JP2000119192A - 骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋白質 - Google Patents
骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋白質Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 骨誘導因子に対して拮抗作用を有する成熟型
蛋白質を提供する。 【解決手段】 骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する
成熟型蛋白質は、成熟型ヒトＭＰ５２のアミノ酸配列中
に存在するメチオニン残基もしくはトリプトファン残基
のうちの少なくとも１個の残基を化学修飾により親水性
残基に変換するか、あるいは該残基を親水性アミノ酸残
基もしくは極性アミノ酸残基で置換することにより得ら
れる。前記メチオニン残基の化学修飾は酸化またはアル
キル化により行われる。前記トリプトファン残基の化学
修飾はアリールスルフェニル化により行われる。得られ
た成熟型蛋白質は異所性骨化石灰沈着を伴う代謝性疾患
の治療または予防剤として有用である。さらに骨誘導因
子とその受容体の結合に競合する薬物のスクリーニング
や評価系における試薬としても有用である。
蛋白質を提供する。 【解決手段】 骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する
成熟型蛋白質は、成熟型ヒトＭＰ５２のアミノ酸配列中
に存在するメチオニン残基もしくはトリプトファン残基
のうちの少なくとも１個の残基を化学修飾により親水性
残基に変換するか、あるいは該残基を親水性アミノ酸残
基もしくは極性アミノ酸残基で置換することにより得ら
れる。前記メチオニン残基の化学修飾は酸化またはアル
キル化により行われる。前記トリプトファン残基の化学
修飾はアリールスルフェニル化により行われる。得られ
た成熟型蛋白質は異所性骨化石灰沈着を伴う代謝性疾患
の治療または予防剤として有用である。さらに骨誘導因
子とその受容体の結合に競合する薬物のスクリーニング
や評価系における試薬としても有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、骨誘導活性を有する成
熟型蛋白質を構成する疎水性アミノ酸の一部残基を化学
修飾した成熟型蛋白質あるいは親水性又は極性アミノ酸
に置き換えた成熟型蛋白質に関する。本発明の成熟型蛋
白質は、骨誘導因子アンタゴニスト様活性を示し、異所
性骨形成および異所性石灰沈着又は石灰沈着を伴う骨代
謝性疾患、例えば、神経性骨化症、手術侵襲による異所
性骨化、外傷性骨化性筋炎、酸素供給不足による骨化、
骨原性腫瘤、後縦靭帯骨化症、動脈硬化の症状を抑える
医薬品として有用である。
熟型蛋白質を構成する疎水性アミノ酸の一部残基を化学
修飾した成熟型蛋白質あるいは親水性又は極性アミノ酸
に置き換えた成熟型蛋白質に関する。本発明の成熟型蛋
白質は、骨誘導因子アンタゴニスト様活性を示し、異所
性骨形成および異所性石灰沈着又は石灰沈着を伴う骨代
謝性疾患、例えば、神経性骨化症、手術侵襲による異所
性骨化、外傷性骨化性筋炎、酸素供給不足による骨化、
骨原性腫瘤、後縦靭帯骨化症、動脈硬化の症状を抑える
医薬品として有用である。
【０００２】
【従来の技術】骨誘導因子 (Bone morphogenetic prote
in：以降BMPと呼ぶ) は、脱灰骨組織に含有される骨誘
導活性を有する蛋白質である。1970年代から精力的にＢ
ＭＰの精製が試みられてきたが、単一の蛋白質としての
分離はきわめて困難であった。1989年にウォズニー(Woz
ney)らは骨誘導活性のある画分を酵素処理して未知のペ
プチドを分離してそのアミノ酸配列を手がかりに分子生
物学的手法により、ＢＭＰと考えられる遺伝子のクロー
ニングに成功した。この遺伝子は直ちに動物培養細胞に
導入され、発現した蛋白質の活性がインビボ（in viv
o）において確認され、この蛋白質に骨誘導活性が確か
にあることが証明された（Wang, E.A. et al., (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.87, p.2220-222
4）。引き続きホモロジーを利用した骨誘導活性を有す
る蛋白質のクローニングが行われ、現在まで骨誘導活性
を有する構造の似た複数の蛋白質が発見されている。こ
れらはいずれもＴＧＦ（トランスフォーミング成長因
子)−βスーパーファミリーに属し、基本的に in vivo
において異所性骨形成を引き起こす活性を有することが
確認されている。ＢＭＰによる骨形成は内軟骨性といわ
れており、胎生期の長骨の形成を再現するものと考えら
れている。したがって、ＢＭＰそのものが骨欠損部を補
う形での治療薬として利用し得るものである。
in：以降BMPと呼ぶ) は、脱灰骨組織に含有される骨誘
導活性を有する蛋白質である。1970年代から精力的にＢ
ＭＰの精製が試みられてきたが、単一の蛋白質としての
分離はきわめて困難であった。1989年にウォズニー(Woz
ney)らは骨誘導活性のある画分を酵素処理して未知のペ
プチドを分離してそのアミノ酸配列を手がかりに分子生
物学的手法により、ＢＭＰと考えられる遺伝子のクロー
ニングに成功した。この遺伝子は直ちに動物培養細胞に
導入され、発現した蛋白質の活性がインビボ（in viv
o）において確認され、この蛋白質に骨誘導活性が確か
にあることが証明された（Wang, E.A. et al., (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.87, p.2220-222
4）。引き続きホモロジーを利用した骨誘導活性を有す
る蛋白質のクローニングが行われ、現在まで骨誘導活性
を有する構造の似た複数の蛋白質が発見されている。こ
れらはいずれもＴＧＦ（トランスフォーミング成長因
子)−βスーパーファミリーに属し、基本的に in vivo
において異所性骨形成を引き起こす活性を有することが
確認されている。ＢＭＰによる骨形成は内軟骨性といわ
れており、胎生期の長骨の形成を再現するものと考えら
れている。したがって、ＢＭＰそのものが骨欠損部を補
う形での治療薬として利用し得るものである。
【０００３】一方、ＢＭＰ遺伝子が明らかにされ、その
特異的抗体が作成されるようになってから、今まで治療
法がなかった異所性石灰化部位にもＢＭＰが発現してお
り、これらの発症にＢＭＰが関与する可能性が示される
ようになってきた。例えば、神経性骨化症、手術侵襲よ
る異所性骨化、外傷性骨化性筋炎、酸素供給不足による
骨化、骨原性腫瘤、特定疾患（難病）に指定されている
後縦靭帯骨化症 (ossification of the posterior long
itudinal ligament：以降 OPLLと呼ぶ) (Spine, 17-3S,
S33, 1992) や、動脈硬化石灰化部位 (J Clin Invest,
vol.91, p.1800, 1993) に、BMPが発現したり含有され
たりしていることが近年明らかにされている。また、偽
悪性転位骨化症（pseudomalignant heterotopic ossifi
cation：以降 PHOと呼ぶ)、偽悪性骨性腫瘍（pseudomal
ignant osseous tumor）および限局性骨化性筋炎（myos
istis ossificans circumscripta）は痛みをともなう筋
肉内の硬組織の塊の出現が主な症状である。原因は不明
であるが、ＢＭＰが患者の筋肉内の硬組織の出現に関与
するものと考えられている。これらは、本来は発現しな
いはずの組織でＢＭＰが発現し、オートクライン（auto
crine）に作用して骨が形成されていることを示してい
る。ＯＰＬＬについては現在のところ有効な治療法もな
く、圧迫性の神経症状が重度であれば外科的に切除を試
みるが、予後は必ずしも良いものではない。また、動脈
の石灰化にしても治療法はない。
特異的抗体が作成されるようになってから、今まで治療
法がなかった異所性石灰化部位にもＢＭＰが発現してお
り、これらの発症にＢＭＰが関与する可能性が示される
ようになってきた。例えば、神経性骨化症、手術侵襲よ
る異所性骨化、外傷性骨化性筋炎、酸素供給不足による
骨化、骨原性腫瘤、特定疾患（難病）に指定されている
後縦靭帯骨化症 (ossification of the posterior long
itudinal ligament：以降 OPLLと呼ぶ) (Spine, 17-3S,
S33, 1992) や、動脈硬化石灰化部位 (J Clin Invest,
vol.91, p.1800, 1993) に、BMPが発現したり含有され
たりしていることが近年明らかにされている。また、偽
悪性転位骨化症（pseudomalignant heterotopic ossifi
cation：以降 PHOと呼ぶ)、偽悪性骨性腫瘍（pseudomal
ignant osseous tumor）および限局性骨化性筋炎（myos
istis ossificans circumscripta）は痛みをともなう筋
肉内の硬組織の塊の出現が主な症状である。原因は不明
であるが、ＢＭＰが患者の筋肉内の硬組織の出現に関与
するものと考えられている。これらは、本来は発現しな
いはずの組織でＢＭＰが発現し、オートクライン（auto
crine）に作用して骨が形成されていることを示してい
る。ＯＰＬＬについては現在のところ有効な治療法もな
く、圧迫性の神経症状が重度であれば外科的に切除を試
みるが、予後は必ずしも良いものではない。また、動脈
の石灰化にしても治療法はない。
【０００４】ＢＭＰの発現を抑制することが、これらの
病変の治療の主要な手段の一つと推察されるが、それ以
外に、例えば、ＢＭＰアンタゴニストの投与も有効と考
えられる。ＢＭＰアンタゴニスト様活性をもつものとし
てはＢＭＰ受容体やＢＭＰに対する中和抗体、ＢＭＰの
結合部位に対応するペプチド、ＢＭＰの特定のアミノ酸
残基に化学修飾等をほどこしたものなどが考えられる。
病変の治療の主要な手段の一つと推察されるが、それ以
外に、例えば、ＢＭＰアンタゴニストの投与も有効と考
えられる。ＢＭＰアンタゴニスト様活性をもつものとし
てはＢＭＰ受容体やＢＭＰに対する中和抗体、ＢＭＰの
結合部位に対応するペプチド、ＢＭＰの特定のアミノ酸
残基に化学修飾等をほどこしたものなどが考えられる。
【０００５】いままで、ＢＭＰの構造活性相関について
種々の検討がなされ、成熟型ＢＭＰの受容体との結合に
関与する部位が推測され、それを基にした合成ペプチド
はＢＭＰのアンタゴニストとしてはたらく事が知られて
いる（特願平７−２００１７５号）。
種々の検討がなされ、成熟型ＢＭＰの受容体との結合に
関与する部位が推測され、それを基にした合成ペプチド
はＢＭＰのアンタゴニストとしてはたらく事が知られて
いる（特願平７−２００１７５号）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】合成ペプチドの他にも
種々の骨・軟骨過形成症等の治療の選択として種類を多
くすることが望ましく、本発明の目的は上記の骨関連疾
患に有効な治療剤として、新規な化学修飾したまたは遺
伝子工学的手法により特定のアミノ酸を置換したＢＭＰ
アンタゴニスト蛋白質を提供することである。
種々の骨・軟骨過形成症等の治療の選択として種類を多
くすることが望ましく、本発明の目的は上記の骨関連疾
患に有効な治療剤として、新規な化学修飾したまたは遺
伝子工学的手法により特定のアミノ酸を置換したＢＭＰ
アンタゴニスト蛋白質を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、成熟型ヒトＭ
Ｐ５２のアミノ酸配列中に存在するメチオニン残基もし
くはトリプトファン残基の少なくとも１個の残基を、化
学修飾により親水性残基に変換するか、あるいは該残基
を親水性アミノ酸残基もしくは極性アミノ酸残基で置換
することにより得られる骨誘導因子アンタゴニスト活性
を有する成熟型蛋白質に関する。
Ｐ５２のアミノ酸配列中に存在するメチオニン残基もし
くはトリプトファン残基の少なくとも１個の残基を、化
学修飾により親水性残基に変換するか、あるいは該残基
を親水性アミノ酸残基もしくは極性アミノ酸残基で置換
することにより得られる骨誘導因子アンタゴニスト活性
を有する成熟型蛋白質に関する。
【０００８】さらに本発明は、成熟型ヒトＢＭＰ−２、
成熟型ヒトＢＭＰ−４または成熟型ヒトＢＭＰ−７のア
ミノ酸配列中に存在するトリプトファン残基の少なくと
も１個の残基を、化学修飾により親水性残基に変換する
か、あるいは該残基を親水性アミノ酸残基もしくは極性
アミノ酸残基で置換することにより得られる骨誘導因子
アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋白質に関する。
成熟型ヒトＢＭＰ−４または成熟型ヒトＢＭＰ−７のア
ミノ酸配列中に存在するトリプトファン残基の少なくと
も１個の残基を、化学修飾により親水性残基に変換する
か、あるいは該残基を親水性アミノ酸残基もしくは極性
アミノ酸残基で置換することにより得られる骨誘導因子
アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋白質に関する。
【０００９】本発明はさらに、成熟型ヒトＢＭＰ−２、
成熟型ヒトＢＭＰ−４または成熟型ヒトＢＭＰ−７のア
ミノ酸配列において、その受容体結合部位を構成する疎
水性アミノ酸残基のうち、成熟型ヒトＭＰ５２のアミノ
酸配列の３０番目、７１番目および７４番目に位置する
メチオニン残基に相当する位置の３個の疎水性アミノ酸
残基のうち少なくとも１個のアミノ酸残基を親水性アミ
ノ酸残基もしくは極性アミノ酸残基で置換することによ
り得られる骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する成熟
型蛋白質に関する。
成熟型ヒトＢＭＰ−４または成熟型ヒトＢＭＰ−７のア
ミノ酸配列において、その受容体結合部位を構成する疎
水性アミノ酸残基のうち、成熟型ヒトＭＰ５２のアミノ
