JP2000235032A - 免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬 - Google Patents
免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬Info
- Publication number
- JP2000235032A JP2000235032A JP11076279A JP7627999A JP2000235032A JP 2000235032 A JP2000235032 A JP 2000235032A JP 11076279 A JP11076279 A JP 11076279A JP 7627999 A JP7627999 A JP 7627999A JP 2000235032 A JP2000235032 A JP 2000235032A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- human
- complement
- liposome
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
含まれるヒト補体による非特異なリポソームの崩壊を防
ぐ際に、熱処理や薬剤処理を施すことなく、ヒト補体に
よる非特異なリポソームの崩壊を防ぐ。 【解決手段】 抗ヒト補体抗体を試薬中に含有させ
る。また、内部に標識物質を封入するとともに抗体を結
合してなるリポソームと、安定剤と、ヒト由来以外の動
物補体と、抗ヒト補体抗体とを内包し、凍結乾燥された
多孔性構造体からなることを特徴とする乾式免疫測定試
薬も提供する。
Description
法、さらに詳しくは、抗原抗体反応を利用して微量生体
成分を迅速かつ正確に測定する方法と、乾式免疫測定試
薬に関する。
微量に存在するホルモン、酵素などを検出する免疫学的
測定方法は医療診断などに広く応用されている。
層法、免疫拡散法、毛細管法、レーザーネフェロメトリ
ー法などの沈降反応を利用したものや免疫蛍光法、酵素
免疫測定方法およびラジオイムノアッセイなどの標識抗
体を利用したものがある。とくに放射性同位元素を抗原
または抗体に標識した試薬を用いるラジオイムノアムッ
セイが広く用いられている。これに対して放射性物質を
用いない方法、すなわち酵素、バクテリオファージフリ
ーラジカル、化学発光物質、蛍光物質などを標識とする
方法も研究され、一部実用化されている。このような方
法においては、測定感度を高めるためにサンドイッチ免
疫測定方法が応用され、たとえば最近では多孔質膜など
の担体に固定化された抗体を用いて、標識物質が蛍光物
質である方法などが報告されている。
量の抗原に対しても感度良く検知できる迅速かつ正確な
測定方法として、抗体を表面に結合させて標識物質がそ
の内部に封入されたリポソームを、「補体の存在下で」
試料中の抗原と反応させる手法が開示されている。この
手法は、以下のようなものである。
補体が存在する試薬中にリポソーム試薬を加え、これと
別に補体又は膜を侵襲出来る物質を加える(補体測定の
場合は不要であり、試料中に補体成分が含まれる場合に
は別途補体を加えても良いし加えなくても良い)。する
と、抗原−抗体反応及びそれに伴う補体又は膜を侵襲出
来る物質の活性化が起こり、補体又は膜を侵襲出来る物
質の膜障害作用によってリポソームが破壊され、封入さ
れていた標識物質が流出する。この流出した標識物質の
量と、試料中の被検物質、すなわち抗体又は抗原又は補
体との間には相関関係があるので、流出した標識物質を
所定の分析方法(例えば蛍光分析)によって定量するこ
とにより、被検物質を定量することが出来る。
いては、ヒト血清試料中の各種成分につき免疫分析する
場合、試料中にもともと含まれるヒト由来の補体によっ
て、試薬中のリポソームが非特異的に崩壊してしまい、
標識物質の流出量に変化が生じ、結果として被検物質を
定量することが出来なくなってしまうという不都合が生
じていた。
60390号では、試料を前処理することにより、試料
中に存在していた補体成分を不活性化させる技術を開示
