JP2001211898A - 遺伝子解析法 - Google Patents
遺伝子解析法Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- Genetics & Genomics (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子の塩基配列情報を解析する
【解決手段】 １組の縮退プローブを遺伝子に由来する
１本鎖の被検体核酸とハイブリダイズさせ、被検体核酸
を鋳型とし、プローブをプライマーとしてサイクルポリ
メラーゼ反応を行わせ、各プローブから得られた反応産
物をゲル電気泳動で分離し、電気泳動パターンをプロー
ブについて比較し、被検体核酸のシークエンスを含めて
その塩基配列の特徴を抽出する。
１本鎖の被検体核酸とハイブリダイズさせ、被検体核酸
を鋳型とし、プローブをプライマーとしてサイクルポリ
メラーゼ反応を行わせ、各プローブから得られた反応産
物をゲル電気泳動で分離し、電気泳動パターンをプロー
ブについて比較し、被検体核酸のシークエンスを含めて
その塩基配列の特徴を抽出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般的に遺伝子解
析方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、縮退プロ
ーブのハイブリダイゼーションを用いて遺伝子に由来す
る１本鎖の被検体核酸を目的に応じて解析することから
なる該遺伝子解析方法に関する。
析方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、縮退プロ
ーブのハイブリダイゼーションを用いて遺伝子に由来す
る１本鎖の被検体核酸を目的に応じて解析することから
なる該遺伝子解析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子の同定、遺伝子の変異検出、その
他、遺伝子の塩基配列の情報を解析する（以下、遺伝子
解析という）ことは、分子生物学において遺伝子の機能
および制御を理解するのに、重要であるばかりでなく、
ゲノム分析、遺伝子診断および法医学等の分野への応用
に見られるように、実用的にも有用な分析手段でもあ
る。
他、遺伝子の塩基配列の情報を解析する（以下、遺伝子
解析という）ことは、分子生物学において遺伝子の機能
および制御を理解するのに、重要であるばかりでなく、
ゲノム分析、遺伝子診断および法医学等の分野への応用
に見られるように、実用的にも有用な分析手段でもあ
る。
【０００３】遺伝子の解析には、大別して、塩基配列情
報は得られ難いが特にその変異の存在を検出可能とする
方法と、遺伝子の塩基配列情報を検出し、解析する方法
とがある。前者の方法としては、例えばＲＦＬＰ法（Ｒ
ｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；特定の制限酵素により断
片化された被検体核酸の長さの多型を解析する）、ＳＳ
ＣＰ法（ＳｉｎｇｌｅＳｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；被検体核酸を変
性させ、１本鎖にしてから１本鎖内で安定構造を取るよ
うに変性条件を非変性条件に戻して、電気泳動を行いバ
ンドの多型を解析する）等が実用化されている。また、
後者の方法としては、遺伝子の部分的な塩基配列情報を
基にその相補鎖となるオリゴヌクレオチドを合成し、し
かる後にその特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドの識別能を利用する形でハイブリダイゼーション、サ
イクルポリメラーゼ反応、リガーゼ反応、等を行い、そ
の反応産物を解析するという方法が実用化されている。
その他、遺伝子の塩基配列を直接決定する、サンガー法
およびマキサム−ギルバート法等のＤＮＡシーケンス法
が常用されている。
報は得られ難いが特にその変異の存在を検出可能とする
方法と、遺伝子の塩基配列情報を検出し、解析する方法
とがある。前者の方法としては、例えばＲＦＬＰ法（Ｒ
ｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ
Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；特定の制限酵素により断
片化された被検体核酸の長さの多型を解析する）、ＳＳ
ＣＰ法（ＳｉｎｇｌｅＳｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；被検体核酸を変
性させ、１本鎖にしてから１本鎖内で安定構造を取るよ
うに変性条件を非変性条件に戻して、電気泳動を行いバ
ンドの多型を解析する）等が実用化されている。また、
後者の方法としては、遺伝子の部分的な塩基配列情報を
基にその相補鎖となるオリゴヌクレオチドを合成し、し
かる後にその特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドの識別能を利用する形でハイブリダイゼーション、サ
イクルポリメラーゼ反応、リガーゼ反応、等を行い、そ
の反応産物を解析するという方法が実用化されている。
その他、遺伝子の塩基配列を直接決定する、サンガー法
およびマキサム−ギルバート法等のＤＮＡシーケンス法
が常用されている。
【０００４】しかしながら、以上説明した諸方法にはい
ずれも問題点がある。すなわち、前者の方法では、塩基
配列情報は得られ難いし、変異も検出できる場合と出来
ない場合がある。また、後者の方法においては、塩基配
列情報は得られるが、各方法ともに被検体核酸の一部分
の塩基配列情報を用いているために、汎用性が得られ難
く、また、一部分若しくは全長の塩基配列情報が分から
ない場合には適用することが出来ない。
ずれも問題点がある。すなわち、前者の方法では、塩基
配列情報は得られ難いし、変異も検出できる場合と出来
ない場合がある。また、後者の方法においては、塩基配
列情報は得られるが、各方法ともに被検体核酸の一部分
の塩基配列情報を用いているために、汎用性が得られ難
く、また、一部分若しくは全長の塩基配列情報が分から
ない場合には適用することが出来ない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、い
かなる塩基配列からなる遺伝子にも適用できる、また、
一部分若しくは全長の塩基配列情報が得られていない遺
伝子にも適用できる汎用的な解析方法を提供しようとす
るものである。さらに、サンガー法が適用できない１ｋ
ｂを超える長さの核酸（若しくは遺伝子）のシークエン
スにも適用できる方法をも提供しようとするものであ
る。
かなる塩基配列からなる遺伝子にも適用できる、また、
一部分若しくは全長の塩基配列情報が得られていない遺
伝子にも適用できる汎用的な解析方法を提供しようとす
るものである。さらに、サンガー法が適用できない１ｋ
ｂを超える長さの核酸（若しくは遺伝子）のシークエン
スにも適用できる方法をも提供しようとするものであ
る。
【０００６】このような試みの一環として、既に本発明
者らの一部は、ハイブリダイゼーションによる迅速なＤ
ＮＡシークエンス方法を見出し、それを用いるＤＮＡシ
ークエンシング装置を開発した（特開平１０‐２４３７
８５号）。この方法は、塩基配列決定法であるために汎
用的に遺伝子解析に用いることが可能である。しかし、
ここで開示された方法に従えば、サイクルポリメラーゼ
反応の効率という点、およびシークエンスしうる長さの
点で実用上は８塩基以上のオリゴヌクレオチド・プロー
ブを使用する必要があった。そのためプローブの塩基配
列の組合せの数（すなわちプローブ数）は膨大となり、
いわゆるＤＮＡチップ等の微細加工技術を用いない限り
実用化が難しいと思われた。
者らの一部は、ハイブリダイゼーションによる迅速なＤ
ＮＡシークエンス方法を見出し、それを用いるＤＮＡシ
ークエンシング装置を開発した（特開平１０‐２４３７
８５号）。この方法は、塩基配列決定法であるために汎
用的に遺伝子解析に用いることが可能である。しかし、
ここで開示された方法に従えば、サイクルポリメラーゼ
反応の効率という点、およびシークエンスしうる長さの
点で実用上は８塩基以上のオリゴヌクレオチド・プロー
ブを使用する必要があった。そのためプローブの塩基配
列の組合せの数（すなわちプローブ数）は膨大となり、
いわゆるＤＮＡチップ等の微細加工技術を用いない限り
実用化が難しいと思われた。
【０００７】そこで電気泳動法を用いて、上記の方法に
従い遺伝子解析を行うことが代案として考えられる。こ
のためには、オリゴヌクレオチド・プローブの塩基数
（すなわちプローブの塩基長）を７塩基以下、好ましく
は３塩基、４塩基、若しくは５塩基程度と小さくする必
要がある。プローブの組み合わせ数は、３塩基では６４
種類、４塩基では２５６種類、そして５塩基では１０２
４種類となる。この程度の短いオリゴヌクレオチド・プ
ローブを用いれば現在、常用されている電気泳動装置を
用いても十分に、実施が可能である。なお、前記オリゴ
ヌクレオチド・プローブを利用して、１ｋｂ以上の長い
被検体核酸をシークエンスしようとすると、平均して３
塩基では６４塩基長、４塩基では２５６塩基長、そして
５塩基では１０２４塩基長ごとに１回、ハイブリダイズ
可能な部位が出現するので複数のプローブ相補部位が存
在することになり、ＤＮＡチップを利用した方法に適さ
なくなるという問題も出てくる。また、このような短い
オリゴヌクレオチド・プローブを用いてサイクルポリメ
ラーゼ反応を行う場合、そのままのオリゴヌクレオチド
プローブでは生成した２本鎖核酸の融解点および被検体
核酸へのアニーリング温度が非常に低くなる。その融解
点Ｔmは、次のように算出される。 （１）ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ法 （２）％ＧＣ法（Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ
Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−
５００／Ｌ） （３）２＋４法（Ｔm＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）） 以上、３方法が知られているが、短いオリゴマーに関し
てよく使われる、２＋４法で見積もると、 ３塩基長の場合：Ｔm＝６〜１２℃、４塩基長の場合：
Ｔm＝８〜１６℃、５塩基長の場合：Ｔm＝１０〜２０℃ となる。ハイブリダイゼーションさせる温度は、一般に
１０℃、さらに低目に設定することになっているので殆
ど氷点近くで行わなければならず、サイクルポリメラー
ゼ反応増幅に使われるＴａｑポリメラ−ゼ（至適温度は
７２度）を含めてＤＮＡポリメラ―ゼがこのような低温
では殆ど働かない。従って、これらの塩基長のままのオ
リゴヌクレオチド・プローブを使用するとやはり遺伝子
解析の実現性に乏しい。
従い遺伝子解析を行うことが代案として考えられる。こ
のためには、オリゴヌクレオチド・プローブの塩基数
（すなわちプローブの塩基長）を７塩基以下、好ましく
は３塩基、４塩基、若しくは５塩基程度と小さくする必
要がある。プローブの組み合わせ数は、３塩基では６４
種類、４塩基では２５６種類、そして５塩基では１０２
４種類となる。この程度の短いオリゴヌクレオチド・プ
ローブを用いれば現在、常用されている電気泳動装置を
用いても十分に、実施が可能である。なお、前記オリゴ
ヌクレオチド・プローブを利用して、１ｋｂ以上の長い
被検体核酸をシークエンスしようとすると、平均して３
塩基では６４塩基長、４塩基では２５６塩基長、そして
５塩基では１０２４塩基長ごとに１回、ハイブリダイズ
可能な部位が出現するので複数のプローブ相補部位が存
在することになり、ＤＮＡチップを利用した方法に適さ
なくなるという問題も出てくる。また、このような短い
オリゴヌクレオチド・プローブを用いてサイクルポリメ
ラーゼ反応を行う場合、そのままのオリゴヌクレオチド
プローブでは生成した２本鎖核酸の融解点および被検体
核酸へのアニーリング温度が非常に低くなる。その融解
点Ｔmは、次のように算出される。 （１）ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ法 （２）％ＧＣ法（Ｔm＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ
Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−
５００／Ｌ） （３）２＋４法（Ｔm＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ）） 以上、３方法が知られているが、短いオリゴマーに関し
てよく使われる、２＋４法で見積もると、 ３塩基長の場合：Ｔm＝６〜１２℃、４塩基長の場合：
Ｔm＝８〜１６℃、５塩基長の場合：Ｔm＝１０〜２０℃ となる。ハイブリダイゼーションさせる温度は、一般に
１０℃、さらに低目に設定することになっているので殆
ど氷点近くで行わなければならず、サイクルポリメラー
ゼ反応増幅に使われるＴａｑポリメラ−ゼ（至適温度は
７２度）を含めてＤＮＡポリメラ―ゼがこのような低温
では殆ど働かない。従って、これらの塩基長のままのオ
リゴヌクレオチド・プローブを使用するとやはり遺伝子
解析の実現性に乏しい。
【０００８】
【課題を解決するための手段】以上の問題を解決するた
めに、本発明は、ハイブリダイゼーションによる汎用性
のある遺伝子解析方法を提供する。
めに、本発明は、ハイブリダイゼーションによる汎用性
のある遺伝子解析方法を提供する。
【０００９】すなわち、本発明の１つの側面では、ハイ
ブリダイゼーションによる遺伝子解析方法であって、１
組の縮退プローブを用意する第１の工程と、前記遺伝子
に由来する１本鎖の被検体核酸を前記１組の縮退プロー
ブの各プローブにハイブリダイズさせる第２の工程と、
前記ハイブリダイズさせた被検体核酸を鋳型とし、前記
各プローブをプライマーとしてサイクルポリメラーゼ反
応を行う第３の工程と、前記各プローブから得られた反
応産物をゲル電気泳動で分離し、電気泳動パターンを取
得する第４の工程と、前記電気泳動パターンを前記各プ
ローブについて比較する第５の工程と、を含む遺伝子解
析方法が提供される。
ブリダイゼーションによる遺伝子解析方法であって、１
組の縮退プローブを用意する第１の工程と、前記遺伝子
に由来する１本鎖の被検体核酸を前記１組の縮退プロー
ブの各プローブにハイブリダイズさせる第２の工程と、
前記ハイブリダイズさせた被検体核酸を鋳型とし、前記
各プローブをプライマーとしてサイクルポリメラーゼ反
応を行う第３の工程と、前記各プローブから得られた反
応産物をゲル電気泳動で分離し、電気泳動パターンを取
得する第４の工程と、前記電気泳動パターンを前記各プ
ローブについて比較する第５の工程と、を含む遺伝子解
析方法が提供される。
【００１０】また、本発明の別の側面では、ハイブリダ
イゼーションによる遺伝子解析方法であって、各プロー
ブが所定の塩基配列を有する、１組の縮退プローブを用
意する第１の工程と、前記遺伝子に由来する１本鎖の被
検体核酸を前記１組の縮退プローブの各プローブにハイ
ブリダイズさせる第２の工程と、前記ハイブリダイズさ
せた被検体核酸を鋳型とし、前記各プローブをプライマ
ーとしてサイクルポリメラーゼ反応を行わせ、該プライ
マーを伸張させる第３の工程と、前記各プローブから得
られた伸張反応産物をゲル電気泳動で伸張フラグメント
に分離し、該伸張フラグメントのそれぞれの塩基長を決
定する第４の工程と、前記伸張フラグメントの塩基長と
前記各プローブの所定の塩基配列とを関連させ、前記被
検体核酸の塩基配列の特徴付けを行う第５の工程と、を
含む遺伝子解析方法が提供される。
イゼーションによる遺伝子解析方法であって、各プロー
ブが所定の塩基配列を有する、１組の縮退プローブを用
意する第１の工程と、前記遺伝子に由来する１本鎖の被
検体核酸を前記１組の縮退プローブの各プローブにハイ
ブリダイズさせる第２の工程と、前記ハイブリダイズさ
せた被検体核酸を鋳型とし、前記各プローブをプライマ
ーとしてサイクルポリメラーゼ反応を行わせ、該プライ
マーを伸張させる第３の工程と、前記各プローブから得
られた伸張反応産物をゲル電気泳動で伸張フラグメント
に分離し、該伸張フラグメントのそれぞれの塩基長を決
定する第４の工程と、前記伸張フラグメントの塩基長と
前記各プローブの所定の塩基配列とを関連させ、前記被
検体核酸の塩基配列の特徴付けを行う第５の工程と、を
含む遺伝子解析方法が提供される。
【００１１】さらに、本発明の別の側面では、ハイブリ
ダイゼーションによる遺伝子解析方法であって、各プロ
ーブが所定の塩基配列を有する、１組の縮退プローブを
用意する第１の工程と、前記遺伝子に由来する１本鎖の
被検体核酸を前記１組の縮退プローブの各プローブにハ
イブリダイズさせる第２の工程と、前記ハイブリダイズ
された被検体核酸を鋳型とし、前記各プローブをプライ
マーとしてサイクルポリメラーゼ反応を行わせ、該プラ
イマーを伸張させる第３の工程と、前記各プローブから
得られた伸張反応産物をゲル電気泳動で伸張フラグメン
トに分離し、該伸張フラグメントのそれぞれの塩基長を
決定する第４の工程と、前記各プローブの所定の塩基配
列を一筆書きアルゴリズムに従い、前記伸張フラグメン
トの塩基長の順に整列し、前記被検体核酸の塩基配列の
一部を決定する第５の工程と、を含む遺伝子の解析方法
が提供される。
ダイゼーションによる遺伝子解析方法であって、各プロ
ーブが所定の塩基配列を有する、１組の縮退プローブを
用意する第１の工程と、前記遺伝子に由来する１本鎖の
被検体核酸を前記１組の縮退プローブの各プローブにハ
イブリダイズさせる第２の工程と、前記ハイブリダイズ
された被検体核酸を鋳型とし、前記各プローブをプライ
マーとしてサイクルポリメラーゼ反応を行わせ、該プラ
イマーを伸張させる第３の工程と、前記各プローブから
得られた伸張反応産物をゲル電気泳動で伸張フラグメン
トに分離し、該伸張フラグメントのそれぞれの塩基長を
決定する第４の工程と、前記各プローブの所定の塩基配
列を一筆書きアルゴリズムに従い、前記伸張フラグメン
トの塩基長の順に整列し、前記被検体核酸の塩基配列の
一部を決定する第５の工程と、を含む遺伝子の解析方法
が提供される。
【００１２】好ましくは、前記遺伝子の解析方法におい
て、前記被検体核酸の塩基配列の全長を決定する。
て、前記被検体核酸の塩基配列の全長を決定する。
【００１３】また、本発明は、上記遺伝子の解析方法に
おいて、前記各プローブがＮ1Ｎ2Ｎ 3・・ＮnＸ1Ｘ2・・
Ｘm（式１）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn（式