酸配列の３０番目、７１番目および７４番目に位置する
メチオニン残基に相当する位置の３個の疎水性アミノ酸
残基のうち少なくとも１個のアミノ酸残基を親水性アミ
ノ酸残基もしくは極性アミノ酸残基で置換することによ
り得られる骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する成熟
型蛋白質に関する。
【００１０】本発明は、さらに上記骨誘導因子アンタゴ
ニスト活性を有する成熟型蛋白質を有効成分とする異所
性骨化の治療または予防剤に関する。そして本発明は、
さらに骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋
白質を有効成分とする石灰沈着を伴う代謝性疾患の治療
または予防剤に関する。
ニスト活性を有する成熟型蛋白質を有効成分とする異所
性骨化の治療または予防剤に関する。そして本発明は、
さらに骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋
白質を有効成分とする石灰沈着を伴う代謝性疾患の治療
または予防剤に関する。
【００１１】ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋
白質は、その遺伝子構造から生体内では、いずれも前駆
体として合成された後、種々のプロセッシングを受け、
成熟型のペプチド二量体を形成すると考えられている。
ヒトＴＧＦ−β１の活性型はＣ末端側１１２残基のペプ
チドの二量体であることが知られている（Nature 316,
701-705, 1985）。本発明において成熟型とは、この活
性型ヒトＴＧＦ−β１のＣ末端側１１２残基と相同性の
あるアミノ酸配列のペプチドの二量体を意味する。本発
明におけるＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白
質の例としてはＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、
ヒトＭＰ５２等があげられる。
白質は、その遺伝子構造から生体内では、いずれも前駆
体として合成された後、種々のプロセッシングを受け、
成熟型のペプチド二量体を形成すると考えられている。
ヒトＴＧＦ−β１の活性型はＣ末端側１１２残基のペプ
チドの二量体であることが知られている（Nature 316,
701-705, 1985）。本発明において成熟型とは、この活
性型ヒトＴＧＦ−β１のＣ末端側１１２残基と相同性の
あるアミノ酸配列のペプチドの二量体を意味する。本発
明におけるＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する蛋白
質の例としてはＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７、
ヒトＭＰ５２等があげられる。
【００１２】本発明者らは、受容体の結合部位に結合し
てＢＭＰアンタゴニストとして強く働く化学修飾蛋白質
を作る目的でＴＧＦ−βスーパーファミリーに属し、そ
の中でもＢＭＰファミリーの一員であるヒトＭＰ５２に
化学修飾およびアミノ酸の置換を試みた。
てＢＭＰアンタゴニストとして強く働く化学修飾蛋白質
を作る目的でＴＧＦ−βスーパーファミリーに属し、そ
の中でもＢＭＰファミリーの一員であるヒトＭＰ５２に
化学修飾およびアミノ酸の置換を試みた。
【００１３】ヒトＭＰ５２の活性型は二量体であるこ
と、および受容体結合部位は蛋白質分子の外側に露出し
た部分であると考えられることから、ヒトＭＰ５２が二
量体を形成したときに隣接する２つのペプチド領域（配
列表配列番号１に記載のアミノ酸配列において20番目の
Arg から38番目の Ala 及び60番目の Glu から77番目
の Glu まで）が受容体結合部位を形成していると推定
した。
と、および受容体結合部位は蛋白質分子の外側に露出し
た部分であると考えられることから、ヒトＭＰ５２が二
量体を形成したときに隣接する２つのペプチド領域（配
列表配列番号１に記載のアミノ酸配列において20番目の
Arg から38番目の Ala 及び60番目の Glu から77番目
の Glu まで）が受容体結合部位を形成していると推定
した。
【００１４】蛋白質のアミノ酸組成において一般的にト
リプトファンとメチオニンは含有率が最も低く選択的な
化学修飾に適していること、および推定されたヒトＭＰ
５２の立体構造モデルから、成熟型ヒトＭＰ５２単量体
に存在する４つのメチオニン残基のうち３つ（30番目、
71番目、74番目）が推定された受容体結合部位に存在す
ることおよび成熟型ヒトＭＰ５２単量体に２つ存在する
トリプトファン残基の両方（33番目、35番目）が推定さ
れた受容体結合部位に存在することから、これら２つの
アミノ酸残基に化学修飾を施した蛋白質を作成した。
リプトファンとメチオニンは含有率が最も低く選択的な
化学修飾に適していること、および推定されたヒトＭＰ
５２の立体構造モデルから、成熟型ヒトＭＰ５２単量体
に存在する４つのメチオニン残基のうち３つ（30番目、
71番目、74番目）が推定された受容体結合部位に存在す
ることおよび成熟型ヒトＭＰ５２単量体に２つ存在する
トリプトファン残基の両方（33番目、35番目）が推定さ
れた受容体結合部位に存在することから、これら２つの
アミノ酸残基に化学修飾を施した蛋白質を作成した。
【００１５】本発明における化学修飾とは、受容体への
結合能力をそのままに保ちつつ蛋白質の活性を無効にす
るに充分な程度にメチオニンまたはトリプトファンの側
鎖を変化させることを意味する。この化学修飾には蛋白
質化学の研究のために一般的に行われるものが適用され
る。この方法は、「タンパク質の化学IV」p.6−118,197
7, (社)日本生化学会等に記載されている。メチオニン
は疎水性アミノ酸であるが化学修飾によって親水性に変
化させることができる。親水性を高めるための化学修飾
には、酸化剤を用いたメチオニンのメチオニンスルホキ
シドあるいはメチオニンスルホンへの酸化と、アルファ
−ハロゲノ酢酸を用いたＳ−カルボキシメチルメチオニ
ン等へのアルキル化がある。メチオニンの酸化剤として
は過酸化水素、過ギ酸、過ヨウ素酸、Ｎ−クロロスクシ
ンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド等が挙げられる。
またアルファ−ハロゲノ酢酸としては、モノヨード酢
酸、モノヨード酢酸アミド等が用いられる。
結合能力をそのままに保ちつつ蛋白質の活性を無効にす
るに充分な程度にメチオニンまたはトリプトファンの側
鎖を変化させることを意味する。この化学修飾には蛋白
質化学の研究のために一般的に行われるものが適用され
る。この方法は、「タンパク質の化学IV」p.6−118,197
7, (社)日本生化学会等に記載されている。メチオニン
は疎水性アミノ酸であるが化学修飾によって親水性に変
化させることができる。親水性を高めるための化学修飾
には、酸化剤を用いたメチオニンのメチオニンスルホキ
シドあるいはメチオニンスルホンへの酸化と、アルファ
−ハロゲノ酢酸を用いたＳ−カルボキシメチルメチオニ
ン等へのアルキル化がある。メチオニンの酸化剤として
は過酸化水素、過ギ酸、過ヨウ素酸、Ｎ−クロロスクシ
ンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド等が挙げられる。
またアルファ−ハロゲノ酢酸としては、モノヨード酢
酸、モノヨード酢酸アミド等が用いられる。
【００１６】トリプトファンについては、そのインドー
ル環に化学修飾を施すことにより、近傍の環境や構造に
微妙な変化を与えることができる。好適な例としてｐ−
あるいはｏ−ニトロフェニルスルフェニルクロライド、
２−ニトロ−４−カルボキシフェニルスルフェニルクロ
ライド、２,４−ジニトロフェニルスルフェニルクロラ
イド等によるインドール核２位のアリ−ルスルフェニル
化あるいは２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミ
ド、ジメチル（２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル）
スルホニウムブロミド等によるインドール核３位への２
−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル基の付加等が挙げら
れる。
ル環に化学修飾を施すことにより、近傍の環境や構造に
微妙な変化を与えることができる。好適な例としてｐ−
あるいはｏ−ニトロフェニルスルフェニルクロライド、
２−ニトロ−４−カルボキシフェニルスルフェニルクロ
ライド、２,４−ジニトロフェニルスルフェニルクロラ
イド等によるインドール核２位のアリ−ルスルフェニル
化あるいは２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミ
ド、ジメチル（２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル）
スルホニウムブロミド等によるインドール核３位への２
−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル基の付加等が挙げら
れる。
【００１７】本発明は特に配列表配列番号１に示す成熟
型ヒトＭＰ５２アミノ酸配列におけるメチオニン残基の
うち１ないし４個のメチオニン残基あるいはトリプトフ
ァン残基の１ないし２個に化学修飾を施した成熟型蛋白
質に関する。
型ヒトＭＰ５２アミノ酸配列におけるメチオニン残基の
うち１ないし４個のメチオニン残基あるいはトリプトフ
ァン残基の１ないし２個に化学修飾を施した成熟型蛋白
質に関する。
【００１８】配列表配列番号１に示す蛋白質は特開平８
−５３１６２１号に記載の方法で製造することが出来
る。この方法によって製造された成熟型ヒトＭＰ５２の
受容体結合部位において構成アミノ酸のメチオニン残基
の４個のうち３個が存在していること、および構成アミ
ノ酸のトリプトファン残基のうち２個ともが存在し、か
つこれらアミノ酸が疎水性であることから、これらの疎
水性アミノ酸が骨誘導活性に重要な役割していることが
考えられる。
−５３１６２１号に記載の方法で製造することが出来
る。この方法によって製造された成熟型ヒトＭＰ５２の
受容体結合部位において構成アミノ酸のメチオニン残基
の４個のうち３個が存在していること、および構成アミ
ノ酸のトリプトファン残基のうち２個ともが存在し、か
つこれらアミノ酸が疎水性であることから、これらの疎
水性アミノ酸が骨誘導活性に重要な役割していることが
考えられる。
【００１９】本発明の成熟型ヒトＭＰ５２には、配列表
配列番号１に示すアミノ酸配列の成熟型蛋白質の他に、
そのＮ末端にＡｌａもしくはＡｒｇ−Ａｌａが結合した
アミノ酸配列の成熟型蛋白質を含む。
配列番号１に示すアミノ酸配列の成熟型蛋白質の他に、
そのＮ末端にＡｌａもしくはＡｒｇ−Ａｌａが結合した
アミノ酸配列の成熟型蛋白質を含む。
【００２０】他の骨誘導因子例えばヒトＢＭＰ-２、ヒ
トＢＭＰ-４、ヒトＢＭＰ−７等の成熟型蛋白質とヒト
ＭＰ５２成熟型蛋白質のアミノ酸配列を比較するとメチ
オニン残基に位置するアミノ酸はすべてメチオニン残基
か疎水性アミノ酸である。
トＢＭＰ-４、ヒトＢＭＰ−７等の成熟型蛋白質とヒト
ＭＰ５２成熟型蛋白質のアミノ酸配列を比較するとメチ
オニン残基に位置するアミノ酸はすべてメチオニン残基
か疎水性アミノ酸である。
【００２１】具体的には成熟型ヒトＢＭＰ−２の受容体
結合部位は配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列（Sc
ience 242 (4885), 1528−1534, 1988）において１６番
目のＡｒｇから３４番目のＡｌａ及び５６番目のＡｓｎ
から７３番目のＬｙｓまでのペプチドと予測され、成熟
型ヒトＭＰ５２のメチオニン（30番目、71番目、74番
目）に相当するアミノ酸の位置は２６番目のバリン、６
７番目のバリン、７０番目のバリンに置換されている。
結合部位は配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列（Sc
ience 242 (4885), 1528−1534, 1988）において１６番
目のＡｒｇから３４番目のＡｌａ及び５６番目のＡｓｎ
から７３番目のＬｙｓまでのペプチドと予測され、成熟
型ヒトＭＰ５２のメチオニン（30番目、71番目、74番
目）に相当するアミノ酸の位置は２６番目のバリン、６
７番目のバリン、７０番目のバリンに置換されている。
【００２２】成熟型ヒトＢＭＰ−４の受容体結合部位は
配列表配列番号３に記載のアミノ酸配列（DNA Seq. 5
(5), 272−275, 1995）において１９番目のＡｒｇから
３７番目のＡｌａ及び５９番目のＡｓｎから７６番目の
Ｓｅｒまでのペプチドと予測され、成熟型ヒトＭＰ５２
のメチオニン（30番目、71番目、74番目）に相当するア
ミノ酸の位置は２９番目のバリン、７０番目のバリン、
７３番目のバリンに置換されている。
配列表配列番号３に記載のアミノ酸配列（DNA Seq. 5
(5), 272−275, 1995）において１９番目のＡｒｇから
３７番目のＡｌａ及び５９番目のＡｓｎから７６番目の
Ｓｅｒまでのペプチドと予測され、成熟型ヒトＭＰ５２
のメチオニン（30番目、71番目、74番目）に相当するア
ミノ酸の位置は２９番目のバリン、７０番目のバリン、
７３番目のバリンに置換されている。
【００２３】成熟型ヒトＢＭＰ−７の受容体結合部位は
配列表配列番号４に記載のアミノ酸配列（Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 93（2）, 878−883, 1996）で４０
番目のＬｙｓから５８番目のＡｌａ及び８０番目のＡｓ
ｎから９７番目のＧｌｕまでのペプチドと予測され、成
熟型ヒトＭＰ５２のメチオニン（30番目、71番目、74番
目）に相当するアミノ酸の位置は５０番目のロイシン、
９１番目のバリン、９４番目のイソロイシンに置換され
ている。
