伝子組み換えによって得られたものの
いずれでもよい。

【００１９】上記不溶性担体の上記溶液中における濃度
は、０．０１〜３重量％とするのがよい。これは、０．
０１重量％未満であると凝集塊の形成が不十分で必要な
感度が得られず、３重量％を超えるとバックグラウンド
としての吸光度が高すぎ、正確な定量が行えないからで
ある。なお測定対象物質が、ＡＦＰ、ＰＬＧ、α₂ −Ｐ
Ｉ、ＡＴIII のいずれかである場合には、 上記不溶性担
体の上記溶液中における濃度は、０．１〜３重量％とす
るのがより好ましく、測定対象物質が、ＨＢｓ抗原、Ｈ
Ｂｓ抗体あるいはフェリチンである場合には、 上記不溶
性担体の上記溶液中における濃度は、０．０１〜０．５
重量％とするのがより好ましい。

【００２０】本発明においては、上記試料と上記不溶性
担体とを溶液中で混合する。上記溶液としては特に限定
されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリ
ス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。

【００２１】本発明においては、上記溶液中に、水溶性
高分子からなる増感剤が含有され、溶液中の濃度は０．
１〜５重量％が好ましく、 より好ましくは、 ０．４〜３
重量％である。この増感剤が上記溶液中に含有されるこ
とにより、感度の向上及び反応の促進を図ることができ
る。上記水溶性高分子からなる増感剤の上記溶液中の濃
度は、０．１重量％未満であると感度が低くなり、５重
量％を超えると、非特異的反応による凝集が生じるため
上記範囲が好ましい。

【００２２】上記水溶性高分子からなる増感剤として
は、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロ
リドン、プルラン等が挙げられる。これらの増感剤は、
単独で用いても、複数種組み合わせて用いてもよい。

【００２３】上記ポリエチレングリコールは、数平均分
子量が１，０００〜２，０００，０００のものを用いる
のが好ましい。これは、数平均分子量が１，０００未満
であると、感度の向上又は反応促進の効果が不十分であ
り、数平均分子量が２，０００，０００を超えると、上
記凝集反応液への溶解度が著しく低くなり、溶解性の点
で問題が生じるためである。なお測定対象物質が、ＡＦ
Ｐ、ＰＬＧ、α₂ −ＰＩ、ＡＴIII のいずれかである場
合には、 数平均分子量が３，０００〜１００，０００の
ポリエチレングリコールを用いるのがより好ましく、測
定対象物質が、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体またはフェリチ
ンである場合には、 数平均分子量が５，０００〜２，０
００，０００のポリエチレングリコールを用いるのがよ
り好ましい。

【００２４】上記ポリビニルピロリドンは、平均分子量
が１，０００〜２，０００，０００のものを用いるのが
好ましく、より好ましくは５，０００〜２，０００，０
００のものを用いるのがよい。これは、平均分子量が
１，０００未満であると、感度の向上又は反応促進の効
果が不十分であり、平均分子量が２，０００，０００を
超えると、上記凝集反応液への溶解度が著しく低くな
り、溶解性の点で問題が生じるためである。

【００２５】上記プルランは、平均分子量が１，０００
〜１，０００，０００のものを用いるのが好ましい。こ
れは、平均分子量が１，０００未満であると、感度の向
上又は反応促進の効果が不十分であり、数平均分子量が
１，０００，０００を超えると、上記凝集反応液への溶
解度が著しく低くなり、溶解性の点で問題が生じるため
である。より好ましい平均分子量の範囲は、 ５，０００
〜１，０００，０００である上記プルランとは、α−
１，４結合のマルトトリオースがその両端で、α−１，
６結合により繰り返し重合した直鎖状のα−グルカンの
ことをいう。

【００２６】上記水溶性高分子からなる増感剤は、適当
な媒体に分散または溶解させて使用することが好まし
い。この場合において、上記不溶性担体と、上記水溶性
高分子からなる増感剤とを同一の媒体に分散及び溶解さ
せることにより１液型のラテックス試薬として使用して
もよく、また、それぞれ、別個の媒体に分散及び溶解さ
せることによりラテックス試薬と溶液状試薬との２液型
試薬として使用してもよい。

【００２７】上記媒体としては特に限定されず、例え
ば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝
液、グッド緩衝液等が挙げられる。上記媒体のｐＨは、
５．５〜８．５が好ましい。より好ましくは、６．５〜
８．０である。

【００２８】上記１液型のラテックス試薬中には、更
に、牛血清アルブミン、ショ糖、塩濃度調整のために塩
化ナトリウム等を適宜溶解させてもよい。また、上記ラ
テックス試薬と溶液状試薬との２液型試薬として使用す
る場合にも、それぞれに牛血清アルブミン、ショ糖、塩
濃度調整のために塩化ナトリウム等を適宜溶解させても
よい。

【００２９】上記溶液中には、抗免疫グロブリンＭ（Ｉ
ｇＭ）抗体を含有させる。試料中には、リウマトイド因
子（ＲＦ）が含まれることがあるが、ＲＦは、免疫グロ
ブリンのＦｃ部分に対する抗体であるので、本発明の測
定法における構成要素である抗体に対しても結合し、 反
応の本体である凝集を増加させる。また、ＲＦは、本発
明における不溶性担体上に存在するタンパク質の変性部
分にも反応し、 本来の抗原抗体反応を妨害おそれがあ
る。そこで、反応系中に抗ＩｇＭ抗体を添加すること
で、その本態がＩｇＭであるＲＦと予め反応させ、除去
することで本来の抗原抗体反応を妨害しないようにした
ものである。上記抗免疫グロブリンＭ抗体としては、そ
の動物種、またポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体の別は問わない。抗免疫グロブリンＭ抗体の溶液中の
量は、ＲＦと反応して全てのＲＦを取り除くのに充分な
量であればよく、一般検体に発生するＲＦ因子の量から
して、溶液中、３μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌとなるよ
うに含有させるのがよい。これは、３μｇ／ｍｌ未満で
あると、多数のリウマチ患者の検体においては、非特異
凝集反応を起こし実際の測定値より高くなるためであ
り、１０ｍｇ／ｍｌより大きいと、試料中に混入してい
る各種免疫グロブリンとの反応を起こし、測定値がばら
つくためである。

【００３０】上記溶液中には、非イオン性界面活性剤を
含有させてもよい。これは、上述の抗ＩｇＭ抗体の添加
により、反応液中で所期の抗原抗体反応以外の反応が発
生してバックグラウンドが上昇し、測定誤差が生じ易く
なるのを防止するためである。上記界面活性剤の含有量
は、１〜２００ｐｐｍとするのが好ましい。これは、１
ｐｐｍ未満では、所期の効果が得られず、２００ｐｐｍ
より大きいと、凝集反応を妨げるためである。界面活性
剤としては、非イオン性界面活性剤に限られ、陰イオン
性界面活性剤や陽イオン性界面活性剤は、抗原抗体反応
系に影響を与え、感度の低下を招くために用いることが
できない。非イオン性界面活性剤としては、特に限定さ
れないが、例えば、市販品として各種Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔ
ｗｅｅｎ等を用いることができる。

