JP2000189064A - 活性成分配合物の製造方法、活性成分配合物、単離タンパク、酵素の使用、食物材料、飼料材料、および医薬組成物 - Google Patents

活性成分配合物の製造方法、活性成分配合物、単離タンパク、酵素の使用、食物材料、飼料材料、および医薬組成物

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡便で、経済的で、広範囲に適用可能な活性
成分配合物の開発。 【解決手段】 活性成分を、リポキシゲナーゼ、タンパ
クジスルフィドイソメラーゼ、フェノールオキシダー
ゼ、フェノールペルオキシダーゼ、リシルオキシダー
ゼ、タンパクジスルフィドリダクターゼ、チロシンオキ
シダーゼまたはスルフヒドリルオキシダーゼから成る群
より選択された酵素で架橋を形成するタンパクから成
る、少なくともひとつの被膜、またはそのような被膜の
一部で取り囲む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リポキシゲナー
ゼ、タンパクジスルフィドイソメラーゼ、フェノールオ
キシダーゼ、リシルオキシダーゼ、タンパクジスルフィ
ドリダクターゼ、チロシンオキシダーゼまたはスルフヒ
ドリルオキシダーゼから成る群より選択される酵素によ
って架橋した、少なくともひとつのタンパク被膜または
そのようなタンパク被膜の一部で取り囲まれた、活性成
分配合物に関する。
【０００２】さらに本発明は、ひとつまたはそれ以上の
活性成分を少なくともひとつの被膜で取り囲み、その
時、活性成分を取り囲む被膜の少なくともひとつ、また
はそのような被膜の一部が、リポキシゲナーゼ、タンパ
クジスルフィドイソメラーゼ、フェノールオキシダー
ゼ、リシルオキシダーゼ、タンパクジスルフィドリダク
ターゼ、チロシンオキシダーゼまたはスルフヒドリルオ
キシダーゼから成る群より選択される酵素によって架橋
したタンパクから成る活性成分配合物の製造に関する。
また、本発明は、活性成分配合のための、前記酵素の使
用に関する。
【０００３】また、本発明は、本願発明の活性成分配合
物に加え、酵素としてリシルオキシダーゼを含有する、
ヒト用食物、動物用飼料および医薬組成物に関する。本
発明は特に、ビタミン、酵素、ヒト食物用添加物および
動物飼料用添加物、例えばカロチノイド、から成る乾燥
粉末に関する。場合によっては、様々な添加物を包埋す
ることも可能である。
【０００４】粉末形の活性成分配合物、たとえばビタミ
ンおよびカロチノイド製品は公知であり、製薬業界、ヒ
ト用食物および動物用飼料工業において大量に利用され
ている。好適な製品を製造するための多くの方法が、文
献に記載されている。
【０００５】配合物を粉体化するための様々な製造方
法、特に噴霧方法の記載があり、その際、油溶性ビタミ
ンまたはカロチノイドのような酸化−感受性物質が、酸
化作用受けないよう、防御されている。
【０００６】ドイツ特許１０３５３１９には、低湿度
（８％を下回る）下に、油溶性ビタミン分散液を大過剰
粉末デンプン中へ噴霧する記載がある。乾燥デンプン末
により、噴霧粒子から水分を除去する。この結果、粒子
は、大量のデンプンを粒子表面に固着したまま凝固す
る。更に、過剰のデンプンを除去し、これを工程に戻さ
なければならない。
【０００７】スイス特許４８８４５５には、撥水性およ
び吸水性物質を含む無機物混合物の、剥離剤としての使
用が記載されている。これは、微細乾燥デンプンが誘起
する爆発の危険性の回避を意図したものである。
【０００８】スイス特許３８９５０５には活性成分分散
液の冷却気体媒質中への噴霧が記載されており、ここ
で、噴霧粒子は冷却により凝固する。この過程には、１
５ｍの落下高さが必要で、温度は必ず室温より低くなけ
ればならない。
【０００９】高級脂肪酸の金属塩を含む粉末中への封じ
込めにより、噴霧粒子を凝固させることも可能である。
この方法はスイス特許４３１２５２に記載されている。
【００１０】安定な活性成分含有配合物を製造するため
の別の方法が、欧州特許ＥＰ−Ａ−０６１８００１に記
載されている。ここで、球体粒子は、様々な担体基質混
合物中に包埋した活性成分を含有し、この球体粒子は、
まず、活性成分、油分、タンパクおよび水分を非水混和
性溶媒に添加して得た第一水中油型エマルジョンから制
御した分割方法により小球が成形され、その後、生成し
た小球を分離することにより製造される。小球の形成に
は特別な混合システムが必要である。次に、この方法で
得た粒子をアセトアルデヒド、グルタルアルデヒド、グ
リオキサールのようなアルデヒドで処理すると、化学的
に架橋する。これは生成物の不溶性によっても証明で
き、このようにして活性成分の付加的な安定性が獲得さ
れる。
【００１１】アメリカ特許４６７０２４７には、架橋粒
子を製造するための別の方法が記載されている。この方
法では、まず、油溶性ビタミン、ゼラチンのような保護
コロイドおよび還元糖を主要素とするエマルジョンを噴
霧および乾燥することにより粉体粒子へ変換する。次に
この粒子を、温度１０５〜１８０℃で加熱処理する。タ
ンパクのアミノ基と還元糖のオキソ基間で起きたメイラ
ード反応により生成した乾燥粉末粒子は、マトリクス構
成要素の架橋により水不溶性となる。
【００１２】欧州特許ＥＰ７８２８８３には、カプセル
壁を有し、食用塩でタンパクを塩析し、トランスグルタ
ミナーゼでカプセル壁を架橋させて製造した経口マイク
ロカプセルが記載されている。この方法の不利点は、広
範囲の適用ができないことである。すなわち、たとえば
トランスグルタミナーゼは噴霧乾燥した活性配合成分を
適切に架橋できず、保管時にも活性成分が分解されるた
め、噴霧配合には不適である。酵素活性による架橋が完
了するまで待機すると、配合物の噴霧は不可能となる。
【００１３】酸化−感受性化合物、この場合には特に油
溶性ビタミンおよびカロチノイド、が大気と接触する
と、酸素と反応して活性成分が不要の化合物へと変換さ
れ、活性成分の消失が誘導される。この酸化は、例え
ば、タンパク上の反応基と反応し、結果的に酸素透過性
を減少させて活性成分への安定した防御を提供するよう
な添加物を、配合剤へ添加することにより回避できる。
これは、タンパクと還元糖のメイラード様反応で、タン
パクの水への溶解が回避されることにより起こる。ま
た、タンパクをアルデヒドと反応させて架橋することも
可能で、さらに、これにより担体マトリクスの安定性が
増加する。
【００１４】しかし、これらの方法にはある不利点があ
り、より良い安定化の手段を模索する必要がある。すな
わち、タンパクと還元糖間のメイラード反応を利用する
と、どのような場合にも温度のストレスを受けるため、
わずかであったとしても活性成分が分解されている。加
えて、生成物が茶褐色化する傾向がある。メイラード反
応を介した活性成分の配合については、たとえば、特許
明細書ＥＰ−Ａ−０５４７４２２に記載がある。
【００１５】アルデヒドまたはタンニン酸のような酸に
代表される化学薬品を架橋剤として利用する場合の不利
点は、架橋のために、高反応性だが健康に有害な添加物
を使用することである。このような方法で生産される生
