JP2000300273A - 葯の裂開に関与する遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 葯の裂開及び花粉の成熟を制御する遺伝
子、及びその遺伝子の発現が抑制されている雄性不稔植
物、並びにその雄性不稔植物の稔性を回復する方法。 【効果】 その花器官が野生型に限りなく近く、また、
ジャスモン酸等により稔性を回復させることのできるた
め、F1種子生産のために極めて有用な雄性不稔植物を提
供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、DAD1(DEFECTIVE I
N ANTHER DEHISCENCE 1)遺伝子、及び該遺伝子の発現を
抑制した植物に関する。DAD1遺伝子は葯の裂開及び花粉
の成熟を制御する遺伝子であり、DAD1遺伝子の発現を抑
制することで、野生型に限りなく近い花器構造を有する
雄性不稔植物の作出を可能にする。作出された雄性不稔
植物はジャスモン酸、リノレン酸処理により稔性を回復
し、自殖種子を得ることができる。そのため、維持系統
を必要とせず、一代雑種品種育成が可能となる。

【０００２】

【従来の技術】近年、多くの作物で雑種強勢（ヘテロシ
ス）を利用した一代雑種(F1)品種の育成が進められてい
る。このF1品種のメリットは、雑種強勢の発現により収
量性、耐病性などの農業形質が優れたものとなること、
単因子優性の農業形質の付与が容易なこと、均一性が高
いこと、また、次世代で遺伝形質の分離が起こるため育
成者の権利が守られることなどが挙げられる。

【０００３】F1品種においては、雑種第１代目の種子を
多量に確保する必要があり、そのための技術として、遺
伝的雄性不稔性を持つものを母親に使用することが行わ
れてきた。この他に自家不和合性を利用する方法、雄花
を人為的に除去する方法、人為的に交配する方法、など
があるが、これらの方法は利用できる植物種が限られて
いる。遺伝的雄性不稔性を利用する方法が、最も汎用性
に富んでいるため、F1種子を確保するために広く用いら
れてきた。

【０００４】遺伝的な雄性不稔性には核内遺伝子によっ
て支配される雄性不稔性（GMS）と核遺伝子と細胞質因
子の両者が関与する細胞質雄性不稔性(CMS)の2種類があ
る。F1品種育成の際の採種においては、以下の理由から
CMSが利用されてきた。GMSの場合、雄性不稔性を示すの
は、その遺伝子についてホモ接合性の個体だけであり、
ヘテロ接合性の個体は通常稔性を持つ。効率的なF1種子
の生産を行うためには、母親に用いる個体すべてが雄性
不稔であることが求められるが、このことは、GMSを利
用してF1種子を生産する場合には、母親に用いる個体す
べてを雄性不稔性に関する遺伝子についてホモ接合性の
個体にしなければならないということを意味する。しか
し、GMSにおいては、それ自身の花粉が利用できないの
で自殖によるホモ接合性の個体を作出・維持出来ない。
ヘテロ接合性の個体を自家受粉することにより、ホモ接
合性の個体を作出することはできるが、この場合にはホ
モ接合性個体が1/4しか得られず、実用化できない。

【０００５】しかし、GMSにおいても、その遺伝子に関
してホモ接合性の集団が得られる技術が開発されれば、
これを利用してF1種子の生産も可能になる。実際、雄性
不稔性のホモ接合性の個体を選抜する方法などが考案さ
れ、一部では利用されているが、ホモ接合性の集団を育
成する方法がなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、葯の
裂開と花粉の成熟を制御する核遺伝子を提供すると共
に、その遺伝子発現を制御することによって、雄性不稔
性と雄性可稔性を制御して、母親に使用する植物集団の
個体全てが雄性不稔性となる技術を提供することであ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本願発明者は、上記の課
題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、T-DNAタギング
法により、開花後も葯の裂開が起こらないシロイヌナズ
ナ（Arabidopsis thaliana）の突然変異体(dad1)の作出
に成功した。この変異体の花粉は、発芽能を失ってお
り、雄性不稔性であった。dad1突然変異体の蕾をジャス
モン酸あるいはリノレン酸で処理すると、その後開花し
た花では葯の裂開が見られ、自殖種子を形成した。この
dad1突然変異体より、T-DNA配列をもとにして、DAD1遺
伝子のゲノミッククローンとcDNAクローンを単離した。
単離したゲノミッククローンを植物導入ベクターに連結
して、dad1変異体に形質転換したところ、再生植物体で
は葯の裂開、自殖種子の形成が見られ、野生型表現型に
回復していた。この結果は、単離した遺伝子がDAD1遺伝
子であることを示すものである。さらに、DAD1のプロモ
ーターに逆向きに連結したアンチセンスDAD1遺伝子を植
物ゲノムDNA中に組み込むことによって、dad1突然変異
体同様に、葯の裂開の起こらない植物体を作出できるこ
とを見いだした。以上の知見に基づき、本発明は完成さ
れたものである。

【０００８】即ち、本発明の第一は、以下の(a)又は(b)
の塩基配列により表され、プロモーター活性を有するDN
Aに関するものである。 (a) 配列番号３に記載の塩基配列 (b) 配列番号３に記載の塩基配列において、１若しくは
複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列

【０００９】本発明の第二は、以下の(a)又は(b)のタン
パク質をコードするDNAに関するものである。 (a) 配列番号２に記載のアミノ酸配列により表されるタ
ンパク質 (b) 配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しく
は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列により表され、葯の裂開を制御する機能を有
するタンパク質

【００１０】本発明の第三は、上記第二発明のDNAと相
補的な塩基配列により表されるDNAに関するものであ
る。本発明の第四は、上記第二発明のDNAの発現が抑制
されていることを特徴とする雄性不稔植物に関するもの
である。本発明の第五は、上記第二発明のDNAの発現を
抑制することを特徴とする雄性不稔植物の作出方法に関
するものである。本発明の第六は、上記第四の発明の雄
性不稔植物をジャスモン酸、リノレン酸、又はそれらの
誘導体で処理することを特徴とする稔性回復方法に関す
るものである。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）第一発明 第一発明のDNAは、プロモーター活性を有するDNAであっ
て、配列番号３に記載の塩基配列又は配列番号３に記載
の塩基配列において、１若しくは複数の塩基が欠失若し
くは付加された塩基配列により表される。このような配
列番号３とは異なる塩基配列により表されるDNAとして
は、本願の出願時において常用される技術、例えば、部
位特異的突然変異誘発法（Zoller et al., Nucleic Aci
d Res. 10:6487-6500, 1982）によって変異を生じさせ
たDNAや配列番号３に記載の塩基配列により表されるDNA
と異なる遺伝子源から単離されたDNAなどを例示するこ
とができる。

