JP4143744B2 - 迅速な免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的測定方法、さらに詳しくは、リポソーム結合抗体を利用して微量生体成分を迅速に測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
試料中の被測定物質の免疫学的測定方法としては、交差免疫電気泳動法（ＣＩＥ）、二次元免疫拡散法（ＭＯ）、受身赤血球凝集反応（ＰＨＡ）、免疫粘着赤血球凝集反応（ＩＡＨＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、固相放射免疫測定法（ＲＩＡ）等が知られている。現在では、主に酵素免疫測定法（ＥＩＡ）が用いられている。
【０００３】
また、特開昭６３−３０９８６４号公報には、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化し、内部に親水性の標識物質（例えば蛍光物質）を封入したリポソーム試薬を用いた測定方法が提案されている。この方法はＬＩＬＡ（リポソーム・イムノライシス・アッセイ）と称される。
【０００４】
このＬＩＬＡは以下のようなものである。すなわち、抗原又は抗体又は補体が存在する試薬中にリポソーム試薬を加え、これと別に補体又は膜を侵襲出来る物質を加える（補体測定の場合は不要であり、試料中に補体成分が含まれる場合には別途補体を加えても良いし加えなくても良い）と、抗原―抗体反応及びそれに伴う補体又は膜を侵襲出来る物質の活性化が起こり、補体又は膜を侵襲出来る物質の膜障害作用によってリポソームが破壊され、封入されていた標識物質が流出する。この流出した標識物質の量と、試料中の被検物質、すなわち抗体又は抗原又は補体との間には相関関係があるので、流出した標識物質を所定の分析方法（例えば蛍光分析や酵素分析）によって定量することにより、被検物質を定量することが出来る。
【０００５】
上記のように、リポソームを侵襲させるために普通はヒト以外の動物由来の補体を存在させるが、補体反応を迅速に行わせ、全体として反応測定時間を短縮化することが望まれる。
【０００６】
その補体反応を迅速化するために、例えば補体の濃度を高める手法が提案されている（「分析化学」４０巻，６９７〜７０３頁，１９９１年）。換言すれば、反応系へ補体を多量に（当業者が通常考える範囲を越える量を示す）添加するのである。
【０００７】
しかし、補体反応を上げ過ぎると、非特異的なリポソームの崩壊が生じて内部の標識物質が漏出し、結果として測定値のバックグラウンドを上げてしまうことが判明した。従って、補体反応の速度を目的として補体濃度を高める手法には限界があった。この非特異的リポソーム崩壊は、試料検体中に含まれるヒト補体による非特異的リポソーム崩壊とは別経路である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
故に、非特異的なリポソーム崩壊を気にすることなく、迅速な反応を期待して添加できる補体濃度を増やすことのできる免疫測定方法が望まれていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明は、ヒト以外の動物由来の補体を含むリポソーム免疫反応において、前記動物由来補体がＢ因子およびＤ因子を含み、前記Ｂ因子および前記Ｄ因子に対する阻害剤として、抗Ｂ因子抗体および抗Ｄ因子抗体を添加することを特徴とする。
【００１０】
本発明の別形態として、本発明の免疫測定方法に使用する乾式免疫測定試薬であって、内部に標識物質を封入するとともに抗体を結合してなるリポソームと、多量のヒト以外の動物由来補体と、前記動物由来補体のＢ因子およびＤ因子に対する阻害剤として、抗Ｂ因子抗体および抗Ｄ因子抗体とを内包し、凍結乾燥された多孔性構造体からなることを特徴とする乾式免疫測定試薬も提供される。
【００１１】
具体的には、補体反応経路の第２経路を阻害する阻害剤を添加する。該補体反応第２経路は抗原抗体反応に依らない反応なので、この第２経路に特有な阻害剤を添加することで、抗原抗体反応へ干渉することなく非特異的なリポソーム崩壊を阻止することができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明に関わる免疫測定方法で使用される阻害剤の具体例としては、ヒト以外の動物由来の補体における、抗Ｂ因子抗体と抗Ｄ因子抗体が挙げられる。以後、本明細書における「補体」とは、「ヒト以外の動物由来の補体」を示すものとする。
【００１３】
【実施例】
（１）蛍光色素を封入したリポソームの調製：
１μｍｏｌジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１μｍｏｌコレステロール、ジチオピリジル−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ）／ブロモアセチル（ＢｒＡｃ）−ＤＰＰＥのクロロフォルム溶液をロータリーエバポレーターで乾燥し、脂質薄膜に調製した。０．１ｍｏｌ／ｌのカルボキシフルオレスセンを添加して、５０℃で１分間インキユーベーションした後、脂質膜を激しくボルテックス混合した。内包されなかったカルボキシフルオレスセンを、３万Ｇで２０分間遠心分離することで除いた。得られたペレットをＨＥＰＥＳ緩衝液にて懸濁し、使用するまで４℃で保存した。