成物は、消費者の需要に限界を生じる。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、簡便
で、経済的で、広範囲に適用でき、かつ前記の不利点を
克服した活性成分の配合方法を開発することである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】この課題を、本発明の活
性成分配合物の製造方法により達成できることが見出さ
れた。この方法では、ひとつまたはそれ以上の活性成分
が少なくともひとつの被膜で取り囲まれ、ここで、活性
成分を取り囲む被膜の少なくともひとつ、またはそのよ
うな被膜の一部が、リポキシゲナーゼ、タンパクジスル
フィドイソメラーゼ、フェノールオキシダーゼ、フェノ
ールペルオキシダーゼ、リシルオキシダーゼ、タンパク
ジスルフィドリダクターゼ、チロシンオキシダーゼまた
はスルフヒドリルオキシダーゼから成る群より選択され
た酵素で架橋を形成するタンパクから成ることを特徴と
する。
【００１８】代謝における、これらの酵素の化学的役割
およびその化学反応については、たとえばグリーン等(G
reen et al.,Biochem.J. 1983, 211, 481〜493)、カガ
ン等（Kagan et al.,Am.J.Respir.Cell Mol. Biol.,5,
1991, 206〜210)、ヘイウッド等（Haywood et al.,Bioc
hem. J., 1981, 199, 187〜201)またはマチス等（Mathe
is et al.,J.Food Biochem. 11, 1987, 309〜327)によ
る著書にも記載がある。
【００１９】本発明の方法による酵素誘導性の架橋が有
する利点は、加熱によるタンパク／糖衣の架橋に伴う活
性成分への温度ストレスとそれに起因するメイラード反
応を介した活性成分配合物の茶褐色化、および、アルデ
ヒドのような有毒化学物質の使用の両方を回避できる点
である。加熱による架橋で起こるメイラード反応は、還
元糖とタンパク上のフリーなアミノ基またはその他のフ
リーなアミノ基との結合を誘導し、それにより活性成分
配合物を安定化する。化学化合物をタンパクの架橋に用
いると、通常、ジアルデヒドのようなアルデヒドとタン
パク上のフリーなアミノ基または別のアミノ基との間に
架橋が形成される。本発明の方法では、タンパクが直接
に架橋し、その架橋は、たとえば、タンパクまたはリポ
タンパク中に存在する脂肪酸残基を介して、システイン
−システイン結合（＝シスチン結合）を介して、ミカエ
ル反応による付加生成物を介して、またはリシンからの
アルデヒド生成と続くフリーなアミノ基との架橋を介し
て起こる。
【００２０】このことが、本発明の新規活性成分配合物
を導き出した。この新規活性成分配合物は、ひとつまた
はそれ以上の活性成分を取り囲み、リポキシゲナーゼ、
タンパクジスルフィドイソメラーゼ、フェノールオキシ
ダーゼ、フェノールペルオキシダーゼ、リシルオキシダ
ーゼ、タンパクジスルフィドリダクターゼ、チロシンオ
キシダーゼまたはスルフヒドリルオキシダーゼから成る
群より選択される酵素によって架橋したタンパクから成
る、少なくともひとつの被膜またはそのような被膜の一
部を有する。本発明の活性成分配合物は、安定性が良好
で、茶褐色化を誘発せず、化学的な架橋剤を含有しな
い。
【００２１】本発明の方法に好適な活性成分または本発
明の活性成分配合物は、原則として、医薬組成物および
ヒトや動物の栄養剤に使用される全ての活性成分を含
む。好適な活性成分はビタミン、酵素、ヒト食物用添加
物、動物飼料用添加物である。
【００２２】本発明の方法または活性成分配合物中に含
まれる活性成分としての酵素は、たとえば、アミダー
ゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ホスホリ
パーゼ、β−グルコシダーゼ、アミラーゼ、ニトリラー
ゼ、マンナナーゼ、フィターゼまたはキシラナーゼのよ
うな加水分解酵素、メチルトランスフェラーゼまたはア
ミノトランスフェラーゼのようなトランスフェラーゼ、
グルコースオキシダーゼまたはイソメラーゼのようなオ
キシドリダクターゼを意味する。
【００２３】疎水性の活性成分は特に有利であり、その
中でも容易に酸化できるものは特に有利である。後者に
は、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ群とその混合物が含ま
れ、特にカロチノイドおよび／またはキサントフィルと
の混合物から成る。本発明の目的のためには、ビタミン
類を油中に溶解した形で、天然または合成ビタミン由来
のプロビタミンおよび純ビタミンとして使用できる。特
に興味深い生成物は、ビタミンＤ3、ビタミンＫ1、ビタ
ミンＡおよびその誘導体、特にビタミンＡアセテート、
ビタミンＡパルミテート、およびビタミンＡプロピオネ
ートおよびそれらの混合物である。ビタミンＥアセテー
トおよびビタミンＥパルミテートのような様々なビタミ
ンＥ誘導体もまた、興味深い。ヒト食物用添加物および
動物飼料用添加物として有利なのは、カロチン、キサン
トフィルおよびβ−カロチンのようなカロチノイド、こ
の他アスタキサンチン、アスタシン、ビキシン、ノルビ
キシン、カプソルビン、バイオラキサンチン、ルビキサ
ンチン、ロドキサンチン、エチルアポ−８’−カロチノ
エート、ニューロスポラキサンチン、シトラナキサンチ
ン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、β−アポ４’
−カロチナール、β−アポ８’−カロチナール、β−ア
ポ１２’−カロチナール、β−アポ−８’−カロチノン
酸、ルテイン、カプサンチン、リコペン、およびこの群
に含まれる物質を含有したヒドロキシエステルおよびカ
ルボキシエステル、たとえば、メチルまたはエチルエス
テルのような低級アルキルエステルまたはその混合物で
ある。
【００２４】本発明の活性成分配合物中の活性成分含量
は、粉末の乾燥質量あたり、通常１〜７５質量％であ
り、有利に５〜５０質量％であり、特に有利に１０〜３
５質量％である。
【００２５】ビタミンまたはカロチノイドの含量は、粉
末の乾燥質量あたり、通常５〜５０質量％であり、有利
に１０〜３５質量％である。
【００２６】本発明の有利な方法では、活性成分−含有
性のエマルジョンまたは分散液を、疎水性シリカで負荷
した雰囲気中に、また、場合によっては不活性化した雰
囲気中に噴霧する。この雰囲気は、別の剥離剤、例え
ば、でんぷんまたはコーンスターチのような変性でんぷ
んをはじめとする、炭水化物起源の作用物質により有利
に負荷できる。
【００２７】さらに有利な方法では、活性成分配合物
を、製造工程の後、噴霧のような方法で乾燥させる。こ
の乾燥により、湿分残量が有利に１０質量％、特に有利
に６質量％を下回る。より低い湿分残量を設定すること
も可能である。
【００２８】本発明の方法を実施する温度は、基本的に
８０℃、有利に６０℃よりも低く保持されている。
【００２９】さらに、本発明は、本発明の方法により獲
得でき、また、付加的な特徴として活性成分の０.０２
５〜４倍量の剥離剤または剥離剤混合物を含有する活性