【００１２】第一発明のDNAは、実施例記載の方法によ
っても得ることが出来るが、その塩基配列は既に決定さ
れているので、この配列に基づきプライマーを合成し、
この遺伝子を含むDNAを鋳型にPCRを行うことによっても
得ることが出来る。使用するプライマーは、特に限定さ
れない。鋳型として用いるDNAとしては、プラスミドpGD
AD1-HS(このプラスミドを含む菌株は、工業技術院生命
工学工業技術研究所に受託番号FERM P-17299として寄託
されている）を挙げることが出来る。

【００１３】（２）第二発明 第二発明のDNAは、配列番号２に記載のアミノ酸配列に
より表されるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列において、一若しくは複数のアミノ酸配列が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列により表さ
れ、葯の裂開を制御する機能を有するタンパク質をコー
ドする。このような配列番号２とは異なるアミノ酸配列
をコードするDNAとしては、本願の出願時において常用
される技術、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Zoll
er et al., Nucleic Acid Res. 10:6487-6500, 1982）
によって変異を生じさせたDNAや配列番号２に記載のア
ミノ酸配列をコードするDNAと異なる遺伝子源から単離
されたDNAなどを例示することができる。なお、配列番
号２に記載のアミノ酸配列により表されるタンパク質を
コードするDNAは、WSエコタイプのシロイヌナズナのゲ
ノミックライブラリーから単離されたものであるが、Le
rエコタイプのシロイヌナズナのcDNAライブラリーから
単離されたDNAは、配列番号２の13〜15番目のVal-Val-V
alに更にもう一つのValが付加された配列をコードする
ものであった。上記の趣旨より、このようなDNAも第二
発明のDNAに含まれるのはいうまでもない。

【００１４】あるDNAが葯の裂開を制御する機能を持つ
かどうかは、そのDNAを、内在のDAD1の発現が抑制され
た植物（例えば、実施例２に記載した「dad1」）に導入
し、それにより葯の裂開が回復するかどうかを調べるこ
とにより判断できる。第二発明のDNAは、実施例記載の
方法によっても得ることが出来るが、その塩基配列は既
に決定されているので、この配列に基づきプライマーを
合成し、この遺伝子を含むDNAを鋳型にPCRを行うことに
よっても得ることが出来る。使用するプライマーは、特
に限定されない。鋳型として用いるDNAとしては、上記
のプラスミドpGDAD1-HSを挙げることが出来る。

【００１５】（３）第三発明 第三発明のDNAは、上記第二発明のDNAと相補的な塩基配
列により表される。第三発明のDNAは、実施例記載の方
法によっても得ることが出来るが、その塩基配列は配列
表に記載した配列から容易に求めることができるので、
この配列に基づきプライマーを合成し、この遺伝子を含
むDNAを鋳型にPCRを行うことによっても得ることが出来
る。使用するプライマーは、特に限定されない。鋳型と
して用いるDNAとしては、上記のプラスミドpGDAD1-HSを
挙げることが出来る。

【００１６】（４）第四発明 第四発明の雄性不稔植物は、第二発明のDNAの発現が抑
制されていることを特徴とするものである。植物の種類
は、第二発明のDNAを有するものであれば特に限定され
ず、例えば、アブラナ科、イネ科、キク科、アカザ科の
植物などを挙げることができる。

【００１７】この雄性不稔の植物の特徴点としては、以
下の2点を挙げることができる。一つは、葯が裂開しな
い他は、その形質は野生型のそれとほとんど変わりがな
い点である。雄性不稔性を利用したF1採種は、例えば、
アブラナ科野菜では数例しか報告がない。これは、従来
の雄性不稔系統の多くに花器の異常が見られるため、送
粉昆虫が訪花せず採種量が少ないためである。本発明の
雄性不稔植物は、その花器官が野生型に限りなく近いた
めに、ハチやアブ等の送粉昆虫の訪花を容易にし、採種
量の増大を図ることができる。この植物の他の一つの特
徴点は、リノレン酸やジャスモン酸などで処理すること
によってその稔性を回復させることができる点である。
本発明の雄性不稔植物は、このような性質から容易に自
殖種子が得られ、雄性不稔遺伝子ホモ接合性の集団を容
易に作製することが出来る。この雄性不稔植物は、例え
ば、後述する第五発明の作出方法に従って作出すること
ができる。

【００１８】（５）第五発明 第五発明の作出方法は、第二発明のDNAの発現を抑制す
ることを特徴とするものである。第二発明のDNAの発現
を抑制する方法は、特に限定されないが、好ましい方法
として、以下のアンチセンス法、コ・サプレッション
法、遺伝子破壊型タギング法、ジーンターゲティング
法、突然変異誘発源を利用する方法などを例示すること
ができる。

【００１９】i) アンチセンス法 この方法は、適当なプロモータとその下流に配置された
第三発明のDNA（アンチセンスDNA）とを含むベクターを
構築し、それを植物に導入することにより、第二発明の
DNAの発現を抑制する方法である。ここで使用するプロ
モーターとしては、第一発明のDNA（プロモーター）が
好ましいが、他のプロモーターを用いても良い。他のプ
ロモーターとしては、CaMV35Sプロモーターなどの公知
の植物発現プロモーターを用いることができる。

【００２０】ベクターの植物への導入は、植物細胞へ外
来遺伝子を導入する際に常用する方法、例えば、アグロ
バクテリウムを用いた方法により行うことが出来る。ア
グロバクテリウムとしては、植物の外来遺伝子導入に常
用されるものであれば特に限定されないが、例えば、Ag
robacterium tumefacience EHA101株（Hood et al.,J.
Bacteriol. 168:1291-1301 1986）を用いることができ
る。

【００２１】プロモーターと共に導入された第三発明の
DNAは、植物内で第二発明のDNAに対するアンチセンス遺
伝子としてはたらく。即ち、第三発明のDNAの転写産物
が、植物内にもともと存在する第二発明のDNAの転写産
物と対合し、その翻訳を阻害し、その結果、第二発明の
DNAの発現が抑制される。植物体に第三発明のDNAが導入
されているかどうかは、植物体よりゲノムDNAを抽出
し、サザンハイブリダイゼーションを行うことにより確
認できる。

【００２２】ii) コ・サプレッション法 この方法は、第一発明のDNA（プロモーター）の下流に
任意の遺伝子を配置したベクターを構築し、これを植物
に導入することにより、コ・サプレッションを起こさ
せ、これにより第二発明のDNAの発現を抑制する方法で
ある。第一発明のDNAの下流に連結する遺伝子は、特に
限定されず、例えば、GUSレポーター遺伝子、第二発明
のDNA等を使用することが出来る。ベクターの植物への
導入は、上記のアンチセンス法と同様に行うことができ
る。

【００２３】iii) 遺伝子破壊型タギング法 この方法は、T-DNAまたはトランスポゾンを第二発明のD
NAに挿入することにより、第二発明のDNAの発現を抑制
する方法である。T-DNAやトランスポゾンを含むベクタ
ーを植物に導入することにより、T-DNAやトランスポゾ
ンがゲノム中にランダムに挿入した突然変異系統群を作
製する。これら系統群の植物体からゲノムDNAを調製
し、PCR法を利用してDAD1の遺伝子破壊株をスクリーニ
ングすることができる。あるいはこれらの系統群の植物
体の表現形を観察して葯の裂開していない変異体を選抜
し、蕾にリノレン酸やジャスモン酸を処理することによ
り、DAD1遺伝子破壊株を選抜することができる。

【００２４】T-DNAタギングに用いるベクターは、特に
限定されず、例えば、pBIH1-IGを使用することができ
る。また、トランスポゾンタギングに使用するトランス
ポゾンについては、特に限定されず、例えば、Ac-Ds系
等のDNA型トランスポゾンや、レトロトランスポゾンを
使用することができる。

【００２５】iv) ジーンターゲティング法 この方法は、相同組換えにより第二発明のDNAの一部に
他のDNAを挿入し、第二発明のDNAをノックアウトするこ
とにより第二発明のDNAの発現を抑制する方法である。
このような第二発明のDNAをノックアウトする方法とし
ては、例えば、Kempinらの方法（Kempin et al. Nature
389: 802-803. 1997）に従って行うことができる。即
ち、第二発明のDNA内にカナマイシン遺伝子等を挿入し
たターゲティングベクターを作製し、これを植物に導入
し、相同組換えを起こさせ、第二発明のDNAをノックア
ウトする。相同組換えが起こったかどうかは、PCRやサ
ザンハイブリダイゼーションにより確認することができ
る。

【００２６】ｖ） 突然変異誘発源を利用した方法 この方法は、突然変異誘発源を処理し、第二発明のDNA
に突然変異を起こすことにより、第二発明のDNAの発現
を抑制する方法である。対象植物の種子もしくは植物体
に誘発源を処理し、処理当代（M1）を自殖した世代（M
2）の植物体からDAD1遺伝子破壊株を選抜することがで
きる。例えば、数千の個体を突然変異誘発源で処理した
後、これらの自殖種子を採種する。M1世代１個体あたり
数粒の種子を圃場に植えて観察して葯の裂開していない
変異体を選抜する。選抜した個体の蕾にリノレン酸やジ
ャスモン酸を処理することにより、DAD1遺伝子破壊株を
選抜することができる。

【００２７】用いる突然変異誘発源は、突然変異率を高
める誘発源としてよく用いられるものであれば特に限定
されないが、例えば、X線およびγ線、メタンスルホン
酸エチル（EMS）、N−ニトロソ−N−メチルウレア（NM
U）を使用することができる。上記のiii)、iv)、v)の方
法により雄性不稔化させた植物は、第二発明のDNAを正
常に発現する植物との交配により次代（F1）で稔性を回
復するので、F1植物の種子を農産物として利用する植
物、例えば、ナタネ、イネ、オオムギ、コムギ等一般作
物のF1採種に有効である。

【００２８】（６）第六発明 第六の発明の稔性回復方法は、上記第四発明の雄性不稔
植物をジャスモン酸、リノレン酸、又はそれらの誘導体
で処理することを特徴とするものである。ジャスモン酸
及びリノレン酸の誘導体としては、例えば、ジャスモン
酸メチル、リノレン酸ナトリウム、12-オキソ‐フィト
ジェン酸、コロナチン等を挙げることができるが、これ
らに限定されるわけではない。

【００２９】処理方法としては、蕾をジャスモン酸等を
含む溶液に浸漬する方法を例示することができるが、こ
れ以外にも例えば、筆、スプレーなどを使用して処理し
てもよい。ジャスモン酸等を含む溶液の濃度及び浸漬時
間は、特に限定されないが、ジャスモン酸メチルの場
合、0.05〜0.5mMの溶液に数秒間浸漬するのが好まし
い。

【００３０】

【実施例】以下、本発明について実施例を挙げて詳細に
説明するが、この実施例は、本発明の範囲を限定するも
のではない。 ［実施例１］ dad1変異体の作出 （１）シロイヌナズナ・ゲノムDNAへの T-DNAの挿入 T-DNAタギングを行うため、タギングベクターpBIH1-IG
（名古屋大学・中村研三教授より供与、図1）をアグロ
バクテリウム用いて、シロイヌナズナへ導入した。シロ
イヌナズナへの遺伝子導入はモデル植物の実験プロトコ
ール(秀潤社 p99-104)に従い、以下のように行った。
シロイヌナズナ（WSエコタイプ、京都大学大学院理学研
究科 植物学教室）の芽ばえから胚軸部分を切り取り、
2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（0.5mg/L）とカイネチン
(0.05mg/L)を含むCIM培地で培養し、胚軸の切り口にカ
ルスを誘導した。このカルスに、pBIH1-IGを含むアグロ
バクテリウム EHA101 株を感染させ、pBIH1-IGの T-DNA
をカルス細胞のゲノムに導入した。

【００３１】（２）形質転換シロイヌナズナ植物体の再
生 T-DNA が導入されたカルスをカナマイシン（50mg/L）、
ハイグロマイシン B（20mg/L）、バンコマイシン（500m
g/L）およびクラフォラン（200mg/L）を含むSIM培地（5
mg/L 2-イソペンテニルアデニンと0.15mg/Lインドール
酢酸)上で選抜しながらシュートを誘導した。シュート
を切り取り、0.02mg/Lインドール酪酸を含むRIM培地に
移し、発根を誘導した。このようにしてできた再生植物
体（T1世代）をバーミキュライトに植えかえ、蛍光灯下
で栽培した。自家受粉によって種子（T2世代）を形成さ
せ、採種した。

【００３２】［実施例２］ dad1変異体の同定と解析 （１）dad1突然変異体の同定 T2世代の種子をバーミキュライトに播種し、蛍光灯下で
栽培した。開花後も葯が裂開しない個体を見いだし、da
d1と命名した（図2）。dad1個体の花の雌しべに非形質
転換体シロイヌナズナ（WSエコタイプ）の花粉を１回目
戻し交配を行い、 F1 種子を得た。育成した植物の表現
型は野生型であり、dad1突然変異体は劣性突然変異であ
ることが分かった。F1植物から自殖種子（F2）を採種し
た後、F2植物集団の中に現れた dad1 変異体に対し、同
様の方法で２回目の戻し交配を行い、F2種子を得た。こ
の F2 集団の中からdad1表現型を示す個体を選び、以下
の解析に用いた。

【００３３】（２）リノレン酸およびジャスモン酸によ
る変異の回復 dad1変異体の花序のうち、まだ開花していないつぼみが
付いている部分を0.05%リノレン酸ナトリウム水溶液ま
たは 0.5 mM ジャスモン酸メチル水溶液（0.05% Tween
20 を含む）に浸したところ、その後開花した 10個程度
の花で葯の裂開が見られ（図2）、自殖種子が形成され
た。この種子を取って土に播き、育てたところ、すべて
の個体が dad1 表現型を示した。

【００３４】［実施例３］ DAD1遺伝子のクローニング （１）IPCR（inverse PCR）によるT-DNA 隣接領域の単
離 dad1突然変異体から調製したゲノミックDNAをEcoRIで切
断し、T4リガーゼで環状化した。ゲノム中に挿入されて
いる T-DNA（バイナリーベクター pBIH1-IG 由来の T-D
NA）のレフトボーダー側に対応する2個のプライマー HP
H-R（5'-TTTGCCCTCGGACGAGTGCT-3'）および L6（5'-CAG
CACATCCCCCTTTCGCCAG-3'）を用いてPCRを行い、T-DNA
のレフトボーダーに隣接した遺伝子 Aの一部（0.5 kbの
DNA断片）を単離した。

【００３５】（２）ゲノミッククローンの単離 （１）で単離したDNA断片（遺伝子 Aの一部）を³²P で
標識してプローブに用い、lambda DASH II（Stratagene
社）をベクターに用いて作製したシロイヌナズナ（WSエ
コタイプ）のゲノミックライブラリをスクリーニング
し、遺伝子 Aを含むゲノミッククローン lambda 2-1a-1
を単離した（図3）。

【００３６】（３）ゲノミッククローンのプラスミドへ
のサブクローニングと塩基配列の決定（図3） lambda 2-1a-1 を HindIIIで切断して得た 3.9 kb の遺
伝子断片と EcoRIで切断して得た 5.8 kb の遺伝子断片
をそれぞれプラスミドベクター pBluescript SK+（Stra
tagene社）につなぎ、遺伝子 Aの 5' 側部分のサブクロ
ーン pAKH3.9と3' 側部分のサブクローン pAKE5.8を作
製した。次に pAKH3.9を HindIIIと EcoRIで切断して得
た断片と pAKE5.8を EcoRIと SplI で切断して得た断片
を連結してプラスミドベクター pBluescript SK+（Stra
tagene社）につなぎ、遺伝子 AのHindIIIから SplI ま
での領域をプラスミド上に再構築した。このプラスミド
をpGDAD1-HSと名付けた。このプラスミドを用いて、遺
伝子 Aの HindIIIから SplI までの領域の塩基配列を決
定した。なお、遺伝子Aを含むプラスミドpGDAD1-HSは、
大腸菌に導入された状態で工業技術院生命工学工業技術
研究所に受託番号FERN P-17299として寄託されている
（寄託日：平成11年3月12日）。

【００３７】（４）cDNAクローンの単離と塩基配列の決
定 lambda 2-1a-1 を SpeI で切断して得られる3.6 kbの D
NA断片を³²P で標識してプローブに用い、lambda ZAP I
I（Stratagene社）をベクターに用いて作製したシロイ
ヌナズナ（Ler エコタイプ）の花芽の cDNA ライブラリ
ーをスクリーニングし、遺伝子 Aの cDNAクローン lamb
da 5a3 を単離した。その塩基配列解析したところ、こ
のクローンは 3' 側を欠いていることが明らかになった
ので、プライマーDAD1-FP3（5'-CTCCTTGAGAAGCAAGGCACG
AAG-3'）を用いて 3'-RACE法を行い、欠けていた部分を
単離した。得られた全長のcDNAクローンは、448アミノ
酸残基よりなるタンパク質をコードするオープンリーデ
ィングフレームを含んでいた。ゲノミッククローンの塩
基配列とcDNAクローンの塩基配列の比較より、遺伝子A
はイントロンを含まないことが明らかになった。また、
cDNAクローンのオープンリーディングフレームはゲノミ
ッククローンのオープンリーディングフレームより3bp
長く、コードするタンパク質のN末端付近に余分に１ア
ミノ酸残基が挿入されていることがわかったが、この差
はクローンがそれぞれ由来するLerとWSのエコタイプの
違いに起因するものであり、コードするタンパク質の活
性には関係がないと推定した。

【００３８】［実施例４］ 相補性実験（遺伝子 Aが D
AD1 遺伝子であることの確認） pGDAD1-HS を SpeI で切断し、切り出した 3651 bpの D
NA断片（配列番号１の一部）を pBI101 由来のバイナリ
ーベクター pARK5-MCS（明治製菓（株）より供与された
プラスミド pARK5を一部改変）の SmaI 部位に連結し
て、バイナリープラスミド pTDAD1-SS（図４）を作製し
た。このプラスミドを Agrobacterium tumefacience C5
8C1 (pGV2260) 株に導入した。リノレン酸処理によって
得た dad1突然変異体の自殖種子から実施例１−（１）
と同様の方法でカルスを調製し、pTDAD1-SS を含む上記
アグロバクテリウムを感染させて、遺伝子 Aを含む Spe
I 断片を挿入した T-DNAをdad1変異体由来のカルスのゲ
ノムに導入した。このカルスをビアラホス（10 mg/L）
（明治製菓（株）より供与）で選抜しながら実施例１−
（２）と同様の方法で培養し、再生植物体を形成させ
た。この再生植物体を土に移して栽培し、開花させたと
ころ、葯の裂開と、自殖種子の形成が見られ、野生型表
現型に回復していることが確認できた。この結果より、
最終的に遺伝子 Aが DAD1 遺伝子であると同定した。

【００３９】［実施例５］ 雄性不稔植物の作出（その
１、アンチセンスDAD1遺伝子を用いた方法） （１）アンチセンスDAD1遺伝子導入ベクターの構築 pGDAD1-HS を SpeI で切断し、切り出した 3651 bpの D
NA断片をpBluescriptII SK+（Stratagene社）に連結し
たプラスミドpGDAD1-SSを作製した。このプラスミドを
鋳型に、ClaI部位を挿入してあるプライマーDAD-p1(5'-
GGATCGATAGTGTCCCACGTGGGTAAC-3')とBamHI部位を挿入し
てあるプライマーDAD-p2(5'-CGCGGATCCGTTGTATATAGAGAA
TGG-3')を用いてプロモーター領域をPCRによって増幅し
た。さらに、BamHI部位を挿入してある2個のプライマー
DAD-c1(5'-CGCGGATCCACACACACTTTCTCAAC-3')とDAD-c2
(5'-CGCGGATCCACAAACCCGTCTACC-3')を用いてDAD1翻訳領
域部分をPCRによって増幅した。これらの増幅した断片
をpBluescriptII SK-（Stratagene社）に挿入し、プロ
モーター配列の後ろにDAD1翻訳領域部分を逆向きに連結
したアンチセンスDAD1遺伝子を作製した。

【００４０】次に、アンチセンスDAD1遺伝子をプラスミ
ドベクターから切り出し、バイナリベクターpGAH（Onou
chi et al. Nucleic Acids Res. 19: 6373-6378. 199
1、名古屋大学・町田泰則教授より供与）のCla IとSac
Iの部位に挿入してバイナリープラスミドpADAD1（図
５）を作製した。

【００４１】（２）シロイヌナズナの形質転換 上記のバイナリープラスミドpADAD1をAgrobacterium tu
mefacience EHA101株に導入し、減圧浸潤（vacuum infi
ltration）法によってシロイヌナズナ（Columbiaエコタ
イプ、東北大学大学院農学研究科 植物遺伝育種学研究
室）に形質転換した。減圧浸潤法によるシロイヌナズナ
への形質転換は、モデル植物の実験プロトコール（秀潤
社 pp. 109-113.）に従って行った。

【００４２】形質転換したシロイヌナズナは、dad1同様
に開花後も葯の裂開が起こらず（図6左）、自殖種子を
形成しなかった。形質転換体のまだ開花していない蕾を
0.5mMジャスモン酸メチル水溶液に浸したところ、その
後開花した花で葯の裂開が見られ、花粉が葯の表面に露
出した（図6右）。また、この花粉を雌しべに受粉した
結果、自殖種子の形成が認められた。このことから、実
施例５−（１）に記載の遺伝子導入ベクターを導入する
ことによって、dad1突然変異体と同様の雄性不稔性を示
す形質転換植物を作出できることが明らかになった。

【００４３】［実施例６］ 雄性不稔植物の作出（その
２，プロモーター−GUS遺伝子導入ベクターを用いた方
法） （１）プロモーター−GUS遺伝子導入ベクターの構築 pGDAD1-HSをSplIで切断し、末端をKlenow断片で平滑化
した。次にHindIIIで切断し、3512bpのDNA断片を単離し
た。このDNA断片をバイナリーベクターpBI101.2（Clont
ec社）のHindIII部位とSmaI部位の間に連結し、DAD1遺
伝子のプロモーターにGUSレポーター遺伝子を連結した
プラスミドpBIDAD1-H（図７）を作製した。

【００４４】（２）シロイヌナズナの形質転換 pBIDAD1-HをAgrobacterium tumefaciens GV3101株に導
入し、実施例5−（2）と同様に、減圧浸潤（vacuum inf
iltration）法でシロイヌナズナ（WSエコタイプ、京都
大学大学院理学研究科 植物学教室）に形質転換した。
形質転換体のシロイヌナズナの大部分では、表現型の異
常は見られなかった。これらの植物から花序を取ってX-
Gluc（5-bromo-4-chloro-3-indoril-beta-D-glucuronid
e、和光純薬）溶液で染色したところ、花糸に強い染色
が観察された。一方、一部の形質転換体では、開花後も
葯の裂開が起こらないというdad1突然変異体と同様の表
現型が観察された。ジャスモン酸処理による裂開能の回
復も観察された。これらの個体では、X-Glucによる染色
も弱くなる傾向が見られた。

【００４５】［実施例７］DAD1遺伝子プローブを用いた
サザンハイブリダイゼーション（図８） シロイヌナズナ以外の植物種のゲノムDNA中にもDAD1遺
伝子と類似の遺伝子が存在するのかを調査するために、
アブラナ科、イネ科、キク科、アカザ科植物のゲノムDN
Aを用いてサザン分析を行った。コマツナ品種おそめ
（タキイ種苗（株））、ブロッコリー品種グリーンコメ
ット（タキイ種苗（株））、イネ（ヤマホウシ、ササニ
シキ）、オオムギ（大六角一号）、トウモロコシ（スイ
ートム102、（株）藤井農産）、レタス２品種（Ｖレタ
ス（カネコ（株）、およびサマーレッド（タキイ種苗
（株）））、並びにサトウダイコン（北海道大学農学部
より供与）の葉からCTAB法（Murray and Thompson Nucl
eic. Acids Res. 8:4321-4325,1980）によりゲノムDNA
を抽出した。ゲノムDNAを制限酵素EcoRIで消化し、0.7%
アガロースゲルに電気泳動した。メンブランにDNAを写
し取り、DAD1遺伝子をプローブに用いてハイブリダイゼ
ーションを行った後、0.5x SSC, 0.1% SDS, 65℃の条件
で洗いを行った。この結果、供試した全ての植物に本遺
伝子あるいはそれと配列が近似している遺伝子の存在が
確認された。

【００４６】

【発明の効果】本発明は、植物の葯の裂開を制御する核
遺伝子及びその遺伝子の発現が抑制されている雄性不稔
植物を提供する。この雄性不稔植物は、その花器官が野
生型に限りなく近く、また、ジャスモン酸等により稔性
を回復させることのできるため、F1種子生産のために極
めて有用である。

