JPH08176191A - 合成ペプチド誘導体または、その塩 - Google Patents
合成ペプチド誘導体または、その塩Info
- Publication number
- JPH08176191A JPH08176191A JP7200175A JP20017595A JPH08176191A JP H08176191 A JPH08176191 A JP H08176191A JP 7200175 A JP7200175 A JP 7200175A JP 20017595 A JP20017595 A JP 20017595A JP H08176191 A JPH08176191 A JP H08176191A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bmp
- group
- amino acid
- peptide
- peptide derivative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、薬理活性をもつ新規な合成ペプチ
ド誘導体に関する。 【構成】 本発明は、以下の一般式 Ｐ１−Ｒ１−Ｐ２ （式中、Ｐ１は配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有
するペプチド又はこれらのアナログを、Ｐ２は配列表の
配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド又はこれら
のアナログを、Ｐ１は前記ペプチド類Ｐ１、Ｐ２のＮ末
端に結合するリンカーを示すし、Ｒ１は前記ペプチドセ
グメントＰ１、Ｐ２の活性に干渉することのないよう調
製されたリンカー群であればよい。）で示されるペプチ
ド誘導体又はその製薬学的に許容し得る塩に関する。さ
らに本発明は、これらのペプチド誘導体又はその製薬学
的に許容し得る塩からなる骨誘導因子アンタゴニスト様
活性を有する医薬に関する。 【効果】 異所性骨形成又は石灰沈着を伴う骨代謝性疾
患の症状を抑える医薬品の開発にとして利用することが
できる。ＢＭＰとその受容体の結合に競合するような薬
物のスクリーニングや評価系における試薬としても有用
である。
ド誘導体に関する。 【構成】 本発明は、以下の一般式 Ｐ１−Ｒ１−Ｐ２ （式中、Ｐ１は配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有
するペプチド又はこれらのアナログを、Ｐ２は配列表の
配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド又はこれら
のアナログを、Ｐ１は前記ペプチド類Ｐ１、Ｐ２のＮ末
端に結合するリンカーを示すし、Ｒ１は前記ペプチドセ
グメントＰ１、Ｐ２の活性に干渉することのないよう調
製されたリンカー群であればよい。）で示されるペプチ
ド誘導体又はその製薬学的に許容し得る塩に関する。さ
らに本発明は、これらのペプチド誘導体又はその製薬学
的に許容し得る塩からなる骨誘導因子アンタゴニスト様
活性を有する医薬に関する。 【効果】 異所性骨形成又は石灰沈着を伴う骨代謝性疾
患の症状を抑える医薬品の開発にとして利用することが
できる。ＢＭＰとその受容体の結合に競合するような薬
物のスクリーニングや評価系における試薬としても有用
である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、薬理活性をもつ新規な
合成ペプチド誘導体又はその塩に関する。本発明の合成
ペプチド誘導体又はその塩は、骨誘導因子アンタゴニス
ト様活性を示し、骨誘導因子アンタゴニスト活性を有す
る。本発明は、異所性石灰沈着、異所性骨形成又は石灰
沈着を伴う骨代謝性疾患、例えば、神経性骨化症、手術
侵襲よる異所性骨化、外傷性骨化性筋炎、酸素供給不足
による骨化、骨原性腫瘤、後縦靭帯骨化症、動脈硬化等
の治療、予防に有用な骨誘導因子拮抗剤にも関する。
合成ペプチド誘導体又はその塩に関する。本発明の合成
ペプチド誘導体又はその塩は、骨誘導因子アンタゴニス
ト様活性を示し、骨誘導因子アンタゴニスト活性を有す
る。本発明は、異所性石灰沈着、異所性骨形成又は石灰
沈着を伴う骨代謝性疾患、例えば、神経性骨化症、手術
侵襲よる異所性骨化、外傷性骨化性筋炎、酸素供給不足
による骨化、骨原性腫瘤、後縦靭帯骨化症、動脈硬化等
の治療、予防に有用な骨誘導因子拮抗剤にも関する。
【０００２】
【従来の技術】骨誘導因子（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇ
ｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ：以降ＢＭＰと呼ぶ）
は、脱灰骨組織に含有される骨誘導活性を有する蛋白質
である。１９７０年代から精力的にＢＭＰの精製が試み
られてきたが、単一の蛋白質としての分離には到ってい
ない。１９８９年にウォズニー（Ｗｏｚｎｅｙ）らはＢ
ＭＰ活性のある画分を酵素処理して未知のペプチドを分
離してそのアミノ酸配列を手がかりに分子生物学的手法
により、ＢＭＰと考えられる遺伝子のクローニングに成
功した。この遺伝子は直ちに動物培養細胞に導入され、
発現した蛋白質の活性がインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で
測定され、この蛋白質にＢＭＰ活性が確かにあることが
証明された（Ｗａｎｇ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９
９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ，ｖｏｌ．８７，ｐ．２２２０−２２２４）。引き続
きホモロジーを利用した類似活性を有する蛋白質のクロ
ーニングが行われ、現在までＢＭＰ−２からＢＭＰ−９
まで複数の蛋白質が確認されている。これらの蛋白質は
いずれもＴＧＦ−βジーンスーパーファミリーに属し、
基本的にｉｎ ｖｉｖｏで異所性骨形成を引き起こす活
性を有することが確認されている。ＢＭＰによる骨形成
は内軟骨性といわれており、胎生期の長骨の形成を再現
するものと考えられている。したがって、ＢＭＰそのも
のは骨欠損部を補う形での治療薬として利用し得るもの
である。
ｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ：以降ＢＭＰと呼ぶ）
は、脱灰骨組織に含有される骨誘導活性を有する蛋白質
である。１９７０年代から精力的にＢＭＰの精製が試み
られてきたが、単一の蛋白質としての分離には到ってい
ない。１９８９年にウォズニー（Ｗｏｚｎｅｙ）らはＢ
ＭＰ活性のある画分を酵素処理して未知のペプチドを分
離してそのアミノ酸配列を手がかりに分子生物学的手法
により、ＢＭＰと考えられる遺伝子のクローニングに成
功した。この遺伝子は直ちに動物培養細胞に導入され、
発現した蛋白質の活性がインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で
測定され、この蛋白質にＢＭＰ活性が確かにあることが
証明された（Ｗａｎｇ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９
９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ，ｖｏｌ．８７，ｐ．２２２０−２２２４）。引き続
きホモロジーを利用した類似活性を有する蛋白質のクロ
ーニングが行われ、現在までＢＭＰ−２からＢＭＰ−９
まで複数の蛋白質が確認されている。これらの蛋白質は
いずれもＴＧＦ−βジーンスーパーファミリーに属し、
基本的にｉｎ ｖｉｖｏで異所性骨形成を引き起こす活
性を有することが確認されている。ＢＭＰによる骨形成
は内軟骨性といわれており、胎生期の長骨の形成を再現
するものと考えられている。したがって、ＢＭＰそのも
のは骨欠損部を補う形での治療薬として利用し得るもの
である。
【０００３】一方、ＢＭＰ遺伝子が明らかにされ、その
特異的抗体が作成されるようになってから、今日まで治
療法がなかった異所性石灰化、異所性骨化症等の発症部
位にもＢＭＰが発現しており、これらの発症にＢＭＰが
関与している可能性が示されるようになってきた。例え
ば、神経性骨化症、手術侵襲よる異所性骨化、外傷性骨
化性筋炎、酸素供給不足による骨化、骨原性腫瘤、特定
疾患（難病）に指定されている後縦靭帯骨化症（ｏｓｓ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｔｅｒｉｏ
ｒ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ：以
降ＯＰＬＬと呼ぶ）（Ｓｐｉｎｅ，１７−３Ｓ，Ｓ３
３，１９９２）や、動脈硬化石灰化部位（Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，ｖｏｌ．９１，ｐ．１８００，１
９９３）に、ＢＭＰが発現したり含有されたりしている
ことが近年明らかにされている。また、偽悪性転位骨化
症（ｐｓｅｕｄｏｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｅｔｅｒｏｔ
ｏｐｉｃ ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ：以降ＰＨＯと呼
ぶ）、偽悪性骨性腫瘍（ｐｓｅｕｄｏｍａｌｉｇｎａｎ
ｔ ｏｓｓｅｏｕ ｔｕｍｏｒ）、限局性骨化性筋炎
（ｍｙｏｓｉｓｔｉｓ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ ｃｉｒ
ｃｕｍｓｃｒｉｐｔａ）などは痛みを伴い、筋肉内に硬
組織の塊の出現が主な症状である。これらの疾患の詳細
な原因は未だ不明であるが、ＢＭＰが患者の筋肉内の硬
組織の出現に関与するものと考えられている。これら
は、本来は発現しないはずの組織でＢＭＰが発現し、オ
ートクライン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）に作用して骨様の
硬組織が形成されるものと考えられている。
特異的抗体が作成されるようになってから、今日まで治
療法がなかった異所性石灰化、異所性骨化症等の発症部
位にもＢＭＰが発現しており、これらの発症にＢＭＰが
関与している可能性が示されるようになってきた。例え
ば、神経性骨化症、手術侵襲よる異所性骨化、外傷性骨
化性筋炎、酸素供給不足による骨化、骨原性腫瘤、特定
疾患（難病）に指定されている後縦靭帯骨化症（ｏｓｓ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｔｅｒｉｏ
ｒ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ：以
降ＯＰＬＬと呼ぶ）（Ｓｐｉｎｅ，１７−３Ｓ，Ｓ３
３，１９９２）や、動脈硬化石灰化部位（Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，ｖｏｌ．９１，ｐ．１８００，１
９９３）に、ＢＭＰが発現したり含有されたりしている
ことが近年明らかにされている。また、偽悪性転位骨化
症（ｐｓｅｕｄｏｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｅｔｅｒｏｔ
ｏｐｉｃ ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ：以降ＰＨＯと呼
ぶ）、偽悪性骨性腫瘍（ｐｓｅｕｄｏｍａｌｉｇｎａｎ
ｔ ｏｓｓｅｏｕ ｔｕｍｏｒ）、限局性骨化性筋炎
（ｍｙｏｓｉｓｔｉｓ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ ｃｉｒ
ｃｕｍｓｃｒｉｐｔａ）などは痛みを伴い、筋肉内に硬
組織の塊の出現が主な症状である。これらの疾患の詳細
な原因は未だ不明であるが、ＢＭＰが患者の筋肉内の硬
組織の出現に関与するものと考えられている。これら
は、本来は発現しないはずの組織でＢＭＰが発現し、オ
ートクライン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）に作用して骨様の
硬組織が形成されるものと考えられている。
【０００４】ＯＰＬＬについては現在のところ有効な治
療法もなく、圧迫性の神経症状が重度であれば外科的に
切除を試みるが、予後は必ずしも良いものではない。ま
た、動脈の石灰化にしても治療法はない。ＢＭＰの発現
を抑制することが、これらの病変の治療の主要な手段の
一つと推察されるが、それ以外に、例えば、ＢＭＰアン
タゴニスト（拮抗剤）の投与も有効と考えられる。
療法もなく、圧迫性の神経症状が重度であれば外科的に
切除を試みるが、予後は必ずしも良いものではない。ま
た、動脈の石灰化にしても治療法はない。ＢＭＰの発現
を抑制することが、これらの病変の治療の主要な手段の
一つと推察されるが、それ以外に、例えば、ＢＭＰアン
タゴニスト（拮抗剤）の投与も有効と考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】したがって、上記の骨
様組織の形成に関連する疾患に対する有効な治療剤が切
望されていた。ＢＭＰアンタゴニスト様活性をもつもの
としてはＢＭＰ受容体やＢＭＰに対する中和抗体とＢＭ
Ｐの結合部位に対応するペプチドなどが考えられる。本
発明はこの考え方に基づき上記の骨関連疾患に有効な新
規な合成ペプチド誘導体を提供することである。
様組織の形成に関連する疾患に対する有効な治療剤が切
望されていた。ＢＭＰアンタゴニスト様活性をもつもの
としてはＢＭＰ受容体やＢＭＰに対する中和抗体とＢＭ
Ｐの結合部位に対応するペプチドなどが考えられる。本
発明はこの考え方に基づき上記の骨関連疾患に有効な新
規な合成ペプチド誘導体を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】従来からＢＭＰの構造活
性相関について種々の検討がなされているが成熟型ＢＭ
Ｐ−２のどの部分が受容体との結合に関与するか知られ
ておらず、受容体との結合能を有するＢＭＰ−２部分ペ
プチドについても知られていない。本発明者らは、受容
体の結合部位に結合してＢＭＰアンタゴニストとして働
くペプチドを設計する目的でＢＭＰ−２と相同な蛋白質
であるＴＧＦ−β２立体構造をもとに、ＢＭＰ−２の立
体構造を類推し、受容体結合部位を推定した。
性相関について種々の検討がなされているが成熟型ＢＭ
Ｐ−２のどの部分が受容体との結合に関与するか知られ
ておらず、受容体との結合能を有するＢＭＰ−２部分ペ
プチドについても知られていない。本発明者らは、受容
体の結合部位に結合してＢＭＰアンタゴニストとして働
くペプチドを設計する目的でＢＭＰ−２と相同な蛋白質
であるＴＧＦ−β２立体構造をもとに、ＢＭＰ−２の立
体構造を類推し、受容体結合部位を推定した。
【０００７】ＢＭＰの活性型はダイマーであること、及
び、受容体結合部位は蛋白質分子の外側に露出した部分
であると考えられることから、ＢＭＰ−２がダイマーを
形成したときに隣接する２つのペプチド領域（ＢＭＰ−
２の成熟型での各分子中の各々残基番号で２２番目のＡ
ｓｐから３８番目のＴｙｒと６１番目のＡｌａから７７
番目のＡｌａまで）が受容体結合部位を形成していると
推定した。この推定に基づき、これらの２つのペプチド
を両端にカルボキシル基を有するリンカーで結合させた
本発明のペプチド誘導体を設計した。好適なリンカーと
しては、類推されたＢＭＰ−２の立体構造に類似した構
造のペプチド誘導体を構成するような二価の有機基であ
る。
び、受容体結合部位は蛋白質分子の外側に露出した部分
であると考えられることから、ＢＭＰ−２がダイマーを
形成したときに隣接する２つのペプチド領域（ＢＭＰ−
２の成熟型での各分子中の各々残基番号で２２番目のＡ
ｓｐから３８番目のＴｙｒと６１番目のＡｌａから７７
番目のＡｌａまで）が受容体結合部位を形成していると
推定した。この推定に基づき、これらの２つのペプチド
を両端にカルボキシル基を有するリンカーで結合させた
本発明のペプチド誘導体を設計した。好適なリンカーと
しては、類推されたＢＭＰ−２の立体構造に類似した構
造のペプチド誘導体を構成するような二価の有機基であ
る。
【０００８】本発明の合成ペプチド誘導体は次式、 Ｐ１−Ｒ１−Ｐ２ 示される。式中、Ｐ１は配列表の配列番号１のアミノ酸
配列を有するペプチド又はこれらのアナログを、Ｐ２は
配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド又
はこれらのアナログを、Ｒ１は各々のペプチドＰ１、Ｐ
２のＮ末端を結合するリンカーを示す。リンカーＲ１は
前記ペプチドセグメントＰ１、Ｐ２の活性に干渉するこ
とのないよう調製された前記ペプチドセグメントを結合
するものであればよい。
配列を有するペプチド又はこれらのアナログを、Ｐ２は
配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド又
はこれらのアナログを、Ｒ１は各々のペプチドＰ１、Ｐ
２のＮ末端を結合するリンカーを示す。リンカーＲ１は
前記ペプチドセグメントＰ１、Ｐ２の活性に干渉するこ
とのないよう調製された前記ペプチドセグメントを結合
するものであればよい。
【０００９】好適なリンカーとしては、例えば、次式化
学式１で示されるマレイン酸イミド基を有するリンカー
又は次式化学式２で示されるジスルフィド基を有するリ
ンカー等が挙げられる。
学式１で示されるマレイン酸イミド基を有するリンカー
又は次式化学式２で示されるジスルフィド基を有するリ
ンカー等が挙げられる。
【００１０】
【化１】又は
【００１１】
【化２】（式中、Ｒ２はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ６の
アルキレン、Ｃ６〜Ｃ９のシクロアルキルアルキレン、
又は、Ｃ７〜Ｃ９のフェニルアルキレンを示し、Ｒ３は
水素、アルキル、アリール、アルカノイルアミノ、又
は、アリーロイルアミノのいずれかを示す。） 前記式で示されるリンカーＲ１中の基Ｒ２におけるＣ１
〜Ｃ６のアルキレンとしては、例えばメチレン、エチレ
ン、プロピレン、ブチレンなどを挙げることができ、Ｃ
６〜Ｃ９のシクロアルキルアルキレンとしては、例えば
シクロヘキシルメチレン−４−イル、シクロヘキシルエ
チレン−３−イルなどを挙げることができ、Ｃ７〜Ｃ９
のフェニルアルキレンとしては、例えばフェニルメチレ
ン、フェニルエチレンなどを挙げることができるが、メ
チレン基、メチレン−４−シクロヘキシル基などが特に
好ましい。前記式で示されるリンカーＲ１中の基Ｒ３に
おけるアルキルとしては直鎖又は分枝したものが挙げら
れ、好ましくは炭素数１〜１０の低級アルキル基、より
好ましくは炭素数１〜５の低級アルキル基を挙げること
ができ、さらに具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プ
ロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル
基、などを挙げることができる。アリール基としては単
環式のものや多環式のものや、環中に異項原子を有する
ものや、低級アルキルなどの鎖状の原子鎖を介して結合
するもの（例えば、ベンジル基などのアリールアルキル
基）、又は環中に置換基を有するものなどが挙げられ、
好ましくは炭素数６〜１２のアリール基、より好ましく
は炭素数６〜１０のアリール基を挙げることでき、さら
に具体的にはフェニル基、ナフチル基などを挙げること
ができる。アルカノイルアミノ基としては、直鎖若しく
は分枝した脂肪酸又は置換された脂肪酸から誘導される
アシル基でアシル化されたアミノ基が挙げられ、好まし
くは炭素数１〜１０のアルカノイルアミノ基、より好ま
しくは炭素数１〜５のアルカノイルアミノ基を挙げるこ
とができ、さらに具体的にはアセチルアミノ基、プロピ
オニルアミノ基などを挙げることができる。アリーロイ
ルアミノ基としては、アリール基を有するカルボン酸か
ら誘導されるアシル基でアシル化されたアミノ基又はア
リールカルボン酸から誘導されるアシル基でアシル化さ
れたアミノ基が挙げられ、好ましくは炭素数７〜１３の
アリーロイルアミノ基、より好ましくは炭素数７〜１１
のアリーロイルアミノ基を挙げることができ、さらに具
体的にはベンゾイルアミノ基などを挙げることができ
る。基Ｒ３は、アルカノイルアミノ基が好ましく、より
具体的にはアセチルアミノ基が好ましい。
アルキレン、Ｃ６〜Ｃ９のシクロアルキルアルキレン、
又は、Ｃ７〜Ｃ９のフェニルアルキレンを示し、Ｒ３は
水素、アルキル、アリール、アルカノイルアミノ、又
は、アリーロイルアミノのいずれかを示す。） 前記式で示されるリンカーＲ１中の基Ｒ２におけるＣ１
〜Ｃ６のアルキレンとしては、例えばメチレン、エチレ
ン、プロピレン、ブチレンなどを挙げることができ、Ｃ
６〜Ｃ９のシクロアルキルアルキレンとしては、例えば
シクロヘキシルメチレン−４−イル、シクロヘキシルエ
チレン−３−イルなどを挙げることができ、Ｃ７〜Ｃ９
のフェニルアルキレンとしては、例えばフェニルメチレ
ン、フェニルエチレンなどを挙げることができるが、メ
チレン基、メチレン−４−シクロヘキシル基などが特に
好ましい。前記式で示されるリンカーＲ１中の基Ｒ３に
おけるアルキルとしては直鎖又は分枝したものが挙げら
れ、好ましくは炭素数１〜１０の低級アルキル基、より
好ましくは炭素数１〜５の低級アルキル基を挙げること
ができ、さらに具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プ
ロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル
基、などを挙げることができる。アリール基としては単
環式のものや多環式のものや、環中に異項原子を有する
ものや、低級アルキルなどの鎖状の原子鎖を介して結合
するもの（例えば、ベンジル基などのアリールアルキル
基）、又は環中に置換基を有するものなどが挙げられ、
好ましくは炭素数６〜１２のアリール基、より好ましく
は炭素数６〜１０のアリール基を挙げることでき、さら
に具体的にはフェニル基、ナフチル基などを挙げること
ができる。アルカノイルアミノ基としては、直鎖若しく
は分枝した脂肪酸又は置換された脂肪酸から誘導される
アシル基でアシル化されたアミノ基が挙げられ、好まし
くは炭素数１〜１０のアルカノイルアミノ基、より好ま
しくは炭素数１〜５のアルカノイルアミノ基を挙げるこ
とができ、さらに具体的にはアセチルアミノ基、プロピ
オニルアミノ基などを挙げることができる。アリーロイ
ルアミノ基としては、アリール基を有するカルボン酸か
ら誘導されるアシル基でアシル化されたアミノ基又はア
リールカルボン酸から誘導されるアシル基でアシル化さ
れたアミノ基が挙げられ、好ましくは炭素数７〜１３の
アリーロイルアミノ基、より好ましくは炭素数７〜１１
のアリーロイルアミノ基を挙げることができ、さらに具
体的にはベンゾイルアミノ基などを挙げることができ
る。基Ｒ３は、アルカノイルアミノ基が好ましく、より
具体的にはアセチルアミノ基が好ましい。
【００１２】本発明におけるリンカーの好ましい例とし
ては、次式で示される、
ては、次式で示される、
【化３】
【００１３】
【化４】 などを挙げることができる。
【００１４】また、各ペプチドＰ１，Ｐ２におけるこれ
らのアナログとは、そのアミノ酸配列が１個又はそれ以
上のアミノ酸の置換、削除、付加によって修飾されたも
のをいう。したがって、これらのアナログは、本発明の
合成ペプチド誘導体のアミノ酸配列を、その部分配列と
して蛋白質中の一部分に持つ蛋白質を含むことは当然で
ある。更にこれらのアナログは、本発明の合成ペプチド
誘導体の主要な性質を保持する程度にこれらのアミノ酸
配列の主要な性質を持った蛋白質とも定義される。この
ような蛋白質としては、本発明のペプチドのいずれか一
方又は両者のアミノ酸配列のうちの少なくとも８５％以
上、好ましくは９０％以上のアミノ酸を、その部分配列
中に共通して有している蛋白質などを例として挙げるこ
とができる。
らのアナログとは、そのアミノ酸配列が１個又はそれ以
上のアミノ酸の置換、削除、付加によって修飾されたも
のをいう。したがって、これらのアナログは、本発明の
合成ペプチド誘導体のアミノ酸配列を、その部分配列と
して蛋白質中の一部分に持つ蛋白質を含むことは当然で
ある。更にこれらのアナログは、本発明の合成ペプチド
誘導体の主要な性質を保持する程度にこれらのアミノ酸
配列の主要な性質を持った蛋白質とも定義される。この
ような蛋白質としては、本発明のペプチドのいずれか一
方又は両者のアミノ酸配列のうちの少なくとも８５％以
上、好ましくは９０％以上のアミノ酸を、その部分配列
中に共通して有している蛋白質などを例として挙げるこ
とができる。
【００１５】本発明のこれらのアナログとしては、アミ
ノ酸配列の修飾によってその性質が改良されたミュータ
ントと称されるものも含んでいる。本発明の合成ペプチ
ド誘導体およびアナログは、他の蛋白質と融合させて融
合蛋白質とすることができる。したがって、本発明はこ
のような融合蛋白質をもカバーする。さらにこれらのペ
プチドのアナログとしては、ＢＭＰ類やＴＧＦ類のアミ
ノ酸配列を有するものを挙げることができる。より具体
的には、Ｐ１及び／又はＰ２のアミノ酸配列が、脊椎動
物、特にヒトの骨誘導因子（ＢＭＰ）のアミノ酸配列の
一部に相当する配列を有するもの、又は、脊椎動物、特
にヒトの骨誘導因子−２（ＢＭＰ−２）のアミノ酸配列
の一部に相当する配列を有するものを挙げることができ
る。さらに具体的には、ペプチドＰ１のアナログの好適
なものの例としては図１に示されるようなものを挙げる
ことができ、また、ペプチドＰ２のアナログの好適なも
のの例としては図２に示されるようなものを挙げること
ができる。これらのペプチドは、前記ＢＭＰ−２の受容
体への結合箇所に相当する部分であり、ＢＭＰ−２から
誘導される前記ペプチドＰ１、ペプチドＰ２と同等な活
性を期待することができるであろう。
ノ酸配列の修飾によってその性質が改良されたミュータ
ントと称されるものも含んでいる。本発明の合成ペプチ
ド誘導体およびアナログは、他の蛋白質と融合させて融
合蛋白質とすることができる。したがって、本発明はこ
のような融合蛋白質をもカバーする。さらにこれらのペ
プチドのアナログとしては、ＢＭＰ類やＴＧＦ類のアミ
ノ酸配列を有するものを挙げることができる。より具体
的には、Ｐ１及び／又はＰ２のアミノ酸配列が、脊椎動
物、特にヒトの骨誘導因子（ＢＭＰ）のアミノ酸配列の
一部に相当する配列を有するもの、又は、脊椎動物、特
にヒトの骨誘導因子−２（ＢＭＰ−２）のアミノ酸配列
の一部に相当する配列を有するものを挙げることができ
る。さらに具体的には、ペプチドＰ１のアナログの好適
なものの例としては図１に示されるようなものを挙げる
ことができ、また、ペプチドＰ２のアナログの好適なも
のの例としては図２に示されるようなものを挙げること
ができる。これらのペプチドは、前記ＢＭＰ−２の受容
体への結合箇所に相当する部分であり、ＢＭＰ−２から
誘導される前記ペプチドＰ１、ペプチドＰ２と同等な活
性を期待することができるであろう。
【００１６】アミノ酸配列については、特に明記しなけ
ればＤ体、Ｌ体又はラセミ体を示すものとする。本発明
は上記のアミノ酸配列で示される新規な合成ペプチド誘
導体及びその薬理学的に許容し得る塩よりなる。
ればＤ体、Ｌ体又はラセミ体を示すものとする。本発明
は上記のアミノ酸配列で示される新規な合成ペプチド誘
導体及びその薬理学的に許容し得る塩よりなる。
【００１７】本発明の合成ペプチド誘導体のＢＭＰ−２
アンタゴニスト様作用は、児玉ら（Ｋｏｄａｍａ，Ｈ．
ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｏｒａｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，ｖｏｌ．２３，ｐ．８９９）によりマウス頭蓋
冠から単一株化された骨芽細胞様の性質を有するＭＣ３
Ｔ３−Ｅ１細胞株に添加培養することにより証明され得
る。本細胞株の培養は、多久和ら（Ｔａｋｕｗａ，Ｙ．
ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎｉ．，ｖｏｌ．１７４，
ｐ．９６−１０１）による記載の方法に準じて行い、血
清アルブミンを含む無血清α−ＭＥＭ培地中で１ｃｍ２
当たり約５×１０４細胞の密度に調製された培養細胞を
種々の濃度の本発明の合成ペプチド及び組み換えヒトＢ
ＭＰ−２（ｒｈ−ＢＭＰ−２）で２日間処理し、細胞中
のアルカリホスファターゼ活性をｐ−ニトロフェニルリ
ン酸を基質として用いる比色法により定量した。アルカ
リホスファターゼ（ＡＬＰａｓｅ）は骨芽細胞および軟
骨細胞の分化・成熟の指標酵素としてしばしば用いられ
る（Ｐｆｅｉｌｓｃｈｉｆｔｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９８７），ｖｏ
ｌ．１２１，ｐ ２１２−２１８；Ｒｏｄａｎ，Ｇ．
Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ｃａｌｃｉｕｍ ｒｅｇｕｌａｔ
ｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔ
ａｂｏｌｉｓｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，（１９９２），ｐ
１８３−１９６）。
アンタゴニスト様作用は、児玉ら（Ｋｏｄａｍａ，Ｈ．
ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｏｒａｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，ｖｏｌ．２３，ｐ．８９９）によりマウス頭蓋
冠から単一株化された骨芽細胞様の性質を有するＭＣ３
Ｔ３−Ｅ１細胞株に添加培養することにより証明され得
る。本細胞株の培養は、多久和ら（Ｔａｋｕｗａ，Ｙ．
ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎｉ．，ｖｏｌ．１７４，
ｐ．９６−１０１）による記載の方法に準じて行い、血
清アルブミンを含む無血清α−ＭＥＭ培地中で１ｃｍ２
当たり約５×１０４細胞の密度に調製された培養細胞を
種々の濃度の本発明の合成ペプチド及び組み換えヒトＢ
ＭＰ−２（ｒｈ−ＢＭＰ−２）で２日間処理し、細胞中
のアルカリホスファターゼ活性をｐ−ニトロフェニルリ
ン酸を基質として用いる比色法により定量した。アルカ
リホスファターゼ（ＡＬＰａｓｅ）は骨芽細胞および軟
骨細胞の分化・成熟の指標酵素としてしばしば用いられ
る（Ｐｆｅｉｌｓｃｈｉｆｔｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９８７），ｖｏ
ｌ．１２１，ｐ ２１２−２１８；Ｒｏｄａｎ，Ｇ．
Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ｃａｌｃｉｕｍ ｒｅｇｕｌａｔ
ｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔ
ａｂｏｌｉｓｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，（１９９２），ｐ
１８３−１９６）。
【００１８】本発明の合成ペプチド誘導体は骨芽細胞様
の性質を有するＭＣ３Ｔ３−Ｅｌ細胞株の組換えヒトＢ
ＭＰ−２（ｒｈ−ＢＭＰ−２）により誘導されたＡＬＰ
ａｓｅ活性の上昇を２×１０−９から２×１０−６Ｍ濃
度において用量依存的に抑制した。
の性質を有するＭＣ３Ｔ３−Ｅｌ細胞株の組換えヒトＢ
ＭＰ−２（ｒｈ−ＢＭＰ−２）により誘導されたＡＬＰ
ａｓｅ活性の上昇を２×１０−９から２×１０−６Ｍ濃
度において用量依存的に抑制した。
【００１９】本発明のペプチドは、ＯＰＬＬや動脈硬化
の症状の進行を抑える薬剤及びＢＭＰが発現している骨
や軟骨の腫瘍の治療、その他骨代謝疾患の治療剤として
有用である。本発明は前記ペプチド誘導体又はその製薬
学的に許容し得る塩を含有することを特徴とする医薬組
成物に関する。また、本発明は前記ペプチド誘導体又は
その製薬学的に許容し得る塩からなる骨誘導因子（ＢＭ
Ｐ）桔抗剤に関する。さらに、本発明は前記ペプチド誘
導体又はその製薬学的に許容し得る塩からなる、異所性
骨化、異所性骨形成又は石灰沈着を伴う代謝性疾患の治
療又は予防剤に関する。その投与方法としては静脈内及
び筋肉内投与が可能であり、静脈内投与の場合は通常の
静脈内注射の他点滴静注が可能である。療法投与とし
て、本発明の合成ペプチド誘導体は、投与に適した有機
又は無機の固体又は液体形剤のような製薬学的に許容さ
れる担体を含む添加物中に前記ペプチド誘導体を含有す
るような薬剤の形態で用いられる。注射用製剤として
は、例えば注射用粉末製剤とすることができる。その場
合は、適当な水溶性賦形剤、例えばマンニトール、ショ
糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖、フルクトース糖の１
種又は２種以上を加えて水で溶解し、バイアル又はアン
プルに分注した後、凍結乾燥し、密封して製剤とするこ
とができる。
の症状の進行を抑える薬剤及びＢＭＰが発現している骨
や軟骨の腫瘍の治療、その他骨代謝疾患の治療剤として
有用である。本発明は前記ペプチド誘導体又はその製薬
学的に許容し得る塩を含有することを特徴とする医薬組
成物に関する。また、本発明は前記ペプチド誘導体又は
その製薬学的に許容し得る塩からなる骨誘導因子（ＢＭ
Ｐ）桔抗剤に関する。さらに、本発明は前記ペプチド誘
導体又はその製薬学的に許容し得る塩からなる、異所性
骨化、異所性骨形成又は石灰沈着を伴う代謝性疾患の治
療又は予防剤に関する。その投与方法としては静脈内及
び筋肉内投与が可能であり、静脈内投与の場合は通常の
静脈内注射の他点滴静注が可能である。療法投与とし
て、本発明の合成ペプチド誘導体は、投与に適した有機
又は無機の固体又は液体形剤のような製薬学的に許容さ
れる担体を含む添加物中に前記ペプチド誘導体を含有す
るような薬剤の形態で用いられる。注射用製剤として
は、例えば注射用粉末製剤とすることができる。その場
合は、適当な水溶性賦形剤、例えばマンニトール、ショ
糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖、フルクトース糖の１
種又は２種以上を加えて水で溶解し、バイアル又はアン
プルに分注した後、凍結乾燥し、密封して製剤とするこ
とができる。
【００２０】臨床における成人１日当たりの投与量は、
投与法、患者の年齢、体重、症状等によって異なるが、
通常は本ペプチド誘導体として１〜５００ｍｇの範囲で
ある。以下に実施例により、本発明を詳述する。なお、
本発明はこれらの実施例により限定されるものではな
い。
投与法、患者の年齢、体重、症状等によって異なるが、
通常は本ペプチド誘導体として１〜５００ｍｇの範囲で
ある。以下に実施例により、本発明を詳述する。なお、
本発明はこれらの実施例により限定されるものではな
い。
【００２１】
実施例１ ペプチド誘導体の合成 本発明ペプチド誘導体はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍ社製４３０Ａペプチド合成機を使った固相法によ
り合成した。試薬、溶媒は全てＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍ社製のものを用いた。ただし、樹脂は国産化
学（株）より購入のＰ−メチルベンズヒドリルアミン樹
脂を用い、リンカーとしてＮ−９−フルオレニルメトキ
シカルボニル−［（５−カルボキシレイトエチル−２，
４−ジメチルオキシフェニル）−４’−メトキシフェニ
ル］−メチルアミンを使用し樹脂と結合した（０．５２
ｍｍｏｌ／ｇ）。各アミノ酸はα−アミノ基をＦｍｏｃ
（９−フルオレニルオキシカルボニル）基で保護した保
護アミノ酸（１ｍｍｏｌ／ｇを用いた。ただし、Ｆｍｏ
ｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨはノババイオケム社製を、
ＳＭＣＣ（スクシンイミヂル４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）−シクロヘキサン１−カルボキシレイト）はピアス
社製を４−メチルメルカプトフェノールはアルドリッチ
化学社製を使用した。リジンのε−アミノ基はＢｏｃ
（ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）基で、セリンのβ−水酸
基、スレオニンのγ−水酸基、チロシンのｐ−ベンジル
水酸基、及びアスパラギン酸のβ−カルボシキル基はｔ
ｅｒｔ−ブチルで、アスパラギンのβ−アミド基、グル
タミン酸のγ−アミド基、システインのγ−メルカプト
基はトリチル基で保護してある。
ｔｅｍ社製４３０Ａペプチド合成機を使った固相法によ
り合成した。試薬、溶媒は全てＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍ社製のものを用いた。ただし、樹脂は国産化
学（株）より購入のＰ−メチルベンズヒドリルアミン樹
脂を用い、リンカーとしてＮ−９−フルオレニルメトキ
シカルボニル−［（５−カルボキシレイトエチル−２，
４−ジメチルオキシフェニル）−４’−メトキシフェニ
ル］−メチルアミンを使用し樹脂と結合した（０．５２
ｍｍｏｌ／ｇ）。各アミノ酸はα−アミノ基をＦｍｏｃ
（９−フルオレニルオキシカルボニル）基で保護した保
護アミノ酸（１ｍｍｏｌ／ｇを用いた。ただし、Ｆｍｏ
ｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨはノババイオケム社製を、
ＳＭＣＣ（スクシンイミヂル４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）−シクロヘキサン１−カルボキシレイト）はピアス
社製を４−メチルメルカプトフェノールはアルドリッチ
化学社製を使用した。リジンのε−アミノ基はＢｏｃ
（ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）基で、セリンのβ−水酸
基、スレオニンのγ−水酸基、チロシンのｐ−ベンジル
水酸基、及びアスパラギン酸のβ−カルボシキル基はｔ
ｅｒｔ−ブチルで、アスパラギンのβ−アミド基、グル
タミン酸のγ−アミド基、システインのγ−メルカプト
基はトリチル基で保護してある。
【００２２】（１） 配列表配列番号２で示されるフラ
グメントＰ２の合成 ペプチド合成機でＣ末端から１７番目のアラニンまで合
成した。ペプチドが結合した樹脂（１１０ｍｇ）に１ｍ
ｌのＮ−メチルピロリンドン（ＮＭＰ）を溶媒として、
ＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（Ｎ−ｍａ
ｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ
１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（５０ｍｇ）を加え
（室温、１５時間）反応させ、Ｎ−末端に４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボニル基を導
入した。その後、ペプチド樹脂（１０９．９ｍｇ）をＴ
ＦＡ処理（ＴＦＡ１．８ｍｌ、４−メチルメルカプトフ
ェノール（ＭＭＰ）８０ｍｇ、メタノール０．２ｍｌ、
トリエチルシラン０．１ｍｌ：室温、２時間）により樹
脂からの切断と全脱保護を行い、ｔｅｒｔ−ブチルメチ
ルエーテルで結晶化した。１０％酢酸に溶解し、ＯＤＳ
カラムを用いた分析用高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）により溶出位置を確認した後分取用ＨＰＬＣに
より精製した。分析用ＨＰＬＣ（日立 Ｌ−６２００シ
ステム、検出器：日立 Ｌ−４０００）の溶出条件は、
カラム：Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ＆ Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ Ｃ１８（直径 ４．６ｍｍ×長さ ２５ｃｍ）、移
動相：０→７５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ、４
５ｍｉｎグラジエント、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム
温度：室温、検出波長：２１４ｎｍであり、一方、分取
用ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅシステム、検出
器：Ｗａｔｅｒｓ ４８４）の条件は、カラム：Ｖｙｄ
ａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ
１８（直径 ２０ｍｍ×長さ ２５ｃｍ） 移動相：０
→７５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ、４５ｍｉｎ
グラジエント、流速：１５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：
室温、検出波長：２３０ｎｍであった。
グメントＰ２の合成 ペプチド合成機でＣ末端から１７番目のアラニンまで合
成した。ペプチドが結合した樹脂（１１０ｍｇ）に１ｍ
ｌのＮ−メチルピロリンドン（ＮＭＰ）を溶媒として、
ＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（Ｎ−ｍａ
ｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ
１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（５０ｍｇ）を加え
（室温、１５時間）反応させ、Ｎ−末端に４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボニル基を導
入した。その後、ペプチド樹脂（１０９．９ｍｇ）をＴ
ＦＡ処理（ＴＦＡ１．８ｍｌ、４−メチルメルカプトフ
ェノール（ＭＭＰ）８０ｍｇ、メタノール０．２ｍｌ、
トリエチルシラン０．１ｍｌ：室温、２時間）により樹
脂からの切断と全脱保護を行い、ｔｅｒｔ−ブチルメチ
ルエーテルで結晶化した。１０％酢酸に溶解し、ＯＤＳ
カラムを用いた分析用高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）により溶出位置を確認した後分取用ＨＰＬＣに
より精製した。分析用ＨＰＬＣ（日立 Ｌ−６２００シ
ステム、検出器：日立 Ｌ−４０００）の溶出条件は、
カラム：Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ＆ Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ Ｃ１８（直径 ４．６ｍｍ×長さ ２５ｃｍ）、移
動相：０→７５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ、４
５ｍｉｎグラジエント、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム
温度：室温、検出波長：２１４ｎｍであり、一方、分取
用ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅシステム、検出
器：Ｗａｔｅｒｓ ４８４）の条件は、カラム：Ｖｙｄ
ａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ
１８（直径 ２０ｍｍ×長さ ２５ｃｍ） 移動相：０
→７５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ、４５ｍｉｎ
グラジエント、流速：１５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：
室温、検出波長：２３０ｎｍであった。
【００２３】（２） 配列表配列番号１で示されるフラ
グメントＰ１の合成 ペプチド合成機でＣ末端から１７番日のアスパラギン酸
まで合成し、さらにシステインを付加した後、ジクロロ
メタン中２０％無水酢酸でシステインのＮ末端をアセチ
ル化した。その後、ペプチド樹脂（３００ｍｇ）をＴＦ
Ａ処理（ＴＦＡ９ｍｌ、ＭＭＰ ４００ｍｇ、メタノー
ル １ｍｌ、トリエチルシラン ０．１ｍｌ：室温、２
時間）で樹脂からの切断と全脱保護を行い、ｔｅｒｔ−
ブチルメチルエーテルで結晶化した。１０％酢酸に溶解
し、フラグメントＰ２と同様に、ＯＤＳカラムを用いた
分析用ＨＰＬＣにより溶出位置を確認した後、分取用Ｈ
ＰＬＣにより精製した。
グメントＰ１の合成 ペプチド合成機でＣ末端から１７番日のアスパラギン酸
まで合成し、さらにシステインを付加した後、ジクロロ
メタン中２０％無水酢酸でシステインのＮ末端をアセチ
ル化した。その後、ペプチド樹脂（３００ｍｇ）をＴＦ
Ａ処理（ＴＦＡ９ｍｌ、ＭＭＰ ４００ｍｇ、メタノー
ル １ｍｌ、トリエチルシラン ０．１ｍｌ：室温、２
時間）で樹脂からの切断と全脱保護を行い、ｔｅｒｔ−
ブチルメチルエーテルで結晶化した。１０％酢酸に溶解
し、フラグメントＰ２と同様に、ＯＤＳカラムを用いた
分析用ＨＰＬＣにより溶出位置を確認した後、分取用Ｈ
ＰＬＣにより精製した。
【００２４】（３） ペプチド誘導体の合成 ＳＭＣＣでＮ末端を修飾したフラグメントＰ２（２．５
ｍｇ，１２５μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）０．３ｍｌ、アセトニトリル０．３ｍｌ、１０％酢
酸０．１ｍｌに溶解し、この溶液にＤＭＦ０．９ｍｌ中
に溶解したフラグメントＰ１（５．０ｍｇ，２．４０μ
ｍｏｌ）とＥＤＴＡ（２μｍｏｌ）の溶液を加えた。さ
らにフラグメントＰ２（５．０ｍｇ、２．５０μｍｏ
ｌ）を溶解したＤＭＦ０．５ｍｌ、アセトニトリル０．
３ｍｌ、１０％酢酸０．２ｍｌの溶液を加え、分析用Ｈ
ＰＬＣで反応の進行を確認した。反応液をそのまま分取
用ＨＰＬＣで精製した。最終精製物合成ペプチド誘導体
１．５ｍｇ（０．３７μｍｏｌ、収率：１５％を得た。
アミノ酸分析、マススペクトル分析により合成ペプチド
誘導体の構造を次式、化３で示されるものであると確認
した。
ｍｇ，１２５μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）０．３ｍｌ、アセトニトリル０．３ｍｌ、１０％酢
酸０．１ｍｌに溶解し、この溶液にＤＭＦ０．９ｍｌ中
に溶解したフラグメントＰ１（５．０ｍｇ，２．４０μ
ｍｏｌ）とＥＤＴＡ（２μｍｏｌ）の溶液を加えた。さ
らにフラグメントＰ２（５．０ｍｇ、２．５０μｍｏ
ｌ）を溶解したＤＭＦ０．５ｍｌ、アセトニトリル０．
３ｍｌ、１０％酢酸０．２ｍｌの溶液を加え、分析用Ｈ
ＰＬＣで反応の進行を確認した。反応液をそのまま分取
用ＨＰＬＣで精製した。最終精製物合成ペプチド誘導体
１．５ｍｇ（０．３７μｍｏｌ、収率：１５％を得た。
アミノ酸分析、マススペクトル分析により合成ペプチド
誘導体の構造を次式、化３で示されるものであると確認
した。
【００２５】
【化３】
【００２６】（４）アミノ酸分析 合成ペプチド誘導体は６ＮＨＣｌによる加水分解（１１
０℃、２４ｈｒ，４％チオグリコール酸添加）の後日立
アミノ酸分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌ８５００）により
アミノ酸組成を調べた。結果を表１に示す。
０℃、２４ｈｒ，４％チオグリコール酸添加）の後日立
アミノ酸分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌ８５００）により
アミノ酸組成を調べた。結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】（５）マススペクトル分析 合成ペプチド誘導体は宝酒造（株）に依頼しマススペク
トル分析を行った。結果は理論値の分子量（ＭＷ）が４
０８３．６５のところ、実測値ではＭＷが４０８３．２
４（±０．３）であった。
トル分析を行った。結果は理論値の分子量（ＭＷ）が４
０８３．６５のところ、実測値ではＭＷが４０８３．２
４（±０．３）であった。
【００２９】実施例２ ＢＭＰ活性抑制の検定 実施例１で得られた本発明の合成ペプチド誘導体のＢＭ
Ｐ−２アンタゴニスト様作用は、児玉ら（前述）による
マウス頭蓋冠から単一株化された骨芽細胞様の性質を有
するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株に添加培養することにより
検定された。本細胞株の培養は、多久和ら（前述）によ
る記載の方法に準じて行い、０．３％牛血清アルブミン
を含む無血清α−ＭＥＭ培地中で１ｃｍ２当たり約５×
１０４細胞の密度に調製された培養細胞を種々の濃度の
本発明の合成ペプチド誘導体及びｒｈ−ＢＭＰ−２で２
日間処理し、細胞中のＡＬＰａｓｅ活性をｐ−ニトロフ
ェニルリン酸を基質として用いる比色法により定量し
た。表２に示すごとく、５ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＢＭＰ−
２はＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株中のＡＬＰａｓｅ活性を非
添加対照群の約３倍に上昇させた。本発明の合成ペプチ
ド誘導体は２×１０−９から２×１０−６Ｍ濃度におい
て用量依存的にそのＡＬＰａｓｅ活性の上昇を抑制し
た。
Ｐ−２アンタゴニスト様作用は、児玉ら（前述）による
マウス頭蓋冠から単一株化された骨芽細胞様の性質を有
するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株に添加培養することにより
検定された。本細胞株の培養は、多久和ら（前述）によ
る記載の方法に準じて行い、０．３％牛血清アルブミン
を含む無血清α−ＭＥＭ培地中で１ｃｍ２当たり約５×
１０４細胞の密度に調製された培養細胞を種々の濃度の
本発明の合成ペプチド誘導体及びｒｈ−ＢＭＰ−２で２
日間処理し、細胞中のＡＬＰａｓｅ活性をｐ−ニトロフ
ェニルリン酸を基質として用いる比色法により定量し
た。表２に示すごとく、５ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＢＭＰ−
２はＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株中のＡＬＰａｓｅ活性を非
添加対照群の約３倍に上昇させた。本発明の合成ペプチ
ド誘導体は２×１０−９から２×１０−６Ｍ濃度におい
て用量依存的にそのＡＬＰａｓｅ活性の上昇を抑制し
た。
【００３０】
【表２】
【００３１】
【発明の効果】本発明の合成ペプチド誘導体は異所性骨
化や動脈硬化の症状の進行を抑える医薬品として利用で
きる。そのほかＢＭＰを発現している骨や軟骨の腫瘍の
治療、ＯＰＬＬ以外の靭帯や骨周辺の軟部組織の骨化を
防止するために使用することが可能である。また、異所
性骨代謝が高進している状態、たとえばページェット病
に対し使用することにより、骨芽細胞の機能を低下させ
症状の進行を抑えられる。また、ＢＭＰから出発したペ
プチドや低分子化合物で、ＢＭＰとその受容体の結合に
競合するような薬物のスクリーニングや評価系における
試薬としても有用である。
化や動脈硬化の症状の進行を抑える医薬品として利用で
きる。そのほかＢＭＰを発現している骨や軟骨の腫瘍の
治療、ＯＰＬＬ以外の靭帯や骨周辺の軟部組織の骨化を
防止するために使用することが可能である。また、異所
性骨代謝が高進している状態、たとえばページェット病
に対し使用することにより、骨芽細胞の機能を低下させ
症状の進行を抑えられる。また、ＢＭＰから出発したペ
プチドや低分子化合物で、ＢＭＰとその受容体の結合に
競合するような薬物のスクリーニングや評価系における
試薬としても有用である。
【図１】ペプチドＰ１のアナログをアミノ酸の一文字記
号で例示した図である。各ペプチドの左側は、そのアミ
ノ酸配列を有する蛋白質を示し、ペプチドの両端の番号
は、その蛋白質におけるアミノ酸番号を示している。図
中の「−」は、ペプチドＰ１とのコンセンサスを比較し
て並べたときに、相当するアミノ酸が欠如していること
を示す。
号で例示した図である。各ペプチドの左側は、そのアミ
ノ酸配列を有する蛋白質を示し、ペプチドの両端の番号
は、その蛋白質におけるアミノ酸番号を示している。図
中の「−」は、ペプチドＰ１とのコンセンサスを比較し
て並べたときに、相当するアミノ酸が欠如していること
を示す。
【図２】ペプチドＰ２のアナログをアミノ酸の一文字記
号で例示した図である。各ペプチドの左側は、そのアミ
ノ酸配列を有する蛋白質を示し、ペプチドの両端の番号
は、その蛋白質におけるアミノ酸番号を示している。図
中の「−」は、ペプチドＰ２とのコンセンサスを比較し
て並べたときに、相当するアミノ酸が欠如していること
を示す。
号で例示した図である。各ペプチドの左側は、そのアミ
ノ酸配列を有する蛋白質を示し、ペプチドの両端の番号
は、その蛋白質におけるアミノ酸番号を示している。図
中の「−」は、ペプチドＰ２とのコンセンサスを比較し
て並べたときに、相当するアミノ酸が欠如していること
を示す。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年１０月１１日
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、薬理活性をもつ新規な
合成ペプチド誘導体又はその塩に関する。本発明の合成
ペプチド誘導体又はその塩は、骨誘導因子アンタゴニス
ト様活性を示し、骨誘導因子アンタゴニスト活性を有す
る。本発明は、異所性石灰沈着、異所性骨形成又は石灰
沈着を伴う骨代謝性疾患、例えば、神経性骨化症、手術
侵襲よる異所性骨化、外傷性骨化性筋炎、酸素供給不足
による骨化、骨原性腫瘤、後縦靭帯骨化症、動脈硬化等
の治療、予防に有用な骨誘導因子拮抗剤にも関する。
合成ペプチド誘導体又はその塩に関する。本発明の合成
ペプチド誘導体又はその塩は、骨誘導因子アンタゴニス
ト様活性を示し、骨誘導因子アンタゴニスト活性を有す
る。本発明は、異所性石灰沈着、異所性骨形成又は石灰
沈着を伴う骨代謝性疾患、例えば、神経性骨化症、手術
侵襲よる異所性骨化、外傷性骨化性筋炎、酸素供給不足
による骨化、骨原性腫瘤、後縦靭帯骨化症、動脈硬化等
の治療、予防に有用な骨誘導因子拮抗剤にも関する。
【０００２】
【従来の技術】骨誘導因子（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇ
ｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ：以降ＢＭＰと呼ぶ）
は、脱灰骨組織に含有される骨誘導活性を有する蛋白質
である。１９７０年代から精力的にＢＭＰの精製が試み
られてきたが、単一の蛋白質としての分離には到ってい
ない。１９８９年にウォズニー（Ｗｏｚｎｅｙ）らはＢ
ＭＰ活性のある画分を酵素処理して未知のペプチドを分
離してそのアミノ酸配列を手がかりに分子生物学的手法
により、ＢＭＰと考えられる遺伝子のクローニングに成
功した。この遺伝子は直ちに動物培養細胞に導入され、
発現した蛋白質の活性がインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で
測定され、この蛋白質にＢＭＰ活性が確かにあることが
証明された（Ｗａｎｇ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９
９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，ｖｏｌ．８７，ｐ．２２２０−２２２４）。引き続
きホモロジーを利用した類似活性を有する蛋白質のクロ
ーニングが行われ、現在までＢＭＰ−２からＢＭＰ−９
まで複数の蛋白質が確認されている。これらの蛋白質は
いずれもＴＧＦ−βジーンスーパーファミリーに属し、
基本的にｉｎ ｖｉｖｏで異所性骨形成を引き起こす活
性を有することが確認されている。ＢＭＰによる骨形成
は内軟骨性といわれており、胎生期の長骨の形成を再現
するものと考えられている。したがって、ＢＭＰそのも
のは骨欠損部を補う形での治療薬として利用し得るもの
である。
ｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ：以降ＢＭＰと呼ぶ）
は、脱灰骨組織に含有される骨誘導活性を有する蛋白質
である。１９７０年代から精力的にＢＭＰの精製が試み
られてきたが、単一の蛋白質としての分離には到ってい
ない。１９８９年にウォズニー（Ｗｏｚｎｅｙ）らはＢ
ＭＰ活性のある画分を酵素処理して未知のペプチドを分
離してそのアミノ酸配列を手がかりに分子生物学的手法
により、ＢＭＰと考えられる遺伝子のクローニングに成
功した。この遺伝子は直ちに動物培養細胞に導入され、
発現した蛋白質の活性がインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で
測定され、この蛋白質にＢＭＰ活性が確かにあることが
証明された（Ｗａｎｇ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９
９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，ｖｏｌ．８７，ｐ．２２２０−２２２４）。引き続
きホモロジーを利用した類似活性を有する蛋白質のクロ
ーニングが行われ、現在までＢＭＰ−２からＢＭＰ−９
まで複数の蛋白質が確認されている。これらの蛋白質は
いずれもＴＧＦ−βジーンスーパーファミリーに属し、
基本的にｉｎ ｖｉｖｏで異所性骨形成を引き起こす活
性を有することが確認されている。ＢＭＰによる骨形成
は内軟骨性といわれており、胎生期の長骨の形成を再現
するものと考えられている。したがって、ＢＭＰそのも
のは骨欠損部を補う形での治療薬として利用し得るもの
である。
【０００３】一方、ＢＭＰ遺伝子が明らかにされ、その
特異的抗体が作成されるようになってから、今日まで治
療法がなかった異所性石灰化、異所性骨化症等の発症部
位にもＢＭＰが発現しており、これらの発症にＢＭＰが
関与している可能性が示されるようになってきた。例え
ば、神経性骨化症、手術侵襲よる異所性骨化、外傷性骨
化性筋炎、酸素供給不足による骨化、骨原性腫瘤、特定
疾患（難病）に指定されている後縦靭帯骨化症（ｏｓｓ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｔｅｒｉｏ
ｒ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ Ｉｉｇａｍｅｎｔ：以
降ＯＰＬＬと呼ぶ）（Ｓｐｉｎｅ，１７−３Ｓ，Ｓ３
３，１９９２）や、動脈硬化石灰化部位（Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，ｖｏｌ．９１，ｐ．１８００，１
９９３）に、ＢＭＰが発現したり含有されたりしている
ことが近年明らかにされている。また、偽悪性転位骨化
症（ｐｓｅｕｄｏｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｅｔｅｒｏｔ
ｏｐｉｃ ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ：以降ＰＨＯと呼
ぶ）、偽悪性骨性腫瘍（ｐｓｅｕｄｏｍａｌｉｇｎａｎ
ｔ ｏｓｓｅｏｕｓ ｔｕｍｏｒ）、限局性骨化性筋炎
（ｍｙｏｓｉｓｔｉｓ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ ｃｉｒ
ｃｕｍｓｃｒｉｐｔａ）などは痛みを伴い、筋肉内に硬
組織の塊の出現が主な症状である。これらの疾患の詳細
な原因は未だ不明であるが、ＢＭＰが患者の筋肉内の硬
組織の出現に関与するものと考えられている。これら
は、本来は発現しないはずの組織でＢＭＰが発現し、オ
ートクライン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）に作用して骨様の
硬組織が形成されるものと考えられている。
特異的抗体が作成されるようになってから、今日まで治
療法がなかった異所性石灰化、異所性骨化症等の発症部
位にもＢＭＰが発現しており、これらの発症にＢＭＰが
関与している可能性が示されるようになってきた。例え
ば、神経性骨化症、手術侵襲よる異所性骨化、外傷性骨
化性筋炎、酸素供給不足による骨化、骨原性腫瘤、特定
疾患（難病）に指定されている後縦靭帯骨化症（ｏｓｓ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｔｅｒｉｏ
ｒ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ Ｉｉｇａｍｅｎｔ：以
降ＯＰＬＬと呼ぶ）（Ｓｐｉｎｅ，１７−３Ｓ，Ｓ３
３，１９９２）や、動脈硬化石灰化部位（Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，ｖｏｌ．９１，ｐ．１８００，１
９９３）に、ＢＭＰが発現したり含有されたりしている
ことが近年明らかにされている。また、偽悪性転位骨化
症（ｐｓｅｕｄｏｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈｅｔｅｒｏｔ
ｏｐｉｃ ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ：以降ＰＨＯと呼
ぶ）、偽悪性骨性腫瘍（ｐｓｅｕｄｏｍａｌｉｇｎａｎ
ｔ ｏｓｓｅｏｕｓ ｔｕｍｏｒ）、限局性骨化性筋炎
（ｍｙｏｓｉｓｔｉｓ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ ｃｉｒ
ｃｕｍｓｃｒｉｐｔａ）などは痛みを伴い、筋肉内に硬
組織の塊の出現が主な症状である。これらの疾患の詳細
な原因は未だ不明であるが、ＢＭＰが患者の筋肉内の硬
組織の出現に関与するものと考えられている。これら
は、本来は発現しないはずの組織でＢＭＰが発現し、オ
ートクライン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）に作用して骨様の
硬組織が形成されるものと考えられている。
【０００４】ＯＰＬＬについては現在のところ有効な治
療法もなく、圧迫性の神経症状が重度であれば外科的に
切除を試みるが、予後は必ずしも良いものではない。ま
た、動脈の石灰化にしても治療法はない。ＢＭＰの発現
を抑制することが、これらの病変の治療の主要な手段の
一つと推察されるが、それ以外に、例えば、ＢＭＰアン
タゴニスト（拮抗剤）の投与も有効と考えられる。
療法もなく、圧迫性の神経症状が重度であれば外科的に
切除を試みるが、予後は必ずしも良いものではない。ま
た、動脈の石灰化にしても治療法はない。ＢＭＰの発現
を抑制することが、これらの病変の治療の主要な手段の
一つと推察されるが、それ以外に、例えば、ＢＭＰアン
タゴニスト（拮抗剤）の投与も有効と考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】したがって、上記の骨
様組織の形成に関連する疾患に対する有効な治療剤が切
望されていた。ＢＭＰアンタゴニスト様活性をもつもの
としてはＢＭＰ受容体やＢＭＰに対する中和抗体とＢＭ
Ｐの結合部位に対応するペプチドなどが考えられる。本
発明はこの考え方に基づき上記の骨関連疾患に有効な新
規な合成ペプチド誘導体を提供することである。
様組織の形成に関連する疾患に対する有効な治療剤が切
望されていた。ＢＭＰアンタゴニスト様活性をもつもの
としてはＢＭＰ受容体やＢＭＰに対する中和抗体とＢＭ
Ｐの結合部位に対応するペプチドなどが考えられる。本
発明はこの考え方に基づき上記の骨関連疾患に有効な新
規な合成ペプチド誘導体を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】従来からＢＭＰの構造活
性相関について種々の検討がなされているが成熟型ＢＭ
Ｐ−２のどの部分が受容体との結合に関与するか知られ
ておらず、受容体との結合能を有するＢＭＰ−２部分ペ
プチペについても知られていない。本発明者らは、受容
体の結合部位に結合してＢＭＰアンタゴニストとして働
くペプチドを設計する目的でＢＭＰ−２と相同な蛋白質
であるＴＧＦ−β２立体構造をもとに、ＢＭＰ−２の立
体構造を類推し、受容体結合部位を推定した。
性相関について種々の検討がなされているが成熟型ＢＭ
Ｐ−２のどの部分が受容体との結合に関与するか知られ
ておらず、受容体との結合能を有するＢＭＰ−２部分ペ
プチペについても知られていない。本発明者らは、受容
体の結合部位に結合してＢＭＰアンタゴニストとして働
くペプチドを設計する目的でＢＭＰ−２と相同な蛋白質
であるＴＧＦ−β２立体構造をもとに、ＢＭＰ−２の立
体構造を類推し、受容体結合部位を推定した。
【０００７】ＢＭＰの活性型はダイマーであること、及
び、受容体結合部位は蛋白質分子の外側に露出した部分
であると考えられることから、ＢＭＰ−２がダイマーを
形成したときに隣接する２つのペプチド領域（ＢＭＰ−
２の成熟型での各分子中の各々残基番号で２２番目のＡ
ｓｐから３８番目のＴｙｒと６１番目のＡｌａから７７
番目のＡｌａまで）が受容体結合部位を形成していると
推定した。この推定に基づき、これらの２つのペプチド
を両端にカルボキシル基を有するリンカーで結合させた
本発明のペプチド誘導体を設計した。好適なリンカーと
しては、類推されたＢＭＰ−２の立体構造に類似した構
造のペプチド誘導体を構成するような二価の有機基であ
る。
び、受容体結合部位は蛋白質分子の外側に露出した部分
であると考えられることから、ＢＭＰ−２がダイマーを
形成したときに隣接する２つのペプチド領域（ＢＭＰ−
２の成熟型での各分子中の各々残基番号で２２番目のＡ
ｓｐから３８番目のＴｙｒと６１番目のＡｌａから７７
番目のＡｌａまで）が受容体結合部位を形成していると
推定した。この推定に基づき、これらの２つのペプチド
を両端にカルボキシル基を有するリンカーで結合させた
本発明のペプチド誘導体を設計した。好適なリンカーと
しては、類推されたＢＭＰ−２の立体構造に類似した構
造のペプチド誘導体を構成するような二価の有機基であ
る。
【０００８】本発明の合成ペプチド誘導体は次式、 Ｐ１−Ｒ１−Ｐ２ で示される。式中、Ｐ１は配列表の配列番号１のアミノ
酸配列を有するペプチド又はこれらのアナログを、Ｐ２
は配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド
又はこれらのアナログを、Ｒ１は各々のペプチドＰ１、
Ｐ２のＮ末端を結合するリンカーを示す。リンカーＲ１
は前記ペプチドセグメントＰ１、Ｐ２の活性に干渉する
ことのないよう調製された前記ペプチドセグメントを結
合するものであればよい。
酸配列を有するペプチド又はこれらのアナログを、Ｐ２
は配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド
又はこれらのアナログを、Ｒ１は各々のペプチドＰ１、
Ｐ２のＮ末端を結合するリンカーを示す。リンカーＲ１
は前記ペプチドセグメントＰ１、Ｐ２の活性に干渉する
ことのないよう調製された前記ペプチドセグメントを結
合するものであればよい。
【０００９】好適なリンカーとしては、例えば、次式化
学式１で示されるマレイン酸イミド基を有するリンカー
又は次式化学式２で示されるジスルフィド基を有するリ
ンカー等が挙げられる。
学式１で示されるマレイン酸イミド基を有するリンカー
又は次式化学式２で示されるジスルフィド基を有するリ
ンカー等が挙げられる。
【００１０】
【化１】 又は
【００１１】
【化２】 （式中、Ｒ２はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ６のアルキレ
ン、Ｃ６〜Ｃ９のシクロアルキルアルキレン、又は、Ｃ
７〜Ｃ９のフェニルアルキレンを示し、Ｒ３は水素、ア
ルキル、アリール、アルカノイルアミノ、又は、アリー
ロイルアミノのいずれかを示す。） 前記式で示されるリンカーＲ１中＋の基Ｒ２におけるＣ
１〜Ｃ６のアルキレンとしては、例えばメチレン、エチ
レン、プロピレン、ブチレンなどを挙げることができ、
Ｃ６〜Ｃ９のシクロアルキルアルキレンとしては、例え
ばシクロヘキシルメチレン−４−イル、シクロヘキシル
エチレン−３−イルなどを挙げることができ、Ｃ７〜Ｃ
９のフェニルアルキレンとしては、例えばフェニルメチ
レン、フェニルエチレンなどを挙げることができるが、
メチレン基、メチレン−４−シクロヘキシル基などが特
に好ましい。前記式で示されるリンカーＲ１＋の基Ｒ３
におけるアルキルとしては直鎖又は分枝したものが挙げ
られ、好ましくは炭素数１〜１０の低級アルキル基、よ
り好ましくは炭素数１〜５の低級アルキル基を挙げるこ
とができ、さらに具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−
プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチ
ル基、などを挙げることができる。アリール基としては
単環式のものや多環式のものや、環中に異項原子を有す
るものや、低級アルキルなどの鎖状の原子鎖を介して結
合するもの（例えば、ベンジル基などのアリールアルキ
ル基）、又は環中に置換基を有するものなどが挙げら
れ、好ましくは炭素数６〜１２のアリール基、より好ま
しくは炭素数６〜１０のアリール基を挙げることでき、
さらに具体的にはフェニル基、ナフチル基などを挙げる
ことができる。アルカノイルアミノ基としては、直鎖若
しくは分枝した脂肪酸又は置換された脂肪酸から誘導さ
れるアシル基でアシル化されたアミノ基が挙げられ、好
ましくは炭素数１〜１０のアルカノイルアミノ基、より
好ましくは炭素数１〜５のアルカノイルアミノ基を挙げ
ることができ、さらに具体的にはアセチルアミノ基、プ
ロピオニルアミノ基などを挙げることができる。アリー
ロイルアミノ基としては、アリール基を有するカルボン
酸から誘導されるアシル基でアシル化されたアミノ基又
はアリールカルボン酸から誘導されるアシル基でアシル
化されたアミノ基が挙げられ、好ましくは炭素数７〜１
３のアリーロイルアミノ基、より好ましくは炭素数７〜
１１のアリーロイルアミノ基を挙げることができ、さら
に具体的にはベンゾイルアミノ基などを挙げることでき
る。基Ｒ３は、アルカノイルアミノ基が好ましく、より
具体的にはアセチルアミノ基が好ましい。
ン、Ｃ６〜Ｃ９のシクロアルキルアルキレン、又は、Ｃ
７〜Ｃ９のフェニルアルキレンを示し、Ｒ３は水素、ア
ルキル、アリール、アルカノイルアミノ、又は、アリー
ロイルアミノのいずれかを示す。） 前記式で示されるリンカーＲ１中＋の基Ｒ２におけるＣ
１〜Ｃ６のアルキレンとしては、例えばメチレン、エチ
レン、プロピレン、ブチレンなどを挙げることができ、
Ｃ６〜Ｃ９のシクロアルキルアルキレンとしては、例え
ばシクロヘキシルメチレン−４−イル、シクロヘキシル
エチレン−３−イルなどを挙げることができ、Ｃ７〜Ｃ
９のフェニルアルキレンとしては、例えばフェニルメチ
レン、フェニルエチレンなどを挙げることができるが、
メチレン基、メチレン−４−シクロヘキシル基などが特
に好ましい。前記式で示されるリンカーＲ１＋の基Ｒ３
におけるアルキルとしては直鎖又は分枝したものが挙げ
られ、好ましくは炭素数１〜１０の低級アルキル基、よ
り好ましくは炭素数１〜５の低級アルキル基を挙げるこ
とができ、さらに具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−
プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチ
ル基、などを挙げることができる。アリール基としては
単環式のものや多環式のものや、環中に異項原子を有す
るものや、低級アルキルなどの鎖状の原子鎖を介して結
合するもの（例えば、ベンジル基などのアリールアルキ
ル基）、又は環中に置換基を有するものなどが挙げら
れ、好ましくは炭素数６〜１２のアリール基、より好ま
しくは炭素数６〜１０のアリール基を挙げることでき、
さらに具体的にはフェニル基、ナフチル基などを挙げる
ことができる。アルカノイルアミノ基としては、直鎖若
しくは分枝した脂肪酸又は置換された脂肪酸から誘導さ
れるアシル基でアシル化されたアミノ基が挙げられ、好
ましくは炭素数１〜１０のアルカノイルアミノ基、より
好ましくは炭素数１〜５のアルカノイルアミノ基を挙げ
ることができ、さらに具体的にはアセチルアミノ基、プ
ロピオニルアミノ基などを挙げることができる。アリー
ロイルアミノ基としては、アリール基を有するカルボン
酸から誘導されるアシル基でアシル化されたアミノ基又
はアリールカルボン酸から誘導されるアシル基でアシル
化されたアミノ基が挙げられ、好ましくは炭素数７〜１
３のアリーロイルアミノ基、より好ましくは炭素数７〜
１１のアリーロイルアミノ基を挙げることができ、さら
に具体的にはベンゾイルアミノ基などを挙げることでき
る。基Ｒ３は、アルカノイルアミノ基が好ましく、より
具体的にはアセチルアミノ基が好ましい。
【００１２】本発明におけるリンカーの好ましい例とし
ては、次式で示される、
ては、次式で示される、
【化３】
【００１３】
【化４】 などを挙げることができる。
【００１４】また、各ペプチドＰ１，Ｐ２におけるこれ
らのアナログとは、そのアミノ酸配列が１個又はそれ以
上のアミノ酸の置換、削除、付加によって修飾されたも
のをいう。したがって、これらのアナログは、本発明の
合成ペプチド誘導体のアミノ酸配列を、その部分配列と
して蛋白質中の一部分に持つ蛋白質を含むことは当然で
ある。更にこれらのアナログは、本発明の合成ペプチド
誘導体の主要な性質を保持する程度にこれらのアミノ酸
配列の主要な性質を持った蛋白質とも定義される。この
ような蛋白質としては、本発明のペプチドのいずれか一
方又は両者のアミノ酸配列のうちの少なくとも８５％以
上、好ましくは９０％以上のアミノ酸を、その部分配列
中に共通して有している蛋白質などを例として挙げるこ
とができる。
らのアナログとは、そのアミノ酸配列が１個又はそれ以
上のアミノ酸の置換、削除、付加によって修飾されたも
のをいう。したがって、これらのアナログは、本発明の
合成ペプチド誘導体のアミノ酸配列を、その部分配列と
して蛋白質中の一部分に持つ蛋白質を含むことは当然で
ある。更にこれらのアナログは、本発明の合成ペプチド
誘導体の主要な性質を保持する程度にこれらのアミノ酸
配列の主要な性質を持った蛋白質とも定義される。この
ような蛋白質としては、本発明のペプチドのいずれか一
方又は両者のアミノ酸配列のうちの少なくとも８５％以
上、好ましくは９０％以上のアミノ酸を、その部分配列
中に共通して有している蛋白質などを例として挙げるこ
とができる。
【００１５】本発明のこれらのアナログとしては、アミ
ノ酸配列の修飾によってその性質が改良されたミュータ
ントと称されるものも含んでいる。本発明の合成ペプチ
ド誘導体およびアナログは、他の蛋白質と融合させて融
合蛋白質とすることができる。したがって、本発明はこ
のような融合蛋白質をもカバーする。さらにこれらのペ
プチドのアナログとしては、ＢＭＰ類やＴＧＦ類のアミ
ノ酸配列を有するものを挙げることができる。より具体
的には、Ｐ１及び／又はＰ２のアミノ酸配列が、脊椎動
物、特にヒトの骨誘導因子（ＢＭＰ）のアミノ酸配列の
一部に相当する配列を有するもの、又は、脊椎動物、特
にヒトの骨誘導因子−２（ＢＭＰ−２）のアミノ酸配列
の一部に相当する配列を有するものを挙げることができ
る。さらに具体的には、ペプチドＰ１のアナログの好適
なものの例としては図１に示されるようなものを挙げる
ことができ、また、ペプチドＰ２のアナログの好適なも
のの例としては図２に示されるようなものを挙げること
ができる。これらのペプチドは、前記ＢＭＰ−２の受容
体への結合箇所に相当する部分であり、ＢＭＰ−２から
誘導される前記ペプチドＰ１、プチドＰ２と同等な活性
を期待することができるであろう。
ノ酸配列の修飾によってその性質が改良されたミュータ
ントと称されるものも含んでいる。本発明の合成ペプチ
ド誘導体およびアナログは、他の蛋白質と融合させて融
合蛋白質とすることができる。したがって、本発明はこ
のような融合蛋白質をもカバーする。さらにこれらのペ
プチドのアナログとしては、ＢＭＰ類やＴＧＦ類のアミ
ノ酸配列を有するものを挙げることができる。より具体
的には、Ｐ１及び／又はＰ２のアミノ酸配列が、脊椎動
物、特にヒトの骨誘導因子（ＢＭＰ）のアミノ酸配列の
一部に相当する配列を有するもの、又は、脊椎動物、特
にヒトの骨誘導因子−２（ＢＭＰ−２）のアミノ酸配列
の一部に相当する配列を有するものを挙げることができ
る。さらに具体的には、ペプチドＰ１のアナログの好適
なものの例としては図１に示されるようなものを挙げる
ことができ、また、ペプチドＰ２のアナログの好適なも
のの例としては図２に示されるようなものを挙げること
ができる。これらのペプチドは、前記ＢＭＰ−２の受容
体への結合箇所に相当する部分であり、ＢＭＰ−２から
誘導される前記ペプチドＰ１、プチドＰ２と同等な活性
を期待することができるであろう。
【００１６】アミノ酸配列については、特に明記しなけ
ればＤ体、Ｌ体又はラセミ体を示すものとする。本発明
は上記のアミノ酸配列で示される新規な合成ペプチド誘
導体及びその薬理学的に許容し得る塩よりなる。
ればＤ体、Ｌ体又はラセミ体を示すものとする。本発明
は上記のアミノ酸配列で示される新規な合成ペプチド誘
導体及びその薬理学的に許容し得る塩よりなる。
【００１７】本発明の合成ペプチド誘導体のＢＭＰ−２
アンタゴニスト様作用は、児玉ら（Ｋｏｄａｍａ，Ｈ．
ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｏｒａｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，ｖｏｌ．２３，ｐ．８９９）によりマウス頭蓋
冠から単一株化された骨芽細胞様の性質を有するＭＣ３
Ｔ３−Ｅ１細胞株に添加培養することにより証明され得
る。本細胞株の培養は、多久和ら（Ｔａｋｕｗａ，Ｙ．
ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎｉ．，ｖｏｌ．１７４，
ｐ．９６−１０１）による記載の方法に準じて行い、血
清アルブミンを含む無血清α−ＭＥＭ培地中で１ｃｍ２
当たり約５×１０４細胞の密度に調製された培養細胞を
種々の濃度の本発明の合成ペプチド及び組み換えヒトＢ
ＭＰ−２（ｒｈ−ＢＭＰ−２）で２日間処理し、細胞中
のアルカリホスファターゼ活性をｐ−ニトロフェニルリ
ン酸を基質として用いる比色法により定量した。アルカ
リホスファターゼ（ＡＬＰａｓｅ）は骨芽細胞および軟
骨細胞の分化・成熟の指標酵素としてしばしば用いられ
る（Ｐｆｅｉｌｓｃｈｆｔｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９８７），ｖｏｌ．１
２１，ｐ ２１２−２１８；Ｒｏｄａｎ，Ｇ．Ａ．，ｅ
ｔ ａｌ．，ｃａｌｃｉｕｍｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｈ
ｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉ
ｓｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，（１９９２），ｐ １８３−１
９６）。
アンタゴニスト様作用は、児玉ら（Ｋｏｄａｍａ，Ｈ．
ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｏｒａｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，ｖｏｌ．２３，ｐ．８９９）によりマウス頭蓋
冠から単一株化された骨芽細胞様の性質を有するＭＣ３
Ｔ３−Ｅ１細胞株に添加培養することにより証明され得
る。本細胞株の培養は、多久和ら（Ｔａｋｕｗａ，Ｙ．
ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｕｎｉ．，ｖｏｌ．１７４，
ｐ．９６−１０１）による記載の方法に準じて行い、血
清アルブミンを含む無血清α−ＭＥＭ培地中で１ｃｍ２
当たり約５×１０４細胞の密度に調製された培養細胞を
種々の濃度の本発明の合成ペプチド及び組み換えヒトＢ
ＭＰ−２（ｒｈ−ＢＭＰ−２）で２日間処理し、細胞中
のアルカリホスファターゼ活性をｐ−ニトロフェニルリ
ン酸を基質として用いる比色法により定量した。アルカ
リホスファターゼ（ＡＬＰａｓｅ）は骨芽細胞および軟
骨細胞の分化・成熟の指標酵素としてしばしば用いられ
る（Ｐｆｅｉｌｓｃｈｆｔｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９８７），ｖｏｌ．１
２１，ｐ ２１２−２１８；Ｒｏｄａｎ，Ｇ．Ａ．，ｅ
ｔ ａｌ．，ｃａｌｃｉｕｍｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｈ
ｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｂｏｌｉ
ｓｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，（１９９２），ｐ １８３−１
９６）。
【００１８】本発明の合成ペプチド誘導体は骨芽細胞様
の性質を有するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株の組換えヒトＢ
ＭＰ−２（ｒｈ−ＢＭＰ−２）により誘導されたＡＬＰ
ａｓｅ活性の上昇を２×１０−９から２×１０−６Ｍ濃
度において用量依存的に抑制した。
の性質を有するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株の組換えヒトＢ
ＭＰ−２（ｒｈ−ＢＭＰ−２）により誘導されたＡＬＰ
ａｓｅ活性の上昇を２×１０−９から２×１０−６Ｍ濃
度において用量依存的に抑制した。
【００１９】本発明のペプチドは、ＯＰＬＬや動脈硬化
の症状の進行を抑える薬剤及びＢＭＰが発現している骨
や軟骨の腫瘍の治療、その他骨代謝疾患の治療剤として
有用である。本発明は前記ペプチド誘導体又はその製薬
学的に許容し得る塩を含有することを特徴とする医薬組
成物に関する。また、本発明は前記ペプチド誘導体又は
その製薬学的に許容し得る塩からなる骨誘導因子（ＢＭ
Ｐ）拮抗剤に関する。さらに、本発明は前記ペプチド誘
導体又はその製薬学的に許容し得る塩からなる、異所性
骨化、異所性骨形成又は石灰沈着を伴う代謝性疾患の治
療又は予防剤に関する。その投与方法としては静脈内及
び筋肉内投与が可能であり、静脈内投与の場合は通常の
静脈内注射の他点滴静注が可能である。療法投与とし
て、本発明の合成ペプチド誘導体は、投与に適した有機
又は無機の固体又は液体形剤のような製薬学的に許容さ
れる担体を含む添加物中に前記ペプチド誘導体を含有す
るような薬剤の形態で用いられる。注射用製剤として
は、例えば注射用粉末製剤とすることができる。その場
合は、適当な水溶性賦形剤、例えばマンニトール、ショ
糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖、フルクトース糖の１
種又は２種以上を加えて水で溶解し、バイアル又はアン
プルに分注した後、凍結乾燥し、密封して製剤とするこ
とができる。
の症状の進行を抑える薬剤及びＢＭＰが発現している骨
や軟骨の腫瘍の治療、その他骨代謝疾患の治療剤として
有用である。本発明は前記ペプチド誘導体又はその製薬
学的に許容し得る塩を含有することを特徴とする医薬組
成物に関する。また、本発明は前記ペプチド誘導体又は
その製薬学的に許容し得る塩からなる骨誘導因子（ＢＭ
Ｐ）拮抗剤に関する。さらに、本発明は前記ペプチド誘
導体又はその製薬学的に許容し得る塩からなる、異所性
骨化、異所性骨形成又は石灰沈着を伴う代謝性疾患の治
療又は予防剤に関する。その投与方法としては静脈内及
び筋肉内投与が可能であり、静脈内投与の場合は通常の
静脈内注射の他点滴静注が可能である。療法投与とし
て、本発明の合成ペプチド誘導体は、投与に適した有機
又は無機の固体又は液体形剤のような製薬学的に許容さ
れる担体を含む添加物中に前記ペプチド誘導体を含有す
るような薬剤の形態で用いられる。注射用製剤として
は、例えば注射用粉末製剤とすることができる。その場
合は、適当な水溶性賦形剤、例えばマンニトール、ショ
糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖、フルクトース糖の１
種又は２種以上を加えて水で溶解し、バイアル又はアン
プルに分注した後、凍結乾燥し、密封して製剤とするこ
とができる。
【００２０】臨床における成人１日当たりの投与量は、
投与法、患者の年齢、体重、症状等によって異なるが、
通常は本ペプチド誘導体として１〜５００ｍｇの範囲で
ある。以下に実施例により、本発明を詳述する。なお、
本発明はこれらの実施例により限定されるものではな
い。
投与法、患者の年齢、体重、症状等によって異なるが、
通常は本ペプチド誘導体として１〜５００ｍｇの範囲で
ある。以下に実施例により、本発明を詳述する。なお、
本発明はこれらの実施例により限定されるものではな
い。
【００２１】
【実施例】 実施例１ ペプチド誘導体の合成 本発明ペプチド誘導体はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍ社製４３０Ａペプチド合成機を使った固相法によ
り合成した。試薬、溶媒は全てＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍ社製のものを用いた。ただし、樹脂は国産化
学（株）より購入のＰ−メチルベンズヒドリルアミン樹
脂を用い、リンカーとしてＮ−９−フルオレニルメトキ
シカルボニルー［（５−カルボキシレイトエチル−２，
４−ジメチルオキシフェニル）−４’−メトキシフェニ
ル］−メチルアミンを使用し樹脂と結合した（０．５２
ｍｍｏｌ／ｇ）。各アミノ酸はα−アミノ基をＦｍｏｃ
（９−フルオレニルオキシカルボニル）基で保護した保
護アミノ酸（１ ｍｍｏｌ／ｇ）を用いた。ただし、Ｆ
ｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨはノババイオケム社製
を、ＳＭＣＣ（スクシンイミヂル４−（Ｎ−マレイミド
メチル）−シクロヘキサン１−カルボキシレイト）はピ
アス社製を４−メチルメルカプトフェノールはアルドリ
ッチ化学社製を使用した。リジンのε−アミノ基はＢｏ
ｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）基で、セリンのβ−水酸
基、スレオニンのγ−水酸基、チロシンのｐ−ベンジル
水酸基、及びアスパラギン酸のβ−カルボシキル基はｔ
ｅｒｔ−ブチルで、アスパラギンのβ−アミド基、グル
タミン酸のγ−アミド基、システインのγ−メルカプト
基はトリチル基で保護してある。
ｔｅｍ社製４３０Ａペプチド合成機を使った固相法によ
り合成した。試薬、溶媒は全てＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍ社製のものを用いた。ただし、樹脂は国産化
学（株）より購入のＰ−メチルベンズヒドリルアミン樹
脂を用い、リンカーとしてＮ−９−フルオレニルメトキ
シカルボニルー［（５−カルボキシレイトエチル−２，
４−ジメチルオキシフェニル）−４’−メトキシフェニ
ル］−メチルアミンを使用し樹脂と結合した（０．５２
ｍｍｏｌ／ｇ）。各アミノ酸はα−アミノ基をＦｍｏｃ
（９−フルオレニルオキシカルボニル）基で保護した保
護アミノ酸（１ ｍｍｏｌ／ｇ）を用いた。ただし、Ｆ
ｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨはノババイオケム社製
を、ＳＭＣＣ（スクシンイミヂル４−（Ｎ−マレイミド
メチル）−シクロヘキサン１−カルボキシレイト）はピ
アス社製を４−メチルメルカプトフェノールはアルドリ
ッチ化学社製を使用した。リジンのε−アミノ基はＢｏ
ｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）基で、セリンのβ−水酸
基、スレオニンのγ−水酸基、チロシンのｐ−ベンジル
水酸基、及びアスパラギン酸のβ−カルボシキル基はｔ
ｅｒｔ−ブチルで、アスパラギンのβ−アミド基、グル
タミン酸のγ−アミド基、システインのγ−メルカプト
基はトリチル基で保護してある。
【００２２】（１） 配列表配列番号２で示されるフラ
グメントＰ２の合成 ペプチド合成機でＣ末端から１７番目のアラニンまで合
成した。ペプチドがした樹脂（１１０ｍｇ）に１ ｍｌ
のＮ−メチルピロリンドン（ＮＭＰ）を溶媒として、Ｓ
ＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（Ｎ−ｍａｌ
ｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ
１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（５０ｍｇ）を加え（室
温、１５時間）反応させ、Ｎ−末端に４−（Ｎ−マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン１−カルボニル基を導入し
た。その後、ペプチド樹脂（１０９．９ｍｇ）をＴＦＡ
処理 （ＴＦＡ１．８ｍｌ、４−メチルメルカプトフェ
ノール（ＭＭＰ）８０ｍｇ、メタノール０．２ｍｌ、ト
リエチルシラン０．１ｍｌ：室温、２時間）により樹脂
からの切断と全脱保護を行い、ｔｅｒｔ−ブチルメチル
エーテルで結晶化した。１０％酢酸に溶解、ＯＤＳカラ
ムを用いた分析用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により溶出位置を確認した後分取用ＨＰＬＣにより
精製した。分析用ＨＰＬＣ（日立Ｌ−６２００システ
ム、検出器：日立Ｌ−４０００））の溶出条件は、カラ
ム：Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ＆ Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｃ１８（直径４．６ｍｍ×長さ２５ｃｍ）、移動相：０
→７５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ、 ４５ｍｉ
ｎグラジエント、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：
室温、検出波長：２１４ｎｍであり、一方、分取用ＨＰ
ＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅシステム、検出器：Ｗａ
ｔｅｒｓ ４８４）の条件は、カラム：Ｖｙｄａｃ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ＆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ１８（直径２０
ｍｍ× 長さ２５ｃｍ）移動相：０→７５％アセトニト
リル／０．１％ＴＦＡ、４５ ｍｉｎグラジエント、流
速：１５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：室温、検出波長：
２３０ｎｍであった。
グメントＰ２の合成 ペプチド合成機でＣ末端から１７番目のアラニンまで合
成した。ペプチドがした樹脂（１１０ｍｇ）に１ ｍｌ
のＮ−メチルピロリンドン（ＮＭＰ）を溶媒として、Ｓ
ＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（Ｎ−ｍａｌ
ｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ
１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（５０ｍｇ）を加え（室
温、１５時間）反応させ、Ｎ−末端に４−（Ｎ−マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン１−カルボニル基を導入し
た。その後、ペプチド樹脂（１０９．９ｍｇ）をＴＦＡ
処理 （ＴＦＡ１．８ｍｌ、４−メチルメルカプトフェ
ノール（ＭＭＰ）８０ｍｇ、メタノール０．２ｍｌ、ト
リエチルシラン０．１ｍｌ：室温、２時間）により樹脂
からの切断と全脱保護を行い、ｔｅｒｔ−ブチルメチル
エーテルで結晶化した。１０％酢酸に溶解、ＯＤＳカラ
ムを用いた分析用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により溶出位置を確認した後分取用ＨＰＬＣにより
精製した。分析用ＨＰＬＣ（日立Ｌ−６２００システ
ム、検出器：日立Ｌ−４０００））の溶出条件は、カラ
ム：Ｖｙｄａｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ＆ Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｃ１８（直径４．６ｍｍ×長さ２５ｃｍ）、移動相：０
→７５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ、 ４５ｍｉ
ｎグラジエント、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：
室温、検出波長：２１４ｎｍであり、一方、分取用ＨＰ
ＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅシステム、検出器：Ｗａ
ｔｅｒｓ ４８４）の条件は、カラム：Ｖｙｄａｃ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ＆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ１８（直径２０
ｍｍ× 長さ２５ｃｍ）移動相：０→７５％アセトニト
リル／０．１％ＴＦＡ、４５ ｍｉｎグラジエント、流
速：１５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：室温、検出波長：
２３０ｎｍであった。
【００２３】（２） 配列表配列番号１で示されるフラ
グメントＰ１合成 ペプチド合成機でＣ末端から１７番目のアスパラギン酸
まで合成し、さらにシステインを付加した後、ジクロロ
メタン中２０％無水酢酸でシステインのＮ末端をアセチ
ル化した。その後、ペプチド樹脂（３００ｍｇ）をＴＦ
Ａ処理（ＴＦＡ９ｍｌ、ＭＭＰ４００ｍｇ、メタノール
１ｍｌ、トリエチルシラン０．１ｍｌ：室温、２時間）
で樹脂からの切断と全脱保護を行い、ｔｅｒｔ−ブチル
メチルエーテルで結晶化した。１０％酢酸に溶解し、フ
ラグメントＰ２と同様に、ＯＤＳカラムを用いた分析用
ＨＰＬＣにより溶出位置を確認した後、分取用ＨＰＬＣ
により精製した。
グメントＰ１合成 ペプチド合成機でＣ末端から１７番目のアスパラギン酸
まで合成し、さらにシステインを付加した後、ジクロロ
メタン中２０％無水酢酸でシステインのＮ末端をアセチ
ル化した。その後、ペプチド樹脂（３００ｍｇ）をＴＦ
Ａ処理（ＴＦＡ９ｍｌ、ＭＭＰ４００ｍｇ、メタノール
１ｍｌ、トリエチルシラン０．１ｍｌ：室温、２時間）
で樹脂からの切断と全脱保護を行い、ｔｅｒｔ−ブチル
メチルエーテルで結晶化した。１０％酢酸に溶解し、フ
ラグメントＰ２と同様に、ＯＤＳカラムを用いた分析用
ＨＰＬＣにより溶出位置を確認した後、分取用ＨＰＬＣ
により精製した。
【００２４】（３） ペプチド誘導体の合成 ＳＭＣＣでＮ末端を修飾したフラグメントＰ２（２．５
ｍｇ、１．２５μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）０．３ｍｌ、アセトニトリル０．３ｍｌ、１０％
酢酸０．１ｍｌに溶解し、この溶液にＤＨＦ０．９ｍｌ
中に溶解したフラグメントＰ１（５．０ｍｇ、２．４０
μｍｏｌ）とＥＤＴＡ（２μｍｏｌ）の溶液を加えた。
さらにフラグメントＰ２（５．０ｍｇ，２．５０μｍｏ
ｌ）を溶解したＤＭＦ０．５ｍｌ、アセトニトリル０．
３ｍｌ、１０％酢酸０．２ｍｌの溶液を加え、分析用Ｈ
ＰＬＣで反応の進行を確認した。反応液をそのまま分取
用ＨＰＬＣで精製した。最終精製物合成ペプチド誘導体
１．５ｍｇ（０．３７μｍｏｌ、収率：１５％）を得
た。アミノ酸分析、マススペクトル分析により合成ペプ
チド誘導体の構造を次式、化３で示されるものであると
確認した。
ｍｇ、１．２５μｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）０．３ｍｌ、アセトニトリル０．３ｍｌ、１０％
酢酸０．１ｍｌに溶解し、この溶液にＤＨＦ０．９ｍｌ
中に溶解したフラグメントＰ１（５．０ｍｇ、２．４０
μｍｏｌ）とＥＤＴＡ（２μｍｏｌ）の溶液を加えた。
さらにフラグメントＰ２（５．０ｍｇ，２．５０μｍｏ
ｌ）を溶解したＤＭＦ０．５ｍｌ、アセトニトリル０．
３ｍｌ、１０％酢酸０．２ｍｌの溶液を加え、分析用Ｈ
ＰＬＣで反応の進行を確認した。反応液をそのまま分取
用ＨＰＬＣで精製した。最終精製物合成ペプチド誘導体
１．５ｍｇ（０．３７μｍｏｌ、収率：１５％）を得
た。アミノ酸分析、マススペクトル分析により合成ペプ
チド誘導体の構造を次式、化３で示されるものであると
確認した。
【００２５】
【化３】
【００２６】（４）アミノ酸分析 合成ペプチド誘導体は６ＮＨＣｌによる加水分解（１１
０℃、２４ｈｒ，４％チオグリコール酸添加）の後日立
アミノ酸分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌ８５００）により
アミノ酸組成を調べた。結果を表１に示す。
０℃、２４ｈｒ，４％チオグリコール酸添加）の後日立
アミノ酸分析機（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｌ８５００）により
アミノ酸組成を調べた。結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】（５）マススペクトル分析 合成ペプチド誘導体は宝酒造（株）に依頼しマススペク
トル分析を行った。結果は理論値の分子量（ＭＷ）が４
０８３．６５のところ、実測値ではＭＷが４０８３．２
４（±０．３）であった。
トル分析を行った。結果は理論値の分子量（ＭＷ）が４
０８３．６５のところ、実測値ではＭＷが４０８３．２
４（±０．３）であった。
【００２９】実施例２ ＢＭＰ活性抑制の検定 実施例１で得られた本発明の合成ペプチド誘導体のＢＭ
Ｐ−２アンタゴニスト様作用は、児玉ら（前述）による
マウス頭蓋冠から単一株化された骨芽細胞様の性質を有
するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株に添加培養することにより
検定された。本細胞株の培養は、多久和ら（前述）によ
る記載の方法に準じて行い、０．３％血清アルブミンを
含む無血清α−ＭＥＭ培地中で１ｃｍ２当たり約５×１
０４細胞の密度に調製された培養細胞を種々の濃度の本
発明の合成ペプチド誘導体及びｒｈ−ＢＭＰ−２で２日
間処理し、細胞中のＡＬＰａｓｅ活性をｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として用いる比色法により定量した。
表２に示すごとく、５ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＢＭＰ−２は
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株中のＡＬＰａｓｅ活性を非添加
対照群の約３倍に上昇させた。本発明の合成ペプチド誘
導体は２×１０−９から２×１０−６Ｍ濃度において用
量依存的にそのＡＬＰａｓｅ活性の上昇を抑制した。
Ｐ−２アンタゴニスト様作用は、児玉ら（前述）による
マウス頭蓋冠から単一株化された骨芽細胞様の性質を有
するＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株に添加培養することにより
検定された。本細胞株の培養は、多久和ら（前述）によ
る記載の方法に準じて行い、０．３％血清アルブミンを
含む無血清α−ＭＥＭ培地中で１ｃｍ２当たり約５×１
０４細胞の密度に調製された培養細胞を種々の濃度の本
発明の合成ペプチド誘導体及びｒｈ−ＢＭＰ−２で２日
間処理し、細胞中のＡＬＰａｓｅ活性をｐ−ニトロフェ
ニルリン酸を基質として用いる比色法により定量した。
表２に示すごとく、５ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＢＭＰ−２は
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株中のＡＬＰａｓｅ活性を非添加
対照群の約３倍に上昇させた。本発明の合成ペプチド誘
導体は２×１０−９から２×１０−６Ｍ濃度において用
量依存的にそのＡＬＰａｓｅ活性の上昇を抑制した。
【００３０】
【表２】
【００３１】
【発明の効果】本発明の合成ペプチド誘導体は異所性骨
化や動脈硬化の症状の進行を抑える医薬品として利用で
きる。そのほかＢＭＰを発現している骨や軟骨の腫瘍の
治療、ＯＰＬＬ以外の靭帯や骨周辺の軟部組織の骨化を
防止するために使用することが可能である。また、異所
性骨代謝が高進している状態、たとえばページェット病
に対し使用することにより、骨芽細胞の機能を低下させ
症状の進行を抑えられる。また、ＢＭＰから出発したペ
プチドや低分子化合物で、ＢＭＰとその受容体の結合に
競合するような薬物のスクリーニングや評価系における
試薬としても有用である。
化や動脈硬化の症状の進行を抑える医薬品として利用で
きる。そのほかＢＭＰを発現している骨や軟骨の腫瘍の
治療、ＯＰＬＬ以外の靭帯や骨周辺の軟部組織の骨化を
防止するために使用することが可能である。また、異所
性骨代謝が高進している状態、たとえばページェット病
に対し使用することにより、骨芽細胞の機能を低下させ
症状の進行を抑えられる。また、ＢＭＰから出発したペ
プチドや低分子化合物で、ＢＭＰとその受容体の結合に
競合するような薬物のスクリーニングや評価系における
試薬としても有用である。
【００３２】
【配列表】
【００３３】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ペプチドＰ１のアナログをアミノ酸の一文字記
号で例示した図である。各ペプチドの左側は、そのアミ
ノ酸配列を有する蛋白質を示し、ペプチドの両端の番号
は、その蛋白質におけるアミノ酸番号を示している。図
中の「−」は、ペプチドＰ１とのコンセンサスを比較し
て並べたときに、相当するアミノ酸が欠如していること
を示す。
号で例示した図である。各ペプチドの左側は、そのアミ
ノ酸配列を有する蛋白質を示し、ペプチドの両端の番号
は、その蛋白質におけるアミノ酸番号を示している。図
中の「−」は、ペプチドＰ１とのコンセンサスを比較し
て並べたときに、相当するアミノ酸が欠如していること
を示す。
【図２】ペプチドＰ２のアナログをアミノ酸の一文字記
号で例示した図である。各ペプチドの左側は、そのアミ
ノ酸配列を有する蛋白質を示し、ペプチドの両端の番号
は、その蛋白質におけるアミノ酸番号を示している。図
中の「−」は、ペプチドＰ２とのコンセンサスを比較し
て並べたときに、相当するアミノ酸が欠如していること
を示す。
号で例示した図である。各ペプチドの左側は、そのアミ
ノ酸配列を有する蛋白質を示し、ペプチドの両端の番号
は、その蛋白質におけるアミノ酸番号を示している。図
中の「−」は、ペプチドＰ２とのコンセンサスを比較し
て並べたときに、相当するアミノ酸が欠如していること
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＤ Ｃ０７Ｋ 14/51 8318−4Ｈ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＤ (72)発明者 濱本 洋子 埼玉県川越市南台１丁目３番２号 ヘキス トジャパン株式会社医薬研究開発本部内 (72)発明者 ゲルハルド・ブライポール ドイツ国フランクフルトアムメインディ− 65926 ヘキスト・アクチェンゲゼルシャ フト ゼネラルファーマリサーチ内
Claims (7)
- 【請求項１】以下の一般式 Ｐ１−Ｒ１−Ｐ２ （式中、Ｐ１は配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有
するペプチド又はこれらのアナログ、Ｐ２は配列表の配
列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド又はこれらの
アナログ、Ｒ１は前記ペプチド類のＮ末端に結合し得る
両端にカルボキシル基を有する有機基からなるリンカー
を示す。）で示されるペプチド誘導体又はその製薬学的
に許容し得る塩。 - 【請求項２】 リンカーＲ１が次式 【化１】 又は 【化２】 （式中、Ｒ２はそれぞれ独立してＣ１〜Ｃ６のアルキレ
ン、Ｃ６〜Ｃ９のシクロアルキルアルキレン、又は、Ｃ
７〜Ｃ９のフェニルアルキレンを示し、Ｒ３は水素、ア
ルキル、アリール、アルカノイルアミノ、又は、アリー
ロイルアミノのいずれかを示す。）で示され、前記各ペ
プチドＰ１及びＰ２の活性に干渉することのない性質を
有し得る基である請求項１のペプチド誘導体又はその製
薬学的に許容し得る塩。 - 【請求項３】 Ｐ１及び／又はＰ２のアミノ酸配列が、
脊椎動物、特にヒトの骨誘導因子（ＢＭＰ）のアミノ酸
配列の一部に相当する配列を有する請求項１又は２に記
載のペプチド誘導体又はその製薬学的に許容し得る塩。 - 【請求項４】 Ｐ１及び／又はＰ２のアミノ酸配列が、
脊椎動物、特にヒトの骨誘導因子−２（ＢＭＰ−２）の
アミノ酸配列の一部に相当する配列を有する請求項１、
２又は３に記載のペプチド誘導体又はその製薬学的に許
容し得る塩。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載のペプチ
ド誘導体又はその製薬学的に許容し得る塩を含有するこ
とを特徴とする医薬組成物。 - 【請求項６】 請求項１〜４のいずれかに記載のペプチ
ド誘導体又はその製薬学的に許容し得る塩からなる骨誘
導因子（ＢＭＰ）拮抗剤。 - 【請求項７】 請求項１から４のいずれかに記載のペプ
チド誘導体からなる、異所性骨化、異所性骨形成又は石
灰沈着を伴う代謝性疾患の治療又は予防剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7200175A JPH08176191A (ja) | 1994-07-04 | 1995-07-04 | 合成ペプチド誘導体または、その塩 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18420394 | 1994-07-04 | ||
| JP6-184203 | 1994-07-04 | ||
| JP7200175A JPH08176191A (ja) | 1994-07-04 | 1995-07-04 | 合成ペプチド誘導体または、その塩 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08176191A true JPH08176191A (ja) | 1996-07-09 |
Family
ID=26502363
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7200175A Pending JPH08176191A (ja) | 1994-07-04 | 1995-07-04 | 合成ペプチド誘導体または、その塩 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08176191A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008538315A (ja) * | 2005-04-12 | 2008-10-23 | ウォーソー・オーソペディック・インコーポレーテッド | 関節形成性人工円板の運動能力を保存する方法およびデバイス |
-
1995
- 1995-07-04 JP JP7200175A patent/JPH08176191A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008538315A (ja) * | 2005-04-12 | 2008-10-23 | ウォーソー・オーソペディック・インコーポレーテッド | 関節形成性人工円板の運動能力を保存する方法およびデバイス |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4519324B2 (ja) | 共有結合で架橋されたインスリンダイマー | |
| US5364851A (en) | Conformationally restricted biologically active peptides, methods for their production and uses thereof | |
| KR100593348B1 (ko) | 글루카곤-유사 펩티드-1 유사체 | |
| EP0476044B1 (en) | Use of IGF1 or IGF2 for the manufacture of a medicament in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis | |
| CN101389648B (zh) | 肽胃泌酸调节素衍生物 | |
| US8603969B2 (en) | Pancreatic polypeptide family motifs and polypeptides comprising the same | |
| WO1994007913A1 (en) | Peptide antagonists of sh2 binding and therapeutic uses thereof | |
| EA020018B1 (ru) | Процессированные аналоги глюкозозависимого инсулинотропного полипептида | |
| EA020005B1 (ru) | Аналоги глюкозазависимого инсулинотропного полипептида | |
| EP1585959A2 (en) | Extended glucagon-like peptide-1 analogs | |
| AU2003200839A2 (en) | Extended glucagon-like peptide-1 analogs | |
| CN101855240A (zh) | 改进的胰岛淀粉样多肽衍生物 | |
| EA020019B1 (ru) | Аналоги глюкозозависимого инсулинотропного полипептида | |
| AU2021278157A1 (en) | Dual-agonist compound for both GLP-1 and GIP receptors and application thereof | |
| KR100629013B1 (ko) | Ｉｇｆ-ⅰ 및 -ⅱ를 억제하는 ｇｈ-ｒｈ의 길항 유사체 | |
| US5908828A (en) | Synthetic peptide derivatives and the salts thereof | |
| US5814610A (en) | Osteogenic growth oligopeptides and pharmaceutical compositions containing them | |
| US7132397B1 (en) | Bone morphogenetic protein antagonist based on the mature protein | |
| JPH08176191A (ja) | 合成ペプチド誘導体または、その塩 | |
| JP2003137899A (ja) | 線維芽細胞増殖促進ペプチド | |
| CN109195983B (zh) | 胰岛新生多肽和类似物的缀合物及其方法 | |
| JP2002539092A (ja) | ラミニン／ニドゲン相互作用の阻害剤としての低分子量ペプチド誘導体 | |
| JP5529014B2 (ja) | 部位特異的なペグ化をされた直鎖状のサケカルシトニン類似体 | |
| AU736207B2 (en) | Peptides which promote activation of latent TGF-beta and method of screening TGF-beta activity-regulating compounds | |
| RU2816492C2 (ru) | Мультирецепторный агонист и его медицинское применение |