成分配合物に関するとともに、このようなタイプの活性
成分配合物から成るヒト用食物または動物用飼料に関す
る。
【００３０】好適な剥離剤は、疎水性シリカ、コーンス
ターチ、化学処理で疎水化したコーンスターチ、高級脂
肪酸の金属塩およびその他の植物デンプンまたはこれら
剥離剤の混合物である。このような剥離剤の少なくとも
ひとつと、潤滑剤として働く無機化合物、例えばナウジ
リン(R)またはゼオレックス(R)、のような他の助剤との
混合物が特に有利である。
【００３１】疎水性シリカの場合、活性成分に対する割
合は、有利に０.０２５〜０.４、特に有利に０.０５〜
０.２の範囲である。コーンスターチの場合、その割合
は、有利に０.２５〜２、特に有利に０.５〜１.５の範
囲である。
【００３２】本発明の活性成分配合物は、このような活
性成分、タンパクおよびその他の担体および、炭水化物
および／または天然デンプンもしくは化学変性デンプン
から成る群より選択される増量剤を主成分とする分散液
を合成することにより獲得できる。この他に安定剤また
は乳化助剤のような添加物も含有する。さらに、様々な
形態でタンパク分子を架橋する酵素をも含有する。得ら
れた架橋により、タンパクまたは活性成分の組み込まれ
たマトリクスの水への溶解能が低下し、その結果安定性
が上昇する。
【００３３】本発明の方法で使用するタンパクは、基本
的に、どのようなタンパクでもよい。経済的な理由から
有利とされる架橋可能なタンパクには、ゼラチン、カゼ
イン、大豆タンパク、小麦タンパク、とうもろこしタン
パクおよびコラーゲンがある。
【００３４】有利な架橋可能なタンパクには、植物タン
パクまたはゼラチンのような動物タンパクの全種類が含
まれる。具体的には、骨ゼラチン、胎牛ゼラチン、魚ゼ
ラチンの他、カゼインのような乳タンパク、大豆タンパ
ク、グルテンのような小麦タンパク、とうもろこしタン
パク、コラーゲンがあり、特に有利なタンパクは、ゼラ
チン、乳タンパクおよび大豆タンパクである。本発明の
方法におけるゼラチンとは、それらが天然ゼラチンや化
学修飾された誘導体であることに関係なく、全ゼラチン
種を意味する。
【００３５】本発明の方法により有利に合成される分散
液には、広いブルームレンジを有するＡおよびＢタイプ
のゼラチンを使用する。特に有利に、ブルームレンジが
５０〜２５０のゼラチンを使用する。
【００３６】本発明で使用するゼラチン量は、活性成分
配合物の乾燥質量あたり、１０〜５０質量％、有利に１
５〜４０質量％、特に有利に２０〜３５質量％である。
【００３７】また、機械的安定性のために、タンパク
へ、可塑剤、糖および／または糖アルコール、たとえば
スクロース、グルコース、ソルビトール、ソルボース、
マンニトール、またはグリセロールのようなポリオール
を添加することが望ましい。
【００３８】本発明の架橋可能な酵素には、リポキシゲ
ナーゼ、タンパクジスルフィドイソメラーゼ（有利に
Ｅ．Ｃ．クラス５.３.４）、フェノールオキシダーゼ
（有利にＥ．Ｃ．クラス１.１４）およびペルオキシダ
ーゼ（有利にＥ．Ｃ．クラス１.１１）、リシルオキシ
ダーゼ（有利にＥ．Ｃ．クラス１.４.３）、タンパクジ
スルフィドレダクターゼ（有利にＥ．Ｃ．クラス１.６.
４）、チロシンオキシダーゼ（有利にＥ．Ｃ．クラス
１.１４）またはスルフヒドリルオキシダーゼ（有利に
Ｅ．Ｃ．クラス１.８.）がある。これらは動物、植物ま
たは微生物を起源とする。菌類または酵母のような真核
微生物由来のもの、あるいはグラム陽性菌やグラム陰性
菌またはアルケオバクテリアのような原核生物由来のも
のが有利である。様々な起源のリシルオキシダーゼを酵
素として有利に使用する。特に有利に使用されるリシル
オキシダーゼは、ジェネラカンジダ（genera Candid
a)、ハンセヌラ（Hansenula)、ピキア（Pichia)、スポ
ロボロマイセス（Sporobolomyces)、スポロパキデルミ
ア（Sporopachydermia)、またはトリゴノプシス（Trigo
nopsis)由来である。特に有利に使用されるリシルオキ
シダーゼは、ジェネラおよびカンジダネゴイアエンシス
（negoyaensis)、カンジダネモデンドラ（nemodendr
a)、カンジダボイジニイ（boidinii)、カンジダリポリ
チカ（lipolytica)、カンジダステアトリチカ（steatol
ytica)、カンジダトロピカリス（tropicalis)、カンジ
ダユーティリス（utilis)、ハンセヌラミヌタ（minut
a)、ハンセヌラポリモルファ（polymorpha)、ピキアピ
ナス（pinus)、ピキアパストリス（pastoris)、スポロ
ボロマイセスアルボ−ルベセンス（albo−rubescens)、
スポリパキデルミアセレアナ(cereana)、トリゴノプシ
スバリアビリス(variabilis)由来である。ジェナスおよ
びピキアパストリス種由来のリシルオキシダーゼは、本
発明の方法に非常に好適である。
【００３９】慣用の方法で細胞破砕し、イオン交換クロ
マトグラフィー、続いて分子ふるいクロマトグラフィー
を行い、最後にイオン交換クロマトグラフィーを再度実
施することにより、本発明のピキアパストリスのリシル
オキシダーゼを、ピキアパストリス細胞のバイオマスか
ら精製した。この精製方法により、リシルオキシダーゼ
の純度を、９０％より高く、有利に９５％より高く、特
に有利に９９％より高く精製できる。
【００４０】精製したリシルオキシダーゼをエドマンタ
ンパクシークエンス法で調べた。これによりＮ末端が決
定され、トリプシン切断により種々のペプチドを獲得し
た（例５参照）。
【００４１】本発明は、以下に示す配列の少なくともひ
とつを含有するか、アミノ−末端配列
【００４２】
【化２】
【００４３】または、タンパクのペプチドに対応し、ト
リプシン切断後に獲得される部分配列を含有し、
【００４４】
【化３】
【００４５】タンパク中のリシンのアミノメチル基を特
異的にホルミル基に酸化できる単離タンパクに関する。
前記の配列に使用した文字およびシンボルは以下の意味
を有する：Ｘは、同定が不可能であった位置の、未確認
アミノ酸を示し；括弧書きされたアミノ酸は、記載のア
ミノ酸がおそらく正しいと思われるものの、明確に同定
されなかったことを示し；斜線は、アミノ酸の選択を意
味し、すなわち、斜線の前および後のアミノ酸のいずれ
かがその位置における正しいアミノ酸であることを示
す。アミノメチル基の酸化が、結果的にタンパクの架橋
を誘導し、同一タンパクまたは異なるタンパクの領域で
架橋し合う可能性もある。
【００４６】リシルオキシダーゼ（＝タンパク−リシン
６−オキシダーゼ、ＥＣ１.４.３.１３またはリシル
オキシダーゼ）、特にピキアパストリス由来のリシルオ
キシダーゼは、タンパクの酵素による架橋を可能にし、
このときタンパクとしてゼラチンを有利に使用する。こ
の反応は、リシンのアミノメチル基のホルミル基への酸
化を含む。ホルミル基は、別のリシンのアミノ基または
他のフリーなアミノ基、たとえばアミノサッカライド、
と反応してシッフの塩基を形成する。利用者にとって、
技術的に特に利点であるのは、全ての連続反応が時間的
に分離して起こること、すなわち、リシンのアミノメチ
ル基からのホルミル基の形成、およびアミノ基とホルミ
ル基の反応が、時間的に分離して起きる点である。たと
えば、トランスグルタミナーゼを助剤とした酵素による
架橋を考えた場合、これは非常に大きな利点である。な
ぜなら、架橋反応はこのような反応中で速やかに誘起さ
れ、酵素反応と架橋反応との間に時間的な分離を認めら
れなかったからである。反応が時間的に分離して起きる
ことで、噴霧乾燥または微粒子化過程（ＥＰ−Ａ−００
６５１９３参照）による活性成分配合物の製造方法に、
酵素反応を有利に使用できるようになった。形成される
分子が関連組織の天然構成成分のため、無害であること
も利点のひとつである（図１および２）。これらは、組
織リシンオキシダーゼにより合成される。
【００４７】図１：２つのリシン側鎖からのアルドール
結合の形成
【００４８】
【化４】
【００４９】前記の酵素は、精製酵素または天然物資源
から得た粗抽出物の形で使用でき、天然物資源には、た
とえば菌類、酵母、動植物細胞のような真核生物、また
はグラム−陽性菌やグラム陰性菌、アルケオバクテリア
などの原核生物がある。酵素を細胞外培地中に分泌する
か、または細胞が透過性である限り、本発明の方法に
は、全ての有機体または細胞を使用できる。本発明の方
法は、精製酵素を用いて実施するのが有利であるが、望
ましくない２次活性物質が存在しないのであれば、粗抽
出物も使用できる。
【００５０】タンパクの架橋に必要とされる酵素量また
は酵素活性は、当業者に公知の簡易な予備試験による慣
用の方法で測定できる。酵素は、架橋されるタンパク中
に存在するリシン残基をはじめとする架橋可能な基の２
０〜１００％量で添加するのが普通である。有利にはタ
ンパク１ｇあたり酵素０.００１〜１０００ユニット、
さらに有利にタンパク１ｇあたり０.０１〜１００ユニ
ット、特に有利に０.１〜１０ユニットである。
【００５１】活性成分配合物は、ひとつまたはそれ以上
の活性成分を含有し、配合物中に存在するこの活性成分
は、ビタミンやカロチノイドのように様々なクラスであ
ったり、または、数種の異なるカロチノイドやビタミ
ン、またはその混合物のように、ある活性成分クラスに
属する数種の活性成分であったりする。
【００５２】配合物中の活性成分は、ひとつまたはそれ
以上の被膜で取り囲まれる。この被膜は、本発明の架橋
タンパク被膜をひとつまたはそれ以上含むか、あるい
は、本発明の架橋されたタンパク被膜をひとつまたはそ
れ以上含む他に化学的に架橋したタンパク被膜を少なく
ともひとつ、および／または天然ポリマー被膜や合成ポ
リマー被膜をも含有できる。本発明の方法で架橋したタ
ンパクが、活性成分を取り囲む少なくともひとつの被膜
の、一部分に過ぎない可能性もある。
【００５３】どのような天然および／または合成ポリマ
ーも、基本的には全て、活性成分の配合に好適である。
特筆すべき天然タンパクの例は、グアーゴム、アルギネ
ート、カラギナン、ペクチンのようなポリマーである
か、または、マンノースおよび／またはガラクトースを
基本構造とするポリマーである。特筆すべき合成タンパ
クの例は、アクリル酸、メタクリル酸、アクリレート、
メタクリレート、このようなモノマーの混合物、たとえ
ば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ Ｌ３０Ｄ−５５（メタクリル
酸：エチルアクリレート、１：１）またはＥｕｄｒａｇ
ｉｔ Ｓ（メタクリル酸：メチルメタクリレート、１：
２）である。ポリマーには、そのほかのモノマーも存在
してよく、たとえばトリメチルアンモニオエチルメタク
リレート、ポリリシンまたはポリアリルアミンのように
プラス電荷を供給するモノマーも存在してよい。使用す
るポリマーまたはポリマー混合物によっては、活性成分
の配合を有利にする本発明の被膜の助けをかりて、作用
部位で特異的に放出するようにできる。すなわち、胃液
に抵抗性の被膜、小腸で溶解する被膜、胃で特異的に溶
解する被膜、第１胃の環境下には溶解しない被膜、体内
に導入後ある程度の時間を経て活性成分を放出するよう
な被膜などを製造できる。体内に活性成分配合物が取り
込まれた後にはじめて放出が起こるような形にして、活
性成分を、動物用飼料またはヒト用食物にも配合でき
る。
【００５４】ひとつまたは数種の活性成分は、本発明の
方法で架橋したタンパク被膜のひとつまたはそれ以上に
より、有利に取り囲まれている。
【００５５】活性成分配合物を含有するエマルジョン
は、疎水性の剥離剤、たとえば疎水性シリカ、コーンス
ターチのような天然デンプン、疎水性コーンスターチの
ようなデンプンの疎水性誘導体、長鎖脂肪酸塩またはこ
れらの混合物を用いて有利に噴霧される。剥離剤を最初
から噴霧用チャンバー内に入れることもでき、剥離剤と
して、空気または不活化ガス（例、窒素）中の疎水性シ
リカ粒子などが挙げられる。次いで、空気または保護気
体流を処理して噴霧粒子を乾燥させるが、場合によって
は剥離剤の除去後でよく、温度を緩慢に８０℃まで、有
利に６０℃まで、特に有利に室温まで上昇させてもよ
い。
【００５６】必須構成成分に加え、活性成分の乾燥粉末
を製造するのに一般的に使用されるその他の化合物を分
散液に有利に添加できる。
【００５７】図２：シッフの塩基を得るためのリシン残
基とアリシンの反応、さらに、リシノノルロイシン、デ
スモシン、イソデスモシンを得る反応。
【００５８】
【化５】
【００５９】動物飼料用添加物として乾燥粉末を使用す
る時、活性成分が酸化−感受性である場合には、安定
剤、たとえばエトキシクイン、ブチル化ヒドロキシトル
エン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨ
Ａ）、トコフェロールのような抗酸化剤やアスコルビル
パルミテート、モノグリセリド、ジグリセリド、モノグ
リセリドと酢酸のエステル、クエン酸、乳酸、ジアセチ
ル酒石酸、トリグリセロールの脂肪酸エステル、ソルビ
タンの脂肪酸エステル、プロピレングリコールの脂肪酸
エステル、ステアロイル−２−ラクチレート、リン酸、
フィチン酸、およびこれらのアルカリ金属塩やアルカリ
土類金属塩、および錯形成剤、たとえばエチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ酸酢酸（ＮＴＡ）を添
加することが特に重要である。
【００６０】さらに、グリセロール、ソルビトール、ポ
リビニルピロリドン、ポリエチレングリコールのような
吸湿剤またはレシチンのような付加的乳化剤も、エマル
ジョンにしばしば添加される。
【００６１】糖、デンプン、デンプン誘導体、中でも特
にコーンスターチやマルトデキストリンのような炭水化
物、または、アラビアゴム、グアーゴム、トラガカント
ゴム、寒天、カラギナン、いなごまめゴム、アルギネー
ト、ペクチン、キサンタン、カードランのような増粘
剤、および特定のデンプン分解物もエマルジョンの粘度
調整に有効であることが知られている。
【００６２】こういった添加物の意味、性質および量に
関するより詳しい情報を得るために、適当な専門誌、た
とえば、前記の専攻論文、”油溶性ビタミン”ｖｏｌ.
