JP2000249708A - 迅速な免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬 - Google Patents
迅速な免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬Info
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- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】リポソーム免疫測定における補体反応の迅速化
のために補体濃度を高める際に生じる、非特異的なリポ
ソーム崩壊を抑制し、非特異的なリポソーム崩壊を気に
することなく、添加できる補体濃度を増やし、反応測定
時間を短縮する。 【解決手段】ヒト以外の動物由来の補体を含むリポソー
ム免疫反応において、該動物由来補体のＢ因子とＤ因子
に対する阻害剤を添加する。阻害剤の具体例としては、
ヒト以外の動物由来の補体における、抗Ｂ因子抗体と抗
Ｄ因子抗体が挙げられる。
のために補体濃度を高める際に生じる、非特異的なリポ
ソーム崩壊を抑制し、非特異的なリポソーム崩壊を気に
することなく、添加できる補体濃度を増やし、反応測定
時間を短縮する。 【解決手段】ヒト以外の動物由来の補体を含むリポソー
ム免疫反応において、該動物由来補体のＢ因子とＤ因子
に対する阻害剤を添加する。阻害剤の具体例としては、
ヒト以外の動物由来の補体における、抗Ｂ因子抗体と抗
Ｄ因子抗体が挙げられる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、免疫学的測定方
法、さらに詳しくは、リポソーム結合抗体を利用して微
量生体成分を迅速に測定する方法に関する。
法、さらに詳しくは、リポソーム結合抗体を利用して微
量生体成分を迅速に測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】試料中の被測定物質の免疫学的測定方法
としては、交差免疫電気泳動法（ＣＩＥ）、二次元免疫
拡散法（ＭＯ）、受身赤血球凝集反応（ＰＨＡ）、免疫
粘着赤血球凝集反応（ＩＡＨＡ）、酵素免疫測定法（Ｅ
ＩＡ）、固相放射免疫測定法（ＲＩＡ）等が知られてい
る。現在では、主に酵素免疫測定法（ＥＩＡ）が用いら
れている。
としては、交差免疫電気泳動法（ＣＩＥ）、二次元免疫
拡散法（ＭＯ）、受身赤血球凝集反応（ＰＨＡ）、免疫
粘着赤血球凝集反応（ＩＡＨＡ）、酵素免疫測定法（Ｅ
ＩＡ）、固相放射免疫測定法（ＲＩＡ）等が知られてい
る。現在では、主に酵素免疫測定法（ＥＩＡ）が用いら
れている。
【０００３】また、特開昭６３−３０９８６４号公報に
は、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化し、内部に親
水性の標識物質（例えば蛍光物質）を封入したリポソー
ム試薬を用いた測定方法が提案されている。この方法は
ＬＩＬＡ（リポソーム・イムノライシス・アッセイ）と
称される。
は、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化し、内部に親
水性の標識物質（例えば蛍光物質）を封入したリポソー
ム試薬を用いた測定方法が提案されている。この方法は
ＬＩＬＡ（リポソーム・イムノライシス・アッセイ）と
称される。
【０００４】このＬＩＬＡは以下のようなものである。
すなわち、抗原又は抗体又は補体が存在する試薬中にリ
ポソーム試薬を加え、これと別に補体又は膜を侵襲出来
る物質を加える（補体測定の場合は不要であり、試料中
に補体成分が含まれる場合には別途補体を加えても良い
し加えなくても良い）と、抗原―抗体反応及びそれに伴
う補体又は膜を侵襲出来る物質の活性化が起こり、補体
又は膜を侵襲出来る物質の膜障害作用によってリポソー
ムが破壊され、封入されていた標識物質が流出する。こ
の流出した標識物質の量と、試料中の被検物質、すなわ
ち抗体又は抗原又は補体との間には相関関係があるの
で、流出した標識物質を所定の分析方法（例えば蛍光分