している。不活性化技術として、測定試料に対する熱処
理と、薬品による処理が挙げられている。
体価または抗原性の低下にかかわらない程度とは言え5
6℃という高温で熱処理する必要があり、測定操作も段
階が増え、煩雑になる。また、薬剤処理は量的に過剰に
なると、試薬として添加されている補体(動物由来)も
失活させてしまうおそれがある。
に本発明は、リポソーム免疫測定方法における、試料中
に含まれるヒト補体による非特異なリポソームの崩壊を
防ぐために、抗ヒト補体抗体を試薬中に含有することを
特徴とする免疫測定方法である。
物質を封入するとともに抗体を結合してなるリポソーム
と、安定剤と、ヒト由来以外の動物補体と、抗ヒト補体
抗体とを内包し、凍結乾燥された多孔性構造体からなる
ことを特徴とする乾式免疫測定試薬も提供する。
抗体)を検体に添加することで、検体中のヒト由来の補
体を特異的にトラップし、その補体活性を抑制すること
で、ヒトの補体由来のリポソームの非特異的な崩壊を抑
制する。
トC1q抗体,抗ヒトC3抗体,抗ヒトC4抗体、また
は、第2経路に関与するB因子やD因子に対する抗体が
あり、またその抗血清も使用可能である。
と対応抗原は同じだがエピトープが異なる第2の抗体を
更に含むこともできる。このようにすることで、効率的
な補体反応を促すことができる。第2抗体を添加するこ
とによる効率的補体反応に関しては、「製薬工場」,7
(5),421−425(1987)に詳しい。
る形態も取り得る。この場合、多孔性構造体(例えば濾
紙、ガラスフィルター等)の内部に凍結乾燥された状態
で保持されていることが好ましい。
体特異的抗体として、抗ヒトC1q抗体,抗ヒトC3抗
体,抗ヒトC4抗体、または、第2経路に関与するB因
子やD因子に対する抗体があり、またその抗血清も使用
可能であり、リポソームに結合している抗体と対応抗原
は同じだがエピトープが異なる第2の抗体を更に含むこ
ともできる。
やすいように、乾式分析要素タイプで説明するが、液系
試薬でも反応が成立することは言うまでもない。
リン)、1μmolコレステロール、ジチオピリジル−
ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DT
P−DPPE)/ブロモアセチル(BrAc)−DPP
Eのクロロフォルム溶液をロータリーエバポレーターで
乾燥し、脂質薄膜に調製した。0.1mol/lのカル
ボキシフルオレスセンを添加して、50℃で1分間イン
キューベーションした後、脂質膜を激しくボルテックス
混合した。内包されなかったカルボキシフルオレスセン
を、3万Gで20分間遠心分離することで除いた。得ら
れたペレットをHEPES緩衝液にて懸濁し、使用する
まで4℃で保存した。
1mlに抗CRP抗体(OY−Medix社)10mg
を混合し、37℃、10時間インキューベートした。2
mol/lトリス−塩酸緩衝液25μl及び0.5mo
l/l水酸化ナトリウムを加えて、反応を停止させた
後、反応混合物を0.22μmのミリポアフィルターで
濾過し、TSK−ゲル濾過カラムで精製し、アミコンの
Centriprepで濃縮した。修飾した抗体の最終
濃度は0.1MPBS(pH6.0)で約3g/lであ
った。これに2−メルカプトエチルアミン−ハイドロク
ロライドを加えて、37℃で30分間インキュベートし
た。この反応液をゲル濾過カラム(PD−10,ファル
マシア社)で精製し、Fab’溶液を得た。Fab’は
約1g/lであった。
り撹拌しながら窒素下で室温で混合し、20時間反応さ
せた。リポソームを3万Gで20分間遠心することで収
集し、ゼラチンバルビタール緩衝液(GBS)2mlに
再縣濁し、冷蔵庫に保存した。
の作製 上記(3)で得た抗CRP抗体結合リポソームを、5%
トレハロース、1%BSA、補体価1〜3CH50のモ
ルモット血清補体、1mg/ml抗ヒトC3抗体、1m
g/ml抗ヒトC1q抗体を含んだ0.05M−PBS
緩衝液(pH7.0)に混合した。濾紙GA−100
(東洋濾紙製)を、上記緩衝液500mlに対して5枚
浸漬させて、10分後に引き上げ、凍結温度−40℃、
真空度0.05〜0.028Torr、乾燥時間23.
