JP2000146968A - 酵素免疫測定法 - Google Patents
酵素免疫測定法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として
用い、新規な化学発光系により抗原又は抗体を免疫学的
に測定する方法を提供する。 【解決手段】 ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として
用いる酵素免疫測定法において、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換
カルボン酸アミド化合物及びギ酸の存在下において光照
射下に反応させることにより得られる化学発光試薬を用
いる化学発光法により抗原又は抗体を免疫学的に高感度
に測定する方法。
用い、新規な化学発光系により抗原又は抗体を免疫学的
に測定する方法を提供する。 【解決手段】 ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として
用いる酵素免疫測定法において、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換
カルボン酸アミド化合物及びギ酸の存在下において光照
射下に反応させることにより得られる化学発光試薬を用
いる化学発光法により抗原又は抗体を免疫学的に高感度
に測定する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、化学発光法を利用
する酵素免疫測定法に関するものであり、更に詳しく
は、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、特定
の新規化学発光試薬を用いる抗原又は抗体の免疫学的測
定方法に関するものである。
する酵素免疫測定法に関するものであり、更に詳しく
は、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、特定
の新規化学発光試薬を用いる抗原又は抗体の免疫学的測
定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】酵素免疫測定法は、標識物質に放射性同
位元素を使用しないので良好な測定環境を保持すること
が可能であり、人体に対して危険性の少ない免疫測定法
として開発され、種々の物質の測定系に利用されてい
る。この酵素免疫測定法において使用される酵素として
は、ぺルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−
ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ等を挙げ
ることができる。これらの酵素を用いた酵素標識抗体又
は抗原の酵素活性を検出する方法としては、過酸化水素
／ｏ−フェニレンジアミン、４−ニトロフェニル−ホス
フェ−ト、２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド等の
酵素基質の酵素による分解反応に伴い生成する発色性物
質の発色量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性
と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する比色法が
一般的である。
位元素を使用しないので良好な測定環境を保持すること
が可能であり、人体に対して危険性の少ない免疫測定法
として開発され、種々の物質の測定系に利用されてい
る。この酵素免疫測定法において使用される酵素として
は、ぺルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−
ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ等を挙げ
ることができる。これらの酵素を用いた酵素標識抗体又
は抗原の酵素活性を検出する方法としては、過酸化水素
／ｏ−フェニレンジアミン、４−ニトロフェニル−ホス
フェ−ト、２−ニトロフェニル−β−ガラクトシド等の
酵素基質の酵素による分解反応に伴い生成する発色性物
質の発色量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活性
と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する比色法が
一般的である。
【０００３】しかしながら、臨床化学分析においては、
その測定対象が生体試料（主として血清、尿等）であ
り、その測定値は病態の診断又は経過観察等に用いられ
ることが多く、そのために、より高感度及び高精度な測
定が求められているが、比色法によりこの要求を完全に
満足させることは難しい。
その測定対象が生体試料（主として血清、尿等）であ
り、その測定値は病態の診断又は経過観察等に用いられ
ることが多く、そのために、より高感度及び高精度な測
定が求められているが、比色法によりこの要求を完全に
満足させることは難しい。
【０００４】そこで、この要求を満たすことを目的とし
て蛍光法が提案されている。蛍光法とは、標識に用いた
酵素の触媒活性により、４−ヒドロキシフェニル酢酸、
４−メチルウムベリフェリル−β−ガラクトシド、４−
メチルウムベリフェリル−ホスフェート等の蛍光基質を
分解して蛍光を発生させた後、この蛍光強度を測定して
酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体
又は抗原の量を定量する方法である。しかし、蛍光法で
は、励起光の散乱が存在するため上記の要求を満たすに
は充分とは云い難い。また、比色法及び蛍光法では、キ
セノンランプ等の光源が必要であり、光源からの光に由
来する迷走現象や溶媒に由来するラマン光が原因とな
り、バックグラウンドのレベルを上昇させてしまうの
で、比色法及び蛍光法による測定の高感度化は原理的に
困難である。
て蛍光法が提案されている。蛍光法とは、標識に用いた
酵素の触媒活性により、４−ヒドロキシフェニル酢酸、
４−メチルウムベリフェリル−β−ガラクトシド、４−
メチルウムベリフェリル−ホスフェート等の蛍光基質を
分解して蛍光を発生させた後、この蛍光強度を測定して
酵素活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体
又は抗原の量を定量する方法である。しかし、蛍光法で
は、励起光の散乱が存在するため上記の要求を満たすに
は充分とは云い難い。また、比色法及び蛍光法では、キ
セノンランプ等の光源が必要であり、光源からの光に由
来する迷走現象や溶媒に由来するラマン光が原因とな
り、バックグラウンドのレベルを上昇させてしまうの
で、比色法及び蛍光法による測定の高感度化は原理的に
困難である。
【０００５】近年、比色法及び蛍光法を上回る高感度な
酵素免疫測定方法として、化学発光酵素免疫測定法（Ｃ
ＬＥＩＡ）が開発され注目されている。ＣＬＥＩＡは、
酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て
励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出
される発光量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活
性と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する方法で
あり、化学反応により化学発光性物質を発光させるため
光源が不要であり、光源に起因するバックグラウンドの
上昇等がないため測定の高感度化が可能である。ＣＬＥ
ＩＡに用いられる酵素としては、ぺルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
これらのなかで、取り扱い易さ、入手し易さ等の点でぺ
ルオキシダーゼが好適に用いられる。酵素にペルオキシ
ダーゼ、化学発光性物質にルミノール、発光増強剤にｐ
−ヨードフェノールを各々用いる化学発光系が開発さ
れ、種々の物質が化学発光法により免疫学的に高感度に
定量することが可能になっている。
酵素免疫測定方法として、化学発光酵素免疫測定法（Ｃ
ＬＥＩＡ）が開発され注目されている。ＣＬＥＩＡは、
酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て
励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出
される発光量を測定して酵素活性を定量し、この酵素活
性と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する方法で
あり、化学反応により化学発光性物質を発光させるため
光源が不要であり、光源に起因するバックグラウンドの
上昇等がないため測定の高感度化が可能である。ＣＬＥ
ＩＡに用いられる酵素としては、ぺルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
これらのなかで、取り扱い易さ、入手し易さ等の点でぺ
ルオキシダーゼが好適に用いられる。酵素にペルオキシ
ダーゼ、化学発光性物質にルミノール、発光増強剤にｐ
−ヨードフェノールを各々用いる化学発光系が開発さ
れ、種々の物質が化学発光法により免疫学的に高感度に
定量することが可能になっている。
【０００６】しかしながら、ペルオキシダーゼ酵素を標
識物質とするＣＬＥＩＡにおいては、測定対象物質の低
濃度領域での定量性を更に高める必要性が生じるケース
が多く、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質とするＣＬＥ
ＩＡの更なる高感度化が望まれていた。
識物質とするＣＬＥＩＡにおいては、測定対象物質の低
濃度領域での定量性を更に高める必要性が生じるケース
が多く、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質とするＣＬＥ
ＩＡの更なる高感度化が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、前
記事情に鑑み、測定対象物質をより高感度で測定可能な
化学発光法による新規な免疫測定系を利用した酵素免疫
測定法を提供することを課題とする。
記事情に鑑み、測定対象物質をより高感度で測定可能な
化学発光法による新規な免疫測定系を利用した酵素免疫
測定法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
前記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びギ酸の
存在下において光照射下で反応させて得られる化学発光
性物質を含有する化学発光試薬を用い、さらに、発光増
強剤として特定のフェノール性化合物を用いる化学発光
系が、化学発光性物質にルミノールを用いる系と比較し
て測定対象物質をより高感度に免疫学的に定量すること
が可能なことを見い出し、これらの知見に基づいて本発
明を完成した。
前記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びギ酸の
存在下において光照射下で反応させて得られる化学発光
性物質を含有する化学発光試薬を用い、さらに、発光増
強剤として特定のフェノール性化合物を用いる化学発光
系が、化学発光性物質にルミノールを用いる系と比較し
て測定対象物質をより高感度に免疫学的に定量すること
が可能なことを見い出し、これらの知見に基づいて本発
明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は、ペルオキシダーゼ酵