【００３１】本発明においては、上記抗原抗体反応によ
る凝集反応は、恒温において行われ、２５〜４０℃で行
うのが好ましく、 ３０〜３８℃で行うのがより好まし
い。また、上記凝集反応は、５秒〜３０分間、より好ま
しくは、 ５秒〜１５分間行う。５秒未満であると、正確
な測定ができず、３０分間を超えると、非特異的反応に
よる凝集が生じ、正確な測定ができないので、上記範囲
に限定される。上記反応は、 通常、 試料及び溶液状試薬
（検体希釈液）を反応容器に分注し、インキュベートし
た後、 ラテックス試薬を添加・混合することにより行う
ことができる。

【００３２】本発明においては、上記凝集反応の際の凝
集反応液の吸光度変化量を測定して検量線と照合するこ
とにより、試料中の測定対象物質を測定する。上記吸光
度変化量は、凝集反応の進行に伴う吸光度の増加量であ
る。

【００３３】上記吸光度変化量の測定の際の測定波長
は、通常、５００〜１０００ｎｍ、好ましくは、５００
〜８００ｎｍ、さらに好ましくは、５５０〜６５０ｎｍ
の範囲から適切な波長が選択される。上記吸光度変化量
の測定に用いられる測定装置としては、経時的に上記溶
液の吸光度を測定することできるものであれば特に限定
されず、例えば、汎用の生化学自動分析装置等が挙げら
れる。上記測定波長、試料量、試薬量等は、上記測定装
置に合わせて適宜選択することができる。

【００３４】上記検量線と照合する具体的な方法として
は、例えば、既知量の測定対象物質を含む試料につい
て、吸光度変化量の測定を行い、その測定値と測定対象
物質の量とから検量線を作成しておき、未知量の測定対
象物質を含む試料について同一条件で測定した吸光度変
化量の測定値から上記検量線において対応する測定対象
物質の量を求めることにより実施することができる。

【００３５】上記測定対象物質が、以下のそれぞれであ
る場合のより好ましい実施態様は次の通りである。

【００３６】測定対象物質がヒトアルファーフェトプロ
テインである場合には、溶液中に、不溶性担体が０．０
１〜２重量％、ヒトアルファーフェトプロテインが１０
０μｇ／ｄＬ〜１００ｍｇ／ｄＬ、抗免疫グロブリンＭ
抗体が２０μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ）含有されるの
がより好ましい。

【００３７】測定対象物質がヒトプラスミノーゲンであ
る場合には、溶液中に、 不溶性担体が０．５〜２％（ｗ
／ｖ）、ヒトプラスミノーゲンが０．５〜４０ｍｇ／ｄ
Ｌ、抗免疫グロブリンＭ抗体が１５μｇ／ｍｌ〜３００
μｇ／ｍｌ含有されるのがより好ましい。

【００３８】測定対象物質がヒトアルファ２−プラスミ
ンインヒビターである場合には、溶液中に、不溶性担体
が０．１〜３％（ｗ／ｖ）、ヒトアルファ２−プラスミ
ンインヒビターが０．２〜２０ｍｇ／ｄＬ、抗免疫グロ
ブリンＭ抗体が１００μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ含有さ
れるのがより好ましい。

【００３９】測定対象物質がヒトアンチトロンビンIII
である場合には、溶液中に、不溶性担体が０．４〜２％
（ｗ／ｖ）、ヒトアンチトロンビンIII が１〜８０ｍｇ
／ｄＬ、抗免疫グロブリンＭ抗体が３０μｇ／ｍｌ〜６
００μｇ／ｍｌ含有されるのがより好ましい。

【００４０】測定対象物質がＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体も
しくはフェリチンである場合には、溶液中の抗免疫グロ
ブリンＭ抗体濃度が３μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌである
のがより好ましい。

【００４１】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００４２】（Ａ）ヒトプラスミノーゲン測定法 （１）試薬及び材料 ａ）ラテックス 平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０重量％、積水化学工業社製）を用いた。 ｂ）ラテックス希釈用緩衝液 ５０ｍＭのＮａ₂ ＨＰＯ₄ と、５０ｍＭのＮａＨ₂ ＰＯ
₄ とを、ｐＨ７．５０になるように混合したものを用い
た。 ｃ）抗ＰＬＧ抗体 ヤギの抗血清からイムノグロブリン分画にまで精製した
ヤギ抗ＰＬＧ抗体（１ｍｇ／ｍｌ、ＡＴＡＢ社製）を用
いた。

【００４３】ｄ）抗体希釈用緩衝液 上記ラテックス希釈用緩衝液を、抗体希釈用緩衝液とし
て用いた。 ｅ）ブロッキング用緩衝液 １００ｍＭのＮａ₂ ＨＰＯ₄ と、１００ｍＭのＮａＨ₂
ＰＯ₄ とを、ｐＨ７．４０になるように混合し、ウシ血
清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍ
ｉｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｇｒａｄ
ｅ、ＭｉｌｅｓＣｏｒｐ．社製）を１重量％になるよう
に、また、ＮａＮ₃ （試薬特級、ナカライテスク社製）
を０．１重量％になるように添加したものを用いた。

【００４４】ｆ）血清検体 血栓既往症を有する患者及び健常人の血清を用いた。 ｇ）ＰＬＧ標準ヒト血清 ヒトプール血清から調製された血液項目用標準血清（イ
アトロセーラ；ダイアヤトロン製）をエルピアエースＰ
ＬＧ（ダイアヤトロン製）を用いてＰＬＧ量を測定し、
生理食塩水で約１０・５・２．５・１．２５ｍｇ／ｄＬ
にそれぞれ希釈して使用した。また、血液項目用標準血
清を含まない、生理食塩水のみのものを０ｍｇ／ｄＬと
した。

【００４５】ｈ）検体希釈用液（Ｒ１液） ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール６０
００（数平均分子量７５００、和光純薬工業社製）を３
重量％、及び、抗ＩｇＭ抗体を６０μｇ／ｍｌになるよ
うに添加したものを用いた。 ｉ）ＳＲＩＤ法 市販のアガロース培地を用いて、精製ＰＬＧ（ＡＤＩ
社）により検量線を作成し、検体中のＰＬＧの定量を行
った。抗体としては、ヤギポリクローナル抗体（ＤＡＫ
Ｏ社）を用いた。 ｊ）従来のＰＬＧ測定用ラテックス凝集免疫試薬 市販のラテックス凝集免疫試薬（エルピアエースＰＬ
Ｇ、ダイアヤトロン社製）を用いた。

【００４６】（２）方法 １）ラテックス試薬の調製 平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０重量％）１容に、ラテックス希釈用緩衝液３容
を添加希釈し、２．５重量％ラテックス液とした。抗Ｐ
ＬＧ抗体は、タンパク濃度が６６．７μｇ／ｍｌになる
ように抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作抗体液とした。
２．５重量％ラテックス液２００μ１を２５℃のインキ
ュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しなが
ら、抗体感作液８００μｌを素早く添加し、２５℃にて
１時間攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液を２．
０ｍｌ添加し、２５℃にて続けて２時間攪拌した。その
後、１５℃、１５０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し
た。得られた沈殿にブロッキング用緩衝液４．０ｍｌを
添加し、同様に遠心分離することにより、沈殿を洗浄し
た。洗浄操作は３回行った。この沈殿にブロッキング用
緩衝液を２．０ｍｌ添加し、よく攪拌した後、超音波破
砕機にて分散処理を行い、固形分０．２５重量％のラテ
ックス試薬とした。このようにして調製したラテックス
試薬は４℃にて保存した。

