JP3783315B2 - 核酸分析方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸を用いた診断、核酸の特性評価法、分析方法、及びこれに用いるＤＮＡプライマーセットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡを病気の診断等に用いることが盛んになりつつある。この診断では、目的とするＤＮＡと相補的な塩基配列をもつＤＮＡプローブを作り、このＤＮＡプローブが目的とするＤＮＡとハイブリダイズするか否かをみるプローブ検査を行なったり、目的とするＤＮＡの塩基配列の特定の領域を選び、２つのＤＮＡプローブ（プライマー）を用いてＰＣＲ増幅により生成したＤＮＡ断片の塩基配列情報を得て診断等に用いている。これらの方法は１種類〜数種類のＤＮＡを調べるのには良いが、非常に多数のＤＮＡ断片を含むＤＮＡの検査や長いＤＮＡの評価には適していない。しかし、生体内でのＤＮＡ又は遺伝子は相互に関連しながら働いており、染色体又は含まれる全てのＤＮＡを総合して把握し評価したいという要求が強い。例えば、ゲノム解析プロジェクトの中で注目されているｃ−ＤＮＡプロジェクトでは、ＤＮＡが生体中で機能する場合、ＤＮＡ情報はまずｍ−ＲＮＡに転写され、蛋白が合成され生体が機能する事に注目し、ｍ−ＲＮＡからその相補鎖であるｃ−ＤＮＡを作り、ｃ−ＤＮＡの種類と量の情報から生体を総合的に理解しようとする試みがなされている。
【０００３】
細胞中で機能しているｍ−ＲＮＡに対応するｃ−ＤＮＡを分離し個々のｃ−ＤＮＡの塩基配列を決め、ｃ−ＤＮＡの塩基配列が１つの組織に現われる頻度を調べている。このためにまず、ｍ−ＲＮＡからｃ−ＤＮＡを作り（種々のｃ−ＤＮＡが混合した状態）目的とするｃ−ＤＮＡをクローニングする。ｃ−ＤＮＡを含んだ大腸菌を寒天培地に撒き、培養しコロニーを得る。各コロニーには目的とするｃ−ＤＮＡのうち何れか１種類が入っているので、目的とするｃ−ＤＮＡを取り出し塩基配列を決定し、ｃ−ＤＮＡの種類を同定する。次々に各コロニーに関してｃ−ＤＮＡの種類を同定していくと、同一種類のｃ−ＤＮＡが出現する。１つの組織中にある特定のｃ−ＤＮＡに注目した時、その量が多いほどその組織で強く発現している遺伝子に相当するので、コロニー中での出現頻度も高い。そこでｃ−ＤＮＡの塩基配列解析を多数のコロニーで行ない、どのｃ−ＤＮＡが何回出現するかの頻度を求めている（文献：Ｋ．Ｍｕｒａｋａｗａ ｅｔ．ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２３、ｐ３７９−ｐ３８９（１９９４））。
【０００４】
一方、ゲノム（全ての染色体中ＤＮＡ）又は特定の染色体全体に注目し、ＤＮＡ診断を行なう試みも行なわれている。Ｇｅｎｅ Ｓｃａｎ法（制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法）と呼ばれる分析法がある（文献：Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ．ａｌ．、「ＤＮＡ多型（ＤＮＡ ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＳＭ）」、ｖｏｌ．３、ｐ１０−ｐ１５（１９９５）（東洋書店））。この方法では、まずＤＮＡを第１の制限酵素（例えば、ＮｏｔＩ等の８塩基認識酵素（平均６４ｋ塩基に１回の頻度で切断される）を用いる）で切断し、切断部にラジオアイソトープ又は蛍光標識をしたヌクレオチドを結合し、アガロースゲルを用いて第１の方向に電気泳動する。泳動分離後、第２の制限酵素（例えば、４塩基認識酵素（平均２５６塩基に１回の頻度で切断される）を用いる）により、アガロースゲル中で泳動分離したＤＮＡ断片をさらに切断した後、第１の方向と直交する第２の方向に電気泳動し、２次元泳動パターンを得る。この２次元泳動パターンをフィンガープリントとして利用して、ＤＮＡ全体の検査を行なう。正常細胞中のＤＮＡとガン等の異常のある細胞のＤＮＡとでは、２次元泳動パターンが異なることを利用して、診断に用いる等の試みがなされている。しかし、大きなＤＮＡのどこに異常があるかを調べるには良い方法がないのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
以上説明したように、長塩基長のＤＮＡを調べたり、複数種類のＤＮＡが含まれる試料の全体像を把握し、検査することは、病気の早期発見、ＤＮＡが細胞中で果している機能の理解の上で重要であるが、従来技術では良い方法がないのが現状である。ｃ−ＤＮＡ解析に関する従来技術では、非常に多くのクローンに含まれる試料の塩基配列を決定する必要があり、手間と時間がかかるため種々の試料に適用するには現実的ではないという問題があった。また、従来のＤＮＡプローブを用いる方法では、せいぜい数種類〜十種類のＤＮＡを一度に分析できるだけで、数百〜数万種類にも及ぶｃ−ＤＮＡやＤＮＡ断片の検査には不向きであり、更に、どこに異常があるか不明な長いＤＮＡの検査にも適用できないという問題があった。
【０００６】
一方、従来技術のＧｅｎｅ Ｓｃａｎ法では長塩基長のＤＮＡの検査ができるが、サンプルＤＮＡの量を多く必要とすること、第１方向に泳動分離されたＤＮＡ断片を切断するために使用される第２の制限酵素の量が厖大であること、２次元泳動パターンの各ＤＮＡ断片の位置が２つの電気泳動方向で常に定量的に得られず、２次元電気泳動分離された各ＤＮＡ断片の長さが正確に決定できないため、フィンガープリントとしてデータベース化しにくい等の問題があった。本発明の目的は、これら従来技術の問題点を克服する新しいフィンガープリント法、ＤＮＡ検査法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明では、まず２本鎖の試料ＤＮＡを２種類以上の制限酵素により切断し、複数種類の長さをもつ試料ＤＮＡに固有な２本鎖ＤＮＡ断片群を生成する。２本鎖ＤＮＡ断片の両側の３’末端に、既知塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを結合し、ＤＮＡプライマーの一部がハイブリダイズできる領域を設ける。この領域と使用した制限酵素が認識する塩基配列及びそれに続く数塩基の位置にハイブリダイズするＤＮＡプライマーセットを複数種用意する。ＤＮＡプライマーセットのプライマーの３’末端の１〜３塩基は、実質全ての塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）の組合わせからなる、ＤＮＡ断片の制限酵素の認識配列に続く１〜３塩基の配列を識別（分類）するための選択塩基配列である。使用する制限酵素の数と用意するＤＮＡプライマーセットの数は同一である。各ＤＮＡプライマーセットのプライマーの組合わせの数に、２本鎖ＤＮＡ断片群を分画して、各分画に異なるプライマーの組合わせを添加して、ハイブリダイズさせ相補鎖合成反応を行なう。各ＤＮＡプライマーセットのプライマーは蛍光体等で標識しておく。各分画で得た相補鎖合成反応生成物を別々の泳動路でゲル電気泳動分離し、各ＤＮＡ断片の長さを測定してフィンガープリントを得る。
【０００８】
２本鎖ＤＮＡ断片群が多数のＤＮＡ断片を含み、長さが識別しにくい場合でも、ほとんどの場合、各ＤＮＡ断片は制限酵素切断部に続く塩基配列が異なる。そこでＤＮＡ断片の制限酵素切断部に続く塩基配列の違いを利用してＤＮＡ断片の分類を行なう。ＤＮＡ断片を分類するには、３’末端の１塩基〜３塩基が全ての組合わせの塩基配列をもつ、４種類〜６４種類のＤＮＡプライマーを用いて相補鎖合成反応を行なう。ＤＮＡプライマーの末端２塩基〜３塩基がＤＮＡ断片に完全にハイブリダイズしている時は、相補鎖合成反応が進行するが、そうではないときは反応は進行しない。
【０００９】
ｍ−ＲＮＡから２本鎖ｃ−ＤＮＡを作製する場合には、ビオチン化オリゴｄＴを含むプライマーを用いて、ｍ−ＲＮＡの３’末端側に相補鎖結合させて、ＤＮＡポリメラーゼにより２本鎖ｃ−ＤＮＡを調製する。なお、キャップ構造を利用してｍ−ＲＮＡの５’末端側に相当するｃ−ＤＮＡ末端にビオチンを入れて同様の操作により２本鎖ｃ−ＤＮＡを調製してもよい。この２本鎖ｃ−ＤＮＡを２つの分画に分け、各分画に第１及び第２の制限酵素を添加して２本鎖ｃ−ＤＮＡを切断する。ビオチンが結合した断片以外を除去し、切断されたＤＮＡ末端にそれぞれ第１及び第２のオリゴヌクレオチドを結合させる。
【００１０】
次いで、第１の制限酵素を添加した分画に第２の制限酵素を添加し、第２の制限酵素を添加した分画に第１の制限酵素を添加して再切断を行ない、切断部にそれぞれ第１及び第２のオリゴヌクレオチドを結合させる。ビオチンが結合した断片を除去すると、第１及び第２の制限酵素により両末端が切断され、第１及び第２のオリゴヌクレオチドにより挟まれたＤＮＡ断片が生じる。即ち、両末端が異なる制限酵素により切断された断片が生じる。各制限酵素の認識配列の一部又は全部に相補結合する各ＤＮＡプライマーセットのプライマー（標識されている）の組合わせを用いて相補鎖合成を行なうと、両末端が異なる制限酵素により切断されたＤＮＡ断片のうち、プライマーの末端塩基がハイブリダイズしたＤＮＡ断片のみで反応が進行する。
【００１１】
相補鎖合成されたＤＮＡ鎖は元のＤＮＡ断片鎖と実質的に同じ長さであるので、ゲル電気泳動分離等によりＤＮＡ鎖の長さを計測できる。１度の相補鎖合成反応では合成されるＤＮＡ断片が検出感度に満たない場合には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて複数回の相補鎖合成反応を行ない、合成されるＤＮＡ断片の量を増幅できる。この場合、プライマーの末端塩基配列を変化させ、相補鎖合成するか否かをコントロールできる。この３’末端の塩基配列を選択配列と呼ぶが、選択配列をもち第１及び第２のオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーを用いて、特定のＤＮＡ断片だけを選択的に増幅できる。例えば、選択配列として２塩基を用いると、ＤＮＡ断片を４2×４2＝２５６の種類に分類して得ることができる。
【００１２】
この２５６の種類に分類されたＤＮＡ断片を、種類毎とに異なる泳動路で電気泳動してフィンガープリントパターンを得る。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明による長い核酸の検査を可能とするフィンガープリント法を提供する核酸分析方法を図を用いて詳細に説明する。
【００１４】
（第１の実施例）
図１は、複数種類の制限酵素を用いて、試料ＤＮＡからＤＮＡ断片混合物の作成し、第１、第２のＤＮＡプライマーセットを用いた相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列の全部又は認識配列の３’末端側の一部に相補な塩基配列に続く所定の２塩基の塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を得る手順を説明する図である。第１の実施例では、試料ＤＮＡとして、大腸菌ゲノムＤＮＡ１（〜５Ｍｂ）を用いる。ＮｏｔＩ（８塩基認識制限酵素であり、塩基配列ＧＣＧＧＣＣＧＣを認識する）の認識配列は平均６４ｋｂに１回出現するので、大腸菌ゲノムＤＮＡ１をＮｏｔＩにより切断すると、約１００本の２本鎖ＤＮＡ断片２−１、２−２、２−３、……が生じる。生じた２本鎖ＤＮＡ断片２の両末端（即ち、ＮｏｔＩによる切断部位）に、２本鎖のビオチン化オリゴヌクレオチド（既知塩基配列をもつ）１００を結合してＤＮＡ断片３−１、３−２、……を得る（以下、各図ではビオチンを簡単のためにｂで表わす）。２本鎖のビオチン化オリゴヌクレオチド（第１のオリゴヌクレオチド）１００は、５’末端がビオチン化された１本鎖オリゴヌクレオチド（塩基長は１０〜３０が望ましい）１０と、オリゴヌクレオチド１０に相補な塩基配列１０１とＮｏｔＩの認識する塩基配列に相補な塩基配列（ＣＧＣＣＧＧＣＧ）１０２の全て又は一部とを５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチド１１からなる。
【００１５】
次いで、制限酵素ＮｌａＩＩＩ（４塩基認識酵素であり、塩基配列ＣＡＴＧを認識する）により、ＤＮＡ断片３−１、３−２、……をさらに切断する。ＮｌａＩＩＩの認識配列は平均２５６塩基に１回出現するので、各ＤＮＡ断片３−１、３−２、……は両末端近傍で切断される。制限酵素ＮｌａＩＩＩにより断片化されたＤＮＡ断片４−１、４−２、……、４−ｎ、４’−１、４’−２、……、４’−ｍの両末端（即ち、ＮｌａＩＩＩによる切断部位）に、２本鎖の第２のオリゴヌクレオチド１１０を結合する。２本鎖の第２のオリゴヌクレオチド（既知塩基配列をもつ）１１０は、１本鎖オリゴヌクレオチド１２（塩基長は１０〜３０が望ましい）と、オリゴヌクレオチド１２に相補な塩基配列１１１とＮｌａＩＩＩの認識する塩基配列に相補な塩基配列（ＧＴＡＣ）１１２の全部又は一部とを５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチド１３からなる。この結果、両末端に第２のヌクレオチド１１０をもつＤＮＡ断片４”−１、４”−２、……と、一方の末端に第１のオリゴヌクレオチド１００をもち、他方の末端に第２のオリゴヌクレオチド１１０をもつＤＮＡ断片５−１、５−ｎ、……が生成される。