素標識した抗体若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原
若しくは抗体又はそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反
応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体から
なる免疫複合体を形成させ、必要により、該免疫複合体
を不溶性担体に固定化した抗体若しくは抗原と反応させ
て該不溶性担体上に捕捉した後、これに、下記一般式
（１）
素標識した抗体若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原
若しくは抗体又はそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反
応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体から
なる免疫複合体を形成させ、必要により、該免疫複合体
を不溶性担体に固定化した抗体若しくは抗原と反応させ
て該不溶性担体上に捕捉した後、これに、下記一般式
（１）
【００１０】
【化３】 （上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 はアルキル
基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群よ
り選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、
Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、
アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲ
ン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異
なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１
又は２である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，
９’−ビスアクリジニウム塩類を、下記一般式（２）
基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群よ
り選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、
Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、
アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲ
ン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異
なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１
又は２である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，
９’−ビスアクリジニウム塩類を、下記一般式（２）
【００１１】
【化４】 （上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数
１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
ミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
2 はメチル基又はエチル基であり、Ｒ3 は炭素数１〜１
０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭
素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該
アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基
及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ
1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合している
カルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に
環を形成していてもよい。）で表わされるＮ，Ｎ−ジ置
換カルボン酸アミド化合物及びギ酸の存在下において光
照射下に反応させることにより得られる化学発光性物質
を含有する化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下に
おいて化学発光させ、その発光強度を測定することによ
り試料中の抗原又は抗体の量を定量することを特徴とす
る化学発光酵素免疫測定法に関するものである。
１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
ミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
2 はメチル基又はエチル基であり、Ｒ3 は炭素数１〜１
０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭
素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該
アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基
及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ
1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合している
カルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に
環を形成していてもよい。）で表わされるＮ，Ｎ−ジ置
換カルボン酸アミド化合物及びギ酸の存在下において光
照射下に反応させることにより得られる化学発光性物質
を含有する化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下に
おいて化学発光させ、その発光強度を測定することによ
り試料中の抗原又は抗体の量を定量することを特徴とす
る化学発光酵素免疫測定法に関するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明につき更に詳しく説
明する。本発明の化学発光酵素免疫測定法は、抗原抗体
反応により測定すべき抗原又は抗体をペルオキシダーゼ
酵素標識した免疫複合体として捕捉する免疫反応段階
と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識
酵素を用いる化学発光法により測定する化学発光反応段
階とからなる。
明する。本発明の化学発光酵素免疫測定法は、抗原抗体
反応により測定すべき抗原又は抗体をペルオキシダーゼ
酵素標識した免疫複合体として捕捉する免疫反応段階
と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識
酵素を用いる化学発光法により測定する化学発光反応段
階とからなる。
【００１３】免疫反応段階を構成する抗原抗体反応の方
法は任意であり、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
化合物及びギ酸の存在下において光照射下で反応させて
得られる化学発光試薬を用いることができるものであれ
ば、いずれの方法も採用することができる。例えば、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
を捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗体を反応
させるサンドイッチ法、 サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体
と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンド
イッチ錯体に対して、さらにこの抗体に対する標識第二
抗体を反応させる二抗体法、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる
競合法、 測定すべき抗原又は抗体を含有する試料にこれらと特
異的に反応する標識した抗体又は抗原を作用させて凝集
沈殿させた後、遠心分離して分離した免疫複合体中の標
識物質を検出する凝集沈殿法、 不溶性担体に結合した抗原に試料中の測定すべき抗体
をペルオキシダーゼ酵素標識抗ヒトガンマグロブリン抗
体を作用させる抗体検出法、さらに、 ビオチン標識抗体及びペルオキシダーゼ酵素標識アビ
ジンを反応させるビオチン−アビジン法等を非限定的に
用いることができる。
法は任意であり、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類を、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
化合物及びギ酸の存在下において光照射下で反応させて
得られる化学発光試薬を用いることができるものであれ
ば、いずれの方法も採用することができる。例えば、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
を捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗体を反応
させるサンドイッチ法、 サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体
と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンド
イッチ錯体に対して、さらにこの抗体に対する標識第二
抗体を反応させる二抗体法、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる
競合法、 測定すべき抗原又は抗体を含有する試料にこれらと特
異的に反応する標識した抗体又は抗原を作用させて凝集
沈殿させた後、遠心分離して分離した免疫複合体中の標
識物質を検出する凝集沈殿法、 不溶性担体に結合した抗原に試料中の測定すべき抗体
をペルオキシダーゼ酵素標識抗ヒトガンマグロブリン抗
体を作用させる抗体検出法、さらに、 ビオチン標識抗体及びペルオキシダーゼ酵素標識アビ
ジンを反応させるビオチン−アビジン法等を非限定的に
用いることができる。
【００１４】本発明の化学発光酵素免疫測定法に用いら
れる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリ
ロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッ
カライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁
性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、
不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、
繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレー
ト、試験管等の種々の形状で用いることができる。さら
に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は
