JP2000245479A

JP2000245479A - 新規なα−ガラクトシダーゼ遺伝子

Info

Publication number: JP2000245479A
Application number: JP11057729A
Authority: JP
Inventors: Kunio Omiya; 邦雄大宮; Kazuo Sakka; 和郎粟冠; Tetsuya Kimura; 哲哉木村; Shuichi Karita; 修一苅田
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 1999-03-04
Filing date: 1999-03-04
Publication date: 2000-09-12

Abstract

(57)【要約】【課題】新規なα-ガラクトシダーゼの提供。【解決手段】以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質。 (b)配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列
を含むタンパク質 (b) 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列
において少なくとも１個のアミノ酸配列からなり、かつ
α-ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、絶対嫌気性菌由来
の新規なα-ガラクトシダーゼタンパク質、該タンパク
質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベク
ター、該組換えベクターを含む形質転換体、該形質転換
体を用いる前記タンパク質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】α-ガラクトシダーゼは、細菌、カビ、
酵母、植物、動物に広く存在し、α-D-ガラクトシド結
合を加水分解してＤ-ガラクトースを遊離させる反応を
触媒する酵素である。この酵素は、還元二糖のメリビオ
ースを加水分解する酵素(メリビアーゼ)として酵母から
抽出されて以来、様々な生物由来のものが単離され、研
究されている。そしてα-ガラクトシダーゼは、甜菜糖
製造工業における製糖工程において、ショ糖の結晶作用
を阻害する糖液中のラフィノースを分解除去するために
用いられている。

【０００３】特に、グアー、ムラサキウマゴヤシ、コー
ヒー、及びコロハの植物体由来のα-ガラクトシダーゼ
[特公平4-34398、特公平8-22396]、ペニシリウム(Penic
illium)属に属するカビ由来のα-ガラクトシダーゼ[特
公平7-36752]、モルティエレラ(Mortierella)属に属す
るカビ由来のα-ガラクトシダーゼ[特開昭61-274695]、
高度好熱菌サーモトガ(Thermotoga)属に属する細菌由来
のα-ガラクトシダーゼ[Biotec. Bioeng., 52, 332, 19
96]、アスペルギルス(Aspergillus)属に属するカビ由来
のα-ガラクトシダーゼ[Biochem. Soc. Trans. 19, 269
S, 1991; EP-A-0121960]、及びモナスカス(Monascus)属
に属するカビ由来のα-ガラクトシダーゼ [Appl. Envir
on. Microbiol. 52, 1147,1986]は、グアーガムのガラ
クトマンナンに、直接作用してガラクトースの遊離活性
を示すことが明らかとなっており、食品加工、及びグア
ーガム改質などの産業用途への利用が期待されている。

【０００４】また、α-ガラクトシダーゼをコードする
遺伝子については、大腸菌[NucleicAcid Res. 23, 210
5,1995]、酵母[Yeast 10: 1559, 1994]、クロコウジカ
ビ[Mol. Gen. Genet.233,404, 1992; 特表平8-50864
4]、ストレプトコッカス・ミュッタンス(Streptococcus
mutans)[J. Gen. Microbiol. 137, 757, 1991]、グア
ー種子[Plant Mol. Biol. 13, 541, 1989; 特公平 8-2
2396]、コーヒーアラビカ[Gene 140, 227, 1994]、ネズ
ミ[Gene 166, 277, 1995]、及びヒト[Nucleic Acids Re
s. 17, 3301, 1989]由来のものが、既にクローニングさ
れ塩基配列が決定されている。このように、α-ガラク
トシダーゼは、好気性(通性)菌、植物、動物由来のもの
については知られているものの、絶対嫌気性菌由来のも
のについては知られていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、絶対嫌気性
菌由来の新規なα-ガラクトシダーゼタンパク質、該タ
ンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換
えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該形
質転換体を用いる前記タンパク質の製造方法を提供する
ことを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意研究を行った結果、絶対嫌気性菌ク
ロストリジウム・ジョースイ(Clostridium josui)のエ
ンドグルカナーゼ遺伝子(celA)上流に、α-ガラクトシ
ダーゼ遺伝子(agaA)が存在することを見出し、本発明を
完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、以下の(a)又は(b)の
組換えタンパク質である。 (a) 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列
を含むタンパク質 (b) 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列
において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しく
は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα-ガラクト
シダーゼ活性を有するタンパク質

【０００８】さらに、本発明は、以下の(a)又は(b)の組
換えタンパク質をコードする遺伝子である。 (a) 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列
を含むタンパク質 (b) 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列
において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しく
は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα-ガラクト
シダーゼ活性を有するタンパク質

【０００９】さらに、本発明は、以下の(c)又は(d)のDN
Aを含む遺伝子である。 (c) 配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列を含
むDNA (d) 配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列を含
むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつα-ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
をコードするDNA さらに、本発明は、前記の遺伝子を含有する組換えベク
ターである。さらに、本発明は、前記の組換えベクター
を含む形質転換体である。

【００１０】さらに、本発明は、前記の形質転換体を培
地に培養し、得られる培養物からα-ガラクトシダーゼ
活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、
該タンパク質の製造方法である。さらに、本発明は、ク
ロストリジウム属に属する細菌(例えばクロストリジウ
ム・ジョースイなど)を培地に培養し、得られる培養物
からα-ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質を採
取することを特徴とする、該タンパク質の製造方法であ
る。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明者らは、絶対嫌気性菌クロ
ストリジウム・ジョースイのエンドグルカナーゼ遺伝子
(celA遺伝子ともいう)をクローニングする過程で、該遺
伝子の上流に、α-ガラクトシダーゼ遺伝子と相同性の
高い領域を見出した。そして、その領域の塩基配列に関
してデータベース検索を行ったところ、該遺伝子はファ
ミリー27：クランGH-Dに属するα-ガラクトシダーゼ遺
伝子(agaA遺伝子という)であることがわかった。このag
aA遺伝子は、以下のようにしてクローニングすることが
できる。

【００１２】１．agaA遺伝子のクローニング (1)ゲノムDNAライブラリーの調製ゲノムDNAの採取源としては、クロストリジウム属に属
する細菌(例えば、クロストリジウム・ジョースイなど)
が挙げれる。ゲノムDNAは、GS培地、PY培地、VL培地な
どを用いて、嫌気培養したクロストリジウム属に属する
細菌から、通常行われる手法により調製することができ
る。例えば、嫌気条件下で液体培養により得られた菌体
を、遠心分離によって回収後、適切な緩衝液(例えばTE
バッファー)に懸濁し、次いで、界面活性剤(例えばSD
S、CTAB)などによる化学的処理法によって細胞を破壊
し、核酸を抽出する。次いで、リボヌクレアーゼ処理に
よりRNAを分解後、アルコール沈殿させることにより、
ゲノムDNAを調製することができる。

【００１３】次いで、得られたゲノムDNAを適当な制限
酵素(例えばEcoRIなど)で消化し、クロロホルム処理
後、エタノール沈殿によりDNA断片を回収する。得られ
たDNA断片をアガロース電気泳動などにより分画後、適
切なベクター(例えばλgt10、λgt11などのファージベ
クター、pBR322、pUC19などのプラスミドベクター、Law
rist4などのコスミドベクターなど)に連結する。最後
に、連結物を大腸菌(例えばXL1blue株、C600株、JM109
株など)に形質転換することにより、ゲノムDNAライブラ
リーを調製することができる。なお、本発明において用
いたクロストリジウム・ジョースイは、工業技術院生命
工学工業技術研究所(茨城県つくば市東1丁目1番3号)
に、FERM P-9684株として寄託されている。