【００１６】
これら生成物から、ビーズ１４に結合したアビジン１５を用いて、一方の末端に第１のオリゴヌクレオチド１００をもち、他方の末端に第２のオリゴヌクレオチド１１０をもつＤＮＡ断片５−１、５−ｎ、……を捕捉する。以上のようにして得られる断片の総数は、ＮｏｔＩにより切断された１つの断片の両末端近傍が切断され２つの断片を得るので約２００となる。
【００１７】
次いで、捕捉された断片を昇温変性又はアルカリ変性させてビオチンｂを含まない相補鎖（ＤＮＡ断片）６（６−１、６−２、６−３、……）を遊離させる。このようにして得た相補鎖６は、３’末端側に、オリゴヌクレオチド１０に相補な塩基配列１０１とＮｏｔＩの認識する塩基配列に相補な塩基配列（ＣＧＣＣＧＧＣＧ）１０２を５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチド１１をもち、５’末端側に、オリゴヌクレオチド１２に相補な塩基配列１１１とＮｌａＩＩＩの認識する塩基配列に相補な塩基配列（ＧＴＡＣ）１１２を５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチド１３をもつ断片である。
【００１８】
ＮｏｔＩの認識配列全て又はＮｏｔＩの認識配列の３’末端側の一部からなる、塩基配列１６−１と、この塩基配列１６−１に続く２塩基からなる選択配列１６−２をもつ第１のＤＮＡプライマーセットのプライマー１６−▲１▼、１６−▲２▼、……を用意する（図１では１６−▲１▼のみを示す）。この第１のＤＮＡプライマーセット１６は、３’末端の２塩基の選択配列の塩基配列が異なる１６種類のプライマーから構成されている。即ち、３’末端の２塩基の選択配列の塩基配列は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃからの２塩基の全ての組合わせに対応した４×４＝１６通りある。同様にして、ＮｌａＩＩＩの認識配列全て又はＮｌａＩＩＩの認識配列の３’末端側の一部からなる、塩基配列１７−１と、この塩基配列１７−１に続く２塩基からなる選択配列１７−２をもつ第２のＤＮＡプライマーセットのプライマー１７−▲１▼、１７−▲２▼、……を用意する（図１では１７−▲１▼のみを示す）。第２のＤＮＡプライマーセット１７も第１のＤＮＡプライマーセット１６と同様に、３’末端の２塩基の選択配列の塩基配列が異なる１６種類のプライマーから構成されている。なお、第１のＤＮＡプライマーセット１６の各プライマーは５’末端を蛍光標識（蛍光標識を＊で示す）しておく。
【００１９】
相補鎖６を含む溶液を２５６個の容器（図示せず）に分注して、２５６個の容器の各々に、第１のＤＮＡプライマーセット１６から選ばれた１種類のプライマーと、第２のＤＮＡプライマーセット１７から選ばれた１種類のプライマーとを添加する。第１、及び第２のＤＮＡプライマーセットからのプライマーの種類の選択は、第１、及び第２のＤＮＡプライマーセットのプライマーの組合わせの合計１６×１６＝２５６通りについて行なう。各容器には異なる組合わせにより選択された２種類のプライマーが添加される。即ち、第１のＤＮＡプライマーセット、第２のＤＮＡプライマーセットとともに１６種類であるから、プライマーの組合わせは１６×１６＝２５６通りであり、この２５６通りのプライマーの組合わせで、２５６個の容器内で相補鎖６の相補鎖合成反応を行なう（図１では簡単のために１つの容器についてのみ図示する）。この相補鎖合成反応では、まずＤＮＡ断片６−ｉ（−鎖）に対して、第１のＤＮＡプライマーセット１６のプライマー１６−▲１▼をプライマーとして伸長反応が進行し、２本鎖が生成する。この２本鎖が昇温変性されて１本鎖となった＋鎖に対して、第２のＤＮＡプライマーセット１７のプライマー１７−▲１▼が、−鎖に対して第１のプライマーセット１６のプライマー１６−▲１▼が、それぞれプライマーとして伸長反応が進行し、２本鎖が生成する。このようにして得た相補鎖合成反応生成物をゲル電気泳動してスペクトルを測定する。ゲル電気泳動では変性ポリアクリルアミドを使用して、２５６個の容器内での相補鎖合成反応生成物は、容器に対応する２５６個の泳動路で１本鎖の状態で電気泳動分離される。なお、第１のＤＮＡプライマーセット１６の各プライマーの５’末端の蛍光標識として、異なる４種類を使用する場合には、異なる４種類の蛍光標識をもつ第１のＤＮＡプライマーセット１６のプライマーを使用する相補鎖合成反応は同一の容器で行なうことができ、６４個の容器内での相補鎖合成反応生成物は、容器に対応する６４個の泳動路で１本鎖の状態で電気泳動分離できる。
【００２０】
図２は、上記の相補鎖合成反応生成物のＤＮＡ断片のゲル電気泳動スペクトルの一部を示す図である。図２において、２１は上記の相補鎖合成反応生成物の全てのＤＮＡ断片を同時に電気泳動分離した場合のスペクトル、２２は上記の容器毎の相補鎖合成反応生成物のＤＮＡ断片によるスペクトル、１６−２、１７−２は使用したプライマーの選択塩基部分の塩基配列、２４はＤＮＡ断片の塩基長を表わす。また、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ、第１のＤＮＡプライマーセット１６のプライマー１６−▲１▼、１６−▲２▼、……の５’末端側にあるＮｏｔＩの認識配列の一部又は全ての塩基配列、第２のＤＮＡプライマーセット１７のプライマー１７−▲１▼、１７−▲２▼、……５’末端側にあるＮｌａＩＩＩの認識配列の一部又は全ての塩基配列である。全てのＤＮＡ断片の長さを同一の泳動路で同時に測定すると、スペクトル２１のように多くのピークが重なって各ＤＮＡ断片が分離ができず分析不可能になる。スペクトル２２は、各々第１、第２のＤＮＡプライマーセットのプライマーの選択配列（各ＤＮＡ断片を識別する）２塩基１６−２、１７−２の組合わせを、変化させて相補鎖合成反応を行ない、ＤＮＡ断片の両末端の塩基配列により識別を行ない、選択配列１６−２、１７−２の組合わせ毎に異なる泳動路でＤＮＡ断片をゲル電気泳動分離したスペクトルである。ＤＮＡ断片群を選択配列１６−２、１７−２の組合わせ毎に分離してスペクトルを得ているので各ピークは分離しており、スペクトルに含まれるＤＮＡ断片の長さ（塩基長２４）を知ることができる。第１の実施例の場合、第１、第２のＤＮＡプライマーセットの２５６通りのプライマーの組合わせを使用して相補鎖合成反応を行なっているので、２５６通りのｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ（ＤＮＡ断片スペクトル）が得られるが、このＤＮＡ断片のｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍは元のＤＮＡ試料に固有のものであり、試料ＤＮＡが異なると別の異なるパターンを示すので、ＤＮＡの診断等に広く使用できる。即ち、第１、第２のＤＮＡプライマーセットのプライマーによる選択配列の複数通りの組み合せにより（図２では、一方の選択配列をＡＡと固定して、他方の選択配列をＡＡ、ＡＣ、ＡＧ、…、ＴＧ、ＴＴからなる１６通りに変化させた組合わせの例を示す）、試料ＤＮＡをより正確に分析できる。 なお、実施例１において、ＤＮＡ断片４”−１、４”−２、……、ＤＮＡ断片５−１、５−ｎ、……の生成に引き続いて、制限酵素ＭｂｏＩ（４塩基認識酵素であり、塩基配列ＧＡＴＣを認識する）により、ＤＮＡ断片４”−１、４”−２、……、ＤＮＡ断片５−１、５−ｎ、……をさらに切断してもよい。この場合には、制限酵素ＭｂｏＩにより断片化されたＤＮＡ断片の両末端（即ち、制限酵素ＭｂｏＩによる切断部位）に、２本鎖の第３のオリゴヌクレオチドを結合してもしなくてもよい。このように第３番目の制限酵素によるＤＮＡ断片の切断を行なう場合、例えば、第３番目の制限酵素が図１に示す５−１、５−ｎを切断した場合、図１において相補鎖合成反応を行っても２本鎖ＤＮＡ断片が得られないので、相補鎖合成反応生成物の電気泳動パターン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｏｇｒａｍ）が単純となるので、フインガープリントパターンの識別が容易となり、試料の分析がより正確となるという効果がある。
【００２１】
（第２の実施例）
第２の実施例はｍ−ＲＮＡの分析に利用した例である。
【００２２】
図３は、本発明の第２の実施例で使用する、ｍ−ＲＮＡから２本鎖ｃ−ＤＮＡを合成して試料ＤＮＡを得る従来技術の反応の手順を説明する図、図４は、本発明の第２の実施例において、２種類の制限酵素により試料ＤＮＡを切断し、２種類のＤＮＡプライマーセットを用いて相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列に続く所定の１塩基を有する塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を得る手順を説明する図である。
【００２３】
図３は、本発明の第２の実施例で使用する、ｍ−ＲＮＡから２本鎖ｃ−ＤＮＡを合成する従来技術（文献：Ｓ．Ｓｕｇａｎｏ ｅｔ．ａｌ．、「蛋白質核酸酵素（ＰＲＯＴＥＩＮ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥ）」、ｖｏｌ．３８、Ｎｏ．３、ｐ２７６−ｐ２８１（１９９３）（共立出版））の反応の手順を説明する図である。図３に示すように、細胞から抽出したｍ−ＲＮＡは、３’末端にポリＡ尾部３３をもち、５’末端にキャップ塩基３１及びリン酸基３２をもつ完全長ｍ−ＲＮＡ３４−１と、５’末端にリン酸基３２をもつ不完全長ｍ−ＲＮＡ３５−１とを含む。まず、ｍ−ＲＮＡ３４−１、３５−１をバクテリアアルカリフォスファターゼで処理して、キャップ構造をもたない不完全長のｍ−ＲＮＡ３５−１の５’末端のリン酸基３２を除去し、ｍ−ＲＮＡ３５−１を、水酸基３６を露出させた構造３５−２に変化させる。
【００２４】
次いで、タバコアシッドピロフォスファターゼで処理して、キャップ構造をもつ完全長ｍ−ＲＮＡ３４−１の５’末端にだけリン酸基３２を露出させ、ｍ−ＲＮＡ３４−１を、リン酸基３２を露出させた構造３４−２に変化させる。次に、ＲＮＡリガーゼを用いて、ｍ−ＲＮＡ３４−２の５’末端に合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド３７を導入したｍ−ＲＮＡ３４−３を得る。ＲＮＡリガーゼはリン酸基にＲＮＡオリゴヌクレオチドを結合し、５’末端の水酸基にはＲＮＡオリゴヌクレオチドを結合しないので、完全長ｍ−ＲＮＡ３４−２にのみに合成オリゴヌクレオチドが結合する。
【００２５】
以上のようにして完全長のｍ−ＲＮＡ３４−１にのみ合成オリゴヌクレオチド３７を導入した後に、オリゴｄＴプライマー、リバーストランスクリプターゼを用いて、ｍ−ＲＮＡをｃ−ＤＮＡ３８に変換する。さらに、ＤＮＡポリメラーゼを用いてｃ−ＤＮＡ３８の２本鎖を合成して、細胞から抽出した各種のｍ−ＲＮＡに関してそれぞれ得られた２本鎖ｃ−ＤＮＡ３９の混合物を２本鎖の試料ＤＮＡ４０として得る。
【００２６】
図４は、２種類の制限酵素により２本鎖の試料ＤＮＡを切断し、２種類のＤＮＡプライマーセットを用いて相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列に続く所定の１塩基を有する塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を得る手順を説明する図である。図４に示す方法は、単一の長い２本鎖ＤＮＡ試料にも適用できることは言うもない。まず、２本鎖ｃ−ＤＮＡの混合物からなる２本鎖の試料ＤＮＡ４０を、制限酵素ＮｌａＩＩＩとＨｈａＩにより断片化する。制限酵素ＮｌａＩＩＩ、ＨｈａＩは各々、２本鎖ＤＮＡをＣＡＴＧ↓、ＧＣＧ↓Ｃのように切断する。切断により生成する各断片の３’末端は、ＮｌａＩＩＩで切断された場合には、ＣＡＴＧ（ＮｌａＩＩＩ切断末端）４６、ＨｈａＩで切断された場合には、ＧＣＧ（ＨｈａＩ切断末端）４７となる。５０は、各制限酵素の認識配列部位（ＮｌａＩＩＩ切断末端、ＨｈａＩ切断末端）に続く５’末端側の１塩基であり、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの何れかを表す。各ＤＮＡ断片４１−１、４１−２、４１−３、……の３’末端に、ライゲーションによりオリゴヌクレオチドを導入するか、又はターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いポリ鎖（ポリＡ鎖、ポリＣ鎖、ポリＧ鎖、ポリＴ鎖いずれか１種類）を付加する。以下では、ポリＡ鎖４２を付加する場合を例にとって説明する。
【００２７】
ＤＮＡ断片の３’末端にポリＡ鎖４２を付加すると、４１’−１、４１’−２に示すように、ＮｌａＩＩＩで切断された３’末端の塩基配列はＣＡＴＧＡＡ…Ａ３’となり、４１’−３に示すように、ＨｈａＩで切断された３’末端の塩基配列はＧＣＧＡＡ…Ａ３’となる。