任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合
法等を用いることができる。
れる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリ
ロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッ
カライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁
性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、
不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、
繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレー
ト、試験管等の種々の形状で用いることができる。さら
に、これら不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法は
任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合
法等を用いることができる。
【００１５】また、本発明の化学発光酵素免疫測定法に
おいて用いられる抗体類は、モノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体のいずれを使うことも可能であり、そ
の形態としては全抗体又はＦ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ等の
断片を用いることができる。また、抗体の起源は任意で
あるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来す
る抗体が好適に用いられる。
おいて用いられる抗体類は、モノクローナル抗体及びポ
リクローナル抗体のいずれを使うことも可能であり、そ
の形態としては全抗体又はＦ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ等の
断片を用いることができる。また、抗体の起源は任意で
あるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来す
る抗体が好適に用いられる。
【００１６】本発明の化学発光酵素免疫測定法の後段を
構成する化学発光反応は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’
−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸
アミド化合物及びギ酸の存在下において光照射により得
られる化学発光性物質を含有する化学発光試薬を用い、
そしてさらに発光増強剤の存在下に水素受容体を作用さ
せて不溶性担体上に捕捉された標識物質であるペルオキ
シダーゼ酵素の活性を測定するものであり、その測定方
法は任意であるが、一般に、化学発光性物質及び発光増
強剤を含有する測定試薬をペルオキシダーゼ酵素標識抗
体又は抗原を免疫学的に捕捉した不溶性担体に添加し、
特定塩基性ｐＨ領域において過酸化水素水溶液を添加し
て化学発光反応させ、その化学発光量を発光測定装置で
測定する方法等が行なわれている。
構成する化学発光反応は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’
−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸
アミド化合物及びギ酸の存在下において光照射により得
られる化学発光性物質を含有する化学発光試薬を用い、
そしてさらに発光増強剤の存在下に水素受容体を作用さ
せて不溶性担体上に捕捉された標識物質であるペルオキ
シダーゼ酵素の活性を測定するものであり、その測定方
法は任意であるが、一般に、化学発光性物質及び発光増
強剤を含有する測定試薬をペルオキシダーゼ酵素標識抗
体又は抗原を免疫学的に捕捉した不溶性担体に添加し、
特定塩基性ｐＨ領域において過酸化水素水溶液を添加し
て化学発光反応させ、その化学発光量を発光測定装置で
測定する方法等が行なわれている。
【００１７】次に、本発明の化学発光酵素免疫測定法に
用いられる化学発光試薬について説明する。化学発光試
薬を製造するためのＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類は、下記一般式（１）
用いられる化学発光試薬について説明する。化学発光試
薬を製造するためのＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類は、下記一般式（１）
【００１８】
【化５】 で表わされる化合物である。
【００１９】上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2
はアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリ
ール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、好まし
いアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、
メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル
基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及
びデシル基等の直鎖状又は分岐状アルキル基を挙げるこ
とができる。また、アリール基は炭素数６〜２０のもの
が好ましく、例えば、フェニル基、トリール基、キシリ
ル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換さ
れたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニ
ル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲ
ン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシ
リル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基
が好ましい。
はアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でもよい。アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリ
ール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、好まし
いアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例えば、
メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル
基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及
びデシル基等の直鎖状又は分岐状アルキル基を挙げるこ
とができる。また、アリール基は炭素数６〜２０のもの
が好ましく、例えば、フェニル基、トリール基、キシリ
ル基等を挙げることができ、さらにアルキル基で置換さ
れたものでもよい。アリール基としては、特に、フェニ
ル基が好ましい。ハロゲン化アリール基としてはハロゲ
ン化フェニル基、ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシ
リル基等を挙げることができ、特に、クロロフェニル基
が好ましい。
【００２０】一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5
及びＲ6 は、各々、水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２
０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。
例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル
基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリ
ーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロ
キシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。
及びＲ6 は、各々、水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２
０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。
例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル
基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリ
ーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロ
キシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。
【００２１】また、一般式（１）において、Ｘはｎ価の
陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとして
は、特に限定されるものではなく、硝酸イオン、ハロゲ
ンイオン（例えば、塩素イオン、フッ素イオン、臭素イ
オン等）、リン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオ
ン等を挙げることができる。これらの陰イオンのなか
で、特に硝酸イオンが好ましい。
陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとして
は、特に限定されるものではなく、硝酸イオン、ハロゲ
ンイオン（例えば、塩素イオン、フッ素イオン、臭素イ
オン等）、リン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオ
ン等を挙げることができる。これらの陰イオンのなか
で、特に硝酸イオンが好ましい。
【００２２】上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチ
ル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエ
チル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ
プロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’
−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、
Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウム
塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジフェニル−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，
９’−ビスアクリジニウム塩等を挙げられ、これらの対
イオンは、前記のような硝酸イオン、ハロゲンイオン、