【００４７】２）ラテックス試薬によるＰＬＧ量の測定 ラテックス試薬によるＰＬＧ量の測定は、生化学用自動
分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行っ
た。上記１）で得られた固形分０．２５重量％のラテッ
クス試薬をそのままＲ２液（固形分０．２５重量％）と
した。測定条件は以下の通りである。

【００４８】 検体容量 ３μｌ 検体希釈液（Ｒ１液） ３００μｌ 試薬（Ｒ２液） １００μｌ 測定波長 ５７０ｎｍ 測定温度 ３７℃

【００４９】試薬（Ｒ２液）を添加してから約８０秒後
の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７０）
を測定し、この吸光度の差を１００００倍したものを吸
光度変化量とした。検体の代わりに既知濃度の血液項目
用標準血清で同様の測定を行って、予め検量線を作成し
ておき、上記検体の吸光度変化量を上記検量線に外挿し
て、検体中のＰＬＧ量を測定した。

【００５０】３）ＳＲＩＤ法によるＰＬＧ量の測定 上記２）で測定したすべての検体について、上記ＳＲＩ
Ｄ法を用いて、検体中のＰＬＧ量を測定した。 ４）市販のラテックス凝集免疫試薬によるＰＬＧ量の測
定 上記２）で測定したすべての検体について、上記市販の
ラテックス凝集免疫試薬（エルピアエースＰＬＧ、ダイ
アヤトロン社製）を用いて検体中のＰＬＧ量を測定し
た。方法は、キット添付の操作法に従い、専用機である
エルピア１００を用いて行った。

【００５１】（３）試験と結果 ［実施例１〜４０］血栓既往症を有する患者及び健常人
の血清を検体として、上記（２）の２）ラテックス試薬
によるＰＬＧ量の測定に従って、検体中のＰＬＧ量を測
定した。また、上記（２）の３）ＳＲＩＤ法によるＰＬ
Ｇ量の測定に従って、検体中のＰＬＧ量を測定し、結果
を表１に示した。また、表１に示したラテックス試薬に
よるＰＬＧ量とＳＲＩＤ法によるＰＬＧ量との相関を図
１に示した。

【００５２】

【表１】

【００５３】［比較例１〜４０］血栓既往症を有する患
者及び健常人の血清を検体として、上記（２）の４）市
販のラテックス凝集免疫試薬によるＰＬＧ量の測定に従
って、検体中のＰＬＧ量を測定し、結果を表１に示し
た。また、表１に示したラテックス試薬によるＰＬＧ量
とＳＲＩＤ法によるＰＬＧ量との相関を図２に示した。

【００５４】表１及び図１・２から明らかなように、本
発明の免疫測定法によって測定されたＰＬＧ量は、ＳＲ
ＩＤ法によるＰＬＧ量と、低濃度域においても高濃度域
においてもよく一致したが、市販のラテックス凝集免疫
試薬によるＰＬＧ量は、ＳＲＩＤ法によるＰＬＧ量と、
低濃度域及び高濃度域において、必ずしも一致しなかっ
た。以上の結果から、本発明によるＰＬＧ測定法は、従
来のラテックス凝集免疫試薬による測定法よりも高感度
で、かつ、ＳＲＩＤ法よりも迅速、簡便な優れた定量法
であることが確認された。

【００５５】（Ｂ）ヒトアルファ２−プラスミンインヒ
ビター測定法 （１）試薬及び材料 ａ）ラテックス 平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０重量％、積水化学工業社製）を用いた。 ｂ）ラテックス希釈用緩衝液 ５０ｍＭのＮａ₂ ＨＰＯ₄ と、５０ｍＭのＮａＨ₂ ＰＯ
₄ とを、ｐＨ７．５０になるように混合したものを用い
た。 ｃ）抗α₂ −ＰＩ抗体 ヤギの抗血清からイムノグロブリン分画にまで精製した
ヤギ抗α₂ −ＰＩ抗体（１ｍｇ／ｍｌ、ＤＡＫＯ社製）
を用いた。

【００５６】ｄ）抗体希釈用緩衝液 上記ラテックス希釈用緩衝液を、抗体希釈用緩衝液とし
て用いた。 ｅ）ブロッキング用緩衝液 １００ｍＭのＮａ₂ ＨＰＯ₄ と、１００ｍＭのＮａＨ₂
ＰＯ₄ とを、ｐＨ７．４０になるように混合し、ウシ血
清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍ
ｉｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｇｒａｄ
ｅ、ＭｉｌｅｓＣｏｒｐ．社製）を１重量％になるよう
に、また、ＮａＮ₃ （試薬特級、ナカライテスク社製）
を０．１重量％になるように添加したものを用いた。

【００５７】ｆ）血漿検体 血栓既往症を有する患者及び健常人の血漿を用いた。 ｇ）α₂ −ＰＩ標準ヒト血漿 ヒトプール血漿から調製された血液項目用標準血漿（イ
アトロセーラ；ダイアヤトロン製）をエルピアα₂ −Ｐ
Ｉ（ダイアヤトロン製）を用いてα₂ −ＰＩ量を測定
し、生理食塩水で約５・２．５・１．２５・０．６２５
ｎｇ／ｍＬにそれぞれ希釈して使用した。また、血液項
目用標準血漿を含まない、生理食塩水のみのものを０ｎ
ｇ／ｍＬとした。

【００５８】ｈ）検体希釈用液（Ｒ１液） ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール６０
００（数平均分子量７５００、和光純薬工業社製）を３
重量％、及び、抗ＩｇＭ抗体２００μｇ／ｍｌ、Ｔｒｉ
ｔｏｎＷＲ−１３３９（ナカライテスク社）を２０ｐｐ
ｍになるように添加したものを用いた。 ｉ）従来のα₂ −ＰＩ測定用ラテックス凝集免疫試薬 市販のラテックス凝集免疫試薬（エルピアエースα₂ −
ＰＩ、ダイアヤトロン製）を用いた。

【００５９】（２）方法 １）ラテックス試薬の調製 平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０重量％）１容に、ラテックス希釈用緩衝液３容
を添加希釈し、２．５重量％ラテックス液とした。抗α
₂ −ＰＩ抗体は、タンパク濃度が６６．７μｇ／ｍｌに
なるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作抗体液とし
た。２．５重量％ラテックス液２００μ１を２５℃のイ
ンキュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しな
がら、抗体感作液８００μｌを素早く添加し、２５℃に
て１時間攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液を
２．０ｍｌ添加し、２５℃にて続けて２時間攪拌した。
その後、１５℃、１５０００ｒｐｍにて１５分間遠心分
離した。得られた沈殿にブロッキング用緩衝液４．０ｍ
ｌを添加し、同様に遠心分離することにより、沈殿を洗
浄した。洗浄操作は３回行った。この沈殿にブロッキン
グ用緩衝液を２．０ｍｌ添加し、よく攪拌した後、超音
波破砕機にて分散処理を行い、固形分０．２５重量％の
ラテックス試薬とした。このようにして調製したラテッ
クス試薬は４℃にて保存した。