【００２８】
２組のＤＮＡプローブ（プライマー）セット４９’、４９”を用意する。ＤＮＡプライマーセット４９’、４９”の各プライマーは蛍光体等により標識されている。ＮｌａＩＩＩによる切断部位に相補鎖結合可能なプライマーとして、塩基配列が５’Ｔ…ＴＴＣＡＴＧＸ３’（Ｘ＝ＡｏｒＣｏｒＧｏｒＴ）であるプライマーの４種類からなる第１のＤＮＡプライマーセット（Ｒ１−Ｘ、Ｒ１＝＊Ｔ…ＴＴＣＡＴＧ、＊は蛍光標識を表す）を用意する。ＨｈａＩによる切断部位に相補鎖結合可能なプライマーとして、塩基配列が５’Ｔ…ＴＴＣＧＣＸ３’（Ｘ＝ＡｏｒＣｏｒＧｏｒＴ）であるプライマーの４種類からなる第２のＤＮＡプライマーセット（Ｒ２−Ｘ、Ｒ２＝＊Ｔ…ＴＴＣＧＣ、＊は蛍光標識を表す）を用意する。
【００２９】
第１のＤＮＡプライマーセットのプライマーの５’末端からＣＡＴＧまでの塩基配列はＮｌａＩＩＩにより切断されたＤＮＡ断片の全てと相補的であるので、ＮｌａＩＩＩにより切断されたＤＮＡ断片の末端にハイブリダイズするが、塩基配列Ｘの部分は、塩基Ｘに相補な塩基をもつ断片にだけハイブリダイズする。例えば、Ｘ＝Ａの場合には、塩基Ｘの部分は塩基Ｎの部分５０が相補な塩基Ｔをもつ断片にだけハイブリダイズする。塩基Ｎの部分５０が相補な塩基でない場合には、５２のように塩基Ｘの部分がハイブリダイズしない。同様に、第２のＤＮＡプライマーセットのプライマーの５’末端からＣＧＣまでの塩基配列はＨｈａＩにより切断されたＤＮＡ断片の全てと相補的であるので、ＨｈａＩにより切断されたＤＮＡ断片の末端にハイブリダイズするが、塩基配列Ｘの部分は、塩基Ｘに相補な塩基をもつ断片にだけハイブリダイズする。塩基Ｘが完全にハイブリダイズしたか否かは、ハイブリダイゼーションの安定性を見るだけでは明確にわからない。それは、ＤＮＡプライマーの殆どの部位がどの断片ともハイブリダイズする共通部分を有し、末端の数塩基部分だけのハイブリダイゼーションの安定性の差では十分大きな差にならないからである。しかし、ＤＮＡポリメラーゼを用いた相補鎖合成反応を用いることにより、末端数塩基が完全にハイブリダイズしているか否か見分けることができる。
【００３０】
２種類の制限酵素により切断されたＤＮＡ断片の３’末端にポリＡ鎖４２を付加した断片を含む溶液を１６個のフラクション５５（５５−１、５５−２、……、５５−１６のうち５５−２、５５−３を図示する）に分割する。１６個のフラクション５５−１、５５−２、……、５５−１６には、第１のＤＮＡプライマーセット４９’（Ｒ１−Ｘ：Ｘ＝ＡｏｒＣｏｒＧｏｒＴ）のプライマーと、第２のＤＮＡプライマーセット４９”（Ｒ２−Ｘ’：Ｘ’＝ＡｏｒＣｏｒＧｏｒＴ）のプライマーとの異なる１６種類の組合わせからなる２種類のプライマーを、１６種類の組合わせに対応させて１６個のフラクションに添加して、相補鎖合成反応を行なう。図４では、フラクション５５−２に添加する２種類のプライマー（４９−２）（Ｒ１−Ｃ、Ｒ２−Ｔ）と、フラクション５５−３に添加する２種類のプライマー（４９−３）（Ｒ１−Ａ、Ｒ２−Ｔ）とを示す。プライマーはＤＮＡ断片にハイブリダイズするが、両方の３’末端が完全に５１（塩基Ｎの部分が完全にハイブリダイズした状態）のようにハイブリダイズしたプライマーだけが、相補鎖伸長して伸長した相補鎖を形成する。片方の３’末端だけが５２（塩基Ｎの部分がハイブリダイズしていない状態）のようにハイブリダイズしたプライマーは、相補鎖伸長せず伸長した相補鎖を形成しない。
【００３１】
相補鎖合成反応をｎサイクルを行なうことによって、ＤＮＡ断片と同じ長さの相補鎖５３は２ｎ倍に増幅される。プライマーが片方の３’末端だけが完全にハイブリダイズしている場合（５２）には、相補鎖合成をｎサイクル行なっても相補鎖はｎ倍に増幅されるだけなので、両方の３’末端が完全にハイブリダイズした場合とは容易に区別できる。プライマーは、例えば、蛍光標識してあるので、伸長した相補鎖の長さを蛍光式ゲル電気泳動装置を用いて知ることができる。
【００３２】
あとは第１の実施例の場合と同様に、各フラクションから得た相補鎖合成反応生成物を別々の泳動路で電気泳動して、即ちプライマーの組合わせ毎に対応して別々の泳動路で電気泳動して、ゲル電気泳動スペクトルを比較することによって、試料ＤＮＡの分析ができる。この場合、プライマーの組合わせは４×４＝１６通りであるので、１６種類のＤＮＡ断片スペクトルが得られる。このＤＮＡ断片のスペクトルは、元のｍ−ＲＮＡに固有であるので、分析だけでなくｍ−ＲＮＡの診断等にも使用できる。なお、第１のＤＮＡプライマーセットの各プライマーの５’末端の蛍光標識として、異なる４種類を使用する場合には、異なる４種類の蛍光標識をもつ第１のＤＮＡプライマーセットのプライマーを使用する相補鎖合成反応は同一の容器で行なうことができ、４個の容器内での相補鎖合成反応生成物は、容器に対応する４個の泳動路で１本鎖の状態で電気泳動分離できる。
【００３３】
第２の実施例において、３種類の制限酵素により２本鎖の試料ＤＮＡを切断し、３種類のＤＮＡプライマーセットを用いて相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列に続く所定の１塩基を有する塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を得ることもできる。この場合、第１、第２のＤＮＡプライマーセット（Ｒ１−Ｘ、Ｒ２−Ｘ：Ｘ＝ＡｏｒＴｏｒＧｏｒＣ）に加えて、第３のＤＮＡプライマーセット（Ｒ３−Ｘ：Ｘ＝ＡｏｒＴｏｒＧｏｒＣ）を使用する。３種類の制限酵素により切断されたＤＮＡ断片の３’末端にポリＡ鎖４２を付加した断片を含む溶液を、蛍光標識された第１、第２、第３のＤＮＡプライマーセット（Ｒ１−Ｘ、Ｒ２−Ｘ、Ｒ３−Ｘ、：Ｘ＝ＡｏｒＴｏｒＧｏｒＣ）の各プライマーの組合わせ、即ちＲ１−ＸとＲ２−Ｘに組合わせ１６通り、Ｒ１−ＸとＲ３−Ｘに組合わせ１６通り、Ｒ２−ＸとＲ３−Ｘに組合わせ１６通りの合計４８通りに対応する４８個のフラクションに分割した後に、上記と同様の処理を行ない、各フラクションから得た相補鎖合成反応生成物を別々の４８の泳動路で電気泳動して、即ちプライマーの組合わせ毎に対応して別々の泳動路で電気泳動して、ゲル電気泳動スペクトルを比較することによって、試料ＤＮＡの分析ができる。この場合、プライマーの組合わせは４８通りであるので、４８種類のＤＮＡ断片スペクトルが得られる。このＤＮＡ断片のスペクトルは、より詳細なｍ−ＲＮＡの分析だけでなくｍ−ＲＮＡの診断等に使用できる。
【００３４】
図４で説明した第１、第２のＤＮＡプライマーセット（Ｒ１−Ｘ、Ｒ２−Ｘ：Ｘ＝ＡｏｒＴｏｒＧｏｒＣ）の代わりに、それぞれＲ１−ＸＹ、Ｒ２−ＺＷ（Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｗは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃに何れかである）の塩基配列をもつプライマーから構成される第１、第２のＤＮＡプライマーセットを用いてもよい。このような第１、第２のＤＮＡプライマーセットは、第１の実施例で説明したように、塩基Ｘ及びＹの組合わせの１６種類、塩基Ｚ及びＷＹの組合わせの１６種類からなり、プライマーの組合わせは１６×１６＝２５６通りである。従って、２種類の制限酵素により切断されたＤＮＡ断片の３’末端にポリＡ鎖４２を付加した断片を含む溶液を２５６個のフラクションに分割した後に、上記と同様の処理を行なう。このような処理を行ない、２５６の泳動路で電気泳動を行なった結果、図２に示したのと全く同様の結果を得ることができる。なお、第１のＤＮＡプライマーセットの各プライマーの５’末端の蛍光標識として、異なる４種類を使用する場合には、異なる４種類の蛍光標識をもつ第１のＤＮＡプライマーセットのプライマーを使用する相補鎖合成反応は同一の容器で行なうことができ、６４個の容器内での相補鎖合成反応生成物は、容器に対応する６４個の泳動路で１本鎖の状態で電気泳動分離できる。
【００３５】
以上のように、複数種類の制限酵素により試料ＤＮＡを切断し、複数種類のＤＮＡプライマーセットを用いて相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列全て又は認識配列の３’末端側の一部に相補な塩基配列に続く所定の塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を分離して得ることができ、試料ＤＮＡから得る複数種類のＤＮＡ断片スペクトルが得られる。このＤＮＡ断片のスペクトルは、より詳細な試料ＤＮＡの分析だけでなく診断等に使用できる。
【００３６】
（第３の実施例）
第３の実施例は、細胞からポリＡ尾部を利用して抽出したｍ−ＲＮＡの分析に本発明を利用した例を示す。
【００３７】
図５は、本発明の第３の実施例であり、ｍ−ＲＮＡから調整した２本鎖ｃ−ＤＮＡ混合物を２種類の制限酵素により切断し、相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列に続く所定の塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を得る手順を説明する図である。従来技術（文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．、ＭＯｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｏｎｇ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、７．１〜７．３６（１９８７）（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））に従って、培養細胞を１％ＳＤＳを含むバッファーで処理して細胞膜を破壊した後、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで処理し、遠心分離を行なって細胞中の核酸を抽出する。オリゴｄＴカラムを用いて核酸成分からポリＡ尾部をもつ成分、即ちｍ−ＲＮＡ６０（混合物）を得る。ｍ−ＲＮＡ６０からリバーストランスクリプターゼ、ビオチン化オリゴｄＴプライマー７０、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、２本鎖ｃ−ＤＮＡ６１（混合物）を調整する。得られた２本鎖ｃ−ＤＮＡ６１（混合物）を分画Ａ（６２）、分画Ｂ（６３）に分ける。分画Ａ（６２）の２本鎖ｃ−ＤＮＡを制限酵素ＮｌａＩＩＩで切断し、分画Ｂ（６３）の２本鎖ｃ−ＤＮＡを制限酵素ＨｈａＩで切断する。
【００３８】
切断生成物のうち、ビオチンｂを含む２本鎖ｃ−ＤＮＡのＮｌａＩＩＩによる切断断片６４、ビオチンｂを含む２本鎖ｃ−ＤＮＡのＨｈａＩによる切断断片６５をビーズに結合したアビジン７１を用いて捕捉し、ビオチンｂを含まない２本鎖ｃ−ＤＮＡのＮｌａＩＩＩによる切断断片６６、ビオチンｂを含まない２本鎖ｃ−ＤＮＡのＨｈａＩによる切断断片６７を除去する。各分画中の２本鎖ｃ−ＤＮＡの末端に各制限酵素の切断部位に相補結合する既知塩基配列をもつ２本鎖オリゴヌクレオチド７２（ＮｌａＩＩＩ切断部位に相補結合する）、７３（ＨｈａＩ切断部位に相補結合する）を結合させる。
【００３９】
分画Ａ（６２）の２本鎖ｃ−ＤＮＡを制限酵素ＨｈａＩで切断し、分画Ｂ（６３）の２本鎖ｃ−ＤＮＡを制限酵素ＮｌａＩＩＩで切断する。各分画からビーズを除去して、ビーズに結合したアビジン７１とビオチンｂとの結合により、ビーズに捕捉された２本鎖ｃ−ＤＮＡを各分画から除いて、ビーズに捕捉されていないＨｈａＩによる切断断片６８、ビーズに捕捉されていないＮｌａＩＩＩによる切断断片６９を各分画に残す。各制限酵素の切断部位に相補結合する既知塩基配列をもつ２本鎖オリゴヌクレオチド７２、７３を結合させた、２本鎖ｃ−ＤＮＡ断片８１、８１’を得る。
【００４０】
制限酵素認識部位が、３’末端側からＮｌａＩＩＩ、ＨｈａＩの順に存在する２本鎖ｃ−ＤＮＡでは、分画Ｂにおいて２種類の制限酵素部位で切断された２本鎖ｃ−ＤＮＡ断片８１が得られ、逆に、ＨｈａＩ、ＮｌａＩＩＩの順に存在する２本鎖ｃ−ＤＮＡでは、分画Ａにおいて２種類の制限酵素部位で切断された２本鎖ｃ−ＤＮＡ断片８１’が得られる。なお、両末端とも同一の制限酵素で切断された２本鎖ｃ−ＤＮＡ断片８０が生じることもあるが、このような断片は、以下で行なう相補鎖合成反応で区別できる。
【００４１】
後は、分画Ａ、分画Ｂから得られた２本鎖ｃ−ＤＮＡ断片を混合あわせ、第１、又は第２の実施例と同様に、第１のＤＮＡプライマーセット（制限酵素ＮｌａＩＩＩの認識配列に相補な塩基配列部分をもつ）、第２のＤＮＡプライマーセット（制限酵素ＨｈａＩの認識配列に相補な塩基配列部分をもつ）を用いて相補鎖合成反応を行ない、第１、第２のＤＮＡプライマーセットのプライマーの組合わせに対応して、相補鎖合成反応生成物を別々の泳動路で電気泳動分離して泳動スペクトルを測定して、ＤＮＡの分析等に使用する。第１の実施例で説明した１６種類からなるＤＮＡプライマーセットを用いる場合には、得られる泳動スペクトルは１６×１６＝２５６通りとなり、第２の実施例に示した４種類からなるＤＮＡプライマーセットを用いる場合には、得られる泳動スペクトルは４×４＝１６通りとなる。また、選択配列を１塩基として第１のＤＮＡプライマーセットを４種類からなるプライマーから構成し、選択配列を２塩基として第２のＤＮＡプライマーセットを１６種類からなるプライマーから構成する場合には、第１、第２のＤＮＡプライマーセットのプライマーの組合わせは４×１６＝６４通りになるので、得られるＤＮＡ断片の電気泳動スペクトルは６４通りとなる。