リン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオン等であ
る。これらのなかで、特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニ
ン）が好適である。化学発光試薬の製造に用いられる
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、次の一般式
（２）
クリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチ
ル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエ
チル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ
プロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’
−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、
Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウム
塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジフェニル−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，
９’−ビスアクリジニウム塩等を挙げられ、これらの対
イオンは、前記のような硝酸イオン、ハロゲンイオン、
リン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオン等であ
る。これらのなかで、特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニ
ン）が好適である。化学発光試薬の製造に用いられる
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、次の一般式
（２）
【００２３】
【化６】 で表わされる化合物である。
【００２４】上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原
子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等からなる群より選
択される基で置換されていてもよい。Ｒ2 はメチル基及
びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は炭素数１〜
１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び
炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、
アリール基は、アルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ
基及びハロゲン原子等からなる群より選択される基で置
換されていてもよい。Ｒ1 及びＲ3 のアルキル基として
は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル
基、ノニル基、デシル基等の直鎖状又は分岐状のものを
挙げることができる。また、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合
して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子
及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよ
い。
子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等からなる群より選
択される基で置換されていてもよい。Ｒ2 はメチル基及
びエチル基からなる群より選択され、Ｒ3 は炭素数１〜
１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び
炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、
アリール基は、アルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ
基及びハロゲン原子等からなる群より選択される基で置
換されていてもよい。Ｒ1 及びＲ3 のアルキル基として
は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル
基、ノニル基、デシル基等の直鎖状又は分岐状のものを
挙げることができる。また、Ｒ1 及びＲ3 は互いに結合
して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子
及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよ
い。
【００２５】上記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアク
リルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，
Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリド
ン等を挙げることができる。
物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアク
リルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，
Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリド
ン等を挙げることができる。
【００２６】化学発光試薬の製造に必要なギ酸の存在
は、得られた化学発光試薬の発光反応時において発光強
度を大幅に増大させる効果を有し、光照射による反応に
おいて化学発光性物質の生成量を増大させる作用を示す
ものと考えられる。この作用はギ酸に特異的であり、酢
酸、プロピオン酸、安息香酸等の有機酸類やホルムアル
デヒド、アセトアルデヒド、ベンズアルデヒド等のアル
デヒド類にはその効果は全く認められない。
は、得られた化学発光試薬の発光反応時において発光強
度を大幅に増大させる効果を有し、光照射による反応に
おいて化学発光性物質の生成量を増大させる作用を示す
ものと考えられる。この作用はギ酸に特異的であり、酢
酸、プロピオン酸、安息香酸等の有機酸類やホルムアル
デヒド、アセトアルデヒド、ベンズアルデヒド等のアル
デヒド類にはその効果は全く認められない。
【００２７】化学発光試薬の製造の際に用いられる光照
射用の光線としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍ
の範囲の紫外可視部が用いられ、特に、約４００〜８０
０ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源として
は、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱
電灯等を非限定的に用いることができ、特に、白熱電灯
が好ましく用いられる。この光照射により得られる化学
発光試薬は、光源を用いずに自然光の下で製造した化学
発光試薬に較べて、同じ原料ルシゲニン濃度で製造し同
量で使用した場合に短時間で非常に高い発光強度を示す
ことと、この反応を光遮蔽下に実施した場合にはペルオ
キシダーゼ濃度依存性を有する化学発光試薬が得られな
いことから、化学発光性物質の生成には光照射が重要な
役割を担っていることが認められる。
射用の光線としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍ
の範囲の紫外可視部が用いられ、特に、約４００〜８０
０ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源として
は、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱
電灯等を非限定的に用いることができ、特に、白熱電灯
が好ましく用いられる。この光照射により得られる化学
発光試薬は、光源を用いずに自然光の下で製造した化学
発光試薬に較べて、同じ原料ルシゲニン濃度で製造し同
量で使用した場合に短時間で非常に高い発光強度を示す
ことと、この反応を光遮蔽下に実施した場合にはペルオ
キシダーゼ濃度依存性を有する化学発光試薬が得られな
いことから、化学発光性物質の生成には光照射が重要な
役割を担っていることが認められる。
【００２８】Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類は、ｐＨ８付近では過酸化水素ともペルオ
キシダーゼ存在下の過酸化水素とも顕著な発光反応は起
こさないが、これはＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウムカチオンが対イオン、特に硝酸イオンと
安定な塩を形成しているためと考えられる。しかし、
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物等の極性の高い
化合物の存在下で光照射を行なうことにより、Ｎ，Ｎ’
−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンへの
対アニオンからの電荷移動が促進され、イオン性の高い
塩類からラジカル性を有する電荷移動錯体に変化し、こ
の錯体がＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の配位
又は溶媒和によって安定化され、この安定化されたビラ
ジカル性化合物が過酸化水素の酵素分解により生成する
活性酸素と反応して、励起状態のジオキセタン構造を経
て発光するのでペルオキシダーゼ濃度に依存した発光強
度が得られるものと考えられる。この発光反応における
ギ酸の作用については、明確な反応機構は不明である
が、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム
カチオンへの電荷移動に関与してその反応を促進する作
用を有するものと考えられる。
ジニウム塩類は、ｐＨ８付近では過酸化水素ともペルオ
キシダーゼ存在下の過酸化水素とも顕著な発光反応は起
こさないが、これはＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウムカチオンが対イオン、特に硝酸イオンと
安定な塩を形成しているためと考えられる。しかし、
Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物等の極性の高い
化合物の存在下で光照射を行なうことにより、Ｎ，Ｎ’
−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンへの
対アニオンからの電荷移動が促進され、イオン性の高い
塩類からラジカル性を有する電荷移動錯体に変化し、こ
の錯体がＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の配位
又は溶媒和によって安定化され、この安定化されたビラ
ジカル性化合物が過酸化水素の酵素分解により生成する
活性酸素と反応して、励起状態のジオキセタン構造を経
て発光するのでペルオキシダーゼ濃度に依存した発光強
度が得られるものと考えられる。この発光反応における
ギ酸の作用については、明確な反応機構は不明である