９、特に１２８〜１３３頁、を引用した。
【００６３】これらの添加物は、活性成分配合物を有利
に安定化し、個々の投与条件に適応させる。
【００６４】本発明の方法を実行する場合、活性成分を
含む分散液を調製するために、たとえば、ゼラチンを熱
水（５０〜７０℃）に溶解し、この溶液へ糖、アミノ化
合物、ビタミンおよび／またはカロチノイド、安定化
剤、その他慣用の添加物、場合によっては水、を添加
し、温度を上昇させながら激しく撹拌して混合物を分散
させる。本発明の方法の最終工程において粉末を酵素で
架橋するために、完成した分散液を、ＮａＯＨ、ＫＯ
Ｈ、Ｃａ（ＯＨ）2、ＭｇＯ、炭酸ナトリウムまたはＮ
Ｈ4ＯＨのような塩基または酢酸ナトリウムやＮａ2ＨＰ
Ｏ4のような塩基性塩によりｐＨを４〜１０に調製す
る。このようにして得た分散液を慣用の方法、すなわ
ち、噴霧乾燥、噴霧造粒またはその他慣用の乾燥手段に
より粉体へ変換する。
【００６５】ＥＰ−Ｂ−００６５１９３には、非常に細
かく粉砕されたカロチノイドの易流動性粉体を製造する
方法が記載されている。ここでは、カロチノイドを揮発
性含水有機溶剤中に、場合によっては圧力を上昇させな
がら、５０〜２００℃で１０秒より短い時間内に溶解
し、次いで、そのようにして得られた分子分散溶液を、
温度０〜５０℃で膨潤性コロイド水溶液とともに激しく
撹拌することにより活性成分をコロイド状に沈澱させ
る。溶媒と分散媒質を慣用の方法により分散液から除去
する。膨潤性コロイドにはタンパクを使用する。これら
のタンパクは、前記した本発明の酵素の添加により架橋
される。酵素を、乾燥工程の前に、水性微細溶液に有利
に添加するため、乾燥以前に、架橋に必要な十分量の反
応基が生成される。この方法の詳細はＥＰ−Ｂ−００６
５１９３に記載される。
【００６６】ＥＰ−Ｂ−０４１０２３６には、コロイド
状カロチノイド配合物の別の製造方法についての記載が
ある。ここでは、高温沸騰した油中カロチノイド懸濁液
を、３０秒を越さない範囲で、過熱水蒸気と接触させ
る。カロチノイドを溶解させた油分に代えて、クロロホ
ルム、メチレンクロライド、テトラクロロメタン、トリ
クロロエチレンのような有機溶媒を代用することも可能
である（ＤＥ Ａ １２１１９１１参照）。最終混合物
を保護コロイド水溶液と乳化し、エマルジョンを噴霧乾
燥する。再度、タンパクを保護コロイドとして使用し、
混合および噴霧前に前記の酵素を添加して本発明の方法
により架橋する。 この方法の詳細はＥＰ−Ｂ−０４１
０２３６に記載される。
【００６７】ＥＰ−Ｂ−０４９８８２４には、微分散活
性成分配合物の、より有利な製造方法が記載されてい
る。ここでは、ゼラチンのようなタンパクに代表される
保護コロイドの存在下に、活性成分であるカロチノイド
を微細化し、続いて、生成した懸濁液を乾燥する。タン
パクを有利に架橋し、活性成分配合物を本発明の方法で
使用する酵素の添加により安定化する。このような製造
方法に関する詳細に関しては、この特許の他に、ＷＯ９
４／１９４１１に記載がある。
【００６８】本発明では、引き続き、分散液から粉体を
製造するが、この方法は、従来文献より公知の全ての方
法で実施することが可能である。
【００６９】粉体には望ましい粒度分布（０.１〜０.６
ｍｍ直径）があるため、分散液中のゲル化液滴が最終的
にその形態が安定化するまで個々に独立状態を保持でき
るような処理を有する方法ほど有利である。
【００７０】例を挙げると、 ＥＰ−Ｂ１−７４０５０
では、分散液を、疎水性シリカまたは高級脂肪酸の金属
塩中に噴霧し、ＥＰ−Ｂ１−２８５６８２では、分散液
を、デンプン粉中に噴霧する。剥離剤として疎水性シリ
カを使用する噴霧操作は、３５質量％より低いゼラチン
含量の配合物の製造方法で、特に有利に実施される。
【００７１】記載の方法で製造した粉体は、乾燥後の水
分含量が１０質量％より少なく、通常では６質量％より
も少ない。得られた粉体生成物は、表面が良好に成形さ
れた粒子から成る。また、約４０℃の温水に速やかに溶
解して乳濁液となる。
【００７２】本発明の活性成分配合物は医薬組成物の製
造およびヒト用食物や動物用飼料の製造に好適かつ有利
である。
【００７３】
【実施例】例１ ピキアパストリス−Ｌｕ５８３−からのリシルオキシダ
ーゼの調製。
【００７４】 この微生物種をＹＭアガー： マルトエキストラクト（malt extract) ３ｇ／ｌ Difco ペプトン（peptone) ５ｇ／ｌ Difco イーストエキストラクト（yeast extract) ３ｇ／ｌ Difco アガー（agar) ２０ｇ／ｌ Difco 上で培養した。
【００７５】プレートを２８℃で４８時間培養し、その
後４５℃で少なくとも４週間保存することが可能であ
る。
【００７６】前培養および発酵培地： グルコース（１２１℃で３０分圧熱滅菌） １０ｇ／ｌ 別個に調製し、１２１℃で３０分圧熱滅菌： 硫酸マグネシウム×７ Ｈ2Ｏ ０.２ｇ／ｌ リン酸二水素カリウム ３.０ｇ／ｌ ヴィシニャック＆サンター 塩溶液＊ ０.２ｍｌ／ｌ
（Vishniac & Santer solt solution) 別個に調製し、濾過滅菌： ロダービタミン溶液（Loddar vitamin solution)＊＊
１０ｍ／ｌ 培地成分を滅菌後、混合する。
【００７７】＊ヴィシニャック＆サンター 塩溶液の内
容 チトリプレックス（Titriplex)ＩＩＩ ５０ｇ／ｌ 硫酸亜鉛×７ Ｈ2Ｏ ２２ｇ／ｌ 塩化カルシウム ５.５４ｇ／ｌ 塩化マンガン×４ Ｈ2Ｏ ５.０６ｇ／ｌ 硫酸鉄×７ Ｈ2Ｏ ４.９９ｇ／ｌ モリブデン酸（ＶＩ）アンモニウム×４ Ｈ2Ｏ １.