【００６０】２）ラテックス試薬によるα₂ −ＰＩ量の
測定 ラテックス試薬によるα₂ −ＰＩ量の測定は、生化学用
自動分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行
った。上記１）で得られた固形分０．２５重量％のラテ
ックス試薬をそのままＲ２液（固形分０．２５重量％）
とした。測定条件は以下の通りである。

【００６１】 検体容量 ３μｌ 検体希釈液（Ｒ１液） ３００μｌ 試薬（Ｒ２液） １００μｌ 測定波長 ５７０ｎｍ 測定温度 ３７℃

【００６２】試薬（Ｒ２液）を添加してから約８０秒後
の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７０）
を測定し、この吸光度の差を１００００倍したものを吸
光度変化量とした。検体の代わりに既知濃度の血液項目
用標準血清で同様の測定を行って、予め検量線を作成し
ておき、上記検体の吸光度変化量を上記検量線に外挿し
て、検体中のα2 −ＰＩ量を測定した。

【００６３】３）ＥＩＡ法によるα₂ −ＰＩ量の測定 上記２）で測定したすべての検体について、市販のＥＩ
Ａ試薬（帝人社製）を用いて、検体中のα₂ −ＰＩ量を
測定した。方法は、キット添付の操作法に従って行っ
た。 ４）市販のラテックス凝集免疫試薬によるα₂ −ＰＩ量
の測定 上記２）で測定したすべての検体について、市販のラテ
ックス凝集免疫試薬（エルピアエースα₂ −ＰＩ、ダイ
アヤトロン社製）を用いて検体中のα₂ −ＰＩ量を測定
した。方法は、キット添付の操作法に従い、専用機であ
るエルピア１００を用いて行った。

【００６４】（３）試験と結果 ［実施例１〜４０］血栓既往症を有する患者及び健常人
の血清を検体として、上記（２）の２）ラテックス試薬
によるα₂ −ＰＩ量の測定に従って、検体中のα₂ −Ｐ
Ｉ量を測定した。また、上記（２）の３）ＥＩＡ法によ
るα₂ −ＰＩ量の測定に従って、検体中のα₂ −ＰＩ量
を測定し、結果を表２に示した。また、表２に示したラ
テックス試薬によるα₂ −ＰＩ量とＥＩＡ法によるα₂
−ＰＩ量との相関を図３に示した。

【００６５】

【表２】

【００６６】［比較例１〜４０］血栓既往症を有する患
者及び健常人の血清を検体として、上記（２）の４）市
販のラテックス凝集免疫試薬によるα₂ −ＰＩ量の測定
に従って、検体中のα₂−ＰＩ量を測定し、結果を表２
に示した。また、表２に示したラテックス試薬によるα
₂ −ＰＩ量とＥＩＡ法によるα₂ −ＰＩ量との相関を図
４に示した。

【００６７】表２及び図３・４から明らかなように、本
発明の免疫測定法によって測定されたα₂ −ＰＩ量は、
ＥＩＡ法によるα₂ −ＰＩ量と、低濃度域においても高
濃度域においてもよく一致したが、市販のラテックス凝
集免疫試薬によるα₂ −ＰＩ量は、ＥＩＡ法によるα₂
−ＰＩ量と、低濃度域及び高濃度域において、必ずしも
一致しなかった。以上の結果から、本発明によるα₂ −
ＰＩ測定法は、従来のラテックス凝集免疫試薬による測
定法よりも高感度で、かつ、ＥＩＡ法よりも迅速、簡便
な優れた定量法であることが確認された。

【００６８】（Ｃ）アンチトロンビンIII 測定法 （１）試薬及び材料 ａ）ラテックス 平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０重量％、積水化学工業社製）を用いた。 ｂ）ラテックス希釈用緩衝液 ５０ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 と、５０ｍＭのＮａＨ2 ＰＯ
4 とを、ｐＨ７．５０になるように混合したものを用い
た。 ｃ）抗ＡＴIII 抗体 ヤギの抗血清からイムノグロブリン分画にまで精製した
ヤギ抗ＡＴIII 抗体（１ｍｇ／ｍｌ、ＡＴＡＢ社製）を
用いた。

【００６９】ｄ）抗体希釈用緩衝液 上記ラテックス希釈用緩衝液を、抗体希釈用緩衝液とし
て用いた。 ｅ）ブロッキング用緩衝液 １００ｍＭのＮａ₂ ＨＰＯ₄ と、１００ｍＭのＮａＨ₂
ＰＯ₄ とを、ｐＨ７．４０になるように混合し、ウシ血
清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍ
ｉｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｇｒａｄ
ｅ、ＭｉｌｅｓＣｏｒｐ．社製）を１重量％になるよう
に、また、ＮａＮ3 （試薬特級、ナカライテスク社製）
を０．１重量％になるように添加したものを用いた。

【００７０】ｆ）血清検体 血栓既往症を有する患者及び健常人の血清を用いた。 ｇ）ＡＴIII 標準ヒト血清 ヒトプール血清から調製された血液項目用標準血清（イ
アトロセーラ；ダイアヤトロン製）をエルピアエースＡ
ＴIII （ダイアヤトロン製）を用いてＡＴIII量を測定
し、生理食塩水で約２０・１０・５・２．５ｎｇ／ｍｌ
にそれぞれ希釈して使用した。また、血液項目用標準血
清を含まない、生理食塩水のみのものを０ｎｇ／ｍｌと
した。

【００７１】ｈ）検体希釈用液（Ｒ１液） ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール６０
００（数平均分子量７５００、和光純薬工業社製）を３
重量％、及び、抗ＩｇＭ抗体１２０μｇ／ｍｌになるよ
うに添加したものを用いた。 ｉ）ＳＲＩＤ法 市販のアガロース培地を用いて、精製ＡＴIII （ＡＤＩ
社）により検量線を作成し、検体中のＡＴIII の定量を
行った。抗体としては、ヤギポリクローナル抗体（ＡＴ
ＡＢ社）を用いた。 ｊ）従来のＡＴIII 測定用ラテックス凝集免疫試薬 市販のラテックス凝集免疫試薬（エルピアエースＡＴII
I 、ダイアヤトロン社製）を用いた。

【００７２】（２）方法 １）ラテックス試薬の調製 平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０重量％）１容に、ラテックス希釈用緩衝液３容
を添加希釈し、２．５重量％ラテックス液とした。抗Ａ
ＴIII 抗体は、タンパク濃度が６６．７μｇ／ｍｌにな
るように抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作抗体液とし
た。２．５重量％ラテックス液２００μ１を２５℃のイ
ンキュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しな
がら、抗体感作液８００μｌを素早く添加し、２５℃に
て１時間攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液を
２．０ｍｌ添加し、２５℃にて続けて２時間攪拌した。
その後、１５℃、１５０００ｒｐｍにて１５分間遠心分
離した。得られた沈殿にブロッキング用緩衝液４．０ｍ
ｌを添加し、同様に遠心分離することにより、沈殿を洗
浄した。洗浄操作は３回行った。この沈殿にブロッキン
グ用緩衝液を２．０ｍｌ添加し、よく攪拌した後、超音
波破砕機にて分散処理を行い、固形分０．２５重量％の
ラテックス試薬とした。このようにして調製したラテッ
クス試薬は４℃にて保存した。