が、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム
カチオンへの電荷移動に関与してその反応を促進する作
用を有するものと考えられる。
【００２９】上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化
合物及びギ酸の存在下における発光反応において、Ｎ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対
するＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びギ酸の
モル比は、過剰なＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物量及びギ酸量が望ましいが、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，
９’−ビスアクリジニウム塩類に対してＮ，Ｎ−ジ置換
カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モルの量で用いる
ことができ、さらに、同種及び／又は異種のＮ，Ｎ−ジ
置換カルボン酸アミド化合物及び／又はその他の溶媒を
反応溶媒として用いることもできる。ギ酸はＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対して１
〜１万倍モル、好ましくは１０〜１千倍モル、更に好ま
しくは５０〜５００倍モルの割合で用いることができ
る。
クリジニウム塩類のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化
合物及びギ酸の存在下における発光反応において、Ｎ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対
するＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びギ酸の
モル比は、過剰なＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物量及びギ酸量が望ましいが、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，
９’−ビスアクリジニウム塩類に対してＮ，Ｎ−ジ置換
カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モルの量で用いる
ことができ、さらに、同種及び／又は異種のＮ，Ｎ−ジ
置換カルボン酸アミド化合物及び／又はその他の溶媒を
反応溶媒として用いることもできる。ギ酸はＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対して１
〜１万倍モル、好ましくは１０〜１千倍モル、更に好ま
しくは５０〜５００倍モルの割合で用いることができ
る。
【００３０】上記光照射反応の反応温度は用いられる溶
媒の有無及び種類によって異なるが、一般的に−１０〜
＋１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ましくは
２０〜９０℃の範囲の温度である。反応時間は１分〜一
昼夜、好ましくは１０分〜１５時間、特に好ましくは３
０分〜１０時間の範囲の時間でよい。
媒の有無及び種類によって異なるが、一般的に−１０〜
＋１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ましくは
２０〜９０℃の範囲の温度である。反応時間は１分〜一
昼夜、好ましくは１０分〜１５時間、特に好ましくは３
０分〜１０時間の範囲の時間でよい。
【００３１】また、化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３
の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、
ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この
発光は、フェノール性化合物等の発光促進剤によって増
強することが認められる。このようなフェノール性化合
物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェ
ノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−
（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨード
フェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブ
ロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジク
ロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾ
チアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が
非限定的に挙げられる。
の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、
ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この
発光は、フェノール性化合物等の発光促進剤によって増
強することが認められる。このようなフェノール性化合
物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェ
ノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−
（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨード
フェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブ
ロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジク
ロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾ
チアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が
非限定的に挙げられる。
【００３２】化学発光試薬の濃度は、１０-8〜１Ｍ、好
ましくは１０-6〜１０-2Ｍ、更に好ましくは、１０-4〜
１０-2Ｍの範囲であり、その使用量は１０〜５００μ
ｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲が望ましい。ま
た、発光促進剤は、化学発光試薬の量の０．０１〜１０
０倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲で用
い、その濃度は１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０
-2Ｍの範囲で用いるのが望ましい。
ましくは１０-6〜１０-2Ｍ、更に好ましくは、１０-4〜
１０-2Ｍの範囲であり、その使用量は１０〜５００μ
ｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲が望ましい。ま
た、発光促進剤は、化学発光試薬の量の０．０１〜１０
０倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲で用
い、その濃度は１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０
-2Ｍの範囲で用いるのが望ましい。
【００３３】化学発光反応に用いられる水素受容体とし
ては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るものであ
れば特に限定されるものではないが、有機過酸化物、無
機過酸化物等が任意に用いられるが、過酸化水素が好ま
しく用いられる。この水素受容体の使用量は化学発光試
薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、
その使用量は化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好
ましくは１０〜１０００倍モルの範囲で用いるのが望ま
しい。
ては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るものであ
れば特に限定されるものではないが、有機過酸化物、無
機過酸化物等が任意に用いられるが、過酸化水素が好ま
しく用いられる。この水素受容体の使用量は化学発光試
薬に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、
その使用量は化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好
ましくは１０〜１０００倍モルの範囲で用いるのが望ま
しい。
【００３４】また、ペルオキシダーゼを標識物質として
抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合に
は、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼ
として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ま
しく用いられる。
抗体、核酸等を標識して種々の物質を定量する場合に
は、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼ
として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ま
しく用いられる。
【００３５】化学発光反応に用いる塩基性緩衝液として
は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸
緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に
用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜
１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面
活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることがで
きる。
は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸
緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に
用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜
１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面
活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることがで
きる。
【００３６】本発明の化学発光酵素免疫測定法における
化学発光反応の発光量の測定は発光光度計を用いて測定
することができる。その際に、発光量測定の開始点及び
積算時間は任意であるが、発光量が安定し且つ発光量の
濃度依存性の高い時間を選択することが望ましい。例え
ば、測定開始点は試薬混合後０〜１時間、好ましくは０
〜３０分、特に好ましくは０〜１５分であり、測定の積
算時間は１秒〜１分、好ましくは１〜３０秒、特に好ま