配列表配列番号４に記載のアミノ酸配列（Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 93（2）, 878−883, 1996）で４０
番目のＬｙｓから５８番目のＡｌａ及び８０番目のＡｓ
ｎから９７番目のＧｌｕまでのペプチドと予測され、成
熟型ヒトＭＰ５２のメチオニン（30番目、71番目、74番
目）に相当するアミノ酸の位置は５０番目のロイシン、
９１番目のバリン、９４番目のイソロイシンに置換され
ている。
【００２４】これらの成熟型ヒトＭＰ５２のメチオニン
に相当するアミノ酸に位置する疎水性アミノ酸の化学修
飾は選択的な修飾は困難であるが、遺伝子工学的手法を
用い疎水性から親水性又は極性アミノ酸に変換すること
は可能である。
に相当するアミノ酸に位置する疎水性アミノ酸の化学修
飾は選択的な修飾は困難であるが、遺伝子工学的手法を
用い疎水性から親水性又は極性アミノ酸に変換すること
は可能である。
【００２５】またトリプトファン残基は上述の骨誘導因
子すべてで保存されていることから、化学修飾法でも遺
伝子工学的手法でも疎水性アミノ酸から親水性又は極性
アミノ酸に置換することが可能である。トリプトファン
残基は化学修飾および遺伝子工学においてその立体構造
に変化を起こさせる点でも重要な役割をもつ。
子すべてで保存されていることから、化学修飾法でも遺
伝子工学的手法でも疎水性アミノ酸から親水性又は極性
アミノ酸に置換することが可能である。トリプトファン
残基は化学修飾および遺伝子工学においてその立体構造
に変化を起こさせる点でも重要な役割をもつ。
【００２６】従って、本発明は成熟型ヒトＭＰ５２、特
に配列表配列番号１に示すアミノ酸配列のメチオニン残
基のうち１ないし４個のメチオニン残基あるいはトリプ
トファン残基の１ないし２個をを遺伝子工学的手法を用
いることにより親水性アミノ酸又は極性アミノ酸に変換
した成熟型蛋白質に関する。本発明において、親水性の
アミノ酸や極性アミノ酸とはアスパラギン酸、グルタミ
ン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレ
オニン残基等をいう。本発明においてメチオニン残基あ
るいはトリプトファン残基を他の親水性又は極性アミノ
酸に組み換える場合、メチオニン残基においては配列表
配列番号１に記載する３０番目、７１番目、７４番目お
よび１１１番目のメチオニンに相当するコドンをアスパ
ラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチ
ジン、セリン、スレオニンなどのコドンに換え換えた組
み換えＤＮＡあるいはトリプトファン残基においては３
２番目、３５番目のトリプトファンに上記アミノ酸に相
当するコドンに組み換えた組換えＤＮＡを導入し大腸菌
に発現させ本発明の蛋白質を得ることができる。
に配列表配列番号１に示すアミノ酸配列のメチオニン残
基のうち１ないし４個のメチオニン残基あるいはトリプ
トファン残基の１ないし２個をを遺伝子工学的手法を用
いることにより親水性アミノ酸又は極性アミノ酸に変換
した成熟型蛋白質に関する。本発明において、親水性の
アミノ酸や極性アミノ酸とはアスパラギン酸、グルタミ
ン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレ
オニン残基等をいう。本発明においてメチオニン残基あ
るいはトリプトファン残基を他の親水性又は極性アミノ
酸に組み換える場合、メチオニン残基においては配列表
配列番号１に記載する３０番目、７１番目、７４番目お
よび１１１番目のメチオニンに相当するコドンをアスパ
ラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチ
ジン、セリン、スレオニンなどのコドンに換え換えた組
み換えＤＮＡあるいはトリプトファン残基においては３
２番目、３５番目のトリプトファンに上記アミノ酸に相
当するコドンに組み換えた組換えＤＮＡを導入し大腸菌
に発現させ本発明の蛋白質を得ることができる。
【００２７】また、本発明は、配列表配列番号２から４
に示されるアミノ酸配列の成熟型蛋白質のうちいずれか
において、トリプトファン残基の１ないし２個に化学修
飾を施した成熟型蛋白質に関する。
に示されるアミノ酸配列の成熟型蛋白質のうちいずれか
において、トリプトファン残基の１ないし２個に化学修
飾を施した成熟型蛋白質に関する。
【００２８】本発明はさらに配列表配列番号２から４に
示されるアミノ酸配列の成熟型蛋白質のうちいずれかに
おいて、その受容体結合部位を構成する疎水性アミノ酸
のうち、配列表配列番号１の３０番目、７１番目および
７４番目に位置するメチオニン残基に相当する位置の疎
水性アミノ酸のうち１ないし３個のアミノ酸残基あるい
はトリプトファン残基の１ないし２個を親水性アミノ酸
又は極性アミノ酸に置換した成熟型蛋白質に関する。本
発明における疎水性アミノ酸とはメチオニン、バリン、
ロイシン、イソロイシンあるいはトリプトファンをい
う。
示されるアミノ酸配列の成熟型蛋白質のうちいずれかに
おいて、その受容体結合部位を構成する疎水性アミノ酸
のうち、配列表配列番号１の３０番目、７１番目および
７４番目に位置するメチオニン残基に相当する位置の疎
水性アミノ酸のうち１ないし３個のアミノ酸残基あるい
はトリプトファン残基の１ないし２個を親水性アミノ酸
又は極性アミノ酸に置換した成熟型蛋白質に関する。本
発明における疎水性アミノ酸とはメチオニン、バリン、
ロイシン、イソロイシンあるいはトリプトファンをい
う。
【００２９】本発明は配列表配列番号１に記載のアミノ
酸配列を有する成熟型蛋白質において、それを構成する
メチオニン残基の１ないし４個のメチオニン残基を酸化
した成熟型蛋白質に関する。詳細にはメチオニン残基を
酸化する場合、２mg／mlの濃度の成熟型蛋白質に、終濃
度が０.０１４％となるように過酸化水素を添加し、室
温にて１５時間以上反応させるメチオニン残基がメチオ
ニンスルホキシド化された成熟型蛋白質を得ることがで
きる。
酸配列を有する成熟型蛋白質において、それを構成する
メチオニン残基の１ないし４個のメチオニン残基を酸化
した成熟型蛋白質に関する。詳細にはメチオニン残基を
酸化する場合、２mg／mlの濃度の成熟型蛋白質に、終濃
度が０.０１４％となるように過酸化水素を添加し、室
温にて１５時間以上反応させるメチオニン残基がメチオ
ニンスルホキシド化された成熟型蛋白質を得ることがで
きる。
【００３０】本発明は配列表配列番号１に記載のアミノ
酸配列を有する成熟型蛋白質において、それを構成する
メチオニン残基の１ないし４個のメチオニン残基をアル
キル化した成熟型蛋白質に関する。詳細には、２mg／ml
の濃度の蛋白質に、メチオニン残基の５０〜１００倍の
モル比のモノヨード酢酸を添加し、室温にて１５時間以
上反応させ、メチオニン残基がＳ−カルボキシメチル化
された成熟型蛋白質を得ることができる。
酸配列を有する成熟型蛋白質において、それを構成する
メチオニン残基の１ないし４個のメチオニン残基をアル
キル化した成熟型蛋白質に関する。詳細には、２mg／ml
の濃度の蛋白質に、メチオニン残基の５０〜１００倍の
モル比のモノヨード酢酸を添加し、室温にて１５時間以
上反応させ、メチオニン残基がＳ−カルボキシメチル化
された成熟型蛋白質を得ることができる。
【００３１】本発明は配列表配列番号１に記載のアミノ
酸配列を有する成熟型蛋白質において、それを構成する
トリプトファン残基のうち１ないし２個のトリプトファ
ン残基をアリールスルフェニル化した成熟型蛋白質に関
する。詳しくは、２mg／mlの濃度の蛋白質に、１００％
酢酸に溶解したｐ−ニトロフェニルスルフェニルクロラ
イドを２０当量添加し、室温にて１時間反応させ、トリ
プトファン残基がアリ−ルスルフェニル化された成熟型
蛋白質を得ることができる。
酸配列を有する成熟型蛋白質において、それを構成する
トリプトファン残基のうち１ないし２個のトリプトファ
ン残基をアリールスルフェニル化した成熟型蛋白質に関
する。詳しくは、２mg／mlの濃度の蛋白質に、１００％
酢酸に溶解したｐ−ニトロフェニルスルフェニルクロラ
イドを２０当量添加し、室温にて１時間反応させ、トリ
プトファン残基がアリ−ルスルフェニル化された成熟型
蛋白質を得ることができる。
【００３２】本発明は配列表配列番号２に記載のアミノ
酸配列の２８番目、３１番目のトリプトファン残基の１
個あるいは２個をアリールスルフェニル化した成熟型蛋
白質に関する。
酸配列の２８番目、３１番目のトリプトファン残基の１
個あるいは２個をアリールスルフェニル化した成熟型蛋
白質に関する。
【００３３】本発明は配列表配列番号２に記載のアミノ
酸配列の２６番目、６７番目、７０番目のバリンのいず
れかまたは全部あるいは２８番目、３１番目のトリプト
ファン残基の１個あるいは２個をアスパラギン酸、グル
タミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、
スレオニン等に置換した成熟型蛋白質に関する。
酸配列の２６番目、６７番目、７０番目のバリンのいず
れかまたは全部あるいは２８番目、３１番目のトリプト
ファン残基の１個あるいは２個をアスパラギン酸、グル
タミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、
スレオニン等に置換した成熟型蛋白質に関する。
【００３４】本発明は配列表配列番号３に記載のアミノ
酸配列の３１番目、３４番目のトリプトファン残基の１
個あるいは２個をアリールスルフェニル化した成熟型蛋
白質に関する。
酸配列の３１番目、３４番目のトリプトファン残基の１
個あるいは２個をアリールスルフェニル化した成熟型蛋
白質に関する。
【００３５】本発明は配列表配列番号３に記載のアミノ
酸配列の２９番目、７０番目、７３番目のバリンのいず
れかまたは全部あるいは３１番目、３４番目のトリプト
ファン残基の１個あるいは2個をアスパラギン酸、グル
タミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、
スレオニン等に置換した成熟型蛋白質に関する。
酸配列の２９番目、７０番目、７３番目のバリンのいず
れかまたは全部あるいは３１番目、３４番目のトリプト
ファン残基の１個あるいは2個をアスパラギン酸、グル
タミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、
スレオニン等に置換した成熟型蛋白質に関する。
【００３６】本発明は配列表配列番号４に記載のアミノ
酸配列の５２番目、５５番目のトリプトファン残基の１
個あるいは２個をアリールスルフェニル化した成熟型蛋
白質に関する。
酸配列の５２番目、５５番目のトリプトファン残基の１
個あるいは２個をアリールスルフェニル化した成熟型蛋
白質に関する。
【００３７】本発明は配列表配列番号４に記載のアミノ
酸配列の５０番目のロイシン、９１番目のバリン、９４
番目のイソロイシン、１３１番目のメチオニンのいずれ
かまたは全部あるいは５２番目、５５番目のトリプトフ
ァン残基の１個あるいは２個をアスパラギン酸、グルタ
ミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、ス
レオニン等に置換した成熟型蛋白質に関する。
酸配列の５０番目のロイシン、９１番目のバリン、９４
番目のイソロイシン、１３１番目のメチオニンのいずれ
かまたは全部あるいは５２番目、５５番目のトリプトフ
ァン残基の１個あるいは２個をアスパラギン酸、グルタ
ミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、ス
レオニン等に置換した成熟型蛋白質に関する。
【００３８】本発明の化学修飾あるいは他のアミノ酸で
置換された蛋白質のＢＭＰアンタゴニスト様作用は、児
玉ら（Kodama, H. et al. (1981) Jpn. J. Oral Biol.,
vol.23, p.899）によりマウス頭蓋冠から単一株化され
た骨芽細胞様の性質を有するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株に
添加培養し、細胞中のアルカリホスファターゼ（ALPas
e）を指標として生物活性を測定することにより証明さ
れ得る。ALPaseは骨芽細胞および軟骨細胞の分化・成熟
の指標酵素としてしばしば用いられる (Pfeilschifter,
J., et al., Endocrinology (1987), vol. 121, p 212
-218; Rodan, G.A., et al., calcium regulating horm
ones and bone metabolism, Elsevier Science Publish
ers B.V., (1992), p 183-196)。
置換された蛋白質のＢＭＰアンタゴニスト様作用は、児
玉ら（Kodama, H. et al. (1981) Jpn. J. Oral Biol.,
vol.23, p.899）によりマウス頭蓋冠から単一株化され
た骨芽細胞様の性質を有するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株に
添加培養し、細胞中のアルカリホスファターゼ（ALPas
e）を指標として生物活性を測定することにより証明さ
れ得る。ALPaseは骨芽細胞および軟骨細胞の分化・成熟
の指標酵素としてしばしば用いられる (Pfeilschifter,
J., et al., Endocrinology (1987), vol. 121, p 212
-218; Rodan, G.A., et al., calcium regulating horm
ones and bone metabolism, Elsevier Science Publish
ers B.V., (1992), p 183-196)。
【００３９】本発明の実施例１から３で得られた成熟型
蛋白質は骨芽細胞様の性質を有するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細
胞株やＣ３Ｈ１０Ｔ1/2細胞株の組換え成熟型ヒトＢＭ
Ｐ−２（ｒｈ−ＢＭＰ−２）や成熟型ヒトＭＰ５２によ