【００１４】(2)本発明のagaA遺伝子のクローニング本発明のagaA遺伝子は、クロストリジウム属に属する細
菌のゲノムDNAにおいて、celA遺伝子の上流に隣接して
存在しているため、celA遺伝子を指標として、上記(1)
において得られた形質転換体の中からagaA遺伝子保有株
をスクリーニングすることができる。すなわち、celA遺
伝子の一部又は全部の領域を³²P、³⁵S又はビオチン等で
標識したプローブを、形質転換体のDNAを変性固定した
ニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、ポ
ジティブ株を検索することにより行う。また、celA遺伝
子はエンドグルカナーゼをコードしているため、この遺
伝子を発現するようになった形質転換体は、カルボキシ
メチルセルロース(CMC)分解能を獲得する。従って、形
質転換体の生物活性によっても、ポジティブ株を検索す
ることができる。すなわち、ゲノムDNA断片を保有する
形質転換体を固体培地に播種し、一定時間培養する。そ
して培地上にCMCを含有する培地を重層後さらに培養を
行う。得られた培地にCMC染色色素(例えばコンゴーレッ
ド)を吹きつける。ここで、CMC分解能を獲得した形質転
換体の周辺には、CMCが分解したために色素で染色され
なかったクリアゾーンが形成される。従って、そのよう
な株を検索することによりポジティブ株を選択する。

【００１５】次いで、常法にしたがって、得られたポジ
ティブ株から挿入DNA断片を調製し塩基配列の決定を行
う。塩基配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾
法、又はM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド
鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常
は自動塩基配列決定機（例えばファルマシア社製ALFII
型DNAシークエンサー等）を用いて配列決定が行われ
る。そして決定された塩基配列は、DNASISなどのDNA解
析ソフトを用いてオープンリーディングフレームの検索
がなされ、得られた推定アミノ酸配列について、データ
ベース検索を行うことにより、公知のタンパク質とのホ
モロジーを調べることができる。

【００１６】配列番号１に本発明のagaA遺伝子の塩基配
列を、配列番号２に本発明のagaAタンパク質のアミノ酸
配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパク
質がα-ガラクトシダーゼ活性を有する限り、当該アミ
ノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸に欠失、置
換、付加等の変異が生じてもよい。例えば、配列番号２
で表されるアミノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは
１〜20個程度、さらに好ましくは１〜10個のアミノ酸が
欠失してもよく、又は、配列番号２で表わされるアミノ
酸配列に少なくとも１個、好ましくは１〜20個程度、さ
らに好ましくは１〜10個のアミノ酸が付加してもよく、
あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の少なく
とも１個、好ましくは１〜20個程度、さらに好ましくは
１〜10個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。

【００１７】また、上記遺伝子とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズすることができるDNAも本発明の
遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、例え
ば、ナトリウム濃度が15〜150mM、好ましくは15〜30mM
であり、温度が37〜80℃、好ましくは50〜65℃での条件
をいう。なお、遺伝子に変異を導入するには、Kunkel
法、 Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる
方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用し
た変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）、M
utant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKAR
A社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを
用いて行うことができる。

【００１８】一旦、本発明の遺伝子の塩基配列が確定さ
れると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のcD
NA又はゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該
塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダ
イズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることがで
きる。例えば、本発明のα-ガラクトシダーゼの全長ア
ミノ酸配列をコードする遺伝子は、クロストリジウム・
ジョースイのゲノムDNAを鋳型として、5'-TGAATTCATGAA
AAAAATCAAACGCCT-3'(配列番号５)及び5'-TGGATCCTGGCTT
GATTTTACTTGCTG-3'(配列番号６)の塩基配列を有するプ
ライマーを用いることによりPCRによって調製すること
ができる。また、α-ガラクトシダーゼの触媒ドメイン
のみをコードする遺伝子は、クロストリジウム・ジョー
スイのゲノムDNAを鋳型として、5'-TTGAATTCGGTGTTTATC
TCACCATTTC-3'(配列番号７)及び5'-TAAGCTTGCTTGTACTTT
TAGTACCACT-3' (配列番号８)の塩基配列を有するプライ
マーを用いることによって、PCRにより調製することが
できる。但し、本発明においては、プライマーはこれら
に限定されるものではない。

【００１９】２．組換えベクター及び形質転換体の作製 (1) 組換えベクターの作製本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で
複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラ
スミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。プラスミド
DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR32
2、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pCBD-C
等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5
等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YEp24、YCp
50、YIp30等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλ
ファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワ
クシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイル
ス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いる
こともできる。

【００２０】ベクターに本発明の遺伝子を挿入するに
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニ
ングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採
用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮
されるようにベクターに組み込まれることが必要であ
る。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本
発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシ
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シ
グナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）
などを含有するものを連結することができる。なお、選
択マーカーとしては、例えばアンピシリン耐性遺伝子、
ネオマイシン耐性遺伝子ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、
等が挙げられる。

【００２１】(2) 形質転換体の作製本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目
的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ
り得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の
DNAを発現できるものであれば特に限定されるものでは
ない。例えば、大腸菌(Escherichia coli）等のエシェ
リヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)
等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas
putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテ
ィ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌
が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyc
es cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizos
accharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、COS細胞、CH
O細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはSf9、Sf21等の
昆虫細胞が挙げられる。

【００２２】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ま
しい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれて
いてもよい。大腸菌としては、例えばエシェリヒア・コ
リ(Escherichia coli)K12、DH1などが挙げられ、枯草菌
としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subt
ilis)MI 114、207-21などが挙げられる。

【００２３】プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中
で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例え
ばtrpプロモーター、lacプロモーター、P_Lプロモータ
ー、P_Rプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来す
るプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどの
ように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いて
もよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、
細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるもの
ではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohe
n, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2
110(1972)]、エレクトロポレーション法等が挙げられ
る。

【００２４】酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾ
サッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pomb
e)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用い
られる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現
できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモ
ーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク
質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモータ
ー、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモー
ター、AOX1プロモーター等が挙げられる。

【００２５】酵母への組換えベクターの導入方法として
は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定され
ず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M. et
al.：Methods. Enzymol., 194： 182(1990)]、スフェ
ロプラスト法[Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad.
Sci., USA, 75： 1929(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh,
H.：J. Bacteriol., 153：163(1983)]等が挙げられる。

【００２６】動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞CO
S-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウスL細胞、ヒトGH3、ヒトFL細胞などが用いら
れる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロ
モーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用い
られ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プ
ロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベク
ターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーショ
ン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙
げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf2
1細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクター
の導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポ
フェクション法、エレクトロポレーション法などが用い
られる。

【００２７】３．本発明のタンパク質の製造本発明のタンパク質は、本発明のα-ガラクトシダーゼ
遺伝子又はα-ガラクトシダーゼの触媒ドメイン遺伝子
によりコードされるアミノ酸配列を有するもの、または
該アミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸に前
記変異が導入されたアミノ酸配列を有するものをいう。
さらに、これらのタンパク質とセルロース結合タンパク
質又はβ-ガラクトシダーゼタンパク質との融合タンパ
ク質も本発明のタンパク質に含まれる。本発明のタンパ
ク質は、クロストリジウム属に属する細菌又は前記２に
おいて得られた形質転換体の培養物から、以下のように
して製造することができる。ここで、「培養物」とは、
培養後の培地上清、培養により得られた細胞若しくは細
胞の破砕物のいずれをも意味するものである。クロスト
リジウム属に属する細菌(例えばクロストリジウム・ジ
ョースイ)又は前記２において得られた形質転換体を培
養する方法は、それらの細胞の培養に用いられる通常の
方法に従って行われる。