析や酵素分析）によって定量することにより、被検物質
を定量することが出来る。
すなわち、抗原又は抗体又は補体が存在する試薬中にリ
ポソーム試薬を加え、これと別に補体又は膜を侵襲出来
る物質を加える（補体測定の場合は不要であり、試料中
に補体成分が含まれる場合には別途補体を加えても良い
し加えなくても良い）と、抗原―抗体反応及びそれに伴
う補体又は膜を侵襲出来る物質の活性化が起こり、補体
又は膜を侵襲出来る物質の膜障害作用によってリポソー
ムが破壊され、封入されていた標識物質が流出する。こ
の流出した標識物質の量と、試料中の被検物質、すなわ
ち抗体又は抗原又は補体との間には相関関係があるの
で、流出した標識物質を所定の分析方法（例えば蛍光分
析や酵素分析）によって定量することにより、被検物質
を定量することが出来る。
【０００５】上記のように、リポソームを侵襲させるた
めに普通はヒト以外の動物由来の補体を存在させるが、
補体反応を迅速に行わせ、全体として反応測定時間を短
縮化することが望まれる。
めに普通はヒト以外の動物由来の補体を存在させるが、
補体反応を迅速に行わせ、全体として反応測定時間を短
縮化することが望まれる。
【０００６】その補体反応を迅速化するために、例えば
補体の濃度を高める手法が提案されている（「分析化
学」４０巻，６９７〜７０３頁，１９９１年）。換言す
れば、反応系へ補体を多量に（当業者が通常考える範囲
を越える量を示す）添加するのである。
補体の濃度を高める手法が提案されている（「分析化
学」４０巻，６９７〜７０３頁，１９９１年）。換言す
れば、反応系へ補体を多量に（当業者が通常考える範囲
を越える量を示す）添加するのである。
【０００７】しかし、補体反応を上げ過ぎると、非特異
的なリポソームの崩壊が生じて内部の標識物質が漏出
し、結果として測定値のバックグラウンドを上げてしま
うことが判明した。従って、補体反応の速度を目的とし
て補体濃度を高める手法には限界があった。この非特異
的リポソーム崩壊は、試料検体中に含まれるヒト補体に
よる非特異的リポソーム崩壊とは別経路である。
的なリポソームの崩壊が生じて内部の標識物質が漏出
し、結果として測定値のバックグラウンドを上げてしま
うことが判明した。従って、補体反応の速度を目的とし
て補体濃度を高める手法には限界があった。この非特異
的リポソーム崩壊は、試料検体中に含まれるヒト補体に
よる非特異的リポソーム崩壊とは別経路である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】故に、非特異的なリポ
ソーム崩壊を気にすることなく、迅速な反応を期待して
添加できる補体濃度を増やすことのできる免疫測定方法
が望まれていた。
ソーム崩壊を気にすることなく、迅速な反応を期待して
添加できる補体濃度を増やすことのできる免疫測定方法
が望まれていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明は、ヒト以外の動物由来の補体を含むリポソ
ーム免疫反応において、該動物由来補体のＢ因子とＤ因
子に対する阻害剤を添加することを特徴とする。
に、本発明は、ヒト以外の動物由来の補体を含むリポソ
ーム免疫反応において、該動物由来補体のＢ因子とＤ因
子に対する阻害剤を添加することを特徴とする。
【００１０】本発明の別形態として、内部に標識物質を
封入するとともに抗体を結合してなるリポソームと、多
量のヒト以外の動物由来補体と、該動物由来補体のＢ因
子とＤ因子に対する阻害剤とを内包し、凍結乾燥された
多孔性構造体からなることを特徴とする乾式免疫測定試
薬も提供される。
封入するとともに抗体を結合してなるリポソームと、多
量のヒト以外の動物由来補体と、該動物由来補体のＢ因
子とＤ因子に対する阻害剤とを内包し、凍結乾燥された
多孔性構造体からなることを特徴とする乾式免疫測定試
薬も提供される。
【００１１】具体的には、補体反応経路の第２経路を阻
害する阻害剤を添加する。該補体反応第２経路は抗原抗
体反応に依らない反応なので、この第２経路に特有な阻