しくは１〜１０秒である。
化学発光反応の発光量の測定は発光光度計を用いて測定
することができる。その際に、発光量測定の開始点及び
積算時間は任意であるが、発光量が安定し且つ発光量の
濃度依存性の高い時間を選択することが望ましい。例え
ば、測定開始点は試薬混合後０〜１時間、好ましくは０
〜３０分、特に好ましくは０〜１５分であり、測定の積
算時間は１秒〜１分、好ましくは１〜３０秒、特に好ま
しくは１〜１０秒である。
【００３７】
【実施例】以下、参考例と共に実施例及び比較例を示
し、本発明を具体的に説明する。もっとも本発明は実施
例等により限定されるものではない。尚、参考例及び実
施例中の％は重量％を意味する。
し、本発明を具体的に説明する。もっとも本発明は実施
例等により限定されるものではない。尚、参考例及び実
施例中の％は重量％を意味する。
【００３８】［参考例１］化学発光試薬の調製 ルシゲニンを１．５ｍｇ試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルホルムアミドを１ｍｌ及びギ酸２０μｌを加え
て均一に溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０
Ｗのコピーランプを３時間照射することにより化学発光
性物質を含有する化学発光試薬を得た。次に、この化学
発光試薬を８×１０-4Ｍのｐ−ヨードフェノール７５ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液で５００倍に希釈する
ことにより化学発光試薬溶液を調製した。
ジメチルホルムアミドを１ｍｌ及びギ酸２０μｌを加え
て均一に溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０
Ｗのコピーランプを３時間照射することにより化学発光
性物質を含有する化学発光試薬を得た。次に、この化学
発光試薬を８×１０-4Ｍのｐ−ヨードフェノール７５ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液で５００倍に希釈する
ことにより化学発光試薬溶液を調製した。
【００３９】［参考例２］不溶性担体固定化ポリクローナル抗体の製造 抗原に特異的反応性を有する兎等の動物由来のポリクロ
ーナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)
（ＰＢＳ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を、
白色マイクロプレート（ラボシステム社）の各ウェルに
０．１ｍｌずつ加え、３７℃の温度で１時間放置した
後、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）水溶液を０．３ｍｌずつ加えて３７℃の温度
で１時間放置してポストコーティング処理を実施してポ
リクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得た。
ーナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)
（ＰＢＳ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を、
白色マイクロプレート（ラボシステム社）の各ウェルに
０．１ｍｌずつ加え、３７℃の温度で１時間放置した
後、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）水溶液を０．３ｍｌずつ加えて３７℃の温度
で１時間放置してポストコーティング処理を実施してポ
リクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得た。
【００４０】［参考例３］ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体の製造 抗原に特異的反応性を有するマウス由来のモノクローナ
ル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(pH
7.4) に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液１ｍｌ
に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイ
ミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のジメ
チルホルムアミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５℃の温
度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセ
ファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１
Ｍリン酸緩衝液(pH6.0) でゲル濾過を行ない、マレイミ
ド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
ル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(pH
7.4) に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液１ｍｌ
に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイ
ミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のジメ
チルホルムアミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５℃の温
度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセ
ファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１
Ｍリン酸緩衝液(pH6.0) でゲル濾過を行ない、マレイミ
ド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
【００４１】一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホース
ラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍ
ｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−
（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１
０ｍｇ／ｍｌの濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃
の温度で３０分間反応させた。
ラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍ
ｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−
（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１
０ｍｇ／ｍｌの濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃
の温度で３０分間反応させた。
【００４２】次いで、この反応混合液をセファデックス
Ｇ−２５を充填したカラムを用い、１０ｍＭ酢酸緩衝液
(pH4.5) でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィド化
ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオンバッ
ク中において氷冷下に約１０倍に濃縮した。次に、これ
に０．１Ｍジチオスレイトールを含有する０．１Ｍ酢酸
緩衝生理食塩水(pH4.5) １ｍｌを添加して、２５℃の温
度で３０分間撹拌してＨＲＰ分子中に導入したピリジル
ジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセファ
デックスＧ−２５を充填したカラムを用いてゲル濾過
し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。
Ｇ−２５を充填したカラムを用い、１０ｍＭ酢酸緩衝液
(pH4.5) でゲル濾過して精製、ピリジルジスルフィド化
ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロジオンバッ
ク中において氷冷下に約１０倍に濃縮した。次に、これ
に０．１Ｍジチオスレイトールを含有する０．１Ｍ酢酸
緩衝生理食塩水(pH4.5) １ｍｌを添加して、２５℃の温
度で３０分間撹拌してＨＲＰ分子中に導入したピリジル
ジスルフィド基を還元した後、この反応混合液をセファ
デックスＧ−２５を充填したカラムを用いてゲル濾過
し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。
【００４３】次に、マレイミド化モノクローナル抗体と
チオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用い
て氷冷下に４ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃
で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰ
ＲＡＣＯＲ社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、
ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体を得た。
チオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用い
て氷冷下に４ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃
で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰ
ＲＡＣＯＲ社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、
ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体を得た。
【００４４】［実施例１］同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロテ
イン（ＡＦＰ）の測定 兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を
０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標
識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.
4) １００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキ
ュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した
後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに
７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) １００μｌを加え、