り誘導されたＡＬＰａｓｅ活性の上昇を用量依存的に抑
制した。このことは、本発明蛋白質がヒトＭＰ５２の活
性のみならず他のBMP蛋白質の活性を抑えることを示し
ている。
蛋白質は骨芽細胞様の性質を有するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細
胞株やＣ３Ｈ１０Ｔ1/2細胞株の組換え成熟型ヒトＢＭ
Ｐ−２（ｒｈ−ＢＭＰ−２）や成熟型ヒトＭＰ５２によ
り誘導されたＡＬＰａｓｅ活性の上昇を用量依存的に抑
制した。このことは、本発明蛋白質がヒトＭＰ５２の活
性のみならず他のBMP蛋白質の活性を抑えることを示し
ている。
【００４０】本発明は上記で得られたいずれかの蛋白質
を有効成分とする異所性骨化の治療および予防剤に関す
る。さらに本発明は上記で得られたいずれかの蛋白質を
有効成分とする石灰沈着を伴う代謝性疾患の治療および
予防剤に関する。
を有効成分とする異所性骨化の治療および予防剤に関す
る。さらに本発明は上記で得られたいずれかの蛋白質を
有効成分とする石灰沈着を伴う代謝性疾患の治療および
予防剤に関する。
【００４１】本発明の化学修飾蛋白質は、ＯＰＬＬや動
脈硬化の症状の進行を抑える薬剤及びＢＭＰが発現して
いる骨や軟骨の腫瘍の治療、その他骨代謝疾患の治療剤
として有用である。その投与方法としては静脈内及び筋
肉内投与が可能であり、静脈内投与の場合は通常の静脈
内注射の他点滴静注が可能である。
脈硬化の症状の進行を抑える薬剤及びＢＭＰが発現して
いる骨や軟骨の腫瘍の治療、その他骨代謝疾患の治療剤
として有用である。その投与方法としては静脈内及び筋
肉内投与が可能であり、静脈内投与の場合は通常の静脈
内注射の他点滴静注が可能である。
【００４２】注射用製剤としては、例えば注射用粉末製
剤とすることができる。その場合は、適当な水溶性賦形
剤、例えばマンニトール、ショ糖、乳頭、マルトース、
ブドウ糖、フルクトース糖の１種又は２種以上を加えて
水で溶解し、バイアル又はアンプルに分注した後、凍結
乾燥し、密封して製剤とすることができる。臨床におけ
る成人１日当たりの投与量は、投与法、患者の年齢、体
重、症状等によって異なるが、通常は本蛋白質として
０.０１〜５mgの範囲である。以下に実施例により、本
発明を詳述する。なお、本発明はこれらの実施例により
限定されるものではない。
剤とすることができる。その場合は、適当な水溶性賦形
剤、例えばマンニトール、ショ糖、乳頭、マルトース、
ブドウ糖、フルクトース糖の１種又は２種以上を加えて
水で溶解し、バイアル又はアンプルに分注した後、凍結
乾燥し、密封して製剤とすることができる。臨床におけ
る成人１日当たりの投与量は、投与法、患者の年齢、体
重、症状等によって異なるが、通常は本蛋白質として
０.０１〜５mgの範囲である。以下に実施例により、本
発明を詳述する。なお、本発明はこれらの実施例により
限定されるものではない。
【００４３】
【実施例】実施例１ メチオニン残基を酸化したヒトＭ
Ｐ５２成熟型蛋白質の作成 (１) 過酸化水素による成熟型ヒトＭＰ５２のメチオニ
ン残基の酸化（メチオニンスルホキシドへの変換） ２mM ＥＤＴＡ−１０mM塩酸に溶解した２mg／mlの濃度
の成熟型ヒトＭＰ５２に、終濃度が０.０１４％となる
ように過酸化水素を添加し、室温にて１５時間以上反応
させた。 (２) メチオニン酸化成熟型ヒトＭＰ５２の分離 配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する成熟型
ヒトＭＰ５２（以下未修飾成熟型ヒトＭＰ５２と記す）
とメチオニン酸化成熟型ヒトＭＰ５２は、逆相ＨＰＬＣ
を用いて両者の保持時間の違いにより分離した。酸化を
受けることによってタンパク質の親水性が増し、逆相Ｈ
ＰＬＣにおける保持時間は、メチオニン酸化成熟型ヒト
ＭＰ５２の方が、早くなる。分離条件は、以下の通りで
ある。カラムは、Nucleosil 5−C18−300カラム（4.6mm
I.D.×150mm, GL Sciense社製）を用い、流速を１分間
あたり１.３mlに設定、カラム温度４５℃、ピーク検出
波長として２１４nm及び２８０nmを用いた。溶媒は、Ａ
液として０.０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ液として０.０５
％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いて、Ｂ液２５％か
ら４５％までの８０分間の直線勾配で溶出を行った。Ｈ
ＰＬＣポンプは、ＨＰ１０５０（HEWLETT PACKARD）を
用いた。この条件で、未修飾成熟型ヒトＭＰ５２が５１
分付近で溶出するのに対し、メチオニン酸化成熟型ヒト
ＭＰ５２は、これより早く４７分付近で溶出し、両者は
容易に分離できた。
Ｐ５２成熟型蛋白質の作成 (１) 過酸化水素による成熟型ヒトＭＰ５２のメチオニ
ン残基の酸化（メチオニンスルホキシドへの変換） ２mM ＥＤＴＡ−１０mM塩酸に溶解した２mg／mlの濃度
の成熟型ヒトＭＰ５２に、終濃度が０.０１４％となる
ように過酸化水素を添加し、室温にて１５時間以上反応
させた。 (２) メチオニン酸化成熟型ヒトＭＰ５２の分離 配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する成熟型
ヒトＭＰ５２（以下未修飾成熟型ヒトＭＰ５２と記す）
とメチオニン酸化成熟型ヒトＭＰ５２は、逆相ＨＰＬＣ
を用いて両者の保持時間の違いにより分離した。酸化を
受けることによってタンパク質の親水性が増し、逆相Ｈ
ＰＬＣにおける保持時間は、メチオニン酸化成熟型ヒト
ＭＰ５２の方が、早くなる。分離条件は、以下の通りで
ある。カラムは、Nucleosil 5−C18−300カラム（4.6mm
I.D.×150mm, GL Sciense社製）を用い、流速を１分間
あたり１.３mlに設定、カラム温度４５℃、ピーク検出
波長として２１４nm及び２８０nmを用いた。溶媒は、Ａ
液として０.０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ液として０.０５
％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いて、Ｂ液２５％か
ら４５％までの８０分間の直線勾配で溶出を行った。Ｈ
ＰＬＣポンプは、ＨＰ１０５０（HEWLETT PACKARD）を
用いた。この条件で、未修飾成熟型ヒトＭＰ５２が５１
分付近で溶出するのに対し、メチオニン酸化成熟型ヒト
ＭＰ５２は、これより早く４７分付近で溶出し、両者は
容易に分離できた。
【００４４】(３) メチオニン残基の酸化の確認 未修飾成熟型ヒトＭＰ５２及びメチオニン酸化成熟型ヒ
トＭＰ５２のトリプシン消化フラグメントの逆相カラム
クロマトグラフィにおける溶出パターンを比較すること
によって、メチオニン残基の酸化の確認を行なった。未
修飾成熟型ヒトＭＰ５２は配列表配列番号１に示すごと
く、システイン残基を７つ持つ。７つのうち６つが３組
のジスルフィド結合を形成し、残りの１つのシステイン
で二量体を形成している。充分な酵素消化のためには、
ジスルフィド結合をはずし、再結合を阻害するためのＳ
Ｈ基のブロックが必要となる。このため、トリプシン消
化の前に、ジチオスレイトールを用いてジスルフィド結
合を還元後、システイン残基をアルキル化（Ｓ−カルボ
キシルメチル化）する処理を行なった。まず、凍結乾燥
した未修飾成熟型ヒトＭＰ５２及びメチオニン酸化成熟
型ヒトＭＰ５２をそれぞれ終濃度１mg／mlとなるように
８Ｍ尿素−０.２Ｍ重炭酸アンモニウム−２mM ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８.５の溶液に溶かし、システイン残基の５０
倍量のジチオスレイトール（DTT）を加えて５０℃で３
０分反応させた。ここに、システイン残基の２５０倍量
のモノヨード酢酸アミドを加え、遮光して３０分反応さ
せることにより、還元アルキル化未修飾成熟型ヒトＭＰ
５２及び還元アルキル化メチオニン酸化成熟型ヒトＭＰ
５２を得た。この溶液を水で４倍に希釈し尿素の終濃度
を２Ｍとした後、成熟型ヒトＭＰ５２の重量あたり１／
５０量のトリプシンを加え、３７℃で１８時間消化を行
なった。このトリプシン消化物を逆相ＨＰＬＣカラムに
かけ、すべてのフラグメントを分離した。分離条件は、
以下の通りである。カラムは、Nucleosil 5−C18−300
カラム（4.6mm I.D.×150mm, GLSciense社製）を用い、
流速を１分間あたり１.３mlに設定、カラム温度４５
℃、ピーク検出波長として２１４nmを用いた。溶媒は、
Ａ液として０.０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ液として０.０
５％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いて、５分間Ｂ液
０％に維持した後、０％から４５％までの９０分間の直
線勾配で溶出を行った。ＨＰＬＣポンプは、ＨＰ１０５
０（HEWLETT PACKARD）を用いた。次に、分離した還元
アルキル化未修飾成熟型ヒトＭＰ５２及び還元アルキル
化メチオニン酸化成熟型ヒトＭＰ５２の各消化フラグメ
ントについての１次構造上の位置を決定するためにアミ
ノ酸組成分析を行なった。アミノ酸組成分析の操作は主
として続生化学実験講座（東京化学同人）第２巻、タン
パク質の化学(上)第４章記載の方法に従った。以下、簡
単に操作を記す。加水分解は、０.１％フェノールを含
む６Ｎ塩酸の蒸気下、Ｗａｔｅｒｓ社のPICO.TAG.WORK
STATIONを用いて、１１０℃、２１時間行なった。その
後、ピアス社のAmino acid standardHを標準アミノ酸と
して用い、ＰＴＣ化法によるアミノ酸組成分析を行なっ
た。ＰＴＣ−アミノ酸の分離に用いたのは、Ｗａｔｅｒ
ｓ社の５１０ＨＰＬＣポンプ、カラムは、和光純薬のWa
kopak WS−PTC（4.0mm I.D.×200mm）、溶媒はＰＴＣア
ミノ酸溶離液Ａ及びＰＴＣアミノ酸溶離液Ｂ（共に和光
純薬）である。アミノ酸組成分析により１次構造上の位
置が決定された還元アルキル化未修飾成熟型ヒトＭＰ５
２及び還元アルキル化メチオニン酸化成熟型ヒトＭＰ５
２の各トリプシンフラグメントの逆相ＨＰＬＣカラムク
ロマトグラフィにおける溶出時間を比較した。還元アル
キル化メチオニン残基を含む成熟型ヒトＭＰ５２のトリ
プシンフラグメントは、配列表配列番号１に示す２９番
目から５６番目に対応するもの（29−56、30番目のメチ
オニンを含む)、配列表配列番号１に示す５７番目から
８８番目に対応するもの（57−88、71及び74番目のメチ
オニンを含む）及び配列表配列番号１に示す１０７番目
から１１９番目に対応するもの（107−119、111番目の
メチオニンを含む）の３種類で、還元アルキル化未修飾
成熟型ヒトＭＰ５２由来のそれぞれのフラグメントの溶
出時間が、順に８４分、６２分、３６分付近であるのに
対し、還元アルキル化メチオニン酸化成熟型ヒトＭＰ５
２由来のフラグメントは、順に８０分、４８分、３１分
付近で、還元アルキル化未修飾成熟型ヒトＭＰ５２由来
のフラグメントより早く溶出した。一方、これ以外のメ
チオニンを含まないフラグメントの溶出時間は両者で変
化がなかった。以上により、メチオニン残基特異的に酸
化反応がおきていることが確認できた。
トＭＰ５２のトリプシン消化フラグメントの逆相カラム
クロマトグラフィにおける溶出パターンを比較すること
によって、メチオニン残基の酸化の確認を行なった。未
修飾成熟型ヒトＭＰ５２は配列表配列番号１に示すごと
く、システイン残基を７つ持つ。７つのうち６つが３組
のジスルフィド結合を形成し、残りの１つのシステイン
で二量体を形成している。充分な酵素消化のためには、
ジスルフィド結合をはずし、再結合を阻害するためのＳ
Ｈ基のブロックが必要となる。このため、トリプシン消
化の前に、ジチオスレイトールを用いてジスルフィド結
合を還元後、システイン残基をアルキル化（Ｓ−カルボ
キシルメチル化）する処理を行なった。まず、凍結乾燥
した未修飾成熟型ヒトＭＰ５２及びメチオニン酸化成熟
型ヒトＭＰ５２をそれぞれ終濃度１mg／mlとなるように
８Ｍ尿素−０.２Ｍ重炭酸アンモニウム−２mM ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８.５の溶液に溶かし、システイン残基の５０
倍量のジチオスレイトール（DTT）を加えて５０℃で３
０分反応させた。ここに、システイン残基の２５０倍量
のモノヨード酢酸アミドを加え、遮光して３０分反応さ
せることにより、還元アルキル化未修飾成熟型ヒトＭＰ
５２及び還元アルキル化メチオニン酸化成熟型ヒトＭＰ
５２を得た。この溶液を水で４倍に希釈し尿素の終濃度
を２Ｍとした後、成熟型ヒトＭＰ５２の重量あたり１／
５０量のトリプシンを加え、３７℃で１８時間消化を行
なった。このトリプシン消化物を逆相ＨＰＬＣカラムに
かけ、すべてのフラグメントを分離した。分離条件は、
以下の通りである。カラムは、Nucleosil 5−C18−300
カラム（4.6mm I.D.×150mm, GLSciense社製）を用い、
流速を１分間あたり１.３mlに設定、カラム温度４５
℃、ピーク検出波長として２１４nmを用いた。溶媒は、
Ａ液として０.０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ液として０.０
５％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いて、５分間Ｂ液
０％に維持した後、０％から４５％までの９０分間の直
線勾配で溶出を行った。ＨＰＬＣポンプは、ＨＰ１０５
０（HEWLETT PACKARD）を用いた。次に、分離した還元
アルキル化未修飾成熟型ヒトＭＰ５２及び還元アルキル
化メチオニン酸化成熟型ヒトＭＰ５２の各消化フラグメ
ントについての１次構造上の位置を決定するためにアミ
ノ酸組成分析を行なった。アミノ酸組成分析の操作は主
として続生化学実験講座（東京化学同人）第２巻、タン
パク質の化学(上)第４章記載の方法に従った。以下、簡
単に操作を記す。加水分解は、０.１％フェノールを含
む６Ｎ塩酸の蒸気下、Ｗａｔｅｒｓ社のPICO.TAG.WORK
STATIONを用いて、１１０℃、２１時間行なった。その
後、ピアス社のAmino acid standardHを標準アミノ酸と
して用い、ＰＴＣ化法によるアミノ酸組成分析を行なっ
た。ＰＴＣ−アミノ酸の分離に用いたのは、Ｗａｔｅｒ
ｓ社の５１０ＨＰＬＣポンプ、カラムは、和光純薬のWa
kopak WS−PTC（4.0mm I.D.×200mm）、溶媒はＰＴＣア
ミノ酸溶離液Ａ及びＰＴＣアミノ酸溶離液Ｂ（共に和光
純薬）である。アミノ酸組成分析により１次構造上の位
置が決定された還元アルキル化未修飾成熟型ヒトＭＰ５
２及び還元アルキル化メチオニン酸化成熟型ヒトＭＰ５
２の各トリプシンフラグメントの逆相ＨＰＬＣカラムク
ロマトグラフィにおける溶出時間を比較した。還元アル
キル化メチオニン残基を含む成熟型ヒトＭＰ５２のトリ
プシンフラグメントは、配列表配列番号１に示す２９番
目から５６番目に対応するもの（29−56、30番目のメチ
オニンを含む)、配列表配列番号１に示す５７番目から
８８番目に対応するもの（57−88、71及び74番目のメチ
オニンを含む）及び配列表配列番号１に示す１０７番目
から１１９番目に対応するもの（107−119、111番目の
メチオニンを含む）の３種類で、還元アルキル化未修飾
成熟型ヒトＭＰ５２由来のそれぞれのフラグメントの溶
出時間が、順に８４分、６２分、３６分付近であるのに
対し、還元アルキル化メチオニン酸化成熟型ヒトＭＰ５
２由来のフラグメントは、順に８０分、４８分、３１分
付近で、還元アルキル化未修飾成熟型ヒトＭＰ５２由来
のフラグメントより早く溶出した。一方、これ以外のメ
チオニンを含まないフラグメントの溶出時間は両者で変
化がなかった。以上により、メチオニン残基特異的に酸
化反応がおきていることが確認できた。
【００４５】実施例２ メチオニン残基をＳ−カルボキ
シメチル化したヒトＭＰ５２成熟型蛋白質の作成 (１) モノヨード酢酸による成熟型ヒトＭＰ５２のメチ
オニン残基のアルキル化 モノヨード酢酸を用いたアルキル化反応は、ジスルフィ
ド結合をしていないシステイン残基のＳＨ基に最も反応
性が高いが、前述したように、未修飾成熟型ヒトＭＰ５
２のシステイン残基はすべてジスルフィド結合をしてい
るため、酸性条件においては、アルキル化反応はほぼ選
択的にメチオニン残基に起きる。よって、以下のように
操作を行なった。１０mM塩酸に溶解した２mg／mlの濃度
の未修飾成熟型ヒトＭＰ５２に、メチオニン残基の５０
〜１００倍のモル比のモノヨード酢酸を添加し、室温に
て３〜１８時間反応させた。 (２) メチオニン残基をアルキル化した成熟型ヒトＭＰ
５２の分離 未修飾成熟型ヒトＭＰ５２とメチオニンアルキル化成熟
型ヒトＭＰ５２は、逆相ＨＰＬＣを用いて両者の保持時
間の違いにより分離した。分離条件（使用カラム、流
速、温度、検出波長およびＨＰＬＣポンプ）は実施例１
(２)と同様である。溶媒は、Ａ液として０.０５％ＴＦ
Ａを含む水、Ｂ液として０.０５％ＴＦＡを含むアセト
ニトリルを用いて、５分後からの６０分間でＢ液３０％
から４５％まで直線勾配を行なった。この条件で、未修
飾成熟型ヒトＭＰ５２が３８分付近で１つのピークとし
て溶出するのに対し、アルキル化成熟型ヒトＭＰ５２
は、未修飾成熟型ヒトＭＰ５２の溶出時間である３８分
付近のピークの他にこれよりも溶出時間の早いピークが
４本（溶出時間；36分、34分、32分、29分）確認でき
た。反応が進むほど、すなわちアルキル化されたメチオ
ニンの数が増すほど溶出時間が早くなる。これらピーク
を分取し、その確認のために実施例１(３)と同様にアミ
ノ酸組成分析を行なった。アミノ酸組成分析において、
アルキル化されたメチオニンは加水分解で壊れないた
め、反応していないメチオニンとは別のピークとして検
出される。すなわち、反応の進行程度はメチオニンピー
クの減少によって確認できる。これにより、溶出時間２
９分のピークはメチオニン４つすべてがアルキル化した
もの、溶出時間３２分のピークはメチオニン３つがアル
キル化したもの、溶出時間３４分のピークはメチオニン
２つがアルキル化したもの、溶出時間３６分のピークは
メチオニン１つがアルキル化したものであることがわか
った。また、未修飾成熟型ヒトＭＰ５２の溶出時間であ
る３８分付近のピークは、アルキル化されていないこと
がわかった。これらすべてのピークについて、メチオニ
ン以外のアミノ酸については、成熟型ヒトＭＰ５２のア
ミノ酸組成の理論値と一致した。以上により、メチオニ
ン残基特異的にアルキル化反応がおきていること、分離
したピークは、アルキル化反応の進行程度の違うもので
あることが確認できた。
シメチル化したヒトＭＰ５２成熟型蛋白質の作成 (１) モノヨード酢酸による成熟型ヒトＭＰ５２のメチ
オニン残基のアルキル化 モノヨード酢酸を用いたアルキル化反応は、ジスルフィ
ド結合をしていないシステイン残基のＳＨ基に最も反応
性が高いが、前述したように、未修飾成熟型ヒトＭＰ５
２のシステイン残基はすべてジスルフィド結合をしてい
るため、酸性条件においては、アルキル化反応はほぼ選
択的にメチオニン残基に起きる。よって、以下のように
操作を行なった。１０mM塩酸に溶解した２mg／mlの濃度
の未修飾成熟型ヒトＭＰ５２に、メチオニン残基の５０
〜１００倍のモル比のモノヨード酢酸を添加し、室温に
て３〜１８時間反応させた。 (２) メチオニン残基をアルキル化した成熟型ヒトＭＰ
５２の分離 未修飾成熟型ヒトＭＰ５２とメチオニンアルキル化成熟
型ヒトＭＰ５２は、逆相ＨＰＬＣを用いて両者の保持時
間の違いにより分離した。分離条件（使用カラム、流
速、温度、検出波長およびＨＰＬＣポンプ）は実施例１
(２)と同様である。溶媒は、Ａ液として０.０５％ＴＦ
Ａを含む水、Ｂ液として０.０５％ＴＦＡを含むアセト
ニトリルを用いて、５分後からの６０分間でＢ液３０％
から４５％まで直線勾配を行なった。この条件で、未修
飾成熟型ヒトＭＰ５２が３８分付近で１つのピークとし
て溶出するのに対し、アルキル化成熟型ヒトＭＰ５２
は、未修飾成熟型ヒトＭＰ５２の溶出時間である３８分
付近のピークの他にこれよりも溶出時間の早いピークが
４本（溶出時間；36分、34分、32分、29分）確認でき
た。反応が進むほど、すなわちアルキル化されたメチオ
ニンの数が増すほど溶出時間が早くなる。これらピーク
を分取し、その確認のために実施例１(３)と同様にアミ
ノ酸組成分析を行なった。アミノ酸組成分析において、
アルキル化されたメチオニンは加水分解で壊れないた
め、反応していないメチオニンとは別のピークとして検
出される。すなわち、反応の進行程度はメチオニンピー
クの減少によって確認できる。これにより、溶出時間２
９分のピークはメチオニン４つすべてがアルキル化した
もの、溶出時間３２分のピークはメチオニン３つがアル
キル化したもの、溶出時間３４分のピークはメチオニン
２つがアルキル化したもの、溶出時間３６分のピークは
メチオニン１つがアルキル化したものであることがわか
った。また、未修飾成熟型ヒトＭＰ５２の溶出時間であ
る３８分付近のピークは、アルキル化されていないこと
がわかった。これらすべてのピークについて、メチオニ
ン以外のアミノ酸については、成熟型ヒトＭＰ５２のア
ミノ酸組成の理論値と一致した。以上により、メチオニ
ン残基特異的にアルキル化反応がおきていること、分離
したピークは、アルキル化反応の進行程度の違うもので
あることが確認できた。
【００４６】(３) メチオニン残基のアルキル化の確認 未修飾成熟型ヒトＭＰ５２及びメチオニンアルキル化成
熟型ヒトＭＰ５２のトリプシン消化フラグメントの逆相
カラムにおける溶出パターンを比較することによって、
メチオニン残基のアルキル化の確認を行なった。実施例
１(３)と同様に、トリプシン消化の前に、ジチオスレイ
トールを用いてジスルフィド結合を還元後、システイン
残基をアルキル化する処理を行なった。ただし、メチオ
ニンのアルキル化反応にモノヨード酢酸を用いたＳ−カ
ルボキシメチル化を行なっているため、モノヨード酢酸
アミドを用いた実施例１と同様のＳ−カルボキシメチル
化ではなく、アルキル化試薬として４−vinyl pyridine
を用いたＳ−ピリジルエチル化を行なった。アルキル化
反応は、ｐＨ８.５においては還元したシステインにほ
ぼ選択的でメチオニンには殆ど起きないが、副反応があ
った場合に区別し得るためである。まず、凍結乾燥した
未修飾成熟型ヒトＭＰ５２及びメチオニンアルキル化成
熟型ヒトＭＰ５２を終濃度１mg／mlとなるように６Ｍ G
uanidine−HCl−０.４Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８.５
の溶液に溶かし、システイン残基の５０倍量のジチオス
レイトール（DTT）を加えて５０℃で３０分反応させ
た。ここに、システイン残基の２５０倍量の４−vinyl
pyridineを加え、遮光して３０分反応させた。この溶液
を、６Ｍ Guanidine−HCl−０.４Ｍトリス塩酸緩衝液、
ｐＨ８.５の溶液にて平衡化させてある脱塩用のゲルろ
過カラム（PD-10、ファルマシア）にかけ過剰の試薬を
除いた後、逆相ＨＰＬＣカラム（Cosmasil 10C18-300、
4.6mm I.D.×100mm、ナカライテスク）にて分離した。
分光光度計で、トリプトファンに由来する２８０nmにお
ける吸収とピリジンに由来する２５４nmにおける吸収を
併せ持つ分画を確認した。その後、実施例１(３)と同様
にトリプシン消化を行ない、消化フラグメントの分離を
行なった。次に、実施例１(３)と同様にして、アミノ酸
組成分析により各フラグメントの１次構造上の位置を決
定した。アミノ酸組成分析により１次構造上の位置が決
定された未修飾成熟型ヒトＭＰ５２及びメチオニンアル
キル化成熟型ヒトＭＰ５２の各トリプシンフラグメント
の逆相ＨＰＬＣカラムにおける溶出時間を比較した。メ
チオニン残基を含む成熟型ヒトＭＰ５２のトリプシンフ
ラグメントは、配列表配列番号１に示す２９番目から５
６番目に対応するもの（29−56、30番目のメチオニンを
含む)、配列表配列番号１に示す５７番目から８８番目
に対応するもの（57−88、71及び74番目のメチオニンを
含む) 及び配列表配列番号１に示す１０７番目から１１
９番目に対応するもの（107−119、111番目のメチオニ
ンを含む）の３種類で、未修飾成熟型ヒトＭＰ５２由来
のそれぞれのフラグメントの溶出時間が、順に７７分、
５８分、３６分付近であるのに対し、メチオニンアルキ
ル化成熟型ヒトＭＰ５２由来のフラグメントは、順に７
４分、４２分、３０分付近で、未修飾成熟型ヒトＭＰ５
２由来のフラグメントより早く溶出した。一方、これ以
外のメチオニンを含まないフラグメントの溶出時間は両
者で変化がなかった。また、アミノ酸組成分析におい
て、溶出時間に変化の見られたメチオニンアルキル化成
熟型ヒトＭＰ５２由来のメチオニンを含むフラグメント
のメチオニン数だけが理論値と違っていた。さらに、Ap
plied Biosystem社のシークエンサー（Model 476A）を
用い、これらフラグメントのＮ末シークエンス分析も行
ない、メチオニン残基特異的にアルキル化反応がおきて
いることが確認できた。
熟型ヒトＭＰ５２のトリプシン消化フラグメントの逆相
カラムにおける溶出パターンを比較することによって、
メチオニン残基のアルキル化の確認を行なった。実施例
１(３)と同様に、トリプシン消化の前に、ジチオスレイ
トールを用いてジスルフィド結合を還元後、システイン
残基をアルキル化する処理を行なった。ただし、メチオ
ニンのアルキル化反応にモノヨード酢酸を用いたＳ−カ
ルボキシメチル化を行なっているため、モノヨード酢酸
アミドを用いた実施例１と同様のＳ−カルボキシメチル
化ではなく、アルキル化試薬として４−vinyl pyridine
を用いたＳ−ピリジルエチル化を行なった。アルキル化
反応は、ｐＨ８.５においては還元したシステインにほ
ぼ選択的でメチオニンには殆ど起きないが、副反応があ
った場合に区別し得るためである。まず、凍結乾燥した
未修飾成熟型ヒトＭＰ５２及びメチオニンアルキル化成
熟型ヒトＭＰ５２を終濃度１mg／mlとなるように６Ｍ G
uanidine−HCl−０.４Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８.５
の溶液に溶かし、システイン残基の５０倍量のジチオス
レイトール（DTT）を加えて５０℃で３０分反応させ
た。ここに、システイン残基の２５０倍量の４−vinyl
pyridineを加え、遮光して３０分反応させた。この溶液
を、６Ｍ Guanidine−HCl−０.４Ｍトリス塩酸緩衝液、
ｐＨ８.５の溶液にて平衡化させてある脱塩用のゲルろ
過カラム（PD-10、ファルマシア）にかけ過剰の試薬を
除いた後、逆相ＨＰＬＣカラム（Cosmasil 10C18-300、
4.6mm I.D.×100mm、ナカライテスク）にて分離した。
分光光度計で、トリプトファンに由来する２８０nmにお
ける吸収とピリジンに由来する２５４nmにおける吸収を
併せ持つ分画を確認した。その後、実施例１(３)と同様
にトリプシン消化を行ない、消化フラグメントの分離を
行なった。次に、実施例１(３)と同様にして、アミノ酸
組成分析により各フラグメントの１次構造上の位置を決
定した。アミノ酸組成分析により１次構造上の位置が決
定された未修飾成熟型ヒトＭＰ５２及びメチオニンアル
キル化成熟型ヒトＭＰ５２の各トリプシンフラグメント
の逆相ＨＰＬＣカラムにおける溶出時間を比較した。メ
チオニン残基を含む成熟型ヒトＭＰ５２のトリプシンフ
ラグメントは、配列表配列番号１に示す２９番目から５
６番目に対応するもの（29−56、30番目のメチオニンを
含む)、配列表配列番号１に示す５７番目から８８番目
に対応するもの（57−88、71及び74番目のメチオニンを
含む) 及び配列表配列番号１に示す１０７番目から１１
９番目に対応するもの（107−119、111番目のメチオニ
ンを含む）の３種類で、未修飾成熟型ヒトＭＰ５２由来
のそれぞれのフラグメントの溶出時間が、順に７７分、
５８分、３６分付近であるのに対し、メチオニンアルキ
ル化成熟型ヒトＭＰ５２由来のフラグメントは、順に７
４分、４２分、３０分付近で、未修飾成熟型ヒトＭＰ５
２由来のフラグメントより早く溶出した。一方、これ以
外のメチオニンを含まないフラグメントの溶出時間は両
者で変化がなかった。また、アミノ酸組成分析におい
て、溶出時間に変化の見られたメチオニンアルキル化成
熟型ヒトＭＰ５２由来のメチオニンを含むフラグメント
のメチオニン数だけが理論値と違っていた。さらに、Ap
plied Biosystem社のシークエンサー（Model 476A）を
用い、これらフラグメントのＮ末シークエンス分析も行
ない、メチオニン残基特異的にアルキル化反応がおきて
いることが確認できた。
【００４７】実施例３ トリプトファン残基をアリール
スルフェニル化した成熟型ヒトＭＰ５２の作成 (１) ｐ−ニトロフェニルスルフェニルクロライドによ
る成熟型ヒトＭＰ５２のトリプトファン残基のアリール
スルフェニル化 ５０％酢酸に溶解した２mg／mlの濃度の未修飾成熟型ヒ
トＭＰ５２に、１００％酢酸に溶解したｐ−ニトロフェ
ニルスルフェニルクロライドを２０当量添加し、室温に
て１時間反応させた。 (２) アリールスルフェニル化成熟型ヒトＭＰ５２の分
離 逆相ＨＰＬＣにおける溶出の保持時間の違いにより分離
した。アリールスルフェニル化によって疎水性が増すこ
とから、アリールスルフェニル化成熟型ヒトＭＰ５２の
逆相ＨＰＬＣにおける溶出時間は、未修飾成熟型ヒトＭ
Ｐ５２に比べて遅くなる。分離条件は、以下の通りであ
る。使用カラム、流速、およびＨＰＬＣポンプは実施例
１(２)と同様で、カラム温度４０℃、ピーク検出波長と
して２１４nm及び３６５nmを用いた。溶媒は、Ａ液とし
て０.０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ液として０.０５％ＴＦ
Ａを含むアセトニトリルを用いて、Ｂ液２５％で５分間
維持した後、その後の３５分間でＢ液２５％から６０％
までの直線勾配で溶出を行った。この条件で、未修飾成
熟型ヒトＭＰ５２が２２分付近で溶出するのに対し、ト
リプトファンをアリールスルフェニル化した成熟型ヒト
ＭＰ５２は、これより遅く２６分付近で溶出し、両者は
容易に分離できた。 (３) トリプトファン残基のアリールスルフェニル化の
確認 実施例１に記した方法と同様の方法で、ジスルフィド結
合を還元後、システイン残基をアルキル化（Ｓ−カルボ
キシル化）した未修飾成熟型ヒトＭＰ５２及びトリプト
ファン残基のアリールスルフェニル化成熟型ヒトＭＰ５
２をトリプシン消化後Ｃ１８逆相カラムで消化フラグメ
ントを分離し、アミノ酸組成分析により各フラグメント
の１次構造上の位置を決定した。トリプトファン残基を
含む成熟型ヒトＭＰ５２のトリプシンフラグメントは、
配列表配列番号１に示す２９番目から５６番目に対応す
るもの（29−56、32番目及び35番目のトリプトファンを
含む）のみである。トリプトファン残基を含むトリプト
ファン残基のアリールスルフェニル化成熟型ヒトＭＰ５
２由来のフラグメントの溶出時間（95分付近）のみが、
未修飾成熟型ヒトＭＰ５２由来のフラグメントの溶出時
間（84分付近）に比べて遅くなっていた。一方、これ以
外のトリプトファンを含まないフラグメントの溶出時間
は両者で変化がなかった。また、Ｎ末シークエンス分析
によってもトリプトファンのみが未修飾と修飾成熟型ヒ
トＭＰ５２で違うことから確認できた。
スルフェニル化した成熟型ヒトＭＰ５２の作成 (１) ｐ−ニトロフェニルスルフェニルクロライドによ
る成熟型ヒトＭＰ５２のトリプトファン残基のアリール
スルフェニル化 ５０％酢酸に溶解した２mg／mlの濃度の未修飾成熟型ヒ
トＭＰ５２に、１００％酢酸に溶解したｐ−ニトロフェ
ニルスルフェニルクロライドを２０当量添加し、室温に
て１時間反応させた。 (２) アリールスルフェニル化成熟型ヒトＭＰ５２の分
離 逆相ＨＰＬＣにおける溶出の保持時間の違いにより分離
した。アリールスルフェニル化によって疎水性が増すこ
とから、アリールスルフェニル化成熟型ヒトＭＰ５２の
逆相ＨＰＬＣにおける溶出時間は、未修飾成熟型ヒトＭ
Ｐ５２に比べて遅くなる。分離条件は、以下の通りであ
る。使用カラム、流速、およびＨＰＬＣポンプは実施例
１(２)と同様で、カラム温度４０℃、ピーク検出波長と
して２１４nm及び３６５nmを用いた。溶媒は、Ａ液とし
て０.０５％ＴＦＡを含む水、Ｂ液として０.０５％ＴＦ
Ａを含むアセトニトリルを用いて、Ｂ液２５％で５分間
維持した後、その後の３５分間でＢ液２５％から６０％
までの直線勾配で溶出を行った。この条件で、未修飾成
熟型ヒトＭＰ５２が２２分付近で溶出するのに対し、ト
リプトファンをアリールスルフェニル化した成熟型ヒト
ＭＰ５２は、これより遅く２６分付近で溶出し、両者は
容易に分離できた。 (３) トリプトファン残基のアリールスルフェニル化の
確認 実施例１に記した方法と同様の方法で、ジスルフィド結
合を還元後、システイン残基をアルキル化（Ｓ−カルボ
キシル化）した未修飾成熟型ヒトＭＰ５２及びトリプト
ファン残基のアリールスルフェニル化成熟型ヒトＭＰ５
２をトリプシン消化後Ｃ１８逆相カラムで消化フラグメ
ントを分離し、アミノ酸組成分析により各フラグメント
の１次構造上の位置を決定した。トリプトファン残基を
含む成熟型ヒトＭＰ５２のトリプシンフラグメントは、
配列表配列番号１に示す２９番目から５６番目に対応す
るもの（29−56、32番目及び35番目のトリプトファンを
含む）のみである。トリプトファン残基を含むトリプト
ファン残基のアリールスルフェニル化成熟型ヒトＭＰ５
２由来のフラグメントの溶出時間（95分付近）のみが、
未修飾成熟型ヒトＭＰ５２由来のフラグメントの溶出時
間（84分付近）に比べて遅くなっていた。一方、これ以
外のトリプトファンを含まないフラグメントの溶出時間
は両者で変化がなかった。また、Ｎ末シークエンス分析
によってもトリプトファンのみが未修飾と修飾成熟型ヒ
トＭＰ５２で違うことから確認できた。
【００４８】実施例４ 骨誘導活性抑制の検定 本発明の成熟型蛋白質のＢＭＰ−２アンタゴニスト様作
用は、児玉ら（前述）によるマウス頭蓋冠から単一株化
された骨芽細胞様の性質を有するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞
株、および未分化細胞であるが、培養条件により骨芽細
胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞などに分化する多分化
能を持つＣ３Ｈ１０Ｔ1/2細胞株に添加培養することに
より検定された。本細胞株の培養は、多久和ら（前述）
による記載の方法に準じて行った。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細
胞株の場合、１cm2当たり５×１０3細胞の密度に調製さ
れた細胞を播き、１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培
地中で３日間前培養を行った。α−ＭＥＭ培地で細胞を
洗った後、０.３％牛血清アルブミンを含む無血清α−
ＭＥＭ培地に交換した。ここに種々の濃度の本発明の成
熟型蛋白質及び成熟型ｒｈ−ＢＭＰ−２（リコンビナン
トヒトＢＭＰ−２）を添加し、さらに３日間培養（後培
養）を行った。細胞中のＡＬＰａｓｅ活性は、ｐ−ニト
ロフェニルリン酸を基質として用いる比色法により定量
した。Ｃ３Ｈ１０Ｔ1/2細胞株の場合は、前培養に用い
た培地が１０％牛胎児血清を含むＢＭＥ培地であり、後
培地に用いた培地が２％牛胎児血清を含むＢＭＥ培地で
ある他は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株の条件と同様であ
る。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株中のＡＬＰａｓｅ活性につ
いて、実施例２において逆相ＨＰＬＣにおける保持時間
の違いにより得られたメチオニン残基アルキル化成熟型
ヒトＭＰ５２の各分画と未修飾成熟型ヒトＭＰ５２の逆
相分画とを比較した結果を図１に示す。図中の黒丸実線
は未修飾成熟型ヒトＭＰ５２の逆相分画を、黒四角実線
は１個のメチオニン残基がアルキル化されたもの、黒三
角破線は２個のメチオニン残基がアルキル化されたもの
を、白抜き丸実線は３個のメチオニン残基がアルキル化
されたものを、白抜き三角点線は４個のメチオニン残基
がアルキル化されたものをそれぞれ表わしている。Ｘ軸
の０上に示してある黒丸は、薬物を添加していない細胞
の活性を示している。図１に示すごとく、メチオニンの
アルキル化反応進行に連れ、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株中
のＡＬＰａｓｅ活性促進作用が減少した。図２は細胞株
の違いによるメチオニン残基を酸化した成熟型ヒトＭＰ
５２およびトリプトファン残基をアリールスルフェニル
化した成熟型ヒトＭＰ５２のアンタゴ二スト様活性を示
した図である。図２(Ａ)は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ1/2細胞株に
おける成熟型ｒｈ−ＢＭＰ−２に対するアンタゴ二スト
様活性、図２(Ｂ)は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株における
成熟型ヒトＭＰ５２に対するアンタゴ二スト様活性をそ
れぞれ表わしている。図中における黒丸実線トリプトフ
ァン残基をアリールスルフェニル化した成熟型ヒトＭＰ
５２を、白抜き丸点線はメチオニン残基を酸化した成熟
型ヒトＭＰ５２を、黒四角は図２(Ａ)ではメチオニン残
基を酸化した成熟型ヒトＭＰ５２未添加の３００ng／ml
の成熟型ｒｈ−ＢＭＰ−２単独のＡＬＰａｓｅ活性（C3
H10T1/2細胞株)、図２(Ｂ)では６００ng／mlの未修飾成
熟型ヒトＭＰ５２単独のＡＬＰａｓｅ活性（MC3T3-E1細
胞株)を示す。また、白抜き四角は薬物未添加の活性を
示している。図２(Ａ)に示すごとく、３００ng／mlの成
熟型ｒｈ−ＢＭＰ−２はＣ３Ｈ１０Ｔ1/2細胞株中のＡ
ＬＰａｓｅ活性を非添加対照群の約４０倍に上昇させ
た。本発明の成熟型ヒトＭＰ５２は１当量から２０当量
において用量依存的にそのＡＬＰａｓｅ活性の上昇を抑
制した。また、図２(Ｂ)に示すごとく、６００ng／mlの
未修飾成熟型ヒトＭＰ５２はＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株中
のＡＬＰａｓｅ活性を非添加対照群の約３倍に上昇させ
た。本発明のアミノ酸修飾成熟型ヒトＭＰ５２は１当量
から１０当量において用量依存的にそのＡＬＰａｓｅ活
性の上昇を抑制した。
用は、児玉ら（前述）によるマウス頭蓋冠から単一株化
された骨芽細胞様の性質を有するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞
株、および未分化細胞であるが、培養条件により骨芽細
胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞などに分化する多分化
能を持つＣ３Ｈ１０Ｔ1/2細胞株に添加培養することに
より検定された。本細胞株の培養は、多久和ら（前述）
による記載の方法に準じて行った。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細
胞株の場合、１cm2当たり５×１０3細胞の密度に調製さ
れた細胞を播き、１０％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培
地中で３日間前培養を行った。α−ＭＥＭ培地で細胞を
洗った後、０.３％牛血清アルブミンを含む無血清α−
ＭＥＭ培地に交換した。ここに種々の濃度の本発明の成
熟型蛋白質及び成熟型ｒｈ−ＢＭＰ−２（リコンビナン
トヒトＢＭＰ−２）を添加し、さらに３日間培養（後培
養）を行った。細胞中のＡＬＰａｓｅ活性は、ｐ−ニト
ロフェニルリン酸を基質として用いる比色法により定量
した。Ｃ３Ｈ１０Ｔ1/2細胞株の場合は、前培養に用い
た培地が１０％牛胎児血清を含むＢＭＥ培地であり、後
培地に用いた培地が２％牛胎児血清を含むＢＭＥ培地で
ある他は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株の条件と同様であ
る。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株中のＡＬＰａｓｅ活性につ
いて、実施例２において逆相ＨＰＬＣにおける保持時間
の違いにより得られたメチオニン残基アルキル化成熟型
ヒトＭＰ５２の各分画と未修飾成熟型ヒトＭＰ５２の逆
相分画とを比較した結果を図１に示す。図中の黒丸実線
は未修飾成熟型ヒトＭＰ５２の逆相分画を、黒四角実線
は１個のメチオニン残基がアルキル化されたもの、黒三
角破線は２個のメチオニン残基がアルキル化されたもの
を、白抜き丸実線は３個のメチオニン残基がアルキル化
されたものを、白抜き三角点線は４個のメチオニン残基
がアルキル化されたものをそれぞれ表わしている。Ｘ軸
の０上に示してある黒丸は、薬物を添加していない細胞
の活性を示している。図１に示すごとく、メチオニンの
アルキル化反応進行に連れ、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株中
のＡＬＰａｓｅ活性促進作用が減少した。図２は細胞株
の違いによるメチオニン残基を酸化した成熟型ヒトＭＰ
５２およびトリプトファン残基をアリールスルフェニル
化した成熟型ヒトＭＰ５２のアンタゴ二スト様活性を示
した図である。図２(Ａ)は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ1/2細胞株に
おける成熟型ｒｈ−ＢＭＰ−２に対するアンタゴ二スト
様活性、図２(Ｂ)は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株における
成熟型ヒトＭＰ５２に対するアンタゴ二スト様活性をそ
れぞれ表わしている。図中における黒丸実線トリプトフ
ァン残基をアリールスルフェニル化した成熟型ヒトＭＰ
５２を、白抜き丸点線はメチオニン残基を酸化した成熟