２）、Ｎ 1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn-1Ｎn（式３）、
‐‐‐‐‐またはＸ1Ｘ2・・ＸmＮ1Ｎ2Ｎ3・・Ｎn-1Ｎn
（式ｎ）（式中、Ｎ1〜Ｎnは、４種類の塩基Ａ、Ｔ、
Ｇ、およびＣのいずれかを指すが、ランダムであり、一
方Ｘ1〜Ｘmは、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣのいずれかを指す
が予め定められており、ｍおよびｎは、それぞれ自然数
である）で表わされオリゴヌクレオチドである遺伝子の
解析方法を提供する。
おいて、前記各プローブがＮ1Ｎ2Ｎ 3・・ＮnＸ1Ｘ2・・
Ｘm（式１）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn（式
２）、Ｎ 1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn-1Ｎn（式３）、
‐‐‐‐‐またはＸ1Ｘ2・・ＸmＮ1Ｎ2Ｎ3・・Ｎn-1Ｎn
（式ｎ）（式中、Ｎ1〜Ｎnは、４種類の塩基Ａ、Ｔ、
Ｇ、およびＣのいずれかを指すが、ランダムであり、一
方Ｘ1〜Ｘmは、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣのいずれかを指す
が予め定められており、ｍおよびｎは、それぞれ自然数
である）で表わされオリゴヌクレオチドである遺伝子の
解析方法を提供する。
【００１４】また、本発明は、上記一連の遺伝子の解析
方法において、１組の縮退プローブが４m個の前記各プ
ローブからなる全ての組合せのセット、若しくはその一
部のサブセットである遺伝子解析方法を提供する。
方法において、１組の縮退プローブが４m個の前記各プ
ローブからなる全ての組合せのセット、若しくはその一
部のサブセットである遺伝子解析方法を提供する。
【００１５】ここで、好ましくは、ｍが３、４、または
５である。さらに、好ましくはｎが５、６、７または８
である。最も好ましくはｍが４であり、ｎが６である。
５である。さらに、好ましくはｎが５、６、７または８
である。最も好ましくはｍが４であり、ｎが６である。
【００１６】また、本発明は、第１の工程において、１
組の縮退プローブの総数に相当する数のウエル部を有す
るアレイ型容器を用意し、該ウエル部の各々に、該１組
の縮退プローブの各プローブを分注する上記一連の遺伝
子の解析方法を提供する。
組の縮退プローブの総数に相当する数のウエル部を有す
るアレイ型容器を用意し、該ウエル部の各々に、該１組
の縮退プローブの各プローブを分注する上記一連の遺伝
子の解析方法を提供する。
【００１７】また、本発明は、前記の遺伝子の解析方法
において、前記各プローブが上記で定義されるものであ
り、前記１組の縮退プローブの総数が４m個である遺伝
子の解析方法を提供する。
において、前記各プローブが上記で定義されるものであ
り、前記１組の縮退プローブの総数が４m個である遺伝
子の解析方法を提供する。
【００１８】さらに、本発明は、遺伝子の解析用キット
であって、各プローブがＮ1Ｎ2Ｎ3・・ＮnＸ1Ｘ2・・Ｘ
m（式１）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn（式２）、
Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn-1Ｎn（式３）、‐‐‐
‐‐またはＸ1Ｘ2・・ＸmＮ 1Ｎ2Ｎ3・・・Ｎn-1Ｎn（式
ｎ）（式中、Ｎ1〜Ｎnは、４種類の塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、お
よびＣのいずれかを指すが、ランダムであり、一方Ｘ1
〜Ｘmは、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣのいずれかを指すが予
め定められており、ｍおよびｎは、それぞれ自然数であ
る）で表わされるオリゴヌクレオチドである１組の縮退
プローブと、該１組の縮退プローブの総数に相当する数
のウエル部を有するアレイ型容器と、さらに緩衝液およ
びＤＮＡポリメラ―ゼとを含み、かつ前記各プローブが
前記アレイ型容器の各ウエル部に分注されている遺伝子
解析用キットを提供する。
であって、各プローブがＮ1Ｎ2Ｎ3・・ＮnＸ1Ｘ2・・Ｘ
m（式１）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn（式２）、
Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn-1Ｎn（式３）、‐‐‐
‐‐またはＸ1Ｘ2・・ＸmＮ 1Ｎ2Ｎ3・・・Ｎn-1Ｎn（式
ｎ）（式中、Ｎ1〜Ｎnは、４種類の塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、お
よびＣのいずれかを指すが、ランダムであり、一方Ｘ1
〜Ｘmは、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣのいずれかを指すが予
め定められており、ｍおよびｎは、それぞれ自然数であ
る）で表わされるオリゴヌクレオチドである１組の縮退
プローブと、該１組の縮退プローブの総数に相当する数
のウエル部を有するアレイ型容器と、さらに緩衝液およ
びＤＮＡポリメラ―ゼとを含み、かつ前記各プローブが
前記アレイ型容器の各ウエル部に分注されている遺伝子
解析用キットを提供する。
【００１９】さらに、本発明は、前記分注された各プロ
ーブが前記アレイ型容器の各ウエル部に固定化されてい
る遺伝子解析用キットを提供する。
ーブが前記アレイ型容器の各ウエル部に固定化されてい
る遺伝子解析用キットを提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】本発明の主要な側面は、ハイブリダイゼー
ションによる遺伝子解析方法であって、１組の縮退プロ
ーブを用意する第１の工程と、前記遺伝子に由来する１
本鎖の被検体核酸を前記１組の縮退プローブの各プロー
ブにハイブリダイズする第２の工程と、前記ハイブリダ
イズした被検体核酸を鋳型として、前記各プローブのサ