【００１４】
（２）抗体の修飾（Ｆａｂ’の調製）
１ｍｇ／ｍｌペプシン（０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）１ｍｌに抗ＣＲＰ抗体（ＯＹ−Ｍｅｄｉｘ社ｃｌｏｎｅ６４０４）１０ｍｇを混合し、３７℃、１０時間インキューベートした。２ｍｏｌ／ｌトリス−塩酸緩衝液２５μｌ及び０．５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウムを加えて、反応を停止させた後、反応混合物を０．２２μｍのミリポアフィルターで濾過し、ＴＳＫ−ゲル濾過カラムで精製し、アミコンのＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐで濃縮した。
修飾した抗体の最終濃度は０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ６．０）で約３ｇ／ｌであった。これに２−メルカプトエチルアミン−ハイドロクロライドを加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。この反応液をゲル濾過カラム（ＰＤ−１０，ファルマシア社）で精製し、Ｆａｂ’溶液を得た。Ｆａｂ’は約１ｇ／ｌであった。
【００１５】
（３）リポソームへのＦａｂ’の結合
先に得られたリポソーム縣濁液とＦａｂ’溶液をゆっくり撹拌しながら窒素下で室温で混合し、２０時間反応させた。リポソームを３万Ｇで２０分間遠心することで収集し、ゼラチンバルビタール緩衝液（ＧＢＳ）２ｍｌに再縣濁し、冷蔵庫に保存した。
【００１６】
（４）リポソームを内包する多孔性構造体の作製
上記（３）で得た抗ＣＲＰ抗体結合リポソームを、５％トレハロース、１％ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍｌヒト抗Ｃ３抗体、１ｍｇ／ｍｌ抗Ｂ因子抗体、１ｍｇ／ｍｌ抗Ｄ因子抗体、リポソームと結合している抗体とはエピトープの異なる抗ＣＲＰ抗体（ＯＹ−Ｍｅｄｉｘ社ｃｌｏｎｅ６４０５）を含んだ０．０５Ｍ−ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に混合した。
濾紙ＧＡ−１００（東洋濾紙製）を、上記緩衝液５００ｍｌに対して５枚浸漬させて、１０分後に引き上げ、凍結温度−４０℃、真空度０．０５〜０．０２８Ｔｏｒｒ、乾燥時間２３．５時間の条件で凍結乾燥させ、免疫測定試薬を得た。得られた免疫測定試薬は、窒素封入した容器に保存した。
【００１７】
（５）ＣＲＰの比較測定
上記抗Ｂ因子抗体及び抗Ｄ因子抗体を含む試薬の多孔性構造体と、含まない多孔性構造体に、それぞれモルモット補体（補体価５ＣＨ_５０）を図１の横軸に示す倍率で希釈したものを１０μｌずつ添加し、室温で３０分間反応させた。
蛍光光度計（パーキンエルマー社製ＬＳ５０Ｂ）を用いて、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍの波長で、リポソームからのカルボキシフルオレスセン流出量を測定した。
１００％流出のカルボキシフルオレスセン量は、１０％トリトンＸ−１００を２０μｌ添加することで測定した。各測定値は、カルボキシフルオレスセンの流出の割合で示し、図１に各流出率と添加補体の希釈率を示した。
【００１８】
図から判るように、補体のＢ因子とＤ因子に対する阻害剤として前記抗Ｂ因子抗体および抗Ｄ因子抗体を添加した方では、リポソームの崩壊率が低い状態が保たれている一方で、何も添加しない方は、補体濃度が高いほどリポソームの崩壊率が高かった。
【００１９】
【発明の効果】
以上詳説したように、本発明を用いると、非特異的なリポソーム崩壊を気にすることなく、添加できる補体濃度を増やすことができ、ひいては反応測定時間の短縮化に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明に関わる阻害剤を添加した際の、各希釈率の補体濃度とカルボキシフルオレスセン流出比（リポソーム崩壊率）との関係を示す図である。

Claims (2)

1. ヒト以外の動物由来の補体を多量に含むリポソーム免疫反応において、前記動物由来補体がＢ因子およびＤ因子を含み、前記Ｂ因子および前記Ｄ因子に対する阻害剤として、抗Ｂ因子抗体および抗Ｄ因子抗体を添加することを特徴とする乾式免疫測定方法。
2. 請求項１記載の免疫測定方法に使用する乾式免疫測定試薬であって、内部に標識物質を封入するとともに抗体を結合してなるリポソームと、多量のヒト以外の動物由来補体と、前記動物由来補体のＢ因子およびＤ因子に対する阻害剤として、抗Ｂ因子抗体および抗Ｄ因子抗体とを内包し、凍結乾燥された多孔性構造体からなることを特徴とする乾式免疫測定試薬。

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