【００４７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Research Institute of Seed Production Co., Ltd. <120> YAKU NO REKKAI NI KANYOSURU IDENSHI <130> P99-0082 <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 8133 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (3487)..(4827) <400> 1 aagcttcttt attacccaat taagtaaata tcccaaacaa ttccattttg catgtaaact 60 taatgtcact attccctaaa ttaaattaca caaaattgca gtgtatgtta tgatgattgt 120 ttgatacttt attccctcct agatattatc ttaaagatca acctttgtgt tgagtaattt 180 cgttgtatag gcttgtggaa tatatacttc aattcttatc agaccataga gtcagatcat 240 ttccacgaat ccttatagaa acatttagtt atgaaataaa acacatccga aataactagc 300 tattagatat aagaaaaaat ttaaaaatat tattgctcat cacagatttt ggaaaaatat 360 atattcatct aatcatgtta atagtcgcca tatatatacg cacattattg ttaaattgaa 420 caatctttgt aaaattatgt ttgttttgaa tattcttata aacatagaga aaattgcata 480 ttatctgttt gtaatgaaac gtatatttat tatatataga ccgatataca ataaagtagc 540 tagtaatagt attgaacaac aattgatcac caaaagaaag ttgttagctg gcttctgatg 600 gtttaacggc tcagttatga cttattcgag ctgcaccaga tactgttagc ttgctttagt 660 cgactttttt ttttttttaa caaacaaatg aaaatagtcg ttaagaagga cttcattgtt 720 agctactaac atacattcat tcatttgggt tatattatgc atgtagaaaa ctcatatgat 780 aaaatgtgcc gaatcgagcc taacaaacag gggacatggc agtaaatata gttataaatt 840 ttcttacacc ctattacaga gaaaggtgaa ttttgttttt tttgtcacag tgaaatttgt 900 ttatatattg aaatatttat acatgcataa actataaact atagttataa gtgtaattgt 960 ctctctttgc cctttttctt tatttcaaga atggtagctt aagtatataa gttttacttg 1020 taaataagtt ttggtagtat atagaagaat ccgagtagaa aactcatact aagtactata 1080 gagcatgaga aataagaaat tcataatgta gtttatcgta tgagttgact ggatgataga 1140 taccataaat atattaagtt aaaagattct actaaacgaa gaccaactgc aaagctacgt 1200 atatatttat ccactgcgta aactaaactt tttctctaca tcgatctctc aatctttggt 1260 cggttcactt tacaaatcat aaatatataa gagtcggttt agttctttac aaaaaatcaa 1320 catcgatcaa agttgatgtc atggctatca ctccattctt ctctgttggc ctcctttaaa 1380 atttacctct taattttctt ttggtatgga aagaagaaat actctttaat gttttccgta 1440 acaacgtgga caaatggtcc cgaaagaaga aatggccaat gtaaatgata ttgaaatagt 1500 cccatcggaa aaaagagtga agaaattaaa cattataaag aaccaattaa tggcttttgt 1560 ggtgtgtagt attgtgtcca caaatatatg aatggtcacg ttggtttgat atatccaaaa 1620 cgatgacatt taaatcgggg aatgtaagta aagtacgtgt cataaccaat agttctaaag 1680 tggtgcatgc aatttttgtt tattacaaaa caagaaattt gttcccaatc gattggaaca 1740 ccaaatcact ttaattgctt aagcactttg atcgtattcc taacgaagac attttccacg 1800 cgttccatgt gcatctcctc ctcagtatct atggtttatc gtgtaaatta aaactccttt 1860 cttcaagtta gttcatagtc tacataattc tttttactgc atataacata taatattctg 1920 taagatatca agaatctaaa agtgttttta ttactagtgt cccacgtggg taacatttga 1980 aatgcattca aacgatgtga taatgtgaaa tgcttaaaag tatatagagt taaaacagtc 2040 tttcagaaat cacgatggtt atcaatacaa tataaagaaa atattgcaaa acagctaaga 2100 ctctaatagg atttataaat gaaaagaggc tatatgttat taaaaagcac aagactaata 2160 tataaagagc tacgacatgt gatgtgaaat tcaaatagta agtaactcac gttgcacttc 2220 ttttattcgt cgttttgccc gaacaacaca tcactccaac ttatttaatt ggacttattc 2280 tgttacccgc gatataggct agcaagataa atttcatcgc gacatttcat atcttgatca 2340 ttctgcctta ttcaatggat tcattcaacc attctctgct catttggata tgatcattta 2400 cacttacatt ttatatttag attctaagtc gataactaat tttaagattg ttatatgttg 2460 cttttatacg tagacataaa acttgtcgtt aattgtataa aaacaatatg ctagaagcct 2520 agaagggcgt gggaatatag gaggtgtata cttcgtactt tccttgagca ttcaaattca 2580 gcaattggcg gcgaatggct aaagccgaaa gtaccaaatc cagccgatat gagccgagtc 2640 gagctggtga tagttcctca cgtgtcaaag cctttctgag ccgtattgtt tgagaactcc 2700 cacgtgtcca gtcccatcga aaacgacggt cagatattta tttcgataca cacttctttc 2760 tcttctcata tcatctcagc cgtccatttc tcttagtctc attatcatac atttacttct 2820 tctttttttt tttggtcacc aattcggtta aatccttttt tttttgtaaa tataagtcac 2880 attaaaaaag agagtaaaaa cgtgatgtca aaaacacaac taataacgta gaatccattc 2940 atgatcccaa atattgattt cacattgtct ttatggtcca tgttagttaa gtaaaagaaa 3000 gaaagagcaa acatagctta tgtgtaccac ataatcattt atatagtatt gaaactttgt 3060 caaagattgt actcattctt catagaataa aatatacaaa cccagctatt gttagctttc 3120 taatttggta catttattgc ttttacatac acgaaaacta 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Ser Ala Tyr Gln Ala Phe 115 120 125 Asp Phe Asp Pro Ser Ser Pro Thr Tyr Gly Thr Cys Arg Phe Pro Arg 130 135 140 Ser Thr Leu Leu Glu Arg Ser Gly Leu Pro Asn Ser Gly Tyr Arg Leu 145 150 155 160 Thr Lys Asn Leu Arg Ala Thr Ser Gly Ile Asn Leu Pro Arg Trp Ile 165 170 175 Glu Lys Ala Pro Ser Trp Met Ala Thr Gln Ser Ser Trp Ile Gly Tyr 180 185 190 Val Ala Val Cys Gln Asp Lys Glu Glu Ile Ser Arg Leu Gly Arg Arg 195 200 205 Asp Val Val Ile Ser Phe Arg Gly Thr Ala Thr Cys Leu Glu Trp Leu 210 215 220 Glu Asn Leu Arg Ala Thr Leu Thr His Leu Pro Asn Gly Pro Thr Gly 225 230 235 240 Ala Asn Leu Asn Gly Ser Asn Ser Gly Pro Met Val Glu Ser Gly Phe 245 250 255 Leu Ser Leu Tyr Thr Ser Gly Val His Ser Leu Arg Asp Met Val Arg 260 265 270 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Leu Gln Ser Tyr Gly Asp Glu Pro Leu Ser 275 280 285 Val Thr Ile Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ala Ile Ala Thr Leu Ala 290 295 300 Ala Tyr Asp Ile Lys Thr Thr Phe Lys Arg Ala Pro Met Val Thr Val 305 310 315 320 Ile Ser Phe Gly Gly Pro Arg Val Gly Asn Arg Cys Phe Arg Lys Leu 325 330 335 Leu Glu Lys Gln Gly Thr Lys Val Leu Arg Ile Val Asn Ser Asp Asp 340 345 350 Val Ile Thr Lys Val Pro Gly Val Val Leu Glu Asn Arg Glu Gln Asp 355 360 365 Asn Val Lys Met Thr Ala Ser Ile Met Pro Ser Trp Ile Gln Arg Arg 370 375 380 Val Glu Glu Thr Pro Trp Val Tyr Ala Glu Ile Gly Lys Glu Leu Arg 385 390 395 400 Leu Ser Ser Arg Asp Ser Pro His Leu Ser Ser Ile Asn Val Ala Thr 405 410 415 Cys His Glu Leu Lys Thr Tyr Leu His Leu Val Asp Gly Phe Val Ser 420 425 430 Ser Thr Cys Pro Phe Arg Glu Thr Ala Arg Arg Val Leu His Arg 435 440 445 <210> 3 <211> 3422 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> promoter <222> (1)..(3422) <400> 3 aagcttcttt attacccaat taagtaaata tcccaaacaa ttccattttg catgtaaact 60 taatgtcact attccctaaa ttaaattaca caaaattgca gtgtatgtta tgatgattgt 120 ttgatacttt attccctcct agatattatc ttaaagatca acctttgtgt tgagtaattt 180 cgttgtatag gcttgtggaa tatatacttc aattcttatc agaccataga gtcagatcat 240 ttccacgaat ccttatagaa acatttagtt atgaaataaa acacatccga aataactagc 300 tattagatat aagaaaaaat ttaaaaatat tattgctcat cacagatttt ggaaaaatat 360 atattcatct aatcatgtta atagtcgcca tatatatacg cacattattg ttaaattgaa 420 caatctttgt aaaattatgt ttgttttgaa tattcttata aacatagaga aaattgcata 480 ttatctgttt gtaatgaaac gtatatttat tatatataga ccgatataca ataaagtagc 540 tagtaatagt attgaacaac aattgatcac caaaagaaag ttgttagctg gcttctgatg 600 gtttaacggc tcagttatga cttattcgag ctgcaccaga tactgttagc ttgctttagt 660 cgactttttt ttttttttaa caaacaaatg aaaatagtcg ttaagaagga cttcattgtt 720 agctactaac atacattcat tcatttgggt tatattatgc atgtagaaaa ctcatatgat 780 aaaatgtgcc gaatcgagcc taacaaacag gggacatggc agtaaatata gttataaatt 840 ttcttacacc ctattacaga gaaaggtgaa ttttgttttt tttgtcacag tgaaatttgt 900 ttatatattg aaatatttat acatgcataa actataaact atagttataa gtgtaattgt 960 ctctctttgc cctttttctt tatttcaaga atggtagctt aagtatataa gttttacttg 1020 taaataagtt ttggtagtat atagaagaat ccgagtagaa aactcatact aagtactata 1080 gagcatgaga aataagaaat tcataatgta gtttatcgta tgagttgact ggatgataga 1140 taccataaat atattaagtt aaaagattct actaaacgaa gaccaactgc aaagctacgt 1200 atatatttat ccactgcgta aactaaactt tttctctaca tcgatctctc aatctttggt 1260 cggttcactt tacaaatcat aaatatataa gagtcggttt agttctttac aaaaaatcaa 1320 catcgatcaa agttgatgtc atggctatca ctccattctt ctctgttggc ctcctttaaa 1380 atttacctct taattttctt ttggtatgga aagaagaaat actctttaat gttttccgta 1440 acaacgtgga caaatggtcc cgaaagaaga aatggccaat gtaaatgata ttgaaatagt 1500 cccatcggaa aaaagagtga agaaattaaa cattataaag aaccaattaa tggcttttgt 1560 ggtgtgtagt attgtgtcca caaatatatg aatggtcacg ttggtttgat atatccaaaa 1620 cgatgacatt taaatcgggg aatgtaagta aagtacgtgt cataaccaat agttctaaag 1680 tggtgcatgc aatttttgtt tattacaaaa caagaaattt gttcccaatc gattggaaca 1740 ccaaatcact ttaattgctt aagcactttg atcgtattcc taacgaagac attttccacg 1800 cgttccatgt gcatctcctc ctcagtatct atggtttatc gtgtaaatta aaactccttt 1860 cttcaagtta gttcatagtc tacataattc tttttactgc atataacata taatattctg 1920 taagatatca agaatctaaa agtgttttta ttactagtgt cccacgtggg taacatttga 1980 aatgcattca aacgatgtga taatgtgaaa tgcttaaaag tatatagagt taaaacagtc 2040 tttcagaaat cacgatggtt atcaatacaa tataaagaaa atattgcaaa acagctaaga 2100 ctctaatagg atttataaat gaaaagaggc tatatgttat taaaaagcac aagactaata 2160 tataaagagc tacgacatgt gatgtgaaat tcaaatagta agtaactcac gttgcacttc 2220 ttttattcgt cgttttgccc gaacaacaca tcactccaac ttatttaatt ggacttattc 2280 tgttacccgc gatataggct agcaagataa atttcatcgc gacatttcat atcttgatca 2340 ttctgcctta ttcaatggat tcattcaacc attctctgct catttggata tgatcattta 2400 cacttacatt ttatatttag attctaagtc gataactaat tttaagattg ttatatgttg 2460 cttttatacg tagacataaa acttgtcgtt aattgtataa aaacaatatg ctagaagcct 2520 agaagggcgt gggaatatag gaggtgtata cttcgtactt tccttgagca ttcaaattca 2580 gcaattggcg gcgaatggct aaagccgaaa gtaccaaatc cagccgatat gagccgagtc 2640 gagctggtga tagttcctca cgtgtcaaag cctttctgag ccgtattgtt tgagaactcc 2700 cacgtgtcca gtcccatcga aaacgacggt cagatattta tttcgataca cacttctttc 2760 tcttctcata tcatctcagc cgtccatttc tcttagtctc attatcatac atttacttct 2820 tctttttttt tttggtcacc aattcggtta aatccttttt tttttgtaaa tataagtcac 2880 attaaaaaag agagtaaaaa cgtgatgtca aaaacacaac taataacgta gaatccattc 2940 atgatcccaa atattgattt cacattgtct ttatggtcca tgttagttaa gtaaaagaaa 3000 gaaagagcaa acatagctta tgtgtaccac ataatcattt atatagtatt gaaactttgt 3060 caaagattgt actcattctt catagaataa aatatacaaa cccagctatt gttagctttc 3120 taatttggta catttattgc ttttacatac acgaaaacta cttgaaatcc tacatacaca 3180 aacgagtacc aatgtgtgta tttgggtatt agatataaat tcatatactt atataagcac 3240 tgtccacaat tttcagagtc gagtcctttc attttcaaca atctctttaa ctccactata 3300 gatcccaact tttctcacta taaaaggaac ccatttcctc tttccttcaa tcactttatc 3360 ttcttacacc aaatctatct tcaagacttc aacatactcc attctctata tacaaccttt 3420 tt 3422