イクルポリメラーゼ反応を行う第３の工程と、前記各プ
ローブから得られた反応産物をゲル電気泳動で分離し、
電気泳動パターンを取得する第４の工程と、前記電気泳
動パターンを前記各プローブについて比較する第５の工
程と、を含む遺伝子の解析方法である。
ションによる遺伝子解析方法であって、１組の縮退プロ
ーブを用意する第１の工程と、前記遺伝子に由来する１
本鎖の被検体核酸を前記１組の縮退プローブの各プロー
ブにハイブリダイズする第２の工程と、前記ハイブリダ
イズした被検体核酸を鋳型として、前記各プローブのサ
イクルポリメラーゼ反応を行う第３の工程と、前記各プ
ローブから得られた反応産物をゲル電気泳動で分離し、
電気泳動パターンを取得する第４の工程と、前記電気泳
動パターンを前記各プローブについて比較する第５の工
程と、を含む遺伝子の解析方法である。
【００２２】本明細書中、「遺伝子に由来する一本鎖の
被検体核酸」とは、遺伝子を構成する二本鎖ｃＤＮＡの
うちの一本でコーディング鎖または非コーディング鎖で
あるＤＮＡ、或いはコーディング鎖ＤＮＡから転写され
たｍＲＮＡ等を指し、組織、細胞から単離されたもの、
遺伝子組換え技術で、または人工的に合成されたもの等
を包含する。
被検体核酸」とは、遺伝子を構成する二本鎖ｃＤＮＡの
うちの一本でコーディング鎖または非コーディング鎖で
あるＤＮＡ、或いはコーディング鎖ＤＮＡから転写され
たｍＲＮＡ等を指し、組織、細胞から単離されたもの、
遺伝子組換え技術で、または人工的に合成されたもの等
を包含する。
【００２３】本明細書中、「１組の縮退プローブ」と
は、それぞれ所定の塩基長の固定部分（すなわち、塩基
配列が一定の部分）と所定の塩基長の可変部分（すなわ
ち、塩基配列が４種類の塩基のランダムな組み合わせか
らなる部分）とを有するプローブのセットである。ま
た、本明細書中、「所定の塩基配列を有する」とは、プ
ローブの固定部分が予め定めた塩基配列を有することを
意味する。個別のプローブは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・ＮnＸ1Ｘ2
・・Ｘm（式１）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn（式
２）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn-1Ｎn（式３）、
‐‐‐‐‐またはＸ 1Ｘ2・・ＸmＮ1Ｎ2Ｎ3・・Ｎn-1Ｎn
（式ｎ）（式中、Ｎ1〜Ｎnは、４種類の塩基Ａ、Ｔ、
Ｇ、およびＣのいずれかを指すが、ランダムであり、一
方Ｘ1〜Ｘmは、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣのいずれかを指す
が予め定められており、ｍおよびｎは、それぞれ自然数
である）で表されるのいずれか１つのオリゴヌクレオチ
ド・プローブである。このようなプローブの混合物を１
組の縮退プローブとして、本発明の遺伝子解析方法に用
いるわけであるが、該プローブは当業者に周知の方法、
例えば市販のＤＮＡ自動合成機（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製３８１型等）によって容易に合
成できる。従って、本発明の遺伝子解析方法の第１の工
程が達成される。
は、それぞれ所定の塩基長の固定部分（すなわち、塩基
配列が一定の部分）と所定の塩基長の可変部分（すなわ
ち、塩基配列が４種類の塩基のランダムな組み合わせか
らなる部分）とを有するプローブのセットである。ま
た、本明細書中、「所定の塩基配列を有する」とは、プ
ローブの固定部分が予め定めた塩基配列を有することを
意味する。個別のプローブは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・ＮnＸ1Ｘ2
・・Ｘm（式１）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn（式
２）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn-1Ｎn（式３）、
‐‐‐‐‐またはＸ 1Ｘ2・・ＸmＮ1Ｎ2Ｎ3・・Ｎn-1Ｎn
（式ｎ）（式中、Ｎ1〜Ｎnは、４種類の塩基Ａ、Ｔ、
Ｇ、およびＣのいずれかを指すが、ランダムであり、一
方Ｘ1〜Ｘmは、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣのいずれかを指す
が予め定められており、ｍおよびｎは、それぞれ自然数
である）で表されるのいずれか１つのオリゴヌクレオチ
ド・プローブである。このようなプローブの混合物を１
組の縮退プローブとして、本発明の遺伝子解析方法に用
いるわけであるが、該プローブは当業者に周知の方法、
例えば市販のＤＮＡ自動合成機（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製３８１型等）によって容易に合
成できる。従って、本発明の遺伝子解析方法の第１の工
程が達成される。
【００２４】前記プローブのＸ1Ｘ2・・Ｘmで表される
固定部分は所定の塩基配列を有しハイブリダイゼーショ
ンによって被検体核酸のそれに相補的な塩基配列を識別
する。従って、配列識別能はｍ塩基に存在するが、プロ
ーブ自体はｎ＋ｍ塩基の長さとなる。好ましくは、ｍは
３乃至７の整数であり、ｎは５乃至８の整数である。例
えば、ｍが３、４、または５である場合には、ｎを７、
６、または５とすればプローブ自体の長さは１０塩基に
なるので、前述の２＋４法でＴmを見積もってみると、
Ｔm＝２０℃〜４０℃となる。従って、サイクルポリメ
ラーゼ反応も充分に実用的に実施しうる範囲のＴmとな
る。しかも、プローブ合成はそれぞれ６４種類、２５６
種類、１０２４種類程度で済むことになる。
固定部分は所定の塩基配列を有しハイブリダイゼーショ
ンによって被検体核酸のそれに相補的な塩基配列を識別
する。従って、配列識別能はｍ塩基に存在するが、プロ
ーブ自体はｎ＋ｍ塩基の長さとなる。好ましくは、ｍは
３乃至７の整数であり、ｎは５乃至８の整数である。例
えば、ｍが３、４、または５である場合には、ｎを７、
６、または５とすればプローブ自体の長さは１０塩基に
なるので、前述の２＋４法でＴmを見積もってみると、
Ｔm＝２０℃〜４０℃となる。従って、サイクルポリメ
ラーゼ反応も充分に実用的に実施しうる範囲のＴmとな
る。しかも、プローブ合成はそれぞれ６４種類、２５６
種類、１０２４種類程度で済むことになる。
【００２５】しかしながら、実際は、縮退オリゴヌクレ
オチド・プローブを用いる場合には、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・・
Ｎｎ等の可変部分で被検体核酸と完全にマッチする塩基
配列はプローブ混合物中のごく一部である。例えば、ｎ
＝６ではそのような塩基配列を有するプローブの存在確
率は４０９６分の１となる。そこで、幾つかの問題点が
浮上する。すなわち、１）サイクルポリメラーゼ反応で
充分な量の完全マッチング・プローブが保証されるか否
か、２）完全マッチング・プローブ以外のプローブのミ
スマッチが結果の解析に影響を及ぼすか否か、３）プロ
ーブ間でのプライマー・ダイマー形成等により被検体核
酸とのサイクルポリメラーゼ反応の反応効率が落ちない
か等である。また、短い塩基配列では相補的配列の識別
能も低下するために、短い塩基長からなるプローブは、
シーケンシング（塩基配列決定）には適さなくなる可能
性も指摘される。実施例に例示する実験結果等から、ｍ
を３〜５、ｎを５〜８の範囲に設定して、本発明に係る
縮退プローブを設計する。これに従い、使用するプロー
ブの総数は、望ましくは、３塩基６４種類、４塩基２５
６種類、５塩基１０２４種類となり、また目的に応じて
は（例えば、３塩基リピートの検出等）、その一部のみ
をサブセットとして使用できる場合もある。いずれにせ
よ、このような縮退プローブが被検体核酸に含まれる相
補的な部分配列にハイプリダイズして、それをプライマ
ーとしてサイクルポリメラーゼ反応が行えるのであれ
ば、汎用性のある遺伝子の解析方法が実現されることに
なる。上記様々な問題点から、本発明以前に、このアプ
ローチが遺伝子解析に適用できるという認識が当業者に
はなかった。
オチド・プローブを用いる場合には、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・・
Ｎｎ等の可変部分で被検体核酸と完全にマッチする塩基
配列はプローブ混合物中のごく一部である。例えば、ｎ
＝６ではそのような塩基配列を有するプローブの存在確
率は４０９６分の１となる。そこで、幾つかの問題点が
浮上する。すなわち、１）サイクルポリメラーゼ反応で
充分な量の完全マッチング・プローブが保証されるか否
か、２）完全マッチング・プローブ以外のプローブのミ
スマッチが結果の解析に影響を及ぼすか否か、３）プロ
ーブ間でのプライマー・ダイマー形成等により被検体核
酸とのサイクルポリメラーゼ反応の反応効率が落ちない
か等である。また、短い塩基配列では相補的配列の識別
能も低下するために、短い塩基長からなるプローブは、
シーケンシング（塩基配列決定）には適さなくなる可能
性も指摘される。実施例に例示する実験結果等から、ｍ
を３〜５、ｎを５〜８の範囲に設定して、本発明に係る
縮退プローブを設計する。これに従い、使用するプロー
ブの総数は、望ましくは、３塩基６４種類、４塩基２５
６種類、５塩基１０２４種類となり、また目的に応じて
は（例えば、３塩基リピートの検出等）、その一部のみ
をサブセットとして使用できる場合もある。いずれにせ
よ、このような縮退プローブが被検体核酸に含まれる相
補的な部分配列にハイプリダイズして、それをプライマ
ーとしてサイクルポリメラーゼ反応が行えるのであれ
ば、汎用性のある遺伝子の解析方法が実現されることに
なる。上記様々な問題点から、本発明以前に、このアプ
ローチが遺伝子解析に適用できるという認識が当業者に
はなかった。
【００２６】本発明の遺伝子解析方法の第２の工程は、
１本鎖の被検体核酸を前記１組の縮退プローブにハイブ
リダイズさせることであ。具体的には、前記被検体核酸
を前記プローブと混合し、出来るだけ完全マッチング・
プローブのみがハイブリダイズするような条件を設定す
る。その後、例えば、ウォシュ等の操作により、ハイブ
リダイズしなかったプローブを取り除く。ここで、採用
されるハイブリダイゼーション条件は、プローブの塩基
長、プローブのＧＣ含量等を考慮して決定されるが、当
業者は公知の文献に基づいて、特定の実施の形態に適当
な条件を適宜、容易に選択しうる。本発明の遺伝子解析
方法において、ハイブリダイゼーションのミスマッチそ
のものは、致命的とはならないが、解析の精度、再現性
から、最小限に抑えることが好ましい。
１本鎖の被検体核酸を前記１組の縮退プローブにハイブ
リダイズさせることであ。具体的には、前記被検体核酸
を前記プローブと混合し、出来るだけ完全マッチング・
プローブのみがハイブリダイズするような条件を設定す
る。その後、例えば、ウォシュ等の操作により、ハイブ
リダイズしなかったプローブを取り除く。ここで、採用
されるハイブリダイゼーション条件は、プローブの塩基
長、プローブのＧＣ含量等を考慮して決定されるが、当
業者は公知の文献に基づいて、特定の実施の形態に適当
な条件を適宜、容易に選択しうる。本発明の遺伝子解析
方法において、ハイブリダイゼーションのミスマッチそ
のものは、致命的とはならないが、解析の精度、再現性
から、最小限に抑えることが好ましい。
【００２７】本発明の遺伝子解析方法の第３の工程は、
前記プローブとハイブリダイズした被検体核酸を鋳型と
し、プローブをプライマーとしてサイクルポリメラーゼ
反応（伸張反応）を行うことである。ここで、反応に採
用されるポリメラ―ゼの種類、および反応条件について
も、特に制限はなく、例えば当業者が公知の文献に基づ
いて、特定の実施の形態に適当な条件を適宜、容易に選
択しうる。
前記プローブとハイブリダイズした被検体核酸を鋳型と
し、プローブをプライマーとしてサイクルポリメラーゼ
反応（伸張反応）を行うことである。ここで、反応に採
用されるポリメラ―ゼの種類、および反応条件について
も、特に制限はなく、例えば当業者が公知の文献に基づ
いて、特定の実施の形態に適当な条件を適宜、容易に選
択しうる。
【００２８】上記第２〜３工程は、サイクルポリメラー
ゼ反応に適した反応容器内で行われるが、そのような容
器の形状、材質に特に制限はない。しかし、使用するプ
ローブの種類が極めて多数にのぼるので、それらを個別
に収容できる容器が必要とされる。本発明の１つの好適
な実施の形態に従えば、１組の縮退プローブの総数（好
ましくは、４m個）に相当する数のウエル部を有するア
レイ型容器が用意され、該ウエル部の各々に、該１組の
縮退プローブの各プローブが分注される。さらに好まし
くは、各プローブがウエル部に固定される。具体的な反
応容器としては、適当なサイズのｅｐｐｅｎｄｏｒｆチ
ューブを必要な数のウエル部に対応する本数用意して、
組み合わせ該容器を構成する。または、市販の９６穴マ
イクロタイタープレートをそのまま、或いはこれも複数
枚、組み合せて該容器として、使用できる。また、特開
平７−２０３９９８号公報に開示されたシーケンス法に
従えば、すなわち、式（１）のプローブが縮退プローブ
でないとすると、ウエル部を４m+n個用意する必要があ
る。一方、本発明の遺伝子解析方法では、これが４m個
となり、より実用的である。
ゼ反応に適した反応容器内で行われるが、そのような容
器の形状、材質に特に制限はない。しかし、使用するプ
ローブの種類が極めて多数にのぼるので、それらを個別
に収容できる容器が必要とされる。本発明の１つの好適
な実施の形態に従えば、１組の縮退プローブの総数（好
ましくは、４m個）に相当する数のウエル部を有するア
レイ型容器が用意され、該ウエル部の各々に、該１組の
縮退プローブの各プローブが分注される。さらに好まし
くは、各プローブがウエル部に固定される。具体的な反
応容器としては、適当なサイズのｅｐｐｅｎｄｏｒｆチ
ューブを必要な数のウエル部に対応する本数用意して、
組み合わせ該容器を構成する。または、市販の９６穴マ
イクロタイタープレートをそのまま、或いはこれも複数
枚、組み合せて該容器として、使用できる。また、特開
平７−２０３９９８号公報に開示されたシーケンス法に
従えば、すなわち、式（１）のプローブが縮退プローブ
でないとすると、ウエル部を４m+n個用意する必要があ
る。一方、本発明の遺伝子解析方法では、これが４m個
となり、より実用的である。
【００２９】本発明の別の実施の形態は、前記アレイ型
容器と、これに１組の縮退プローブ、緩衝液、ＤＮＡポ
リメラーゼ等を加えてなり、かつ、各プローブがアレイ
型容器の各ウェル部に分注されている遺伝子解析用キッ
トである。好ましくは、前記と同様に各プローブがアレ
イ型容器の各ウェル部に固定化されている。
容器と、これに１組の縮退プローブ、緩衝液、ＤＮＡポ
リメラーゼ等を加えてなり、かつ、各プローブがアレイ
型容器の各ウェル部に分注されている遺伝子解析用キッ
トである。好ましくは、前記と同様に各プローブがアレ
イ型容器の各ウェル部に固定化されている。
【００３０】本発明の遺伝子解析方法の第４の工程で
は、前記第３の工程で得られたサイクルポリメラーゼ反
応産物をゲル電気泳動（高分解能アガロースゲル等）で
分離し、電気泳動パターンを取得する。そのために使用
される電気泳動装置は、サンガー法でシーケンスに使用
するような標準的な装置でよい。本発明の遺伝子解析方
法でさらに分離したサイクルポリメラーゼ反応産物のシ
ーケンスを必要としないとき、読み取り誤差が多少あっ
ても構わないのでごく短時間だけ電気泳動して、その泳
動パタ−ンを画像で一気に撮れるタイプが実用上より好
ましい。電気泳動の条件（アガロース濃度、電圧、泳動
時間等）も常法に従い、当業者が容易に設定しうる。
は、前記第３の工程で得られたサイクルポリメラーゼ反
応産物をゲル電気泳動（高分解能アガロースゲル等）で
分離し、電気泳動パターンを取得する。そのために使用
される電気泳動装置は、サンガー法でシーケンスに使用
するような標準的な装置でよい。本発明の遺伝子解析方
法でさらに分離したサイクルポリメラーゼ反応産物のシ
ーケンスを必要としないとき、読み取り誤差が多少あっ
ても構わないのでごく短時間だけ電気泳動して、その泳
動パタ−ンを画像で一気に撮れるタイプが実用上より好
ましい。電気泳動の条件（アガロース濃度、電圧、泳動
時間等）も常法に従い、当業者が容易に設定しうる。
【００３１】続いて、本発明の遺伝子解析方法の第５の
工程では、前記第４の工程で得られた電気泳動パターン
を各プローブ（すなわち、プローブの組み合わせ数だけ
パターンが得られる）について比較する。電気泳動パタ
−ンの比較（すなわち、解析）は、目視で可能な場合も
あるが、解析の目的に応じて、本発明の遺伝子解析方法
に適合するアルゴリズムおよびソフトウエアを使用する
ことが好ましい。解析用ソフトとしては、遺伝子の同定
なら、パターン認識やニューラルネットワーク等が考え
られる。また、遺伝子の変異の検出ならば、正常な遺伝
子の電気泳動パターンを基礎にそのパターンから被検体
核酸を含む対象遺伝子のパターンをサブトラクション解
析する。そこで差を抽出して、変異やその他の異常を検
出することが可能となる。このように、電気泳動パタ−
ンの解析を、ソフトウエアを用いて行い、自動化するこ
とも本発明の遺伝子解析方法の１つの実施の形態であ
る。
工程では、前記第４の工程で得られた電気泳動パターン
を各プローブ（すなわち、プローブの組み合わせ数だけ
パターンが得られる）について比較する。電気泳動パタ
−ンの比較（すなわち、解析）は、目視で可能な場合も
あるが、解析の目的に応じて、本発明の遺伝子解析方法
に適合するアルゴリズムおよびソフトウエアを使用する
ことが好ましい。解析用ソフトとしては、遺伝子の同定
なら、パターン認識やニューラルネットワーク等が考え
られる。また、遺伝子の変異の検出ならば、正常な遺伝
子の電気泳動パターンを基礎にそのパターンから被検体
核酸を含む対象遺伝子のパターンをサブトラクション解
析する。そこで差を抽出して、変異やその他の異常を検
出することが可能となる。このように、電気泳動パタ−
ンの解析を、ソフトウエアを用いて行い、自動化するこ
とも本発明の遺伝子解析方法の１つの実施の形態であ
る。
【００３２】前記第５の工程は、目的とする遺伝子解析
のタイプによって、様々な態様となる。特に、好適な実
施の形態では、電気泳動パタ−ンを解析することによ
り、遺伝子の塩基配列の特徴抽出が可能となる。例え
ば、サンガー法では、数ｋｂの長さの被検体核酸であっ
てもサブクローニングしなければその塩基配列を知るこ
とができない。また、配列情報が予め得られないとき、