１ｇ／ｌ 硫酸銅×５ Ｈ2Ｏ １.５７ｇ／ｌ 塩化コバルト×６ Ｈ2Ｏ １.６１ｇ／ｌ ＫＯＨでｐＨを６.０に調整。
【００７８】＊＊ロダービタミン溶液の内容 ビオチン ２０μｇ／ｌ パントテン酸カルシウム ２００００μｇ／ｌ 葉酸 ２μｇ／ｌ イノシトール １００００μｇ／ｌ ｐ−アミノ安息香酸 ２００μｇ／ｌ ナイアシン（ニコチン酸） ４００μｇ／ｌ 塩酸ピリドキシン ４００μｇ／ｌ リボフラビン ２００μｇ／ｌ 塩酸チアミン ４００μｇ／ｌ 前培養 発酵液１０ｌ用に、１ｌの各エーレンマイヤーフラスコ
中の２×２５０ｍｌ前培養液へ白金ループでＬｕ−５８
３を３〜４回接種してを調製し、２８℃、２００ｒｐｍ
で２４時間インキュベートした。
【００７９】主培養 以下の条件を備える１０ｌインフォース(Infors)発酵器
中でのバッチ： 温度 ２８℃ 通気 ５ｌ／分で循環気体の導入 回転数 ４００ｒｐｍ 発酵器取付部品 標準回転パドル３個、組み込みバッフ
ル 発酵開始前に、５０％濃度(Ｖ／Ｖ）ｎ−ブチルアミン
水溶液を添加してｐＨを約７.０に調整した。次いで、
発酵器に前培養液２×２５０ｍｌを接種した。発酵を約
２８〜３０時間かけて実施した。６００ｎｍでＯＤを測
定することにより発酵の停止時期を決定した。６００ｎ
ｍにおける発酵液のＯＤを大気を規準に測定し、その値
が０.９〜１.０でなければならない。ＯＤがこれより大
きくなると、酵素活性が短時間の内に消滅する。
【００８０】後処理 発酵器の内容物をヘレアスクリオフージ（Hereaus Cryo
fuge）８０００を用い、４５℃、５０００ｒｐｍ（約９
５００×ｇ）で２０分間遠心分離した。得られた湿バイ
オマスを５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液２５０ｍｌ中
で洗浄し、再度遠心分離した。このバイオマスは、−１
５℃のディープフリーザーで保存できる。
【００８１】細胞破砕およびリシルオキシダーゼの測定 湿バイオマス（１００ｍｌ）を、ガラスビーズ（直径
０.５ｍｍ）１００ｍｌとともに、回転数５０００ｒｐ
ｍのボールミル中で、氷冷下に３０分間破砕した。細胞
分画をガーゼで濾過し、４℃、１００００ｒｐｍで１０
分間遠心分離した。上清の活性をＨＰＬＣアッセーで測
定した。リシルオキシダーゼはベンジルアミンをベンズ
アルデヒドに変換する（２５０ｎｍで検出）。産生され
るベンズアルデヒド量を検量プロットにより測定した。
【００８２】実施条件 緩衝液Ａ：水、０.１％ ＴＦＡ 緩衝液Ｂ：アセトニトリル、０.１％ ＴＦＡ ０分 ４０％ Ｂ ６分 ７０％ Ｂ ６.１分 １００％ Ｂ ６.５分 １００％ Ｂ 流速 １ｍｌ／分 ６.５〜９分 ４０％Ｂへ戻す。流速１.５ｍｌ／分。
【００８３】７×１０ｌの発酵器内容物から得たリシル
オキシデート含有上清を集めてひとまとめにした。活性
の測定結果は、１.８ｌ中１２５.５Ｕ／ｌであった。
【００８４】例２ 蛍光染色液によるゼラチンの標識およびリシルオキシダ
ーゼによるゼラチンの架橋 ゼラチン（１０ｇ）をｐＨ９.０の５０ｍＭホウ酸ナト
リウム緩衝液に溶解した。ｐＨを確認し、０.５Ｍ Ｎ
ａＨＣＯ3で再調整した。蛍光染色液Ｃｙ−５またはＢ
ｏｄｉｐｙ６３０／６５０−Ｘ、ＳＥ）をＤＭＳＯ（＝
ジメチルスルホキシド）５ｍｌに溶解し、１：１００の
質量比でタンパクへ添加した。染色液のサクシニミジル
エステルをタンパクのフリーなアミノ基と室温で１６時
間かけて反応させた。反応混合物を、大容量のアジド
０.０１％を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で５
回透析し、１％濃度のタンパク溶液として−２０℃で保
存した。
【００８５】ゼラチンＡ１００ブルーム４５４ｇを、４
ｌの振盪フラスコを用い、リシルオキシダーゼ発酵液の
合した上清を含む溶液（ＺＨ２９３０３／５；１２５.
５Ｕ／ｌ）１８００ｍｌ中に、４０℃で撹拌しながら溶
解した。そこへＢｏｄｉｐｙ処理したゼラチン（前記参
照）を添加した。最終混合物を４０℃で４８時間撹拌
し、このとき、継続的に大気、すなわち酸素と接触でき
るように、フラスコには蓋をしない。
【００８６】サンプル３００ｇを、下記の時間ごとに、
溶液から採取した。
【００８７】 サンプル１：実験開始直後 サンプル２：実験開始後２時間 サンプル３：実験開始後５時間 サンプル４：実験開始後２４時間 サンプル５：実験開始後２９時間 サンプル６：実験開始後４８時間 サンプルを以下のように後処理した： ａ）２００ｇを単一−成分ノズルにより、疎水性シリカ
（Sipernat D 17)のミスト中に直接噴霧し、直径が約２
００μｍの粒子を得た。生じた湿式生成物を分割した；
半分を室温で乾燥し、残りの半分を８０℃で乾燥した。
いずれの場合も、大気流中の吸引漏斗上で実施した。
【００８８】ｂ）残りの１００ｇにビタミンＡ、イソ甘
味料およびとうもろこしデンプンを添加し、ウルトラツ
ラックス（Ultraturrax)で油層を乳化した後、同様の方
法で噴霧し、噴霧生成物を室温で乾燥させて乾燥粉末に
した。生成物の組成は、だいたい以下の通りである。
【００８９】２５％ エトキシクインおよびＢＨＴで安
定化した酢酸ビタミンＡ ３０％ ゼラチンＡ１００ブルーム ２５％ コーンスターチ １５％ イソ甘味料 残分：水+シパーナットＤ１７（Sipernat D 17）＋発酵
残留物 例３ 蛍光相関分光計（＝ＦＣＳ、fluorescence crrelation
spectroscopy)による架橋の測定 ＦＣＳは、数変動を関知する分光光度計の測定方法を基
本とする。ＦＣＳでは、極めて希薄な溶液中の蛍光分子
の拡散係数および数濃度(number concentration)を測定
できる。図１および図２は、ＦＣＳ装置の構成とその機
能原理を示す。ＦＣＳは、顕微鏡対物レンズにより微量
液体サンプルにレザー光線の焦点を合わせ、そこに存在
する蛍光物質を測定する。
【００９０】図１は、ＦＣＳ装置を示す図である。焦点
を合わせたレザー光線および同焦点レンズアパーチュア
により、サンプルの非常に小さい測定容量（＝同焦点容
量）が確定される。この容量から発する蛍光の時間によ
る変化を、コレレーターにより分析する。
【００９１】図２：測定容量における粒子数の変動はＦ
ＣＳシグナルＩ（ｔ）を変動させる。ＦＣＳシグナルの
自動相関関数Ｇ（ｔ）から、平均滞留時間τ（＝粒子が
測定容量内を通過し拡散する平均時間）および測定容量
中に含まれる分子数Ｎを読みとるれる。τは、蛍光分子
の大きさにそのまま比例する。
【００９２】今回は容量が非常に少ないので、そこには
平均してわずかの粒子しか存在しない。拡散が起きるた
め、容量中の粒子数は平均値Ｎ付近で間断なく変化す
る。これは、蛍光強度Ｉ（ｔ）も、その平均値Ｉｍ付近
で変動することを意味する。拡散時間τ（分子の大きさ
に比例）および蛍光分子数濃度を蛍光の変動から算出で
きる（図１参照）。
【００９３】ゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）に
よる分子量の測定 分子量の分布（ＭＷＤ）をＧＰＣで測定した。主要な実
験パラメータは： カラム： ＴＳＫゲル、４０００ＳＷＸＬ、２５０・４ｍｍ 移動相： ０.０１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、０.１Ｍ Ｎａ2ＳＯ4、１％ ＳＤＳ ｐＨ： ５.３ 温度： ３０℃ 流速： ０.５ｍｌ／分 検出： ＵＶスペクトロメーター：２２０ｎｍ 物質約０.５ｇを移動相１００ｍｌ中、Ｔ＝６０℃で１
５分撹拌してサンプルを調製した。このようにして得た
混濁溶液を０.２μｍのフィルターを通して濾過し、Ｇ