これに参考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ
及び０．００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩
酸緩衝液(pH8.0) ５０μｌを順次注入して発光させた
後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製
ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定
し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることに
より、図１に示される濃度依存性の良い検量線を得た。
この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを０．０２
ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。
イン（ＡＦＰ）の測定 兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を
０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標
識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.
4) １００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキ
ュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した
後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに
７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) １００μｌを加え、
これに参考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ
及び０．００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩
酸緩衝液(pH8.0) ５０μｌを順次注入して発光させた
後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製
ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定
し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることに
より、図１に示される濃度依存性の良い検量線を得た。
この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰを０．０２
ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。
【００４５】［実施例２］同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるプロラクチン（Ｐ
ＲＬ）の測定 兎抗ヒトＰＲＬポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＰＲＬ（標準物質）を
０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標
識マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約２μｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.
4) １００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキ
ュベートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去し、
ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５
ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) １００μｌを加え、これ
に参考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩
衝液(pH8.0) ５０μｌを順次注入して発光させた後、こ
の発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナ
スＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、こ
の値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、
図２に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検
量線を用いて血清検体中のヒトプロラクチンを０．１ｎ
ｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。
ＲＬ）の測定 兎抗ヒトＰＲＬポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＰＲＬ（標準物質）を
０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標
識マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約２μｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.
4) １００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキ
ュベートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引除去し、
ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５
ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) １００μｌを加え、これ
に参考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩
衝液(pH8.0) ５０μｌを順次注入して発光させた後、こ
の発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナ
スＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、こ
の値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、
図２に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検
量線を用いて血清検体中のヒトプロラクチンを０．１ｎ
ｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能であった。
【００４６】［実施例３］同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるヒト絨毛性ゴナド
トロピンβ鎖（βｈＣＧ）の測定 兎抗ヒトｈＣＧポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したβｈＣＧ（標準物質）を０
〜２００ｍＩＵ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標
識マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4)
１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベ
ートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウ
ェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.0) １００μｌを加え、これに
参考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩
衝液(pH8.0) ５０μｌを順次注入して発光させた後、こ
の発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナ
スＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、こ
の値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、
図３に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検
量線を用いて血清検体中のβｈＣＧを０．１ｍＩＵ／ｍ
ｌの濃度まで測定することが可能であった。
トロピンβ鎖（βｈＣＧ）の測定 兎抗ヒトｈＣＧポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したβｈＣＧ（標準物質）を０
〜２００ｍＩＵ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標
識マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ／ｍ
ｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.4)
１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベ
ートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウ
ェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.0) １００μｌを加え、これに
参考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び
０．００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩
衝液(pH8.0) ５０μｌを順次注入して発光させた後、こ
の発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナ
スＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、こ
の値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、
図３に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検
量線を用いて血清検体中のβｈＣＧを０．１ｍＩＵ／ｍ
ｌの濃度まで測定することが可能であった。
【００４７】［比較例１］ルミノールを用いる同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによ
るα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定 兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を
０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標
識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.