害剤を添加することで、抗原抗体反応へ干渉することな
く非特異的なリポソーム崩壊を阻止することができる。
害する阻害剤を添加する。該補体反応第２経路は抗原抗
体反応に依らない反応なので、この第２経路に特有な阻
害剤を添加することで、抗原抗体反応へ干渉することな
く非特異的なリポソーム崩壊を阻止することができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明に関わる免疫測定方法で使
用される阻害剤の具体例としては、ヒト以外の動物由来
の補体における、抗Ｂ因子抗体と抗Ｄ因子抗体が挙げら
れる。以後、本明細書における「補体」とは、「ヒト以
外の動物由来の補体」を示すものとする。
用される阻害剤の具体例としては、ヒト以外の動物由来
の補体における、抗Ｂ因子抗体と抗Ｄ因子抗体が挙げら
れる。以後、本明細書における「補体」とは、「ヒト以
外の動物由来の補体」を示すものとする。
【００１３】
【実施例】（１）蛍光色素を封入したリポソームの調
製：１μｍｏｌジパルミトイルホスファチジルコリン
（ＤＰＰＣ）、１μｍｏｌコレステロール、ジチオピリ
ジル−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ）／ブロモアセチル（ＢｒＡｃ）−
ＤＰＰＥのクロロフォルム溶液をロータリーエバポレー
ターで乾燥し、脂質薄膜に調製した。０．１ｍｏｌ／ｌ
のカルボキシフルオレスセンを添加して、５０℃で１分
間インキユーベーションした後、脂質膜を激しくボルテ
ックス混合した。内包されなかったカルボキシフルオレ
スセンを、３万Ｇで２０分間遠心分離することで除い
た。得られたペレットをＨＥＰＥＳ緩衝液にて懸濁し、
使用するまで４℃で保存した。
製：１μｍｏｌジパルミトイルホスファチジルコリン
（ＤＰＰＣ）、１μｍｏｌコレステロール、ジチオピリ
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ターで乾燥し、脂質薄膜に調製した。０．１ｍｏｌ／ｌ
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間インキユーベーションした後、脂質膜を激しくボルテ
ックス混合した。内包されなかったカルボキシフルオレ
スセンを、３万Ｇで２０分間遠心分離することで除い
た。得られたペレットをＨＥＰＥＳ緩衝液にて懸濁し、
使用するまで４℃で保存した。
【００１４】（２）抗体の修飾（Ｆａｂ’の調製） １ｍｇ／ｍｌペプシン（０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）
１ｍｌに抗ＣＲＰ抗体（ＯＹ−Ｍｅｄｉｘ社ｃｌｏｎｅ
６４０４）１０ｍｇを混合し、３７℃、１０時間インキ
ューベートした。２ｍｏｌ／ｌトリス−塩酸緩衝液２５
μｌ及び０．５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウムを加えて、
反応を停止させた後、反応混合物を０．２２μｍのミリ
ポアフィルターで濾過し、ＴＳＫ−ゲル濾過カラムで精
製し、アミコンのＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐで濃縮した。修
飾した抗体の最終濃度は０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ６．０）
で約３ｇ／ｌであった。これに２−メルカプトエチルア
ミン−ハイドロクロライドを加えて、３７℃で３０分間
インキュベートした。この反応液をゲル濾過カラム（Ｐ
Ｄ−１０，ファルマシア社）で精製し、Ｆａｂ’溶液を
得た。Ｆａｂ’は約１ｇ／ｌであった。
１ｍｌに抗ＣＲＰ抗体（ＯＹ−Ｍｅｄｉｘ社ｃｌｏｎｅ
６４０４）１０ｍｇを混合し、３７℃、１０時間インキ
ューベートした。２ｍｏｌ／ｌトリス−塩酸緩衝液２５
μｌ及び０．５ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウムを加えて、
反応を停止させた後、反応混合物を０．２２μｍのミリ
ポアフィルターで濾過し、ＴＳＫ−ゲル濾過カラムで精