5時間の条件で凍結乾燥させ、免疫測定試薬を得た。得
られた免疫測定試薬は、窒素封入した容器に保存した。
の多孔性構造体に、CRPのゼロ血清(国際バイオ社
製)10μlを添加し、室温で30分間反応させた。蛍
光光度計(パーキンエルマー社製 LS50B)を用い
て、励起波長490nm、蛍光波長520nmの波長
で、リポソームからのカルボキシフルオレスセン流出量
を測定した。
量は、10%トリトンX−100を20μl添加するこ
とで測定した。各測定値は、カルボキシフルオレスセン
の流出の割合で示した。
対する抗体)を添加した免疫測定試薬と、添加していな
い免疫測定試薬の非特異的なリポソームの崩壊率を示し
た表である。図1から判断できるように、本発明は良好
に非特異崩壊を防いでいる。
と、熱処理や薬剤処理を施すことなく、ヒト補体による
非特異なリポソームの崩壊を防ぐことができる。
添加していない免疫測定試薬の非特異的なリポソームの
崩壊率を示した表である。
Claims (4)
- 【請求項1】 リポソーム免疫測定方法における、試料
中に含まれるヒト補体による非特異なリポソームの崩壊
を防ぐために、抗ヒト補体抗体を含ませることを特徴と
する免疫測定方法。 - 【請求項2】 リポソームに結合している抗体と対応抗
原は同じだがエピトープが異なる第2の抗体を更に含
む、特許請求の範囲第1項に記載の免疫測定方法。 - 【請求項3】 内部に標識物質を封入するとともに抗体
を結合してなるリポソームと、安定剤と、ヒト由来以外
の動物補体と、抗ヒト補体抗体とを内包し、凍結乾燥さ
れた多孔性構造体からなることを特徴とする乾式免疫測
定試薬。 - 【請求項4】 リポソームに結合している抗体と対応抗
原は同じだがエピトープが異なる第2の抗体を更に含
む、特許請求の範囲第3項に記載の乾式免疫測定試薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP07627999A JP4068259B2 (ja) | 1999-02-15 | 1999-02-15 | 免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP07627999A JP4068259B2 (ja) | 1999-02-15 | 1999-02-15 | 免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2000235032A true JP2000235032A (ja) | 2000-08-29 |
JP4068259B2 JP4068259B2 (ja) | 2008-03-26 |
Family
ID=13600854
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP07627999A Expired - Fee Related JP4068259B2 (ja) | 1999-02-15 | 1999-02-15 | 免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4068259B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022163605A1 (ja) * | 2021-01-26 | 2022-08-04 | 積水メディカル株式会社 | 免疫学的測定方法 |
WO2024004805A1 (ja) * | 2022-06-27 | 2024-01-04 | 積水メディカル株式会社 | 免疫学的測定方法 |
-
1999
- 1999-02-15 JP JP07627999A patent/JP4068259B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2022163605A1 (ja) * | 2021-01-26 | 2022-08-04 | 積水メディカル株式会社 | 免疫学的測定方法 |
WO2024004805A1 (ja) * | 2022-06-27 | 2024-01-04 | 積水メディカル株式会社 | 免疫学的測定方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4068259B2 (ja) | 2008-03-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9995744B2 (en) | Multiple hybrid immunoassay | |
US4483929A (en) | Liposomes with glycolipid-linked antibodies | |
US4652533A (en) | Method of solid phase immunoassay incorporating a luminescent label | |
CA1261743A (en) | Biological diagnostic assay product, and process utilizing labeled fab fragments | |
EP0185738A1 (en) | Immunoliposome assay - methods and products | |
US5225328A (en) | Stable alkaline phosphatase compositions with color enhancement and their use in assays | |
JP2002517728A (ja) | 分析対象物質を検出する方法 | |
US20050118727A1 (en) | Conjugates and their use in detection methods | |
JPS61221651A (ja) | 干渉に耐えるリポソ−ム特異的結合検定 | |
CA1300498C (en) | Ice nucleation immunoassay | |
CA2064972A1 (en) | Immunoassay for immunoglobulins | |
JPH0646893A (ja) | 分析物の測定方法および測定手段 | |
JP4068259B2 (ja) | 免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬 | |
JPS61250558A (ja) | 免疫分析方法 | |
US20130137115A1 (en) | Homogeneous detection method | |
JP2527434B2 (ja) | 測定用液体単一試薬 | |
JPH0799374B2 (ja) | 免疫分析用試薬およびこれを用いる免疫分析方法 | |
JPH0346074B2 (ja) | ||
JPS60159652A (ja) | 免疫分析用試薬 | |
JP4143744B2 (ja) | 迅速な免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬 | |
CH675309A5 (ja) | ||
JP4250704B2 (ja) | 乾式免疫測定試薬 | |
JP2000249707A (ja) | 免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬 | |
JPH06105252B2 (ja) | 遊離型サイロキシンの酵素免疫測定法 | |
JPS62291568A (ja) | マイクロカプセルの保存方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051227 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20051227 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20071219 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20071225 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080110 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110118 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120118 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130118 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |