JP2000146966A - リポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬 - Google Patents
リポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬Info
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- JP2000146966A JP2000146966A JP10320647A JP32064798A JP2000146966A JP 2000146966 A JP2000146966 A JP 2000146966A JP 10320647 A JP10320647 A JP 10320647A JP 32064798 A JP32064798 A JP 32064798A JP 2000146966 A JP2000146966 A JP 2000146966A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 リポタンパク質（ａ）に結合させる抗体
として、アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ド
メインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タ
イプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又
はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、かつアポ
リポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイ
プ２には結合しない抗体だけを使用することを特徴とす
る、試料中のリポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法
及び免疫学的測定試薬。 【効果】 試料中のリポタンパク質（ａ）のフェノタイ
プの種類によって測定値が変動し、誤差が生じてしまう
という問題を解決できる。
として、アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ド
メインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タ
イプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又
はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、かつアポ
リポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイ
プ２には結合しない抗体だけを使用することを特徴とす
る、試料中のリポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法
及び免疫学的測定試薬。 【効果】 試料中のリポタンパク質（ａ）のフェノタイ
プの種類によって測定値が変動し、誤差が生じてしまう
という問題を解決できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動脈硬化症の危険
因子であり臨床的に意義があるリポタンパク質（ａ）を
測定する際に、試料によるリポタンパク質（ａ）のフェ
ノタイプの種類の違いにより測定値が変動し誤差が生じ
ることを防ぎ、試料中の正確なリポタンパク質（ａ）濃
度を測定することができる方法及び試薬に関するもので
ある。本発明は、分子生物学分野、医療分野、特に臨床
検査分野において有用なものである。
因子であり臨床的に意義があるリポタンパク質（ａ）を
測定する際に、試料によるリポタンパク質（ａ）のフェ
ノタイプの種類の違いにより測定値が変動し誤差が生じ
ることを防ぎ、試料中の正確なリポタンパク質（ａ）濃
度を測定することができる方法及び試薬に関するもので
ある。本発明は、分子生物学分野、医療分野、特に臨床
検査分野において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】リポタンパク質（ａ）（ｌｉｐｏｐｒｏ
ｔｅｉｎ（ａ）、Ｌｐ（ａ））は、１９６３年ベルクに
よりβ−リポタンパク質の変異型として初めて報告され
た〔Ｋ．Ｂｅｒｇ，Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，５９，３６９−３８２（１
９６３）〕。
ｔｅｉｎ（ａ）、Ｌｐ（ａ））は、１９６３年ベルクに
よりβ−リポタンパク質の変異型として初めて報告され
た〔Ｋ．Ｂｅｒｇ，Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，５９，３６９−３８２（１
９６３）〕。
【０００３】リポタンパク質（ａ）の臨床的側面につい
て、狭心症や心筋梗塞をはじめとする虚血性心疾患患者
で、試料中のリポタンパク質（ａ）濃度が高い者が多い
ということが報告されている〔Ｇ．Ｄａｈｌｅｎ ｅｔ
ａｌ．，Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｓｃａｎｄ．，（Ｓｕｐ
ｐｌ．）５３１，１−２９（１９７２），Ｋ．Ｂｅｒｇ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６，３４
７−３５２（１９７９），Ｇ．Ｍ．Ｋｏｓｔｎｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，３８，
５１−６１（１９８１）〕。
て、狭心症や心筋梗塞をはじめとする虚血性心疾患患者
で、試料中のリポタンパク質（ａ）濃度が高い者が多い
ということが報告されている〔Ｇ．Ｄａｈｌｅｎ ｅｔ
ａｌ．，Ａｃｔａ Ｍｅｄ．Ｓｃａｎｄ．，（Ｓｕｐ
ｐｌ．）５３１，１−２９（１９７２），Ｋ．Ｂｅｒｇ
ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６，３４
７−３５２（１９７９），Ｇ．Ｍ．Ｋｏｓｔｎｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，３８，
５１−６１（１９８１）〕。
【０００４】更に、リポタンパク質（ａ）は、コレステ
ロール、ＬＤＬ−コレステロール、ＨＤＬ−コレステロ
ール等の虚血性心疾患の既知のマーカーとは相関を示さ
ず、動脈硬化症、虚血性心疾患の独立した新規な危険因
子であることが報告された〔Ｃ．Ｅｈｎｈｏｌｍ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ，２３６，４３１−４３９（１９７１），Ｈ．Ｓｃｈ
ｒｉｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．
Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２，５９１−５９６
（１９８４）〕。
ロール、ＬＤＬ−コレステロール、ＨＤＬ−コレステロ
ール等の虚血性心疾患の既知のマーカーとは相関を示さ
ず、動脈硬化症、虚血性心疾患の独立した新規な危険因
子であることが報告された〔Ｃ．Ｅｈｎｈｏｌｍ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ，２３６，４３１−４３９（１９７１），Ｈ．Ｓｃｈ
ｒｉｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ.,Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．
Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２，５９１−５９６
（１９８４）〕。
【０００５】また、リポタンパク質（ａ）が動脈硬化症
の危険因子としてだけではなく、糖尿病性腎症あるいは
ＰＴＣＡ（経皮的冠動脈内腔拡張術）術後再狭窄をおこ
した人で高値を示す傾向があるということや、ＣＲＰの
ような急性反応性タンパク質と同様の挙動を示すという
報告もあり、血液等の生体試料中のリポタンパク質
（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）を測定することは
臨床的に重要な意義を持つものとなってきており、リポ
タンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）を正確
に測定できる方法が望まれている。
の危険因子としてだけではなく、糖尿病性腎症あるいは
ＰＴＣＡ（経皮的冠動脈内腔拡張術）術後再狭窄をおこ
した人で高値を示す傾向があるということや、ＣＲＰの
ような急性反応性タンパク質と同様の挙動を示すという
報告もあり、血液等の生体試料中のリポタンパク質
（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）を測定することは
臨床的に重要な意義を持つものとなってきており、リポ
タンパク質（ａ）及びアポリポタンパク質（ａ）を正確
に測定できる方法が望まれている。
【０００６】リポタンパク質（ａ）は、通常生体内でコ
レステロールエステルの輸送を主な役割とする低密度リ
ポタンパク質（ＬＤＬ）とリポタンパク質（ａ）に特有
なタンパク質であるアポリポタンパク質（ａ）（ａｐｏ
ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）、ａｐｏ（ａ）、アポ
（ａ））からなり、ＬＤＬのタンパク質部分であるアポ
リポタンパク質Ｂ−１００とアポリポタンパク質（ａ）
との間でジスルフィド結合により結合した物質である
（図１参照）。
レステロールエステルの輸送を主な役割とする低密度リ
ポタンパク質（ＬＤＬ）とリポタンパク質（ａ）に特有
なタンパク質であるアポリポタンパク質（ａ）（ａｐｏ
ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）、ａｐｏ（ａ）、アポ
（ａ））からなり、ＬＤＬのタンパク質部分であるアポ
リポタンパク質Ｂ−１００とアポリポタンパク質（ａ）
との間でジスルフィド結合により結合した物質である
（図１参照）。
【０００７】１９８７年、イートンら〔Ｄ．Ｌ．Ｅａｔ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４，３２２４−３２２８（１
９８７）〕は、生化学的手法により、次いでマクリーン
ら〔Ｊ．Ｗ．ＭｃＬｅａｎｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３３０，１３２−１３７（１９８７）〕は、ｃＤＮ
Ａ塩基配列よりアポリポタンパク質（ａ）のアミノ酸配
列を決定した。
ｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４，３２２４−３２２８（１
９８７）〕は、生化学的手法により、次いでマクリーン
ら〔Ｊ．Ｗ．ＭｃＬｅａｎｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒ
ｅ，３３０，１３２−１３７（１９８７）〕は、ｃＤＮ
Ａ塩基配列よりアポリポタンパク質（ａ）のアミノ酸配
列を決定した。
【０００８】これによりアポリポタンパク質（ａ）は、
その分子構造の大部分が、線溶系に働くプラスミノーゲ
ンと相同性の高い構造から構成されていることが判明し
た。このことは、リポタンパク質（ａ）及びアポリポタ
ンパク質（ａ）が、動脈硬化、及び血液凝固線溶系を同
一の視点で考えるうえでの重要な鍵となることを示唆す
るものである。
その分子構造の大部分が、線溶系に働くプラスミノーゲ
ンと相同性の高い構造から構成されていることが判明し
た。このことは、リポタンパク質（ａ）及びアポリポタ
ンパク質（ａ）が、動脈硬化、及び血液凝固線溶系を同
一の視点で考えるうえでの重要な鍵となることを示唆す
るものである。
【０００９】そして、アポリポタンパク質（ａ）は、セ
リンプロテアーゼであるプラスミノーゲンのクリングル
４と呼ばれる構造と相同性の高い構造を最大３７個有す
るクリングル４様ドメイン、プラスミノーゲンのクリン
グル５と呼ばれる構造と相同性の高い構造からなるクリ
ングル５様ドメイン、及びプラスミノーゲンのプロテア
ーゼ構造部分と相同性の高い構造を有するプロテアーゼ
様ドメインから構成されている。なお、このクリングル
４様ドメインのクリングルは、アミノ酸レベルの違いで
１０種類のタイプがあり、それぞれ、タイプ１、タイプ
２、タイプ３、タイプ４、タイプ５、タイプ６、タイプ
７、タイプ８、タイプ９及びタイプ１０と呼ばれてい
る。
リンプロテアーゼであるプラスミノーゲンのクリングル
４と呼ばれる構造と相同性の高い構造を最大３７個有す
るクリングル４様ドメイン、プラスミノーゲンのクリン
グル５と呼ばれる構造と相同性の高い構造からなるクリ
ングル５様ドメイン、及びプラスミノーゲンのプロテア
ーゼ構造部分と相同性の高い構造を有するプロテアーゼ
様ドメインから構成されている。なお、このクリングル
４様ドメインのクリングルは、アミノ酸レベルの違いで
１０種類のタイプがあり、それぞれ、タイプ１、タイプ
２、タイプ３、タイプ４、タイプ５、タイプ６、タイプ
７、タイプ８、タイプ９及びタイプ１０と呼ばれてい
る。
【００１０】このクリングル４様ドメインの各タイプ
は、Ｎ末端側から、タイプ１、タイプ２、タイプ３、タ
イプ４、タイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タ
イプ９、そして、タイプ１０と順につながっている
〔Ｓ．Ｍａｒｃｏｖｉｎａ ｅｔａｌ．，ＢＢＲＣ，１
９１，１１９２−１１９６（１９９３）〕。そして、タ
イプ２は、全く同じ構造のクリングルが１０〜４３個つ
ながった構造よりなっている〔ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３０，１３２−１３７（１９８
７）等〕。
は、Ｎ末端側から、タイプ１、タイプ２、タイプ３、タ
イプ４、タイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タ
イプ９、そして、タイプ１０と順につながっている
〔Ｓ．Ｍａｒｃｏｖｉｎａ ｅｔａｌ．，ＢＢＲＣ，１
９１，１１９２−１１９６（１９９３）〕。そして、タ
イプ２は、全く同じ構造のクリングルが１０〜４３個つ
ながった構造よりなっている〔ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３０，１３２−１３７（１９８
７）等〕。
【００１１】また、リポタンパク質（ａ）にはフェノタ
イプ（イソ型）が存在し、多形（型）性を有することが
報告されている。〔Ｇ．Ｕｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８０，４５８−
４６５（１９８７），Ｈ．Ｇ．Ｋｒａｆｔ ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，８，２１２
−２１６（１９８８），Ｇ．Ｕｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，７８，４１−４６（１
９８８）〕。これは、アポリポタンパク質（ａ）のクリ
ングル４様ドメイン中のクリングルの繰り返し数の違い
によるものと考えられている〔Ｖ．Ｎ．Ｔｒｉｅｕ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，５４
８０−５４８５（１９９１）〕。
イプ（イソ型）が存在し、多形（型）性を有することが
報告されている。〔Ｇ．Ｕｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８０，４５８−
４６５（１９８７），Ｈ．Ｇ．Ｋｒａｆｔ ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，８，２１２
−２１６（１９８８），Ｇ．Ｕｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，７８，４１−４６（１
９８８）〕。これは、アポリポタンパク質（ａ）のクリ
ングル４様ドメイン中のクリングルの繰り返し数の違い
によるものと考えられている〔Ｖ．Ｎ．Ｔｒｉｅｕ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，５４
８０−５４８５（１９９１）〕。
【００１２】フェノタイプは、ＳＤＳ電気泳動法と免疫
ブロット法を用いた分画により、Ｆ型、Ｂ型、Ｓ１型、
Ｓ２型、Ｓ３型、Ｓ４型及びＯ型が認められた〔Ｇ．Ｕ
ｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．，８ ０，４５８−４６５（１９８７）〕。また
最近、クリングル４様ドメインのタイプ２のクリングル
の繰り返し数の１個の違いを明らかにできるアガロース
電気泳動法が開発された。これとウエスタンブロット法
とを組み合わせた分析により、現在３４種類のフェノタ
イプが確認されている〔Ｓ．Ｍａｒｃｏｖｉｎａ ｅｔ
ａｌ．，ＢＢＲＣ，１９１，１１９２−１１９６（１
９９３）〕。
ブロット法を用いた分画により、Ｆ型、Ｂ型、Ｓ１型、
Ｓ２型、Ｓ３型、Ｓ４型及びＯ型が認められた〔Ｇ．Ｕ
ｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．，８ ０，４５８−４６５（１９８７）〕。また
最近、クリングル４様ドメインのタイプ２のクリングル
の繰り返し数の１個の違いを明らかにできるアガロース
電気泳動法が開発された。これとウエスタンブロット法
とを組み合わせた分析により、現在３４種類のフェノタ
イプが確認されている〔Ｓ．Ｍａｒｃｏｖｉｎａ ｅｔ
ａｌ．，ＢＢＲＣ，１９１，１１９２−１１９６（１
９９３）〕。
【００１３】リポタンパク質（ａ）の測定方法として
は、種々の測定方法が提案されているが、低濃度のリポ
タンパク質（ａ）まで感度よく測定が行える方法とし
て、単純免疫拡散法、ラテックス凝集反応、ロケット免
疫電気泳動法、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス比濁
法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）〔Ｊ．Ｊ．Ａｌｂｅｒｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，１８，３３
１−３３８（１９７７）〕、及び酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ、ＥＬＩＳＡ）〔Ａ．Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１７７，３１−４０（１９８
８）〕等の免疫学的測定方法が推奨され、使用されてい
る。
は、種々の測定方法が提案されているが、低濃度のリポ
タンパク質（ａ）まで感度よく測定が行える方法とし
て、単純免疫拡散法、ラテックス凝集反応、ロケット免
疫電気泳動法、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス比濁
法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）〔Ｊ．Ｊ．Ａｌｂｅｒｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，１８，３３
１−３３８（１９７７）〕、及び酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ、ＥＬＩＳＡ）〔Ａ．Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉ
ｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１７７，３１−４０（１９８
８）〕等の免疫学的測定方法が推奨され、使用されてい
る。
【００１４】しかし、リポタンパク質（ａ）を免疫原と
して動物に免疫して得られる抗体をこれらの免疫学的測
定法にそのまま使用すると、リポタンパク質（ａ）はそ
の分子中にＬＤＬを含み、そしてプラスミノーゲンと相
同性の高い部分を持つため、生体試料に含まれるＬＤＬ
やプラスミノーゲンとも反応してしまい、ＬＤＬやプラ
スミノーゲンをも測りこんでしまうので、正確なリポタ
ンパク質（ａ）の測定値を得ることができない。
して動物に免疫して得られる抗体をこれらの免疫学的測
定法にそのまま使用すると、リポタンパク質（ａ）はそ
の分子中にＬＤＬを含み、そしてプラスミノーゲンと相
同性の高い部分を持つため、生体試料に含まれるＬＤＬ
やプラスミノーゲンとも反応してしまい、ＬＤＬやプラ
スミノーゲンをも測りこんでしまうので、正確なリポタ
ンパク質（ａ）の測定値を得ることができない。
【００１５】そこで、リポタンパク質（ａ）からＬＤＬ
部分を除いたアポリポタンパク質（ａ）を免疫原として
用いてリポタンパク質（ａ）に対する抗血清（ポリクロ
ーナル抗体）を作製するという方法が報告されているが
〔Ｇ．Ｍ．Ｆｌｅｓｓ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２６１，８７１２−８７１８（１９８６），
Ｇ．Ｕｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６５，９８１−９８６（１９９０）〕、
この方法により得られた抗血清（ポリクローナル抗体）
はＬＤＬとは交叉反応を起こさないものの、アポリポタ
ンパク質（ａ）はプラスミノーゲンと相同性の高い部分
を持つために、この抗血清（ポリクローナル抗体）はプ
ラスミノーゲンとは交叉反応性を有する。
部分を除いたアポリポタンパク質（ａ）を免疫原として
用いてリポタンパク質（ａ）に対する抗血清（ポリクロ
ーナル抗体）を作製するという方法が報告されているが
〔Ｇ．Ｍ．Ｆｌｅｓｓ ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，２６１，８７１２−８７１８（１９８６），
Ｇ．Ｕｔｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６５，９８１−９８６（１９９０）〕、
この方法により得られた抗血清（ポリクローナル抗体）
はＬＤＬとは交叉反応を起こさないものの、アポリポタ
ンパク質（ａ）はプラスミノーゲンと相同性の高い部分
を持つために、この抗血清（ポリクローナル抗体）はプ
ラスミノーゲンとは交叉反応性を有する。
【００１６】そのため、この抗血清（ポリクローナル抗
体）はヒトプラスミノーゲンで吸収操作を行いプラスミ
ノーゲンと反応する抗体を除去するという煩雑な操作を
行わなければ使用できない。そして、このような操作に
よって調製されたリポタンパク質（ａ）又はアポリポタ
ンパク質（ａ）に対する抗血清及びポリクローナル抗体
はロット差が非常に大きく、同一条件でリポタンパク質
（ａ）又はアポリポタンパク質（ａ）の測定を行った場
合には、抗血清又はポリクローナル抗体のロットによっ
て測定値に差が生じてしまうため、ロットごとに測定条
件を設定し直す必要がある。
体）はヒトプラスミノーゲンで吸収操作を行いプラスミ
ノーゲンと反応する抗体を除去するという煩雑な操作を
行わなければ使用できない。そして、このような操作に
よって調製されたリポタンパク質（ａ）又はアポリポタ
ンパク質（ａ）に対する抗血清及びポリクローナル抗体
はロット差が非常に大きく、同一条件でリポタンパク質
（ａ）又はアポリポタンパク質（ａ）の測定を行った場
合には、抗血清又はポリクローナル抗体のロットによっ
て測定値に差が生じてしまうため、ロットごとに測定条
件を設定し直す必要がある。
【００１７】また、前記のように、アポリポタンパク質
（ａ）は、クリングル４様ドメインのタイプ２のクリン
グルの繰り返し数が一定ではなく、分子量を異にする多
形（型）性を有しフェノタイプが存在するため、前記の
免疫学的測定方法によるリポタンパク質（ａ）の測定値
に誤差を生じさせてしまっている。つまり、従来の免疫
学的測定方法（免疫学的測定試薬）によるリポタンパク
質（ａ）の測定方法（測定試薬）は、クリングル４様ド
メインのタイプ２のクリングルに結合する抗体又はこの
抗体を含むポリクローナル抗体を使用するため、クリン
グル４様ドメインのタイプ２のクリングルの繰り返し数
の違い、つまりフェノタイプの種類の違いにより、得ら
れるシグナルの量が違ってしまい、即ち測定値が変動し
てしまい、真のリポタンパク質（ａ）濃度とは異なる濃
度を算出してしまう（誤差を生じてしまう）ものであっ
た。
（ａ）は、クリングル４様ドメインのタイプ２のクリン
グルの繰り返し数が一定ではなく、分子量を異にする多
形（型）性を有しフェノタイプが存在するため、前記の
免疫学的測定方法によるリポタンパク質（ａ）の測定値
に誤差を生じさせてしまっている。つまり、従来の免疫
学的測定方法（免疫学的測定試薬）によるリポタンパク
質（ａ）の測定方法（測定試薬）は、クリングル４様ド
メインのタイプ２のクリングルに結合する抗体又はこの
抗体を含むポリクローナル抗体を使用するため、クリン
グル４様ドメインのタイプ２のクリングルの繰り返し数
の違い、つまりフェノタイプの種類の違いにより、得ら
れるシグナルの量が違ってしまい、即ち測定値が変動し
てしまい、真のリポタンパク質（ａ）濃度とは異なる濃
度を算出してしまう（誤差を生じてしまう）ものであっ
た。
【００１８】この問題点について、多くの研究者が解決
策の模索を試みてきた。例えば、マルコビーナ（Ｍａｒ
ｃｏｖｉｎａ）らは、フェノタイプ既知の試料を、固相
化したリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ２のクリングルに結合するモノクローナル抗体
とパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識したリポタンパク
質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２のクリン
グルに結合するモノクローナル抗体とを用いたＥＬＩＳ
Ａ法での測定方法と、固相化したリポタンパク質（ａ）
のクリングル４様ドメインのタイプ２のクリングルに結
合するモノクローナル抗体とパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）で標識したリポタンパク質（ａ）のクリングル４様
ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、
タイプ９又はタイプ１０のクリングルに結合するモノク
ローナル抗体とを用いたＥＬＩＳＡ法での測定方法と
で、それぞれ測定して測定値の比較、検討を行っている
〔Ｓ．Ｍａｒｃｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ．，４ １，２４６−２５５（１９９５）〕。
策の模索を試みてきた。例えば、マルコビーナ（Ｍａｒ
ｃｏｖｉｎａ）らは、フェノタイプ既知の試料を、固相
化したリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ２のクリングルに結合するモノクローナル抗体
とパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識したリポタンパク
質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２のクリン
グルに結合するモノクローナル抗体とを用いたＥＬＩＳ
Ａ法での測定方法と、固相化したリポタンパク質（ａ）
のクリングル４様ドメインのタイプ２のクリングルに結
合するモノクローナル抗体とパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）で標識したリポタンパク質（ａ）のクリングル４様
ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、
タイプ９又はタイプ１０のクリングルに結合するモノク
ローナル抗体とを用いたＥＬＩＳＡ法での測定方法と
で、それぞれ測定して測定値の比較、検討を行っている
〔Ｓ．Ｍａｒｃｏｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｅｍ．，４ １，２４６−２５５（１９９５）〕。
【００１９】しかし、ここで開示された測定方法は、い
ずれも固相化した抗体がクリングル４様ドメインのタイ
プ２のクリングルに結合する抗体であるため、試料中の
リポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイ
プ２のクリングルの繰り返し数の違い、つまりフェノタ
イプの種類により測定値が変動し、誤差が生じてしまう
ものである。また、リポタンパク質（ａ）の免疫学的測
定方法において、アポリポタンパク質（ａ）に対する抗
体と、アポリポタンパク質Ｂに対する抗体を用いる測定
方法が開示されている〔Ｓ．Ｍａｒｃｏｖｉｎａ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４１，２４６−２５
５（１９９５）〕。
ずれも固相化した抗体がクリングル４様ドメインのタイ
プ２のクリングルに結合する抗体であるため、試料中の
リポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイ
プ２のクリングルの繰り返し数の違い、つまりフェノタ
イプの種類により測定値が変動し、誤差が生じてしまう
ものである。また、リポタンパク質（ａ）の免疫学的測
定方法において、アポリポタンパク質（ａ）に対する抗
体と、アポリポタンパク質Ｂに対する抗体を用いる測定
方法が開示されている〔Ｓ．Ｍａｒｃｏｖｉｎａ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４１，２４６−２５
５（１９９５）〕。
【００２０】しかし、この測定方法は、リポタンパク質
（ａ）中のアポリポタンパク質（ａ）とアポリポタンパ
ク質Ｂが１対１で結合していることを前提として考えら
れたものであるが、リポタンパク質（ａ）が種々のタン
パク質と相互作用を持っているという報告があり〔Ｊ．
Ｊ．Ａｌｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅ
ｓ．，３７，１９２−１９６（１９９６）〕、また、リ
ジン−セファロースアフィニティークロマトグラフィー
カラムで精製したリポタンパク質（ａ）中のアポリポタ
ンパク質（ａ）とアポリポタンパク質Ｂの比が２対１で
あるとの報告もあるので〔Ｇ．Ｍ．Ｆｌｅｓｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，１３４９２
−１３５０１（１９９４）〕、前記の前提が成り立たな
い可能性も十分考えられる。
（ａ）中のアポリポタンパク質（ａ）とアポリポタンパ
ク質Ｂが１対１で結合していることを前提として考えら
れたものであるが、リポタンパク質（ａ）が種々のタン
パク質と相互作用を持っているという報告があり〔Ｊ．
Ｊ．Ａｌｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＬｉｐｉｄＲｅ
ｓ．，３７，１９２−１９６（１９９６）〕、また、リ
ジン−セファロースアフィニティークロマトグラフィー
カラムで精製したリポタンパク質（ａ）中のアポリポタ
ンパク質（ａ）とアポリポタンパク質Ｂの比が２対１で
あるとの報告もあるので〔Ｇ．Ｍ．Ｆｌｅｓｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，１３４９２
−１３５０１（１９９４）〕、前記の前提が成り立たな
い可能性も十分考えられる。
【００２１】更に、最近、アポリポタンパク質Ｂと結合
していないフリーのアポリポタンパク質（ａ）の存在が
報告されているが〔Ｅ．Ｔｒｅｎｋｗａｌｄｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ，５２，１６８５−１６９２（１９９７）〕、この測
定方法では、フリーのアポリポタンパク質（ａ）の測定
は行うことができない。
していないフリーのアポリポタンパク質（ａ）の存在が
報告されているが〔Ｅ．Ｔｒｅｎｋｗａｌｄｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ，５２，１６８５−１６９２（１９９７）〕、この測
定方法では、フリーのアポリポタンパク質（ａ）の測定
は行うことができない。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】前記のような現状に鑑
みて、本発明者らは、リポタンパク質（ａ）の免疫学的
測定方法及び免疫学的測定試薬において、試料中のリポ
タンパク質（ａ）のフェノタイプの種類によって測定値
が変動し、誤差が生じてしまう問題を、従来技術とは異
なる手段を用いて改善することを課題とした。即ち、試
料中のリポタンパク質（ａ）のフェノタイプの種類によ
らず、真のリポタンパク質（ａ）濃度を正確かつ簡便に
得ることができる試料中のリポタンパク質（ａ）の免疫
学的測定方法及び免疫学的測定試薬の提供を課題とした
ものである。
みて、本発明者らは、リポタンパク質（ａ）の免疫学的
測定方法及び免疫学的測定試薬において、試料中のリポ
タンパク質（ａ）のフェノタイプの種類によって測定値
が変動し、誤差が生じてしまう問題を、従来技術とは異
なる手段を用いて改善することを課題とした。即ち、試
料中のリポタンパク質（ａ）のフェノタイプの種類によ
らず、真のリポタンパク質（ａ）濃度を正確かつ簡便に
得ることができる試料中のリポタンパク質（ａ）の免疫
学的測定方法及び免疫学的測定試薬の提供を課題とした
ものである。
【００２３】
【課題を解決するための手段】本発明は、以下の発明を
包含する。 （１）試料中のリポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方
法において、リポタンパク質（ａ）に結合させる抗体と
して、アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメ
インのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイ
プ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又は
プロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、かつアポリ
ポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ
２には結合しない抗体だけを使用することを特徴とする
リポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法。
包含する。 （１）試料中のリポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方
法において、リポタンパク質（ａ）に結合させる抗体と
して、アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメ
インのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイ
プ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又は
プロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、かつアポリ
ポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ
２には結合しない抗体だけを使用することを特徴とする
リポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法。
【００２４】（２）アポリポタンパク質（ａ）のクリン
グル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タ
イプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様
ドメイン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合
し、かつアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ド
メインのタイプ２には結合しない抗体が、アポリポタン
パク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、タ
イプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９又はタイプ１０
に特異的に結合し、かつアポリポタンパク質（ａ）のク
リングル４様ドメインのタイプ２には結合しない抗体で
ある前記（１）に記載の測定方法。
グル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タ
イプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様
ドメイン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合
し、かつアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ド
メインのタイプ２には結合しない抗体が、アポリポタン
パク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、タ
イプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９又はタイプ１０
に特異的に結合し、かつアポリポタンパク質（ａ）のク
リングル４様ドメインのタイプ２には結合しない抗体で
ある前記（１）に記載の測定方法。
【００２５】（３）試料中のリポタンパク質（ａ）の免
疫学的測定試薬において、リポタンパク質（ａ）に結合
させる抗体として、アポリポタンパク質（ａ）のクリン
グル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タ
イプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様
ドメイン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合
し、かつアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ド
メインのタイプ２には結合しない抗体だけを使用するこ
とを特徴とするリポタンパク質（ａ）の免疫学的測定試
薬。
疫学的測定試薬において、リポタンパク質（ａ）に結合
させる抗体として、アポリポタンパク質（ａ）のクリン
グル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タ
イプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様
ドメイン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合
し、かつアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ド
メインのタイプ２には結合しない抗体だけを使用するこ
とを特徴とするリポタンパク質（ａ）の免疫学的測定試
薬。
【００２６】（４）アポリポタンパク質（ａ）のクリン
グル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タ
イプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様
ドメイン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合
し、かつアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ド
メインのタイプ２には結合しない抗体が、アポリポタン
パク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、タ
イプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９又はタイプ１０
に特異的に結合し、かつアポリポタンパク質（ａ）のク
リングル４様ドメインのタイプ２には結合しない抗体で
ある前記（３）に記載の測定試薬。
グル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タ
イプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様
ドメイン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合
し、かつアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ド
メインのタイプ２には結合しない抗体が、アポリポタン
パク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、タ
イプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９又はタイプ１０
に特異的に結合し、かつアポリポタンパク質（ａ）のク
リングル４様ドメインのタイプ２には結合しない抗体で
ある前記（３）に記載の測定試薬。
【００２７】
【発明の実施の形態】〔１〕抗体 抗体 本発明のリポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法及び
免疫学的測定試薬においては、リポタンパク質（ａ）に
結合させる抗体として、アポリポタンパク質（ａ）のク
リングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ
７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリング
ル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に
結合し、かつアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４
様ドメインのタイプ２には結合しない抗体（以下、「本
発明使用の抗体」ということがある）だけを使用する。
免疫学的測定試薬においては、リポタンパク質（ａ）に
結合させる抗体として、アポリポタンパク質（ａ）のク
リングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ
７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリング
ル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に
結合し、かつアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４
様ドメインのタイプ２には結合しない抗体（以下、「本
発明使用の抗体」ということがある）だけを使用する。
【００２８】リポタンパク質（ａ）の測定に用いる抗体
は、「プラスミノーゲン」と結合しないことが、試料中
の「プラスミノーゲン」を測り込んで正誤差を生じない
ため好ましい。よって、「プラスミノーゲン」と非常に
相同性の高い「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル
５様ドメイン及びプロテアーゼ様ドメイン」とは結合し
ない抗体であることが、「プラスミノーゲン」と結合し
てしまう可能性が非常に小さくなることから好ましい。
は、「プラスミノーゲン」と結合しないことが、試料中
の「プラスミノーゲン」を測り込んで正誤差を生じない
ため好ましい。よって、「プラスミノーゲン」と非常に
相同性の高い「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル
５様ドメイン及びプロテアーゼ様ドメイン」とは結合し
ない抗体であることが、「プラスミノーゲン」と結合し
てしまう可能性が非常に小さくなることから好ましい。
【００２９】この点で、本発明使用の抗体は、アポリポ
タンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ
５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９又はタイ
プ１０に特異的に結合し、かつアポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２には結合し
ない抗体であることが好ましい。なお、この本発明使用
の抗体は、クリングル４様ドメインのタイプ２に結合し
ないことが必須であるが、アポリポタンパク質（ａ）の
クリングル４様ドメインのタイプ１、タイプ３又はタイ
プ４にも結合しないことが好ましい。
タンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ
５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９又はタイ
プ１０に特異的に結合し、かつアポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２には結合し
ない抗体であることが好ましい。なお、この本発明使用
の抗体は、クリングル４様ドメインのタイプ２に結合し
ないことが必須であるが、アポリポタンパク質（ａ）の
クリングル４様ドメインのタイプ１、タイプ３又はタイ
プ４にも結合しないことが好ましい。
【００３０】更に、この本発明使用の抗体は、ＬＤＬと
交叉反応を起こさないものであることが好ましい。そし
て、この本発明使用の抗体は、プラスミノーゲンと交叉
反応を起こさないものであることが好ましい。この本発
明使用の抗体は、ポリクローナル抗体、ポリクローナル
抗体よりなる抗血清又はモノクローナル抗体のいずれの
タイプのものでもよく、またこれらの抗体のフラグメン
ト（Ｆab、Ｆ(ab')2、Ｆab' 等）も含むものである。
交叉反応を起こさないものであることが好ましい。そし
て、この本発明使用の抗体は、プラスミノーゲンと交叉
反応を起こさないものであることが好ましい。この本発
明使用の抗体は、ポリクローナル抗体、ポリクローナル
抗体よりなる抗血清又はモノクローナル抗体のいずれの
タイプのものでもよく、またこれらの抗体のフラグメン
ト（Ｆab、Ｆ(ab')2、Ｆab' 等）も含むものである。
【００３１】本発明使用の抗体は、リポタンパク質
（ａ）、アポリポタンパク質（ａ）、又はアポリポタン
パク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、タ
イプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ
１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメ
インの全体又は一部を抗体産生用免疫原として動物に免
疫し、アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメ
インのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイ
プ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又は
プロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、かつアポリ
ポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ
２には結合しない抗体を選択することにより得ることが
できる。
（ａ）、アポリポタンパク質（ａ）、又はアポリポタン
パク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、タ
イプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ
１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメ
インの全体又は一部を抗体産生用免疫原として動物に免
疫し、アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメ
インのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイ
プ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又は
プロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、かつアポリ
ポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ
２には結合しない抗体を選択することにより得ることが
できる。
【００３２】この抗体産生用免疫原は、前記の物質その
ものを抗体産生用免疫原として動物に免疫してもよい
し、これらの物質と担体（キャリア）を結合させたもの
を抗体産生用免疫原として動物に免疫してもよい。な
お、抗体産生用免疫原として用いる物質が低分子物質の
場合には、担体と結合したものを免疫するのが一般的で
あるものの、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこ
れに対する特異抗体を産生させたとの報告〔木山ら「日
本薬学会第１１２年会講演要旨集３」，１９９２，ｐ．
１２２．〕もあるので、担体を使用することは必須では
ない。担体を使用する場合には、スカシガイのヘモシア
ニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト
血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−
リジン、ポリアラニルリジン、ジパルミチルリジン、破
傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを
用いることができる。
ものを抗体産生用免疫原として動物に免疫してもよい
し、これらの物質と担体（キャリア）を結合させたもの
を抗体産生用免疫原として動物に免疫してもよい。な
お、抗体産生用免疫原として用いる物質が低分子物質の
場合には、担体と結合したものを免疫するのが一般的で
あるものの、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこ
れに対する特異抗体を産生させたとの報告〔木山ら「日
本薬学会第１１２年会講演要旨集３」，１９９２，ｐ．
１２２．〕もあるので、担体を使用することは必須では
ない。担体を使用する場合には、スカシガイのヘモシア
ニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト
血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−
リジン、ポリアラニルリジン、ジパルミチルリジン、破
傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを
用いることができる。
【００３３】そして、抗体産生用免疫原として用いる前
記の物質と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサ
クシニミドエステル法、Ｎ−サクシミジル−３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオン酸法、ビスジアゾ化ベンジ
ジン法又はジパルミチルリジン法等の公知の結合法を用
いることができる。また、ニトロセルロース粒子、ポリ
ビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に前記の物質
を吸着させたものを抗体産生用免疫原とすることもでき
る。
記の物質と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、１
−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサ
クシニミドエステル法、Ｎ−サクシミジル−３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオン酸法、ビスジアゾ化ベンジ
ジン法又はジパルミチルリジン法等の公知の結合法を用
いることができる。また、ニトロセルロース粒子、ポリ
ビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に前記の物質
を吸着させたものを抗体産生用免疫原とすることもでき
る。
【００３４】ポリクローナル抗体、抗血清 ポリクローナル抗体又は抗血清よりなる本発明使用の抗
体は、以下の操作により調製することができる。まず、
リポタンパク質（ａ）、アポリポタンパク質（ａ）、又
はアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９
もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又はプロ
テアーゼ様ドメインの全体又は一部を抗体産生用免疫原
（担体は使用してもよいし、使用しなくてもよい）とし
て、哺乳動物（マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤ
ギ、ウマ等）又は鳥類（ニワトリ等）に免疫する。
体は、以下の操作により調製することができる。まず、
リポタンパク質（ａ）、アポリポタンパク質（ａ）、又
はアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９
もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又はプロ
テアーゼ様ドメインの全体又は一部を抗体産生用免疫原
（担体は使用してもよいし、使用しなくてもよい）とし
て、哺乳動物（マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤ
ギ、ウマ等）又は鳥類（ニワトリ等）に免疫する。
【００３５】この抗体産生用免疫原の免疫量は免疫動物
の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであ
るが、例えば、マウスの場合には約５〜１０週齢のマウ
ス一匹当たり一回につき０．１μｇ〜５ｍｇ、好ましく
は５０μｇ〜１ｍｇの前記抗体産生用免疫原を免疫注射
する。また、ウサギの場合はウサギ一匹当たり一回につ
き１０μｇ〜数十ｍｇの前記抗体産生用免疫原を免疫注
射するのが好ましい。なお、抗体産生用免疫原はアジュ
バントを添加混合して免疫注射をすることが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、
フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムア
ジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを
用いることができる。
の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであ
るが、例えば、マウスの場合には約５〜１０週齢のマウ
ス一匹当たり一回につき０．１μｇ〜５ｍｇ、好ましく
は５０μｇ〜１ｍｇの前記抗体産生用免疫原を免疫注射
する。また、ウサギの場合はウサギ一匹当たり一回につ
き１０μｇ〜数十ｍｇの前記抗体産生用免疫原を免疫注
射するのが好ましい。なお、抗体産生用免疫原はアジュ
バントを添加混合して免疫注射をすることが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、
フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムア
ジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを
用いることができる。
【００３６】免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背
部等の部位に行えばよい。初回免疫後、２〜３週間間隔
で、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に抗体産生
用免疫原を追加免疫注射する。この場合も抗体産生用免
疫原はアジュバントを添加混合して追加免疫注射をする
ことが好ましい。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗
体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体
価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して
抗血清を得る。
部等の部位に行えばよい。初回免疫後、２〜３週間間隔
で、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に抗体産生
用免疫原を追加免疫注射する。この場合も抗体産生用免
疫原はアジュバントを添加混合して追加免疫注射をする
ことが好ましい。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗
体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体
価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して
抗血清を得る。
【００３７】この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナ
トリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー
等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の
精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。なお、これら
の抗血清又はポリクローナル抗体中には、アポリポタン
パク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２に結
合する抗体も含まれるので、この抗体を吸収して除去す
る。この除去は、アポリポタンパク質（ａ）のクリング
ル４様ドメインのタイプ２からなるフラグメントを、得
られた抗体あるいは抗血清の溶液中に添加して生成した
凝集物を取り除くか、前記フラグメントを不溶化担体に
固相化してアフィニティークロマトグラフィーにより除
去する方法等により行うことができる。
トリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー
等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の
精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。なお、これら
の抗血清又はポリクローナル抗体中には、アポリポタン
パク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２に結
合する抗体も含まれるので、この抗体を吸収して除去す
る。この除去は、アポリポタンパク質（ａ）のクリング
ル４様ドメインのタイプ２からなるフラグメントを、得
られた抗体あるいは抗血清の溶液中に添加して生成した
凝集物を取り除くか、前記フラグメントを不溶化担体に
固相化してアフィニティークロマトグラフィーにより除
去する方法等により行うことができる。
【００３８】また、抗体産生用免疫原に担体としてヒト
血清アルブミン又はＢＳＡを用いた場合は、得られた抗
体あるいは抗血清中にヒト血清アルブミンと交叉反応を
起こす抗体が含まれる可能性があるので、このような抗
体の除去処理を行うことが好ましい。この除去処理方法
としては、担体として用いたヒト血清アルブミン又はＢ
ＳＡを、得られた抗体あるいは抗血清の溶液中に添加し
て生成した凝集物を取り除くか、担体として用いたヒト
血清アルブミン又はＢＳＡを不溶化担体に固相化してア
フィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等
を用いることができる。以上のようにして本発明におけ
る抗血清及びポリクローナル抗体を得ることができる。
血清アルブミン又はＢＳＡを用いた場合は、得られた抗
体あるいは抗血清中にヒト血清アルブミンと交叉反応を
起こす抗体が含まれる可能性があるので、このような抗
体の除去処理を行うことが好ましい。この除去処理方法
としては、担体として用いたヒト血清アルブミン又はＢ
ＳＡを、得られた抗体あるいは抗血清の溶液中に添加し
て生成した凝集物を取り除くか、担体として用いたヒト
血清アルブミン又はＢＳＡを不溶化担体に固相化してア
フィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等
を用いることができる。以上のようにして本発明におけ
る抗血清及びポリクローナル抗体を得ることができる。
【００３９】モノクローナル抗体 次に、モノクローナル抗体の調製法について以下説明を
行う。モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法
〔Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２
５６，４９５−４９７（１９７５）〕によるハイブリド
ーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによ
る腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができ
る。
行う。モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法
〔Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２
５６，４９５−４９７（１９７５）〕によるハイブリド
ーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによ
る腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができ
る。
【００４０】細胞融合法によるモノクローナル抗体の調
製は、以下の操作により行うことができる。まず、リポ
タンパク質（ａ）、アポリポタンパク質（ａ）、又はア
ポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタ
イプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もし
くはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又はプロテア
ーゼ様ドメインの全体又は一部を抗体産生用免疫原（担
体は使用してもよいし、使用しなくてもよい）として、
哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラット等、例えば近
交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリ等）に
免疫する。
製は、以下の操作により行うことができる。まず、リポ
タンパク質（ａ）、アポリポタンパク質（ａ）、又はア
ポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタ
イプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もし
くはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又はプロテア
ーゼ様ドメインの全体又は一部を抗体産生用免疫原（担
体は使用してもよいし、使用しなくてもよい）として、
哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラット等、例えば近
交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリ等）に
免疫する。
【００４１】抗体産生用免疫原の免疫量は、免疫動物の
種類、免疫注射部位等により適宜決められるものである
が、例えば、マウスの場合には一匹当たり一回につき
０．１μｇ〜５ｍｇの抗体産生用免疫原を免疫注射する
のが好ましい。なお、抗体産生用免疫原はアジュバント
を添加混合して免疫注射をすることが好ましい。アジュ
バントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイ
ント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバ
ント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いる
ことができる。免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は
背部等の部位に行えばよい。
種類、免疫注射部位等により適宜決められるものである
が、例えば、マウスの場合には一匹当たり一回につき
０．１μｇ〜５ｍｇの抗体産生用免疫原を免疫注射する
のが好ましい。なお、抗体産生用免疫原はアジュバント
を添加混合して免疫注射をすることが好ましい。アジュ
バントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイ
ント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバ
ント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いる
ことができる。免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は
背部等の部位に行えばよい。
【００４２】初回免疫後、１〜２週間間隔で、皮下、静
脈内、腹腔内又は背部等の部位に抗体産生用免疫原を追
加免疫注射する。この追加免疫注射の回数としては２〜
６回が一般的である。この場合も抗体産生用免疫原はア
ジュバントを添加混合して追加免疫注射をすることが好
ましい。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測
定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラ
トーに達したら、抗体産生用免疫原を生理食塩水（０．
９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又
は腹腔内に注射し、最終免疫とする。この最終免疫の３
〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢
リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
脈内、腹腔内又は背部等の部位に抗体産生用免疫原を追
加免疫注射する。この追加免疫注射の回数としては２〜
６回が一般的である。この場合も抗体産生用免疫原はア
ジュバントを添加混合して追加免疫注射をすることが好
ましい。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測
定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラ
トーに達したら、抗体産生用免疫原を生理食塩水（０．
９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又
は腹腔内に注射し、最終免疫とする。この最終免疫の３
〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢
リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
【００４３】この免疫動物より得られた抗体産生能を有
する細胞と哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラット
等）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させ
るのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン
・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（Ｈ
ＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠
損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ
マウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−
Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲ
Ｂ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（Ｊ
ＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株
（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株
（ＪＣＲＢ００２９）などを用いることができる。
する細胞と哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラット
等）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させ
るのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン
・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（Ｈ
ＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠
損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ
マウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−
Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲ
Ｂ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（Ｊ
ＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株
（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株
（ＪＣＲＢ００２９）などを用いることができる。
【００４４】細胞融合は、各種分子量のポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）、リポソーム又はセンダイウイルス
（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融
合法により行うことができる。ミエローマ細胞がＨＧＰ
ＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポ
キサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培
地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有
する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドー
マ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
リコール（ＰＥＧ）、リポソーム又はセンダイウイルス
（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融
合法により行うことができる。ミエローマ細胞がＨＧＰ
ＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポ
キサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培
地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有
する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドー
マ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
【００４５】このようにして得られたハイブリドーマの
培養上清をＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免
疫学的測定法により測定することにより、アポリポタン
パク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、タ
イプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ
１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメ
インに特異的に結合し、かつアポリポタンパク質（ａ）
のクリングル４様ドメインのタイプ２には結合しない抗
体を産生するハイブリドーマを選択することができ、こ
の方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組
み合わせて行うことにより、本発明に使用するモノクロ
ーナル抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。
培養上清をＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免
疫学的測定法により測定することにより、アポリポタン
パク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、タ
イプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ
１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメ
インに特異的に結合し、かつアポリポタンパク質（ａ）
のクリングル４様ドメインのタイプ２には結合しない抗
体を産生するハイブリドーマを選択することができ、こ
の方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組
み合わせて行うことにより、本発明に使用するモノクロ
ーナル抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。
【００４６】このモノクローナル抗体産生細胞株を適当
な培地で培養して、その培養上清から本発明に使用する
モノクローナル抗体を得ることができるが、培地として
は無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、こ
の場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥ
Ｍ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等
の培地を用いることができる。
な培地で培養して、その培養上清から本発明に使用する
モノクローナル抗体を得ることができるが、培地として
は無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、こ
の場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥ
Ｍ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等
の培地を用いることができる。
【００４７】また、モノクローナル抗体産生細胞株を、
これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した
哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたま
った腹水より本発明のモノクローナル抗体を得ることも
できる。このようにして得られたモノクローナル抗体
は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析
法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はア
フィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこ
れらの方法を組み合わせることにより、精製された本発
明に使用するモノクローナル抗体を得ることができる。
これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した
哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたま
った腹水より本発明のモノクローナル抗体を得ることも
できる。このようにして得られたモノクローナル抗体
は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析
法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はア
フィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこ
れらの方法を組み合わせることにより、精製された本発
明に使用するモノクローナル抗体を得ることができる。
【００４８】〔２〕測定方法、測定試薬 本発明における、リポタンパク質（ａ）に結合させる抗
体として、アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様
ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、
タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン
又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、かつア
ポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタ
イプ２には結合しない抗体だけを使用することを特徴と
する試料中のリポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法
及び免疫学的測定試薬は、試料中のリポタンパク質
（ａ）のフェノタイプの種類により測定値が変動し誤差
が生じてしまうことがなく、試料中のリポタンパク質
（ａ）の濃度を正確かつ簡便に測定することができる方
法及び試薬である。
体として、アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様
ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、
タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン
又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、かつア
ポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタ
イプ２には結合しない抗体だけを使用することを特徴と
する試料中のリポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法
及び免疫学的測定試薬は、試料中のリポタンパク質
（ａ）のフェノタイプの種類により測定値が変動し誤差
が生じてしまうことがなく、試料中のリポタンパク質
（ａ）の濃度を正確かつ簡便に測定することができる方
法及び試薬である。
【００４９】なお、本発明のリポタンパク質（ａ）の免
疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬に使用する前記抗
体は、アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメ
インのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイ
プ９又はタイプ１０に特異的に結合し、かつアポリポタ
ンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２に
は結合しない抗体であることが好ましい。本発明の測定
方法及び測定試薬においては、リポタンパク質（ａ）に
結合させる抗体として、前記の性質を有する抗体のうち
１種類の抗体を用いるだけでなく、前記の性質を有する
複数種類の抗体を組み合わせて用いてもよい。
疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬に使用する前記抗
体は、アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメ
インのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイ
プ９又はタイプ１０に特異的に結合し、かつアポリポタ
ンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２に
は結合しない抗体であることが好ましい。本発明の測定
方法及び測定試薬においては、リポタンパク質（ａ）に
結合させる抗体として、前記の性質を有する抗体のうち
１種類の抗体を用いるだけでなく、前記の性質を有する
複数種類の抗体を組み合わせて用いてもよい。
【００５０】そして、本測定方法（本測定試薬）は、抗
原抗体反応を利用する測定方法（測定試薬）、即ち免疫
学的測定方法（免疫学的測定試薬）であればいずれの方
法（試薬）においても、その測定方法（測定試薬）で使
用される抗体として、前記の抗体を用いることにより、
所期の効果を奏するものである。例えば、酵素免疫測定
法（ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法、放射
免疫測定法（ＲＩＡ法）、発光免疫測定法、酵素抗体
法、蛍光抗体法、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス凝
集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集
反応、単純免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動法、又は
ウエスタンブロット法等により本測定方法（本測定試
薬）は実施される。
原抗体反応を利用する測定方法（測定試薬）、即ち免疫
学的測定方法（免疫学的測定試薬）であればいずれの方
法（試薬）においても、その測定方法（測定試薬）で使
用される抗体として、前記の抗体を用いることにより、
所期の効果を奏するものである。例えば、酵素免疫測定
法（ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法、放射
免疫測定法（ＲＩＡ法）、発光免疫測定法、酵素抗体
法、蛍光抗体法、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス凝
集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集
反応、単純免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動法、又は
ウエスタンブロット法等により本測定方法（本測定試
薬）は実施される。
【００５１】本発明の免疫学的測定方法（免疫学的測定
試薬）により測定を行うものは、試料中に含まれる、リ
ポタンパク質（ａ）もしくはアポリポタンパク質（ａ）
又はこれらの構成部分である。なお、本明細書において
は、これらを総称して「リポタンパク質（ａ）」と記載
する。本測定方法（本測定試薬）における試料として
は、ヒト又は動物の、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾
液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒトもしくは動物の
脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉又は神経組織等の抽
出液；ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の
抽出液等、リポタンパク質（ａ）が含まれる可能性のあ
る生体試料であれば対象となる。
試薬）により測定を行うものは、試料中に含まれる、リ
ポタンパク質（ａ）もしくはアポリポタンパク質（ａ）
又はこれらの構成部分である。なお、本明細書において
は、これらを総称して「リポタンパク質（ａ）」と記載
する。本測定方法（本測定試薬）における試料として
は、ヒト又は動物の、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾
液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒトもしくは動物の
脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉又は神経組織等の抽
出液；ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の
抽出液等、リポタンパク質（ａ）が含まれる可能性のあ
る生体試料であれば対象となる。
【００５２】本測定方法（本測定試薬）を、酵素免疫測
定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測
定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法（免疫学的
測定試薬）により実施する場合には、サンドイッチ法又
は競合法により行うこともでき、サンドイッチ法の場合
には固相化抗体及び標識抗体等、直接リポタンパク質
（ａ）と結合する抗体のいずれも前記の抗体を用いる。
固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、
ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、
ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテ
ックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロ
ース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質
よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティッ
ク又は試験片等の形状の固相担体を用いることができ
る。固相化抗体は、固相担体と抗体を物理的吸着法、化
学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法に従って結
合させることにより調製することができる。
定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測
定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法（免疫学的
測定試薬）により実施する場合には、サンドイッチ法又
は競合法により行うこともでき、サンドイッチ法の場合
には固相化抗体及び標識抗体等、直接リポタンパク質
（ａ）と結合する抗体のいずれも前記の抗体を用いる。
固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、
ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、
ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテ
ックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロ
ース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質
よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティッ
ク又は試験片等の形状の固相担体を用いることができ
る。固相化抗体は、固相担体と抗体を物理的吸着法、化
学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法に従って結
合させることにより調製することができる。
【００５３】標識物質としては、酵素免疫測定法の場合
には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファ
ターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアー
ゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素
酵素又はアミラーゼ等を、蛍光免疫測定法の場合には、
フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシ
アネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等
を、そして放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨ
ウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ2 −ルシ
フェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、ア
クリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を
用いることができる。
には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファ
ターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアー
ゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素
酵素又はアミラーゼ等を、蛍光免疫測定法の場合には、
フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシ
アネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等
を、そして放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨ
ウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
また、発光免疫測定法は、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ2 −ルシ
フェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、ア
クリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を
用いることができる。
【００５４】標識物質と抗体との結合法は、グルタルア
ルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又
は過ヨウ素酸法等の公知の方法を用いることができる。
測定の操作法は公知の方法〔日本臨床病理学会編「臨床
病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノア
ッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８
３．，石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学
書院，１９８７．，北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊
Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８
７．〕等により行うことができる。
ルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又
は過ヨウ素酸法等の公知の方法を用いることができる。
測定の操作法は公知の方法〔日本臨床病理学会編「臨床
病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノア
ッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８
３．，石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学
書院，１９８７．，北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊
Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８
７．〕等により行うことができる。
【００５５】例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同
時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体
を反応させて、固相化抗体−リポタンパク質（ａ）−標
識抗体の複合体を形成させる。そして、未結合の標識抗
体を洗浄分離して、結合標識抗体量又は未結合標識抗体
量より試料中のリポタンパク質（ａ）量を測定すること
ができる。具体的には、酵素免疫測定法の場合は、標識
酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成
物の量を光学的方法等により測定する。蛍光免疫測定法
の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測
定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定す
る。発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を
測定する。
時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体
を反応させて、固相化抗体−リポタンパク質（ａ）−標
識抗体の複合体を形成させる。そして、未結合の標識抗
体を洗浄分離して、結合標識抗体量又は未結合標識抗体
量より試料中のリポタンパク質（ａ）量を測定すること
ができる。具体的には、酵素免疫測定法の場合は、標識
酵素にその至適条件下で基質を反応させ、その反応生成
物の量を光学的方法等により測定する。蛍光免疫測定法
の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測
定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定す
る。発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を
測定する。
【００５６】本測定方法（本測定試薬）を、免疫比濁
法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝
集反応又は粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成
を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目
視的に測る測定方法（測定試薬）により実施する場合に
は、溶媒として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液又はグッド
緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコ
ール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませても
よい。
法、ラテックス凝集反応、ラテックス比濁法、赤血球凝
集反応又は粒子凝集反応等の免疫複合体凝集物の生成
を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、目
視的に測る測定方法（測定試薬）により実施する場合に
は、溶媒として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液又はグッド
緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコ
ール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませても
よい。
【００５７】抗体を固相担体に感作させて用いる場合に
は、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−ブタ
ジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマ
ー、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプ
セル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、
金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よ
りなる粒子を使用することができる。この感作の方法と
しては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの方法
の併用等の公知の方法を使うことができる。
は、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−ブタ
ジエン共重合体、（メタ）アクリル酸エステル類ポリマ
ー、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプ
セル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、
金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よ
りなる粒子を使用することができる。この感作の方法と
しては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの方法
の併用等の公知の方法を使うことができる。
【００５８】測定の操作法は公知の方法により行うこと
ができるが、例えば、光学的方法により測定する場合に
は、試料と抗体、又は試料と固相担体に感作させた抗体
とを反応させ、エンドポイント法又はレート法により、
透過光や散乱光を測定する。また、目視的に測定する場
合には、プレートやマイクロタイタープレート等の容器
中で、試料と固相担体に感作させた抗体とを反応させ、
凝集の状態を目視的に判定する。なお、目視的に測定す
る代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて
測定を行ってもよい。
ができるが、例えば、光学的方法により測定する場合に
は、試料と抗体、又は試料と固相担体に感作させた抗体
とを反応させ、エンドポイント法又はレート法により、
透過光や散乱光を測定する。また、目視的に測定する場
合には、プレートやマイクロタイタープレート等の容器
中で、試料と固相担体に感作させた抗体とを反応させ、
凝集の状態を目視的に判定する。なお、目視的に測定す
る代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて
測定を行ってもよい。
【００５９】
【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 〔実施例１〕 アポリポタンパク質（ａ）のクリングル
４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ
８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメ
イン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、か
つアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ２には結合しない抗体の調製
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 〔実施例１〕 アポリポタンパク質（ａ）のクリングル
４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ
８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメ
イン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、か
つアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ２には結合しない抗体の調製
【００６０】〔１〕抗体産生用免疫原の調製 ヒト血清１，０００ｍＬに臭化カリウムを添加し、密度
ｄ（Ｋｇ／Ｌ）が、１．０５＜ｄ＜１．１２の範囲に入
るようにした。これを、超遠心分離機（日立工機社製；
ＳＣＰ６５型）を使用して等密度超遠心分離を行い、リ
ポタンパク質（ａ）に富むフラクションを分取した。次
に、このリポタンパク質（ａ）に富むフラクションを、
０．０１％アジ化ナトリウム及び０．０１％ＥＤＴＡを
含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で十分に透析
した後、このリン酸緩衝液で平衡化されているリジン−
セファロースアフィニティークロマトグラフィーカラム
にかけた。そして、十分に洗浄した後、６−アミノカプ
ロン酸を含む０．１Ｍリン酸緩衝液を溶出液として流
し、リポタンパク質（ａ）を溶出させた。このリポタン
パク質（ａ）を抗体産生用免疫原とした。
ｄ（Ｋｇ／Ｌ）が、１．０５＜ｄ＜１．１２の範囲に入
るようにした。これを、超遠心分離機（日立工機社製；
ＳＣＰ６５型）を使用して等密度超遠心分離を行い、リ
ポタンパク質（ａ）に富むフラクションを分取した。次
に、このリポタンパク質（ａ）に富むフラクションを、
０．０１％アジ化ナトリウム及び０．０１％ＥＤＴＡを
含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で十分に透析
した後、このリン酸緩衝液で平衡化されているリジン−
セファロースアフィニティークロマトグラフィーカラム
にかけた。そして、十分に洗浄した後、６−アミノカプ
ロン酸を含む０．１Ｍリン酸緩衝液を溶出液として流
し、リポタンパク質（ａ）を溶出させた。このリポタン
パク質（ａ）を抗体産生用免疫原とした。
【００６１】〔２〕動物への免疫 （１） 前記〔１〕のようにして得たリポタンパク質
（ａ）を抗体産生用免疫原として、５０μｇ／ｍＬにな
るように生理食塩水に溶解し、これをフロイント完全ア
ジュバントと等量ずつ混合しエマルジョンとして、８週
齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー
社）の腹部皮下に０．５ｍＬを免疫注射した。 （２） 初回免疫から２週間後に、前記の抗体産生用免
疫原を３０μｇ／ｍＬになるように生理食塩水で溶解
し、フロイント不完全アジュバントと等量ずつ混合しエ
マルジョンとして、その０．５ｍＬにより追加免疫注射
を行った。この追加免疫注射は２週間おきに行った。
（ａ）を抗体産生用免疫原として、５０μｇ／ｍＬにな
るように生理食塩水に溶解し、これをフロイント完全ア
ジュバントと等量ずつ混合しエマルジョンとして、８週
齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー
社）の腹部皮下に０．５ｍＬを免疫注射した。 （２） 初回免疫から２週間後に、前記の抗体産生用免
疫原を３０μｇ／ｍＬになるように生理食塩水で溶解
し、フロイント不完全アジュバントと等量ずつ混合しエ
マルジョンとして、その０．５ｍＬにより追加免疫注射
を行った。この追加免疫注射は２週間おきに行った。
【００６２】（３） 免疫動物であるこのマウスの血清
中の抗体価を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ
法）にて１週間ごとに測定した。このＥＬＩＳＡ法は、
前記〔１〕で得たリポタンパク質（ａ）〔抗体産生用免
疫原〕をマイクロプレートに１ウエル当たり１μｇずつ
固相化し、適当な濃度に希釈した免疫動物の血清をこれ
に加えて反応させ、洗浄後更にパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）標識抗マウスＩｇＧ抗体を加えて反応を行わせ、そ
して洗浄した後、過酸化水素と２，２’−アジノ−ビス
（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〔Ａ
ＢＴＳ〕を含んだ発色液を加えて発色させ、ＥＩＡプレ
ートリーダー（バイオラッド社製）にて４１５ｎｍの吸
光度を測定して抗体価を求めるという操作法により行っ
た。
中の抗体価を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ
法）にて１週間ごとに測定した。このＥＬＩＳＡ法は、
前記〔１〕で得たリポタンパク質（ａ）〔抗体産生用免
疫原〕をマイクロプレートに１ウエル当たり１μｇずつ
固相化し、適当な濃度に希釈した免疫動物の血清をこれ
に加えて反応させ、洗浄後更にパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）標識抗マウスＩｇＧ抗体を加えて反応を行わせ、そ
して洗浄した後、過酸化水素と２，２’−アジノ−ビス
（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〔Ａ
ＢＴＳ〕を含んだ発色液を加えて発色させ、ＥＩＡプレ
ートリーダー（バイオラッド社製）にて４１５ｎｍの吸
光度を測定して抗体価を求めるという操作法により行っ
た。
【００６３】（４） 追加免疫を４回行った後に、抗体
価がプラトーに達したと認められたので、この免疫動物
であるマウスの腹部皮下に、生理食塩水で１００μｇ／
ｍＬとした前記〔１〕で得たリポタンパク質（ａ）〔抗
体産生用免疫原〕の０．５ｍＬを注射した。その後３日
目に、この免疫動物のマウスより脾臓を取得した。
価がプラトーに達したと認められたので、この免疫動物
であるマウスの腹部皮下に、生理食塩水で１００μｇ／
ｍＬとした前記〔１〕で得たリポタンパク質（ａ）〔抗
体産生用免疫原〕の０．５ｍＬを注射した。その後３日
目に、この免疫動物のマウスより脾臓を取得した。
【００６４】〔３〕骨髄腫細胞の増殖 ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・
ホスホリボシル・トランスフェラーゼ欠損の骨髄腫細胞
株であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサー
チソースバンク ９０８５）を、胎生ウシ血清を１０％
含有しグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン
を補ったＲＰＭＩ１６４０組織培養培地（ギブコ・オリ
エンタル社製）で増殖を行った。これは、この骨髄腫細
胞を細胞培養用中型ボトル（ヌンク社製、２００ｍＬ
容）内で、ボトルの底面の約８割を細胞が占めるまで増
殖させた。なお、細胞数は、トリパン青染料排除法及び
血球計で計数を行った。
ホスホリボシル・トランスフェラーゼ欠損の骨髄腫細胞
株であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサー
チソースバンク ９０８５）を、胎生ウシ血清を１０％
含有しグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン
を補ったＲＰＭＩ１６４０組織培養培地（ギブコ・オリ
エンタル社製）で増殖を行った。これは、この骨髄腫細
胞を細胞培養用中型ボトル（ヌンク社製、２００ｍＬ
容）内で、ボトルの底面の約８割を細胞が占めるまで増
殖させた。なお、細胞数は、トリパン青染料排除法及び
血球計で計数を行った。
【００６５】〔４〕細胞融合 （１） 前記の免疫動物のマウスから取得した脾臓を、
ステンレススチールメッシュ＃２００を使用して充分に
ほぐし、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で洗浄
しながら濾過した。その後、２００ｇで遠心分離を行
い、脾臓細胞を分離した。更に、再度血清を含まないＲ
ＰＭＩ１６４０培地液で３回脾臓細胞を洗浄した。 （２） この脾臓細胞と前記の増殖させたＰ３−Ｘ６３
−Ａｇ８−Ｕ１株骨髄腫細胞を５対１の割合で混合した
後、遠心分離を行った。混合した細胞を、ポリエチレン
グリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ベーリンガーマ
ンハイム社製）を５０％含むＲＰＭＩ１６４０培地液に
ゆっくりと懸濁した。そして、最終的にポリエチレング
リコール濃度が５％となるように、これをＲＰＭＩ１６
４０培地液で徐々に希釈した。
ステンレススチールメッシュ＃２００を使用して充分に
ほぐし、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で洗浄
しながら濾過した。その後、２００ｇで遠心分離を行
い、脾臓細胞を分離した。更に、再度血清を含まないＲ
ＰＭＩ１６４０培地液で３回脾臓細胞を洗浄した。 （２） この脾臓細胞と前記の増殖させたＰ３−Ｘ６３
−Ａｇ８−Ｕ１株骨髄腫細胞を５対１の割合で混合した
後、遠心分離を行った。混合した細胞を、ポリエチレン
グリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ベーリンガーマ
ンハイム社製）を５０％含むＲＰＭＩ１６４０培地液に
ゆっくりと懸濁した。そして、最終的にポリエチレング
リコール濃度が５％となるように、これをＲＰＭＩ１６
４０培地液で徐々に希釈した。
【００６６】（３） これより細胞を遠心分離で分離
し、５％のハイブリドーマクローニングファクター（オ
リゲン社製）を含んだＳ−クローン培地（三光純薬社
製）よりなる増殖培地に徐々に分散させた。そして、平
底の９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の
ウエルに、１ウエル当たり１０6 個／１００μＬの細胞
数の細胞を植え、５％の二酸化炭素中３７℃で培養し
た。 （４） 細胞融合後１日目に、各ウエルに１００μＬの
ＨＡＴ培地（前記の増殖培地に０．０１ｍＭヒポキサン
チン、１．６μＭチミジン及び０．０４μＭアミノプテ
リンとなるようにそれぞれを補充したもの、いずれも東
京化成社製）を加えた。その後３日間は、毎日、約半分
のＨＡＴ培地を新しいＨＡＴ培地と交換し、更にその後
は、２〜３日毎に同様の交換を行った。
し、５％のハイブリドーマクローニングファクター（オ
リゲン社製）を含んだＳ−クローン培地（三光純薬社
製）よりなる増殖培地に徐々に分散させた。そして、平
底の９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の
ウエルに、１ウエル当たり１０6 個／１００μＬの細胞
数の細胞を植え、５％の二酸化炭素中３７℃で培養し
た。 （４） 細胞融合後１日目に、各ウエルに１００μＬの
ＨＡＴ培地（前記の増殖培地に０．０１ｍＭヒポキサン
チン、１．６μＭチミジン及び０．０４μＭアミノプテ
リンとなるようにそれぞれを補充したもの、いずれも東
京化成社製）を加えた。その後３日間は、毎日、約半分
のＨＡＴ培地を新しいＨＡＴ培地と交換し、更にその後
は、２〜３日毎に同様の交換を行った。
【００６７】（５） 細胞は、顕微鏡で観察した。ハイ
ブリドーマ（融合細胞）のクローンは１０日以後より出
現し、１４日以降にリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体の産生を検査するため、ウエルの上澄み液をＥＬＩＳ
Ａ法でスクリーニングした。なお、このＥＬＩＳＡ法の
操作は、免疫動物の血清に代えてウエルの上澄み液を用
いる他は、前記〔２〕の（３）と同様にして行った。 （６） 前記（５）のスクリーニングにおいて、リポタ
ンパク質（ａ）に結合する抗体を産生していることが判
明したウエルのハイブリドーマを２４穴のウエルがある
プレートに拡げて培養し、細胞密度が高くなるに従い、
小型ボトル、中型ボトルとスケールを大きくして培養し
た。
ブリドーマ（融合細胞）のクローンは１０日以後より出
現し、１４日以降にリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体の産生を検査するため、ウエルの上澄み液をＥＬＩＳ
Ａ法でスクリーニングした。なお、このＥＬＩＳＡ法の
操作は、免疫動物の血清に代えてウエルの上澄み液を用
いる他は、前記〔２〕の（３）と同様にして行った。 （６） 前記（５）のスクリーニングにおいて、リポタ
ンパク質（ａ）に結合する抗体を産生していることが判
明したウエルのハイブリドーマを２４穴のウエルがある
プレートに拡げて培養し、細胞密度が高くなるに従い、
小型ボトル、中型ボトルとスケールを大きくして培養し
た。
【００６８】（７） そして、ハイブリドーマはＨＴ培
地（アミノプテリン及びハイブリドーマクローニングフ
ァクターを含まないＨＡＴ培地）で培養、保持した。 （８） リポタンパク質（ａ）に結合する抗体の産生を
ＥＬＩＳＡ法により前記（５）と同様にして調べたとこ
ろ、リポタンパク質（ａ）と結合する抗体を産生する３
２個のハイブリドーマを確認した。
地（アミノプテリン及びハイブリドーマクローニングフ
ァクターを含まないＨＡＴ培地）で培養、保持した。 （８） リポタンパク質（ａ）に結合する抗体の産生を
ＥＬＩＳＡ法により前記（５）と同様にして調べたとこ
ろ、リポタンパク質（ａ）と結合する抗体を産生する３
２個のハイブリドーマを確認した。
【００６９】〔５〕ハイブリドーマサブクローニング （１） 前記の３２個のハイブリドーマを限界希釈法に
てサブクローニングした。これらのハイブリドーマの細
胞数を、トリパン青染料排除法及び血球計により計数を
行った。そして、これらのハイブリドーマを、１００μ
ＬのＨＴ培地当たり、０．５個の生育細胞数の割合と１
個の生育細胞数の割合の２種類の割合で懸濁し、９６穴
の平底マイクロプレートの１ウエル当たり１００μＬず
つ分注した。これを、２〜３日毎に培地を交換して、ハ
イブリドーマを増殖させた。 （２） ２週間後、顕微鏡下で各ウエルのコロニー数を
調べ、そして、リポタンパク質（ａ）と結合する抗体を
産生するウエルを前記と同様にしてＥＬＩＳＡ法で調べ
た。１ウエル中に１コロニーが存在し、そしてこのよう
な抗体を産生するウエルを６個得た。
てサブクローニングした。これらのハイブリドーマの細
胞数を、トリパン青染料排除法及び血球計により計数を
行った。そして、これらのハイブリドーマを、１００μ
ＬのＨＴ培地当たり、０．５個の生育細胞数の割合と１
個の生育細胞数の割合の２種類の割合で懸濁し、９６穴
の平底マイクロプレートの１ウエル当たり１００μＬず
つ分注した。これを、２〜３日毎に培地を交換して、ハ
イブリドーマを増殖させた。 （２） ２週間後、顕微鏡下で各ウエルのコロニー数を
調べ、そして、リポタンパク質（ａ）と結合する抗体を
産生するウエルを前記と同様にしてＥＬＩＳＡ法で調べ
た。１ウエル中に１コロニーが存在し、そしてこのよう
な抗体を産生するウエルを６個得た。
【００７０】（３） これを、２４穴のプレートに移
し、細胞生育が良好となるまで２週間培養を行った。 （４） 次に、これらのハイブリドーマが産生する抗体
の、「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメ
インのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイ
プ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又は
プロテアーゼ様ドメイン」、「アポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ１、タイプ
２、タイプ３又はタイプ４」、「ＬＤＬ」、そして「プ
ラスミノーゲン」それぞれとの反応性を前記のＥＬＩＳ
Ａ法により調べた。
し、細胞生育が良好となるまで２週間培養を行った。 （４） 次に、これらのハイブリドーマが産生する抗体
の、「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメ
インのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイ
プ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又は
プロテアーゼ様ドメイン」、「アポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ１、タイプ
２、タイプ３又はタイプ４」、「ＬＤＬ」、そして「プ
ラスミノーゲン」それぞれとの反応性を前記のＥＬＩＳ
Ａ法により調べた。
【００７１】（５） その後、このハイブリドーマを、
再度前記（１）及び（２）と同様にしてクローニングを
行い、それぞれのウエルについて抗体の産生を調べたと
ころ、１ウエル中に１コロニーのハイブリドーマが存在
した。そして、「アポリポタンパク質（ａ）のクリング
ル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイ
プ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ド
メイン又はプロテアーゼ様ドメイン」と結合し、かつ
「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ１、タイプ２、タイプ３又はタイプ４」、「Ｌ
ＤＬ」とは結合しない抗体を産生するものを全部で４ク
ローン得た。
再度前記（１）及び（２）と同様にしてクローニングを
行い、それぞれのウエルについて抗体の産生を調べたと
ころ、１ウエル中に１コロニーのハイブリドーマが存在
した。そして、「アポリポタンパク質（ａ）のクリング
ル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイ
プ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ド
メイン又はプロテアーゼ様ドメイン」と結合し、かつ
「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ１、タイプ２、タイプ３又はタイプ４」、「Ｌ
ＤＬ」とは結合しない抗体を産生するものを全部で４ク
ローン得た。
【００７２】（６） これらのハイブリドーマ細胞株
を、リポタンパク質（ａ）に結合するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞株「２０２Ａ９株」、
「２０２Ｆ８株」、「２０３Ｅ２株」及び「１０４Ｄ１
１株」とした。これらのハイブリドーマ細胞株「２０２
Ａ９株」、「２０２Ｆ８株」「２０３Ｅ２株」及び「１
０４Ｄ１１株」は、通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所にそれぞれ「ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４２」、
「ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４３」、「ＦＥＲＭ Ｐ−１７
０４４」及び「ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４５」として平成
１０年１１月５日付けにて寄託されている。
を、リポタンパク質（ａ）に結合するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞株「２０２Ａ９株」、
「２０２Ｆ８株」、「２０３Ｅ２株」及び「１０４Ｄ１
１株」とした。これらのハイブリドーマ細胞株「２０２
Ａ９株」、「２０２Ｆ８株」「２０３Ｅ２株」及び「１
０４Ｄ１１株」は、通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所にそれぞれ「ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４２」、
「ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４３」、「ＦＥＲＭ Ｐ−１７
０４４」及び「ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４５」として平成
１０年１１月５日付けにて寄託されている。
【００７３】〔６〕モノクローナル抗体の産生 （１） 得られたリポタンパク質（ａ）に結合するモノ
クローナル抗体産生細胞株を、中型ボトル（ヌンク社
製）の中で、底面の約８割を細胞が占めるまでＨＴ培地
中で培養を行った。 （２） その後、これらのハイブリドーマを掻き取り、
そして２００ｇ、５分間の遠心分離を行い集めた。次
に、これを血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で３
回洗浄した後、２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地液に懸濁
した。
クローナル抗体産生細胞株を、中型ボトル（ヌンク社
製）の中で、底面の約８割を細胞が占めるまでＨＴ培地
中で培養を行った。 （２） その後、これらのハイブリドーマを掻き取り、
そして２００ｇ、５分間の遠心分離を行い集めた。次
に、これを血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で３
回洗浄した後、２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地液に懸濁
した。
【００７４】（３） 前もって２，６，１０，１４−テ
トラメチルペンタデカンで処置しておいたオスのＢＡＬ
Ｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹腔に、前
記（２）で得たハイブリドーマ懸濁液１ｍＬを注射し
た。注射から２週間以内に腹部の膨張が認められなかっ
た場合には、再度これを繰り返し行った。 （４） このマウスの腹部の膨張が認められたときに腹
水を採取した。これを２００ｇ、５分間の遠心分離にか
け、リポタンパク質（ａ）に結合するモノクローナル抗
体を含む上澄み液をハイブリドーマから分離して取得し
た。
トラメチルペンタデカンで処置しておいたオスのＢＡＬ
Ｂ／ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹腔に、前
記（２）で得たハイブリドーマ懸濁液１ｍＬを注射し
た。注射から２週間以内に腹部の膨張が認められなかっ
た場合には、再度これを繰り返し行った。 （４） このマウスの腹部の膨張が認められたときに腹
水を採取した。これを２００ｇ、５分間の遠心分離にか
け、リポタンパク質（ａ）に結合するモノクローナル抗
体を含む上澄み液をハイブリドーマから分離して取得し
た。
【００７５】〔７〕モノクローナル抗体の精製 （１） リポタンパク質（ａ）に結合するモノクローナ
ル抗体を含む上澄み液の１０ｍＬに、２２℃で硫酸ナト
リウム１．８ｇを撹拌しながら加え、硫酸ナトリウムが
完全に溶けてから更に１時間撹拌を続けて塩析を行っ
た。 （２） これを２２℃で遠心分離（７，０００ｇ、１５
分間）を行い、上澄み液と分離して得た沈殿を、３０ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ８．０）２ｍＬに溶解した。
ル抗体を含む上澄み液の１０ｍＬに、２２℃で硫酸ナト
リウム１．８ｇを撹拌しながら加え、硫酸ナトリウムが
完全に溶けてから更に１時間撹拌を続けて塩析を行っ
た。 （２） これを２２℃で遠心分離（７，０００ｇ、１５
分間）を行い、上澄み液と分離して得た沈殿を、３０ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ８．０）２ｍＬに溶解した。
【００７６】（３） 次に、これを前記の塩化ナトリウ
ムを含むリン酸ナトリウム緩衝液に対して充分に透析し
た後、１，０００ｇで２０分間遠心分離し不溶性のもの
を除去した。 （４） これを前記の塩化ナトリウムを含むリン酸ナト
リウム緩衝液で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロース
イオン交換カラム（セルバ社製）〔１×１０ｃｍ〕に流
速０．４ｍＬ／分で通して、溶出液を２ｍＬずつ集め
た。 （５） 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が溶出液の素通り
画分に含まれていることを２８０ｎｍの吸光度より確認
し、これを集めて２ｍＬに濃縮した。
ムを含むリン酸ナトリウム緩衝液に対して充分に透析し
た後、１，０００ｇで２０分間遠心分離し不溶性のもの
を除去した。 （４） これを前記の塩化ナトリウムを含むリン酸ナト
リウム緩衝液で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロース
イオン交換カラム（セルバ社製）〔１×１０ｃｍ〕に流
速０．４ｍＬ／分で通して、溶出液を２ｍＬずつ集め
た。 （５） 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が溶出液の素通り
画分に含まれていることを２８０ｎｍの吸光度より確認
し、これを集めて２ｍＬに濃縮した。
【００７７】（６） 更に、これをプロテインＡ−セフ
ァロースＣＬ−４Ｂアフィニティークロマトグラフィー
カラム（ファルマシア−エルケービー社製）にかけて精
製を行い、リポタンパク質（ａ）に結合するマウスモノ
クローナル抗体を得た。なお、この得られたモノクロー
ナル抗体の量は、それぞれタンパク質量で１０〜３０ｍ
ｇであった。また、ここで得たリポタンパク質（ａ）に
結合するモノクローナル抗体の抗体クラスとサブタイプ
は、市販の特異抗マウス免疫グロブリン抗血清（ダコ社
製）を用いたオクタロニイ免疫拡散法により、いずれも
ＩｇＧ1 、λ鎖と決定した。本実施例で得た４種類のリ
ポタンパク質（ａ）に結合するマウスモノクローナル抗
体を以下にまとめた。
ァロースＣＬ−４Ｂアフィニティークロマトグラフィー
カラム（ファルマシア−エルケービー社製）にかけて精
製を行い、リポタンパク質（ａ）に結合するマウスモノ
クローナル抗体を得た。なお、この得られたモノクロー
ナル抗体の量は、それぞれタンパク質量で１０〜３０ｍ
ｇであった。また、ここで得たリポタンパク質（ａ）に
結合するモノクローナル抗体の抗体クラスとサブタイプ
は、市販の特異抗マウス免疫グロブリン抗血清（ダコ社
製）を用いたオクタロニイ免疫拡散法により、いずれも
ＩｇＧ1 、λ鎖と決定した。本実施例で得た４種類のリ
ポタンパク質（ａ）に結合するマウスモノクローナル抗
体を以下にまとめた。
【００７８】 「２０２Ａ９株」〔ＦＥＲＭ Ｐ−１
７０４２〕由来のリポタンパク質（ａ）に結合する抗体 「２０２Ｆ８株」〔ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４３〕由
来のリポタンパク質（ａ）に結合する抗体 「２０３Ｅ２株」〔ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４４〕由
来のリポタンパク質（ａ）に結合する抗体 「１０４Ｄ１１株」〔ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４５〕
由来のリポタンパク質（ａ）に結合する抗体
７０４２〕由来のリポタンパク質（ａ）に結合する抗体 「２０２Ｆ８株」〔ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４３〕由
来のリポタンパク質（ａ）に結合する抗体 「２０３Ｅ２株」〔ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４４〕由
来のリポタンパク質（ａ）に結合する抗体 「１０４Ｄ１１株」〔ＦＥＲＭ Ｐ−１７０４５〕
由来のリポタンパク質（ａ）に結合する抗体
【００７９】〔実施例２〕 実施例１で得られたリポタ
ンパク質（ａ）に結合する抗体のＬＤＬへの反応性の確
認 実施例１で得られた４種類のリポタンパク質（ａ）に結
合する抗体のＬＤＬへの反応性をウエスタンブロット法
により確かめた。 （１） ＬＤＬ濃度が高いヒト血清を、超遠心分離を行
い、比重が１．００６以上かつ１．０６３以下の部分を
分取し、抗リポタンパク質（ａ）抗体（イムノ社製）を
リガンドとして結合させたアフィニティークロマトグラ
フィーカラムにかけて素通り画分を分取して、精製ＬＤ
Ｌを得た。
ンパク質（ａ）に結合する抗体のＬＤＬへの反応性の確
認 実施例１で得られた４種類のリポタンパク質（ａ）に結
合する抗体のＬＤＬへの反応性をウエスタンブロット法
により確かめた。 （１） ＬＤＬ濃度が高いヒト血清を、超遠心分離を行
い、比重が１．００６以上かつ１．０６３以下の部分を
分取し、抗リポタンパク質（ａ）抗体（イムノ社製）を
リガンドとして結合させたアフィニティークロマトグラ
フィーカラムにかけて素通り画分を分取して、精製ＬＤ
Ｌを得た。
【００８０】（２） このＬＤＬを０．５ｍｇ／ｍＬに
なるように生理食塩水に溶解し、この２μＬを試料とし
てタイタン・ジェル・リポタンパク質電気泳動キット
（ヘレナ研究所社製）を用いて電気泳動を行った。な
お、支持体はアガロースゲルであり、泳動緩衝液はバル
ビタール緩衝液（ｐＨ８．８）を使用して、電圧９０Ｖ
で７５分間通電して行った。 （３） 転写はノバ・ブロット・エレクトロフォレティ
ック・トランスファー・キット（ファルマシア−エルケ
ービー社製）を用いて、その使用説明書に従い、ドライ
方式で行った。
なるように生理食塩水に溶解し、この２μＬを試料とし
てタイタン・ジェル・リポタンパク質電気泳動キット
（ヘレナ研究所社製）を用いて電気泳動を行った。な
お、支持体はアガロースゲルであり、泳動緩衝液はバル
ビタール緩衝液（ｐＨ８．８）を使用して、電圧９０Ｖ
で７５分間通電して行った。 （３） 転写はノバ・ブロット・エレクトロフォレティ
ック・トランスファー・キット（ファルマシア−エルケ
ービー社製）を用いて、その使用説明書に従い、ドライ
方式で行った。
【００８１】（４） 転写用装置上に置いた（２）のア
ガロースゲルの上に、９ｃｍ×９ｃｍのニトロセルロー
ス膜（バイオラッド社製）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン、３９ｍＭグリシン、
０．０３７５％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）及び２０％（Ｖ／Ｖ）メタノールよりなる転写用
緩衝液を用いて、電流６５ｍＡで２時間転写を行った。 （５） 転写を行ったニトロセルロース膜を、１％ＢＳ
Ａを含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水
素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、
１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム
（ｐＨ７．２））２０ｍＬに４℃で１晩浸漬して、ブロ
ッキングを行った。
ガロースゲルの上に、９ｃｍ×９ｃｍのニトロセルロー
ス膜（バイオラッド社製）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン、３９ｍＭグリシン、
０．０３７５％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）及び２０％（Ｖ／Ｖ）メタノールよりなる転写用
緩衝液を用いて、電流６５ｍＡで２時間転写を行った。 （５） 転写を行ったニトロセルロース膜を、１％ＢＳ
Ａを含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水
素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、
１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム
（ｐＨ７．２））２０ｍＬに４℃で１晩浸漬して、ブロ
ッキングを行った。
【００８２】（６） 次にこれを洗浄液〔０．０５％ツ
イーン２０（Tween20 ）を含むリン酸緩衝生理食塩水〕
２０ｍＬ中で１０分間振とう洗浄を行った。この操作を
３回行った。 （７） 実施例１で得られた４種類のリポタンパク質
（ａ）に結合する抗体（「２０２Ａ９株」由来、「２０
２Ｆ８株」由来、「２０３Ｅ２株」由来及び「１０４Ｄ
１１株」由来）を、それぞれ２０ｍＬのリン酸緩衝生理
食塩水に８０μｇ溶解して４種類の溶液を調製した。次
に、これらの溶液に（６）の操作を行ったニトロセルロ
ース膜をそれぞれ室温で２時間浸漬して反応させた。
イーン２０（Tween20 ）を含むリン酸緩衝生理食塩水〕
２０ｍＬ中で１０分間振とう洗浄を行った。この操作を
３回行った。 （７） 実施例１で得られた４種類のリポタンパク質
（ａ）に結合する抗体（「２０２Ａ９株」由来、「２０
２Ｆ８株」由来、「２０３Ｅ２株」由来及び「１０４Ｄ
１１株」由来）を、それぞれ２０ｍＬのリン酸緩衝生理
食塩水に８０μｇ溶解して４種類の溶液を調製した。次
に、これらの溶液に（６）の操作を行ったニトロセルロ
ース膜をそれぞれ室温で２時間浸漬して反応させた。
【００８３】（８） なお対照として、実施例１で得ら
れたリポタンパク質（ａ）に結合する抗体の代わりに、
ＬＤＬの構成成分のアポリポタンパク質Ｂ−１００に対
する同濃度のヤギ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体（インタ
ーナショナルエンザイム社製）を用いて、前記（７）の
操作を行った。また、（６）で得られたニトロセルロー
ス膜に、実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結
合する抗体及び対照に使用したヤギ抗アポリポタンパク
質Ｂ抗体のいずれも作用させないものを陰性対照として
用意した。 （９） 前記（７）又は（８）の操作を行ったニトロセ
ルロース膜を洗浄液２０ｍＬで１０分間振とう洗浄を行
った。これを３回行った。
れたリポタンパク質（ａ）に結合する抗体の代わりに、
ＬＤＬの構成成分のアポリポタンパク質Ｂ−１００に対
する同濃度のヤギ抗アポリポタンパク質Ｂ抗体（インタ
ーナショナルエンザイム社製）を用いて、前記（７）の
操作を行った。また、（６）で得られたニトロセルロー
ス膜に、実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結
合する抗体及び対照に使用したヤギ抗アポリポタンパク
質Ｂ抗体のいずれも作用させないものを陰性対照として
用意した。 （９） 前記（７）又は（８）の操作を行ったニトロセ
ルロース膜を洗浄液２０ｍＬで１０分間振とう洗浄を行
った。これを３回行った。
【００８４】（１０） 次にパーオキシダーゼ標識抗マ
ウスＩｇＧ抗体（ダコ社製）及びパーオキシダーゼ標識
抗ヤギＩｇＧ抗体（ダコ社製）を、３％ＢＳＡを含むリ
ン酸緩衝生理食塩水で５００倍希釈して２０ｍＬの溶液
を調製し、これにそれぞれのニトロセルロース膜を室温
で２時間浸漬して反応させた。 （１１） これらのニトロセルロース膜を洗浄液２０ｍ
Ｌで１０分間振とう洗浄した。これを３回行った。
ウスＩｇＧ抗体（ダコ社製）及びパーオキシダーゼ標識
抗ヤギＩｇＧ抗体（ダコ社製）を、３％ＢＳＡを含むリ
ン酸緩衝生理食塩水で５００倍希釈して２０ｍＬの溶液
を調製し、これにそれぞれのニトロセルロース膜を室温
で２時間浸漬して反応させた。 （１１） これらのニトロセルロース膜を洗浄液２０ｍ
Ｌで１０分間振とう洗浄した。これを３回行った。
【００８５】（１２） ０．０２５％３，３’−ジアミ
ノベンジジン四塩酸塩及び０．０１％過酸化水素を含む
リン酸緩衝生理食塩水２０ｍＬに室温で１５分間前記
（１１）のニトロセルロース膜を浸漬して発色させた。
このウエスタンブロット法の結果を図２に示した。図２
において、Ｐは対照、Ｎは陰性対照、１は「２０２Ａ９
株」由来の抗体を作用させたもの、２は「２０３Ｅ２
株」由来の抗体を作用させたもの、３は「２０２Ｆ８
株」由来の抗体を作用させたもの、４は「１０４Ｄ１１
株」由来の抗体を作用させたものである。
ノベンジジン四塩酸塩及び０．０１％過酸化水素を含む
リン酸緩衝生理食塩水２０ｍＬに室温で１５分間前記
（１１）のニトロセルロース膜を浸漬して発色させた。
このウエスタンブロット法の結果を図２に示した。図２
において、Ｐは対照、Ｎは陰性対照、１は「２０２Ａ９
株」由来の抗体を作用させたもの、２は「２０３Ｅ２
株」由来の抗体を作用させたもの、３は「２０２Ｆ８
株」由来の抗体を作用させたもの、４は「１０４Ｄ１１
株」由来の抗体を作用させたものである。
【００８６】図２における対照との比較より、前記実施
例１で得られた４種類のリポタンパク質（ａ）に結合す
る抗体は、いずれも、市販の抗アポリポタンパク質Ｂ抗
体が発色を示す位置には発色を認めないことから、ＬＤ
Ｌとは結合しないことが確かめられた。更に、前記実施
例１で得られた４種類の抗体、及び市販の抗アポリポタ
ンパク質Ｂ抗体のいずれも作用させていない陰性対照に
発色が見られないことから、非特異的な発色が起きてい
ないことが示された。
例１で得られた４種類のリポタンパク質（ａ）に結合す
る抗体は、いずれも、市販の抗アポリポタンパク質Ｂ抗
体が発色を示す位置には発色を認めないことから、ＬＤ
Ｌとは結合しないことが確かめられた。更に、前記実施
例１で得られた４種類の抗体、及び市販の抗アポリポタ
ンパク質Ｂ抗体のいずれも作用させていない陰性対照に
発色が見られないことから、非特異的な発色が起きてい
ないことが示された。
【００８７】〔実施例３〕 実施例１で得られたリポタ
ンパク質（ａ）に結合する抗体のプラスミノーゲンへの
反応性の確認実施例１で得られた４種類のリポタンパク
質（ａ）に結合する抗体のプラスミノーゲンへの反応性
をウエスタンブロット法により確かめた。 （１） プラスミノーゲン濃度が高いヒト血漿を、超遠
心分離を行い比重が１．２１以上の部分を分取し、リジ
ン−セファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィ
ーカラム（ファルマシア−エルケービー社製）にかけ、
更に抗リポタンパク質（ａ）抗体（イムノ社製）をリガ
ンドとして結合させたアフィニティークロマトグラフィ
ーカラムにかけて素通り画分を分取し、精製プラスミノ
ーゲンを得た。
ンパク質（ａ）に結合する抗体のプラスミノーゲンへの
反応性の確認実施例１で得られた４種類のリポタンパク
質（ａ）に結合する抗体のプラスミノーゲンへの反応性
をウエスタンブロット法により確かめた。 （１） プラスミノーゲン濃度が高いヒト血漿を、超遠
心分離を行い比重が１．２１以上の部分を分取し、リジ
ン−セファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィ
ーカラム（ファルマシア−エルケービー社製）にかけ、
更に抗リポタンパク質（ａ）抗体（イムノ社製）をリガ
ンドとして結合させたアフィニティークロマトグラフィ
ーカラムにかけて素通り画分を分取し、精製プラスミノ
ーゲンを得た。
【００８８】（２） １．０ｍｇ／ｍＬになるように生
理食塩水に溶解した前記精製プラスミノーゲンの１０μ
Ｌを試料として電気泳動を行った。なお、支持体は３〜
１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで、泳動緩衝液は
０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン−０．１９Ｍグリシン緩衝液を使用し
て、電流２０ｍＡで１２０分間通電して行った。 （３） 転写はノバ・ブロット・エレクトロフォレティ
ック・トランスファー・キット（ファルマシア−エルケ
ービー社製）を用いて、その使用説明書に従い、ドライ
方式で行った。
理食塩水に溶解した前記精製プラスミノーゲンの１０μ
Ｌを試料として電気泳動を行った。なお、支持体は３〜
１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで、泳動緩衝液は
０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン−０．１９Ｍグリシン緩衝液を使用し
て、電流２０ｍＡで１２０分間通電して行った。 （３） 転写はノバ・ブロット・エレクトロフォレティ
ック・トランスファー・キット（ファルマシア−エルケ
ービー社製）を用いて、その使用説明書に従い、ドライ
方式で行った。
【００８９】（４） 転写用装置上に置いた前記（２）
の３〜１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの上に、９
ｃｍ×９ｃｍのニトロセルロース膜（バイオラッド社
製）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、３９ｍＭグリシン、０．０３７５％（Ｗ／
Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び２０％（Ｖ
／Ｖ）メタノールよりなる転写用緩衝液を用いて、電流
６５ｍＡで２時間転写を行った。 以下の操作は、前記実施例２の（５）〜（１２）に記載
の方法と同様にして行った。但し、前記実施例２の
（８）の操作において、対照として、ヤギ抗アポリポタ
ンパク質Ｂ抗体の代わりにヤギ抗プラスミノーゲン抗体
（医学生物学研究所社製）を用いて操作を行った。
の３〜１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの上に、９
ｃｍ×９ｃｍのニトロセルロース膜（バイオラッド社
製）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、３９ｍＭグリシン、０．０３７５％（Ｗ／
Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び２０％（Ｖ
／Ｖ）メタノールよりなる転写用緩衝液を用いて、電流
６５ｍＡで２時間転写を行った。 以下の操作は、前記実施例２の（５）〜（１２）に記載
の方法と同様にして行った。但し、前記実施例２の
（８）の操作において、対照として、ヤギ抗アポリポタ
ンパク質Ｂ抗体の代わりにヤギ抗プラスミノーゲン抗体
（医学生物学研究所社製）を用いて操作を行った。
【００９０】ウエスタンブロット法の結果を図３に示し
た。図３において、Ｐは対照、Ｎは陰性対照、１は「２
０２Ａ９株」由来の抗体を作用させたもの、２は「２０
３Ｅ２株」由来の抗体を作用させたもの、３は「２０２
Ｆ８株」由来の抗体を作用させたもの、４は「１０４Ｄ
１１株」由来の抗体を作用させたものである。図３にお
ける対照との比較より、「２０２Ａ９株」由来、「２０
２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来の３種類の
実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体は、いずれも、市販の抗プラスミノーゲン抗体が発色
を示す位置には発色を認めないことから、プラスミノー
ゲンとは結合しないことが確かめられた。
た。図３において、Ｐは対照、Ｎは陰性対照、１は「２
０２Ａ９株」由来の抗体を作用させたもの、２は「２０
３Ｅ２株」由来の抗体を作用させたもの、３は「２０２
Ｆ８株」由来の抗体を作用させたもの、４は「１０４Ｄ
１１株」由来の抗体を作用させたものである。図３にお
ける対照との比較より、「２０２Ａ９株」由来、「２０
２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来の３種類の
実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体は、いずれも、市販の抗プラスミノーゲン抗体が発色
を示す位置には発色を認めないことから、プラスミノー
ゲンとは結合しないことが確かめられた。
【００９１】また、「１０４Ｄ１１株」由来の実施例１
で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗体は、市
販の抗プラスミノーゲン抗体が発色を示す位置に発色を
認めることから、プラスミノーゲンと結合することが確
かめられた。更に、前記実施例１で得られた４種類の抗
体及び市販の抗プラスミノーゲン抗体のいずれも作用さ
せていない陰性対照に発色が見られないことから、非特
異的な発色が起きていないことが示された。
で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗体は、市
販の抗プラスミノーゲン抗体が発色を示す位置に発色を
認めることから、プラスミノーゲンと結合することが確
かめられた。更に、前記実施例１で得られた４種類の抗
体及び市販の抗プラスミノーゲン抗体のいずれも作用さ
せていない陰性対照に発色が見られないことから、非特
異的な発色が起きていないことが示された。
【００９２】〔実施例４〕 「クリングル５ドメイン及
びプロテア−ゼドメインからなるフラグメント」の調製 （１） 前記実施例３に記載の方法に従って調製した精
製プラスミノ−ゲン５００ｍｇを、０．０６％トリプシ
ンインヒビターを含む０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム緩
衝液（ｐＨ８．３）５ｍＬに溶解後、ブタ膵エラスタ−
ゼ１．５ｍｇを添加し、室温で４時間ゆっくりと撹拌し
ながら反応させた。
びプロテア−ゼドメインからなるフラグメント」の調製 （１） 前記実施例３に記載の方法に従って調製した精
製プラスミノ−ゲン５００ｍｇを、０．０６％トリプシ
ンインヒビターを含む０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム緩
衝液（ｐＨ８．３）５ｍＬに溶解後、ブタ膵エラスタ−
ゼ１．５ｍｇを添加し、室温で４時間ゆっくりと撹拌し
ながら反応させた。
【００９３】（２） 次に、前記の０．１Ｍ炭酸水素ア
ンモニウム緩衝液で平衡化されているセファデックスＧ
−７５（５×１２０ｃｍ）でゲルろ過を行い、ピ−ク
１、ピーク２、ピーク３及びピーク４の４つのピ−クを
得た。ピ−ク２には、「クリングル１ドメイン、クリン
グル２ドメイン及びクリングル３ドメインからなるフラ
グメント」、そして「クリングル５ドメイン及びプロテ
ア−ゼドメインからなるフラグメント」が含まれてい
た。また、ピーク３には、「クリングル４ドメインに無
関係なタンパク質」が含まれていた。
ンモニウム緩衝液で平衡化されているセファデックスＧ
−７５（５×１２０ｃｍ）でゲルろ過を行い、ピ−ク
１、ピーク２、ピーク３及びピーク４の４つのピ−クを
得た。ピ−ク２には、「クリングル１ドメイン、クリン
グル２ドメイン及びクリングル３ドメインからなるフラ
グメント」、そして「クリングル５ドメイン及びプロテ
ア−ゼドメインからなるフラグメント」が含まれてい
た。また、ピーク３には、「クリングル４ドメインに無
関係なタンパク質」が含まれていた。
【００９４】（３） ピ−ク２中の成分を分離するた
め、このピーク２の画分をリジン−セファロース４Ｂア
フィニティークロマトグラフィーカラムに通した。この
結果、素通り画分に「クリングル５ドメイン及びプロテ
ア−ゼドメインからなるフラグメント」が単一なタンパ
ク質成分として溶出した。その後、６−アミノカプロン
酸により溶出させた画分に「クリングル１ドメイン、ク
リングル２ドメイン及びクリングル３ドメインからなる
フラグメント」が単一なタンパク質成分として溶出し
た。
め、このピーク２の画分をリジン−セファロース４Ｂア
フィニティークロマトグラフィーカラムに通した。この
結果、素通り画分に「クリングル５ドメイン及びプロテ
ア−ゼドメインからなるフラグメント」が単一なタンパ
ク質成分として溶出した。その後、６−アミノカプロン
酸により溶出させた画分に「クリングル１ドメイン、ク
リングル２ドメイン及びクリングル３ドメインからなる
フラグメント」が単一なタンパク質成分として溶出し
た。
【００９５】（４） 次に、ピ−ク３中の成分を分離す
るため、このピーク３の画分をリジン−セファロース４
Ｂアフィニティークロマトグラフィーカラムに通した。
この結果、「クリングル４ドメインに無関係なタンパク
質」は素通りしてしまい、その後、６−アミノカプロン
酸により溶出させた画分に、「クリングル４ドメインの
タイプ１、タイプ２及びタイプ３からなるフラグメン
ト」が単一なタンパク質成分として溶出した。
るため、このピーク３の画分をリジン−セファロース４
Ｂアフィニティークロマトグラフィーカラムに通した。
この結果、「クリングル４ドメインに無関係なタンパク
質」は素通りしてしまい、その後、６−アミノカプロン
酸により溶出させた画分に、「クリングル４ドメインの
タイプ１、タイプ２及びタイプ３からなるフラグメン
ト」が単一なタンパク質成分として溶出した。
【００９６】〔実施例５〕 「クリングル４様ドメイン
のタイプ１、タイプ２、タイプ３及びタイプ４からなる
フラグメント」及び「クリングル４様ドメインのタイプ
５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９及びタイ
プ１０、クリングル５様ドメイン、プロテアーゼ様ドメ
イン並びにＬＤＬからなるフラグメント」の調製 （１） 実施例１に記載の方法に従って調製したヒトの
リポタンパク質（ａ）５０ｍｇを、１５０ｍＭ塩化ナト
リウム、４ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１％アジ化ナ
トリウムを含む１２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
８）５ｍＬに溶解した後、サーモライシン（ベーリンガ
ーマンハイム社製、４０単位／ｍｇ）０．１ｍｇを添加
し、３７℃で３０分間反応させた。
のタイプ１、タイプ２、タイプ３及びタイプ４からなる
フラグメント」及び「クリングル４様ドメインのタイプ
５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９及びタイ
プ１０、クリングル５様ドメイン、プロテアーゼ様ドメ
イン並びにＬＤＬからなるフラグメント」の調製 （１） 実施例１に記載の方法に従って調製したヒトの
リポタンパク質（ａ）５０ｍｇを、１５０ｍＭ塩化ナト
リウム、４ｍＭ塩化カルシウム及び０．０１％アジ化ナ
トリウムを含む１２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
８）５ｍＬに溶解した後、サーモライシン（ベーリンガ
ーマンハイム社製、４０単位／ｍｇ）０．１ｍｇを添加
し、３７℃で３０分間反応させた。
【００９７】（２） これに１０ｍＭ ＥＤＴＡを添加
し反応を止めた後、５０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０
１％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．６）に対して、４℃で一晩透析を行った。 （３） 次に、前記の塩化ナトリウム及びアジ化ナトリ
ウムを含むトリス塩酸緩衝液で平衡化されているヘパリ
ン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーカ
ラム（ファルマシア社製、１０×３ｃｍ）に通した。
し反応を止めた後、５０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０
１％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．６）に対して、４℃で一晩透析を行った。 （３） 次に、前記の塩化ナトリウム及びアジ化ナトリ
ウムを含むトリス塩酸緩衝液で平衡化されているヘパリ
ン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーカ
ラム（ファルマシア社製、１０×３ｃｍ）に通した。
【００９８】このアフィニティーカラムに結合せずに素
通りしたものが「クリングル４様ドメインのタイプ１、
タイプ２、タイプ３及びタイプ４からなるフラグメン
ト」であり、０．５Ｍ塩化ナトリウム及び０．０１％ア
ジ化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．６）を流したときに溶出してきたものが「クリング
ル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイ
プ８、タイプ９及びタイプ１０、クリングル５様ドメイ
ン、プロテアーゼ様ドメイン並びにＬＤＬからなるフラ
グメント」（ＬＤＬはクリングル４様ドメインのタイプ
９に結合している）であった。
通りしたものが「クリングル４様ドメインのタイプ１、
タイプ２、タイプ３及びタイプ４からなるフラグメン
ト」であり、０．５Ｍ塩化ナトリウム及び０．０１％ア
ジ化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．６）を流したときに溶出してきたものが「クリング
ル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイ
プ８、タイプ９及びタイプ１０、クリングル５様ドメイ
ン、プロテアーゼ様ドメイン並びにＬＤＬからなるフラ
グメント」（ＬＤＬはクリングル４様ドメインのタイプ
９に結合している）であった。
【００９９】〔実施例６〕 実施例１で得られたリポタ
ンパク質（ａ）に結合する抗体の「クリングル４様ドメ
インのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイ
プ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又は
プロテアーゼ様ドメイン」への反応性の確認 実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体のうち、３種類の抗体（「２０２Ａ９株」由来、「２
０２Ｆ８株」由来及び「２０３Ｅ２株」由来）につい
て、「クリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、
タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、ク
リングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」に
対する反応性をウエスタンブロット法により確かめた。
ンパク質（ａ）に結合する抗体の「クリングル４様ドメ
インのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイ
プ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又は
プロテアーゼ様ドメイン」への反応性の確認 実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体のうち、３種類の抗体（「２０２Ａ９株」由来、「２
０２Ｆ８株」由来及び「２０３Ｅ２株」由来）につい
て、「クリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、
タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、ク
リングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」に
対する反応性をウエスタンブロット法により確かめた。
【０１００】（１） 実施例５に記載の方法に従って調
製した「クリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ
６、タイプ７、タイプ８、タイプ９及びタイプ１０、ク
リングル５様ドメイン、プロテアーゼ様ドメイン並びに
ＬＤＬからなるフラグメント」を０．５ｍｇ／ｍＬにな
るように生理食塩水に溶解した。 （２） 次に、この２μＬを試料としてタイタン・ジェ
ル・リポタンパク質電気泳動キット（ヘレナ研究所社
製）を用いて電気泳動を行った。なお、支持体はアガロ
−スゲルであり、泳動緩衝液はバルビタール緩衝液（ｐ
Ｈ８．８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して
行った。
製した「クリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ
６、タイプ７、タイプ８、タイプ９及びタイプ１０、ク
リングル５様ドメイン、プロテアーゼ様ドメイン並びに
ＬＤＬからなるフラグメント」を０．５ｍｇ／ｍＬにな
るように生理食塩水に溶解した。 （２） 次に、この２μＬを試料としてタイタン・ジェ
ル・リポタンパク質電気泳動キット（ヘレナ研究所社
製）を用いて電気泳動を行った。なお、支持体はアガロ
−スゲルであり、泳動緩衝液はバルビタール緩衝液（ｐ
Ｈ８．８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して
行った。
【０１０１】以下の操作は、前記実施例２の（３）〜
（１２）に記載の方法と同様にして行った。但し、前記
実施例２の（７）の操作において、３種類の実施例１で
得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗体（「２０
２Ａ９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及び「２０３
Ｅ２株」由来）を、それぞれリン酸緩衝生理食塩水に溶
解して、３種類の溶液を調製した。また、前記実施例２
の（８）の操作において、対照として、ヤギ抗アポリポ
タンパク質Ｂ抗体の代わりにヤギ抗リポタンパク質
（ａ）ポリクローナル抗体（インターナショナルエンザ
イム社製）を用いて操作を行った。
（１２）に記載の方法と同様にして行った。但し、前記
実施例２の（７）の操作において、３種類の実施例１で
得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗体（「２０
２Ａ９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及び「２０３
Ｅ２株」由来）を、それぞれリン酸緩衝生理食塩水に溶
解して、３種類の溶液を調製した。また、前記実施例２
の（８）の操作において、対照として、ヤギ抗アポリポ
タンパク質Ｂ抗体の代わりにヤギ抗リポタンパク質
（ａ）ポリクローナル抗体（インターナショナルエンザ
イム社製）を用いて操作を行った。
【０１０２】ウエスタンブロット法の結果を図４に示し
た。図４において、Ｐは対照、Ｎは陰性対照、１は「２
０２Ａ９株」由来の抗体を作用させたもの、２は「２０
２Ｆ８株」由来の抗体を作用させたもの、３は「２０３
Ｅ２株」由来の抗体を作用させたものである。図４にお
ける対照との比較より、「２０２Ａ９株」由来、「２０
２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来の３種類の
実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体は、いずれも、市販の抗リポタンパク質（ａ）ポリク
ローナル抗体が発色を示す位置に発色を認めることか
ら、「クリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、
タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、ク
リングル５様ドメイン、プロテアーゼドメイン、又はＬ
ＤＬ」と結合することが確かめられた。
た。図４において、Ｐは対照、Ｎは陰性対照、１は「２
０２Ａ９株」由来の抗体を作用させたもの、２は「２０
２Ｆ８株」由来の抗体を作用させたもの、３は「２０３
Ｅ２株」由来の抗体を作用させたものである。図４にお
ける対照との比較より、「２０２Ａ９株」由来、「２０
２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来の３種類の
実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体は、いずれも、市販の抗リポタンパク質（ａ）ポリク
ローナル抗体が発色を示す位置に発色を認めることか
ら、「クリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、
タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、ク
リングル５様ドメイン、プロテアーゼドメイン、又はＬ
ＤＬ」と結合することが確かめられた。
【０１０３】しかしながら、前記実施例２の検討結果よ
り、「２０２Ａ９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及
び「２０３Ｅ２株」由来の３種類のリポタンパク質
（ａ）に結合する抗体は、いずれも、ＬＤＬには結合し
ないことが確認されているので、これらの「２０２Ａ９
株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２
株」由来の抗体は、「クリングル４様ドメインのタイプ
５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくは
タイプ１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ
様ドメイン」と結合するものであることが分かった。更
に、前記の実施例１で得たリポタンパク質（ａ）に結合
する抗体及び市販の抗リポタンパク質（ａ）ポリクロー
ナル抗体のいずれも作用させていない陰性対照に発色が
見られないことから、非特異的な発色が起きていないこ
とが示された。
り、「２０２Ａ９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及
び「２０３Ｅ２株」由来の３種類のリポタンパク質
（ａ）に結合する抗体は、いずれも、ＬＤＬには結合し
ないことが確認されているので、これらの「２０２Ａ９
株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２
株」由来の抗体は、「クリングル４様ドメインのタイプ
５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくは
タイプ１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ
様ドメイン」と結合するものであることが分かった。更
に、前記の実施例１で得たリポタンパク質（ａ）に結合
する抗体及び市販の抗リポタンパク質（ａ）ポリクロー
ナル抗体のいずれも作用させていない陰性対照に発色が
見られないことから、非特異的な発色が起きていないこ
とが示された。
【０１０４】〔実施例７〕 実施例１で得られたリポタ
ンパク質（ａ）に結合する抗体（１０４Ｄ１１株由来）
の「クリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タ
イプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリ
ングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」への
反応性の確認 実施例１で得られた「１０４Ｄ１１株」由来のリポタン
パク質（ａ）に結合する抗体の「クリングル４様ドメイ
ンのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ
９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又はプ
ロテアーゼ様ドメイン」に対する反応性をウエスタンブ
ロット法により確かめた。
ンパク質（ａ）に結合する抗体（１０４Ｄ１１株由来）
の「クリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タ
イプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリ
ングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」への
反応性の確認 実施例１で得られた「１０４Ｄ１１株」由来のリポタン
パク質（ａ）に結合する抗体の「クリングル４様ドメイ
ンのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ
９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメイン又はプ
ロテアーゼ様ドメイン」に対する反応性をウエスタンブ
ロット法により確かめた。
【０１０５】３種類の実施例１で得られたリポタンパク
質（ａ）に結合する抗体（「２０２Ａ９株」由来、「２
０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来）に代え
て、「１０４Ｄ１１株」由来の実施例１で得られたリポ
タンパク質（ａ）に結合する抗体を用いる他は、前記実
施例６に記載の方法と同様にして操作を行った。ウエス
タンブロット法の結果を図５に示した。図５において、
Ｐは対照、Ｎは陰性対照、１は「１０４Ｄ１１株」由来
の抗体を作用させたものである。
質（ａ）に結合する抗体（「２０２Ａ９株」由来、「２
０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来）に代え
て、「１０４Ｄ１１株」由来の実施例１で得られたリポ
タンパク質（ａ）に結合する抗体を用いる他は、前記実
施例６に記載の方法と同様にして操作を行った。ウエス
タンブロット法の結果を図５に示した。図５において、
Ｐは対照、Ｎは陰性対照、１は「１０４Ｄ１１株」由来
の抗体を作用させたものである。
【０１０６】図５における対照との比較より、「１０４
Ｄ１１株」由来の実施例１で得られたリポタンパク質
（ａ）に結合する抗体は、市販の抗リポタンパク質
（ａ）ポリクローナル抗体が発色を示す位置に発色を認
めることから、「クリングル４様ドメインのタイプ５、
タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイ
プ１０、クリングル５様ドメイン、プロテアーゼドメイ
ン、又はＬＤＬ」と結合することが確かめられた。
Ｄ１１株」由来の実施例１で得られたリポタンパク質
（ａ）に結合する抗体は、市販の抗リポタンパク質
（ａ）ポリクローナル抗体が発色を示す位置に発色を認
めることから、「クリングル４様ドメインのタイプ５、
タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイ
プ１０、クリングル５様ドメイン、プロテアーゼドメイ
ン、又はＬＤＬ」と結合することが確かめられた。
【０１０７】しかしながら、前記実施例２の検討結果よ
り、「１０４Ｄ１１株」由来のリポタンパク質（ａ）に
結合する抗体も、ＬＤＬには結合しないことが確認され
ているので、この「１０４Ｄ１１株」由来の抗体は、
「クリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイ
プ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリン
グル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」と結合
するものであることが分かった。更に、前記の実施例１
で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗体及び市
販の抗リポタンパク質（ａ）ポリクローナル抗体のいず
れも作用させていない陰性対照に発色が見られないこと
から、非特異的な発色が起きていないことが示された。
り、「１０４Ｄ１１株」由来のリポタンパク質（ａ）に
結合する抗体も、ＬＤＬには結合しないことが確認され
ているので、この「１０４Ｄ１１株」由来の抗体は、
「クリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイ
プ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリン
グル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」と結合
するものであることが分かった。更に、前記の実施例１
で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗体及び市
販の抗リポタンパク質（ａ）ポリクローナル抗体のいず
れも作用させていない陰性対照に発色が見られないこと
から、非特異的な発色が起きていないことが示された。
【０１０８】〔実施例８〕 実施例１で得られたリポタ
ンパク質（ａ）に結合する抗体３種類の「クリングル４
様ドメインのタイプ１、タイプ２、タイプ３及びタイプ
４」への反応性の確認 実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体のうち、３種類の抗体（「２０２Ａ９株」由来、「２
０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来）につい
て、「クリングル４様ドメインのタイプ１、タイプ２、
タイプ３及びタイプ４」に対する反応性をウエスタンブ
ロット法により確かめた。
ンパク質（ａ）に結合する抗体３種類の「クリングル４
様ドメインのタイプ１、タイプ２、タイプ３及びタイプ
４」への反応性の確認 実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体のうち、３種類の抗体（「２０２Ａ９株」由来、「２
０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来）につい
て、「クリングル４様ドメインのタイプ１、タイプ２、
タイプ３及びタイプ４」に対する反応性をウエスタンブ
ロット法により確かめた。
【０１０９】（１） 実施例５に記載の方法に従って調
製した「クリングル４様ドメインのタイプ１、タイプ
２、タイプ３及びタイプ４からなるフラグメント」を
０．５ｍｇ／ｍＬになるように生理食塩水に溶解した。 （２） 次に、この２μＬを試料としてタイタン・ジェ
ル・リポタンパク質電気泳動キット（ヘレナ研究所社
製）を用いて電気泳動を行った。なお、支持体はアガロ
ースゲルであり、泳動緩衝液はバルビタール緩衝液（ｐ
Ｈ８．８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して
行った。
製した「クリングル４様ドメインのタイプ１、タイプ
２、タイプ３及びタイプ４からなるフラグメント」を
０．５ｍｇ／ｍＬになるように生理食塩水に溶解した。 （２） 次に、この２μＬを試料としてタイタン・ジェ
ル・リポタンパク質電気泳動キット（ヘレナ研究所社
製）を用いて電気泳動を行った。なお、支持体はアガロ
ースゲルであり、泳動緩衝液はバルビタール緩衝液（ｐ
Ｈ８．８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して
行った。
【０１１０】以下の操作は、前記実施例２の（３）〜
（１２）に記載の方法と同様にして行った。但し、前記
実施例２の（７）の操作において、３種類の実施例１で
得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗体（「２０
２Ａ９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及び「２０３
Ｅ２株」由来）を、それぞれリン酸緩衝生理食塩水に溶
解して、３種類の溶液を調製した。また、前記実施例２
の（８）の操作において、対照として、ヤギ抗アポリポ
タンパク質Ｂ抗体の代わりにヤギ抗リポタンパク質
（ａ）ポリクローナル抗体（インターナショナルエンザ
イム社製）を用いて操作を行った。ウエスタンブロット
法の結果を図６に示した。図６において、Ｐは対照、Ｎ
は陰性対照、１は「２０２Ａ９株」由来の抗体を作用さ
せたもの、２は「２０３Ｅ２株」由来の抗体を作用させ
たもの、３は「２０２Ｆ８株」由来の抗体を作用させた
ものである。
（１２）に記載の方法と同様にして行った。但し、前記
実施例２の（７）の操作において、３種類の実施例１で
得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗体（「２０
２Ａ９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及び「２０３
Ｅ２株」由来）を、それぞれリン酸緩衝生理食塩水に溶
解して、３種類の溶液を調製した。また、前記実施例２
の（８）の操作において、対照として、ヤギ抗アポリポ
タンパク質Ｂ抗体の代わりにヤギ抗リポタンパク質
（ａ）ポリクローナル抗体（インターナショナルエンザ
イム社製）を用いて操作を行った。ウエスタンブロット
法の結果を図６に示した。図６において、Ｐは対照、Ｎ
は陰性対照、１は「２０２Ａ９株」由来の抗体を作用さ
せたもの、２は「２０３Ｅ２株」由来の抗体を作用させ
たもの、３は「２０２Ｆ８株」由来の抗体を作用させた
ものである。
【０１１１】図６における対照との比較より、「２０２
Ａ９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ
２株」由来の３種類の実施例１で得られたリポタンパク
質（ａ）に結合する抗体は、いずれも、市販の抗リポタ
ンパク質（ａ）ポリクローナル抗体が発色を示す位置に
は発色を認めないことから、「クリングル４様ドメイン
のタイプ１、タイプ２、タイプ３及びタイプ４」とは、
結合しないことが確かめられた。更に、前記の実施例１
で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗体及び市
販の抗リポタンパク質（ａ）ポリクローナル抗体のいず
れも作用させていない陰性対照に発色が見られないこと
から、非特異的な発色が起きていないことが示された。
Ａ９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ
２株」由来の３種類の実施例１で得られたリポタンパク
質（ａ）に結合する抗体は、いずれも、市販の抗リポタ
ンパク質（ａ）ポリクローナル抗体が発色を示す位置に
は発色を認めないことから、「クリングル４様ドメイン
のタイプ１、タイプ２、タイプ３及びタイプ４」とは、
結合しないことが確かめられた。更に、前記の実施例１
で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗体及び市
販の抗リポタンパク質（ａ）ポリクローナル抗体のいず
れも作用させていない陰性対照に発色が見られないこと
から、非特異的な発色が起きていないことが示された。
【０１１２】〔実施例９〕 実施例１で得られたリポタ
ンパク質（ａ）に結合する抗体（１０４Ｄ１１株由来）
の「クリングル４様ドメインのタイプ１、タイプ２、タ
イプ３及びタイプ４」への反応性の確認 実施例１で得られた「１０４Ｄ１１株」由来のリポタン
パク質（ａ）に結合する抗体の「クリングル４様ドメイ
ンのタイプ１、タイプ２、タイプ３及びタイプ４」に対
する反応性をウエスタンブロット法により確かめた。
ンパク質（ａ）に結合する抗体（１０４Ｄ１１株由来）
の「クリングル４様ドメインのタイプ１、タイプ２、タ
イプ３及びタイプ４」への反応性の確認 実施例１で得られた「１０４Ｄ１１株」由来のリポタン
パク質（ａ）に結合する抗体の「クリングル４様ドメイ
ンのタイプ１、タイプ２、タイプ３及びタイプ４」に対
する反応性をウエスタンブロット法により確かめた。
【０１１３】３種類の実施例１で得られたリポタンパク
質（ａ）に結合する抗体（「２０２Ａ９株」由来、「２
０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来）に代え
て、「１０４Ｄ１１株」由来の実施例１で得られたリポ
タンパク質（ａ）に結合する抗体を用いる他は、前記実
施例８に記載の方法と同様にして操作を行った。ウエス
タンブロット法の結果を図７に示した。図７において、
Ｐは対照、Ｎは陰性対照、１は「１０４Ｄ１１株」由来
の抗体を作用させたものである。
質（ａ）に結合する抗体（「２０２Ａ９株」由来、「２
０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来）に代え
て、「１０４Ｄ１１株」由来の実施例１で得られたリポ
タンパク質（ａ）に結合する抗体を用いる他は、前記実
施例８に記載の方法と同様にして操作を行った。ウエス
タンブロット法の結果を図７に示した。図７において、
Ｐは対照、Ｎは陰性対照、１は「１０４Ｄ１１株」由来
の抗体を作用させたものである。
【０１１４】図７における対照との比較より、「１０４
Ｄ１１株」由来の実施例１で得られたリポタンパク質
（ａ）に結合する抗体は、市販の抗リポタンパク質
（ａ）ポリクローナル抗体が発色を示す位置には発色を
認めないことから、「クリングル４様ドメインのタイプ
１、タイプ２、タイプ３及びタイプ４」とは、結合しな
いことが確かめられた。更に、前記の実施例１で得られ
たリポタンパク質（ａ）に結合する抗体及び市販の抗リ
ポタンパク質（ａ）ポリクローナル抗体のいずれも作用
させていない陰性対照に発色が見られないことから、非
特異的な発色が起きていないことが示された。
Ｄ１１株」由来の実施例１で得られたリポタンパク質
（ａ）に結合する抗体は、市販の抗リポタンパク質
（ａ）ポリクローナル抗体が発色を示す位置には発色を
認めないことから、「クリングル４様ドメインのタイプ
１、タイプ２、タイプ３及びタイプ４」とは、結合しな
いことが確かめられた。更に、前記の実施例１で得られ
たリポタンパク質（ａ）に結合する抗体及び市販の抗リ
ポタンパク質（ａ）ポリクローナル抗体のいずれも作用
させていない陰性対照に発色が見られないことから、非
特異的な発色が起きていないことが示された。
【０１１５】〔実施例１０〕 実施例１で得られたリポ
タンパク質（ａ）に結合する抗体（１０４Ｄ１１株由
来）の「クリングル５ドメイン又はプロテア−ゼドメイ
ン」への反応性の確認 実施例１で得られた「１０４Ｄ１１株」由来のリポタン
パク質（ａ）に結合する抗体の「クリングル５ドメイン
又はプロテアーゼドメイン」に対する反応性をウエスタ
ンブロット法により確かめた。
タンパク質（ａ）に結合する抗体（１０４Ｄ１１株由
来）の「クリングル５ドメイン又はプロテア−ゼドメイ
ン」への反応性の確認 実施例１で得られた「１０４Ｄ１１株」由来のリポタン
パク質（ａ）に結合する抗体の「クリングル５ドメイン
又はプロテアーゼドメイン」に対する反応性をウエスタ
ンブロット法により確かめた。
【０１１６】（１） 実施例４に記載の方法に従って調
製した「クリングル５ドメイン及びプロテアーゼドメイ
ンからなるフラグメント」を０．５ｍｇ／ｍＬになるよ
うに生理食塩水に溶解した。 （２） 次に、この２μＬを試料としてタイタン・ジェ
ル・リポタンパク質電気泳動キット（ヘレナ研究所社
製）を用いて電気泳動を行った。なお、支持体はアガロ
−スゲルであり、泳動緩衝液はバルビタール緩衝液（ｐ
Ｈ８．８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して
行った。
製した「クリングル５ドメイン及びプロテアーゼドメイ
ンからなるフラグメント」を０．５ｍｇ／ｍＬになるよ
うに生理食塩水に溶解した。 （２） 次に、この２μＬを試料としてタイタン・ジェ
ル・リポタンパク質電気泳動キット（ヘレナ研究所社
製）を用いて電気泳動を行った。なお、支持体はアガロ
−スゲルであり、泳動緩衝液はバルビタール緩衝液（ｐ
Ｈ８．８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して
行った。
【０１１７】以下の操作は、前記実施例２の（３）〜
（１２）に記載の方法と同様にして行った。但し、前記
実施例２の（７）の操作において、実施例１で得られた
リポタンパク質（ａ）に結合する抗体（「１０４Ｄ１１
株」由来）をリン酸緩衝生理食塩水に溶解して、１種類
の溶液を調製した。また、前記実施例２の（８）の操作
において、対照として、ヤギ抗アポリポタンパク質Ｂ抗
体の代わりに、ヒツジ抗プラスミノーゲンポリクローナ
ル抗体（ダコ社製）を用いて操作を行った。
（１２）に記載の方法と同様にして行った。但し、前記
実施例２の（７）の操作において、実施例１で得られた
リポタンパク質（ａ）に結合する抗体（「１０４Ｄ１１
株」由来）をリン酸緩衝生理食塩水に溶解して、１種類
の溶液を調製した。また、前記実施例２の（８）の操作
において、対照として、ヤギ抗アポリポタンパク質Ｂ抗
体の代わりに、ヒツジ抗プラスミノーゲンポリクローナ
ル抗体（ダコ社製）を用いて操作を行った。
【０１１８】更に、前記実施例２の（１０）の操作にお
いて、パーオキシダーゼ標識抗ヤギＩｇＧ抗体の代わり
に、パーオキシダーゼ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体（ダコ社
製）を用いて操作を行った。ウエスタンブロット法の結
果を図８に示した。図８において、Ｐは対照、Ｎは陰性
対照、１は実施例１で得られた「１０４Ｄ１１株」由来
のリポタンパク質（ａ）に対する抗体を作用させたもの
である。
いて、パーオキシダーゼ標識抗ヤギＩｇＧ抗体の代わり
に、パーオキシダーゼ標識抗ヒツジＩｇＧ抗体（ダコ社
製）を用いて操作を行った。ウエスタンブロット法の結
果を図８に示した。図８において、Ｐは対照、Ｎは陰性
対照、１は実施例１で得られた「１０４Ｄ１１株」由来
のリポタンパク質（ａ）に対する抗体を作用させたもの
である。
【０１１９】図８における対照との比較より、実施例１
で得られた「１０４Ｄ１１株」由来のリポタンパク質
（ａ）に対する抗体は、市販の抗プラスミノーゲンポリ
クローナル抗体が発色を示す位置に発色を認めることか
ら、「クリングル５ドメイン又はプロテアーゼドメイ
ン」と結合することが確かめられた。更に、前記の実施
例１で得られた抗体及び市販の抗プラスミノーゲンポリ
クローナル抗体のいずれも作用させていない陰性対照に
発色が見られないことから、非特異的な発色が起きてい
ないことが示された。以上の実施例２、実施例３、実施
例６、実施例７、実施例８、実施例９及び実施例１０の
検討結果をまとめると下記のようになる。
で得られた「１０４Ｄ１１株」由来のリポタンパク質
（ａ）に対する抗体は、市販の抗プラスミノーゲンポリ
クローナル抗体が発色を示す位置に発色を認めることか
ら、「クリングル５ドメイン又はプロテアーゼドメイ
ン」と結合することが確かめられた。更に、前記の実施
例１で得られた抗体及び市販の抗プラスミノーゲンポリ
クローナル抗体のいずれも作用させていない陰性対照に
発色が見られないことから、非特異的な発色が起きてい
ないことが示された。以上の実施例２、実施例３、実施
例６、実施例７、実施例８、実施例９及び実施例１０の
検討結果をまとめると下記のようになる。
【０１２０】 「２０２Ａ９株」由来、「２０２Ｆ８
株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来の３種類の実施例
１で得られた抗体は、「アポリポタンパク質（ａ）のク
リングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ
７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリング
ル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」と結合す
るものの、「ＬＤＬ」、「プラスミノーゲン」、そして
「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ１、タイプ２、タイプ３及びタイプ４」とは結
合しない。
株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来の３種類の実施例
１で得られた抗体は、「アポリポタンパク質（ａ）のク
リングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ
７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリング
ル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」と結合す
るものの、「ＬＤＬ」、「プラスミノーゲン」、そして
「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ１、タイプ２、タイプ３及びタイプ４」とは結
合しない。
【０１２１】 「１０４Ｄ１１株」由来の実施例１で
得られた抗体は、「アポリポタンパク質（ａ）のクリン
グル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タ
イプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様
ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」、「プラスミノ
ーゲンのクリングル５ドメイン又はプロテアーゼドメイ
ン」、そして「プラスミノーゲン」と結合するものの、
「ＬＤＬ」、そして「アポリポタンパク質（ａ）のクリ
ングル４様ドメインのタイプ１、タイプ２、タイプ３及
びタイプ４」とは結合しない。
得られた抗体は、「アポリポタンパク質（ａ）のクリン
グル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タ
イプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様
ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」、「プラスミノ
ーゲンのクリングル５ドメイン又はプロテアーゼドメイ
ン」、そして「プラスミノーゲン」と結合するものの、
「ＬＤＬ」、そして「アポリポタンパク質（ａ）のクリ
ングル４様ドメインのタイプ１、タイプ２、タイプ３及
びタイプ４」とは結合しない。
【０１２２】つまり、実施例１で得られたリポタンパク
質（ａ）に結合する抗体は、４種類いずれも、「アポリ
ポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ
５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくは
タイプ１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ
様ドメイン」に、特異的に結合し、かつ「クリングル４
様ドメインのタイプ２」には結合しない抗体であること
が確かめられた。
質（ａ）に結合する抗体は、４種類いずれも、「アポリ
ポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ
５、タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくは
タイプ１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ
様ドメイン」に、特異的に結合し、かつ「クリングル４
様ドメインのタイプ２」には結合しない抗体であること
が確かめられた。
【０１２３】なお、「２０２Ａ９株」由来、「２０２Ｆ
８株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来の３種類の実施
例１で得られた抗体は、「アポリポタンパク質（ａ）の
クリングル５様ドメイン及びプロテアーゼ様ドメイン」
と非常に相同性の高い箇所を持つ「プラスミノーゲン」
には結合しないものの、「アポリポタンパク質（ａ）の
クリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ
７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリング
ル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」には結合
することから、「アポリポタンパク質（ａ）のクリング
ル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイ
プ８、タイプ９もしくはタイプ１０」の箇所に結合する
ものと推察される。
８株」由来、及び「２０３Ｅ２株」由来の３種類の実施
例１で得られた抗体は、「アポリポタンパク質（ａ）の
クリングル５様ドメイン及びプロテアーゼ様ドメイン」
と非常に相同性の高い箇所を持つ「プラスミノーゲン」
には結合しないものの、「アポリポタンパク質（ａ）の
クリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ
７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリング
ル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」には結合
することから、「アポリポタンパク質（ａ）のクリング
ル４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイ
プ８、タイプ９もしくはタイプ１０」の箇所に結合する
ものと推察される。
【０１２４】〔実施例１１〕 単一のリポタンパク質
（ａ）のフェノタイプからなる血清試料の選択、及びフ
ェノタイプの種類の決定 単一のリポタンパク質（ａ）のフェノタイプからなる血
清試料を選択し、選択した血清試料のフェノタイプの種
類を決定した。 （１） １．５％のアガロースゲル〔９０ｍＭホウ酸、
２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、１．５％アガロ−
ス及び９０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンを含む；２０×２５ｃｍ〕、電気泳動緩衝液〔４５ｍ
Ｍホウ酸、２ｍＭＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳを含む４
５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
液〕、及び還元緩衝液（β−メルカプトエタノールと、
０．５％ＢＰＢと、５％グリセリン及び５％ＳＤＳと
を、各々１：２：１０で混合したもの）を調製し、Ｓｕ
ｐｅｒｓｕｂ ＨＥ１００システム（ファルマシア・バ
イオテック社製）を用いて、約１５０検体の血清試料に
ついてサブマリン電気泳動を行った。
（ａ）のフェノタイプからなる血清試料の選択、及びフ
ェノタイプの種類の決定 単一のリポタンパク質（ａ）のフェノタイプからなる血
清試料を選択し、選択した血清試料のフェノタイプの種
類を決定した。 （１） １．５％のアガロースゲル〔９０ｍＭホウ酸、
２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、１．５％アガロ−
ス及び９０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンを含む；２０×２５ｃｍ〕、電気泳動緩衝液〔４５ｍ
Ｍホウ酸、２ｍＭＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳを含む４
５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
液〕、及び還元緩衝液（β−メルカプトエタノールと、
０．５％ＢＰＢと、５％グリセリン及び５％ＳＤＳと
を、各々１：２：１０で混合したもの）を調製し、Ｓｕ
ｐｅｒｓｕｂ ＨＥ１００システム（ファルマシア・バ
イオテック社製）を用いて、約１５０検体の血清試料に
ついてサブマリン電気泳動を行った。
【０１２５】（２） 各々の血清試料３０μＬと還元緩
衝液６０μＬとをそれぞれ混合し、これを１００℃で１
分間インキュベートし還元処理を行った。これらの還元
処理した試料２５〜３０μＬをそれぞれ前記のアガロー
スゲルにアプライし、４℃の冷蔵庫中、１０Ｗで通電
し、１７時間電気泳動を行った。
衝液６０μＬとをそれぞれ混合し、これを１００℃で１
分間インキュベートし還元処理を行った。これらの還元
処理した試料２５〜３０μＬをそれぞれ前記のアガロー
スゲルにアプライし、４℃の冷蔵庫中、１０Ｗで通電
し、１７時間電気泳動を行った。
【０１２６】（３） 次に、これらのウエスタンブロッ
トを行った。まず、転写緩衝液〔３９ｍＭグリシン、
０．０３７５％ＳＤＳ及び２０％エタノールを含む４８
ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
液〕、ブロッキング剤（０．１％ＢＳＡを含む０．１Ｍ
リン酸緩衝液）、洗浄液〔０．５Ｍ塩化ナトリウム及び
０．０５％ツイーン（Tween20 ）を含む２０ｍＭトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〕及びＰＯＤ
発色液（０．５Ｍ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ％ジアミ
ノベンジジン及び０．００３％過酸化水素を含む２０ｍ
Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液）を
調製した。
トを行った。まず、転写緩衝液〔３９ｍＭグリシン、
０．０３７５％ＳＤＳ及び２０％エタノールを含む４８
ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
液〕、ブロッキング剤（０．１％ＢＳＡを含む０．１Ｍ
リン酸緩衝液）、洗浄液〔０．５Ｍ塩化ナトリウム及び
０．０５％ツイーン（Tween20 ）を含む２０ｍＭトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〕及びＰＯＤ
発色液（０．５Ｍ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ％ジアミ
ノベンジジン及び０．００３％過酸化水素を含む２０ｍ
Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液）を
調製した。
【０１２７】（４） 転写は、ノバ・ブロットトランス
ファーユニットシステム（ノバ社製）を使用し、タンパ
ク質の前記の電気泳動を行ったゲルからニトロセルロー
ス膜（バイオラッド社製）への転写を４００ｍＡで３時
間かけて行った。 （５） 転写後、これらのニトロセルロース膜をブロッ
キング剤に浸し、４℃で一晩放置しブロッキングを行っ
た。十分に洗浄剤で洗浄した後、ブロッキングしたニト
ロセルロース膜を、ヤギ抗リポタンパク質（ａ）ポリク
ローナル抗体（インターナショナルエンザイム社製）４
００μｇを前記ブロッキング剤４０ｍＬに溶解して調製
した液に浸し、３７℃で６時間反応させた。 （６） 再び洗浄剤で洗浄した後、ブロッキング剤で
２，０００倍希釈したＰＯＤ標識抗ヤギイムノグロブリ
ン抗体（ダコ社製）に浸して反応させた。
ファーユニットシステム（ノバ社製）を使用し、タンパ
ク質の前記の電気泳動を行ったゲルからニトロセルロー
ス膜（バイオラッド社製）への転写を４００ｍＡで３時
間かけて行った。 （５） 転写後、これらのニトロセルロース膜をブロッ
キング剤に浸し、４℃で一晩放置しブロッキングを行っ
た。十分に洗浄剤で洗浄した後、ブロッキングしたニト
ロセルロース膜を、ヤギ抗リポタンパク質（ａ）ポリク
ローナル抗体（インターナショナルエンザイム社製）４
００μｇを前記ブロッキング剤４０ｍＬに溶解して調製
した液に浸し、３７℃で６時間反応させた。 （６） 再び洗浄剤で洗浄した後、ブロッキング剤で
２，０００倍希釈したＰＯＤ標識抗ヤギイムノグロブリ
ン抗体（ダコ社製）に浸して反応させた。
【０１２８】（７） 最後にもう一度洗浄剤で十分に洗
浄した後、発色剤に浸して発色させた。 （８） これらの血清試料のバンドを５種類のリポタン
パク質（ａ）のフェノタイプよりなる標準血清（イムノ
社製）の各々のバンドの泳動位置と比較した。そして、
単一なリポタンパク質（ａ）のフェノタイプからなる５
種類の血清試料（血清試料１、血清試料２、血清試料
３、血清試料４及び血清試料５）を選択し、フェノタイ
プの種類を決定した。この結果を表１に示した。なお、
この表において、アポリポタンパク質（ａ）のクリング
ル４様ドメイン中のクリングルの数で、リポタンパク質
（ａ）のフェノタイプの種類を表した。
浄した後、発色剤に浸して発色させた。 （８） これらの血清試料のバンドを５種類のリポタン
パク質（ａ）のフェノタイプよりなる標準血清（イムノ
社製）の各々のバンドの泳動位置と比較した。そして、
単一なリポタンパク質（ａ）のフェノタイプからなる５
種類の血清試料（血清試料１、血清試料２、血清試料
３、血清試料４及び血清試料５）を選択し、フェノタイ
プの種類を決定した。この結果を表１に示した。なお、
この表において、アポリポタンパク質（ａ）のクリング
ル４様ドメイン中のクリングルの数で、リポタンパク質
（ａ）のフェノタイプの種類を表した。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】〔実施例１２〕 標準物質の調製及び設定 （１） 標準物質の設定は、実施例１１で選択した単一
なフェノタイプからなる血清試料（血清試料５；クリン
グル４様ドメイン中のクリングルの数が２７であるフェ
ノタイプのみよりなる）よりリポタンパク質（ａ）を精
製して、その全体量（脂質量、及びアミノ酸分析より求
めたタンパク質量）を決定することにより行った。な
お、血清試料のリポタンパク質（ａ）の精製は、実施例
１の〔１〕に記載した方法に従って行った。
なフェノタイプからなる血清試料（血清試料５；クリン
グル４様ドメイン中のクリングルの数が２７であるフェ
ノタイプのみよりなる）よりリポタンパク質（ａ）を精
製して、その全体量（脂質量、及びアミノ酸分析より求
めたタンパク質量）を決定することにより行った。な
お、血清試料のリポタンパク質（ａ）の精製は、実施例
１の〔１〕に記載した方法に従って行った。
【０１３１】（２） このように精製したリポタンパク
質（ａ）を１．０ｍｇ／ｍＬになるように生理食塩水に
溶解し、この１０μＬを試料として電気泳動を行った。
なお、支持体は３〜１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ルで、泳動緩衝液は０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−０．１９Ｍグリ
シン緩衝液を使用して、電流２０ｍＡで１２０分間通電
して行った。その後、クマシーブリリアントブルーより
なる染色液に６０分間浸した後、泳動後のバンドの確認
を行った。結果は、リポタンパク質（ａ）のバンドだけ
が認められ、他のバンドは認められなかった。
質（ａ）を１．０ｍｇ／ｍＬになるように生理食塩水に
溶解し、この１０μＬを試料として電気泳動を行った。
なお、支持体は３〜１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ルで、泳動緩衝液は０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−０．１９Ｍグリ
シン緩衝液を使用して、電流２０ｍＡで１２０分間通電
して行った。その後、クマシーブリリアントブルーより
なる染色液に６０分間浸した後、泳動後のバンドの確認
を行った。結果は、リポタンパク質（ａ）のバンドだけ
が認められ、他のバンドは認められなかった。
【０１３２】（３） この精製したリポタンパク質
（ａ）の脂質類（リン脂質、総コレステロール及び中性
脂肪）の測定を市販の測定試薬（リン脂質：「クイック
オートネオＰＬ」、総コレステロール：「クイックオー
トネオＴ−ＣＨＯII」、中性脂肪：「クイックオートネ
オＴＧII」；いずれもシノテスト社製）を使用して行っ
た。総脂質含量は、７５．５ｍｇ／ｄＬであった。 （４） また、タンパク質量をアミノ酸分析機（Ｌ−８
５００；日立製作所社製）により求めた。タンパク質量
は２５．７ｍｇ／ｄＬであった。 （５） この標品をリポタンパク質（ａ）の一次標準物
質とした。
（ａ）の脂質類（リン脂質、総コレステロール及び中性
脂肪）の測定を市販の測定試薬（リン脂質：「クイック
オートネオＰＬ」、総コレステロール：「クイックオー
トネオＴ−ＣＨＯII」、中性脂肪：「クイックオートネ
オＴＧII」；いずれもシノテスト社製）を使用して行っ
た。総脂質含量は、７５．５ｍｇ／ｄＬであった。 （４） また、タンパク質量をアミノ酸分析機（Ｌ−８
５００；日立製作所社製）により求めた。タンパク質量
は２５．７ｍｇ／ｄＬであった。 （５） この標品をリポタンパク質（ａ）の一次標準物
質とした。
【０１３３】〔実施例１３〕 サンドイッチ・ＥＬＩＳ
Ａ法によるリポタンパク質（ａ）測定方法（測定試薬）
の構築と検量線の作成 実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体を用いるＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）によるリポ
タンパク質（ａ）測定方法（測定試薬）を構築した。ま
た、検量線を作成した。
Ａ法によるリポタンパク質（ａ）測定方法（測定試薬）
の構築と検量線の作成 実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体を用いるＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）によるリポ
タンパク質（ａ）測定方法（測定試薬）を構築した。ま
た、検量線を作成した。
【０１３４】（１） 実施例１で得られた「アポリポタ
ンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、
タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイ
プ１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ド
メインに特異的に結合し、かつアポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２には結合し
ない抗体」（２０３Ｅ２株由来）をリン酸緩衝生理食塩
水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍ
Ｍリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、
２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．２））により１５
μｇ／ｍＬとした後、９６ウエル−マイクロプレート
（ヌンク社製）に１ウエル当たり１００μＬずつ加え、
３７℃で２時間静置して、前記の抗体の固相化を行った
（固相化抗体）。
ンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、
タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイ
プ１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ド
メインに特異的に結合し、かつアポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２には結合し
ない抗体」（２０３Ｅ２株由来）をリン酸緩衝生理食塩
水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍ
Ｍリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、
２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．２））により１５
μｇ／ｍＬとした後、９６ウエル−マイクロプレート
（ヌンク社製）に１ウエル当たり１００μＬずつ加え、
３７℃で２時間静置して、前記の抗体の固相化を行った
（固相化抗体）。
【０１３５】（２） このマイクロプレートを洗浄液
〔０．０５％ツイーン（Tween20 ）を含むリン酸緩衝生
理食塩水（ｐＨ７．２）〕で洗浄した後、１％ＢＳＡを
含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウエル当たり３００μＬ
ずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行
い、その後再び洗浄液で洗浄した。
〔０．０５％ツイーン（Tween20 ）を含むリン酸緩衝生
理食塩水（ｐＨ７．２）〕で洗浄した後、１％ＢＳＡを
含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウエル当たり３００μＬ
ずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行
い、その後再び洗浄液で洗浄した。
【０１３６】（３） 実施例１２で調製したリポタンパ
ク質（ａ）の標品（一次標準物質）をリポタンパク質
（ａ）を含まない血清で希釈して、リポタンパク質
（ａ）濃度が１８．６ｍｇ／ｄＬ、３５．１ｍｇ／ｄ
Ｌ、４８．４ｍｇ／ｄＬ、７１．０ｍｇ／ｄＬ及び９
８．５ｍｇ／ｄＬの５種類の試料を調製した。なお、リ
ポタンパク質（ａ）を含まない血清をリポタンパク質
（ａ）濃度０ｍｇ／ｄＬの試料とした。 （４） 前記（３）で調製した６種類の試料を生理食塩
水で１，０００倍希釈した後、前記（２）で調製したマ
イクロプレートに１ウエル当たり１００μＬずつ分注
し、３７℃で２時間静置して抗原抗体反応を行わせた。
その後、これを洗浄液で洗浄した。
ク質（ａ）の標品（一次標準物質）をリポタンパク質
（ａ）を含まない血清で希釈して、リポタンパク質
（ａ）濃度が１８．６ｍｇ／ｄＬ、３５．１ｍｇ／ｄ
Ｌ、４８．４ｍｇ／ｄＬ、７１．０ｍｇ／ｄＬ及び９
８．５ｍｇ／ｄＬの５種類の試料を調製した。なお、リ
ポタンパク質（ａ）を含まない血清をリポタンパク質
（ａ）濃度０ｍｇ／ｄＬの試料とした。 （４） 前記（３）で調製した６種類の試料を生理食塩
水で１，０００倍希釈した後、前記（２）で調製したマ
イクロプレートに１ウエル当たり１００μＬずつ分注
し、３７℃で２時間静置して抗原抗体反応を行わせた。
その後、これを洗浄液で洗浄した。
【０１３７】（５） 実施例１で得られた「アポリポタ
ンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、
タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイ
プ１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ド
メインに特異的に結合し、かつアポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２には結合し
ない抗体」（２０２Ａ９株由来）５ｍｇを０．５ｍＬの
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。こ
れに０．６ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水
物を溶解した０．０１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミドを加え、室温で３０分間インキュベートした。
ンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、
タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイ
プ１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ド
メインに特異的に結合し、かつアポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２には結合し
ない抗体」（２０２Ａ９株由来）５ｍｇを０．５ｍＬの
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。こ
れに０．６ｍｇのＳ−アセチルメルカプトコハク酸無水
物を溶解した０．０１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミドを加え、室温で３０分間インキュベートした。
【０１３８】次にこれに、０．１Ｍ ＥＤＴＡ０．０２
ｍＬ、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩
衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍＬ及び１Ｍヒドロキシルア
ミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍＬを加え、３０
℃で３０分間インキュベートした。これを、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．０）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カ
ラムでゲルろ過を行い、メルカプト・サクシニル化抗体
を得た。
ｍＬ、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩
衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍＬ及び１Ｍヒドロキシルア
ミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍＬを加え、３０
℃で３０分間インキュベートした。これを、５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
６．０）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カ
ラムでゲルろ過を行い、メルカプト・サクシニル化抗体
を得た。
【０１３９】（６） ２ｍｇのパーオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）を０．３ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶解した。これに、０．２５ｍｇのＮ
−サクシミジル−６−マレイミドヘキサン酸を溶解した
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３０μＬを加えて、３０
℃で６０分間インキュベートした。これを、０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておい
たセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、マ
レイミド化パーオキシダーゼを得た。
Ｄ）を０．３ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）に溶解した。これに、０．２５ｍｇのＮ
−サクシミジル−６−マレイミドヘキサン酸を溶解した
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３０μＬを加えて、３０
℃で６０分間インキュベートした。これを、０．１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておい
たセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行い、マ
レイミド化パーオキシダーゼを得た。
【０１４０】（７） 前記（５）で調製したメルカプト
・サクシニル化抗体２．３ｍｇを５ｍＭ ＥＤＴＡを含
む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．
２５ｍＬに溶解した。これに、前記（６）で調製したマ
レイミド化パーオキシダーゼ１．８ｍｇを０．２５ｍＬ
の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶
解したものを添加した。これを３０℃で２０時間インキ
ュベートした後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）で平衡化しておいたウルトラゲルＡｃＡ３４
カラムでゲルろ過を行い、実施例１で得られた抗体（２
０２Ａ９株由来）をパーオキシダーゼで標識したＰＯＤ
標識抗体（２０２Ａ９株由来）を得た。
・サクシニル化抗体２．３ｍｇを５ｍＭ ＥＤＴＡを含
む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．
２５ｍＬに溶解した。これに、前記（６）で調製したマ
レイミド化パーオキシダーゼ１．８ｍｇを０．２５ｍＬ
の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶
解したものを添加した。これを３０℃で２０時間インキ
ュベートした後、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）で平衡化しておいたウルトラゲルＡｃＡ３４
カラムでゲルろ過を行い、実施例１で得られた抗体（２
０２Ａ９株由来）をパーオキシダーゼで標識したＰＯＤ
標識抗体（２０２Ａ９株由来）を得た。
【０１４１】（８） 前記（７）で得たＰＯＤ標識抗体
（２０２Ａ９株由来）を１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生
理食塩水に溶解した。これを１ウエル当たり１００μＬ
ずつ前記（４）のマイクロプレートの各ウエルに分注
し、３７℃で２時間静置して反応を行わせた。その後、
これを洗浄液で洗浄した。 （９） これを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ
反応液〔３ｍＭ ３，３’，５，５’−テトラメチルベ
ンジジン（ＴＭＢＺ）を含む５０ｍＭリン酸水素二ナト
リウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液１ｍＬに対して２μＬ
の１．７％過酸化水素を使用直前に添加したもの〕を１
ウエル当たり１００μＬずつ加え、室温で反応させた。
１５分後に１ウエル当たり１００μＬの６Ｎ硫酸を加え
て反応を停止させた。これをＥＩＡマイクロプレートリ
ーダー（バイオラッド社製）にて、４５０ｎｍにおける
吸光度の測定を行った。
（２０２Ａ９株由来）を１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生
理食塩水に溶解した。これを１ウエル当たり１００μＬ
ずつ前記（４）のマイクロプレートの各ウエルに分注
し、３７℃で２時間静置して反応を行わせた。その後、
これを洗浄液で洗浄した。 （９） これを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ
反応液〔３ｍＭ ３，３’，５，５’−テトラメチルベ
ンジジン（ＴＭＢＺ）を含む５０ｍＭリン酸水素二ナト
リウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液１ｍＬに対して２μＬ
の１．７％過酸化水素を使用直前に添加したもの〕を１
ウエル当たり１００μＬずつ加え、室温で反応させた。
１５分後に１ウエル当たり１００μＬの６Ｎ硫酸を加え
て反応を停止させた。これをＥＩＡマイクロプレートリ
ーダー（バイオラッド社製）にて、４５０ｎｍにおける
吸光度の測定を行った。
【０１４２】この結果を図９に示した。なお、このサン
ドイッチ・ＥＬＩＳＡ法によるリポタンパク質（ａ）測
定方法（測定試薬）での検量線を示す図において、横軸
はリポタンパク質（ａ）の濃度、縦軸は４５０ｎｍにお
ける吸光度の測定値を表す。但し、吸光度の測定値は、
リポタンパク質（ａ）濃度が０ｍｇ／ｄＬの試料の吸光
度を盲検値として差し引いたものを表した。この図よ
り、本発明はＥＬＩＳＡ法において、試料中のリポタン
パク質（ａ）の定量が行えることが確認できた。 〔実施例１４〕 本発明の測定方法（測定試薬）〔ＥＬ
ＩＳＡ法〕及び従来の測定試薬におけるフェノタイプの
種類による測定値の変動の確認 実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体を下記のように組み合わせ、実施例１３に記載した方
法（ＥＬＩＳＡ法；サンドイッチ法）に従って、実施例
１１で得た単一なリポタンパク質（ａ）のフェノタイプ
からなる５種類の血清試料（血清試料１〜血清試料５）
を試料として測定を行った。なお、ＰＯＤ標識抗体
（「１０４Ｄ１１株」由来）は、前記実施例１で得られ
たリポタンパク質（ａ）に結合する抗体（「１０４Ｄ１
１株」由来）を、前記実施例１３の（５）〜（７）に記
載の方法に従って処理し、調製した。
ドイッチ・ＥＬＩＳＡ法によるリポタンパク質（ａ）測
定方法（測定試薬）での検量線を示す図において、横軸
はリポタンパク質（ａ）の濃度、縦軸は４５０ｎｍにお
ける吸光度の測定値を表す。但し、吸光度の測定値は、
リポタンパク質（ａ）濃度が０ｍｇ／ｄＬの試料の吸光
度を盲検値として差し引いたものを表した。この図よ
り、本発明はＥＬＩＳＡ法において、試料中のリポタン
パク質（ａ）の定量が行えることが確認できた。 〔実施例１４〕 本発明の測定方法（測定試薬）〔ＥＬ
ＩＳＡ法〕及び従来の測定試薬におけるフェノタイプの
種類による測定値の変動の確認 実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体を下記のように組み合わせ、実施例１３に記載した方
法（ＥＬＩＳＡ法；サンドイッチ法）に従って、実施例
１１で得た単一なリポタンパク質（ａ）のフェノタイプ
からなる５種類の血清試料（血清試料１〜血清試料５）
を試料として測定を行った。なお、ＰＯＤ標識抗体
（「１０４Ｄ１１株」由来）は、前記実施例１で得られ
たリポタンパク質（ａ）に結合する抗体（「１０４Ｄ１
１株」由来）を、前記実施例１３の（５）〜（７）に記
載の方法に従って処理し、調製した。
【０１４３】 本発明１ 固相化抗体： 「２０３Ｅ２株」由来の抗体 ＰＯＤ標識抗体： 「２０２Ａ９株」由来の抗体 本発明２ 固相化抗体： 「２０３Ｅ２株」由来の抗体 ＰＯＤ標識抗体： 「１０４Ｄ１１株」由来の抗体
【０１４４】また、比較のため、市販されている従来の
リポタンパク質（ａ）測定試薬（サンドイッチ・ＥＬＩ
ＳＡ法；Ａ社製）でも同一の試料を測定した。試料中の
リポタンパク質（ａ）濃度は、測定により得られた吸光
度の測定値を、前記実施例１３で得た検量線にあてはめ
て求めた。この結果を表２に示した。
リポタンパク質（ａ）測定試薬（サンドイッチ・ＥＬＩ
ＳＡ法；Ａ社製）でも同一の試料を測定した。試料中の
リポタンパク質（ａ）濃度は、測定により得られた吸光
度の測定値を、前記実施例１３で得た検量線にあてはめ
て求めた。この結果を表２に示した。
【０１４５】
【表２】
【０１４６】この表において、前記本発明１における測
定値（Ｖ１）、前記本発明２における測定値（Ｖ２）、
従来のリポタンパク質（ａ）測定試薬における測定値
（Ｖ０）、そしてこれらの測定値の比であるＶ１／Ｖ２
及びＶ０／Ｖ１を示した。本発明における測定値である
Ｖ１とＶ２は、血清試料１〜血清試料５のいずれにおい
てもほとんど同じ値が得られているのに対して、従来の
測定試薬における測定値Ｖ０は、血清試料１以外では異
なってしまっている。また、本発明における測定値同士
の比であるＶ１／Ｖ２は、リポタンパク質（ａ）のフェ
ノタイプの種類がそれぞれ異なる血清試料１〜血清試料
５のいずれにおいてもほぼ１となっている。
定値（Ｖ１）、前記本発明２における測定値（Ｖ２）、
従来のリポタンパク質（ａ）測定試薬における測定値
（Ｖ０）、そしてこれらの測定値の比であるＶ１／Ｖ２
及びＶ０／Ｖ１を示した。本発明における測定値である
Ｖ１とＶ２は、血清試料１〜血清試料５のいずれにおい
てもほとんど同じ値が得られているのに対して、従来の
測定試薬における測定値Ｖ０は、血清試料１以外では異
なってしまっている。また、本発明における測定値同士
の比であるＶ１／Ｖ２は、リポタンパク質（ａ）のフェ
ノタイプの種類がそれぞれ異なる血清試料１〜血清試料
５のいずれにおいてもほぼ１となっている。
【０１４７】これより本発明の測定方法（測定試薬）
は、いずれのフェノタイプのリポタンパク質（ａ）で
も、リポタンパク質（ａ）１分子を正しく１分子として
捉えることができ、フェノタイプの種類（クリングル４
様ドメイン中のクリングルの数）により測定値が変動す
ることがない方法（試薬）であることが分かる。これに
対して、従来の測定試薬における測定値Ｖ０と本発明に
おける測定値Ｖ１の比であるＶ０／Ｖ１は、血清試料１
においては１であるものの、試料中のリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメイン中のクリングルの数が
増えるにつれて増加してゆく。
は、いずれのフェノタイプのリポタンパク質（ａ）で
も、リポタンパク質（ａ）１分子を正しく１分子として
捉えることができ、フェノタイプの種類（クリングル４
様ドメイン中のクリングルの数）により測定値が変動す
ることがない方法（試薬）であることが分かる。これに
対して、従来の測定試薬における測定値Ｖ０と本発明に
おける測定値Ｖ１の比であるＶ０／Ｖ１は、血清試料１
においては１であるものの、試料中のリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメイン中のクリングルの数が
増えるにつれて増加してゆく。
【０１４８】これより従来の測定試薬（測定方法）で
は、試料中のリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ド
メイン中のクリングルの数が増えるにつれて、得られる
シグナルも増加してしまい、リポタンパク質（ａ）１分
子を正しく１分子として捉えることができず、測定値に
誤差が生じてしまうことが分かる。以上のことより、本
発明のリポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法（免疫
学的測定試薬）は、従来の測定方法（測定試薬）のよう
に、試料中のリポタンパク質（ａ）のフェノタイプの種
類により測定値が変動し、誤差が生じてしまうようなこ
とがなく、正確なリポタンパク質（ａ）の測定値が得ら
れる方法（試薬）であることが確かめられた。
は、試料中のリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ド
メイン中のクリングルの数が増えるにつれて、得られる
シグナルも増加してしまい、リポタンパク質（ａ）１分
子を正しく１分子として捉えることができず、測定値に
誤差が生じてしまうことが分かる。以上のことより、本
発明のリポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法（免疫
学的測定試薬）は、従来の測定方法（測定試薬）のよう
に、試料中のリポタンパク質（ａ）のフェノタイプの種
類により測定値が変動し、誤差が生じてしまうようなこ
とがなく、正確なリポタンパク質（ａ）の測定値が得ら
れる方法（試薬）であることが確かめられた。
【０１４９】〔実施例１５〕 ラテックス比濁法による
リポタンパク質（ａ）測定方法（測定試薬）の構築と検
量線の作成 実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体を用いるラテックス比濁法によるリポタンパク質
（ａ）測定方法（測定試薬）を構築した。また、検量線
を作成した。
リポタンパク質（ａ）測定方法（測定試薬）の構築と検
量線の作成 実施例１で得られたリポタンパク質（ａ）に結合する抗
体を用いるラテックス比濁法によるリポタンパク質
（ａ）測定方法（測定試薬）を構築した。また、検量線
を作成した。
【０１５０】（１） 実施例１で得られた「アポリポタ
ンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、
タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイ
プ１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ド
メインに特異的に結合し、かつアポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２には結合し
ない抗体」（２０２Ａ９株由来）６００μｇと、１０％
ラテックス粒子懸濁液（粒径０．１２μｍ；日本ペイン
ト社製）１００μＬと、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ
８．４）１ｍＬを混合し、振とうしながら、３７℃で２
時間反応させた。
ンパク質（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、
タイプ６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイ
プ１０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ド
メインに特異的に結合し、かつアポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ２には結合し
ない抗体」（２０２Ａ９株由来）６００μｇと、１０％
ラテックス粒子懸濁液（粒径０．１２μｍ；日本ペイン
ト社製）１００μＬと、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ
８．４）１ｍＬを混合し、振とうしながら、３７℃で２
時間反応させた。
【０１５１】（２） その後、これに１％ＢＳＡ及び
０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍグリシン緩衝
液（ｐＨ８．４）１ｍＬを添加し、振とうしながら、３
７℃で１時間反応させた。そして、これを１６，０００
ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、上清を取り除いた。 （３） 次に、これに０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．４）の１ｍＬを添加
し、１６，０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離を行い、上清
を取り除いて洗浄を行った。この洗浄操作を更に２回繰
り返した。
０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍグリシン緩衝
液（ｐＨ８．４）１ｍＬを添加し、振とうしながら、３
７℃で１時間反応させた。そして、これを１６，０００
ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離し、上清を取り除いた。 （３） 次に、これに０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む
０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．４）の１ｍＬを添加
し、１６，０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離を行い、上清
を取り除いて洗浄を行った。この洗浄操作を更に２回繰
り返した。
【０１５２】（４） その後、これを０．０１％アジ化
ナトリウム及び０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．４）０．５ｍＬに再分散さ
せた。これをラテックス試薬Ａとした。 （５） 実施例１で得られた「アポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ
６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１
０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイ
ンに特異的に結合し、かつアポリポタンパク質（ａ）の
クリングル４様ドメインのタイプ２には結合しない抗
体」（２０３Ｅ２株由来）６００μｇを用い、前記
（１）〜（４）に記載の方法に従って、ラテックス試薬
Ｂを調製した。
ナトリウム及び０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．４）０．５ｍＬに再分散さ
せた。これをラテックス試薬Ａとした。 （５） 実施例１で得られた「アポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ
６、タイプ７、タイプ８、タイプ９もしくはタイプ１
０、クリングル５様ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイ
ンに特異的に結合し、かつアポリポタンパク質（ａ）の
クリングル４様ドメインのタイプ２には結合しない抗
体」（２０３Ｅ２株由来）６００μｇを用い、前記
（１）〜（４）に記載の方法に従って、ラテックス試薬
Ｂを調製した。
【０１５３】（６） 前記（４）のラテックス試薬Ａと
前記（５）のラテックス試薬Ｂを等量ずつ混合して、第
二試薬を調製した。 （７） ０．０１％アジ化ナトリウム及び０．０５Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．１Ｍトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．４）を調製し、第一
試薬とした。 （８） 実施例１３の（３）に記載の方法に従い、リポ
タンパク質（ａ）濃度が１３ｍｇ／ｄＬ、３９．４ｍｇ
／ｄＬ及び９４．１ｍｇ／ｄＬの血清試料を調製した。
前記（５）のラテックス試薬Ｂを等量ずつ混合して、第
二試薬を調製した。 （７） ０．０１％アジ化ナトリウム及び０．０５Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．１Ｍトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ８．４）を調製し、第一
試薬とした。 （８） 実施例１３の（３）に記載の方法に従い、リポ
タンパク質（ａ）濃度が１３ｍｇ／ｄＬ、３９．４ｍｇ
／ｄＬ及び９４．１ｍｇ／ｄＬの血清試料を調製した。
【０１５４】（９） 測定は、日立−７１５０形自動分
析装置（日立製作所社製）を使用して行った。試料１０
μＬに第一試薬２００μＬを添加し、３７℃で５分間反
応させ、その後、第二試薬５０μＬを添加し、更に５分
間３７℃で反応させた。試料に第一試薬を添加してから
１０分後の、主波長８００ｎｍ、副波長５７０ｎｍにお
ける吸光度を測定した。 （１０） この測定の結果を図１０に示した。この図よ
り、本発明はラテックス比濁法においても、試料中のリ
ポタンパク質（ａ）の定量が行えることが確認できた。
また、このことより、前記（１）記載の２０２Ａ９株由
来の実施例１で得られた抗体と、前記（５）記載の２０
３Ｅ２株由来の実施例１で得られた抗体は、試料中のリ
ポタンパク質（ａ）との結合において、お互いに阻害し
合わない（干渉し合わない）ことが確かめられた。
析装置（日立製作所社製）を使用して行った。試料１０
μＬに第一試薬２００μＬを添加し、３７℃で５分間反
応させ、その後、第二試薬５０μＬを添加し、更に５分
間３７℃で反応させた。試料に第一試薬を添加してから
１０分後の、主波長８００ｎｍ、副波長５７０ｎｍにお
ける吸光度を測定した。 （１０） この測定の結果を図１０に示した。この図よ
り、本発明はラテックス比濁法においても、試料中のリ
ポタンパク質（ａ）の定量が行えることが確認できた。
また、このことより、前記（１）記載の２０２Ａ９株由
来の実施例１で得られた抗体と、前記（５）記載の２０
３Ｅ２株由来の実施例１で得られた抗体は、試料中のリ
ポタンパク質（ａ）との結合において、お互いに阻害し
合わない（干渉し合わない）ことが確かめられた。
【０１５５】
【発明の効果】本発明のリポタンパク質（ａ）の免疫学
的測定方法及び免疫学的測定試薬は、試料中のリポタン
パク質（ａ）のフェノタイプの種類によって測定値が変
動し、誤差が生じてしまうという問題を解決したもので
ある。つまり、試料中のリポタンパク質（ａ）のフェノ
タイプの種類によらず、真のリポタンパク質（ａ）濃度
を正確かつ簡便に得ることができる、という効果を有す
るものである。
的測定方法及び免疫学的測定試薬は、試料中のリポタン
パク質（ａ）のフェノタイプの種類によって測定値が変
動し、誤差が生じてしまうという問題を解決したもので
ある。つまり、試料中のリポタンパク質（ａ）のフェノ
タイプの種類によらず、真のリポタンパク質（ａ）濃度
を正確かつ簡便に得ることができる、という効果を有す
るものである。
【図１】リポタンパク質（ａ）の構造を示した図であ
る。
る。
【図２】４種類の実施例１で得られた抗体（「２０２Ａ
９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、「２０３Ｅ２株」
由来、及び「１０４Ｄ１１株」由来）のＬＤＬへの反応
性を確かめたウエスタンブロットの図である。（実施例
２）
９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、「２０３Ｅ２株」
由来、及び「１０４Ｄ１１株」由来）のＬＤＬへの反応
性を確かめたウエスタンブロットの図である。（実施例
２）
【図３】４種類の実施例１で得られた抗体（「２０２Ａ
９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、「２０３Ｅ２株」
由来、及び「１０４Ｄ１１株」由来）のプラスミノーゲ
ンへの反応性を確かめたウエスタンブロットの図であ
る。（実施例３）
９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、「２０３Ｅ２株」
由来、及び「１０４Ｄ１１株」由来）のプラスミノーゲ
ンへの反応性を確かめたウエスタンブロットの図であ
る。（実施例３）
【図４】３種類の実施例１で得られた抗体（「２０２Ａ
９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２
株」由来）の「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル
４様ドメインのタイプ５〜タイプ１０、クリングル５様
ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」への反応性を確
かめたウエスタンブロットの図である。（実施例６）
９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２
株」由来）の「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル
４様ドメインのタイプ５〜タイプ１０、クリングル５様
ドメイン又はプロテアーゼ様ドメイン」への反応性を確
かめたウエスタンブロットの図である。（実施例６）
【図５】実施例１で得られた抗体（「１０４Ｄ１１株」
由来）の「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様
ドメインのタイプ５〜タイプ１０、クリングル５様ドメ
イン又はプロテアーゼ様ドメイン」への反応性を確かめ
たウエスタンブロットの図である。（実施例７）
由来）の「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様
ドメインのタイプ５〜タイプ１０、クリングル５様ドメ
イン又はプロテアーゼ様ドメイン」への反応性を確かめ
たウエスタンブロットの図である。（実施例７）
【図６】３種類の実施例１で得られた抗体（「２０２Ａ
９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２
株」由来）の「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル
４様ドメインのタイプ１〜タイプ４」への反応性を確か
めたウエスタンブロットの図である。（実施例８）
９株」由来、「２０２Ｆ８株」由来、及び「２０３Ｅ２
株」由来）の「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル
４様ドメインのタイプ１〜タイプ４」への反応性を確か
めたウエスタンブロットの図である。（実施例８）
【図７】実施例１で得られた抗体（「１０４Ｄ１１株」
由来）の「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様
ドメインのタイプ１〜タイプ４」への反応性を確かめた
ウエスタンブロットの図である。（実施例９）
由来）の「アポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様
ドメインのタイプ１〜タイプ４」への反応性を確かめた
ウエスタンブロットの図である。（実施例９）
【図８】実施例１で得られた抗体（「１０４Ｄ１１株」
由来）の「プラスミノーゲンのクリングル５ドメイン又
はプロテアーゼドメイン」への反応性を確かめたウエス
タンブロットの図である。（実施例１０）
由来）の「プラスミノーゲンのクリングル５ドメイン又
はプロテアーゼドメイン」への反応性を確かめたウエス
タンブロットの図である。（実施例１０）
【図９】本発明の測定方法（測定試薬）〔ＥＬＩＳＡ
法〕における検量線を示した図である。（実施例１３）
法〕における検量線を示した図である。（実施例１３）
【図１０】本発明の測定方法（測定試薬）〔ラテックス
比濁法〕における検量線を示した図である。（実施例１
５）
比濁法〕における検量線を示した図である。（実施例１
５）
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１０年１１月１７日（１９９８．１１．
１７）
１７）
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 安部 彰 岐阜県関市市平賀字長峰795 岐阜医療技 術短期大学内 (72)発明者 久保 信彦 埼玉県大宮市天沼町１−847 自治医科大 学 大宮医療センター内 (72)発明者 櫻林 郁之介 埼玉県大宮市天沼町１−847 自治医科大 学 大宮医療センター内
Claims (4)
- 【請求項１】 試料中のリポタンパク質（ａ）の免疫学
的測定方法において、リポタンパク質（ａ）に結合させ
る抗体として、アポリポタンパク質（ａ）のクリングル
４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ
８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメ
イン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、か
つアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ２には結合しない抗体だけを使用することを特
徴とするリポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法。 - 【請求項２】 アポリポタンパク質（ａ）のクリングル
４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ
８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメ
イン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、か
つアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ２には結合しない抗体が、アポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ
６、タイプ７、タイプ８、タイプ９又はタイプ１０に特
異的に結合し、かつアポリポタンパク質（ａ）のクリン
グル４様ドメインのタイプ２には結合しない抗体である
請求項１記載の測定方法。 - 【請求項３】 試料中のリポタンパク質（ａ）の免疫学
的測定試薬において、リポタンパク質（ａ）に結合させ
る抗体として、アポリポタンパク質（ａ）のクリングル
４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ
８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメ
イン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、か
つアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ２には結合しない抗体だけを使用することを特
徴とするリポタンパク質（ａ）の免疫学的測定試薬。 - 【請求項４】 アポリポタンパク質（ａ）のクリングル
４様ドメインのタイプ５、タイプ６、タイプ７、タイプ
８、タイプ９もしくはタイプ１０、クリングル５様ドメ
イン又はプロテアーゼ様ドメインに特異的に結合し、か
つアポリポタンパク質（ａ）のクリングル４様ドメイン
のタイプ２には結合しない抗体が、アポリポタンパク質
（ａ）のクリングル４様ドメインのタイプ５、タイプ
６、タイプ７、タイプ８、タイプ９又はタイプ１０に特
異的に結合し、かつアポリポタンパク質（ａ）のクリン
グル４様ドメインのタイプ２には結合しない抗体である
請求項３記載の測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10320647A JP2000146966A (ja) | 1998-11-11 | 1998-11-11 | リポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10320647A JP2000146966A (ja) | 1998-11-11 | 1998-11-11 | リポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000146966A true JP2000146966A (ja) | 2000-05-26 |
Family
ID=18123756
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10320647A Withdrawn JP2000146966A (ja) | 1998-11-11 | 1998-11-11 | リポタンパク質（ａ）の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000146966A (ja) |
-
1998
- 1998-11-11 JP JP10320647A patent/JP2000146966A/ja not_active Withdrawn
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|---|---|---|---|
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