製し、アミコンのＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐで濃縮した。修
飾した抗体の最終濃度は０．１ＭＰＢＳ（ｐＨ６．０）
で約３ｇ／ｌであった。これに２−メルカプトエチルア
ミン−ハイドロクロライドを加えて、３７℃で３０分間
インキュベートした。この反応液をゲル濾過カラム（Ｐ
Ｄ−１０，ファルマシア社）で精製し、Ｆａｂ’溶液を
得た。Ｆａｂ’は約１ｇ／ｌであった。
【００１５】（３）リポソームへのＦａｂ’の結合 先に得られたリポソーム縣濁液とＦａｂ’溶液をゆっく
り撹拌しながら窒素下で室温で混合し、２０時間反応さ
せた。リポソームを３万Ｇで２０分間遠心することで収
集し、ゼラチンバルビタール緩衝液（ＧＢＳ）２ｍｌに
再縣濁し、冷蔵庫に保存した。
り撹拌しながら窒素下で室温で混合し、２０時間反応さ
せた。リポソームを３万Ｇで２０分間遠心することで収
集し、ゼラチンバルビタール緩衝液（ＧＢＳ）２ｍｌに
再縣濁し、冷蔵庫に保存した。
【００１６】（４）リポソームを内包する多孔性構造体
の作製 上記（３）で得た抗ＣＲＰ抗体結合リポソームを、５％
トレハロース、１％ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍｌヒト抗Ｃ３抗
体、１ｍｇ／ｍｌ抗Ｂ因子抗体、１ｍｇ／ｍｌ抗Ｄ因子
抗体、リポソームと結合している抗体とはエピトープの
異なる抗ＣＲＰ抗体（ＯＹ−Ｍｅｄｉｘ社ｃｌｏｎｅ６
４０５）を含んだ０．０５Ｍ−ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）に混合した。濾紙ＧＡ−１００（東洋濾紙製）を、
上記緩衝液５００ｍｌに対して５枚浸漬させて、１０分
後に引き上げ、凍結温度−４０℃、真空度０．０５〜
０．０２８Ｔｏｒｒ、乾燥時間２３．５時間の条件で凍
結乾燥させ、免疫測定試薬を得た。得られた免疫測定試
薬は、窒素封入した容器に保存した。
の作製 上記（３）で得た抗ＣＲＰ抗体結合リポソームを、５％
トレハロース、１％ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍｌヒト抗Ｃ３抗
体、１ｍｇ／ｍｌ抗Ｂ因子抗体、１ｍｇ／ｍｌ抗Ｄ因子
抗体、リポソームと結合している抗体とはエピトープの
異なる抗ＣＲＰ抗体（ＯＹ−Ｍｅｄｉｘ社ｃｌｏｎｅ６
４０５）を含んだ０．０５Ｍ−ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）に混合した。濾紙ＧＡ−１００（東洋濾紙製）を、
上記緩衝液５００ｍｌに対して５枚浸漬させて、１０分
後に引き上げ、凍結温度−４０℃、真空度０．０５〜
０．０２８Ｔｏｒｒ、乾燥時間２３．５時間の条件で凍
結乾燥させ、免疫測定試薬を得た。得られた免疫測定試
薬は、窒素封入した容器に保存した。
【００１７】（５）ＣＲＰの比較測定 土記抗Ｂ因子抗体及び抗Ｄ因子抗体を含む試薬の多孔性
構造体と、含まない多孔性構造体に、それぞれモルモッ
ト補体（補体価５ＣＨ５０）を図１の横軸に示す倍率で
希釈したものを１０μｌずつ添加し、室温で３０分間反
応させた。蛍光光度計（パーキンエルマー社製ＬＳ５０
Ｂ）を用いて、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎ
ｍの波長で、リポソームからのカルボキシフルオレスセ
ン流出量を測定した。１００％流出のカルボキシフルオ
レスセン量は、１０％トリトンＸ−１００を２０μｌ添
加することで測定した。各測定値は、カルボキシフルオ
レスセンの流出の割合で示し、図１に各流出率と添加補
体の希釈率を示した。
構造体と、含まない多孔性構造体に、それぞれモルモッ
ト補体（補体価５ＣＨ５０）を図１の横軸に示す倍率で
希釈したものを１０μｌずつ添加し、室温で３０分間反
応させた。蛍光光度計（パーキンエルマー社製ＬＳ５０
Ｂ）を用いて、励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎ
ｍの波長で、リポソームからのカルボキシフルオレスセ
ン流出量を測定した。１００％流出のカルボキシフルオ
レスセン量は、１０％トリトンＸ−１００を２０μｌ添
加することで測定した。各測定値は、カルボキシフルオ
レスセンの流出の割合で示し、図１に各流出率と添加補
体の希釈率を示した。
【００１８】図から判るように、補体のＢ因子とＤ因子
に対する阻害剤を添加した方では、リポソームの崩壊率
が低い状態が保たれている一方で、何も添加しない方
は、補体濃度が高いほどリポソームの崩壊率が高かっ
た。
に対する阻害剤を添加した方では、リポソームの崩壊率
が低い状態が保たれている一方で、何も添加しない方
は、補体濃度が高いほどリポソームの崩壊率が高かっ
た。
【００１９】
【発明の効果】以上詳説したように、本発明を用いる
と、非特異的なリポソーム崩壊を気にすることなく、添
加できる補体濃度を増やすことができ、ひいては反応測
定時間の短縮化に貢献することができる。
と、非特異的なリポソーム崩壊を気にすることなく、添
加できる補体濃度を増やすことができ、ひいては反応測
定時間の短縮化に貢献することができる。
【図１】 本発明に関わる阻害剤を添加した際の、各希
釈率の補体濃度とカルボキシフルオレスセン流出比（リ
ポソーム崩壊率）との関係を示す図である。
釈率の補体濃度とカルボキシフルオレスセン流出比（リ
ポソーム崩壊率）との関係を示す図である。
Claims (4)
- 【請求項１】 ヒト以外の動物由来の補体を多量に含む
リポソーム免疫反応において、該動物由来補体のＢ因子
とＤ因子に対する阻害剤を添加することを特徴とする免
疫測定方法。 - 【請求項２】 阻害剤が抗Ｂ因子抗体と抗Ｄ因子抗体で
ある、特許請求の範囲第１項に記載の免疫測定方法。 - 【請求項３】 内部に標識物質を封入するとともに抗体
を結合してなるリポソームと、多量のヒト以外の動物由
来補体と、該動物由来補体のＢ因子とＤ因子に対する阻
害剤とを内包し、凍結乾燥された多孔性構造体からなる
ことを特徴とする乾式免疫測定試薬。 - 【請求項４】 阻害剤が抗Ｂ因子抗体と抗Ｄ因子抗体で
ある、特許請求の範囲第３項に記載の乾式免疫測定試
薬。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09795699A JP4143744B2 (ja) | 1999-03-01 | 1999-03-01 | 迅速な免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09795699A JP4143744B2 (ja) | 1999-03-01 | 1999-03-01 | 迅速な免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000249708A true JP2000249708A (ja) | 2000-09-14 |
| JP4143744B2 JP4143744B2 (ja) | 2008-09-03 |
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ID=14206129
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP09795699A Expired - Fee Related JP4143744B2 (ja) | 1999-03-01 | 1999-03-01 | 迅速な免疫測定方法及び乾式免疫測定試薬 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4143744B2 (ja) |
-
1999
- 1999-03-01 JP JP09795699A patent/JP4143744B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| JP4143744B2 (ja) | 2008-09-03 |
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