【００７３】２）ラテックス試薬によるＡＴIII 量の測
定 ラテックス試薬によるＡＴIII 量の測定は、生化学用自
動分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行っ
た。上記１）で得られた固形分０．２５重量％のラテッ
クス試薬をそのままＲ２液（固形分０．２５重量％）と
した。測定条件は以下の通りである。

【００７４】 検体容量 ３μｌ 検体希釈液（Ｒ１液） ３００μｌ 試薬（Ｒ２液） １００μｌ 測定波長 ５７０ｎｍ 測定温度 ３７℃

【００７５】試薬（Ｒ２液）を添加してから約８０秒後
の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７０）
を測定し、この吸光度の差を１００００倍したものを吸
光度変化量とした。検体の代わりに既知濃度の血液項目
用標準血清で同様の測定を行って、予め検量線を作成し
ておき、上記検体の吸光度変化量を上記検量線に外挿し
て、検体中のＡＴIII 量を測定した。

【００７６】３）ＳＲＩＤ法によるＡＴIII 量の測定 上記２）で測定したすべての検体について、ＳＲＩＤ法
を用いて、検体中のＡＴIII 量を測定した。 ４）市販のラテックス凝集免疫試薬によるＡＴIII 量の
測定 上記２）で測定したすべての検体について、市販のラテ
ックス凝集免疫試薬（エルピアエースＡＴIII 、ダイア
ヤトロン社製）を用いて検体中のＡＴIII 量を測定し
た。方法は、キット添付の操作法に従い、専用機である
エルピア１００を用いて行った。

【００７７】（３）試験と結果 ［実施例１〜４０］血栓既往症を有する患者及び健常人
の血清を検体として、上記（２）の２）ラテックス試薬
によるＡＴIII 量の測定に従って、検体中のＡＴIII 量
を測定した。また、上記（２）の３）ＳＲＩＤ法による
ＡＴIII 量の測定に従って、検体中のＡＴIII 量を測定
し、結果を表３に示した。また、表３に示したラテック
ス試薬によるＡＴIII 量とＳＲＩＤ法によるＡＴIII 量
との相関を図５に示した。

【００７８】

【表３】

【００７９】［比較例１〜４０］血栓既往症を有する患
者及び健常人の血清を検体として、上記（２）の４）市
販のラテックス凝集免疫試薬によるＡＴIII 量の測定に
従って、検体中のＡＴIII 量を測定し、結果を表３に示
した。また、表３に示したラテックス試薬によるＡＴII
I 量とＳＲＩＤ法によるＡＴIII 量との相関を図６に示
した。

【００８０】表３及び図５・６から明らかなように、本
発明の免疫測定法によって測定されたＡＴIII 量は、Ｓ
ＲＩＤ法によるＡＴIII 量と、低濃度域においても高濃
度域においてもよく一致したが、市販のラテックス凝集
免疫試薬によるＡＴIII 量は、ＳＲＩＤ法によるＡＴII
I 量と、低濃度域及び高濃度域において、必ずしも一致
しなかった。以上の結果から、本発明によるＡＴIII 測
定法は、従来のラテックス凝集免疫試薬による測定法よ
りも高感度で、かつ、ＳＲＩＤ法よりも迅速、簡便な優
れた定量法であることが確認された。

【００８１】（Ｄ）ＨＢｓ抗原測定法 ［実施例１］ （１）試薬の調製 １）抗ＨＢｓ抗体感作ラテックス液の調製 抗ＨＢｓウサギ抗体を１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．０
３６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．６、０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ）（以下ＰＢＳという）に溶解した液１．２５ｍｌ
に、平均粒径０．３μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０重量％、積水化学工業（株）社製）１ｍｌを添
加し、３０℃で６０分間攪拌した。 ついで、この液にウ
シ血清アルブミン（以下ＢＳＡという）を１重量％含有
するＰＢＳを添加し、 ３０℃にて６０分間攪拌した後、
４℃にて２０分間、 １８，０００ｒｐｍで遠心分離する
ことにより洗浄した。 洗浄操作は、３回行った。 得られ
た沈殿物にＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳ１００ｍｌ
を添加し、 ラテックスを懸濁した後、 超音波破砕機にて
分散処理を行い、 固形分０．１％（ｗ／ｖ）の抗ＨＢｓ
抗体感作ラテックス液を調製した。

【００８２】２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量１，２
００，０００のポリビニルピロリドン（Ｌｕｖｉｓｋｏ
ｌ Ｋ−９０、ＢＡＳＦ社製）を１．８重量％、抗Ｉｇ
Ｍを１０μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。 ３）ＨＢｓ抗原測定試薬 本実施例のＨＢｓ抗原測定試薬は、上記１）項の抗ＨＢ
ｓ抗体感作ラテックス液からなる第１試薬と、 上記２）
項の検体希釈液からなる第２試薬とから構成される２液
系の試薬である。 ４）標準ＨＢｓ抗原液 ＨＢｓ抗原を、 ０・５０・１００・３００・５００ＩＵ
／ｍｌ濃度で含むヒト血清を標準品として使用した。

【００８３】（２）測定 １）方法 検体２０μｌと上記（１）２）項の検体希釈液１５０μ
ｌを混合し、 ３７℃で適時保存した後、 上記（１）１）
項の抗ＨＢｓ抗体感作ラテックス液１５０μｌを添加攪
拌した。 この後、１分後及び５分後の波長７５０ｎｍで
の吸光度を測定し、 この差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）
とした。測定は日立自動分析装置７１５０型を使用し
た。検体中のＨＢｓ抗原量は、標準ＨＢｓ抗原液を測定
して、 予め検量線を作成しておき、 検体の吸光度変化量
を上記検量線に外挿することにより求めた。 ２）検体の測定 ＨＢｓ抗原陽性の血清及び陰性の血清を検体として、上
記測定方法に従って、ＨＢｓ抗原量を測定した。 なお、
全ての検体において、市販のＥＩＡ法によるＨＢｓ抗原
測定キット（エンザイグノスト ＨＢｓＡｇ ｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌ、デイドベーリング（株）製）を用いてＨ
Ｂｓ抗原を測定した。 測定方法は、 キットの添付文書に
従って行った。

【００８４】［実施例２］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量９０
０，０００のポリビニルピロリドン（Ｌｕｖｉｓｋｏｌ
Ｋ−６０、ＢＡＳＦ社製）を２．０重量％、抗ＩｇＭ
抗体を１００μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。

【００８５】［実施例３］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量２０
０，０００のプルラン（ＰＩ−２０ 林原商事社製）を
２．０重量％、抗ＩｇＭ抗体を３０μｇ／ｍｌの濃度に
なるように溶解した。

【００８６】［実施例４］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、数平均分子量５０
０，０００のポリエチレングリコール（和光純薬工業社
製）を１．０重量％、抗ＩｇＭ抗体を８００μｇ／ｍｌ
の濃度になるように溶解した。

【００８７】［比較例１］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量１，２
００，０００のポリビニルピロリドン（Ｌｕｖｉｓｋｏ
ｌ Ｋ−９０、ＢＡＳＦ社製）を１．８重量％の濃度に
なるように溶解した。

【００８８】［比較例２］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量２０
０，０００のプルラン（ＰＩ−２０ 林原商事社製）を
２．０重量％の濃度になるように溶解した。

【００８９】［比較例３］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、数平均分子量５０
０，０００のポリエチレングリコール（和光純薬工業社
製）を１．０重量％の濃度になるように溶解した。

【００９０】［結果］実施例１〜４の測定結果を表４
に、比較例１〜３の測定結果を表５に示した。表４・５
から明らかなように、 実施例における測定値は、 ＥＩＡ
法における測定値とよく一致したが、 比較例における測
定値は、 いくつかの検体において乖離が見られた。 この
ことより、比較例では、非特異凝集反応が起こっている
ことが示唆された。

【００９１】

【表４】

【００９２】

【表５】

【００９３】（Ｅ）ＨＢｓ抗体測定法 ［実施例１］ （１）試薬の調製 １）ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の調製 ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で１０ｍＭトリス
塩緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した液１．０ｍｌに、平
均粒径０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１
０重量％、積水化学工業（株）社製）０．５ｍｌと０．
０３６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．６、０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ）を添加し、３０℃で６０分間攪拌した。 ついで、こ
の液にウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡという）を１重
量％含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、
０．１Ｍ ＮａＣｌ）（以下、 ＰＢＳという）を添加
し、 ３０℃にて６０分間攪拌した後、 ４℃にて２０分
間、 １８，０００ｒｐｍで遠心分離することにより洗浄
した。 洗浄操作は、３回行った。得られた沈殿物にＢＳ
Ａを１重量％含有するＰＢＳ５０ｍｌを添加し、 ラテッ
クスを懸濁した後、 超音波破砕機にて分散処理を行い、
固形分０．１％（ｗ／ｖ）のＨＢｓ抗原感作ラテックス
液を調製した。

【００９４】２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量１，２
００，０００のポリビニルピロリドン（Ｌｕｖｉｓｋｏ
ｌ Ｋ−９０、ＢＡＳＦ社製）を１．８重量％、抗Ｉｇ
Ｍを１０μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。 ３）抗ＨＢｓ抗体測定試薬 本実施例の抗ＨＢｓ抗体測定試薬は、上記１）項のＨＢ
ｓ抗原感作ラテックス液からなる第１試薬と、 上記２）
項の検体希釈液からなる第２試薬とから構成される２液
系の試薬である。 ４）標準ＨＢｓ抗体液 ＨＢｓ抗体を、 ０・１５０・３００・６００・１２００
ｍＩＵ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を標準品として使用し
た。

【００９５】（２）測定 １）方法 検体２０μｌと上記（１）２）項の検体希釈液１２０μ
ｌを混合し、 ３７℃で適時保存した後、 上記（１）１）
項のＨＢｓ抗原感作ラテックス液１２０μｌを添加攪拌
した。 この後、１分後及び５分後の波長７５０ｎｍでの
吸光度を測定し、 この差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）と
した。測定は日立自動分析装置７１５０型を使用した。 検体中のＨＢｓ抗体量は、標準ＨＢｓ抗体液を測定し
て、 予め検量線を作成しておき、 検体の吸光度変化量を
上記検量線に外挿することにより求めた。 ２）検体の測定 ＨＢｓ抗体陽性の血清及び陰性の血清を検体として、上
記測定方法に従って、ＨＢｓ抗体量を測定した。 なお、
全ての検体において、市販のＥＩＡ法によるＨＢｓ抗体
測定キット（エンザイグノスト ａｎｔｉ−ＨＢｓ ｍ
ｉｃｒｏ、ヘキストジャパン（株）製）を用いてＨＢｓ
抗体を測定した。 測定方法は、 キットの添付文書に従っ
て行った。

【００９６】［実施例２］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量９０
０，０００のポリビニルピロリドン（Ｌｕｖｉｓｋｏｌ
Ｋ−６０、ＢＡＳＦ社製）を２．０重量％、抗ＩｇＭ
抗体を５０μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。

【００９７】［実施例３］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量２０
０，０００のプルラン（ＰＩ−２０ 林原商事社製）を
２．０重量％、抗ＩｇＭ抗体を７００μｇ／ｍｌの濃度
になるように溶解した。

【００９８】［実施例４］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量５０
０，０００のポリエチレングリコール（和光純薬工業社
製）を１．０重量％、抗ＩｇＭ抗体を１０μｇ／ｍｌの
濃度になるように溶解した。

【００９９】［比較例１］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量１，２
００，０００のポリビニルピロリドン（Ｌｕｖｉｓｋｏ
ｌ Ｋ−９０、ＢＡＳＦ社製）を１．８重量％の濃度に
なるように溶解した。

【０１００】［比較例２］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量２０
０，０００のプルラン（ＰＩ−２０ 林原商事社製）を
２．０重量％の濃度になるように溶解した。

【０１０１】［比較例３］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量５０
０，０００のポリエチレングリコール（和光純薬工業社
製）を１．０重量％の濃度になるように溶解した。

【０１０２】［結果］実施例１〜４の測定結果を表６
に、比較例１〜３の測定結果を表７に示した。表６・７
から明らかなように、 ＨＢｓ抗体陰性検体中の数例で、
実施例１〜４においては陰性判定されているにもかかわ
らず、比較例１〜３においては陽性と判定され、 非特異
凝集反応が起こっていることが示唆された。

【０１０３】

【表６】

【０１０４】

【表７】

【０１０５】（Ｆ）フェリチン測定法 ［実施例１］ （１）試薬の調製 １）抗ヒト胎盤フェリチン抗体感作ラテックス液の調製 抗ヒト胎盤フェリチン抗体を１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で
０．０３６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．６、０．１Ｍ Ｎ
ａＣｌ）（以下ＰＢＳという）に溶解した液１．２５ｍ
ｌに、平均粒径０．３μｍのポリスチレンラテックス
（固形分１０重量％、積水化学工業（株）社製）１ｍｌ
を添加し、３０℃で６０分間攪拌した。 ついで、この液
にウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡという）を１重量％
含有するＰＢＳを添加し、 ３０℃にて６０分間攪拌した
後、 ４℃にて２０分間、 １８，０００ｒｐｍで遠心分離
することにより洗浄した。 洗浄操作は、３回行った。 得
られた沈殿物にＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳ１００
ｍｌを添加し、 ラテックスを懸濁した後、 超音波破砕機
にて分散処理を行い、 固形分０．１％（ｗ／ｖ）の抗フ
ェリチン抗体感作ラテックス液を調製した。

【０１０６】２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量１，２
００，０００のポリビニルピロリドン（Ｌｕｖｉｓｋｏ
ｌ Ｋ−９０、ＢＡＳＦ社製）を１．８重量％、抗Ｉｇ
Ｍを１０μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。 ３）抗フェリチン測定試薬 本実施例の抗フェリチン測定試薬は、上記１）項の抗フ
ェリチン抗体感作ラテックス液からなる第１試薬と、 上
記２）項の検体希釈液からなる第２試薬とから構成され
る２液系の試薬である。 ４）標準フェリチン液 フェリチンを、 ０・２５・５０・１００・３００・６０
０ｍＩＵ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を標準品として使用
した。

【０１０７】（２）測定 １）方法 検体２０μｌと上記（１）２）項の検体希釈液１２０μ
ｌを混合し、 ３７℃で適時保存した後、 上記（１）１）
項の抗フェリチン抗体感作ラテックス液１２０μｌを添
加攪拌した。 この後、１分後及び５分後の波長７５０ｎ
ｍでの吸光度を測定し、 この差を吸光度変化量（ΔＡｂ
ｓ）とした。測定は日立自動分析装置７１５０型を使用
した。検体中のフェリチン量は、標準フェリチン液を測
定して、 予め検量線を作成しておき、 検体の吸光度変化
量を上記検量線に外挿することにより求めた。 ２）検体の測定 フェリチン陽性の血清及び陰性の血清を検体として、上
記測定方法に従って、フェリチン量を測定した。 なお、
全ての検体において、市販のＥＩＡ法によるフェリチン
測定キット（エルジア・Ｆ−フェリチン、国際試薬
（株）製）を用いてフェリチンを測定した。 測定方法
は、 キットの添付文書に従って行った。

【０１０８】［実施例２］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量９０
０，０００のポリビニルピロリドン（Ｌｕｖｉｓｋｏｌ
Ｋ−６０、ＢＡＳＦ社製）を２．０重量％、抗ＩｇＭ
抗体を１００μｇ／ｍｌの濃度になるように溶解した。

【０１０９】［実施例３］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量２０
０，０００のプルラン（ＰＩ−２０ 林原商事社製）を
２．０重量％、抗ＩｇＭ抗体を３０μｇ／ｍｌの濃度に
なるように溶解した。

【０１１０】［実施例４］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量５０
０，０００のポリエチレングリコール（和光純薬工業社
製）を１．０重量％、抗ＩｇＭ抗体を８００μｇ／ｍｌ
の濃度になるように溶解した。

【０１１１】［比較例１］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量１，２
００，０００のポリビニルピロリドン（Ｌｕｖｉｓｋｏ
ｌ Ｋ−９０、ＢＡＳＦ社製）を１．８重量％の濃度に
なるように溶解した。

【０１１２】［比較例２］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量２０
０，０００のプルラン（ＰＩ−２０ 林原商事社製）を
２．０重量％の濃度になるように溶解した。

【０１１３】［比較例３］実施例１の（１）２）検体希
釈液の調製を以下のように行った以外は、 実施例１と同
様に行った。 （１）２）検体希釈液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量５０
０，０００のポリエチレングリコール（和光純薬工業社
製）を１．０重量％の濃度になるように溶解した。

【０１１４】［結果］実施例１〜４及び比較例１〜３の
測定結果を表８に示した。 また、実施例１〜４、比較例
１〜３のラテックス試薬による測定値とＥＩＡ法による
測定値との相関をそれぞれ図１〜７に示した。表８及び
図１〜７から明らかなように、 実施例における測定値
は、 ＥＩＡ法における測定値とよく一致したが、 比較例
における測定値は、 いくつかの検体において乖離が見ら
れた。 このことより、比較例では、非特異凝集反応が起
こっていることが示唆された。

【０１１５】

【表８】

【０１１６】（Ｇ）ヒトアルファ−フェトプロテイン測
定法 （１）試薬及び材料 ａ）ラテックス 平均粒径０．４０３μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０重量％、積水化学工業社製）を用いた。 ｂ）ラテックス希釈用緩衝液 ５０ｍＭのＮａ₂ ＨＰＯ₄ と、５０ｍＭのＮａＨ₂ ＰＯ
₄ とを、ｐＨ７．５０になるように混合したものを用い
た。 ｃ）抗ＡＦＰ抗体 ヤギの抗血清からイムノグロブリン分画にまで精製した
ヤギ抗ＡＦＰ抗体（１ｍｇ／ｍｌ、ＡＴＡＢ社製）を用
いた。

【０１１７】ｄ）抗体希釈用緩衝液 上記ラテックス希釈用緩衝液を、抗体希釈用緩衝液とし
て用いた。 ｅ）ブロッキング用緩衝液 １００ｍＭのＮａ₂ ＨＰＯ₄ と、１００ｍＭのＮａＨ₂
ＰＯ₄ とを、ｐＨ７．４０になるように混合し、ウシ血
清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍ
ｉｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｇｒａｄ
ｅ、ＭｉｌｅｓＣｏｒｐ．社製）を１重量％になるよう
に、また、ＮａＮ₃ （試薬特級、ナカライテスク社製）
を０．１重量％になるように添加したものを用いた。

【０１１８】ｆ）血清検体 肝細胞癌を有する患者及び健常人の血清を用いた。 ｇ）ＡＦＰ標準ヒト血清 ヒトプール血清にヒトアルファプロテインを正確に１０
０ｍｇ／ｄＬとなるように添加したものを凍結乾燥し、
エルピアエースＡＦＰ（ダイアヤトロン製）を用いてＡ
ＦＰ量を測定し、生理食塩水で約２００・５０・１０ｎ
ｇ／ｍＬにそれぞれ希釈して使用した。また、血液項目
用標準血漿を含まない、生理食塩水のみのものを０ｎｇ
／ｍＬとした。

【０１１９】ｈ）検体希釈用液（Ｒ１液） ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール６０
００（数平均分子量７５００、和光純薬工業社製）を３
重量％、及び、抗ＩｇＭ抗体１５０μｇ／ｍｌになるよ
うに添加したものを用いた。 ｉ）従来のＡＦＰ測定用ラテックス凝集免疫試薬 市販のラテックス凝集免疫試薬（エルピアエースＡＦ
Ｐ、ダイアヤトロン製）を用いた。

【０１２０】（２）方法 １）ラテックス試薬の調製 平均粒径０．４０３μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０重量％）１容に、ラテックス希釈用緩衝液３容
を添加希釈し、２．５重量％ラテックス液とした。抗Ａ
ＦＰ抗体は、タンパク濃度が６６．７μｇ／ｍｌになる
ように抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作抗体液とした。
２．５重量％ラテックス液２００μ１を２５℃のインキ
ュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しなが
ら、抗体感作液８００μｌを素早く添加し、２５℃にて
１時間攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液を２．
０ｍｌ添加し、２５℃にて続けて２時間攪拌した。その
後、１５℃、１５０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離し
た。得られた沈殿にブロッキング用緩衝液４．０ｍｌを
添加し、同様に遠心分離することにより、沈殿を洗浄し
た。洗浄操作は３回行った。この沈殿にブロッキング用
緩衝液を２．０ｍｌ添加し、よく攪拌した後、超音波破
砕機にて分散処理を行い、固形分０．２５重量％のラテ
ックス試薬とした。このようにして調製したラテックス
試薬は４℃にて保存した。