【００４２】
以上説明したように、従来技術のＤＮＡプライマーを用いるＤＮＡ診断方法では、せいぜい数種類〜十種類のＤＮＡ断片を一度に調べられるだけで、数百〜数千種類にも及ぶｃ−ＤＮＡやＤＮＡ断片の検査には不向きであり、どこに異常があるか不明な長いＤＮＡの検査には適用できなかったが、本発明では、ＤＮＡ断片の３’末端に結合したオリゴヌクレオチドと、制限酵素が認識する塩基配列の全部又は一部とにハイブリダイズし、３’末端に目的とするＤＮＡ断片とハイブリダイズするか否かを判別する１〜４塩基からなる塩基配列（選択配列）をもつＤＮＡプライマーセットを複数種類用いて、選択的にＤＮＡ断片を識別して相補鎖合成を行ない増幅し、複数種類のＤＮＡプライマーセットのプライマーの組合わせに対応させて、別々の泳動路でゲル電気泳動で分離して、合成された相補鎖の長さを表わす泳動パターンからフィンガープリントを得ることができ、従来技術の問題点を克服する新しいフィンガープリント法、ＤＮＡ検査法を可能とする。このように複数のＤＮＡプライマーセットを用いて、簡便に試料ＤＮＡの分類が可能になり、多数のＤＮＡ断片を含む試料の分析が可能になる。
【００４３】
本発明で使用する制限酵素は、３’突出末端、３’平滑末端、５’突出末端の何れかを与える。３’平滑末端を与える制限酵素によるＤＮＡ断片の末端に結合させるオリゴヌクレオチドとして、ポリ鎖（ポリＡ鎖、ポリＣ鎖、ポリＧ鎖、ポリＴ鎖いずれか１種類）を付加するのが簡便である。
【００４４】
また、以上で説明した各実施例において、電気泳動分離による泳動分離パターン（フインガープリントパターン）が非常に複雑である場合には、上記各実施例において使用する各ＤＮＡプライマーセットの各ＤＮＡプライマーにビオチン付加しておき、最終的に合成された相補鎖だけを捕捉し、捕捉されたＤＮＡ断片を新たな試料と見なして、上記各実施例において使用する制限酵素の種類を変更して、再び各実施例における処理を行う。この結果得られる電気泳動分離による泳動分離パターン（フインガープリントパターン）がより識別しやすくなり、試料の分析がより正確にできる。即ち、本発明では、多数のＤＮＡ断片の長さ情報をそのままフィンガープリントとして利用するのではなく、複数の制限酵素を用いて試料ＤＮＡを切断して、制限酵素の切断部に続く末端塩基配列によりＤＮＡ断片のグループ分けをして、各グループ毎に断片長を計測しフィンガープリントとするので、同じ断片長でも重ならず高いＤＮＡ断片の識別能が得られる利点や、制限酵素の組合わせを変化させて、識別能の調節ができる利点がある。
【００４５】
以上説明した本発明を要約して説明すると、本発明の核酸分析方法は、
１）核酸試料を２種類以上の制限酵素で試料ＤＮＡを切断してＤＮＡ断片を得る工程と、
２）ＤＮＡ断片の両末端にデオキシヌクレオチド又はそのアナログを含むオリゴヌクレオチドを結合する工程と、
３）結合したオリゴヌクレオチドの塩基配列、及び結合したオリゴヌクレオチドの塩基配列に続く制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全部と相補な塩基配列と、３’末端に１塩基〜３塩基からなる選択塩基配列をもち、かつ標識されたＤＮＡプライマーセット（選択塩基配列が１塩基の時は４種類、２塩基の時は１６種類、３塩基の時は６４種類の標識されたＤＮＡプライマーからなる）の、少なくとも２セット以上をプライマーとして、異なる制限酵素が認識する塩基配列に挟まれた領域の相補鎖合成反応を行なう工程と、
４）相補鎖合成生成物を電気泳動分離してＤＮＡ断片を検出する工程とを含むことに特徴を有し、さらに以下の特徴がある。
【００４６】
イ）核酸試料がＲＮＡであり、ＲＮＡをリバーストランスクリプターゼを用いてＤＮＡ鎖に変換すること。
【００４７】
ロ）ＤＮＡプライマーの３’末端の１塩基〜３塩基の塩基配列は、実質全ての塩基種の組合わせからなり、ＤＮＡプライマーは、放射性同位体、ビオチン、蛍光体等の何れかで標識されていること。
【００４８】
ハ）３’末端１基〜３塩基が全ての可能な塩基配列をもつＤＮＡプライマーセットを同時に複数種用いて、２種類の制限酵素が認識する塩基配列に挟まれる領域を相補鎖合成により生成した標識されたＤＮＡ断片であること。
【００４９】
ニ）制限酵素は、３’突出末端、３’平滑末端、５’突出末端の何れかを与えること。
【００５０】
また、本発明の核酸分析方法において用いるＤＮＡプライマーセットの各ＤＮＡプライマーは、５’Ｎ1Ｎ2…ＮnＸ1Ｘ2…ＸmＺ1Ｚ2…ＺhＹ1Ｙ2…Ｙk３’の構造を有し、Ｎ1Ｎ2…Ｎn（５≦ｎ≦２７）はＤＮＡ断片の末端に結合したオリゴヌクレオチドと実質相補な塩基配列であり、Ｘ1Ｘ2…Ｘm（１≦ｍ≦６）は制限酵素が認識する塩基配列の一部と相補な塩基配列であり、Ｚ1Ｚ2…Ｚh（０≦ｈ≦３）は複数種のヌクレオチドとハイブリダイズし得るヌクレオチドアナログであり、Ｙ1Ｙ2…Ｙk（１≦ｋ≦４）はＡ、Ｃ、Ｇ及びＴの組合わせ（４のｋ乗）の種類からなり、Ｎ1Ｎ2…Ｎnを構成する何れかのヌクレオチドが標識されていることに特徴がある
【００５１】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、試料ＤＮＡを２種類以上の制限酵素で切断し、所定のＤＮＡプライマーセットを用いて相補鎖合成反応を行ない、ＤＮＡ断片を増幅し、多数のＤＮＡ断片をグループに区分けし、各グループのＤＮＡ断片数を減らし、各グループのＤＮＡ断片数の電気泳動分離スペクトルパターンの比較から試料ＤＮＡの構成を知ることができる。試料ＤＮＡを２種類の制限酵素で切断して、ＤＮＡ断片の両端部の塩基配列を明確に特定し、断片長を確定するとともに、ＤＮＡ断片をグループの区分けの数を多くできる。ＤＮＡ断片末端の配列を識別するためのプライマーの選択塩基配列の数を、例えば、３塩基とすると、４3＝６４通りにＤＮＡ断片をグループに区分けできる。この６４通りの選択塩基配列をもつプライマーからなるＤＮＡプライマーセットを２組用いると、６４×６４＝４０９６通りにＤＮＡ断片をグループに区分けできる。ゲル電気泳動の分解能では、各区分当たり１００種類以上のＤＮＡ断片を分離して識別できるので、４０９６区分では合計４０９６×１００≒４０００００種類以上ものＤＮＡ断片を区別できる。本発明では、長い核酸から制限酵素により得られる多数のＤＮＡ断片から、長い核酸の検査を可能とするフィンガープリントパターンを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施例であり、試料ＤＮＡからＤＮＡ断片混合物の作成し、相補鎖合成反応によりＤＮＡ断片を得る手順を説明する図。
【図２】本発明の第１の実施例における相補鎖合成反応生成物のＤＮＡ断片のゲル電気泳動スペクトルの一部を示す図。
【図３】本発明の第２の実施例で使用する、ｍ−ＲＮＡから２本鎖ｃ−ＤＮＡを合成して試料ＤＮＡを得る従来技術の反応の手順を説明する図。
【図４】本発明の第２の実施例において、２種類の制限酵素を用いて２本鎖ｃ−ＤＮＡ混合物を切断し、相補鎖合成反応によりＤＮＡ断片を得る手順を示す図。
【図５】本発明の第３の実施例であり、ｍ−ＲＮＡから調整した２本鎖ｃ−ＤＮＡ混合物を２種類の制限酵素を用いて切断し、相補鎖合成反応によりＤＮＡ断片を得る手順を説明する図。
【符号の説明】
１…大腸菌ゲノムＤＮＡ、２−１、２−２、〜…２本鎖ＤＮＡ切断断片、３−１、３−２、〜…両末端に第１のヌクレオチドが結合したＤＮＡ断片、４−１、４−２、〜、４’−１、４’−２、〜…ＮｌａＩＩＩにより切断されたＤＮＡ断片、４”−１、４”−２、〜…両末端に第２のヌクレオチドをもつＤＮＡ断片、５−１、５−２、〜…一方の末端に第１のヌクレオチド、他方の末端に第２のヌクレオチドが結合したＤＮＡ断片、６（６−１、６−２、〜）…ビオチンを含まない相補鎖、１０…ＮｏｔＩ認識配列に対合する１本鎖のビオチン化ヌクレオチド、１０１…オリゴヌクレオチド１０に相補な塩基配列、１０２…ＮｏｔＩの認識する塩基配列に相補な塩基配列、１１…塩基配列１０１と塩基配列１０２の全て又は一部とを５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチド、１００…２本鎖のビオチン化オリゴヌクレオチド、１２…１本鎖オリゴヌクレオチド、１１１…オリゴヌクレオチド１２に相補な塩基配列、１１２…ＮｌａＩＩＩの認識する塩基配列に相補な塩基配列、１３…塩基配列１１１と塩基配列１１２の全部又は一部とを５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチド、１１０…２本鎖の第２のオリゴヌクレオチド、１４…ビーズ、１５…アビジン、１６−１…ＮｏｔＩの認識配列全て又はＮｏｔＩの認識配列の３’末端側の一部からなる塩基配列、１６−２…２塩基からなる選択配列、１６（１６−▲１▼、１６−▲２▼、〜）…蛍光標識した第１のＤＮＡプライマーセットのプライマー、１７−１…ＮｌａＩＩＩの認識配列全て又はＮｌａＩＩＩの認識配列の３’末端側の一部からなる塩基配列、１７−２…２塩基からなる選択配列、１７（１７−▲１▼、１７−▲２▼、〜）…第２のＤＮＡプライマーセットのプライマー、２１…全てのＤＮＡ断片を区分けしないで同時に測定した場合のスペクトル、２２…区分けされたＤＮＡ断片によるスペクトル、２４…塩基長、３１…キャップ塩基、３２…リン酸基、３３…ポリＡ尾部、３４−１…完全長ｍ−ＲＮＡ、３５−１…不完全長ｍ−ＲＮＡ、３４−２…ｍ−ＲＮＡ３４−１のリン酸基３２を露出させた構造、３７…合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド、３４−３…合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド３７を導入したｍ−ＲＮＡ、３６…水酸基、３５−２…ｍ−ＲＮＡ３５−１の水酸基３６を露出させた構造、３８…ｃ−ＤＮＡ、３９…２本鎖ｃ−ＤＮＡ、４０…２本鎖の試料ＤＮＡ、４１−１、４１−２、〜…ｃ−ＤＮＡ断片、４２…ポリＡ鎖、４１’−１、４１’−２、〜…ポリＡ鎖４２を３’末端に付加したＤＮＡ断片、４６…ＮｌａＩＩＩ切断末端、４７…ＨｈａＩ切断末端、４９’、４９”…ＤＮＡプライマーセット
４９−１、４９−２、４９−３、〜…フラクションに添加する２種類のプライマー、５０…Ｎ部分、５１…Ｎ部分が完全にハイブリダイズした状態、５２…Ｎ部分がハイブリダイズしていない状態、５３…伸長した相補鎖、５５（５５−１、５５−２、〜）…フラクション、６０…ｍ−ＲＮＡ混合物、６１…２本鎖ｃ−ＤＮＡ混合物、６２…分画Ａ、６３…分画Ｂ、６４…ビオチンを含むｃ−ＤＮＡのＮｌａＩＩＩ切断断片、６５…ビオチンを含むｃ−ＤＮＡのＨｈａＩ切断断片、６６…ビオチンを含まないｃ−ＤＮＡのＮｌａＩＩＩ切断断片、６７…ビオチンを含まないｃ−ＤＮＡのＨｈａＩ切断断片、６８…ビーズに捕捉されていないＨｈａＩ切断断片、６９…ビーズに捕捉されていないＮｌａＩＩＩ切断断片、７０…ビオチン化オリゴｄＴプライマー、７１…ビーズに結合したアビジン、７２…ＮｌａＩＩＩ切断部位に対応するオリゴヌクレオチド、７３…ＨｈａＩ切断部位に対応するオリゴヌクレオチド、８０…両末端とも同一の制限酵素で切断されたｃ−ＤＮＡ断片、８１、８１’…２種類の制限酵素で切断され各々の切断部位にオリゴヌクレオチドを結合したｃ−ＤＮＡ断片。
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸を用いた診断、核酸の特性評価法、分析方法、及びこれに用いるＤＮＡプライマーセットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡを病気の診断等に用いることが盛んになりつつある。この診断では、目的とするＤＮＡと相補的な塩基配列をもつＤＮＡプローブを作り、このＤＮＡプローブが目的とするＤＮＡとハイブリダイズするか否かをみるプローブ検査を行なったり、目的とするＤＮＡの塩基配列の特定の領域を選び、２つのＤＮＡプローブ（プライマー）を用いてＰＣＲ増幅により生成したＤＮＡ断片の塩基配列情報を得て診断等に用いている。これらの方法は１種類〜数種類のＤＮＡを調べるのには良いが、非常に多数のＤＮＡ断片を含むＤＮＡの検査や長いＤＮＡの評価には適していない。しかし、生体内でのＤＮＡ又は遺伝子は相互に関連しながら働いており、染色体又は含まれる全てのＤＮＡを総合して把握し評価したいという要求が強い。例えば、ゲノム解析プロジェクトの中で注目されているｃ−ＤＮＡプロジェクトでは、ＤＮＡが生体中で機能する場合、ＤＮＡ情報はまずｍ−ＲＮＡに転写され、蛋白が合成され生体が機能する事に注目し、ｍ−ＲＮＡからその相補鎖であるｃ−ＤＮＡを作り、ｃ−ＤＮＡの種類と量の情報から生体を総合的に理解しようとする試みがなされている。
【０００３】
細胞中で機能しているｍ−ＲＮＡに対応するｃ−ＤＮＡを分離し個々のｃ−ＤＮＡの塩基配列を決め、ｃ−ＤＮＡの塩基配列が１つの組織に現われる頻度を調べている。このためにまず、ｍ−ＲＮＡからｃ−ＤＮＡを作り（種々のｃ−ＤＮＡが混合した状態）目的とするｃ−ＤＮＡをクローニングする。ｃ−ＤＮＡを含んだ大腸菌を寒天培地に撒き、培養しコロニーを得る。各コロニーには目的とするｃ−ＤＮＡのうち何れか１種類が入っているので、目的とするｃ−ＤＮＡを取り出し塩基配列を決定し、ｃ−ＤＮＡの種類を同定する。次々に各コロニーに関してｃ−ＤＮＡの種類を同定していくと、同一種類のｃ−ＤＮＡが出現する。１つの組織中にある特定のｃ−ＤＮＡに注目した時、その量が多いほどその組織で強く発現している遺伝子に相当するので、コロニー中での出現頻度も高い。そこでｃ−ＤＮＡの塩基配列解析を多数のコロニーで行ない、どのｃ−ＤＮＡが何回出現するかの頻度を求めている（文献：Ｋ．Ｍｕｒａｋａｗａ ｅｔ．ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２３、ｐ３７９−ｐ３８９（１９９４））。
【０００４】
一方、ゲノム（全ての染色体中ＤＮＡ）又は特定の染色体全体に注目し、ＤＮＡ診断を行なう試みも行なわれている。Ｇｅｎｅ Ｓｃａｎ法（制限酵素ランドマークゲノムスキャニング法）と呼ばれる分析法がある（文献：Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ．ａｌ．、「ＤＮＡ多型（ＤＮＡ ＰＯＬＹＭＯＲＰＨＩＳＭ）」、ｖｏｌ．３、ｐ１０−ｐ１５（１９９５）（東洋書店））。この方法では、まずＤＮＡを第１の制限酵素（例えば、ＮｏｔＩ等の８塩基認識酵素（平均６４ｋ塩基に１回の頻度で切断される）を用いる）で切断し、切断部にラジオアイソトープ又は蛍光標識をしたヌクレオチドを結合し、アガロースゲルを用いて第１の方向に電気泳動する。泳動分離後、第２の制限酵素（例えば、４塩基認識酵素（平均２５６塩基に１回の頻度で切断される）を用いる）により、アガロースゲル中で泳動分離したＤＮＡ断片をさらに切断した後、第１の方向と直交する第２の方向に電気泳動し、２次元泳動パターンを得る。この２次元泳動パターンをフィンガープリントとして利用して、ＤＮＡ全体の検査を行なう。正常細胞中のＤＮＡとガン等の異常のある細胞のＤＮＡとでは、２次元泳動パターンが異なることを利用して、診断に用いる等の試みがなされている。しかし、大きなＤＮＡのどこに異常があるかを調べるには良い方法がないのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
以上説明したように、長塩基長のＤＮＡを調べたり、複数種類のＤＮＡが含まれる試料の全体像を把握し、検査することは、病気の早期発見、ＤＮＡが細胞中で果している機能の理解の上で重要であるが、従来技術では良い方法がないのが現状である。ｃ−ＤＮＡ解析に関する従来技術では、非常に多くのクローンに含まれる試料の塩基配列を決定する必要があり、手間と時間がかかるため種々の試料に適用するには現実的ではないという問題があった。また、従来のＤＮＡプローブを用いる方法では、せいぜい数種類〜十種類のＤＮＡを一度に分析できるだけで、数百〜数万種類にも及ぶｃ−ＤＮＡやＤＮＡ断片の検査には不向きであり、更に、どこに異常があるか不明な長いＤＮＡの検査にも適用できないという問題があった。
【０００６】
一方、従来技術のＧｅｎｅ Ｓｃａｎ法では長塩基長のＤＮＡの検査ができるが、サンプルＤＮＡの量を多く必要とすること、第１方向に泳動分離されたＤＮＡ断片を切断するために使用される第２の制限酵素の量が厖大であること、２次元泳動パターンの各ＤＮＡ断片の位置が２つの電気泳動方向で常に定量的に得られず、２次元電気泳動分離された各ＤＮＡ断片の長さが正確に決定できないため、フィンガープリントとしてデータベース化しにくい等の問題があった。本発明の目的は、これら従来技術の問題点を克服する新しいフィンガープリント法、ＤＮＡ検査法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明では、まず２本鎖の試料ＤＮＡを２種類以上の制限酵素により切断し、複数種類の長さをもつ試料ＤＮＡに固有な２本鎖ＤＮＡ断片群を生成する。２本鎖ＤＮＡ断片の両側の３’末端に、既知塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを結合し、ＤＮＡプライマーの一部がハイブリダイズできる領域を設ける。この領域と使用した制限酵素が認識する塩基配列及びそれに続く数塩基の位置にハイブリダイズするＤＮＡプライマーセットを複数種用意する。ＤＮＡプライマーセットのプライマーの３’末端の１〜３塩基は、実質全ての塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）の組合わせからなる、ＤＮＡ断片の制限酵素の認識配列に続く１〜３塩基の配列を識別（分類）するための選択塩基配列である。使用する制限酵素の数と用意するＤＮＡプライマーセットの数は同一である。各ＤＮＡプライマーセットのプライマーの組合わせの数に、２本鎖ＤＮＡ断片群を分画して、各分画に異なるプライマーの組合わせを添加して、ハイブリダイズさせ相補鎖合成反応を行なう。各ＤＮＡプライマーセットのプライマーは蛍光体等で標識しておく。各分画で得た相補鎖合成反応生成物を別々の泳動路でゲル電気泳動分離し、各ＤＮＡ断片の長さを測定してフィンガープリントを得る。
【０００８】
２本鎖ＤＮＡ断片群が多数のＤＮＡ断片を含み、長さが識別しにくい場合でも、ほとんどの場合、各ＤＮＡ断片は制限酵素切断部に続く塩基配列が異なる。そこでＤＮＡ断片の制限酵素切断部に続く塩基配列の違いを利用してＤＮＡ断片の分類を行なう。ＤＮＡ断片を分類するには、３’末端の１塩基〜３塩基が全ての組合わせの塩基配列をもつ、４種類〜６４種類のＤＮＡプライマーを用いて相補鎖合成反応を行なう。ＤＮＡプライマーの末端２塩基〜３塩基がＤＮＡ断片に完全にハイブリダイズしている時は、相補鎖合成反応が進行するが、そうではないときは反応は進行しない。
【０００９】
ｍ−ＲＮＡから２本鎖ｃ−ＤＮＡを作製する場合には、ビオチン化オリゴｄＴを含むプライマーを用いて、ｍ−ＲＮＡの３’末端側に相補鎖結合させて、ＤＮＡポリメラーゼにより２本鎖ｃ−ＤＮＡを調製する。なお、キャップ構造を利用してｍ−ＲＮＡの５’末端側に相当するｃ−ＤＮＡ末端にビオチンを入れて同様の操作により２本鎖ｃ−ＤＮＡを調製してもよい。この２本鎖ｃ−ＤＮＡを２つの分画に分け、各分画に第１及び第２の制限酵素を添加して２本鎖ｃ−ＤＮＡを切断する。ビオチンが結合した断片以外を除去し、切断されたＤＮＡ末端にそれぞれ第１及び第２のオリゴヌクレオチドを結合させる。
【００１０】
次いで、第１の制限酵素を添加した分画に第２の制限酵素を添加し、第２の制限酵素を添加した分画に第１の制限酵素を添加して再切断を行ない、切断部にそれぞれ第１及び第２のオリゴヌクレオチドを結合させる。ビオチンが結合した断片を除去すると、第１及び第２の制限酵素により両末端が切断され、第１及び第２のオリゴヌクレオチドにより挟まれたＤＮＡ断片が生じる。即ち、両末端が異なる制限酵素により切断された断片が生じる。各制限酵素の認識配列の一部又は全部に相補結合する各ＤＮＡプライマーセットのプライマー（標識されている）の組合わせを用いて相補鎖合成を行なうと、両末端が異なる制限酵素により切断されたＤＮＡ断片のうち、プライマーの末端塩基がハイブリダイズしたＤＮＡ断片のみで反応が進行する。
【００１１】
相補鎖合成されたＤＮＡ鎖は元のＤＮＡ断片鎖と実質的に同じ長さであるので、ゲル電気泳動分離等によりＤＮＡ鎖の長さを計測できる。１度の相補鎖合成反応では合成されるＤＮＡ断片が検出感度に満たない場合には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて複数回の相補鎖合成反応を行ない、合成されるＤＮＡ断片の量を増幅できる。この場合、プライマーの末端塩基配列を変化させ、相補鎖合成するか否かをコントロールできる。この３’末端の塩基配列を選択配列と呼ぶが、選択配列をもち第１及び第２のオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーを用いて、特定のＤＮＡ断片だけを選択的に増幅できる。例えば、選択配列として２塩基を用いると、ＤＮＡ断片を４2×４2＝２５６の種類に分類して得ることができる。
【００１２】
この２５６の種類に分類されたＤＮＡ断片を、種類毎とに異なる泳動路で電気泳動してフィンガープリントパターンを得る。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明による長い核酸の検査を可能とするフィンガープリント法を提供する核酸分析方法を図を用いて詳細に説明する。
【００１４】
（第１の実施例）
図１は、複数種類の制限酵素を用いて、試料ＤＮＡからＤＮＡ断片混合物の作成し、第１、第２のＤＮＡプライマーセットを用いた相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列の全部又は認識配列の３’末端側の一部に相補な塩基配列に続く所定の２塩基の塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を得る手順を説明する図である。第１の実施例では、試料ＤＮＡとして、大腸菌ゲノムＤＮＡ１（〜５Ｍｂ）を用いる。ＮｏｔＩ（８塩基認識制限酵素であり、塩基配列ＧＣＧＧＣＣＧＣを認識する）の認識配列は平均６４ｋｂに１回出現するので、大腸菌ゲノムＤＮＡ１をＮｏｔＩにより切断すると、約１００本の２本鎖ＤＮＡ断片２−１、２−２、２−３、……が生じる。生じた２本鎖ＤＮＡ断片２の両末端（即ち、ＮｏｔＩによる切断部位）に、２本鎖のビオチン化オリゴヌクレオチド（既知塩基配列をもつ）１００を結合してＤＮＡ断片３−１、３−２、……を得る（以下、各図ではビオチンを簡単のためにｂで表わす）。２本鎖のビオチン化オリゴヌクレオチド（第１のオリゴヌクレオチド）１００は、５’末端がビオチン化された１本鎖オリゴヌクレオチド（塩基長は１０〜３０が望ましい）１０と、オリゴヌクレオチド１０に相補な塩基配列１０１とＮｏｔＩの認識する塩基配列に相補な塩基配列（ＣＧＣＣＧＧＣＧ）１０２の全て又は一部とを５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチド１１からなる。
【００１５】
次いで、制限酵素ＮｌａＩＩＩ（４塩基認識酵素であり、塩基配列ＣＡＴＧを認識する）により、ＤＮＡ断片３−１、３−２、……をさらに切断する。ＮｌａＩＩＩの認識配列は平均２５６塩基に１回出現するので、各ＤＮＡ断片３−１、３−２、……は両末端近傍で切断される。制限酵素ＮｌａＩＩＩにより断片化されたＤＮＡ断片４−１、４−２、……、４−ｎ、４’−１、４’−２、……、４’−ｍの両末端（即ち、ＮｌａＩＩＩによる切断部位）に、２本鎖の第２のオリゴヌクレオチド１１０を結合する。２本鎖の第２のオリゴヌクレオチド（既知塩基配列をもつ）１１０は、１本鎖オリゴヌクレオチド１２（塩基長は１０〜３０が望ましい）と、オリゴヌクレオチド１２に相補な塩基配列１１１とＮｌａＩＩＩの認識する塩基配列に相補な塩基配列（ＧＴＡＣ）１１２の全部又は一部とを５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチド１３からなる。この結果、両末端に第２のヌクレオチド１１０をもつＤＮＡ断片４”−１、４”−２、……と、一方の末端に第１のオリゴヌクレオチド１００をもち、他方の末端に第２のオリゴヌクレオチド１１０をもつＤＮＡ断片５−１、５−ｎ、……が生成される。
【００１６】
これら生成物から、ビーズ１４に結合したアビジン１５を用いて、一方の末端に第１のオリゴヌクレオチド１００をもち、他方の末端に第２のオリゴヌクレオチド１１０をもつＤＮＡ断片５−１、５−ｎ、……を捕捉する。以上のようにして得られる断片の総数は、ＮｏｔＩにより切断された１つの断片の両末端近傍が切断され２つの断片を得るので約２００となる。
【００１７】
次いで、捕捉された断片を昇温変性又はアルカリ変性させてビオチンｂを含まない相補鎖（ＤＮＡ断片）６（６−１、６−２、６−３、……）を遊離させる。このようにして得た相補鎖６は、３’末端側に、オリゴヌクレオチド１０に相補な塩基配列１０１とＮｏｔＩの認識する塩基配列に相補な塩基配列（ＣＧＣＣＧＧＣＧ）１０２を５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチド１１をもち、５’末端側に、オリゴヌクレオチド１２に相補な塩基配列１１１とＮｌａＩＩＩの認識する塩基配列に相補な塩基配列（ＧＴＡＣ）１１２を５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチド１３をもつ断片である。
【００１８】