ＰＣ装置のサンプルループ（約２０μｌ）へ注入した。
水不溶性ゼラチン成分は検出されない。
【００９４】この方法で得られる実測変数は、溶出時間
の関数として検出器の強度シグナルに表れる（濃度測
定）。ＧＰＣでは、分子はその流体力学半径ｒＨによっ
て分離される。大きいｒＨを有する分子は、小さいｒＨ
を有する分子よりも早く溶出される。
【００９５】標準ポリマー（今回：プルランスタンダー
ド、pullulan standards）を使用して得た検量線による
溶出図からＭＷＤを計算できる。[M.D. Lechner、K. Ge
hrkeおよびE.H. Nordmeier著”Makromolekulare Chemi
e”第４.３.６.１.章、Birkhaeuser Verlag(1996)参
照]。一次近似式、溶出時間ｔＥとプルランスタンダー
ドの分子量Ｍは以下の式で示す比例関係にある： ｔＥ ∝ ｌｏｇ（Ｍ） （１） ただし、３次多項式でｌｏｇ（Ｍ）に対するｔＥをプロ
ットすると、データはより正確になる。この多項式の逆
数を使用して、ゼラチンの溶出時間からゼラチンの分子
量を算出できる。このようにして得た分子量は、決して
ゼラチンの絶対分子量（たとえばＬＳから得た分子量）
ではなく、単なる相対分子量（ここで使用した標準物質
の相対値）である。ここで注記すべきは、プルランスタ
ンダードを使用したため、溶出図の１２分＜ｔ＜２５分
（≡１０3ｇ／モル＜ＭＷ＜１０7ｇ／モル）の範囲し
か、相対分子量の算出に有用でないことである。片対数
プロット（ｔＥ対ｌｏｇ（Ｍ））であれば、曲線下面積
が被検物質量にだいたい比例している[反応式（１）参
照]。溶出図では、不変の総面積を標準化しているの
で、各物質の曲線下面積−すなわち、物質の特異量−を
直接比較できる。
【００９６】観察結果を以下に示す：標識ゼラチンと非
標識ゼラチンおよびリシルオキシダーゼとのインキュベ
ート時間を延長すると、それに伴い、ＦＣＳ測定による
τ値（分子の大きさに比例）の低下、同時に蛍光強度
（Ｉ、ｋｃｐｓ）の減少（表１、図３）が観察された。
【００９７】加えて、インキュベーション時間の延長と
共に、ＧＰＣで確認される高分子ゼラチンの割合が減少
した（表２、図４）。
【００９８】ゼラチンはリシルオキシダーゼとのインキ
ュベートにより架橋する。架橋したタンパクは、水に全
く溶解せず、膨潤ゲル粒子となる。ＦＣＳおよびＧＰＣ
のサンプル調整時に、これらの粒子を遠心分離または濾
過操作により除去し、検出されないようにした。
【００９９】ゼラチンのインキュベーション時間の延長
に伴い、溶出図において、高分子ゼラチン部分が優先的
に消失した。このことは、架橋が、なんといっても高分
子ゼラチン部分に対し、不均等なほど大きい影響を及ぼ
すことを意味している。これは統計的根拠をもってして
も全く妥当な結果である。加えて、リシン群の分子量依
存的分布もまた、この結果をもたらす原因の一部を担っ
ていると思われる。
【０１００】ＦＣＳ測定で見られたτの減少は、分子量
の減少と判断され、これはゲル濾過クロマトグラフィー
で直接確認できる。強度の減少は、生成物を再溶解した
際の上清に存在する蛍光粒子の数の減少に起因する。大
きなゼラチン分子の方が、小さな分子よりも高い確率で
架橋による影響を受けやすいと考えられる。さらに、小
さい分子は、不溶性部に残留する未架橋の大きなゼラチ
ン分子と比べて、リシルオキシダーゼの働きで確立され
たネットワークを、より回避しやすい。
【０１０１】従って、リシルオキシダーゼにより生成す
るアリシンおよび続いて生成するシッフの塩基の数が、
架橋に十分であることが分かる。
【０１０２】例４ マイクロタイタープレートを用いた、迅速かつ平行して
実行できる架橋の実施 ゼラチンを、ｐＨ８.４のホウ酸緩衝液中、１ｍＭ Ｎ
−ヒドロキシサクシンイミド−活性化ビオチンで標識
し、ｐＨ７.４の２０ｍＭリン酸緩衝液で数回透析し
た。このようにして標識したゼラチンの、アビジンまた
はストレプトアビジンへの結合能は、予備実験で確認さ
れている。ビオチン標識後のゼラチン１０〜１００ｍｇ
／ｍｌはアビジン修飾したビアコアセンサーチップ（Bi
acore sensorchip)表面に結合する。未標識ゼラチンは
この表面に結合しない。
【０１０３】試験の原理および方法 ゼラチンをマイクロタイタープレートの表面へ吸着し
た。次に、ビオチン標識ゼラチンおよび架橋物質／酵素
を添加した。吸着したゼラチンはビオチニル化ゼラチン
と架橋する。洗浄工程の後、ストレプトアビジン−ペル
オキシダーゼ複合体を使用して、ビオチニル化を検出し
た。
【０１０４】ｐＨ９.２である、０.１Ｍ ＮａＨＣＯ3
中の１％濃度ゼラチン溶液０.４ｍｌをＮＵＮＣマキシ
ソープエライザプレート（MaxiSorp Elisa plates)上
に、室温で３時間かけて吸着させた。続いて、これをＰ
ＢＳ、０.０５％トゥィーン２０（Tween 20)溶液で３回
洗浄した。
【０１０５】それからビオチニル化ゼラチンおよび異な
る濃度の架橋剤を添加した。この操作を５ｍＭ ＤＴＴ
および０.１％トゥィーン２０を含むＰＢＳ緩衝液中で
実施した。マイクロタイタープレートを様々な温度と時
間でインキュベートした。次に、未反応材料を除去する
ため、このプレートを６回洗浄した。
【０１０６】検出の際に、ベーリンガー社製ストレプト
アビジン−ペルオキシダーゼをＰＢＳ、０.１％トゥィ
ーン２０で１：１００００に希釈し、各ウェルに１ｍｌ
づつ添加した。インキュベーションを新たに室温（約２
３℃）で３０分間実施した。さらに洗浄工程を経てた
後、反応混合物（４２ｍＭテトラメチルベンジジンのＤ
ＭＳＯ溶液０.１ｍｌ、０.１Ｍ酢酸ナトリウム１０ｍ
ｌ、クエン酸でｐＨを４.９に調整）を添加した。この
反応過程により青色の溶液ができる。５分後に２Ｍ硫酸
０.１ｍｌにより反応を停止させた。青色は次第に黄色
に変化した。４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１０７】例５ リシルオキシダーゼの精製 細胞破砕 −２０℃で保存した後、ピキアパストリスの細胞（約１
８ｍｌ）を解凍し、緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウ
ム、１ｍＭエタノールアミン、ｐＨ７.０）で５０ｍｌ
に希釈する。ガラスビーズ５０ｍｌ、直径０.５ｍｍ、
を添加し、氷中で冷却しながら５０００ｒｐｍで３０分
間かけて細胞を破砕した。破砕後の懸濁液をガーゼで濾
過した。濾液を４℃、８０００ｒｐｍで１０分間、遠心
分離した。
【０１０８】イオン交換クロマトグラフィー 上清をＮａＯＨでｐＨ７.０に再調整し、Ｑ−セファロ
ースカラム（Ｑ−Sepharose Fast Flow、ファルマシ
ア、直径５ｃｍ、長さ１３ｃｍ、容量２５０ｍｌ）にの
せた。カラム（コンダクティヴィティー０.７ｍＳ／ｃ
ｍ、５４０ｍｌ）にのせた後、緩衝液Ａ６００ｍｌを流
した。カラムは、緩衝液Ａ１ｌと緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに
１Ｍ ＮａＣｌを添加したもの）１ｌとの直線勾配（リ
ニアグラジエント）により溶出させた。活性のある分画
を回収した。
【０１０９】分子ふるいクロマトグラフィー 関連分画を１０ｋＤａのオメガフィルターを通して濃縮
し、分取用スーパーデックスカラム（ファルマシア、直
径２.６ｃｍ、長さ６０ｃｍ、容量３２０ｍｌ）にの
せ、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭＮａ
Ｃｌ、１ｍＭエタノールアミン、ｐＨ７.５、流速３ｍ
ｌ／分の条件で分離した。活性のある分画を回収した。