【００２８】培地としては、前記細胞が資化し得る炭素
源、窒素源、無機塩類等を含有し、該細胞の培養を効率
的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培
地のいずれを用いてもよい。ここで、炭素源としては、
グルコース、フラクトース、スクロース、デキストリ
ン、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有
機酸、グリセロール、エタノール、プロパノール等のア
ルコール類、動物油、糖蜜などが用いられる。また、窒
素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等
の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の
含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、麦芽エキス、コーンスティープリカー等が用いられ
る。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウ
ム、カルシウム、マグネシウム、マンガン、コバルト、
亜鉛、鉄、モリブデン等の陽イオン、及び硫酸、リン
酸、塩酸、硝酸などの陰イオンの塩が用いられる。

【００２９】また、クロストリジウム属に属する細菌な
どを嫌気培養する場合にはシステインなどの還元作用を
有する物質を培地に添加し、菌の接種は培養器上部の空
間に残存する酸素を窒素パージ等で十分除去した後に行
うことが好ましい。そして嫌気性菌の培養は、嫌気ボッ
クス、嫌気ジャー、ブチルゴム栓付き試験管などで行
う。さらに、形質転換体を培養する場合には、必要に応
じて培地にアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物
質を添加してもよい。そして、前記細胞のα-ガラクト
シダーゼ活性が最高値に達するまで培養を行う。

【００３０】さらに、クロストリジウム属に属する細菌
などを培養する場合には、グアーガムなどのガラクトマ
ンナン、ラクトース、メリビオース、ラフィノース等の
ガラクトシド又はイソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド
を添加すると細胞当りのα-ガラクトシダーゼ活性を上
昇させることができる場合があるため、必要に応じてこ
れらの物質を添加する。さらに、形質転換体の培養にお
いて、その形質転換体が誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換されたものである場合には、必
要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例
えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転
換された微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-
チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロモーター
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
ときにはインドールアクリル酸(IAA)等を培地に添加し
てもよい。

【００３１】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添
加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％CO₂存
在下、37℃で１〜30日行う。培養中は必要に応じてカナ
マイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加しても
よい。

【００３２】培養後、本発明のα-ガラクトシダーゼタ
ンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌
体又は細胞を破砕することによりα-ガラクトシダーゼ
タンパク質を抽出する。菌体の破砕は、超音波、フレン
チプレス、ガラスビーズを使用するホモジナイザーなど
を用いることができるが、リゾチームや凍結融解法との
併用によって行うこともできる。また、本発明のα-ガ
ラクトシダーゼタンパク質が菌体外又は細胞外に生産さ
れる場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離
等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質
の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば
硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜
組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発
明のタンパク質を単離精製することができる。

【００３３】なお、本発明のα-ガラクトシダーゼは、
その下流域に、現在までに知られているα-ガラクトシ
ダーゼには見られないドックリン配列を有している(図
２)。一般的に、ドックリン配列は、クロストリジウム
属に属する細菌によって生産される骨格タンパク質に結
合することが知られている[Kakiuchi,M.ら：J.Bacterio
l. 180:4303-4308(1998)]。従って、この骨格タンパク
質をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィー
によって、本発明タンパク質は容易に精製することがで
きる。なお、リガンドとして用いることができる骨格タ
ンパク質は、常法によって調製することができる。すな
わち、まず骨格タンパク質をコードする遺伝子を、その
塩基配列[Kakiuchi,M.ら：J.Bacteriol. 180:4303-4308
(1998)]に基づいて設計したプライマーを用い、クロス
トリジウム・ジョースイ由来のゲノムDNAを鋳型とし
て、PCRにより増幅する。得られた増幅断片を適当な発
現ベクターに連結し、その発現ベクターを大腸菌などの
宿主に形質転換する。次いで、その形質転換体を培養
し、得られた培養物から精製することによって調製する
ことができる。

【００３４】４．α-ガラクトシダーゼ活性の測定 α-ガラクトシダーゼの活性は以下のようにして測定す
ることができる。すなわち、酵素溶液をα-D-メリビオ
ースなどの二糖やD-ラフィノースなどの三糖に作用させ
て、生成したα-D-ガラクトシドを薄層クロマトグラフ
ィーなどにより検出することにより行う。また、パラニ
トロフェニル-α-ガラクトシドなどの合成基質に酵素溶
液を作用させて、遊離したパラニトロフェノールの量を
分光光度計を用いて測定することによっても行うことが
できる。

【００３５】５．本発明のタンパク質に対する抗体本発明においては、本発明のタンパク質に対する抗体を
作製することもできる。「抗体」とは、抗原である本発
明のペプチドに結合し得る抗体分子全体またはその断片
(例えば、FabまたはF(ab')₂断片)を意味し、ポリクロー
ナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよ
い。本発明の抗体は、種々の方法のいずれかによって製
造することができる。このような抗体の製造法は当該分
野で周知である[例えばSambrook, J et al., Molecular
Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press(198
9)を参照]。

【００３６】(1) 本発明のタンパク質に対するポリクロ
ーナル抗体の作製前記のようにして、遺伝子工学的に作製した本発明のα
-ガラクトシダーゼタンパク質又はその断片を抗原とし
て、これを哺乳動物、例えばヒト、マウス、ウサギなど
に投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュ
バントを用いないときは１〜５mgであり、アジュバント
を用いるときは50〜100μgである。アジュバントとして
は、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不
完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバ
ント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、
腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の
間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好まし
くは２〜４週間間隔で、２〜５回、好ましくは３〜４回
免疫を行う。そして、最終の免疫日から12〜16日後に、
好ましくは、酵素免疫測定法(EIA； enzyme immunoassa
y)、放射性免疫測定法(RIA；radioimmuno assay)等で抗
体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血
清を得る。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合
は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル
濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の
方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることに
より精製することができる。

【００３７】(2) 本発明のタンパク質に対するモノクロ
ーナル抗体の作製 (i) 抗体産生細胞の採取前記のようにして、遺伝子工学的に作製した本発明のタ
ンパク質又はその断片を抗原として、哺乳動物、例えば
ラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１
匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは１
〜５mgであり、アジュバントを用いるときは25〜100μg
である。アジュバントとしては、フロイント完全アジュ
バント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水
酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫
は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することによ
り行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日
から数週間間隔で、好ましくは２〜４週間間隔で、２〜
５回、好ましくは３〜４回免疫を行う。そして、最終の
免疫日から12〜16日後、好ましくは14日後に抗体産生細
胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リン
パ節細胞、抹消血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は
局所リンパ節細胞が好ましい。

【００３８】(ii)細胞融合ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ
細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミ
エローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可
能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株
としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選
択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを
含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態での
み生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ
細胞としては、例えば P3X63-Ag.8.U1(P3U1)、Sp2/O、N
S-Iなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。

【００３９】次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞
とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないDME
M、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体
産生細胞とミエローマ細胞とを４：１〜１：４の割合で
混合し、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。
細胞融合促進剤として、平均分子量1,500ダルトンのポ
リエチレングリコール等を使用することができる。ま
た、電気刺激(例えばエレクトロポレーション)を利用し
た市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエロー
マ細胞とを融合させることもできる。

【００４０】(iii) ハイブリドーマの選別及びクローニ
ング細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを
選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎
児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイク
ロタイタープレート上に0.8個/ウエル程度まき、各ウエ
ルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培
養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、約14日前
後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得るこ
とができる。

【００４１】次に、増殖してきたハイブリドーマの培養
上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリー
ニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常
の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイ
ブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の
一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等に
よって行うことができる。融合細胞のクローニングは、
限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体
産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。

【００４２】(iv)モノクローナル抗体の採取樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取
する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を
採用することができる。細胞培養法においては、ハイブ
リドーマを10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培
地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培
養条件(例えば37℃、５％CO₂濃度)で２〜10日間培養
し、その培養上清から抗体を取得する。

【００４３】腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来
の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約
１×10⁷個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させ
る。そして、１〜２週間後に腹水または血清を採集す
る。上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要と
される場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーな
どの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わ
せることにより精製することができる。

【００４４】このようにしてポリクローナル抗体又はモ
ノクローナル抗体が得られた後は、これをリガンドとし
て、固体担体に結合させることによりアフィニティーク
ロマトグラフィーカラムを作製し、そして該カラムを用
い、前記の採取源又は他の採取源から、本発明のα-ガ
ラクトシダーゼタンパク質を精製することができる。さ
らにこれらの抗体は本発明のα-ガラクトシダーゼタン
パク質を検出するためにウエスタンブロッティングに用
いることもできる。

【００４５】

【実施例】以下に、本発明を実施例を示して具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものでは
ない。〔実施例1〕agaA遺伝子のクローニング (1) ゲノムDNAの調製常法に従って、クロストリジウム・ジョースイ(Clostri
dium josui)のゲノムDNAを調製した。すなわち、クロス
トリジウム・ジョースイFERM P-9684株を、GS培地(0.5
％酵母エキス、0.5％セロビオース、0.1％システイン、
１％MOPS、0.15％KH₂PO₄、0.29％K₂HPO₄、0.13％(NH₄)₂
SO₄、0.2％MgSO₄、0.03％CaCl₂、pH7.4)で培養後、遠心
分離することにより菌体を回収した。得られた菌体をTE
バッファー(10mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM EDTA)に懸濁
し、これに10％SDS及び20mg/mlプロティナーゼKを加
え、37℃で１時間インキュベートした。次いで5M NaCl
を加えよく攪拌後、10％CTAB(セチルトリメチルアンモ
ニウムブロマイド)-0.7M NaClを加え、65℃で10分間イ
ンキュベートした。次いでクロロホルム／イソアミルア
ルコールを加えよく攪拌した後、10,000×ｇで５分間遠
心分離した。得られた上清を滅菌済遠心管に移し、２倍
容量のエチルアルコールを加え、室温に10分間放置し
た。次いで、10,000×gで10分間遠心分離後、上清を除
去し、残った白色の沈殿物をデシケーター中で乾燥させ
た。次いで、1,000μlのTEバッファーに懸濁し、２μl
の10mg/mlリボヌクレアーゼA溶液を加え、37℃で30分間
インキュベートした。100μlの３Ｍ酢酸ナトリウム(pH
8.0)及び2.2mlのエチルアルコールを加え、よく混合し
た後、10,000×gで10分間遠心分離し上清を除去した。
沈殿物をデシケーター中で乾燥させた後500μlのTEバッ
ファーに溶解させることによりゲノムDNAを得た。

【００４６】(2) ゲノムDNAライブラリーの調製上記(1)において得られたゲノムDNAを用い、クロストリ
ジウム・ジョースイのゲノムDNAライブラリーを調製し
た。すなわち、10μgのゲノムDNAを制限酵素EcoRIで切
断後、エタノール沈殿によって断片を回収した。次い
で、得られた両端にEcoRI制限酵素部位を有するゲノムD
NA断片を、クローニングベクターであるλgt11のEcoRI
部位にT4DNAリガーゼを用いて挿入した。反応は16℃で1
2時間行った。このライゲーション反応液全量(20μl)
を、ギガパックパッケージングキット (STRATAGENE社
製) を用いてin vitroパッケージングに供した。パッケ
ージングされた組換えバクテリオファージを含むパッケ
ージング溶液に大腸菌XL1 blue株を加え、37℃で30分間
培養した。得られた培養物をトップアガロース(１％ト
リプトン、0.8％NaCl、0.6％寒天)に加え、これを9.0cm
×1.5cm丸型シャーレ(イワキガラス社製)を用いて作製
したLBプレート(0.5％酵母エキス、1.0％トリプトン、
0.5％NaCl、1.5％寒天)上に、１枚当たり約2,000個のプ
ラークが形成されるように計15枚のプレートに播き、合
計約30,000個のプラークからなるライブラリーを作製し
た。

【００４７】(3) クローンの単離上記(2)において得られたファージライブラリーを含む
シャーレに、0.2％カルボキシメチルセルロースを含む
0.5％寒天３mlを重層し、さらに５時間培養した。その
後、重層寒天上にコンゴーレッド溶液約0.4mlを噴霧
し、カルボキシメチルセルロースを赤色に発色させた。
コンゴーレッドで染色されないプラークを掻き取りポジ
ティブクローンとした。

【００４８】(4) 挿入断片の増幅クローン化したファージをそれぞれプレーティングし、
37℃で12時間培養した。上層の軟寒天を掻き取り、遠心
分離した。遠心後の上清からウィザードラムダプレップ
キット(Promega社製)を用いてファージDNAを精製した。
得られたファージDNAをEcoRI消化した後、挿入DNA断片
をpUC19のEcoRI部位に挿入した。得られた組換えプラス
ミドpCjAgaAを大腸菌BL21に形質転換し増幅した。

【００４９】(5) 挿入断片の塩基配列決定上記(4)で調製した大腸菌から組換えプラスミドpCjAgaA
を分離精製後、EcoRIで切断し、ベクターpBlueScriptII
SK(-) (Stratagene社製)のEcoRI部位に挿入断片を連結
した。得られたクローンの塩基配列を、Bca BEST^TMシー
クエンスコアキット(TAKARA社製)を用い、蛍光自動DNA
シーケンサー(ファルマシア社製、ALF IIシークエンサ
ー)により解析した。その結果、478個の推定アミノ酸配
列を有する(配列番号２)、1434bpの長さを有する遺伝子
が得られた(配列番号１）。データベース検索の結果、
このアミノ酸配列(Cj AgaA)は、図１に示したようにダ
イズのメリビアーゼ(U12926)と56.8％、グアーのメリビ
アーゼ(A12675)と56.3％、コーヒーアラビカのメリビア
ーゼ(Q42656)と57.1％のホモロジーを有し、ファミリー
27:クランGH-Dに属する新規なα-ガラクトシダーゼをコ
ードしていることが判明した。そこで本遺伝子をagaA遺
伝子と命名した。また、このアミノ酸配列を詳細に調べ
たところその下流域には、図２に示したように、クロシ
トリジウム・ジョースイ由来のセルラーゼ(Cj CelB、Cj
CelB)やクロストリジウム・セルロリチカム(Clostridi
um cellulolyticum)由来のセルラーゼ(Cc CelA、CelC)
に見られるものと相同性の高いドックリン配列が存在し
ていることを見出した。

【００５０】〔実施例２〕α-ガラクトシダーゼ触媒ド
メイン−セルロース結合ドメイン融合タンパク質の調製 (1)α-ガラクトシダーゼ触媒ドメイン遺伝子増幅用プラ
イマーの作製 α-ガラクトシダーゼ触媒ドメインをコードする遺伝子
を増幅するためのプライマーを合成した。すなわち、セ
ンス鎖については、5'末端にEcoRI制限酵素部位を付加
した5'-TTGAATTCGGTGTTTATCTCACCATTTC-3'(配列番号７)
の配列を有する合成プライマーEcoCjMAを、アンチセン
ス鎖については、5'末端にHindIII制限酵素部位を付加
した5'-TAAGCTTGCTTGTACTTTTAGTACCACT-3'(配列番号８)
の配列を有する合成プライマーHindCjMAを作製した。な
お、合成オリゴヌクレオチドは、全自動DNA合成機(PERK
IN-ELMER社製)を使用して化学合成した。