ＮｏｔＩの認識配列全て又はＮｏｔＩの認識配列の３’末端側の一部からなる、塩基配列１６−１と、この塩基配列１６−１に続く２塩基からなる選択配列１６−２をもつ第１のＤＮＡプライマーセットのプライマー１６−▲１▼、１６−▲２▼、……を用意する（図１では１６−▲１▼のみを示す）。この第１のＤＮＡプライマーセット１６は、３’末端の２塩基の選択配列の塩基配列が異なる１６種類のプライマーから構成されている。即ち、３’末端の２塩基の選択配列の塩基配列は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃからの２塩基の全ての組合わせに対応した４×４＝１６通りある。同様にして、ＮｌａＩＩＩの認識配列全て又はＮｌａＩＩＩの認識配列の３’末端側の一部からなる、塩基配列１７−１と、この塩基配列１７−１に続く２塩基からなる選択配列１７−２をもつ第２のＤＮＡプライマーセットのプライマー１７−▲１▼、１７−▲２▼、……を用意する（図１では１７−▲１▼のみを示す）。第２のＤＮＡプライマーセット１７も第１のＤＮＡプライマーセット１６と同様に、３’末端の２塩基の選択配列の塩基配列が異なる１６種類のプライマーから構成されている。なお、第１のＤＮＡプライマーセット１６の各プライマーは５’末端を蛍光標識（蛍光標識を＊で示す）しておく。
【００１９】
相補鎖６を含む溶液を２５６個の容器（図示せず）に分注して、２５６個の容器の各々に、第１のＤＮＡプライマーセット１６から選ばれた１種類のプライマーと、第２のＤＮＡプライマーセット１７から選ばれた１種類のプライマーとを添加する。第１、及び第２のＤＮＡプライマーセットからのプライマーの種類の選択は、第１、及び第２のＤＮＡプライマーセットのプライマーの組合わせの合計１６×１６＝２５６通りについて行なう。各容器には異なる組合わせにより選択された２種類のプライマーが添加される。即ち、第１のＤＮＡプライマーセット、第２のＤＮＡプライマーセットとともに１６種類であるから、プライマーの組合わせは１６×１６＝２５６通りであり、この２５６通りのプライマーの組合わせで、２５６個の容器内で相補鎖６の相補鎖合成反応を行なう（図１では簡単のために１つの容器についてのみ図示する）。この相補鎖合成反応では、まずＤＮＡ断片６−ｉ（−鎖）に対して、第１のＤＮＡプライマーセット１６のプライマー１６−▲１▼をプライマーとして伸長反応が進行し、２本鎖が生成する。この２本鎖が昇温変性されて１本鎖となった＋鎖に対して、第２のＤＮＡプライマーセット１７のプライマー１７−▲１▼が、−鎖に対して第１のプライマーセット１６のプライマー１６−▲１▼が、それぞれプライマーとして伸長反応が進行し、２本鎖が生成する。このようにして得た相補鎖合成反応生成物をゲル電気泳動してスペクトルを測定する。ゲル電気泳動では変性ポリアクリルアミドを使用して、２５６個の容器内での相補鎖合成反応生成物は、容器に対応する２５６個の泳動路で１本鎖の状態で電気泳動分離される。なお、第１のＤＮＡプライマーセット１６の各プライマーの５’末端の蛍光標識として、異なる４種類を使用する場合には、異なる４種類の蛍光標識をもつ第１のＤＮＡプライマーセット１６のプライマーを使用する相補鎖合成反応は同一の容器で行なうことができ、６４個の容器内での相補鎖合成反応生成物は、容器に対応する６４個の泳動路で１本鎖の状態で電気泳動分離できる。
【００２０】
図２は、上記の相補鎖合成反応生成物のＤＮＡ断片のゲル電気泳動スペクトルの一部を示す図である。図２において、２１は上記の相補鎖合成反応生成物の全てのＤＮＡ断片を同時に電気泳動分離した場合のスペクトル、２２は上記の容器毎の相補鎖合成反応生成物のＤＮＡ断片によるスペクトル、１６−２、１７−２は使用したプライマーの選択塩基部分の塩基配列、２４はＤＮＡ断片の塩基長を表わす。また、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ、第１のＤＮＡプライマーセット１６のプライマー１６−▲１▼、１６−▲２▼、……の５’末端側にあるＮｏｔＩの認識配列の一部又は全ての塩基配列、第２のＤＮＡプライマーセット１７のプライマー１７−▲１▼、１７−▲２▼、……５’末端側にあるＮｌａＩＩＩの認識配列の一部又は全ての塩基配列である。全てのＤＮＡ断片の長さを同一の泳動路で同時に測定すると、スペクトル２１のように多くのピークが重なって各ＤＮＡ断片が分離ができず分析不可能になる。スペクトル２２は、各々第１、第２のＤＮＡプライマーセットのプライマーの選択配列（各ＤＮＡ断片を識別する）２塩基１６−２、１７−２の組合わせを、変化させて相補鎖合成反応を行ない、ＤＮＡ断片の両末端の塩基配列により識別を行ない、選択配列１６−２、１７−２の組合わせ毎に異なる泳動路でＤＮＡ断片をゲル電気泳動分離したスペクトルである。ＤＮＡ断片群を選択配列１６−２、１７−２の組合わせ毎に分離してスペクトルを得ているので各ピークは分離しており、スペクトルに含まれるＤＮＡ断片の長さ（塩基長２４）を知ることができる。第１の実施例の場合、第１、第２のＤＮＡプライマーセットの２５６通りのプライマーの組合わせを使用して相補鎖合成反応を行なっているので、２５６通りのｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ（ＤＮＡ断片スペクトル）が得られるが、このＤＮＡ断片のｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍは元のＤＮＡ試料に固有のものであり、試料ＤＮＡが異なると別の異なるパターンを示すので、ＤＮＡの診断等に広く使用できる。即ち、第１、第２のＤＮＡプライマーセットのプライマーによる選択配列の複数通りの組み合せにより（図２では、一方の選択配列をＡＡと固定して、他方の選択配列をＡＡ、ＡＣ、ＡＧ、…、ＴＧ、ＴＴからなる１６通りに変化させた組合わせの例を示す）、試料ＤＮＡをより正確に分析できる。 なお、実施例１において、ＤＮＡ断片４”−１、４”−２、……、ＤＮＡ断片５−１、５−ｎ、……の生成に引き続いて、制限酵素ＭｂｏＩ（４塩基認識酵素であり、塩基配列ＧＡＴＣを認識する）により、ＤＮＡ断片４”−１、４”−２、……、ＤＮＡ断片５−１、５−ｎ、……をさらに切断してもよい。この場合には、制限酵素ＭｂｏＩにより断片化されたＤＮＡ断片の両末端（即ち、制限酵素ＭｂｏＩによる切断部位）に、２本鎖の第３のオリゴヌクレオチドを結合してもしなくてもよい。このように第３番目の制限酵素によるＤＮＡ断片の切断を行なう場合、例えば、第３番目の制限酵素が図１に示す５−１、５−ｎを切断した場合、図１において相補鎖合成反応を行っても２本鎖ＤＮＡ断片が得られないので、相補鎖合成反応生成物の電気泳動パターン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｏｇｒａｍ）が単純となるので、フインガープリントパターンの識別が容易となり、試料の分析がより正確となるという効果がある。
【００２１】
（第２の実施例）
第２の実施例はｍ−ＲＮＡの分析に利用した例である。
【００２２】
図３は、本発明の第２の実施例で使用する、ｍ−ＲＮＡから２本鎖ｃ−ＤＮＡを合成して試料ＤＮＡを得る従来技術の反応の手順を説明する図、図４は、本発明の第２の実施例において、２種類の制限酵素により試料ＤＮＡを切断し、２種類のＤＮＡプライマーセットを用いて相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列に続く所定の１塩基を有する塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を得る手順を説明する図である。
【００２３】
図３は、本発明の第２の実施例で使用する、ｍ−ＲＮＡから２本鎖ｃ−ＤＮＡを合成する従来技術（文献：Ｓ．Ｓｕｇａｎｏ ｅｔ．ａｌ．、「蛋白質核酸酵素（ＰＲＯＴＥＩＮ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＡＮＤ ＥＮＺＹＭＥ）」、ｖｏｌ．３８、Ｎｏ．３、ｐ２７６−ｐ２８１（１９９３）（共立出版））の反応の手順を説明する図である。図３に示すように、細胞から抽出したｍ−ＲＮＡは、３’末端にポリＡ尾部３３をもち、５’末端にキャップ塩基３１及びリン酸基３２をもつ完全長ｍ−ＲＮＡ３４−１と、５’末端にリン酸基３２をもつ不完全長ｍ−ＲＮＡ３５−１とを含む。まず、ｍ−ＲＮＡ３４−１、３５−１をバクテリアアルカリフォスファターゼで処理して、キャップ構造をもたない不完全長のｍ−ＲＮＡ３５−１の５’末端のリン酸基３２を除去し、ｍ−ＲＮＡ３５−１を、水酸基３６を露出させた構造３５−２に変化させる。
【００２４】
次いで、タバコアシッドピロフォスファターゼで処理して、キャップ構造をもつ完全長ｍ−ＲＮＡ３４−１の５’末端にだけリン酸基３２を露出させ、ｍ−ＲＮＡ３４−１を、リン酸基３２を露出させた構造３４−２に変化させる。次に、ＲＮＡリガーゼを用いて、ｍ−ＲＮＡ３４−２の５’末端に合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド３７を導入したｍ−ＲＮＡ３４−３を得る。ＲＮＡリガーゼはリン酸基にＲＮＡオリゴヌクレオチドを結合し、５’末端の水酸基にはＲＮＡオリゴヌクレオチドを結合しないので、完全長ｍ−ＲＮＡ３４−２にのみに合成オリゴヌクレオチドが結合する。
【００２５】
以上のようにして完全長のｍ−ＲＮＡ３４−１にのみ合成オリゴヌクレオチド３７を導入した後に、オリゴｄＴプライマー、リバーストランスクリプターゼを用いて、ｍ−ＲＮＡをｃ−ＤＮＡ３８に変換する。さらに、ＤＮＡポリメラーゼを用いてｃ−ＤＮＡ３８の２本鎖を合成して、細胞から抽出した各種のｍ−ＲＮＡに関してそれぞれ得られた２本鎖ｃ−ＤＮＡ３９の混合物を２本鎖の試料ＤＮＡ４０として得る。
【００２６】
図４は、２種類の制限酵素により２本鎖の試料ＤＮＡを切断し、２種類のＤＮＡプライマーセットを用いて相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列に続く所定の１塩基を有する塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を得る手順を説明する図である。図４に示す方法は、単一の長い２本鎖ＤＮＡ試料にも適用できることは言うもない。まず、２本鎖ｃ−ＤＮＡの混合物からなる２本鎖の試料ＤＮＡ４０を、制限酵素ＮｌａＩＩＩとＨｈａＩにより断片化する。制限酵素ＮｌａＩＩＩ、ＨｈａＩは各々、２本鎖ＤＮＡをＣＡＴＧ↓、ＧＣＧ↓Ｃのように切断する。切断により生成する各断片の３’末端は、ＮｌａＩＩＩで切断された場合には、ＣＡＴＧ（ＮｌａＩＩＩ切断末端）４６、ＨｈａＩで切断された場合には、ＧＣＧ（ＨｈａＩ切断末端）４７となる。５０は、各制限酵素の認識配列部位（ＮｌａＩＩＩ切断末端、ＨｈａＩ切断末端）に続く５’末端側の１塩基であり、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの何れかを表す。各ＤＮＡ断片４１−１、４１−２、４１−３、……の３’末端に、ライゲーションによりオリゴヌクレオチドを導入するか、又はターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いポリ鎖（ポリＡ鎖、ポリＣ鎖、ポリＧ鎖、ポリＴ鎖いずれか１種類）を付加する。以下では、ポリＡ鎖４２を付加する場合を例にとって説明する。
【００２７】
ＤＮＡ断片の３’末端にポリＡ鎖４２を付加すると、４１’−１、４１’−２に示すように、ＮｌａＩＩＩで切断された３’末端の塩基配列はＣＡＴＧＡＡ…Ａ３’となり、４１’−３に示すように、ＨｈａＩで切断された３’末端の塩基配列はＧＣＧＡＡ…Ａ３’となる。
【００２８】
２組のＤＮＡプローブ（プライマー）セット４９’、４９”を用意する。ＤＮＡプライマーセット４９’、４９”の各プライマーは蛍光体等により標識されている。ＮｌａＩＩＩによる切断部位に相補鎖結合可能なプライマーとして、塩基配列が５’Ｔ…ＴＴＣＡＴＧＸ３’（Ｘ＝ＡｏｒＣｏｒＧｏｒＴ）であるプライマーの４種類からなる第１のＤＮＡプライマーセット（Ｒ１−Ｘ、Ｒ１＝＊Ｔ…ＴＴＣＡＴＧ、＊は蛍光標識を表す）を用意する。ＨｈａＩによる切断部位に相補鎖結合可能なプライマーとして、塩基配列が５’Ｔ…ＴＴＣＧＣＸ３’（Ｘ＝ＡｏｒＣｏｒＧｏｒＴ）であるプライマーの４種類からなる第２のＤＮＡプライマーセット（Ｒ２−Ｘ、Ｒ２＝＊Ｔ…ＴＴＣＧＣ、＊は蛍光標識を表す）を用意する。
【００２９】
第１のＤＮＡプライマーセットのプライマーの５’末端からＣＡＴＧまでの塩基配列はＮｌａＩＩＩにより切断されたＤＮＡ断片の全てと相補的であるので、ＮｌａＩＩＩにより切断されたＤＮＡ断片の末端にハイブリダイズするが、塩基配列Ｘの部分は、塩基Ｘに相補な塩基をもつ断片にだけハイブリダイズする。例えば、Ｘ＝Ａの場合には、塩基Ｘの部分は塩基Ｎの部分５０が相補な塩基Ｔをもつ断片にだけハイブリダイズする。塩基Ｎの部分５０が相補な塩基でない場合には、５２のように塩基Ｘの部分がハイブリダイズしない。同様に、第２のＤＮＡプライマーセットのプライマーの５’末端からＣＧＣまでの塩基配列はＨｈａＩにより切断されたＤＮＡ断片の全てと相補的であるので、ＨｈａＩにより切断されたＤＮＡ断片の末端にハイブリダイズするが、塩基配列Ｘの部分は、塩基Ｘに相補な塩基をもつ断片にだけハイブリダイズする。塩基Ｘが完全にハイブリダイズしたか否かは、ハイブリダイゼーションの安定性を見るだけでは明確にわからない。それは、ＤＮＡプライマーの殆どの部位がどの断片ともハイブリダイズする共通部分を有し、末端の数塩基部分だけのハイブリダイゼーションの安定性の差では十分大きな差にならないからである。しかし、ＤＮＡポリメラーゼを用いた相補鎖合成反応を用いることにより、末端数塩基が完全にハイブリダイズしているか否か見分けることができる。