【０１２１】２）ラテックス試薬によるＡＦＰ量の測定 ラテックス試薬によるＡＦＰ量の測定は、生化学用自動
分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行っ
た。上記１）で得られた固形分０．２５重量％のラテッ
クス試薬をそのままＲ２液（固形分０．２５重量％）と
した。測定条件は以下の通りである。

【０１２２】 検体容量 ２０μｌ 検体希釈液（Ｒ１液） ２１０μｌ 試薬（Ｒ２液） ７０μｌ 測定波長 ５７０ｎｍ 測定温度 ３７℃

【０１２３】試薬（Ｒ２液）を添加してから約８０秒後
の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７０）
を測定し、この吸光度の差を１００００倍したものを吸
光度変化量とした。検体の代わりに既知濃度の血液項目
用標準血清で同様の測定を行って、予め検量線を作成し
ておき、上記検体の吸光度変化量を上記検量線に外挿し
て、検体中のＡＦＰ量を測定した。

【０１２４】３）ＥＩＡ法によるＡＦＰ量の測定 上記２）で測定したすべての検体について、市販のＥＩ
Ａ試薬（帝人社製）を用いて、検体中のＡＦＰ量を測定
した。方法は、キット添付の操作法に従って行った。

【０１２５】（３）試験と結果 ［実施例１〜４０］血栓既往症を有する患者及び健常人
の血清を検体として、上記（２）の２）ラテックス試薬
によるＡＦＰ量の測定に従って、検体中のＡＦＰ量を測
定した。また、上記（２）の３）ＥＩＡ法によるＡＦＰ
量の測定に従って、検体中のＡＦＰ量を測定し、結果を
表９に示した。また、表９に示したラテックス試薬によ
るＡＦＰ量とＥＩＡ法によるＡＦＰ量との相関を図１４
に示した。

【０１２６】

【表９】

【０１２７】［比較例１〜４０］肝細胞癌を有する患者
及び健常人の血清を検体として、上記（２）の４）市販
のラテックス凝集免疫試薬によるＡＦＰ量の測定に従っ
て、検体中のＡＦＰ量を測定し、結果を表９に示した。
また、表９に示したラテックス試薬によるＡＦＰ量とＥ
ＩＡ法によるＡＦＰ量との相関を図１５に示した。

【０１２８】表９及び図１４・１５から明らかなよう
に、本発明の免疫測定法によって測定されたＡＦＰ量
は、ＥＩＡ法によるＡＦＰ量と、低濃度域においても高
濃度域においてもよく一致したが、市販のラテックス凝
集免疫試薬によるＡＦＰ量は、ＥＩＡ法によるＡＦＰ量
と、低濃度域及び高濃度域において、必ずしも一致しな
かった。以上の結果から、本発明によるＡＦＰ測定法
は、従来のラテックス凝集免疫試薬による測定法よりも
高感度で、かつ、ＥＩＡ法よりも迅速、簡便な優れた定
量法であることが確認された。

【発明の効果】本発明の免疫測定法は、上述の構成から
なるので、従来のラテックス凝集法で見られたような検
体中の共存物質による非特異的反応を抑制し、かつ低濃
度域でもＳＲＩＤ法やＥＩＡ法と同様の検出感度を示
す。また、この免疫測定法を利用することにより、迅速
かつ簡便に測定対象物質を正確に定量することが可能と
なり、疾患の発見、病態の把握、治療方法の決定等に有
効に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 （Ａ）本発明のラテックス試薬によるＰＬＧ
量とＳＲＩＤ法によるＰＬＧ量との相関を示した図

【図２】 （Ａ）従来のラテックス試薬によるＰＬＧ量
とＳＲＩＤ法によるＰＬＧ量との相関を示した図

【図３】 （Ｂ）本発明のラテックス試薬によるα2 −
ＰＩ量とＥＩＡ法によるα2 −ＰＩ量との相関を示した
図

【図４】 （Ｂ）従来のラテックス試薬によるα2 −Ｐ
Ｉ量とＥＩＡ法によるα2 −ＰＩ量との相関を示した図

【図５】 （Ｃ）本発明のラテックス試薬によるＡＴII
I 量とＳＲＩＤ法によるＡＴIII 量との相関を示した図

【図６】 （Ｃ）従来のラテックス試薬によるＡＴIII
量とＳＲＩＤ法によるＡＴIII 量との相関を示した図

【図７】 （Ｆ）実施例１のラテックス試薬によるフェ
リチン量とＥＩＡ法によるフェリチン量との相関を示し
た図

【図８】 （Ｆ）実施例２のラテックス試薬によるフェ
リチン量とＥＩＡ法によるフェリチン量との相関を示し
た図

【図９】 （Ｆ）実施例３のラテックス試薬によるフェ
リチン量とＥＩＡ法によるフェリチン量との相関を示し
た図

【図１０】（Ｆ）実施例４のラテックス試薬によるフェ
リチン量とＥＩＡ法によるフェリチン量との相関を示し
た図

【図１１】（Ｆ）比較例１のラテックス試薬によるフェ
リチン量とＥＩＡ法によるフェリチン量との相関を示し
た図

【図１２】（Ｆ）比較例２のラテックス試薬によるフェ
リチン量とＥＩＡ法によるフェリチン量との相関を示し
た図

【図１３】（Ｆ）比較例３のラテックス試薬によるフェ
リチン量とＥＩＡ法によるフェリチン量との相関を示し
た図

【図１４】（Ｇ）本発明のラテックス試薬によるＡＦＰ
量とＥＩＡ法によるＡＦＰ量との相関を示した図

【図１５】（Ｇ）従来のラテックス試薬によるＡＦＰ量
とＥＩＡ法によるＡＦＰ量との相関を示した図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の測定対象物質を定量するにあた
   り、測定対象物質に対する抗体又は抗原を感作した不溶
   性担体と上記試料を溶液中で混合して抗原抗体反応によ
   る凝集反応を生じさせ、該凝集反応に基づく吸光度変化
   量を測定して検量線と照合することよりなる免疫測定法
   であって、 上記不溶性担体としてラテックス粒子を用い、 上記溶液中に、水溶性高分子からなる増感剤及び抗免疫
   グロブリンＭ抗体が含有され、 上記凝集反応は、恒温において、５秒〜３０分間行うも
   のであり、 上記吸光度変化量は、凝集反応の進行に伴う吸光度の増
   加量であることを特徴とする免疫測定法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の免疫測定法であって、前
   記溶液中における水溶性高分子からなる増感剤の濃度が
   ０．１〜５重量％、抗免疫グロブリンＭ抗体の濃度が３
   μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌとされていることを特徴と
   する免疫測定法。
3. 【請求項３】 請求項２記載の免疫測定法であって、前
   記溶液中における不溶性担体の濃度が０．０１〜３重量
   ％、測定対象物質の濃度が１００ｎｇ／ｄＬ〜８０ｍｇ
   ／ｄＬとされていることを特徴とする免疫測定法。
4. 【請求項４】 測定対象物質に対する抗体又は抗原を感
   作したラテックス粒子と、水溶性高分子からなる増感剤
   を含有する検体希釈液とからなることを特徴とする請求
   項１〜３のいずれか一項記載の免疫測定法を実施するた
   めの測定キット。