型ヒトＭＰ５２を、黒四角は図２(Ａ)ではメチオニン残
基を酸化した成熟型ヒトＭＰ５２未添加の３００ng／ml
の成熟型ｒｈ−ＢＭＰ−２単独のＡＬＰａｓｅ活性（C3
H10T1/2細胞株)、図２(Ｂ)では６００ng／mlの未修飾成
熟型ヒトＭＰ５２単独のＡＬＰａｓｅ活性（MC3T3-E1細
胞株)を示す。また、白抜き四角は薬物未添加の活性を
示している。図２(Ａ)に示すごとく、３００ng／mlの成
熟型ｒｈ−ＢＭＰ−２はＣ３Ｈ１０Ｔ1/2細胞株中のＡ
ＬＰａｓｅ活性を非添加対照群の約４０倍に上昇させ
た。本発明の成熟型ヒトＭＰ５２は１当量から２０当量
において用量依存的にそのＡＬＰａｓｅ活性の上昇を抑
制した。また、図２(Ｂ)に示すごとく、６００ng／mlの
未修飾成熟型ヒトＭＰ５２はＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株中
のＡＬＰａｓｅ活性を非添加対照群の約３倍に上昇させ
た。本発明のアミノ酸修飾成熟型ヒトＭＰ５２は１当量
から１０当量において用量依存的にそのＡＬＰａｓｅ活
性の上昇を抑制した。
【００４９】
【発明の効果】本発明の蛋白質は異所性骨化や動脈硬化
の症状の進行を抑える医薬品として利用できる。そのほ
かＢＭＰを発現している骨や軟骨の腫瘍の治療、ＯＰＬ
Ｌ以外の靭帯や骨周辺の軟部組織の骨化を防止するため
に使用することが可能である。また、骨代謝回転の高ま
っている状態、たとえばページェット病に対し使用する
ことにより、骨芽細胞の機能を低下させ症状の進行を抑
えられる。また、ＢＭＰから出発したペプチドや低分子
化合物で、ＢＭＰとその受容体の結合に競合するような
薬物のスクリーニングや評価系における試薬としても有
用である。
の症状の進行を抑える医薬品として利用できる。そのほ
かＢＭＰを発現している骨や軟骨の腫瘍の治療、ＯＰＬ
Ｌ以外の靭帯や骨周辺の軟部組織の骨化を防止するため
に使用することが可能である。また、骨代謝回転の高ま
っている状態、たとえばページェット病に対し使用する
ことにより、骨芽細胞の機能を低下させ症状の進行を抑
えられる。また、ＢＭＰから出発したペプチドや低分子
化合物で、ＢＭＰとその受容体の結合に競合するような
薬物のスクリーニングや評価系における試薬としても有
用である。
【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> Hoechst Marion Roussel Ltd. <120> BMP antagonist <130> <140> <141> <150> <151> <160> 4 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Human MP52 mature protein; 30th, 71st, 74th and 111th Met are modified to methionine sulfoxide, methionin sulfone, s-carboxymethyl (s-carboxamidemethyl) methionine or substituted to Glx, Asx, Lys His, Arg, Thr or Ser. 32nd and 34th Trp are modified to allylsulphenyl Trp or substituted to Glx, Asx, Lys His, Arg, Thr or Ser. <400> Pro Ser Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp 20 25 30 Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu 35 40 45 Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His 50 55 60 Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro 65 70 75 80 Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe 85 90 95 Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val 100 105 110 Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Human BMP-2 mature protein; 26th, 67st and 70th Val are substituted to Glx, Asx, Lys His, Arg, Thr or Ser. 28th and 31st Trp are modified to allylsulphenyl Trp or substituted to Glx, Asx, Lys, His, Arg, Thr or Ser. <400> Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg 1 5 10 15 His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile 20 25 30 Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro 35 40 45 Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln 50 55 60 Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val 65 70 75 80 Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu 85 90 95 Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly 100 105 110 Cys Arg <210> 3 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Human BMP-4 mature protein; 29th, 70st, 73rd Val are substituted to Glx, Asx, Lys His, Arg, Thr or Ser. 31st and 34th Trp are modified to allylsulphenyl Trp or substituted to Glx, Asx, Lys His, Arg, Thr or Ser. <400> Arg Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn 1 5 10 15 Cys Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn 20 25 30 Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr Cys His Gly 35 40 45 Asp Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala 50 55 60 Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala 65 70 75 80 Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Lys Tyr Leu Asp 85 90 95 Glu Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met Val Val Glu 100 105 110 Gly Cys Gly Cys Arg 115 <210> 4 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Human BMP-7 mature protein; 50th Leu, 91st Val and 94th Ile are substituted to Glx, Asx, Lys, His, Arg, Thr or Ser. 52nd and 55th Trp are modified to allylsulphenyl Trp or substituted to Glx, Asx, Lys His, Arg, Thr or Ser. <400> Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys 1 5 10 15 Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser 20 25 30 Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala 50 55 60 Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn 65 70 75 80 Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro 85 90 95 Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile 100 105 110 Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr 115 120 125 Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His 130 135
【図１】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株中のＡＬＰａｓｅ活性
について、逆相ＨＰＬＣにおける保持時間の違うメチオ
ニン残基をアルキル化した成熟型ヒトＭＰ５２の各分画
と未修飾成熟型ヒトＭＰ５２の逆相分画とを比較した図
である。図中の黒丸実線は未修飾成熟型ヒトＭＰ５２の
逆相分画を、黒四角実線は１個のメチオニン残基がアル
キル化されたもの、黒三角破線は２個のメチオニン残基
がアルキル化されたものを、白抜き丸実線は３個のメチ
オニン残基がアルキル化されたものを、白抜き三角点線
は４個のメチオニン残基がアルキル化されたものをそれ
ぞれ表わしている。Ｘ軸の０上に示してある黒丸は、薬
物を添加していない細胞の活性を示している。
について、逆相ＨＰＬＣにおける保持時間の違うメチオ
ニン残基をアルキル化した成熟型ヒトＭＰ５２の各分画
と未修飾成熟型ヒトＭＰ５２の逆相分画とを比較した図
である。図中の黒丸実線は未修飾成熟型ヒトＭＰ５２の
逆相分画を、黒四角実線は１個のメチオニン残基がアル
キル化されたもの、黒三角破線は２個のメチオニン残基
がアルキル化されたものを、白抜き丸実線は３個のメチ
オニン残基がアルキル化されたものを、白抜き三角点線
は４個のメチオニン残基がアルキル化されたものをそれ
ぞれ表わしている。Ｘ軸の０上に示してある黒丸は、薬
物を添加していない細胞の活性を示している。
【図２】細胞株の違いによるメチオニン残基を酸化した
成熟型ヒトＭＰ５２およびトリプトファン残基をアリー
ルスルフェニル化した成熟型ヒトＭＰ５２のアンタゴ二
スト様活性を示した図である。(Ａ)は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ1/
2細胞株における成熟型ｒｈ−ＢＭＰ−２に対するアン
タゴ二スト様活性、(Ｂ)は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株に
おける成熟型ヒトＭＰ５２に対するアンタゴ二スト様活
性をそれぞれ表わしている。図中における黒丸実線トリ
プトファン残基をアリールスルフェニル化した成熟型ヒ
トＭＰ５２を、白抜き丸点線はメチオニン残基を酸化し
た成熟型ヒトＭＰ５２を、黒四角は(Ａ)ではメチオニン
残基を酸化した成熟型ヒトＭＰ５２未添加の３００ng／
mlの成熟型ｒｈ−ＢＭＰ−２単独のＡＬＰａｓｅ活性
（C3H10T1/2細胞株)、(Ｂ)では６００ng／mlの未修飾成
熟型ヒトＭＰ５２単独のＡＬＰａｓｅ活性（MC3T3-E1細
胞株）を示す。また、白抜き四角は薬物未添加の活性を
示している。
成熟型ヒトＭＰ５２およびトリプトファン残基をアリー
ルスルフェニル化した成熟型ヒトＭＰ５２のアンタゴ二
スト様活性を示した図である。(Ａ)は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ1/
2細胞株における成熟型ｒｈ−ＢＭＰ−２に対するアン
タゴ二スト様活性、(Ｂ)は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株に
おける成熟型ヒトＭＰ５２に対するアンタゴ二スト様活
性をそれぞれ表わしている。図中における黒丸実線トリ
プトファン残基をアリールスルフェニル化した成熟型ヒ
トＭＰ５２を、白抜き丸点線はメチオニン残基を酸化し
た成熟型ヒトＭＰ５２を、黒四角は(Ａ)ではメチオニン
残基を酸化した成熟型ヒトＭＰ５２未添加の３００ng／
mlの成熟型ｒｈ−ＢＭＰ−２単独のＡＬＰａｓｅ活性
（C3H10T1/2細胞株)、(Ｂ)では６００ng／mlの未修飾成
熟型ヒトＭＰ５２単独のＡＬＰａｓｅ活性（MC3T3-E1細
胞株）を示す。また、白抜き四角は薬物未添加の活性を
示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4C084 AA07 BA01 BA21 BA22 BA44 DB70 MA44 MA66 ZA962 ZC212 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA20 EA23 EA27 EA28 FA52 GA25
Claims (10)
- 【請求項１】 成熟型ヒトＭＰ５２のアミノ酸配列中に
存在するメチオニン残基もしくはトリプトファン残基の
うちの少なくとも１個の残基を化学修飾により親水性残