【００５１】(2) PCRによるα-ガラクトシダーゼ触媒ド
メイン遺伝子の増幅 α-ガラクトシダーゼ触媒ドメインをコードする遺伝子
をPCRを用いて調製した。すなわち、まず、実施例１に
おいて得られたプラスミドpCjAgaAを鋳型として、上記
(1)において合成したプライマーを用い、PCRによりα-
ガラクトシダーゼの触媒ドメインと推定される領域を増
幅した。PCRの反応液の組成は以下の通りである。

【００５２】プラスミドDNA溶液(pCjAgaA) １μl 10×PCR緩衝液(15mM MgCl₂含、TOYOBO社製) 10μl 10mM dNTPミックス４μl 0.5μMプライマー(センス) １μl 0.5μMプライマー(アンチセンス) １μl 滅菌水 82μl ４U/μl Taqポリメラーゼ(TAKARA社製) １μl 全量 100μl

【００５３】上記反応液を、よく混合後、96℃で15秒間
の熱変性、50℃で15秒間のアニーリング、72℃で１分間
の伸長反応の条件を１サイクルとして、30サイクル行っ
た。反応終了後、フェノール／クロロホルム処理、エタ
ノール沈殿を行うことによりPCR産物を得た。

【００５４】(3) α-ガラクトシダーゼ触媒ドメイン−
セルロース結合ドメイン融合タンパク質発現ベクターの
構築 α-ガラクトシダーゼ触媒ドメイン−セルロース結合ド
メイン融合タンパク質を発現するためのベクターを構築
した。すなわち、まずセルロース結合ドメイン(Cellulo
se Binding Domain；CBD)をコードする領域を含む発現
用ベクターpCBD-C[Shuichi K.ら：J.Ferm.Bioeng. 84
(4):354-357(1997)]を、EcoRI及びHindIIIで消化後、エ
タノール沈殿により回収した。また、上記(2)において
得られたPCR産物もEcoRI及びHindIIIで消化し、エタノ
ール沈殿により該DNA断片を回収した。次いで、得られ
たEcoRI-HindIII消化したPCR産物を、先のEcoRI-HindII
I消化した発現用ベクターpCBD-Cと混合し、５単位T4DNA
リガーゼを用い、18℃で４時間反応させることにより連
結した。次いで得られた連結物を大腸菌JM109にエレク
トロポレーションによって形質転換後、得られた形質転
換物を、アンピシリンを含む培地に播種した。次いで37
℃で一晩培養後、出現したコロニー由来の細胞を、LB培
地によって培養後、プラスミドを抽出し、制限酵素消化
分析によって、α-ガラクトシダーゼ触媒ドメイン−セ
ルロース結合ドメインコード領域を含むα-ガラクトシ
ダーゼ触媒ドメイン−セルロース結合ドメイン融合タン
パク質発現ベクターpAgaA-CBDを得た。

【００５５】(4) agaA-CBD融合タンパク質の発現 agaA-CBD融合タンパク質を大腸菌において発現させた。
すなわち、上記(3)において得られたプラスミドpAgaA-C
BDを大腸菌BL21株に形質転換した。得られた形質転換体
を50μg/mlのアンピシリンを含む5ml LB培地で37℃、一
夜、振盪培養した。これを250mlの同培地に吸光度がA
₆₀₀=0.001になるように接種後、37℃で、振盪培養を行
い、A₆₀₀=0.5となった時点で、イソプロピルチオ-β-ガ
ラクトシド(IPTG)を１mMになるように添加した。引き続
いて、４時間、振盪培養を行った。IPTG添加の前後に採
取した細胞を用い、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳
動(SDS-PAGE)により、誘導された蛋白質を観察した。そ
の結果、agaA-CBD融合タンパク質と推定されるバンドが
検出された。

【００５６】(5) agaA触媒ドメイン-CBD融合タンパク質
の精製プラスミドpAgaA-CBDを含む大腸菌BL21を、750mlのLB培
地で培養し前記(4)と同様の手順でA₆₀₀=0.5の時点でIPT
Gを１mMになるように添加した。４時間培養後、菌体を
４℃、3,900×ｇ、10分間で集菌し、0.1Mリン酸カリウ
ム緩衝液ｐＨ７．０に懸濁後、超音波破砕処理を行
い、１６，０００×ｇ、15分の遠心上清を得た。遠心上
清に対しボールミルドセルロース(Ball-Milled Cellulo
se；BMC)３％を懸濁し0℃、10分間撹拌しながら放置後
1,800×ｇ、15分でBMCを回収した。

【００５７】BMCを0.1Mリン酸カリウム緩衝液 pH7.0で
洗浄した後、5％セロビオース含有10mMリン酸カリウム
緩衝液 pH7.0に懸濁し、吸着した融合蛋白質を遊離させ
1,800×ｇ、20分の遠心分離によりBMCを除去した。遠心
上清中の蛋白質濃度をブラッドフォード法により算出
し、その100分の１量のトリプシンを添加して一夜消化
する事によりセルロース結合ドメインを触媒ドメインか
ら遊離した。agaA触媒ドメイン-CBD融合蛋白質が効率よ
くBMCに吸着され、セロビオースにより特異的に遊離さ
れることを確認した。またトリプシンは融合蛋白質の触
媒ドメインとCBDとを特異的に切断することも明らかと
なった。このドックリン配列を持たない酵素蛋白質の分
子量はゲルろ過カラムにより、約40,000と測定され、ア
ミノ酸配列から推定される分子量41,542とほぼ一致し
た。

【００５８】(6) agaA触媒ドメインの活性特性二糖のα-Ｄ−メリビオース、三糖のＤ−ラフィノー
ス、ガラクトマンナンのグアーガムに対する前記(5)に
おいて得られたagaA触媒ドメインの作用を調べた。これ
ら基質の加水分解物の確認は110℃、30分熱処理したシ
リカゲル薄層クロマトグラフィー（SIL G-25 MACHERY-N
AGEL）を用いて行い、酵素反応は80μｌの1%(wt./vol.)
各基質溶液、40μｌ(0.8U) agaA触媒ドメイン含有10mM
燐酸カリウム溶液pH7.0、80μｌMcilvain氏緩衝液pH5.5
を混合し、35℃、24時間反応させた。

【００５９】薄層クロマトグラフィーの展開溶媒は１ー
プロパノール：ニトロメタン：水（5:2:3, vol/vol）を
用いた。展開後は風乾させ、硫酸噴霧、及び140℃、5分
の熱処理により発色させた。agaA触媒ドメインはα-Ｄ
−メリビオース、Ｄ−ラフィノース、及びグアーガムか
らいずれもα-Ｄ−ガラクトシドを遊離した。このこと
より、前記(5)において得られたagaA触媒ドメインは、
α-ガラクトシダーゼ活性を有していることが分かっ
た。

【００６０】

【発明の効果】本発明により、絶対嫌気性菌由来の新規
なα-ガラクトシダーゼタンパク質、該タンパク質をコ
ードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、
該組換えベクターを含む形質転換体、該形質転換体を用
いる前記タンパク質の製造方法が提供される。

