JP2000106900A - 混合ｄｎａ断片分析法 - Google Patents
混合ｄｎａ断片分析法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子発現モニター方法を可能とする混合Ｄ
ＮＡ断片分析法を提供する。 【解決手段】 １）ＤＮＡ断片群の各群のＤＮＡ断片
３、４に、同じ溶解温度と同じ長さを持つプライマー２
１、２２と相補結合するオリゴマー１１、１２を、各群
毎に異ならせて結合する工程と、２）オリゴマーが結合
した各群のＤＮＡ断片５、６を混合する工程と、３）オ
リゴマーに相補な各群に対応するプライマー２１、２２
を用いて、オリゴマーが結合した各群のＤＮＡ断片５、
６を、同一容器２９で同時にＰＣＲする工程、４）ＰＣ
Ｒ増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動分離して検出する工
程とを有する。 【効果】 ＰＣＲの再現性の影響を受けず複数の試料を
比較できる。
ＮＡ断片分析法を提供する。 【解決手段】 １）ＤＮＡ断片群の各群のＤＮＡ断片
３、４に、同じ溶解温度と同じ長さを持つプライマー２
１、２２と相補結合するオリゴマー１１、１２を、各群
毎に異ならせて結合する工程と、２）オリゴマーが結合
した各群のＤＮＡ断片５、６を混合する工程と、３）オ
リゴマーに相補な各群に対応するプライマー２１、２２
を用いて、オリゴマーが結合した各群のＤＮＡ断片５、
６を、同一容器２９で同時にＰＣＲする工程、４）ＰＣ
Ｒ増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動分離して検出する工
程とを有する。 【効果】 ＰＣＲの再現性の影響を受けず複数の試料を
比較できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸増幅法、混合
ＤＮＡ断片分析法、混合ＲＮＡ断片分析法、発現してい
る遺伝子群を調べる遺伝子発現パターンの分析法に関
し、特に蛍光標識を利用したゲル電気泳動によるＤＮＡ
断片分析法に関する。
ＤＮＡ断片分析法、混合ＲＮＡ断片分析法、発現してい
る遺伝子群を調べる遺伝子発現パターンの分析法に関
し、特に蛍光標識を利用したゲル電気泳動によるＤＮＡ
断片分析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子、又はＤＮＡの塩基配列の比較を
行なうには、遺伝子やＤＮＡの塩基配列を決定して比較
すれば良いが、長いＤＮＡの塩基配列決定や多数のＤＮ
Ａ断片の混合物からなる試料の塩基配列決定は困難であ
る。そのため、長いＤＮＡを調べる場合には、ＤＮＡを
断片化し生成した断片のゲル電気泳動パターンを調べる
ことが行なわれる。最近、種々計測法、及び装置の発展
に伴い、非常に多数の遺伝子の発現計測の同時検出が可
能になってきている。
行なうには、遺伝子やＤＮＡの塩基配列を決定して比較
すれば良いが、長いＤＮＡの塩基配列決定や多数のＤＮ
Ａ断片の混合物からなる試料の塩基配列決定は困難であ
る。そのため、長いＤＮＡを調べる場合には、ＤＮＡを
断片化し生成した断片のゲル電気泳動パターンを調べる
ことが行なわれる。最近、種々計測法、及び装置の発展
に伴い、非常に多数の遺伝子の発現計測の同時検出が可
能になってきている。
【０００３】遺伝子発現の測定法の例として、ゲル電気
泳動に基づくスキャニング法と呼ばれる方法がある。ス
キャニング法には、ＦＤＤ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ）（ＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５１、２３１−２３６（１９９
４））、末端識別プライマーを用いた方法（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４、２６１６
−２６１７（１９９６）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｎｏ．３５、２
５７−２５８（１９９６））が含まれる。
泳動に基づくスキャニング法と呼ばれる方法がある。ス
キャニング法には、ＦＤＤ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ）（ＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５１、２３１−２３６（１９９
４））、末端識別プライマーを用いた方法（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４、２６１６
−２６１７（１９９６）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｎｏ．３５、２
５７−２５８（１９９６））が含まれる。
【０００４】スキャニング法は何れも、複数のＤＮＡ断
片に共通に作用する複数のプライマーを用いて試料ｃＤ
ＮＡ、又はｍＲＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ない、得ら
れたＰＣＲ産物の電気泳動パターンから遺伝子の発現情
報を得る方法である。スキャニング法では、遺伝子に対
応した特異なプローブがなくても発現状態を検出できる
ため、塩基配列未知の遺伝子の発現情報を得ることがで
きる利点がある。
片に共通に作用する複数のプライマーを用いて試料ｃＤ
ＮＡ、又はｍＲＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ない、得ら
れたＰＣＲ産物の電気泳動パターンから遺伝子の発現情
報を得る方法である。スキャニング法では、遺伝子に対
応した特異なプローブがなくても発現状態を検出できる
ため、塩基配列未知の遺伝子の発現情報を得ることがで
きる利点がある。
【０００５】例えば、末端識別プライマーを用いる方法
では、２本鎖ｃＤＮＡを制限酵素で切断し、ＤＮＡ断片
末端の切断部に既知の塩基配列を持つオリゴヌクレオチ
ドを導入する。ｃＤＮＡの３’末端には通常ポリＡ鎖が
存在している。ｃＤＮＡの３’末端のポリＡ鎖と導入さ
れたオリゴヌクレオチドとで挟まれた塩基配列は、各々
のｃＤＮＡに特異的であると考えらるため、挟まれた塩
基配列の部分を持つＤＮＡ断片を、ｃＤＮＡを代表する
（、又は識別する）代表断片として計測する。
では、２本鎖ｃＤＮＡを制限酵素で切断し、ＤＮＡ断片
末端の切断部に既知の塩基配列を持つオリゴヌクレオチ
ドを導入する。ｃＤＮＡの３’末端には通常ポリＡ鎖が
存在している。ｃＤＮＡの３’末端のポリＡ鎖と導入さ
れたオリゴヌクレオチドとで挟まれた塩基配列は、各々
のｃＤＮＡに特異的であると考えらるため、挟まれた塩
基配列の部分を持つＤＮＡ断片を、ｃＤＮＡを代表する
（、又は識別する）代表断片として計測する。
【０００６】生体内では数千から数万種の遺伝子が発現
しているため、ｃＤＮＡを代表する代表断片の種類は非
常に多く、１つの電気泳動レーンでは区別して計測でき
ない。このため、全ての代表断片を複数のグループに分
け、１つのグループ内のＤＮＡ断片数を充分分離計測で
きる程度に減らしてからゲル電気泳動を行なう。全ての
代表断片を複数のグループに分ける際に、ＰＣＲプライ
マーの３’末端に２塩基からなる選択塩基配列を付加し
たプライマーを用いる。ＰＣＲでは、断片の末端２塩基
が選択塩基配列に相補な断片だけが増幅される。２塩基
の選択塩基配列を持つプライマーセット２組からそれぞ
れ１つのプライマーを選択し、任意の２つのプライマー
の組み合わせからなるグループを構成する。
しているため、ｃＤＮＡを代表する代表断片の種類は非
常に多く、１つの電気泳動レーンでは区別して計測でき
ない。このため、全ての代表断片を複数のグループに分
け、１つのグループ内のＤＮＡ断片数を充分分離計測で
きる程度に減らしてからゲル電気泳動を行なう。全ての
代表断片を複数のグループに分ける際に、ＰＣＲプライ
マーの３’末端に２塩基からなる選択塩基配列を付加し
たプライマーを用いる。ＰＣＲでは、断片の末端２塩基
が選択塩基配列に相補な断片だけが増幅される。２塩基
の選択塩基配列を持つプライマーセット２組からそれぞ
れ１つのプライマーを選択し、任意の２つのプライマー
の組み合わせからなるグループを構成する。
【０００７】各グループのプライマーを用いてＰＣＲを
行ない、増幅産物を電気泳動で分析する。各グループの
電気泳動パターンに現れるＤＮＡ断片を合わせると全て
の発現している遺伝子に関する情報が得られる。その結
果、発現している各ｃＤＮＡの種類と量を知ることがで
きる。
行ない、増幅産物を電気泳動で分析する。各グループの
電気泳動パターンに現れるＤＮＡ断片を合わせると全て
の発現している遺伝子に関する情報が得られる。その結
果、発現している各ｃＤＮＡの種類と量を知ることがで
きる。
【０００８】断片を計測する場合には、オリゴｄＴプラ
イマーと、ＤＮＡ断片末端の切断部に導入されたオリゴ
マーに相補的なプライマーのうち少なくとも何れかのプ
ライマーを蛍光標識し、蛍光標識されたプライマーを用
いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ）により、ＤＮＡの断片数を装置の検出感
度以上に増幅した後、蛍光式ＤＮＡシーケンサー等の装
置を用いて計測する。
イマーと、ＤＮＡ断片末端の切断部に導入されたオリゴ
マーに相補的なプライマーのうち少なくとも何れかのプ
ライマーを蛍光標識し、蛍光標識されたプライマーを用
いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ）により、ＤＮＡの断片数を装置の検出感
度以上に増幅した後、蛍光式ＤＮＡシーケンサー等の装
置を用いて計測する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従来技術の電気泳動に
基づいた遺伝子発現モニター方法は、実用面では以下に
説明する種々の問題がある。電気泳動に基づく方法で
は、ＰＣＲ増幅の再現性が低い場合には、得られる比較
結果に大きな誤差が生じる。
基づいた遺伝子発現モニター方法は、実用面では以下に
説明する種々の問題がある。電気泳動に基づく方法で
は、ＰＣＲ増幅の再現性が低い場合には、得られる比較
結果に大きな誤差が生じる。
【００１０】複数の試料に於ける遺伝子発現状態の差を
比較する場合には、各々の試料について独立にＰＣＲを
行ない、ＰＣＲ産物を電気泳動分析して得られる結果を
比較する。複数の試料を同一種類の蛍光体で標識した場
合には、別々の反応チューブで調製したＰＣＲ産物を別
々の電気泳動レーンで分析する。複数の試料を異なる種
類の蛍光体で標識した場合は、試料毎に別々のチューブ
でＰＣＲを行なった後に、同じ電気泳動レーンで分析す
る。従来技術では、電気泳動のサンプル調製時に、別々
のチューブでＰＣＲを行なわなければならないため、Ｐ
ＣＲの再現性が、ＰＣＲ産物の電気泳動分析の結果の比
較の精度に影響を与えるが、現状では、ＰＣＲの再現性
は充分ではないという問題がある。
比較する場合には、各々の試料について独立にＰＣＲを
行ない、ＰＣＲ産物を電気泳動分析して得られる結果を
比較する。複数の試料を同一種類の蛍光体で標識した場
合には、別々の反応チューブで調製したＰＣＲ産物を別
々の電気泳動レーンで分析する。複数の試料を異なる種
類の蛍光体で標識した場合は、試料毎に別々のチューブ
でＰＣＲを行なった後に、同じ電気泳動レーンで分析す
る。従来技術では、電気泳動のサンプル調製時に、別々
のチューブでＰＣＲを行なわなければならないため、Ｐ
ＣＲの再現性が、ＰＣＲ産物の電気泳動分析の結果の比
較の精度に影響を与えるが、現状では、ＰＣＲの再現性
は充分ではないという問題がある。
【００１１】本発明の目的は、ＰＣＲを、同じ反応チュ
ーブで行なうことにより、ＰＣＲの再現性の影響を受け
ず、複数の試料を比較する遺伝子発現モニター方法を可
能とする混合ＤＮＡ断片分析法を提供することにある。
ーブで行なうことにより、ＰＣＲの再現性の影響を受け
ず、複数の試料を比較する遺伝子発現モニター方法を可
能とする混合ＤＮＡ断片分析法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明の混合ＤＮＡ断片
分析法では、ＰＣＲに於いて試料毎に、異なる塩基配列
を持ち、長さ、及び溶解温度Ｔm値が同であるプライマ
ーを用い、同一チューブ内で複数の試料の反応を行な
う。複数の試料毎に対応する各プライマーは、それぞれ
独立に機能し、お互いの反応に影響を与えない様に、プ
ライマー同士で二次構造を形成しない塩基配列を有して
いる。反応チューブ内に複数の試料ＤＮＡを入れ、同一
反応チューブでＰＣＲを行ない反応毎のばらつきをなく
す。
分析法では、ＰＣＲに於いて試料毎に、異なる塩基配列
を持ち、長さ、及び溶解温度Ｔm値が同であるプライマ
ーを用い、同一チューブ内で複数の試料の反応を行な
う。複数の試料毎に対応する各プライマーは、それぞれ
独立に機能し、お互いの反応に影響を与えない様に、プ
ライマー同士で二次構造を形成しない塩基配列を有して
いる。反応チューブ内に複数の試料ＤＮＡを入れ、同一
反応チューブでＰＣＲを行ない反応毎のばらつきをなく
す。
【００１３】第１の試料ＤＮＡは第１のプライマーセッ
トのプライマーで増幅され、第２の試料ＤＮＡは第２の
プライマーセットのプライマーで増幅される様に、各々
のプライマーに相補な塩基配列をもつオリゴヌクレオチ
ドを結合させておく。また、何れのプライマーセットの
プライマーで増幅されたかを識別するため、第１のプラ
イマーセットのプライマーと、第２のプライマーセット
のプライマーとは、異なる蛍光体で標識しておく。同一
チューブ内で複数のプライマーセットのプライマーを用
いて複数の試料ＤＮＡを増幅するので、ＰＣＲの再現性
の問題は生じない。
トのプライマーで増幅され、第２の試料ＤＮＡは第２の
プライマーセットのプライマーで増幅される様に、各々
のプライマーに相補な塩基配列をもつオリゴヌクレオチ
ドを結合させておく。また、何れのプライマーセットの
プライマーで増幅されたかを識別するため、第１のプラ
イマーセットのプライマーと、第２のプライマーセット
のプライマーとは、異なる蛍光体で標識しておく。同一
チューブ内で複数のプライマーセットのプライマーを用
いて複数の試料ＤＮＡを増幅するので、ＰＣＲの再現性
の問題は生じない。
【００１４】複数のプライマーセットのプライマーによ
って増幅されたＤＮＡ断片を比較するには、プライマー
による反応性の違いをなくすことが必要である。プライ
マーのＴm値、試料ＤＮＡのＴm値、ＰＣＲ増幅産物のＴ
m値が、ＰＣＲの反応効率を決定している。
って増幅されたＤＮＡ断片を比較するには、プライマー
による反応性の違いをなくすことが必要である。プライ
マーのＴm値、試料ＤＮＡのＴm値、ＰＣＲ増幅産物のＴ
m値が、ＰＣＲの反応効率を決定している。
【００１５】複数の試料ＤＮＡで同じ遺伝子が発現して
いる場合には、その遺伝子に関連する試料ＤＮＡ、及び
ＰＣＲ増幅産物は同じであるから、Ｔm値も同じ値をと
る。従ってＰＣＲの反応効率は、プライマーのＴm値に
依存しており、複数のプライマーのＴm値を揃えること
でＰＣＲの反応効率を揃えることができる。
いる場合には、その遺伝子に関連する試料ＤＮＡ、及び
ＰＣＲ増幅産物は同じであるから、Ｔm値も同じ値をと
る。従ってＰＣＲの反応効率は、プライマーのＴm値に
依存しており、複数のプライマーのＴm値を揃えること
でＰＣＲの反応効率を揃えることができる。
【００１６】ＤＮＡのＴm値は、塩基配列を構成する塩
基の種類によって大まかに計算でき（Ｂｉｏｐｏｌｙｍ
ｅｒｓ、３、１９５−２０８（１９６５））。このＴm
値の計算では、塩基種による隣接塩基とのスタッキング
の差を利用している。着目塩基とその隣接１塩基を考慮
した２塩基からなる塩基配列を用いてＴmを、より正確
に計算することが提案されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３、３７４６−３７
５０（１９８６））。
基の種類によって大まかに計算でき（Ｂｉｏｐｏｌｙｍ
ｅｒｓ、３、１９５−２０８（１９６５））。このＴm
値の計算では、塩基種による隣接塩基とのスタッキング
の差を利用している。着目塩基とその隣接１塩基を考慮
した２塩基からなる塩基配列を用いてＴmを、より正確
に計算することが提案されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３、３７４６−３７
５０（１９８６））。
【００１７】複数のプライマーのＴm値を揃えるため
に、プライマーの塩基配列に、４塩基〜６塩基からなる
サブユニットを含ませて、数種類のサブユニットでプラ
イマーの塩基配列を構成する。例えば、４塩基からなる
５種類のサブユニット（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）を、Ａ−
Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅの順番で並べた塩基配列を持つプライマ
ーと、Ｃ−Ｄ−Ｂ−Ａ−Ｅの順番で並べた塩基配列を持
つプライマーを用いる。ここで、各サブユニットの両末
端の塩基種は同じにしておく。サブユニットの順番を入
れ替えても、サブユニットの両末端の塩基は同じなの
で、サブユニット−サブユニット連結部の塩基配列は変
化しない。従って、サブユニット同士の順番の入れ替え
によるＴm値への影響はない。
に、プライマーの塩基配列に、４塩基〜６塩基からなる
サブユニットを含ませて、数種類のサブユニットでプラ
イマーの塩基配列を構成する。例えば、４塩基からなる
５種類のサブユニット（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）を、Ａ−
Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅの順番で並べた塩基配列を持つプライマ
ーと、Ｃ−Ｄ−Ｂ−Ａ−Ｅの順番で並べた塩基配列を持
つプライマーを用いる。ここで、各サブユニットの両末
端の塩基種は同じにしておく。サブユニットの順番を入
れ替えても、サブユニットの両末端の塩基は同じなの
で、サブユニット−サブユニット連結部の塩基配列は変
化しない。従って、サブユニット同士の順番の入れ替え
によるＴm値への影響はない。
【００１８】また、プライマー全体を構成する塩基組成
は、サブユニット同士の順番を入れ替えただけであるた
め変化しない。以上説明したように、サブユニットを入
れ替えたプライマー同士のＴm値は殆ど差がなく、ＰＣ
Ｒでの反応効率も同じである。また、サブユニットを入
れ替えたプライマーは、お互いに相補な塩基配列でない
ので、プライマー同士で２本鎖を形成してＰＣＲを妨げ
ることはない。
は、サブユニット同士の順番を入れ替えただけであるた
め変化しない。以上説明したように、サブユニットを入
れ替えたプライマー同士のＴm値は殆ど差がなく、ＰＣ
Ｒでの反応効率も同じである。また、サブユニットを入
れ替えたプライマーは、お互いに相補な塩基配列でない
ので、プライマー同士で２本鎖を形成してＰＣＲを妨げ
ることはない。
【００１９】このように、両末端が同じ塩基で構成され
るサブユニットを数種類並べ変えることで、ＰＣＲの反
応効率に差がないプライマーを複数種構成できる。ま
た、同一反応チューブでＰＣＲを行なうので、ＰＣＲの
反応効率のばらつきをなくすことができる。
るサブユニットを数種類並べ変えることで、ＰＣＲの反
応効率に差がないプライマーを複数種構成できる。ま
た、同一反応チューブでＰＣＲを行なうので、ＰＣＲの
反応効率のばらつきをなくすことができる。
【００２０】本発明の混合ＤＮＡ断片分析法では、異な
る塩基配列を持ち、長さ、及び溶解温度Ｔm値が同であ
るプライマーを用いて、同一チューブ内で複数の試料の
反応を行なうので、ＰＣＲの反応効率のばらつきの影響
を受けることなく、複数の試料に含まれるＤＮＡ断片の
存在比を定量的に比較できる。
る塩基配列を持ち、長さ、及び溶解温度Ｔm値が同であ
るプライマーを用いて、同一チューブ内で複数の試料の
反応を行なうので、ＰＣＲの反応効率のばらつきの影響
を受けることなく、複数の試料に含まれるＤＮＡ断片の
存在比を定量的に比較できる。
【００２１】本発明の混合ＤＮＡ断片分析法は、ａ）Ｄ
ＮＡ断片群の各群のＤＮＡ断片に、同じ溶解温度と同じ
長さを持つプライマーと相補結合するオリゴマーを、前
記各群毎に異ならせて結合する工程と、ｂ）前記オリゴ
マーが結合した前記各群の前記ＤＮＡ断片を混合する工
程と、ｃ）前記オリゴマーに相補な前記各群に対応する
前記プライマーを用いて、前記オリゴマーが結合した前
記各群の前記ＤＮＡ断片を、同一容器で同時にＰＣＲす
る工程、ｄ）ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を検出する工
程とを有することに特徴を有し、（１）前記各群に対応
する前記プライマーは、前記各群に対応して異なる蛍光
体で標識されており、前記ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片
を電気泳動し、前記蛍光体で標識されたＤＮＡ断片を検
出すること、（２）前記各群の前記ＤＮＡ断片に相補な
塩基配列を持つＤＮＡプローブを複数種類固定したＤＮ
Ａプローブアレイを用いて、前記ＰＣＲ増幅されたＤＮ
Ａ断片を検出すること、（３）前記各群に対応する前記
プライマーは、前記各群に対応して異なる蛍光体で標識
されていること、（４）前記プライマーは、４塩基〜６
塩基からなる複数のサブユニット配列を有し、該複数の
サブユニット配列の並びの順番は、前記各群に対応して
異なり、前記サブユニット配列の３’末端の塩基種と
５’末端の塩基種とが同一であること、（５）前記各群
に対応する前記プライマーは、前記各群毎に前記プライ
マーに共通する１０塩基〜２５塩基からなる共通塩基配
列と、１塩基〜３塩基からなり前記各群の前記ＤＮＡ断
片を識別する選択用塩基配列とを有し、前記共通塩基配
列部分は、４塩基〜６塩基からなる複数のサブユニット
配列の異なる並びを前記各群に対応して含み、前記選択
用塩基配列は、前記１塩基〜３塩基の組合せの可能な全
ての塩基配列を含むこと、等にも特徴がある。
ＮＡ断片群の各群のＤＮＡ断片に、同じ溶解温度と同じ
長さを持つプライマーと相補結合するオリゴマーを、前
記各群毎に異ならせて結合する工程と、ｂ）前記オリゴ
マーが結合した前記各群の前記ＤＮＡ断片を混合する工
程と、ｃ）前記オリゴマーに相補な前記各群に対応する
前記プライマーを用いて、前記オリゴマーが結合した前
記各群の前記ＤＮＡ断片を、同一容器で同時にＰＣＲす
る工程、ｄ）ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を検出する工
程とを有することに特徴を有し、（１）前記各群に対応
する前記プライマーは、前記各群に対応して異なる蛍光
体で標識されており、前記ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片
を電気泳動し、前記蛍光体で標識されたＤＮＡ断片を検
出すること、（２）前記各群の前記ＤＮＡ断片に相補な
塩基配列を持つＤＮＡプローブを複数種類固定したＤＮ
Ａプローブアレイを用いて、前記ＰＣＲ増幅されたＤＮ
Ａ断片を検出すること、（３）前記各群に対応する前記
プライマーは、前記各群に対応して異なる蛍光体で標識
されていること、（４）前記プライマーは、４塩基〜６
塩基からなる複数のサブユニット配列を有し、該複数の
サブユニット配列の並びの順番は、前記各群に対応して
異なり、前記サブユニット配列の３’末端の塩基種と
５’末端の塩基種とが同一であること、（５）前記各群
に対応する前記プライマーは、前記各群毎に前記プライ
マーに共通する１０塩基〜２５塩基からなる共通塩基配
列と、１塩基〜３塩基からなり前記各群の前記ＤＮＡ断
片を識別する選択用塩基配列とを有し、前記共通塩基配
列部分は、４塩基〜６塩基からなる複数のサブユニット
配列の異なる並びを前記各群に対応して含み、前記選択
用塩基配列は、前記１塩基〜３塩基の組合せの可能な全
ての塩基配列を含むこと、等にも特徴がある。
【００２２】本発明のプライマーは上記の混合ＤＮＡ断
片分析法に使用されるプライマーであり、該プライマー
は、４塩基〜６塩基からなる複数のサブユニット配列を
有し、該複数のサブユニット配列の並びの順番は、前記
各群に対応して異なり、前記サブユニット配列の３’末
端の塩基種と５’末端の塩基種とが同一であることに特
徴がある。
片分析法に使用されるプライマーであり、該プライマー
は、４塩基〜６塩基からなる複数のサブユニット配列を
有し、該複数のサブユニット配列の並びの順番は、前記
各群に対応して異なり、前記サブユニット配列の３’末
端の塩基種と５’末端の塩基種とが同一であることに特
徴がある。
【００２３】また、本発明のプライマーは上記の混合Ｄ
ＮＡ断片分析法に使用されるプライマーであり、前記各
群に対応する前記プライマーは、前記各群毎に前記プラ
イマーに共通する１０塩基〜２５塩基からなる共通塩基
配列と、１塩基〜３塩基からなり前記各群の前記ＤＮＡ
断片を識別する選択用塩基配列とを有し、前記共通塩基
配列部分は、４塩基〜６塩基からなる複数のサブユニッ
ト配列の異なる並びを前記各群に対応して含み、前記選
択用塩基配列は、前記１塩基〜３塩基の組合せの可能な
全ての塩基配列を含み、前記サブユニット配列の３’末
端の塩基種と５’末端の塩基種とが同一であることに特
徴がある。
ＮＡ断片分析法に使用されるプライマーであり、前記各
群に対応する前記プライマーは、前記各群毎に前記プラ
イマーに共通する１０塩基〜２５塩基からなる共通塩基
配列と、１塩基〜３塩基からなり前記各群の前記ＤＮＡ
断片を識別する選択用塩基配列とを有し、前記共通塩基
配列部分は、４塩基〜６塩基からなる複数のサブユニッ
ト配列の異なる並びを前記各群に対応して含み、前記選
択用塩基配列は、前記１塩基〜３塩基の組合せの可能な
全ての塩基配列を含み、前記サブユニット配列の３’末
端の塩基種と５’末端の塩基種とが同一であることに特
徴がある。
【００２４】更に、本発明のプライマーはＰＣＲに使用
される異なる塩基配列を持つ複数のプライマーであり、
該プライマーは、複数の塩基からなる複数のサブユニッ
ト配列の並びを有し、前記複数のプライマーは、前記並
びが異なり同じ溶解温度を持ち、前記サブユニット配列
の３’末端の塩基種と５’末端の塩基種とが同一である
ことに特徴がある。
される異なる塩基配列を持つ複数のプライマーであり、
該プライマーは、複数の塩基からなる複数のサブユニッ
ト配列の並びを有し、前記複数のプライマーは、前記並
びが異なり同じ溶解温度を持ち、前記サブユニット配列
の３’末端の塩基種と５’末端の塩基種とが同一である
ことに特徴がある。
【００２５】また、本発明のプライマーセットはＰＣＲ
に使用される異なる塩基配列を持つ複数のプライマーを
有する複数のプライマーセットであり、該各プライマー
セット毎に前記プライマーに共通する１０塩基〜２５塩
基からなる共通塩基配列と、１塩基〜３塩基からなり試
料ＤＮＡから得たＤＮＡ断片を識別する選択用塩基配列
とを有し、前記共通塩基配列部分は、４塩基〜６塩基か
らなる複数のサブユニット配列の異なる並びを前記プラ
イマーセットに対応して含み、前記選択用塩基配列は、
前記１塩基〜３塩基の組合せの可能な全ての塩基配列を
含むことに特徴があり、前記サブユニット配列の３’末
端の塩基種と５’末端の塩基種とが同一であること、前
記複数のプライマーセットの前記複数のプライマーは、
同じ溶解温度を持つこと、等の特徴がある。
に使用される異なる塩基配列を持つ複数のプライマーを
有する複数のプライマーセットであり、該各プライマー
セット毎に前記プライマーに共通する１０塩基〜２５塩
基からなる共通塩基配列と、１塩基〜３塩基からなり試
料ＤＮＡから得たＤＮＡ断片を識別する選択用塩基配列
とを有し、前記共通塩基配列部分は、４塩基〜６塩基か
らなる複数のサブユニット配列の異なる並びを前記プラ
イマーセットに対応して含み、前記選択用塩基配列は、
前記１塩基〜３塩基の組合せの可能な全ての塩基配列を
含むことに特徴があり、前記サブユニット配列の３’末
端の塩基種と５’末端の塩基種とが同一であること、前
記複数のプライマーセットの前記複数のプライマーは、
同じ溶解温度を持つこと、等の特徴がある。
【００２６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例を用いて説
明する。
明する。
【００２７】（第１の実施例）図１は、本発明の第１の
実施例の発現遺伝子モニターの手順を示すフローチャー
トである。試料ｃＤＮＡとして、ラット肝臓、及びラッ
ト腎臓から抽出したＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用い
た。定法によりホモジナイズした細胞からグアニジンチ
オシアネート法によりＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮ
Ａを逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに変換し、試料ｃＤＮ
Ａ（ラット肝臓由来ｃＤＮＡ、ラット腎臓由来ｃＤＮ
Ａ）とした。
実施例の発現遺伝子モニターの手順を示すフローチャー
トである。試料ｃＤＮＡとして、ラット肝臓、及びラッ
ト腎臓から抽出したＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用い
た。定法によりホモジナイズした細胞からグアニジンチ
オシアネート法によりＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮ
Ａを逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに変換し、試料ｃＤＮ
Ａ（ラット肝臓由来ｃＤＮＡ、ラット腎臓由来ｃＤＮ
Ａ）とした。
【００２８】図１に示すように、ラット肝臓由来の試料
ｃＤＮＡ１（種々のｃＤＮＡ混合物であり、図では１種
のみ示す。）を、反応チューブ２７でクラスＩＩ制限酵
素により切断して、ｃＤＮＡ断片３を得る。同様にし
て、別の反応チューブ２８でラット腎臓由来の試料ｃＤ
ＮＡ２を、試料ｃＤＮＡ１の切断に用いた同じ制限酵素
で切断し、ｃＤＮＡ断片４（種々のｃＤＮＡ混合物であ
り、図では１種のみ示す。）を得る。クラスＩＩ制限酵
素として、塩基配列５’−ＧＡＴＣ−３’を認識して、
↓ＧＡＴＣの位置を切断するＳａｕ３Ａ Ｉを用いた。
クラスＩＩ制限酵素としては、Ｎｌａ ＩＩＩ、Ｈｈａ
Ｉ等４塩基認識の酵素が望ましいが、Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ等６塩基認識の酵素でも良い。
ｃＤＮＡ１（種々のｃＤＮＡ混合物であり、図では１種
のみ示す。）を、反応チューブ２７でクラスＩＩ制限酵
素により切断して、ｃＤＮＡ断片３を得る。同様にし
て、別の反応チューブ２８でラット腎臓由来の試料ｃＤ
ＮＡ２を、試料ｃＤＮＡ１の切断に用いた同じ制限酵素
で切断し、ｃＤＮＡ断片４（種々のｃＤＮＡ混合物であ
り、図では１種のみ示す。）を得る。クラスＩＩ制限酵
素として、塩基配列５’−ＧＡＴＣ−３’を認識して、
↓ＧＡＴＣの位置を切断するＳａｕ３Ａ Ｉを用いた。
クラスＩＩ制限酵素としては、Ｎｌａ ＩＩＩ、Ｈｈａ
Ｉ等４塩基認識の酵素が望ましいが、Ｈｉｎｄ ＩＩ
Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ等６塩基認識の酵素でも良い。
【００２９】ｃＤＮＡ断片３の切断部に、既知の塩基配
列を持つ既知塩基配列オリゴヌクレオチド１１をライゲ
ーション反応により導入し、３’末端に既知塩基配列オ
リゴヌクレオチド１１が導入されたｃＤＮＡ断片５を得
る。同様に、別の反応チューブ２８でｃＤＮＡ断片４の
切断部に、既知の塩基配列を持つ既知塩基配列オリゴヌ
クレオチド１２をライゲーション反応により導入し、
３’末端に既知塩基配列オリゴヌクレオチド１２が導入
されたｃＤＮＡ断片６を得る。
列を持つ既知塩基配列オリゴヌクレオチド１１をライゲ
ーション反応により導入し、３’末端に既知塩基配列オ
リゴヌクレオチド１１が導入されたｃＤＮＡ断片５を得
る。同様に、別の反応チューブ２８でｃＤＮＡ断片４の
切断部に、既知の塩基配列を持つ既知塩基配列オリゴヌ
クレオチド１２をライゲーション反応により導入し、
３’末端に既知塩基配列オリゴヌクレオチド１２が導入
されたｃＤＮＡ断片６を得る。
【００３０】次に、ｃＤＮＡ断片５とｃＤＮＡ断片６を
混合し、混合液の一部を、ＰＣＲ用チューブ２９に入れ
てＰＣＲでの鋳型ＤＮＡ断片とする。
混合し、混合液の一部を、ＰＣＲ用チューブ２９に入れ
てＰＣＲでの鋳型ＤＮＡ断片とする。
【００３１】ＰＣＲでのプライマーとして、４つのサブ
ユニットの配列（Ｉ）ＴＣＡＴ、（ＩＩ）ＣＡＣＣ、
（ＩＩＩ）ＴＴＣＴ、（ＩＶ）ＣＣＡＣ、制限酵素認識
塩基配列ＧＡＴＣ、２塩基からなり制限酵素認識塩基配
列ＧＡＴＣの５’末端（Ｇ）に続く２塩基を識別する選
択用塩基配列ＮＮ（ＮＮは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れかの
塩基である）１５から構成されるプライマー２１を用意
する。
ユニットの配列（Ｉ）ＴＣＡＴ、（ＩＩ）ＣＡＣＣ、
（ＩＩＩ）ＴＴＣＴ、（ＩＶ）ＣＣＡＣ、制限酵素認識
塩基配列ＧＡＴＣ、２塩基からなり制限酵素認識塩基配
列ＧＡＴＣの５’末端（Ｇ）に続く２塩基を識別する選
択用塩基配列ＮＮ（ＮＮは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れかの
塩基である）１５から構成されるプライマー２１を用意
する。
【００３２】各サブユニットの配列を構成している塩基
のうち、サブユニットの両末端の塩基種はサブユニット
の順番を変えてもサブユニット連結部分の塩基配列が変
わらないように、同じ塩基種で構成されている。プライ
マー２１の塩基配列（配列番号１）は、（Ｉ）−（Ｉ
Ｉ）−（ＩＩＩ）−（ＩＶ）の順番に並ぶ４つのサブユ
ニットの配列と、制限酵素認識塩基配列ＧＡＴＣからな
る共通塩基配列１３と、２塩基からなる選択用塩基配列
ＮＮ１５から構成される。
のうち、サブユニットの両末端の塩基種はサブユニット
の順番を変えてもサブユニット連結部分の塩基配列が変
わらないように、同じ塩基種で構成されている。プライ
マー２１の塩基配列（配列番号１）は、（Ｉ）−（Ｉ
Ｉ）−（ＩＩＩ）−（ＩＶ）の順番に並ぶ４つのサブユ
ニットの配列と、制限酵素認識塩基配列ＧＡＴＣからな
る共通塩基配列１３と、２塩基からなる選択用塩基配列
ＮＮ１５から構成される。
【００３３】（配列番号１）５’−ＴＣＡＴＣＡＣＣＴ
ＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＣＮＮ−３’ ＮＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れかの塩基であり、プライマ
ー２１は、１６種のプライマーからなるプライマーセッ
ト２３を構成する。
ＴＣＴＣＣＡＣＧＡＴＣＮＮ−３’ ＮＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れかの塩基であり、プライマ
ー２１は、１６種のプライマーからなるプライマーセッ
ト２３を構成する。
【００３４】更に、（ＩＩＩ）−（ＩＶ）−（Ｉ）−
（ＩＩ）の順番に並ぶ４つのサブユニ.ットの配列と、
制限酵素認識塩基配列ＧＡＴＣからなる共通塩基配列１
４と、２塩基からなる選択用塩基配列ＮＮ（ＮＮは、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れかの塩基）１６から構成され、配
列番号２の塩基配列を持つプライマー２２を用意する。
ＮＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れかの塩基であり、プライマ
ー２２も、プライマー２１と同様に１６種のプライマー
からなるプライマーセット２４を構成する。
（ＩＩ）の順番に並ぶ４つのサブユニ.ットの配列と、
制限酵素認識塩基配列ＧＡＴＣからなる共通塩基配列１
４と、２塩基からなる選択用塩基配列ＮＮ（ＮＮは、
Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れかの塩基）１６から構成され、配
列番号２の塩基配列を持つプライマー２２を用意する。
ＮＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの何れかの塩基であり、プライマ
ー２２も、プライマー２１と同様に１６種のプライマー
からなるプライマーセット２４を構成する。
【００３５】（配列番号２）５’−ＴＴＣＴＣＣＡＣＴ
ＣＡＴＣＡＣＣＧＡＴＣＮＮ−３’） 既知の塩基配列を持つ既知塩基配列オリゴヌクレオチド
１１は、プライマーセット２３に属するプライマー２１
の、（Ｉ）−（ＩＩ）−（ＩＩＩ）−（ＩＶ）の順番で
並ぶ４つのサブユニットの配列と相補な塩基配列であ
る。塩基配列５’−ＧＡＴＣ−３’を認識して、↓ＧＡ
ＴＣの位置を切断する制限酵素Ｓａｕ３ＡＩにより切断
されたｃＤＮＡ断片３の切断部に、オリゴヌクレオチド
１１が導入される。オリゴヌクレオチド１１は、ｃＤＮ
Ａ断片３の−鎖の３’末端の４塩基の配列５’−ＧＡＴ
Ｃ−３’の３’側、及びｃＤＮＡ断片３の＋鎖の３’末
端の４塩基の配列５’−ＧＡＴＣ−３’の３’側にそれ
ぞれ導入される。
ＣＡＴＣＡＣＣＧＡＴＣＮＮ−３’） 既知の塩基配列を持つ既知塩基配列オリゴヌクレオチド
１１は、プライマーセット２３に属するプライマー２１
の、（Ｉ）−（ＩＩ）−（ＩＩＩ）−（ＩＶ）の順番で
並ぶ４つのサブユニットの配列と相補な塩基配列であ
る。塩基配列５’−ＧＡＴＣ−３’を認識して、↓ＧＡ
ＴＣの位置を切断する制限酵素Ｓａｕ３ＡＩにより切断
されたｃＤＮＡ断片３の切断部に、オリゴヌクレオチド
１１が導入される。オリゴヌクレオチド１１は、ｃＤＮ
Ａ断片３の−鎖の３’末端の４塩基の配列５’−ＧＡＴ
Ｃ−３’の３’側、及びｃＤＮＡ断片３の＋鎖の３’末
端の４塩基の配列５’−ＧＡＴＣ−３’の３’側にそれ
ぞれ導入される。
【００３６】プライマーセット２３は、ｃＤＮＡ断片３
の−鎖の３’末端の制限酵素認識配列とオリゴヌクレオ
チド１１、及びｃＤＮＡ断片３の＋鎖の３’末端の制限
酵素認識配列とオリゴヌクレオチド１１に相補鎖結合す
る。従って、プライマーセット２３は３’末端に既知塩
基配列オリゴヌクレオチド１１が導入されたＤＮＡ断片
５を増幅する。
の−鎖の３’末端の制限酵素認識配列とオリゴヌクレオ
チド１１、及びｃＤＮＡ断片３の＋鎖の３’末端の制限
酵素認識配列とオリゴヌクレオチド１１に相補鎖結合す
る。従って、プライマーセット２３は３’末端に既知塩
基配列オリゴヌクレオチド１１が導入されたＤＮＡ断片
５を増幅する。
【００３７】既知の塩基配列を持つ既知塩基配列オリゴ
ヌクレオチド１２は、プライマーセット２４に属するプ
ライマー２２の、（ＩＩＩ）−（ＩＶ）−（Ｉ）−（Ｉ
Ｉ）の順番で並ぶ４つのサブユニットの配列と相補な塩
基配列である。塩基配列５’−ＧＡＴＣ−３’を認識し
て、↓ＧＡＴＣの位置を切断する制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
によって切断されたｃＤＮＡ断片４の切断部に、オリゴ
ヌクレオチド１２が導入される。オリゴヌクレオチド１
２は、ｃＤＮＡ断片４の−鎖の３’末端の４塩基の配列
５’−ＧＡＴＣ−３’の３’側、及びｃＤＮＡ断片４の
＋鎖の３’末端の４塩基の配列５’−ＧＡＴＣ−３’の
３’側にそれぞれ導入される。
ヌクレオチド１２は、プライマーセット２４に属するプ
ライマー２２の、（ＩＩＩ）−（ＩＶ）−（Ｉ）−（Ｉ
Ｉ）の順番で並ぶ４つのサブユニットの配列と相補な塩
基配列である。塩基配列５’−ＧＡＴＣ−３’を認識し
て、↓ＧＡＴＣの位置を切断する制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
によって切断されたｃＤＮＡ断片４の切断部に、オリゴ
ヌクレオチド１２が導入される。オリゴヌクレオチド１
２は、ｃＤＮＡ断片４の−鎖の３’末端の４塩基の配列
５’−ＧＡＴＣ−３’の３’側、及びｃＤＮＡ断片４の
＋鎖の３’末端の４塩基の配列５’−ＧＡＴＣ−３’の
３’側にそれぞれ導入される。
【００３８】プライマーセット２４は、ｃＤＮＡ断片４
の−鎖の３’末端の制限酵素認識配列とオリゴヌクレオ
チド１２、及びｃＤＮＡ断片４の＋鎖の３’末端の制限
酵素認識配列とオリゴヌクレオチド１２に相補鎖結合す
る。従ってプライマーセット２４は３’末端に既知塩基
配列オリゴヌクレオチド１２が導入されたＤＮＡ断片６
を増幅する。
の−鎖の３’末端の制限酵素認識配列とオリゴヌクレオ
チド１２、及びｃＤＮＡ断片４の＋鎖の３’末端の制限
酵素認識配列とオリゴヌクレオチド１２に相補鎖結合す
る。従ってプライマーセット２４は３’末端に既知塩基
配列オリゴヌクレオチド１２が導入されたＤＮＡ断片６
を増幅する。
【００３９】なお、プライマーセット２３、２４の各プ
ライマーは、それぞれ蛍光体ＦＡ２５、蛍光体ＦＢ２６
で標識されている。
ライマーは、それぞれ蛍光体ＦＡ２５、蛍光体ＦＢ２６
で標識されている。
【００４０】図２は、本発明の第１の実施例のプライマ
ー、及び既知塩基配列オリゴヌクレオチドの構造を示す
図である。
ー、及び既知塩基配列オリゴヌクレオチドの構造を示す
図である。
【００４１】図２（ａ）は、プライマー４１の構造を示
す。プライマー４１は、４塩基からなるサブユニットの
配列３１、３２、３３、３４が５’末端から順に並ぶ４
つのサブユニットの配列（Ｉ）−（ＩＩ）−（ＩＩＩ）
−（ＩＶ）、制限酵素認識塩基配列３５、２塩基からな
る選択塩基配列３６から構成される。図２（ｂ）は、プ
ライマー４２の構造を示す。プライマー４２は、４塩基
からなるサブユニットの配列３３、３４、３１、３２が
５’末端から順に並ぶ４つのサブユニットの配列（ＩＩ
Ｉ）−（ＩＶ）−（Ｉ）−（ＩＩ）、制限酵素認識塩基
配列３５、２塩基からなる選択塩基配列３６が並んだ塩
基配列構造である。
す。プライマー４１は、４塩基からなるサブユニットの
配列３１、３２、３３、３４が５’末端から順に並ぶ４
つのサブユニットの配列（Ｉ）−（ＩＩ）−（ＩＩＩ）
−（ＩＶ）、制限酵素認識塩基配列３５、２塩基からな
る選択塩基配列３６から構成される。図２（ｂ）は、プ
ライマー４２の構造を示す。プライマー４２は、４塩基
からなるサブユニットの配列３３、３４、３１、３２が
５’末端から順に並ぶ４つのサブユニットの配列（ＩＩ
Ｉ）−（ＩＶ）−（Ｉ）−（ＩＩ）、制限酵素認識塩基
配列３５、２塩基からなる選択塩基配列３６が並んだ塩
基配列構造である。
【００４２】図２（ｃ）は、プライマー４１とＤＮＡ断
片４５との結合状態、図２（ｄ）は、プライマー４２と
ＤＮＡ断片４６との結合状態を示す。図２（ｃ）、図２
（ｄ）に於いて、サブユニット３１、３２、３３、３４
による塩基配列はオリゴヌクレオチド４３に相補であ
り、サブユニット３３、３４、３１、３２による塩基配
列はオリゴヌクレオチド４４に相補である。プライマー
４１、４２は同じサブユニットの配列３１、３２、３
３、３４、及び制限酵素認識塩基配列３５、２塩基から
なる選択塩基配列３６から構成されており、サブユニッ
トの配列の順番が異なるだけであるため、同じＴm値を
持つ。プライマー４１は、制限酵素切断部位４８の３’
末端に、プライマー４１に相補なオリゴヌクレオチド４
３を結合したＤＮＡ断片４５にハイブリダイズする。プ
ライマー４２は、制限酵素切断部位４８の３’末端に、
プライマー４２に相補なオリゴヌクレオチド４４を結合
したＤＮＡ断片４６にハイブリダイズする。
片４５との結合状態、図２（ｄ）は、プライマー４２と
ＤＮＡ断片４６との結合状態を示す。図２（ｃ）、図２
（ｄ）に於いて、サブユニット３１、３２、３３、３４
による塩基配列はオリゴヌクレオチド４３に相補であ
り、サブユニット３３、３４、３１、３２による塩基配
列はオリゴヌクレオチド４４に相補である。プライマー
４１、４２は同じサブユニットの配列３１、３２、３
３、３４、及び制限酵素認識塩基配列３５、２塩基から
なる選択塩基配列３６から構成されており、サブユニッ
トの配列の順番が異なるだけであるため、同じＴm値を
持つ。プライマー４１は、制限酵素切断部位４８の３’
末端に、プライマー４１に相補なオリゴヌクレオチド４
３を結合したＤＮＡ断片４５にハイブリダイズする。プ
ライマー４２は、制限酵素切断部位４８の３’末端に、
プライマー４２に相補なオリゴヌクレオチド４４を結合
したＤＮＡ断片４６にハイブリダイズする。
【００４３】プライマー４１、４２は同じＴm値を持つ
ため、それぞれ同じ反応効率で既知塩基配列オリゴヌク
レオチド４３、４４と相補鎖結合するが、相補でない相
手同士とはハイブリダイズせず、お互いの反応を阻害す
ることはない。従って、同一反応チューブでのＰＣＲが
可能になる。プライマー４１、４２は、それぞれ異なる
蛍光体３７、３８で標識されており、プライマー４１、
４２によってＰＣＲ増幅されるＤＮＡ断片４５、４６は
異なる蛍光体で標識され、電気泳動解析に於いて蛍光波
長の差を区別して検出できる。
ため、それぞれ同じ反応効率で既知塩基配列オリゴヌク
レオチド４３、４４と相補鎖結合するが、相補でない相
手同士とはハイブリダイズせず、お互いの反応を阻害す
ることはない。従って、同一反応チューブでのＰＣＲが
可能になる。プライマー４１、４２は、それぞれ異なる
蛍光体３７、３８で標識されており、プライマー４１、
４２によってＰＣＲ増幅されるＤＮＡ断片４５、４６は
異なる蛍光体で標識され、電気泳動解析に於いて蛍光波
長の差を区別して検出できる。
【００４４】図１に於いて、プライマーセット２３か
ら、ＤＮＡ断片５を増幅するためのフォワードプライマ
ーとリバースプライマーを選び、プライマーセット２４
からは、ＤＮＡ断片６を増幅するためのフォワードプラ
イマーとリバースプライマーを選ぶ。選ばれた計４種類
のプライマーを、試料ＤＮＡ断片５、６が分注された反
応チューブに入れ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、基質ｄ
ＮＴＰ、反応緩衝液からなる反応溶液をチューブに加
え、ＰＣＲを行なう。ＰＣＲでは反応液は熱変性、再会
合、伸長の３ステップからなる温度サイクルによって増
幅反応が行なわれる。
ら、ＤＮＡ断片５を増幅するためのフォワードプライマ
ーとリバースプライマーを選び、プライマーセット２４
からは、ＤＮＡ断片６を増幅するためのフォワードプラ
イマーとリバースプライマーを選ぶ。選ばれた計４種類
のプライマーを、試料ＤＮＡ断片５、６が分注された反
応チューブに入れ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、基質ｄ
ＮＴＰ、反応緩衝液からなる反応溶液をチューブに加
え、ＰＣＲを行なう。ＰＣＲでは反応液は熱変性、再会
合、伸長の３ステップからなる温度サイクルによって増
幅反応が行なわれる。
【００４５】熱変性ステップでは、反応液は９４°Ｃ程
度に加熱されてｃＤＮＡ断片５、及び６（２本鎖ＤＮ
Ａ）は、それぞれｃＤＮＡ断片＋鎖７、８とｃＤＮＡ断
片−鎖９、１０に分離され、１本鎖ＤＮＡ断片となる。
再会合ステップでは、反応液は６０°Ｃ程度に保たれ
る。ｃＤＮＡ断片＋鎖７、８、ｃＤＮＡ断片−鎖９、１
０よりも、プライマーの濃度が高いため、ｃＤＮＡ断片
＋鎖７とｃＤＮＡ断片−鎖９、又は、ｃＤＮＡ断片＋鎖
８とｃＤＮＡ断片−鎖１０が再会合するよりも優先的に
プライマーとｃＤＮＡ断片が会合する。プライマー２１
とｃＤＮＡ断片＋鎖７が会合し、プライマー２１とｃＤ
ＮＡ断片−鎖９が会合して２本鎖ＤＮＡを形成し、プラ
イマー２２とｃＤＮＡ断片＋鎖８が会合し、プライマー
２２とｃＤＮＡ断片−鎖１０が会合して、それぞれ２本
鎖ＤＮＡを形成する。ｃＤＮＡ断片と２本鎖を形成した
プライマー２１、２２は、伸長ステップでＤＮＡポリメ
ラーゼにより伸長されてＤＮＡ断片が増幅される。ＰＣ
Ｒでは、オリゴヌクレオチドがｃＤＮＡ断片の両末端か
ら伸長した場合に増幅が起こる。ＤＮＡ断片の＋鎖、又
は−鎖だけしか伸長しない場合には、熱サイクルをｎ回
行なってもｎ倍にしか増幅されず、検出感度に満たない
ためである。＋鎖、−鎖両方の伸長があった場合に２n
倍に増幅される。
度に加熱されてｃＤＮＡ断片５、及び６（２本鎖ＤＮ
Ａ）は、それぞれｃＤＮＡ断片＋鎖７、８とｃＤＮＡ断
片−鎖９、１０に分離され、１本鎖ＤＮＡ断片となる。
再会合ステップでは、反応液は６０°Ｃ程度に保たれ
る。ｃＤＮＡ断片＋鎖７、８、ｃＤＮＡ断片−鎖９、１
０よりも、プライマーの濃度が高いため、ｃＤＮＡ断片
＋鎖７とｃＤＮＡ断片−鎖９、又は、ｃＤＮＡ断片＋鎖
８とｃＤＮＡ断片−鎖１０が再会合するよりも優先的に
プライマーとｃＤＮＡ断片が会合する。プライマー２１
とｃＤＮＡ断片＋鎖７が会合し、プライマー２１とｃＤ
ＮＡ断片−鎖９が会合して２本鎖ＤＮＡを形成し、プラ
イマー２２とｃＤＮＡ断片＋鎖８が会合し、プライマー
２２とｃＤＮＡ断片−鎖１０が会合して、それぞれ２本
鎖ＤＮＡを形成する。ｃＤＮＡ断片と２本鎖を形成した
プライマー２１、２２は、伸長ステップでＤＮＡポリメ
ラーゼにより伸長されてＤＮＡ断片が増幅される。ＰＣ
Ｒでは、オリゴヌクレオチドがｃＤＮＡ断片の両末端か
ら伸長した場合に増幅が起こる。ＤＮＡ断片の＋鎖、又
は−鎖だけしか伸長しない場合には、熱サイクルをｎ回
行なってもｎ倍にしか増幅されず、検出感度に満たない
ためである。＋鎖、−鎖両方の伸長があった場合に２n
倍に増幅される。
【００４６】プライマー２１、２２は蛍光標識されてい
るので、プライマー２１、２２によって増幅されたＰＣ
Ｒ増幅産物１７、１８も蛍光標識される。従って、ＰＣ
Ｒ増幅産物１７、１８の分析は、蛍光検出型の電気泳動
装置等を用いて行なう。電気泳動分離されたＰＣＲ増幅
産物はレーザー照射され、蛍光体２５、２６は蛍光を発
し、異なる波長の蛍光は、像分割プリズム、フィルター
を通して２次元検出器によって検出され、何れの蛍光体
による発光であるかを区別する。測定の結果、得られる
シグナルは、試料ｃＤＮＡを制限酵素切断して得たｃＤ
ＮＡ断片のＰＣＲ増幅産物に基づく。このため、増幅Ｄ
ＮＡ断片の断片長とその蛍光強度を測定して、種々ｍＲ
ＮＡの種類を知ることができる。
るので、プライマー２１、２２によって増幅されたＰＣ
Ｒ増幅産物１７、１８も蛍光標識される。従って、ＰＣ
Ｒ増幅産物１７、１８の分析は、蛍光検出型の電気泳動
装置等を用いて行なう。電気泳動分離されたＰＣＲ増幅
産物はレーザー照射され、蛍光体２５、２６は蛍光を発
し、異なる波長の蛍光は、像分割プリズム、フィルター
を通して２次元検出器によって検出され、何れの蛍光体
による発光であるかを区別する。測定の結果、得られる
シグナルは、試料ｃＤＮＡを制限酵素切断して得たｃＤ
ＮＡ断片のＰＣＲ増幅産物に基づく。このため、増幅Ｄ
ＮＡ断片の断片長とその蛍光強度を測定して、種々ｍＲ
ＮＡの種類を知ることができる。
【００４７】図３は、本発明の第１の実施例のプライマ
ーを用いて発現遺伝子モニターを行ない得られるエレク
トロフェログラム（電気泳動分離パターン）の一部５
１、５２を塩基長５３に対応させて示す図である。第１
の実施例では、ラット肝臓、及び腎臓に発現している遺
伝子の比較を行なった。
ーを用いて発現遺伝子モニターを行ない得られるエレク
トロフェログラム（電気泳動分離パターン）の一部５
１、５２を塩基長５３に対応させて示す図である。第１
の実施例では、ラット肝臓、及び腎臓に発現している遺
伝子の比較を行なった。
【００４８】エレクトロフェログラム５１は、プライマ
ー２１によって増幅されたＰＣＲ産物を電気泳動して得
られ、エレクトロフェログラム５２は、プライマー２２
によって増幅されたＰＣＲ産物を電気泳動して得られ
る。
ー２１によって増幅されたＰＣＲ産物を電気泳動して得
られ、エレクトロフェログラム５２は、プライマー２２
によって増幅されたＰＣＲ産物を電気泳動して得られ
る。
【００４９】エレクトロフェログラム５１、５２のピー
クの大部分は同じ位置に検出されており、両組織間で共
通に発現している遺伝子であることがわかる。両組織間
で発現状態が異なり、特異的に発現している遺伝子に由
来するピーク５５が片方のエレクトロフェログラム５２
に検出されている。両組織で共通に発現している遺伝子
は２つのエレクトロフェログラム５１、５２で再現性よ
く検出されている。各プライマーセットのプライマーを
用いて別々にＰＣＲを行なうのではなく、同一反応チュ
ーブで複数のプライマーセットのプライマーを用いてＰ
ＣＲを行なうことにより、ＰＣＲ産物の比較を容易に、
正確にできる。
クの大部分は同じ位置に検出されており、両組織間で共
通に発現している遺伝子であることがわかる。両組織間
で発現状態が異なり、特異的に発現している遺伝子に由
来するピーク５５が片方のエレクトロフェログラム５２
に検出されている。両組織で共通に発現している遺伝子
は２つのエレクトロフェログラム５１、５２で再現性よ
く検出されている。各プライマーセットのプライマーを
用いて別々にＰＣＲを行なうのではなく、同一反応チュ
ーブで複数のプライマーセットのプライマーを用いてＰ
ＣＲを行なうことにより、ＰＣＲ産物の比較を容易に、
正確にできる。
【００５０】（第２の実施例）第２の実施例は、遺伝子
配列に相補な塩基配列を持つｃＤＮＡプローブを多数の
種類固定したプローブアレイを用いて、ＰＣＲ産物の解
析を行なう例である。図４は本発明の第２の実施例の、
発現遺伝子モニターを行なう手順を示すフローチャート
を示す図である。第１の実施例と同様にして、異なる株
の酵母から抽出したＲＮＡから合成した試料であるｃＤ
ＮＡ混合物（図４には１種のみ示す）６１、６２をそれ
ぞれ別の反応チューブ９１、９２に入れ、クラスＩＩ制
限酵素で切断する。クラスＩＩ制限酵素として配列５’
−ＧＡＴＣ−３’を認識して↓ＧＡＴＣの位置を切断す
るＭｂｏ Ｉを用いた。得られたｃＤＮＡ断片６３、６
４にオリゴマー７１、７２を結合し、末端にオリゴマー
７１、７２の導入されたｃＤＮＡ断片６５、６６を得
る。次に、ｃＤＮＡ断片６５、６６を混合し、混合液の
一部をＰＣＲ用チューブ９３に入れてＰＣＲでの鋳型Ｄ
ＮＡ断片とする。
配列に相補な塩基配列を持つｃＤＮＡプローブを多数の
種類固定したプローブアレイを用いて、ＰＣＲ産物の解
析を行なう例である。図４は本発明の第２の実施例の、
発現遺伝子モニターを行なう手順を示すフローチャート
を示す図である。第１の実施例と同様にして、異なる株
の酵母から抽出したＲＮＡから合成した試料であるｃＤ
ＮＡ混合物（図４には１種のみ示す）６１、６２をそれ
ぞれ別の反応チューブ９１、９２に入れ、クラスＩＩ制
限酵素で切断する。クラスＩＩ制限酵素として配列５’
−ＧＡＴＣ−３’を認識して↓ＧＡＴＣの位置を切断す
るＭｂｏ Ｉを用いた。得られたｃＤＮＡ断片６３、６
４にオリゴマー７１、７２を結合し、末端にオリゴマー
７１、７２の導入されたｃＤＮＡ断片６５、６６を得
る。次に、ｃＤＮＡ断片６５、６６を混合し、混合液の
一部をＰＣＲ用チューブ９３に入れてＰＣＲでの鋳型Ｄ
ＮＡ断片とする。
【００５１】ＰＣＲでのプライマーとして、４つのサブ
ユニット配列（Ｉ）ＡＣＡＡ、（ＩＩ）ＧＡＣＧ、（Ｉ
ＩＩ）ＡＴＣＡ、（ＩＶ）ＧＣＡＧ、及び制限酵素認識
塩基配列ＧＡＴＣを持つ共通塩基配列７３と、２塩基か
らなり制限酵素認識配列ＧＡＴＣの５’末端に続く２塩
基を識別する選択用塩基配列ＮＮ（ＮＮは、Ａ、Ｃ、
Ｇ、Ｔの何れかの塩基）７５から構成され、配列番号３
の塩基配列を持つプライマー８１を用意する。
ユニット配列（Ｉ）ＡＣＡＡ、（ＩＩ）ＧＡＣＧ、（Ｉ
ＩＩ）ＡＴＣＡ、（ＩＶ）ＧＣＡＧ、及び制限酵素認識
塩基配列ＧＡＴＣを持つ共通塩基配列７３と、２塩基か
らなり制限酵素認識配列ＧＡＴＣの５’末端に続く２塩
基を識別する選択用塩基配列ＮＮ（ＮＮは、Ａ、Ｃ、
Ｇ、Ｔの何れかの塩基）７５から構成され、配列番号３
の塩基配列を持つプライマー８１を用意する。
【００５２】（配列番号３）５’−ＡＣＡＡＧＡＣＧＡ
ＴＣＡＧＣＡＧＧＡＴＣＮＮ−３’ ＮＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔは何れかの塩基であり、プライマ
ー８１は１６種のプライマーからなるプライマーセット
８３を構成する。更に、（Ｉ）−（ＩＶ）−（ＩＩＩ）
−（ＩＩ）の順番に並ぶ４つのサブユニットの配列と、
制限酵素認識配列ＧＡＴＣからなる共通塩基配列７４
と、２塩基からなる選択用塩基配列ＮＮ（ＮＮは、Ａ、
Ｃ、Ｇ、Ｔの何れかの塩基）７６から構成され、配列番
号４の塩基配列を持つプライマー８２を用意する。ＮＮ
はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ何れかの塩基であり、プライマー８２
は、プライマー８１と同様に、１６種からなるプライマ
ーセット８４を構成する。
ＴＣＡＧＣＡＧＧＡＴＣＮＮ−３’ ＮＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔは何れかの塩基であり、プライマ
ー８１は１６種のプライマーからなるプライマーセット
８３を構成する。更に、（Ｉ）−（ＩＶ）−（ＩＩＩ）
−（ＩＩ）の順番に並ぶ４つのサブユニットの配列と、
制限酵素認識配列ＧＡＴＣからなる共通塩基配列７４
と、２塩基からなる選択用塩基配列ＮＮ（ＮＮは、Ａ、
Ｃ、Ｇ、Ｔの何れかの塩基）７６から構成され、配列番
号４の塩基配列を持つプライマー８２を用意する。ＮＮ
はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ何れかの塩基であり、プライマー８２
は、プライマー８１と同様に、１６種からなるプライマ
ーセット８４を構成する。
【００５３】（配列番号４）５’−ＡＣＡＡＧＣＡＧＡ
ＴＣＡＧＡＣＧＧＡＴＣＮＮ−３’ 既知配列オリゴマー７１は、プライマーセット８３に属
するプライマー８１の、（Ｉ）−（ＩＩ）−（ＩＩＩ）
−（ＩＶ）の順番で並ぶ４つのサブユニットの配列と相
補な配列であり、既知配列オリゴマー７２は、プライマ
ーセット８４に属するプライマー８２の（Ｉ）−（Ｉ
Ｖ）−（ＩＩＩ）−（ＩＩ）の順番で並ぶ４つのサブユ
ニットの配列と相補な配列である。従って、プライマー
セット８３は３’末端に既知配列オリゴマー７１が導入
されたＤＮＡ断片６５を増幅し、プライマーセット８４
は３’末端に既知配列オリゴマー７２が導入されたＤＮ
Ａ断片６６を増幅する。なお、プライマーセット８３、
８４の各プライマーはそれぞれ蛍光体ＦＡ８５、蛍光体
ＦＢ８６で標識されている。
ＴＣＡＧＡＣＧＧＡＴＣＮＮ−３’ 既知配列オリゴマー７１は、プライマーセット８３に属
するプライマー８１の、（Ｉ）−（ＩＩ）−（ＩＩＩ）
−（ＩＶ）の順番で並ぶ４つのサブユニットの配列と相
補な配列であり、既知配列オリゴマー７２は、プライマ
ーセット８４に属するプライマー８２の（Ｉ）−（Ｉ
Ｖ）−（ＩＩＩ）−（ＩＩ）の順番で並ぶ４つのサブユ
ニットの配列と相補な配列である。従って、プライマー
セット８３は３’末端に既知配列オリゴマー７１が導入
されたＤＮＡ断片６５を増幅し、プライマーセット８４
は３’末端に既知配列オリゴマー７２が導入されたＤＮ
Ａ断片６６を増幅する。なお、プライマーセット８３、
８４の各プライマーはそれぞれ蛍光体ＦＡ８５、蛍光体
ＦＢ８６で標識されている。
【００５４】プライマーセット８３からＤＮＡ断片６５
を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプラ
イマーを選び、プライマーセット８４からＤＮＡ断片６
６を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプ
ライマーを選ぶ。選ばれた合計４種類のプライマーを、
試料ＤＮＡ断片６５、６６が分注された反応チューブ９
３に加え、更に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、基質ｄＮ
ＴＰ、反応緩衝液からなる反応溶液をチューブ９３に加
えて、ＰＣＲ反応を行なう。その後、ガラス基板上にｃ
ＤＮＡプローブを多数の種類固定したＤＮＡプローブア
レイを用いて、ＰＣＲ産物６７、６８の解析を行なう。
を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプラ
イマーを選び、プライマーセット８４からＤＮＡ断片６
６を増幅するためのフォワードプライマーとリバースプ
ライマーを選ぶ。選ばれた合計４種類のプライマーを、
試料ＤＮＡ断片６５、６６が分注された反応チューブ９
３に加え、更に、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、基質ｄＮ
ＴＰ、反応緩衝液からなる反応溶液をチューブ９３に加
えて、ＰＣＲ反応を行なう。その後、ガラス基板上にｃ
ＤＮＡプローブを多数の種類固定したＤＮＡプローブア
レイを用いて、ＰＣＲ産物６７、６８の解析を行なう。
【００５５】図５は、本発明の第２の実施例に於いて、
発現遺伝子の比較をＤＮＡプローブアレイを用いて行な
う手順を示す図である。図５に於いて、１９１はガラス
基板、１９２、１９３はそれぞれガラス基板上に固定し
たＤＮＡプローブである。ガラス基板１９１上には、数
平方センチメートルの範囲に、数十〜数百種類のＤＮＡ
プローブが種類毎に二次元状に固定されている。ガラス
基板１９１に蛍光体ＦＡ１１１、ＦＢ１１２で標識され
たＰＣＲ産物１０１、１０２をのせ、ＤＮＡプローブと
相補鎖結合させる。その後、洗浄して相補鎖結合しなか
ったＰＣＲ産物を洗い流す。ＤＮＡプローブ１９２が固
定されているガラス基板上の区画では、ＰＣＲ産物（混
合物）のうち、ＤＮＡプローブ１９２に相補でないＰＣ
Ｒ産物は洗い流され、相補なＰＣＲ産物１０３、１０４
はＤＮＡプローブ１９２に相補鎖結合する。同様に、Ｄ
ＮＡプローブ１９３が固定されているガラス基板上の区
画では、ＤＮＡプローブ１９３に相補でないＰＣＲ産物
は洗い流され、相補なＰＣＲ反応産物１０５はＤＮＡプ
ローブ１９３に相補鎖結合する。ＰＣＲ産物１０３、１
０５はＰＣＲ産物１０１のうち、ＤＮＡプローブアレイ
上のＤＮＡプローブ１９２、１９３にそれぞれ相補鎖結
合したＤＮＡ断片であり、蛍光体ＦＡ１１１で標識され
ている。一方、ＰＣＲ産物１０４はＤＮＡプローブアレ
イ上のＤＮＡプローブ１９２に相補鎖結合したＤＮＡ断
片であり、蛍光体ＦＢ１１２で標識されている。
発現遺伝子の比較をＤＮＡプローブアレイを用いて行な
う手順を示す図である。図５に於いて、１９１はガラス
基板、１９２、１９３はそれぞれガラス基板上に固定し
たＤＮＡプローブである。ガラス基板１９１上には、数
平方センチメートルの範囲に、数十〜数百種類のＤＮＡ
プローブが種類毎に二次元状に固定されている。ガラス
基板１９１に蛍光体ＦＡ１１１、ＦＢ１１２で標識され
たＰＣＲ産物１０１、１０２をのせ、ＤＮＡプローブと
相補鎖結合させる。その後、洗浄して相補鎖結合しなか
ったＰＣＲ産物を洗い流す。ＤＮＡプローブ１９２が固
定されているガラス基板上の区画では、ＰＣＲ産物（混
合物）のうち、ＤＮＡプローブ１９２に相補でないＰＣ
Ｒ産物は洗い流され、相補なＰＣＲ産物１０３、１０４
はＤＮＡプローブ１９２に相補鎖結合する。同様に、Ｄ
ＮＡプローブ１９３が固定されているガラス基板上の区
画では、ＤＮＡプローブ１９３に相補でないＰＣＲ産物
は洗い流され、相補なＰＣＲ反応産物１０５はＤＮＡプ
ローブ１９３に相補鎖結合する。ＰＣＲ産物１０３、１
０５はＰＣＲ産物１０１のうち、ＤＮＡプローブアレイ
上のＤＮＡプローブ１９２、１９３にそれぞれ相補鎖結
合したＤＮＡ断片であり、蛍光体ＦＡ１１１で標識され
ている。一方、ＰＣＲ産物１０４はＤＮＡプローブアレ
イ上のＤＮＡプローブ１９２に相補鎖結合したＤＮＡ断
片であり、蛍光体ＦＢ１１２で標識されている。
【００５６】図６は、本発明の第２の実施例に於いて、
ＤＮＡプローブアレイ上の試料を検出するための蛍光顕
微鏡の構成を示す図である。図６に示すレーザー顕微鏡
を用いてＤＮＡプローブアレイ上に相補鎖結合したＰＣ
Ｒ産物を検出する。レーザー光源１３１から出たレーザ
ービーム１３２はダイクロイックミラー１３４で反射さ
れ、顕微鏡ステージ１３３上に置かれているＤＮＡプロ
ーブアレイ１３５を照射する。ＤＮＡプローブアレイ上
の蛍光体から発する蛍光１３６はフィルター１３７を通
して検出器１３８で検出される。第２の実施例では２種
類の蛍光体ＦＡ、ＦＢを使用したので、透過波長の異な
るフィルターを２種類用意して、それぞれの蛍光波長を
検出する。
ＤＮＡプローブアレイ上の試料を検出するための蛍光顕
微鏡の構成を示す図である。図６に示すレーザー顕微鏡
を用いてＤＮＡプローブアレイ上に相補鎖結合したＰＣ
Ｒ産物を検出する。レーザー光源１３１から出たレーザ
ービーム１３２はダイクロイックミラー１３４で反射さ
れ、顕微鏡ステージ１３３上に置かれているＤＮＡプロ
ーブアレイ１３５を照射する。ＤＮＡプローブアレイ上
の蛍光体から発する蛍光１３６はフィルター１３７を通
して検出器１３８で検出される。第２の実施例では２種
類の蛍光体ＦＡ、ＦＢを使用したので、透過波長の異な
るフィルターを２種類用意して、それぞれの蛍光波長を
検出する。
【００５７】図７は、本発明の第２の実施例のプライマ
ーを用いて、発現遺伝子モニターを行ない、ＤＮＡプロ
ーブアレイを用いて得られる蛍光強度を示すグラフの一
部を示す図である。図７に示すように、ＤＮＡプローブ
アレイ上のそれぞれのＤＮＡプローブが固定された位置
から検出される蛍光強度を比較することにより、複数種
のＤＮＡ断片の比較を行なう。図７の縦軸１４１、１４
２は、それぞれ異なる蛍光体で標識されたＰＣＲ産物か
らの蛍光強度を示している。横軸はＤＮＡプローブアレ
イ上でのＤＮＡプローブが固定された位置を示すナンバ
リングである。ＤＮＡプローブアレイ上の同じＤＮＡプ
ローブの位置で、それぞれの波長の蛍光強度を比較する
ことにより、複数の試料から抽出して得られたＤＮＡ断
片の比較を行なう。ｃＤＮＡ断片を同一の反応チューブ
で同時にＰＣＲ増幅するため、ＰＣＲの再現性の問題を
考慮することなく、容易に比較解析ができる。
ーを用いて、発現遺伝子モニターを行ない、ＤＮＡプロ
ーブアレイを用いて得られる蛍光強度を示すグラフの一
部を示す図である。図７に示すように、ＤＮＡプローブ
アレイ上のそれぞれのＤＮＡプローブが固定された位置
から検出される蛍光強度を比較することにより、複数種
のＤＮＡ断片の比較を行なう。図７の縦軸１４１、１４
２は、それぞれ異なる蛍光体で標識されたＰＣＲ産物か
らの蛍光強度を示している。横軸はＤＮＡプローブアレ
イ上でのＤＮＡプローブが固定された位置を示すナンバ
リングである。ＤＮＡプローブアレイ上の同じＤＮＡプ
ローブの位置で、それぞれの波長の蛍光強度を比較する
ことにより、複数の試料から抽出して得られたＤＮＡ断
片の比較を行なう。ｃＤＮＡ断片を同一の反応チューブ
で同時にＰＣＲ増幅するため、ＰＣＲの再現性の問題を
考慮することなく、容易に比較解析ができる。
【００５８】本発明では、少なくとも２組以上のプライ
マーを用いて、同じ反応チューブでＰＣＲを行なう。各
々のプライマーは、異なる蛍光体で標識されており、そ
れぞれ独立に機能する。一方の試料ＤＮＡは第１の組の
プライマーで増幅され、他方の試料ＤＮＡは第２の組の
プライマーで増幅される様に、各々のプライマーに相補
な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを各々の試料ＤＮ
Ａに結合させておき、複数の試料ＤＮＡを同じ反応チュ
ーブに入れて、同一反応チューブ内でＰＣＲを行なう。
ＰＣＲで用いる複数のプライマーのＴm値を揃え、各プ
ライマーによる反応効率の差をなくしておく。複数のプ
ライマーのＴm値を揃えるために、各プライマーの塩基
配列に、４塩基〜６塩基からなる複数のサブユニットを
含ませて、サブユニット同士の順番を入れ替えることに
より、複数のプライマーを構成する。サブユニットの順
番を入れ替えても、サブユニットとサブユニットが連結
する部分の塩基配列が変化しないように、サブユニット
の両末端の塩基種は同じにしておく。このように、Ｔm
値がほぼ同じ値をとり、ＰＣＲの反応効率に差がない複
数のプライマーを用いて、複数の試料ＤＮＡを同一反応
チューブでＰＣＲを行なうことにより反応毎のばらつき
をなくすことができる。
マーを用いて、同じ反応チューブでＰＣＲを行なう。各
々のプライマーは、異なる蛍光体で標識されており、そ
れぞれ独立に機能する。一方の試料ＤＮＡは第１の組の
プライマーで増幅され、他方の試料ＤＮＡは第２の組の
プライマーで増幅される様に、各々のプライマーに相補
な塩基配列を持つオリゴヌクレオチドを各々の試料ＤＮ
Ａに結合させておき、複数の試料ＤＮＡを同じ反応チュ
ーブに入れて、同一反応チューブ内でＰＣＲを行なう。
ＰＣＲで用いる複数のプライマーのＴm値を揃え、各プ
ライマーによる反応効率の差をなくしておく。複数のプ
ライマーのＴm値を揃えるために、各プライマーの塩基
配列に、４塩基〜６塩基からなる複数のサブユニットを
含ませて、サブユニット同士の順番を入れ替えることに
より、複数のプライマーを構成する。サブユニットの順
番を入れ替えても、サブユニットとサブユニットが連結
する部分の塩基配列が変化しないように、サブユニット
の両末端の塩基種は同じにしておく。このように、Ｔm
値がほぼ同じ値をとり、ＰＣＲの反応効率に差がない複
数のプライマーを用いて、複数の試料ＤＮＡを同一反応
チューブでＰＣＲを行なうことにより反応毎のばらつき
をなくすことができる。
【００５９】
【発明の効果】本発明によれば、複数のサブユニットの
配列の順序を変化させたプライマーを複数使用すること
により、Ｔm値が同じ複数のプライマーの調製が可能に
なる。その結果、複数の試料ＤＮＡをＰＣＲによって増
幅しその増幅産物を比較する際に、複数の試料から抽出
したＤＮＡ、又はＲＮＡを同一反応チューブでＰＣＲ増
幅でき、ＰＣＲ産物を同じ電気泳動レーンで分析でき
る。反応の手間を低減し、反応チューブ毎のＰＣＲのば
らつきがなくなるため、従来技術での再現性の問題を考
慮する必要がなく、比較の精度を向上させることができ
る。
配列の順序を変化させたプライマーを複数使用すること
により、Ｔm値が同じ複数のプライマーの調製が可能に
なる。その結果、複数の試料ＤＮＡをＰＣＲによって増
幅しその増幅産物を比較する際に、複数の試料から抽出
したＤＮＡ、又はＲＮＡを同一反応チューブでＰＣＲ増
幅でき、ＰＣＲ産物を同じ電気泳動レーンで分析でき
る。反応の手間を低減し、反応チューブ毎のＰＣＲのば
らつきがなくなるため、従来技術での再現性の問題を考
慮する必要がなく、比較の精度を向上させることができ
る。
【００６０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING 〈110〉 HITACH、LTD. 〈120〉 Analysis Method for Mixture of DNA Fragments 〈130〉 H98022681A1 〈160〉 4 〈210〉 1 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉 artificial Sequence 〈220〉 〈221〉 unsure 〈222〉 (21)-(22) 〈223〉 DNA primer used for PCR (n is a or c or g or t). 〈400〉 1 tcatcacctt ctccacgatc nn 22 〈210〉 2 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉 〈221〉 unsure 〈222〉 (21)-(22) 〈223〉 DNA primer used for PCR (n is a or c or g or t). 〈400〉 2 ttctccactc atcaccgatc nn 22 〈210〉 3 〈211〉 14 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉 〈221〉 unsure 〈222〉 (21)-(22) 〈223〉 DNA primer used for PCR (n is a or c or g or t). 〈400〉 3 acaagacgat cagcaggatc nn 22 〈210〉 4 〈211〉 22 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial Sequence 〈220〉 〈221〉 unsure 〈222〉 （２１）−（２２） 〈２２３〉 DNA primer used for PCR (n is a or c or g or t). 〈400〉 4 acaagcagat cagacggatc nn 22 配列表フリーテキスト （１）配列番号１の配列に関する他の関連する情報の記
載 ＰＣＲに使用されるＤＮＡプライマー（ｎは、ａ、ｃ、
ｇ、ｔの何れか）。
載 ＰＣＲに使用されるＤＮＡプライマー（ｎは、ａ、ｃ、
ｇ、ｔの何れか）。
【００６１】（２）配列番号２の配列に関する他の関連
する情報の記載 ＰＣＲに使用されるＤＮＡプライマー（ｎは、ａ、ｃ、
ｇ、ｔの何れか）。
する情報の記載 ＰＣＲに使用されるＤＮＡプライマー（ｎは、ａ、ｃ、
ｇ、ｔの何れか）。
【００６２】（３）配列番号３の配列に関する他の関連
する情報の記載 ＰＣＲに使用されるＤＮＡプライマー（ｎは、ａ、ｃ、
ｇ、ｔの何れか）。
する情報の記載 ＰＣＲに使用されるＤＮＡプライマー（ｎは、ａ、ｃ、
ｇ、ｔの何れか）。
【００６３】（４）配列番号４の配列に関する他の関連
する情報の記載 ＰＣＲに使用されるＤＮＡプライマー（ｎは、ａ、ｃ、
ｇ、ｔの何れか）。
する情報の記載 ＰＣＲに使用されるＤＮＡプライマー（ｎは、ａ、ｃ、
ｇ、ｔの何れか）。
【図１】本発明の第１の実施例の、発現遺伝子モニター
の手順を示すフローチャート。
の手順を示すフローチャート。
【図２】本発明の第１の実施例のプライマー、及び既知
塩基配列オリゴヌクレオチドの構造を示す図。
塩基配列オリゴヌクレオチドの構造を示す図。
【図３】本発明の第１の実施例のプライマーを用いて発
現遺伝子モニターを行ない得られるエレクトロフェログ
ラムの一部を示す図。
現遺伝子モニターを行ない得られるエレクトロフェログ
ラムの一部を示す図。
【図４】図４は本発明の第２の実施例の、発現遺伝子モ
ニターを行なう手順を示すフローチャート。
ニターを行なう手順を示すフローチャート。
【図５】本発明の第２の実施例に於いて、発現遺伝子の
比較をＤＮＡプローブアレイを用いて行なう手順を示す
図。
比較をＤＮＡプローブアレイを用いて行なう手順を示す
図。
【図６】本発明の第２の実施例に於いて、ＤＮＡプロー
ブアレイ上の試料を検出するための蛍光顕微鏡の構成を
示す図。
ブアレイ上の試料を検出するための蛍光顕微鏡の構成を
示す図。
【図７】本発明の第２の実施例のプライマーを用いて、
発現遺伝子モニターを行ない、ＤＮＡプローブアレイを
用いて得られる蛍光強度を示すグラフの一部を示す図。
発現遺伝子モニターを行ない、ＤＮＡプローブアレイを
用いて得られる蛍光強度を示すグラフの一部を示す図。
１、２、６１、６２…試料ｃＤＮＡ混合物、３、４、６
３、６４…ｃＤＮＡ制限酵素断片、５、６…末端に既知
塩基配列オリゴヌクレオチドを導入したｃＤＮＡ断片、
７、８…ｃＤＮＡ断片＋鎖、９、１０…ｃＤＮＡ断片−
鎖、１１、１２…既知塩基配列オリゴヌクレオチド、１
３、１４、７３、７４…共通塩基配列、１５、１６、３
６、７５、７６…選択塩基配列、１７、１８、６７、６
８、１０１、１０２…ＰＣＲ増幅産物、２１、２２、４
１、４２、８１、８２…プライマー、２３、２４、８
３、８４…プライマーセット、２５、２６、３７、３
８、８５、８６、１１１、１１２…蛍光体、２７、２
８、２９、９１、９２、９３…反応チューブ、３１、３
２、３３、３４…サブユニットの配列、３５…制限酵素
認識塩基配列、４３、４４…オリゴヌクレオチド、４
５、４６…ＤＮＡ断片、４８…制限酵素切断部位、５
１、５２、…エレクトロフェログラム、５３…塩基長、
５５…特異的に発現している遺伝子に由来するピーク、
６５、６６…末端に既知塩基配列オリゴマーを導入した
ｃＤＮＡ断片、７１、７２…既知塩基配列オリゴマー、
１０３、１０４、１０５…ＤＮＡプローブに結合したＰ
ＣＲ産物、１３１…レーザー光源、１３２…レーザービ
ーム、１３３…顕微鏡ステージ、１３４…ダイクロイッ
クミラー、１３５…ＤＮＡプローブアレイ、１３６…蛍
光、１３７…フィルター、１３８…検出器、１４１、１
４２…ＰＣＲ産物からの蛍光強度、１９１…ガラス基
板、１９２、１９３…ＤＮＡプローブ。
３、６４…ｃＤＮＡ制限酵素断片、５、６…末端に既知
塩基配列オリゴヌクレオチドを導入したｃＤＮＡ断片、
７、８…ｃＤＮＡ断片＋鎖、９、１０…ｃＤＮＡ断片−
鎖、１１、１２…既知塩基配列オリゴヌクレオチド、１
３、１４、７３、７４…共通塩基配列、１５、１６、３
６、７５、７６…選択塩基配列、１７、１８、６７、６
８、１０１、１０２…ＰＣＲ増幅産物、２１、２２、４
１、４２、８１、８２…プライマー、２３、２４、８
３、８４…プライマーセット、２５、２６、３７、３
８、８５、８６、１１１、１１２…蛍光体、２７、２
８、２９、９１、９２、９３…反応チューブ、３１、３
２、３３、３４…サブユニットの配列、３５…制限酵素
認識塩基配列、４３、４４…オリゴヌクレオチド、４
５、４６…ＤＮＡ断片、４８…制限酵素切断部位、５
１、５２、…エレクトロフェログラム、５３…塩基長、
５５…特異的に発現している遺伝子に由来するピーク、
６５、６６…末端に既知塩基配列オリゴマーを導入した
ｃＤＮＡ断片、７１、７２…既知塩基配列オリゴマー、
１０３、１０４、１０５…ＤＮＡプローブに結合したＰ
ＣＲ産物、１３１…レーザー光源、１３２…レーザービ
ーム、１３３…顕微鏡ステージ、１３４…ダイクロイッ
クミラー、１３５…ＤＮＡプローブアレイ、１３６…蛍
光、１３７…フィルター、１３８…検出器、１４１、１
４２…ＰＣＲ産物からの蛍光強度、１９１…ガラス基
板、１９２、１９３…ＤＮＡプローブ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡野 和宣 東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB50 DA13 DA14 FB01 FB05 FB07 FB12 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 CA11 DA02 HA09 HA11 4B063 QA01 QQ02 QQ42 QQ52 QR14 QR31 QR55 QR62 QR66 QS16 QS25 QS34 QX01 QX02
Claims (16)
- 【請求項１】１）ＤＮＡ断片群の各群のＤＮＡ断片に、
同じ溶解温度と同じ長さを持つプライマーと相補結合す
るオリゴマーを、前記各群毎に異ならせて結合する工程
と、 ２）前記オリゴマーが結合した前記各群の前記ＤＮＡ断
片を混合する工程と、３）前記オリゴマーに相補な前記
各群に対応する前記プライマーを用いて、前記オリゴマ
ーが結合した前記各群の前記ＤＮＡ断片を、同一容器で
同時にＰＣＲする工程、４）ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断
片を検出する工程とを有することを特徴とする混合ＤＮ
Ａ断片分析法。 - 【請求項２】請求項１に記載の混合ＤＮＡ断片分析法に
於いて、前記各群に対応する前記プライマーは、前記各
群に対応して異なる蛍光体で標識されており、前記ＰＣ
Ｒ増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動し、前記蛍光体で標
識されたＤＮＡ断片を検出することを特徴とする混合Ｄ
ＮＡ断片分析法。 - 【請求項３】請求項１に記載の混合ＤＮＡ断片分析法に
於いて、前記各群の前記ＤＮＡ断片に相補な塩基配列を
持つＤＮＡプローブを複数種類固定したＤＮＡプローブ
アレイを用いて、前記ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を検
出することを特徴とする混合ＤＮＡ断片分析法。 - 【請求項４】請求項１に記載の混合ＤＮＡ断片分析法に
於いて、前記各群に対応する前記プライマーは、前記各
群に対応して異なる蛍光体で標識されていることを特徴
とする混合ＤＮＡ断片分析法。 - 【請求項５】請求項１に記載の混合ＤＮＡ断片分析法に
於いて、前記プライマーは、４塩基〜６塩基からなる複
数のサブユニット配列を有し、該複数のサブユニット配
列の並びの順番は、前記各群に対応して異なることを特
徴とする混合ＤＮＡ断片分析法。 - 【請求項６】請求項５に記載の混合ＤＮＡ断片分析法に
於いて、前記サブユニット配列の３’末端の塩基種と
５’末端の塩基種とが同一であることを特徴とする混合
ＤＮＡ断片分析法。 - 【請求項７】請求項１に記載の混合ＤＮＡ断片分析法に
於いて、前記各群に対応する前記プライマーは、前記各
群毎に前記プライマーに共通する１０塩基〜２５塩基か
らなる共通塩基配列と、１塩基〜３塩基からなり前記各
群の前記ＤＮＡ断片を識別する選択用塩基配列とを有
し、前記共通塩基配列部分は、４塩基〜６塩基からなる
複数のサブユニット配列の異なる並びを前記各群に対応
して含み、前記選択用塩基配列は、前記１塩基〜３塩基
の組合せの可能な全ての塩基配列を含むことを特徴とす
る混合ＤＮＡ断片分析法。 - 【請求項８】請求項１に記載の混合ＤＮＡ断片分析法に
使用されるプライマーであり、該プライマーは、４塩基
〜６塩基からなる複数のサブユニット配列を有し、該複
数のサブユニット配列の並びの順番は、前記各群に対応
して異なることを特徴とするプライマー。 - 【請求項９】請求項８に記載のプライマーに於いて、前
記サブユニット配列の３’末端の塩基種と５’末端の塩
基種とが同一であることを特徴とするプライマー。 - 【請求項１０】請求項１に記載の混合ＤＮＡ断片分析法
に使用されるプライマーであり、前記各群に対応する前
記プライマーは、前記各群毎に前記プライマーに共通す
る１０塩基〜２５塩基からなる共通塩基配列と、１塩基
〜３塩基からなり前記各群の前記ＤＮＡ断片を識別する
選択用塩基配列とを有し、前記共通塩基配列部分は、４
塩基〜６塩基からなる複数のサブユニット配列の異なる
並びを前記各群に対応して含み、前記選択用塩基配列
は、前記１塩基〜３塩基の組合せの可能な全ての塩基配
列を含むことを特徴とするプライマー。 - 【請求項１１】請求項１０に記載のプライマーに於い
て、前記サブユニット配列の３’末端の塩基種と５’末
端の塩基種とが同一であることを特徴とするプライマ
ー。 - 【請求項１２】ＰＣＲに使用される異なる塩基配列を持
つ複数のプライマーであり、該プライマーは、複数の塩
基からなる複数のサブユニット配列の並びを有し、前記
複数のプライマーは、前記並びが異なり同じ溶解温度を
持つことを特徴とするプライマー。 - 【請求項１３】請求項１２に記載のプライマーに於い
て、前記サブユニット配列の３’末端の塩基種と５’末
端の塩基種とが同一であることを特徴とするプライマ
ー。 - 【請求項１４】ＰＣＲに使用される異なる塩基配列を持
つ複数のプライマーを有する複数のプライマーセットで
あり、該各プライマーセット毎に前記プライマーに共通
する１０塩基〜２５塩基からなる共通塩基配列と、１塩
基〜３塩基からなり試料ＤＮＡから得たＤＮＡ断片を識
別する選択用塩基配列とを有し、前記共通塩基配列部分
は、４塩基〜６塩基からなる複数のサブユニット配列の
異なる並びを前記プライマーセットに対応して含み、前
記選択用塩基配列は、前記１塩基〜３塩基の組合せの可
能な全ての塩基配列を含むことを特徴とするプライマー
セット。 - 【請求項１５】請求項１４に記載のプライマーに於い
て、前記サブユニット配列の３’末端の塩基種と５’末
端の塩基種とが同一であることを特徴とするプライマ
ー。 - 【請求項１６】請求項１４に記載のプライマーに於い
て、前記複数のプライマーセットの前記複数のプライマ
ーは、同じ溶解温度を持つことを特徴とするプライマ
ー。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28628698A JP3855492B2 (ja) | 1998-10-08 | 1998-10-08 | 混合核酸断片分析法 |
| US09/413,814 US6225064B1 (en) | 1998-10-08 | 1999-10-07 | Method for assaying DNA fragments in mixture |
| US09/842,791 US20020098490A1 (en) | 1998-10-08 | 2001-04-27 | Method for assaying DNA fragments in mixture |
| US10/634,795 US7241597B2 (en) | 1998-10-08 | 2003-08-06 | Method for assaying DNA fragments in mixture |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28628698A JP3855492B2 (ja) | 1998-10-08 | 1998-10-08 | 混合核酸断片分析法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000106900A true JP2000106900A (ja) | 2000-04-18 |
| JP3855492B2 JP3855492B2 (ja) | 2006-12-13 |
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ID=17702418
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28628698A Expired - Fee Related JP3855492B2 (ja) | 1998-10-08 | 1998-10-08 | 混合核酸断片分析法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3855492B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002046393A1 (fr) * | 2000-12-07 | 2002-06-13 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Procede d'identification de polymorphisme nucleotidique |
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|---|---|---|---|---|
| JP3855492B2 (ja) * | 1998-10-08 | 2006-12-13 | 株式会社日立製作所 | 混合核酸断片分析法 |
| US20030207295A1 (en) * | 1999-04-20 | 2003-11-06 | Kevin Gunderson | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
| US20060275782A1 (en) | 1999-04-20 | 2006-12-07 | Illumina, Inc. | Detection of nucleic acid reactions on bead arrays |
| US8076063B2 (en) | 2000-02-07 | 2011-12-13 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| DK1259643T3 (da) * | 2000-02-07 | 2009-02-23 | Illumina Inc | Fremgangsmåde til detektion af nukleinsyre ved anvendelse af universel priming |
| US6913884B2 (en) * | 2001-08-16 | 2005-07-05 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA |
| US7955794B2 (en) * | 2000-09-21 | 2011-06-07 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US7611869B2 (en) * | 2000-02-07 | 2009-11-03 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| CN1182256C (zh) * | 2002-08-09 | 2004-12-29 | 周国华 | 基因表达量比较分析法 |
| US20040259105A1 (en) * | 2002-10-03 | 2004-12-23 | Jian-Bing Fan | Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples |
| US7622281B2 (en) * | 2004-05-20 | 2009-11-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid |
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|---|---|---|---|---|
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| US5627032A (en) * | 1990-12-24 | 1997-05-06 | Ulanovsky; Levy | Composite primers for nucleic acids |
| RU2182176C2 (ru) * | 1991-09-24 | 2002-05-10 | Кейгене Н.В. | Способ селективной амплификации, олигонуклеотид и набор для селективной амплификации |
| JP3322894B2 (ja) | 1991-10-22 | 2002-09-09 | 株式会社日立製作所 | 核酸試料蛍光検出方法 |
| US5545527A (en) * | 1994-07-08 | 1996-08-13 | Visible Genetics Inc. | Method for testing for mutations in DNA from a patient sample |
| JP3735400B2 (ja) | 1995-01-19 | 2006-01-18 | 湧永製薬株式会社 | メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出法及びキット |
| US5565340A (en) * | 1995-01-27 | 1996-10-15 | Clontech Laboratories, Inc. | Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR |
| US6060240A (en) * | 1996-12-13 | 2000-05-09 | Arcaris, Inc. | Methods for measuring relative amounts of nucleic acids in a complex mixture and retrieval of specific sequences therefrom |
| US6333179B1 (en) * | 1997-06-20 | 2001-12-25 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for multiplex amplification of nucleic acids |
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1999
- 1999-10-07 US US09/413,814 patent/US6225064B1/en not_active Expired - Fee Related
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- 2001-04-27 US US09/842,791 patent/US20020098490A1/en not_active Abandoned
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2003
- 2003-08-06 US US10/634,795 patent/US7241597B2/en not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| WO2002046393A1 (fr) * | 2000-12-07 | 2002-06-13 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Procede d'identification de polymorphisme nucleotidique |
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