【００３０】
２種類の制限酵素により切断されたＤＮＡ断片の３’末端にポリＡ鎖４２を付加した断片を含む溶液を１６個のフラクション５５（５５−１、５５−２、……、５５−１６のうち５５−２、５５−３を図示する）に分割する。１６個のフラクション５５−１、５５−２、……、５５−１６には、第１のＤＮＡプライマーセット４９’（Ｒ１−Ｘ：Ｘ＝ＡｏｒＣｏｒＧｏｒＴ）のプライマーと、第２のＤＮＡプライマーセット４９”（Ｒ２−Ｘ’：Ｘ’＝ＡｏｒＣｏｒＧｏｒＴ）のプライマーとの異なる１６種類の組合わせからなる２種類のプライマーを、１６種類の組合わせに対応させて１６個のフラクションに添加して、相補鎖合成反応を行なう。図４では、フラクション５５−２に添加する２種類のプライマー（４９−２）（Ｒ１−Ｃ、Ｒ２−Ｔ）と、フラクション５５−３に添加する２種類のプライマー（４９−３）（Ｒ１−Ａ、Ｒ２−Ｔ）とを示す。プライマーはＤＮＡ断片にハイブリダイズするが、両方の３’末端が完全に５１（塩基Ｎの部分が完全にハイブリダイズした状態）のようにハイブリダイズしたプライマーだけが、相補鎖伸長して伸長した相補鎖を形成する。片方の３’末端だけが５２（塩基Ｎの部分がハイブリダイズしていない状態）のようにハイブリダイズしたプライマーは、相補鎖伸長せず伸長した相補鎖を形成しない。
【００３１】
相補鎖合成反応をｎサイクルを行なうことによって、ＤＮＡ断片と同じ長さの相補鎖５３は２ｎ倍に増幅される。プライマーが片方の３’末端だけが完全にハイブリダイズしている場合（５２）には、相補鎖合成をｎサイクル行なっても相補鎖はｎ倍に増幅されるだけなので、両方の３’末端が完全にハイブリダイズした場合とは容易に区別できる。プライマーは、例えば、蛍光標識してあるので、伸長した相補鎖の長さを蛍光式ゲル電気泳動装置を用いて知ることができる。
【００３２】
あとは第１の実施例の場合と同様に、各フラクションから得た相補鎖合成反応生成物を別々の泳動路で電気泳動して、即ちプライマーの組合わせ毎に対応して別々の泳動路で電気泳動して、ゲル電気泳動スペクトルを比較することによって、試料ＤＮＡの分析ができる。この場合、プライマーの組合わせは４×４＝１６通りであるので、１６種類のＤＮＡ断片スペクトルが得られる。このＤＮＡ断片のスペクトルは、元のｍ−ＲＮＡに固有であるので、分析だけでなくｍ−ＲＮＡの診断等にも使用できる。なお、第１のＤＮＡプライマーセットの各プライマーの５’末端の蛍光標識として、異なる４種類を使用する場合には、異なる４種類の蛍光標識をもつ第１のＤＮＡプライマーセットのプライマーを使用する相補鎖合成反応は同一の容器で行なうことができ、４個の容器内での相補鎖合成反応生成物は、容器に対応する４個の泳動路で１本鎖の状態で電気泳動分離できる。
【００３３】
第２の実施例において、３種類の制限酵素により２本鎖の試料ＤＮＡを切断し、３種類のＤＮＡプライマーセットを用いて相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列に続く所定の１塩基を有する塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を得ることもできる。この場合、第１、第２のＤＮＡプライマーセット（Ｒ１−Ｘ、Ｒ２−Ｘ：Ｘ＝ＡｏｒＴｏｒＧｏｒＣ）に加えて、第３のＤＮＡプライマーセット（Ｒ３−Ｘ：Ｘ＝ＡｏｒＴｏｒＧｏｒＣ）を使用する。３種類の制限酵素により切断されたＤＮＡ断片の３’末端にポリＡ鎖４２を付加した断片を含む溶液を、蛍光標識された第１、第２、第３のＤＮＡプライマーセット（Ｒ１−Ｘ、Ｒ２−Ｘ、Ｒ３−Ｘ、：Ｘ＝ＡｏｒＴｏｒＧｏｒＣ）の各プライマーの組合わせ、即ちＲ１−ＸとＲ２−Ｘに組合わせ１６通り、Ｒ１−ＸとＲ３−Ｘに組合わせ１６通り、Ｒ２−ＸとＲ３−Ｘに組合わせ１６通りの合計４８通りに対応する４８個のフラクションに分割した後に、上記と同様の処理を行ない、各フラクションから得た相補鎖合成反応生成物を別々の４８の泳動路で電気泳動して、即ちプライマーの組合わせ毎に対応して別々の泳動路で電気泳動して、ゲル電気泳動スペクトルを比較することによって、試料ＤＮＡの分析ができる。この場合、プライマーの組合わせは４８通りであるので、４８種類のＤＮＡ断片スペクトルが得られる。このＤＮＡ断片のスペクトルは、より詳細なｍ−ＲＮＡの分析だけでなくｍ−ＲＮＡの診断等に使用できる。
【００３４】
図４で説明した第１、第２のＤＮＡプライマーセット（Ｒ１−Ｘ、Ｒ２−Ｘ：Ｘ＝ＡｏｒＴｏｒＧｏｒＣ）の代わりに、それぞれＲ１−ＸＹ、Ｒ２−ＺＷ（Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｗは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃに何れかである）の塩基配列をもつプライマーから構成される第１、第２のＤＮＡプライマーセットを用いてもよい。このような第１、第２のＤＮＡプライマーセットは、第１の実施例で説明したように、塩基Ｘ及びＹの組合わせの１６種類、塩基Ｚ及びＷＹの組合わせの１６種類からなり、プライマーの組合わせは１６×１６＝２５６通りである。従って、２種類の制限酵素により切断されたＤＮＡ断片の３’末端にポリＡ鎖４２を付加した断片を含む溶液を２５６個のフラクションに分割した後に、上記と同様の処理を行なう。このような処理を行ない、２５６の泳動路で電気泳動を行なった結果、図２に示したのと全く同様の結果を得ることができる。なお、第１のＤＮＡプライマーセットの各プライマーの５’末端の蛍光標識として、異なる４種類を使用する場合には、異なる４種類の蛍光標識をもつ第１のＤＮＡプライマーセットのプライマーを使用する相補鎖合成反応は同一の容器で行なうことができ、６４個の容器内での相補鎖合成反応生成物は、容器に対応する６４個の泳動路で１本鎖の状態で電気泳動分離できる。
【００３５】
以上のように、複数種類の制限酵素により試料ＤＮＡを切断し、複数種類のＤＮＡプライマーセットを用いて相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列全て又は認識配列の３’末端側の一部に相補な塩基配列に続く所定の塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を分離して得ることができ、試料ＤＮＡから得る複数種類のＤＮＡ断片スペクトルが得られる。このＤＮＡ断片のスペクトルは、より詳細な試料ＤＮＡの分析だけでなく診断等に使用できる。
【００３６】
（第３の実施例）
第３の実施例は、細胞からポリＡ尾部を利用して抽出したｍ−ＲＮＡの分析に本発明を利用した例を示す。
【００３７】
図５は、本発明の第３の実施例であり、ｍ−ＲＮＡから調整した２本鎖ｃ−ＤＮＡ混合物を２種類の制限酵素により切断し、相補鎖合成反応により、制限酵素の認識配列に続く所定の塩基配列を５’末端側にもつＤＮＡ断片を得る手順を説明する図である。従来技術（文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．、ＭＯｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｏｎｇ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、７．１〜７．３６（１９８７）（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ））に従って、培養細胞を１％ＳＤＳを含むバッファーで処理して細胞膜を破壊した後、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで処理し、遠心分離を行なって細胞中の核酸を抽出する。オリゴｄＴカラムを用いて核酸成分からポリＡ尾部をもつ成分、即ちｍ−ＲＮＡ６０（混合物）を得る。ｍ−ＲＮＡ６０からリバーストランスクリプターゼ、ビオチン化オリゴｄＴプライマー７０、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、２本鎖ｃ−ＤＮＡ６１（混合物）を調整する。得られた２本鎖ｃ−ＤＮＡ６１（混合物）を分画Ａ（６２）、分画Ｂ（６３）に分ける。分画Ａ（６２）の２本鎖ｃ−ＤＮＡを制限酵素ＮｌａＩＩＩで切断し、分画Ｂ（６３）の２本鎖ｃ−ＤＮＡを制限酵素ＨｈａＩで切断する。
【００３８】
切断生成物のうち、ビオチンｂを含む２本鎖ｃ−ＤＮＡのＮｌａＩＩＩによる切断断片６４、ビオチンｂを含む２本鎖ｃ−ＤＮＡのＨｈａＩによる切断断片６５をビーズに結合したアビジン７１を用いて捕捉し、ビオチンｂを含まない２本鎖ｃ−ＤＮＡのＮｌａＩＩＩによる切断断片６６、ビオチンｂを含まない２本鎖ｃ−ＤＮＡのＨｈａＩによる切断断片６７を除去する。各分画中の２本鎖ｃ−ＤＮＡの末端に各制限酵素の切断部位に相補結合する既知塩基配列をもつ２本鎖オリゴヌクレオチド７２（ＮｌａＩＩＩ切断部位に相補結合する）、７３（ＨｈａＩ切断部位に相補結合する）を結合させる。
【００３９】
分画Ａ（６２）の２本鎖ｃ−ＤＮＡを制限酵素ＨｈａＩで切断し、分画Ｂ（６３）の２本鎖ｃ−ＤＮＡを制限酵素ＮｌａＩＩＩで切断する。各分画からビーズを除去して、ビーズに結合したアビジン７１とビオチンｂとの結合により、ビーズに捕捉された２本鎖ｃ−ＤＮＡを各分画から除いて、ビーズに捕捉されていないＨｈａＩによる切断断片６８、ビーズに捕捉されていないＮｌａＩＩＩによる切断断片６９を各分画に残す。各制限酵素の切断部位に相補結合する既知塩基配列をもつ２本鎖オリゴヌクレオチド７２、７３を結合させた、２本鎖ｃ−ＤＮＡ断片８１、８１’を得る。
【００４０】
制限酵素認識部位が、３’末端側からＮｌａＩＩＩ、ＨｈａＩの順に存在する２本鎖ｃ−ＤＮＡでは、分画Ｂにおいて２種類の制限酵素部位で切断された２本鎖ｃ−ＤＮＡ断片８１が得られ、逆に、ＨｈａＩ、ＮｌａＩＩＩの順に存在する２本鎖ｃ−ＤＮＡでは、分画Ａにおいて２種類の制限酵素部位で切断された２本鎖ｃ−ＤＮＡ断片８１’が得られる。なお、両末端とも同一の制限酵素で切断された２本鎖ｃ−ＤＮＡ断片８０が生じることもあるが、このような断片は、以下で行なう相補鎖合成反応で区別できる。
【００４１】
後は、分画Ａ、分画Ｂから得られた２本鎖ｃ−ＤＮＡ断片を混合あわせ、第１、又は第２の実施例と同様に、第１のＤＮＡプライマーセット（制限酵素ＮｌａＩＩＩの認識配列に相補な塩基配列部分をもつ）、第２のＤＮＡプライマーセット（制限酵素ＨｈａＩの認識配列に相補な塩基配列部分をもつ）を用いて相補鎖合成反応を行ない、第１、第２のＤＮＡプライマーセットのプライマーの組合わせに対応して、相補鎖合成反応生成物を別々の泳動路で電気泳動分離して泳動スペクトルを測定して、ＤＮＡの分析等に使用する。第１の実施例で説明した１６種類からなるＤＮＡプライマーセットを用いる場合には、得られる泳動スペクトルは１６×１６＝２５６通りとなり、第２の実施例に示した４種類からなるＤＮＡプライマーセットを用いる場合には、得られる泳動スペクトルは４×４＝１６通りとなる。また、選択配列を１塩基として第１のＤＮＡプライマーセットを４種類からなるプライマーから構成し、選択配列を２塩基として第２のＤＮＡプライマーセットを１６種類からなるプライマーから構成する場合には、第１、第２のＤＮＡプライマーセットのプライマーの組合わせは４×１６＝６４通りになるので、得られるＤＮＡ断片の電気泳動スペクトルは６４通りとなる。
【００４２】
以上説明したように、従来技術のＤＮＡプライマーを用いるＤＮＡ診断方法では、せいぜい数種類〜十種類のＤＮＡ断片を一度に調べられるだけで、数百〜数千種類にも及ぶｃ−ＤＮＡやＤＮＡ断片の検査には不向きであり、どこに異常があるか不明な長いＤＮＡの検査には適用できなかったが、本発明では、ＤＮＡ断片の３’末端に結合したオリゴヌクレオチドと、制限酵素が認識する塩基配列の全部又は一部とにハイブリダイズし、３’末端に目的とするＤＮＡ断片とハイブリダイズするか否かを判別する１〜４塩基からなる塩基配列（選択配列）をもつＤＮＡプライマーセットを複数種類用いて、選択的にＤＮＡ断片を識別して相補鎖合成を行ない増幅し、複数種類のＤＮＡプライマーセットのプライマーの組合わせに対応させて、別々の泳動路でゲル電気泳動で分離して、合成された相補鎖の長さを表わす泳動パターンからフィンガープリントを得ることができ、従来技術の問題点を克服する新しいフィンガープリント法、ＤＮＡ検査法を可能とする。このように複数のＤＮＡプライマーセットを用いて、簡便に試料ＤＮＡの分類が可能になり、多数のＤＮＡ断片を含む試料の分析が可能になる。
【００４３】