【００６１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Rayon Co., Ltd. <120> Novel α-Galactosidase Gene <160> 8 <210> 1 <211> 1434 <212> DNA <213> Clostridium josui <220> <221> CDS <222> (1)..(1434) <400> 1 atg aaa aaa atc aaa cgc ctt ata gcc ttg gca att tta aca atg gtg 48 Met Lys Lys Ile Lys Arg Leu Ile Ala Leu Ala Ile Leu Thr Met Val 1 5 10 15 ttt atc tca cca ttt ccg gca tct gtc tta aat ttc aat caa gta atg 96 Phe Ile Ser Pro Phe Pro Ala Ser Val Leu Asn Phe Asn Gln Val Met 20 25 30 gcc ctg aac aac ggt ctg gga ttg act ccc cca atg ggt tgg aac agc 144 Ala Leu Asn Asn Gly Leu Gly Leu Thr Pro Pro Met Gly Trp Asn Ser 35 40 45 tgg aat ata ttt ggg ggt gac atc aac gaa gat aaa att aaa gaa att 192 Trp Asn Ile Phe Gly Gly Asp Ile Asn Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ile 50 55 60 gca gat gct atg gtt aca aca gga atg aag gat gca ggc tat gag tat 240 Ala Asp Ala Met Val Thr Thr Gly Met Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr 65 70 75 80 gta aat ctt gat gac aat tgg atg gca aac cct gca cgt gac gct aat 288 Val Asn Leu Asp Asp Asn Trp Met Ala Asn Pro Ala Arg Asp Ala Asn 85 90 95 gga aaa ctt att cca gac ccc aaa cgt ttt ccg agc gga atg aag gct 336 Gly Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Arg Phe Pro Ser Gly Met Lys Ala 100 105 110 ttg gca gat tat att cat tca aaa gga tta aaa ttt gga ata tat ggt 384 Leu Ala Asp Tyr Ile His Ser Lys Gly Leu Lys Phe Gly Ile Tyr Gly 115 120 125 gac agg gga gta acc act tgc tgc aat att ccc caa agt gga agt cag 432 Asp Arg Gly Val Thr Thr Cys Cys Asn Ile Pro Gln Ser Gly Ser Gln 130 135 140 gga tat gag gag caa gat gca aaa act ttt gct gaa tgg ggg ctg gac 480 Gly Tyr Glu Glu Gln Asp Ala Lys Thr Phe Ala Glu Trp Gly Leu Asp 145 150 155 160 tat tta aaa tat gat aac tgc gct tca gac agg aat ttg cag gca ggc 528 Tyr Leu Lys Tyr Asp Asn Cys Ala Ser Asp Arg Asn Leu Gln Ala Gly 165 170 175 tac gaa aaa atg agg gat gct ctt ttg aag aca ggg agg cct att ttt 576 Tyr Glu Lys Met Arg Asp Ala Leu Leu Lys Thr Gly Arg Pro Ile Phe 180 185 190 tac agc ata tgt tgc tgg tat ttt gca ggt ccg tgg atg gta gat tgc 624 Tyr Ser Ile Cys Cys Trp Tyr Phe Ala Gly Pro Trp Met Val Asp Cys 195 200 205 ggt aat tct tgg aga acc acg ggg gat ata agt gac agt tgg gga agc 672 Gly Asn Ser Trp Arg Thr Thr Gly Asp Ile Ser Asp Ser Trp Gly Ser 210 215 220 att ata agg aat att gac gaa aac tct aaa tca gcc gct tac gca ggt 720 Ile Ile Arg Asn Ile Asp Glu Asn Ser Lys Ser Ala Ala Tyr Ala Gly 225 230 235 240 cct ggg cat tgg aac gac cca gat atg ttg gag gtt ggt aat ggt aat 768 Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Glu Val Gly Asn Gly Asn 245 250 255 atg aca gac aca gaa tac aaa gcg cat ttc agc atg tgg tgt atg atg 816 Met Thr Asp Thr Glu Tyr Lys Ala His Phe Ser Met Trp Cys Met Met 260 265 270 gca gct cca ctt att gcc gga aat gat ctt aga aat atg aca cct gct 864 Ala Ala Pro Leu Ile Ala Gly Asn Asp Leu Arg Asn Met Thr Pro Ala 275 280 285 acc aaa gaa att ctt acc aac aaa gaa gtc att gct att gac caa gat 912 Thr Lys Glu Ile Leu Thr Asn Lys Glu Val Ile Ala Ile Asp Gln Asp 290 295 300 gcc gca gga gtg caa ggc act aag gta agt tct tca gga gaa ctt gaa 960 Ala Ala Gly Val Gln Gly Thr Lys Val Ser Ser Ser Gly Glu Leu Glu 305 310 315 320 gta tgg tgt aaa cct cta ggg aca gat ggt act acc aag gcg gtt gca 1008 Val Trp Cys Lys Pro Leu Gly Thr Asp Gly Thr Thr Lys Ala Val Ala 325 330 335 ctc tta aat aga gga gcc act tcg gca gat atc aca gtt aat tgg agt 1056 Leu Leu Asn Arg Gly Ala Thr Ser Ala Asp Ile Thr Val Asn Trp Ser 340 345 350 gat ata cag ctt gcc gat ggt cct gtc aca gtt cgt gat ctt tgg gag 1104 Asp Ile Gln Leu Ala Asp Gly Pro Val Thr Val Arg Asp Leu Trp Glu 355 360 365 cat aag gac tgc ggt acc ttt aac act ggg tat aca gcc aat gta ccg 1152 His Lys Asp Cys Gly Thr Phe Asn Thr Gly Tyr Thr Ala Asn Val Pro 370 375 380 tca cat ggt gta gtg gta cta aaa gta caa gca agc tcc act gat aca 1200 Ser His Gly Val Val Val Leu Lys Val Gln Ala Ser Ser Thr Asp Thr 385 390 395 400 aat ata gag ttt ggt gat gtt gac gga aat ggc atg att gac gca tta 1248 Asn Ile Glu Phe Gly Asp Val Asp Gly Asn Gly Met Ile Asp Ala Leu 405 410 415 gat tat tca tta gta aaa cgg tat ttg ctg ggc cag att tct gat tgt 1296 Asp Tyr Ser Leu Val Lys Arg Tyr Leu Leu Gly Gln Ile Ser Asp Cys 420 425 430 cct gat tca aaa ggc aag ctt gct gct gat gtt gat gga gac cag caa 1344 Pro Asp Ser Lys Gly Lys Leu Ala Ala Asp Val Asp Gly Asp Gln Gln 435 440 445 ata aca gca ctg gat ttt tca tta att aag caa tac tta ctt ggg act 1392 Ile Thr Ala Leu Asp Phe Ser Leu Ile Lys Gln Tyr Leu Leu Gly Thr 450 455 460 att aac aaa ttt cct gct caa aca gca agt aaa atc aag cca 1434 Ile Asn Lys Phe Pro Ala Gln Thr Ala Ser Lys Ile Lys Pro 465 470 475 <210> 2 <211> 478 <212> PRT <213> Clostridium josui <400> 2 Met Lys Lys Ile Lys Arg Leu Ile Ala Leu Ala Ile Leu Thr Met Val 1 5 10 15 Phe Ile Ser Pro Phe Pro Ala Ser Val Leu Asn Phe Asn Gln Val Met 20 25 30 Ala Leu Asn Asn Gly Leu Gly Leu Thr Pro Pro Met Gly Trp Asn Ser 35 40 45 Trp Asn Ile Phe Gly Gly Asp Ile Asn Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ile 50 55 60 Ala Asp Ala Met Val Thr Thr Gly Met Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr 65 70 75 80 Val Asn Leu Asp Asp Asn Trp Met Ala Asn Pro Ala Arg Asp Ala Asn 85 90 95 Gly Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Arg Phe Pro Ser Gly Met Lys Ala 100 105 110 Leu Ala Asp Tyr Ile His Ser Lys Gly Leu Lys Phe Gly Ile Tyr Gly 115 120 125 Asp Arg Gly Val Thr Thr Cys Cys Asn Ile Pro Gln Ser Gly Ser Gln 130 135 140 Gly Tyr Glu Glu Gln Asp Ala Lys Thr Phe Ala Glu Trp Gly Leu Asp 145 150 155 160 Tyr Leu Lys Tyr Asp Asn Cys Ala Ser Asp Arg Asn Leu Gln Ala Gly 165 170 175 Tyr Glu Lys Met Arg Asp Ala Leu Leu Lys Thr Gly Arg Pro Ile Phe 180 185 190 Tyr Ser Ile Cys Cys Trp Tyr Phe Ala Gly Pro Trp Met Val Asp Cys 195 200 205 Gly Asn Ser Trp Arg Thr Thr Gly Asp Ile Ser Asp Ser Trp Gly Ser 210 215 220 Ile Ile Arg Asn Ile Asp Glu Asn Ser Lys Ser Ala Ala Tyr Ala Gly 225 230 235 240 Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Glu Val Gly Asn Gly Asn 245 250 255 Met Thr Asp Thr Glu Tyr Lys Ala His Phe Ser Met Trp Cys Met Met 260 265 270 Ala Ala Pro Leu Ile Ala Gly Asn Asp Leu Arg Asn Met Thr Pro Ala 275 280 285 Thr Lys Glu Ile Leu Thr Asn Lys Glu Val Ile Ala Ile Asp Gln Asp 290 295 300 Ala Ala Gly Val Gln Gly Thr Lys Val Ser Ser Ser Gly Glu Leu Glu 305 310 315 320 Val Trp Cys Lys Pro Leu Gly Thr Asp Gly Thr Thr Lys Ala Val Ala 325 330 335 Leu Leu Asn Arg Gly Ala Thr Ser Ala Asp Ile Thr Val Asn Trp Ser 340 345 350 Asp Ile Gln Leu Ala Asp Gly Pro Val Thr Val Arg Asp Leu Trp Glu 355 360 365 His Lys Asp Cys Gly Thr Phe Asn Thr Gly Tyr Thr Ala Asn Val Pro 370 375 380 Ser His Gly Val Val Val Leu Lys Val Gln Ala Ser Ser Thr Asp Thr 385 390 395 400 Asn Ile Glu Phe Gly Asp Val Asp Gly Asn Gly Met Ile Asp Ala Leu 405 410 415 Asp Tyr Ser Leu Val Lys Arg Tyr Leu Leu Gly Gln Ile Ser Asp Cys 420 425 430 Pro Asp Ser Lys Gly Lys Leu Ala Ala Asp Val Asp Gly Asp Gln Gln 435 440 445 Ile Thr Ala Leu Asp Phe Ser Leu Ile Lys Gln Tyr Leu Leu Gly Thr 450 455 460 Ile Asn Lys Phe Pro Ala Gln Thr Ala Ser Lys Ile Lys Pro 465 470 475 <210> 3 <211> 1143 <212> DNA <213> Clostridium josui <220> <221> CDS <222> (1)..