【図面の簡単な説明】

【図１】T-DNAタギングに使用した遺伝子導入ベクター
の図。

【図２】野生型（WS）およびdad1突然変異体の花および
葯の形態を示す写真。

【図３】DAD1遺伝子クローニングの概要を示す図。

【図４】相補性実験に用いた遺伝子導入ベクターの構造
を示す図。

【図５】アンチセンスDAD1遺伝子植物導入ベクターの構
造を示す図。

【図６】アンチセンスDAD1を形質転換したシロイヌナズ
ナの花および葯の形態を示す写真。

【図７】プロモーター−GUS遺伝子導入ベクターの構造
を示す図。

【図８】DAD1遺伝子をプローブにしたサザンハイブリダ
イゼーションの結果を示す図。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１２年６月１６日（２０００．６．１
６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２

【補正方法】変更

【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 小田 明子 愛知県岡崎市明大寺町字西郷中38番地 岡 崎国立共同研究機構基礎生物学研究所 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA07 CA08 CA17 CA19 CB02 CD06 CD13 CD14 CD17 CG01 HA01 4B024 AA08 BA80 CA04 EA04 4B065 AA88X AA88Y AB01 BA16 CA24 CA53

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)又は(b)の塩基配列により表さ
   れ、プロモーター活性を有するDNA。 (a) 配列番号３に記載の塩基配列 (b) 配列番号３に記載の塩基配列において、１若しくは
   複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列
2. 【請求項２】 以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
   するDNA。 (a) 配列番号２に記載のアミノ酸配列により表されるタ
   ンパク質 (b) 配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しく
   は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列により表され、葯の裂開を制御する機能を有
   するタンパク質
3. 【請求項３】 請求項２記載のDNAと相補的な塩基配列
   により表されるDNA。
4. 【請求項４】 請求項２記載のDNAの発現が抑制されて
   いることを特徴とする雄性不稔植物。
5. 【請求項５】 請求項２記載のDNAの発現を抑制するこ
   とを特徴とする雄性不稔植物の作出方法。
6. 【請求項６】 請求項４記載の雄性不稔植物をジャスモ
   ン酸、リノレン酸、又はそれらの誘導体で処理すること
   を特徴とする稔性回復方法。