本発明で使用する制限酵素は、３’突出末端、３’平滑末端、５’突出末端の何れかを与える。３’平滑末端を与える制限酵素によるＤＮＡ断片の末端に結合させるオリゴヌクレオチドとして、ポリ鎖（ポリＡ鎖、ポリＣ鎖、ポリＧ鎖、ポリＴ鎖いずれか１種類）を付加するのが簡便である。
【００４４】
また、以上で説明した各実施例において、電気泳動分離による泳動分離パターン（フインガープリントパターン）が非常に複雑である場合には、上記各実施例において使用する各ＤＮＡプライマーセットの各ＤＮＡプライマーにビオチン付加しておき、最終的に合成された相補鎖だけを捕捉し、捕捉されたＤＮＡ断片を新たな試料と見なして、上記各実施例において使用する制限酵素の種類を変更して、再び各実施例における処理を行う。この結果得られる電気泳動分離による泳動分離パターン（フインガープリントパターン）がより識別しやすくなり、試料の分析がより正確にできる。即ち、本発明では、多数のＤＮＡ断片の長さ情報をそのままフィンガープリントとして利用するのではなく、複数の制限酵素を用いて試料ＤＮＡを切断して、制限酵素の切断部に続く末端塩基配列によりＤＮＡ断片のグループ分けをして、各グループ毎に断片長を計測しフィンガープリントとするので、同じ断片長でも重ならず高いＤＮＡ断片の識別能が得られる利点や、制限酵素の組合わせを変化させて、識別能の調節ができる利点がある。
【００４５】
以上説明した本発明を要約して説明すると、本発明の核酸分析方法は、
１）核酸試料を２種類以上の制限酵素で試料ＤＮＡを切断してＤＮＡ断片を得る工程と、
２）ＤＮＡ断片の両末端にデオキシヌクレオチド又はそのアナログを含むオリゴヌクレオチドを結合する工程と、
３）結合したオリゴヌクレオチドの塩基配列、及び結合したオリゴヌクレオチドの塩基配列に続く制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全部と相補な塩基配列と、３’末端に１塩基〜３塩基からなる選択塩基配列をもち、かつ標識されたＤＮＡプライマーセット（選択塩基配列が１塩基の時は４種類、２塩基の時は１６種類、３塩基の時は６４種類の標識されたＤＮＡプライマーからなる）の、少なくとも２セット以上をプライマーとして、異なる制限酵素が認識する塩基配列に挟まれた領域の相補鎖合成反応を行なう工程と、
４）相補鎖合成生成物を電気泳動分離してＤＮＡ断片を検出する工程とを含むことに特徴を有し、さらに以下の特徴がある。
【００４６】
イ）核酸試料がＲＮＡであり、ＲＮＡをリバーストランスクリプターゼを用いてＤＮＡ鎖に変換すること。
【００４７】
ロ）ＤＮＡプライマーの３’末端の１塩基〜３塩基の塩基配列は、実質全ての塩基種の組合わせからなり、ＤＮＡプライマーは、放射性同位体、ビオチン、蛍光体等の何れかで標識されていること。
【００４８】
ハ）３’末端１基〜３塩基が全ての可能な塩基配列をもつＤＮＡプライマーセットを同時に複数種用いて、２種類の制限酵素が認識する塩基配列に挟まれる領域を相補鎖合成により生成した標識されたＤＮＡ断片であること。
【００４９】
ニ）制限酵素は、３’突出末端、３’平滑末端、５’突出末端の何れかを与えること。
【００５０】
また、本発明の核酸分析方法において用いるＤＮＡプライマーセットの各ＤＮＡプライマーは、５’Ｎ1Ｎ2…ＮnＸ1Ｘ2…ＸmＺ1Ｚ2…ＺhＹ1Ｙ2…Ｙk３’の構造を有し、Ｎ1Ｎ2…Ｎn（５≦ｎ≦２７）はＤＮＡ断片の末端に結合したオリゴヌクレオチドと実質相補な塩基配列であり、Ｘ1Ｘ2…Ｘm（１≦ｍ≦６）は制限酵素が認識する塩基配列の一部と相補な塩基配列であり、Ｚ1Ｚ2…Ｚh（０≦ｈ≦３）は複数種のヌクレオチドとハイブリダイズし得るヌクレオチドアナログであり、Ｙ1Ｙ2…Ｙk（１≦ｋ≦４）はＡ、Ｃ、Ｇ及びＴの組合わせ（４のｋ乗）の種類からなり、Ｎ1Ｎ2…Ｎnを構成する何れかのヌクレオチドが標識されていることに特徴がある
【００５１】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、試料ＤＮＡを２種類以上の制限酵素で切断し、所定のＤＮＡプライマーセットを用いて相補鎖合成反応を行ない、ＤＮＡ断片を増幅し、多数のＤＮＡ断片をグループに区分けし、各グループのＤＮＡ断片数を減らし、各グループのＤＮＡ断片数の電気泳動分離スペクトルパターンの比較から試料ＤＮＡの構成を知ることができる。試料ＤＮＡを２種類の制限酵素で切断して、ＤＮＡ断片の両端部の塩基配列を明確に特定し、断片長を確定するとともに、ＤＮＡ断片をグループの区分けの数を多くできる。ＤＮＡ断片末端の配列を識別するためのプライマーの選択塩基配列の数を、例えば、３塩基とすると、４3＝６４通りにＤＮＡ断片をグループに区分けできる。この６４通りの選択塩基配列をもつプライマーからなるＤＮＡプライマーセットを２組用いると、６４×６４＝４０９６通りにＤＮＡ断片をグループに区分けできる。ゲル電気泳動の分解能では、各区分当たり１００種類以上のＤＮＡ断片を分離して識別できるので、４０９６区分では合計４０９６×１００≒４０００００種類以上ものＤＮＡ断片を区別できる。本発明では、長い核酸から制限酵素により得られる多数のＤＮＡ断片から、長い核酸の検査を可能とするフィンガープリントパターンを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施例であり、試料ＤＮＡからＤＮＡ断片混合物の作成し、相補鎖合成反応によりＤＮＡ断片を得る手順を説明する図。
【図２】本発明の第１の実施例における相補鎖合成反応生成物のＤＮＡ断片のゲル電気泳動スペクトルの一部を示す図。
【図３】本発明の第２の実施例で使用する、ｍ−ＲＮＡから２本鎖ｃ−ＤＮＡを合成して試料ＤＮＡを得る従来技術の反応の手順を説明する図。
【図４】本発明の第２の実施例において、２種類の制限酵素を用いて２本鎖ｃ−ＤＮＡ混合物を切断し、相補鎖合成反応によりＤＮＡ断片を得る手順を示す図。
【図５】本発明の第３の実施例であり、ｍ−ＲＮＡから調整した２本鎖ｃ−ＤＮＡ混合物を２種類の制限酵素を用いて切断し、相補鎖合成反応によりＤＮＡ断片を得る手順を説明する図。
【符号の説明】
１…大腸菌ゲノムＤＮＡ、２−１、２−２、〜…２本鎖ＤＮＡ切断断片、３−１、３−２、〜…両末端に第１のヌクレオチドが結合したＤＮＡ断片、４−１、４−２、〜、４’−１、４’−２、〜…ＮｌａＩＩＩにより切断されたＤＮＡ断片、４”−１、４”−２、〜…両末端に第２のヌクレオチドをもつＤＮＡ断片、５−１、５−２、〜…一方の末端に第１のヌクレオチド、他方の末端に第２のヌクレオチドが結合したＤＮＡ断片、６（６−１、６−２、〜）…ビオチンを含まない相補鎖、１０…ＮｏｔＩ認識配列に対合する１本鎖のビオチン化ヌクレオチド、１０１…オリゴヌクレオチド１０に相補な塩基配列、１０２…ＮｏｔＩの認識する塩基配列に相補な塩基配列、１１…塩基配列１０１と塩基配列１０２の全て又は一部とを５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチド、１００…２本鎖のビオチン化オリゴヌクレオチド、１２…１本鎖オリゴヌクレオチド、１１１…オリゴヌクレオチド１２に相補な塩基配列、１１２…ＮｌａＩＩＩの認識する塩基配列に相補な塩基配列、１３…塩基配列１１１と塩基配列１１２の全部又は一部とを５’末端にもつ１本鎖オリゴヌクレオチド、１１０…２本鎖の第２のオリゴヌクレオチド、１４…ビーズ、１５…アビジン、１６−１…ＮｏｔＩの認識配列全て又はＮｏｔＩの認識配列の３’末端側の一部からなる塩基配列、１６−２…２塩基からなる選択配列、１６（１６−▲１▼、１６−▲２▼、〜）…蛍光標識した第１のＤＮＡプライマーセットのプライマー、１７−１…ＮｌａＩＩＩの認識配列全て又はＮｌａＩＩＩの認識配列の３’末端側の一部からなる塩基配列、１７−２…２塩基からなる選択配列、１７（１７−▲１▼、１７−▲２▼、〜）…第２のＤＮＡプライマーセットのプライマー、２１…全てのＤＮＡ断片を区分けしないで同時に測定した場合のスペクトル、２２…区分けされたＤＮＡ断片によるスペクトル、２４…塩基長、３１…キャップ塩基、３２…リン酸基、３３…ポリＡ尾部、３４−１…完全長ｍ−ＲＮＡ、３５−１…不完全長ｍ−ＲＮＡ、３４−２…ｍ−ＲＮＡ３４−１のリン酸基３２を露出させた構造、３７…合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド、３４−３…合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド３７を導入したｍ−ＲＮＡ、３６…水酸基、３５−２…ｍ−ＲＮＡ３５−１の水酸基３６を露出させた構造、３８…ｃ−ＤＮＡ、３９…２本鎖ｃ−ＤＮＡ、４０…２本鎖の試料ＤＮＡ、４１−１、４１−２、〜…ｃ−ＤＮＡ断片、４２…ポリＡ鎖、４１’−１、４１’−２、〜…ポリＡ鎖４２を３’末端に付加したＤＮＡ断片、４６…ＮｌａＩＩＩ切断末端、４７…ＨｈａＩ切断末端、４９’、４９”…ＤＮＡプライマーセット
４９−１、４９−２、４９−３、〜…フラクションに添加する２種類のプライマー、５０…Ｎ部分、５１…Ｎ部分が完全にハイブリダイズした状態、５２…Ｎ部分がハイブリダイズしていない状態、５３…伸長した相補鎖、５５（５５−１、５５−２、〜）…フラクション、６０…ｍ−ＲＮＡ混合物、６１…２本鎖ｃ−ＤＮＡ混合物、６２…分画Ａ、６３…分画Ｂ、６４…ビオチンを含むｃ−ＤＮＡのＮｌａＩＩＩ切断断片、６５…ビオチンを含むｃ−ＤＮＡのＨｈａＩ切断断片、６６…ビオチンを含まないｃ−ＤＮＡのＮｌａＩＩＩ切断断片、６７…ビオチンを含まないｃ−ＤＮＡのＨｈａＩ切断断片、６８…ビーズに捕捉されていないＨｈａＩ切断断片、６９…ビーズに捕捉されていないＮｌａＩＩＩ切断断片、７０…ビオチン化オリゴｄＴプライマー、７１…ビーズに結合したアビジン、７２…ＮｌａＩＩＩ切断部位に対応するオリゴヌクレオチド、７３…ＨｈａＩ切断部位に対応するオリゴヌクレオチド、８０…両末端とも同一の制限酵素で切断されたｃ−ＤＮＡ断片、８１、８１’…２種類の制限酵素で切断され各々の切断部位にオリゴヌクレオチドを結合したｃ−ＤＮＡ断片。
Claims (3)
- m-RNAを用いて、一方の鎖の端部に標識を有してかつ２本鎖のc-DNAを調整する工程と、
前記c-DNAの一部を第１の制限酵素により切断し、第１の切断断片を得る工程と、
前記c-DNAの一部を第２の制限酵素により切断し、第２の切断断片を得る工程と、
前記第１の切断断片のうちの前記標識を含む第１の標識断片について、前記第１の制限酵素による切断部位に相補結合する第１の２本鎖オリゴヌクレオチドを結合させて第１の結合体を得、前記第１の結合体を前記第２の制限酵素で切断し、第１の再切断断片を得る工程と、
前記第２の切断断片のうちの前記標識を含む第２の標識断片について、前記第２の制限酵素による切断部位に相補結合する第２の２本鎖オリゴヌクレオチドを結合させて第２の結合体を得、前記第２の結合体を前記第１の制限酵素で切断し、第２の再切断断片を得る工程と、
前記第１の再切断断片のうちの前記標識を有さない断片と、前記第２の２本鎖オリゴヌクレオチドを結合させて第１の再結合体を得る工程と、
前記第２の再切断断片のうちの前記標識を有さない断片と、前記第１の２本鎖オリゴヌクレオチドを結合させて第２の再結合体を得る工程と、
前記第１の再結合体と前記第２の再結合体とプライマーを用いて相補鎖合成反応を行なう工程と、
前記相補鎖合成の生成物について分析する工程とを有し、
前記プライマーは、前記第１の再結合体と前記第２の再結合体との各々の少なくとも１の末端の塩基配列の違いを、前記プライマーの３’末端の１塩基〜４塩基の塩基配列により識別するものであり、前記１塩基〜４塩基の塩基配列は、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンからの全ての組合せに対応するものであることを特徴とする核酸分析方法。 - 前記プライマーは、前記第１の制限酵素の認識配列の相補配列を有しかつ前記違いを３’末端の２塩基の塩基配列により識別する第１のプライマー群と、前記第２の制限酵素の認識配列の相補配列を有しかつ前記違いを３’末端の２塩基の塩基配列により識別する第２のプライマー群とからなり、前記第１のプライマー群の前記２塩基と前記第２のプライマー群の前記２塩基とは、各々、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンからの全ての組合せに対応するものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析方法。
- 前記プライマーは、前記第１の制限酵素の認識配列の相補配列を有しかつ前記違いを３’末端の１塩基の塩基配列により識別する第１のプライマー群と、前記第２の制限酵素の認識配列の相補配列を有しかつ前記違いを３’末端の２塩基の塩基配列により識別する第２のプライマー群とからなり、前記第１のプライマー群の前記１塩基と前記第２のプライマー群の前記２塩基とは、各々、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンからの全ての組合せに対応するものであることを特徴とする請求項１に記載の核酸分析方法。
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