(1143) <400> 3 gtg ttt atc tca cca ttt ccg gca tct gtc tta aat ttc aat caa gta 48 Val Phe Ile Ser Pro Phe Pro Ala Ser Val Leu Asn Phe Asn Gln Val 1 5 10 15 atg gcc ctg aac aac ggt ctg gga ttg act ccc cca atg ggt tgg aac 96 Met Ala Leu Asn Asn Gly Leu Gly Leu Thr Pro Pro Met Gly Trp Asn 20 25 30 agc tgg aat ata ttt ggg ggt gac atc aac gaa gat aaa att aaa gaa 144 Ser Trp Asn Ile Phe Gly Gly Asp Ile Asn Glu Asp Lys Ile Lys Glu 35 40 45 att gca gat gct atg gtt aca aca gga atg aag gat gca ggc tat gag 192 Ile Ala Asp Ala Met Val Thr Thr Gly Met Lys Asp Ala Gly Tyr Glu 50 55 60 tat gta aat ctt gat gac aat tgg atg gca aac cct gca cgt gac gct 240 Tyr Val Asn Leu Asp Asp Asn Trp Met Ala Asn Pro Ala Arg Asp Ala 65 70 75 80 aat gga aaa ctt att cca gac ccc aaa cgt ttt ccg agc gga atg aag 288 Asn Gly Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Arg Phe Pro Ser Gly Met Lys 85 90 95 gct ttg gca gat tat att cat tca aaa gga tta aaa ttt gga ata tat 336 Ala Leu Ala Asp Tyr Ile His Ser Lys Gly Leu Lys Phe Gly Ile Tyr 100 105 110 ggt gac agg gga gta acc act tgc tgc aat att ccc caa agt gga agt 384 Gly Asp Arg Gly Val Thr Thr Cys Cys Asn Ile Pro Gln Ser Gly Ser 115 120 125 cag gga tat gag gag caa gat gca aaa act ttt gct gaa tgg ggg ctg 432 Gln Gly Tyr Glu Glu Gln Asp Ala Lys Thr Phe Ala Glu Trp Gly Leu 130 135 140 gac tat tta aaa tat gat aac tgc gct tca gac agg aat ttg cag gca 480 Asp Tyr Leu Lys Tyr Asp Asn Cys Ala Ser Asp Arg Asn Leu Gln Ala 145 150 155 160 ggc tac gaa aaa atg agg gat gct ctt ttg aag aca ggg agg cct att 528 Gly Tyr Glu Lys Met Arg Asp Ala Leu Leu Lys Thr Gly Arg Pro Ile 165 170 175 ttt tac agc ata tgt tgc tgg tat ttt gca ggt ccg tgg atg gta gat 576 Phe Tyr Ser Ile Cys Cys Trp Tyr Phe Ala Gly Pro Trp Met Val Asp 180 185 190 tgc ggt aat tct tgg aga acc acg ggg gat ata agt gac agt tgg gga 624 Cys Gly Asn Ser Trp Arg Thr Thr Gly Asp Ile Ser Asp Ser Trp Gly 195 200 205 agc att ata agg aat att gac gaa aac tct aaa tca gcc gct tac gca 672 Ser Ile Ile Arg Asn Ile Asp Glu Asn Ser Lys Ser Ala Ala Tyr Ala 210 215 220 ggt cct ggg cat tgg aac gac cca gat atg ttg gag gtt ggt aat ggt 720 Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Glu Val Gly Asn Gly 225 230 235 240 aat atg aca gac aca gaa tac aaa gcg cat ttc agc atg tgg tgt atg 768 Asn Met Thr Asp Thr Glu Tyr Lys Ala His Phe Ser Met Trp Cys Met 245 250 255 atg gca gct cca ctt att gcc gga aat gat ctt aga aat atg aca cct 816 Met Ala Ala Pro Leu Ile Ala Gly Asn Asp Leu Arg Asn Met Thr Pro 260 265 270 gct acc aaa gaa att ctt acc aac aaa gaa gtc att gct att gac caa 864 Ala Thr Lys Glu Ile Leu Thr Asn Lys Glu Val Ile Ala Ile Asp Gln 275 280 285 gat gcc gca gga gtg caa ggc act aag gta agt tct tca gga gaa ctt 912 Asp Ala Ala Gly Val Gln Gly Thr Lys Val Ser Ser Ser Gly Glu Leu 290 295 300 gaa gta tgg tgt aaa cct cta ggg aca gat ggt act acc aag gcg gtt 960 Glu Val Trp Cys Lys Pro Leu Gly Thr Asp Gly Thr Thr Lys Ala Val 305 310 315 320 gca ctc tta aat aga gga gcc act tcg gca gat atc aca gtt aat tgg 1008 Ala Leu Leu Asn Arg Gly Ala Thr Ser Ala Asp Ile Thr Val Asn Trp 325 330 335 agt gat ata cag ctt gcc gat ggt cct gtc aca gtt cgt gat ctt tgg 1056 Ser Asp Ile Gln Leu Ala Asp Gly Pro Val Thr Val Arg Asp Leu Trp 340 345 350 gag cat aag gac tgc ggt acc ttt aac act ggg tat aca gcc aat gta 1104 Glu His Lys Asp Cys Gly Thr Phe Asn Thr Gly Tyr Thr Ala Asn Val 355 360 365 ccg tca cat ggt gta gtg gta cta aaa gta caa gca agc 1143 Pro Ser His Gly Val Val Val Leu Lys Val Gln Ala Ser 370 375 380 <210> 4 <211> 381 <212> PRT <213> Clostridium josui <400> 4 Val Phe Ile Ser Pro Phe Pro Ala Ser Val Leu Asn Phe Asn Gln Val 1 5 10 15 Met Ala Leu Asn Asn Gly Leu Gly Leu Thr Pro Pro Met Gly Trp Asn 20 25 30 Ser Trp Asn Ile Phe Gly Gly Asp Ile Asn Glu Asp Lys Ile Lys Glu 35 40 45 Ile Ala Asp Ala Met Val Thr Thr Gly Met Lys Asp Ala Gly Tyr Glu 50 55 60 Tyr Val Asn Leu Asp Asp Asn Trp Met Ala Asn Pro Ala Arg Asp Ala 65 70 75 80 Asn Gly Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Arg Phe Pro Ser Gly Met Lys 85 90 95 Ala Leu Ala Asp Tyr Ile His Ser Lys Gly Leu Lys Phe Gly Ile Tyr 100 105 110 Gly Asp Arg Gly Val Thr Thr Cys Cys Asn Ile Pro Gln Ser Gly Ser 115 120 125 Gln Gly Tyr Glu Glu Gln Asp Ala Lys Thr Phe Ala Glu Trp Gly Leu 130 135 140 Asp Tyr Leu Lys Tyr Asp Asn Cys Ala Ser Asp Arg Asn Leu Gln Ala 145 150 155 160 Gly Tyr Glu Lys Met Arg Asp Ala Leu Leu Lys Thr Gly Arg Pro Ile 165 170 175 Phe Tyr Ser Ile Cys Cys Trp Tyr Phe Ala Gly Pro Trp Met Val Asp 180 185 190 Cys Gly Asn Ser Trp Arg Thr Thr Gly Asp Ile Ser Asp Ser Trp Gly 195 200 205 Ser Ile Ile Arg Asn Ile Asp Glu Asn Ser Lys Ser Ala Ala Tyr Ala 210 215 220 Gly Pro Gly His Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Glu Val Gly Asn Gly 225 230 235 240 Asn Met Thr Asp Thr Glu Tyr Lys Ala His Phe Ser Met Trp Cys Met 245 250 255 Met Ala Ala Pro Leu Ile Ala Gly Asn Asp Leu Arg Asn Met Thr Pro 260 265 270 Ala Thr Lys Glu Ile Leu Thr Asn Lys Glu Val Ile Ala Ile Asp Gln 275 280 285 Asp Ala Ala Gly Val Gln Gly Thr Lys Val Ser Ser Ser Gly Glu Leu 290 295 300 Glu Val Trp Cys Lys Pro Leu Gly Thr Asp Gly Thr Thr Lys Ala Val 305 310 315 320 Ala Leu Leu Asn Arg Gly Ala Thr Ser Ala Asp Ile Thr Val Asn Trp 325 330 335 Ser Asp Ile Gln Leu Ala Asp Gly Pro Val Thr Val Arg Asp Leu Trp 340 345 350 Glu His Lys Asp Cys Gly Thr Phe Asn Thr Gly Tyr Thr Ala Asn Val 355 360 365 Pro Ser His Gly Val Val Val Leu Lys Val Gln Ala Ser 370 375 380 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> Designed oligonucleotide based the 5' terminal side sequence of α-galactosidase gene and having a EcoRI. <400> 5 tgaattcatg aaaaaaatca aacgcct 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> Designed oligonucleotide based the 3' terminal side sequence of α-galactosidase gene and having a BamHI site. <400> 6 tggatcctgg cttgatttta cttgctg 27 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based the 5' terminal side sequence of the gene coding for catalytic domain of α-galactosidase and having a EcoRI site. <400> 7 ttgaattcgg tgtttatctc accatttc 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide based the 3' terminal side sequence of the gene coding for catalytic domain of α-galactosidase and having a HindIII site. <400> 8 taagcttgct tgtactttta gtaccact 28

【００６２】

【配列表フリーテキスト】配列番号５：α-ガラクトシ
ダーゼ遺伝子の5'末側配列に基づいて設計した、EcoRI
部位を有するオリゴヌクレオチド。配列番号６：α-ガラクトシダーゼ遺伝子の3'末側配列
に基づいて設計した、BamHI部位を有するオリゴヌクレ
オチド。配列番号７：α-ガラクトシダーゼの触媒ドメインをコ
ードする遺伝子の5'末側配列に基づいて設計した、EcoR
I部位を有するオリゴヌクレオチド。配列番号８：α-ガラクトシダーゼの触媒ドメインをコ
ードする遺伝子の3'末側配列に基づいて設計した、Hind
III部位を有するオリゴヌクレオチド。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のα-ガラクトシダーゼのアミノ酸配列
と各種植物由来のα-ガラクトシダーゼのアミノ酸配列
との相同性を示す図である。

【図２】本発明のα-ガラクトシダーゼのドックリン配
列と公知のセルラーゼに見られるドックリン配列との比
較を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/40 Ｃ１２Ｒ 1:145） (72)発明者木村哲哉三重県津市上浜町1515 三重大学生物資源学部応用微生物学研究室内 (72)発明者苅田修一三重県津市上浜町1515 三重大学遺伝子実験施設内Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA12 CA04 EA04 GA11 HA01 4B050 CC05 DD02 LL02 4B065 AA23Y AA26X AB01 BA02 CA31 CA41

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質。 (a)配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列
を含むタンパク質 (b) 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列
において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しく
は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα-ガラクト
シダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質を
コードする遺伝子。 (a) 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列
を含むタンパク質 (b) 配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列
において少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しく
は付加されたアミノ酸配列からなり、かつα-ガラクト
シダーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】以下の(c)又は(d)のDNAを含む遺伝子。 (c) 配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列を含
むDNA (d) 配列番号１又は配列番号３で表される塩基配列を含
むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつα-ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質
をコードするDNA
【請求項４】請求項２又は請求項３のいずれかに記載
の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】請求項４記載の組換えベクターを含む形
質転換体。
【請求項６】請求項５記載の形質転換体を培地に培養
し、得られる培養物からα-ガラクトシダーゼ活性を有
するタンパク質を採取することを特徴とする、該タンパ
ク質の製造方法。
【請求項７】クロストリジウム属に属する細菌を培地
に培養し、得られる培養物からα-ガラクトシダーゼ活
性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、該
タンパク質の製造方法。
【請求項８】クロストリジウム属に属する細菌が、ク
ロストリジウム・ジョースイである請求項７記載の製造
方法。