基に変換するか、あるいは該残基を親水性アミノ酸残基
もしくは極性アミノ酸残基で置換することにより得られ
る骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋白
質。 - 【請求項２】 前記メチオニン残基の化学修飾が酸化で
ある請求項１記載の成熟型蛋白質。 - 【請求項３】 前記メチオニン残基の化学修飾がアルキ
ル化である請求項１記載の成熟型蛋白質。 - 【請求項４】 前記トリプトファン残基の化学修飾がア
リールスルフェニル化である請求項１記載の成熟型蛋白
質。 - 【請求項５】 前記成熟型ヒトＭＰ５２が配列表配列番
号１に示すアミノ酸配列を有する蛋白質の二量体である
請求項１乃至４に記載の成熟型蛋白質。 - 【請求項６】 成熟型ヒトＢＭＰ−２、成熟型ヒトＢＭ
Ｐ−４または成熟型ヒトＢＭＰ−７のアミノ酸配列中に
存在するトリプトファン残基の少なくとも１個の残基
を、化学修飾により親水性残基に変換するか、あるいは
該残基を親水性アミノ酸残基もしくは極性アミノ酸残基
で置換することにより得られる骨誘導因子アンタゴニス
ト活性を有する成熟型蛋白質。 - 【請求項７】 成熟型ヒトＢＭＰ−２、成熟型ヒトＢＭ
Ｐ−４または成熟型ヒトＢＭＰ−７のアミノ酸配列にお
いて、その受容体結合部位を構成する疎水性アミノ酸残
基のうち、成熟型ヒトＭＰ５２のアミノ酸配列の３０番
目、７１番目および７４番目に位置するメチオニン残基
に相当する位置の３個の疎水性アミノ酸残基のうち少な
くとも１個のアミノ酸残基を親水性アミノ酸残基もしく
は極性アミノ酸残基で置換することにより得られる骨誘
導因子アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋白質。 - 【請求項８】 前記成熟型ヒトＢＭＰ−２、成熟型ヒト
ＢＭＰ−４または成熟型ヒトＢＭＰ−７がそれぞれ配列
表配列番号２、３または４に示すアミノ酸配列を有する
蛋白質の二量体である請求項６または７に記載の成熟型
蛋白質。 - 【請求項９】 請求項１乃至８のいずれかの項に記載の
骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋白質を
有効成分とする異所性骨化の治療または予防剤。 - 【請求項１０】 請求項１乃至８のいずれかの項に記載
の骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋白質
を有効成分とする石灰沈着を伴う代謝性疾患の治療また
は予防剤。
Priority Applications (11)
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|---|---|---|---|
| JP10288103A JP2000119192A (ja) | 1998-10-09 | 1998-10-09 | 骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋白質 |
| DK99944750.1T DK1117689T3 (da) | 1998-10-09 | 1999-10-04 | Knoglemorfogenese-proteinantagonist baseret på det modne protein |
| ES99944750T ES2382992T3 (es) | 1998-10-09 | 1999-10-04 | Antagonistas de la proteína morfogenética ósea basados en la proteína madura |
| PT99944750T PT1117689E (pt) | 1998-10-09 | 1999-10-04 | Antagonista de proteína morfogenética do osso baseada na proteína madura |
| PCT/IB1999/001621 WO2000021998A1 (en) | 1998-10-09 | 1999-10-04 | Bone morphogenetic protein antagonist based on the mature protein |
| US09/806,368 US7132397B1 (en) | 1998-10-09 | 1999-10-04 | Bone morphogenetic protein antagonist based on the mature protein |
| CA2345201A CA2345201C (en) | 1998-10-09 | 1999-10-04 | Mature protein having antagonistic activity against bone morphogenetic protein |
| AU57560/99A AU5756099A (en) | 1998-10-09 | 1999-10-04 | Bone morphogenetic protein antagonist based on the mature protein |
| EP99944750A EP1117689B1 (en) | 1998-10-09 | 1999-10-04 | Bone morphogenetic protein antagonists based on the mature protein |
| AT99944750T ATE551359T1 (de) | 1998-10-09 | 1999-10-04 | Knochenmorphogeneseprotein antagoniste basierend auf dem maturen protein |
| CY20121100513T CY1112822T1 (el) | 1998-10-09 | 2012-06-06 | Ανταγωνιστης μορφογενετικων πρωτεϊνων οστων με βαση την ωριμη πρωτεϊνη |
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| JP10288103A JP2000119192A (ja) | 1998-10-09 | 1998-10-09 | 骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋白質 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=17725844
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10288103A Pending JP2000119192A (ja) | 1998-10-09 | 1998-10-09 | 骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋白質 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1117689B1 (ja) |
| JP (1) | JP2000119192A (ja) |
| AT (1) | ATE551359T1 (ja) |
| AU (1) | AU5756099A (ja) |
| CA (1) | CA2345201C (ja) |
| CY (1) | CY1112822T1 (ja) |
| DK (1) | DK1117689T3 (ja) |
| ES (1) | ES2382992T3 (ja) |
| PT (1) | PT1117689E (ja) |
| WO (1) | WO2000021998A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008538315A (ja) * | 2005-04-12 | 2008-10-23 | ウォーソー・オーソペディック・インコーポレーテッド | 関節形成性人工円板の運動能力を保存する方法およびデバイス |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6586388B2 (en) | 1988-04-08 | 2003-07-01 | Stryker Corporation | Method of using recombinant osteogenic protein to repair bone or cartilage defects |
| CA2104678C (en) | 1991-03-11 | 2002-05-14 | Charles M. Cohen | Protein-induced morphogenesis |
| US7811793B2 (en) | 1996-12-25 | 2010-10-12 | Biopharma Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh | Process for preparing purified active monomer of bone-derived factor |
| DE10026713A1 (de) * | 2000-05-30 | 2001-12-06 | Walter Sebald | Mutein einer Kette eines Proteins aus der Superfamilie des Wachstumsfaktors TGF-beta |
| PL1948689T3 (pl) * | 2005-11-18 | 2012-09-28 | Biopharm Ges Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh | Mutanty czynników wzrostu o wysokiej aktywności |
| US8075562B2 (en) * | 2007-06-25 | 2011-12-13 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Controlled release of biopharmaceutical growth factors from hydroxyapatite coating on bioresorbable interference screws used in cruciate ligament reconstruction surgery |
| EP2602264A1 (en) | 2011-12-05 | 2013-06-12 | Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka mbH | GDF-5 mutant for inducing cartilage formation |
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|---|---|---|---|---|
| EP0691349A3 (en) * | 1994-07-04 | 1997-09-10 | Hoechst Japan | Morphogenetic dimeric proteins of bone origin and their fragments and anologues and pharmaceutical compositions containing them |
-
1998
- 1998-10-09 JP JP10288103A patent/JP2000119192A/ja active Pending
-
1999
- 1999-10-04 PT PT99944750T patent/PT1117689E/pt unknown
- 1999-10-04 AT AT99944750T patent/ATE551359T1/de active
- 1999-10-04 DK DK99944750.1T patent/DK1117689T3/da active
- 1999-10-04 EP EP99944750A patent/EP1117689B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-04 ES ES99944750T patent/ES2382992T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-10-04 AU AU57560/99A patent/AU5756099A/en not_active Abandoned
- 1999-10-04 WO PCT/IB1999/001621 patent/WO2000021998A1/en active Application Filing
- 1999-10-04 CA CA2345201A patent/CA2345201C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-10-04 US US09/806,368 patent/US7132397B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-06-06 CY CY20121100513T patent/CY1112822T1/el unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008538315A (ja) * | 2005-04-12 | 2008-10-23 | ウォーソー・オーソペディック・インコーポレーテッド | 関節形成性人工円板の運動能力を保存する方法およびデバイス |
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| ATE551359T1 (de) | 2012-04-15 |
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| US7132397B1 (en) | 2006-11-07 |
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