4) １００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキ
ュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した
後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに
ｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌを加え、これ
にルミノールを５．６×１０-5Ｍの濃度で含有する０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌ、及び０．０
０３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.
4) ５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノ
メーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００
Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃
度に対してプロットすることにより、図４に示される濃
度依存性を有する検量線を得た。この検量線を用いて血
清検体中のヒトＡＦＰを２．０ｎｇ／ｍｌの濃度まで測
定することが可能であった。
るα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定 兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を
０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液(pH7.4) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標
識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μｇ／
ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.
4) １００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキ
ュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した
後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに
ｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌを加え、これ
にルミノールを５．６×１０-5Ｍの濃度で含有する０．
１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌ、及び０．０
０３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.
4) ５０μｌを注入して発光させ、この発光量をルミノ
メーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００
Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃
度に対してプロットすることにより、図４に示される濃
度依存性を有する検量線を得た。この検量線を用いて血
清検体中のヒトＡＦＰを２．０ｎｇ／ｍｌの濃度まで測
定することが可能であった。
【００４８】
【発明の効果】本発明の化学発光酵素免疫測定法によれ
ば、入手が容易であり取り扱いも比較的に容易なペルオ
キシダーゼ酵素を標識物質として用い、安価で入手が容
易であるルシゲニン等を出発原料とし、且つ容易に製造
できる新規化学発光試薬を用いる化学発光法により測定
対象物質である種々の抗原又は抗体類を免疫学的に高感
度に測定することができる。
ば、入手が容易であり取り扱いも比較的に容易なペルオ
キシダーゼ酵素を標識物質として用い、安価で入手が容
易であるルシゲニン等を出発原料とし、且つ容易に製造
できる新規化学発光試薬を用いる化学発光法により測定
対象物質である種々の抗原又は抗体類を免疫学的に高感
度に測定することができる。
【図１】 実施例１記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。
【図２】 実施例２記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトプロラクチン（標準物質）の濃度の
関数としてプロットして作成したヒトプロラクチン測定
用の検量線である。
た化学発光量をヒトプロラクチン（標準物質）の濃度の
関数としてプロットして作成したヒトプロラクチン測定
用の検量線である。
【図３】 実施例３記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をβｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数とし
てプロットして作成したβｈＣＧ測定用の検量線であ
る。
た化学発光量をβｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数とし
てプロットして作成したβｈＣＧ測定用の検量線であ
る。
【図４】 比較例１記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトαＡＦＰ測定用の検量
線である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 荒谷 弦一郎 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 細越 未央 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 Ｆターム(参考） 2G054 AA06 AB04 CA21 CE01 CE10 EA01 GB10
Claims (7)
- 【請求項１】 ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体
若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原若しくは抗体又
はこれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペルオ
キシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体
を形成させた後、下記一般式（１） 【化１】 （上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 はアルキル
基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群よ
り選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、
Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、
アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲ
ン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異
なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１
又は２である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，
９’−ビスアクリジニウム塩類を、下記一般式（２） 【化２】 （上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数
１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
ミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
2 はメチル基又はエチル基であり、Ｒ3 は炭素数１〜１
０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭
素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該
アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基
及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ
1 及びＲ3 は互いに結合して、それぞれが結合している
カルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に
環を形成していてもよい。）で表わされるＮ，Ｎ−ジ置
換カルボン酸アミド化合物及びギ酸の存在下において光
照射下に反応させることにより得られる化学発光性物質
を含有する化学発光試薬を用い、水素受容体の存在下に
おいて化学発光させ、その発光強度を測定することによ
り試料中の抗原又は抗体の量を定量することを特徴とす
る化学発光酵素免疫測定法。 - 【請求項２】 前記抗原抗体反応を不溶性担体に固
定化した抗体の存在下に行ない、標識化された免疫複合
体を該不溶性担体上に形成させる請求項１に記載の化学
発光酵素免疫測定法。 - 【請求項３】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニ
ン）である請求項１又は２に記載の化学発光酵素免疫測
定法。 - 【請求項４】 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミ
ド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はＮ，Ｎ
−ジメチルアセトアミドである請求項１〜３のいずれか
の請求項に記載の化学発光酵素免疫測定法。 - 【請求項５】 前記水素受容体が、過酸化水素又は
過酸化水素源である請求項１〜４のいずれかの請求項に
記載の化学発光酵素免疫測定法。 - 【請求項６】 前記化学発光反応を行なう際に、さ
らに、発光増強剤を含有させてなる請求項１〜５のいず
れかの請求項に記載の化学発光酵素免疫測定法。 - 【請求項７】 前記発光増強剤が、フェノール性化合
物である請求項６に記載の化学発光酵素免疫測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34111798A JP3815905B2 (ja) | 1998-11-13 | 1998-11-13 | 酵素免疫測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34111798A JP3815905B2 (ja) | 1998-11-13 | 1998-11-13 | 酵素免疫測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000146968A true JP2000146968A (ja) | 2000-05-26 |
| JP3815905B2 JP3815905B2 (ja) | 2006-08-30 |
Family
ID=18343421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34111798A Expired - Fee Related JP3815905B2 (ja) | 1998-11-13 | 1998-11-13 | 酵素免疫測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3815905B2 (ja) |
-
1998
- 1998-11-13 JP JP34111798A patent/JP3815905B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP3815905B2 (ja) | 2006-08-30 |
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