【０１１０】イオン交換クロマトグラフィー 分子ふるいクロマトグラフィーで得た関連分画を精製
し、ＭｏｎｏＱカラム（ファルマシア、ＨＲ５／５）を
用いたクロマトグラフィーによりさらに精製した。緩衝
液Ａおよび緩衝液Ｂで勾配（グラジエント）をかけた。
流速１ｍｌ／分、１ｍｌづつで１００フラクションを取
った。リシルオキシダーゼは主要活性タンパクとして溶
出された。このタンパクは、還元条件下のＳＤＳゲルに
よる検出で、分子量が約１２１０００Ｄａであった。
【０１１１】以下に示す配列が得られた： アミノ−末端配列
【０１１２】
【化６】
【０１１３】トリプシンによるタンパクの切断後に得ら
れたペプチドに対応する配列：
【０１１４】
【化７】
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光相関分光計（＝ＦＣＳ）装置の図である。
【図２】図１のＦＣＳ装置を使用して、平均滞留時間τ
および分子量を導く方法を示す図である。
【図３】インキュベーション時間とτ値あるいは蛍光強
度との関係を示すグラフである。
【図４】インキュベーション時間と分子量の関係を示す
グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ２３Ｊ 3/18 Ａ２３Ｊ 3/18 Ａ２３Ｋ 1/16 ３０３ Ａ２３Ｋ 1/16 ３０３Ｆ Ａ２３Ｌ 1/00 Ａ２３Ｌ 1/00 Ｃ Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ヴォルフガング ベヴェルト ドイツ連邦共和国 フランケンタール ロ ルシャー リング ８ツェー (72)発明者 エリック リュデッケ ドイツ連邦共和国 ムターシュタット ト ーマス−マン−シュトラーセ 27 (72)発明者 ユルゲン クリングラー ドイツ連邦共和国 ムターシュタット ブ ルネンシュトラーセ 31 (72)発明者 ローベルト ヘーガー ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク リー グニッツァーシュトラーセ ３

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 活性成分配合物の製造方法において、ひ
    とつまたはそれ以上の活性成分が少なくともひとつの被
    膜で取り囲まれ、活性成分を取り囲む被膜の少なくとも
    ひとつ、またはそのような被膜の一部が、リポキシゲナ
    ーゼ、タンパクジスルフィドイソメラーゼ、フェノール
    オキシダーゼ、フェノールペルオキシダーゼ、リシルオ
    キシダーゼ、タンパクジスルフィドリダクターゼ、チロ
    シンオキシダーゼまたはスルフヒドリルオキシダーゼか
    ら成る群より選択される酵素で架橋されたタンパクから
    成る、活性成分配合物の製造方法。
  2. 【請求項２】 活性成分、または少なくともひとつの被
    膜で取り囲まれたひとつまたはそれ以上の活性成分を、
    コーティングに必要とされる架橋可能なタンパクおよび
    酵素とともに溶液中に混合し、ここで活性成分とタンパ
    クの質量比が１：１００〜５：１である、請求項１記載
    の活性成分配合物の製造方法。
  3. 【請求項３】 ビタミン、酵素、ヒト食物用添加物また
    は動物飼料用添加物を活性成分として使用する、請求項
    １または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 活性成分が疎水性である、請求項１から
    ３までのいずれか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】 ゼラチン、カゼイン、大豆タンパク、小
    麦タンパク、とうもろこしタンパクまたはコラーゲンか
    ら成る群より選択した架橋可能なタンパクを使用する、
    請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】 微生物由来の酵素を使用する、請求項１
    から５までのいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 リシルオキシダーゼ酵素で架橋を行う、
    請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
  8. 【請求項８】 少なくともひとつの活性成分を、架橋可
    能なタンパクおよび酵素から成る水溶液と混合し、噴霧
    する、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
  9. 【請求項９】 疎水性シリカ、コーンスターチまたは疎
    水性コーンスターチで負荷した雰囲気下に噴霧操作を行
    う、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 活性成分配合物を乾燥し、湿分残量を
    １０質量％より低くする、請求項１から９までのいずれ
    か１項記載の方法。
  11. 【請求項１１】 活性成分配合物の製造時の温度を、基
    本的に８０℃より低く保つ、請求項１から１０までのい
    ずれか１項記載の方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１から１１までのいずれか１項
    記載の方法で得られる、活性成分配合物。
  13. 【請求項１３】 ひとつまたはそれ以上の活性成分を取
    り囲む少なくともひとつの被膜、または、そのような被
    膜の一部が、リポキシゲナーゼ、タンパクジスルフィド
    イソメラーゼ、フェノールオキシダーゼ、フェノールペ
    ルオキシダーゼ、リシルオキシダーゼ、タンパクジスル
    フィドリダクターゼ、チロシンオキシダーゼまたはスル
    フヒドリルオキシダーゼから成る群より選択される酵素
    で架橋されたタンパクから成る、活性成分配合物。
  14. 【請求項１４】 活性成分が： カロチノイド キサントフィル ビタミンＡ ビタミンＥ ビタミンＤ3 ビタミンＫ1 から成る群より選択される、請求項１３記載の活性成分
    配合物。
  15. 【請求項１５】 剥離剤または剥離剤混合物の含量が、
    活性成分質量の０.０２５〜４倍である、請求項１３ま
    たは１４記載の活性成分配合物。
  16. 【請求項１６】 活性成分配合物中の活性成分含量が、
    １〜７５質量％である、請求項１３から１５までのいず
    れか１項記載の活性成分配合物。
  17. 【請求項１７】 以下に示すアミノ酸配列： 【化１】 の少なくともひとつを有し、リシンのアミノメチル基を
    ホルミル基へ酸化し得る、単離タンパク。
  18. 【請求項１８】 リポキシゲナーゼ、タンパクジスルフ
    ィドイソメラーゼ、フェノールオキシダーゼ、フェノー
    ルペルオキシダーゼ、リシルオキシダーゼ、タンパクジ
    スルフィドリダクターゼ、チロシンオキシダーゼまたは
    スルフヒドリルオキシダーゼから成る群より選択される
    酵素の、活性成分配合物製造のための使用。
  19. 【請求項１９】 請求項１３から１６までのいずれか１
    項記載の活性成分配合物を含有する、ヒト用食物または
    動物用飼料。
  20. 【請求項２０】 請求項１３から１６までのいずれか１
    項記載の活性成分配合物を含有する、医薬組成物。
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