従来の多くの遺伝子解析法は使えない。このような状況
においても、本発明の解析方法は適用可能である。しか
も、その適用範囲は、遺伝子同定、種の同定、ｃＤＮＡ
の同定、還伝子変異、ＳＮＰ、遺伝子多型解析、３塩基
リピ−ト病等の遺伝病の診断等、多岐にわたる。
のタイプによって、様々な態様となる。特に、好適な実
施の形態では、電気泳動パタ−ンを解析することによ
り、遺伝子の塩基配列の特徴抽出が可能となる。例え
ば、サンガー法では、数ｋｂの長さの被検体核酸であっ
てもサブクローニングしなければその塩基配列を知るこ
とができない。また、配列情報が予め得られないとき、
従来の多くの遺伝子解析法は使えない。このような状況
においても、本発明の解析方法は適用可能である。しか
も、その適用範囲は、遺伝子同定、種の同定、ｃＤＮＡ
の同定、還伝子変異、ＳＮＰ、遺伝子多型解析、３塩基
リピ−ト病等の遺伝病の診断等、多岐にわたる。
【００３３】本発明の別の側面では、以上の遺伝子解析
を実施するより具体的な手段が提供される。すなわち、
前記第３の工程で得られた伸張反応産物をゲル電気泳動
で伸張フラグメントに分離し、該伸張フラグメントの塩
基長を決定する工程を含む。これは、通常、電気泳動装
置で電気泳動の条件を適切に設定すればよい。そうする
と、よく分解された複数の伸張フラグメントに対応する
ピークがそれぞれの塩基長の位置に現れる。図１、図2
を参照。次に、前記伸張フラグメントの塩基長とプロー
ブの所定の塩基配列とを関連させる。既述のように、プ
ローブの所定の塩基配列は被検体核酸の配列を認識する
ので、特定の伸張フラグメントの取得は前記所定の塩基
配列に相補的な配列が被検体核酸中に存在することを示
す。また、伸張フラグメントの塩基長は、プライマー
（すなわち、プローブ）の5'から3'方向への伸張量と一
致するはずである。従って、伸張フラグメントの塩基長
とプローブの所定の塩基配列とを関連させると、被検体
核酸の塩基配列の5'末端からフラグメントの塩基長分の
位置に前記所定の塩基配列に相補的な配列があることに
なる。このような工程を幾つかのプローブについて繰り
返せば、自ずと被検体核酸の塩基配列の特徴付けが可能
となる。この特定の実施の形態は、例えば、３塩基リピ
ート（反復配列、例えばＣＡＧまたはＣＴＧ）の同定に
有用である。これらの配列は世代を通して増幅すること
があると知られており、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ舞踏病お
よび筋緊張性ジストロフィー等の遺伝病の発症をもたら
す。さらに、遺伝子のタグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｔａｇともいう）の同定にも威力を発揮
する。この実施の形態では、所望ならば、興味ある伸張
フラグメントの塩基配列の部分または全体を、さらにサ
ンガー法等、他のシークエンス法と組み合せて決定する
ことも可能である。
を実施するより具体的な手段が提供される。すなわち、
前記第３の工程で得られた伸張反応産物をゲル電気泳動
で伸張フラグメントに分離し、該伸張フラグメントの塩
基長を決定する工程を含む。これは、通常、電気泳動装
置で電気泳動の条件を適切に設定すればよい。そうする
と、よく分解された複数の伸張フラグメントに対応する
ピークがそれぞれの塩基長の位置に現れる。図１、図2
を参照。次に、前記伸張フラグメントの塩基長とプロー
ブの所定の塩基配列とを関連させる。既述のように、プ
ローブの所定の塩基配列は被検体核酸の配列を認識する
ので、特定の伸張フラグメントの取得は前記所定の塩基
配列に相補的な配列が被検体核酸中に存在することを示
す。また、伸張フラグメントの塩基長は、プライマー
（すなわち、プローブ）の5'から3'方向への伸張量と一
致するはずである。従って、伸張フラグメントの塩基長
とプローブの所定の塩基配列とを関連させると、被検体
核酸の塩基配列の5'末端からフラグメントの塩基長分の
位置に前記所定の塩基配列に相補的な配列があることに
なる。このような工程を幾つかのプローブについて繰り
返せば、自ずと被検体核酸の塩基配列の特徴付けが可能
となる。この特定の実施の形態は、例えば、３塩基リピ
ート（反復配列、例えばＣＡＧまたはＣＴＧ）の同定に
有用である。これらの配列は世代を通して増幅すること
があると知られており、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ舞踏病お
よび筋緊張性ジストロフィー等の遺伝病の発症をもたら
す。さらに、遺伝子のタグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ ｔａｇともいう）の同定にも威力を発揮
する。この実施の形態では、所望ならば、興味ある伸張
フラグメントの塩基配列の部分または全体を、さらにサ
ンガー法等、他のシークエンス法と組み合せて決定する
ことも可能である。
【００３４】本発明のさらに別の側面でも、以上の遺伝
子解析を実施するより具体的な手段が提供される。すな
わち、ここでも前記第３の工程で得られた伸張反応産物
をゲル電気泳動で伸張フラグメントに分離し、それぞれ
の伸張フラグメントの塩基長を決定する工程を含む。続
いて、各プローブの所定の塩基配列を一筆書きアルゴリ
ズムに従い、前記伸張フラグメントの塩基長の順に整列
し、被検体核酸の塩基配列の一部を決定する。これは、
特開平７−２０３９９８号公報に開示されたシークエン
シング法と、原理的には全く同じである。当該公報によ
ると、具体的にはプライマー（すなわち、プローブ）の
5'から3'方向への伸張量を生化学的或いは酵素的に測定
して、伸張量に基づきプライマーを整列し、プライマー
の塩基配列から被検体核酸の塩基配列が決定されてい
る。本発明では、前記伸張フラグメントの塩基長に基づ
いて、プローブの配列を整列するので、電気泳動装置に
よるフラグメント塩基長の読み取りの誤差はあるもの
の、当該公報の方法よりも正確に、シークエンスが可能
となる。このようにして、実施例で例示されるように、
被検体核酸（１ｋｂ以上）の塩基配列の一部さらには、
全長をクローニングを伴わずに決定することが可能とな
る。
子解析を実施するより具体的な手段が提供される。すな
わち、ここでも前記第３の工程で得られた伸張反応産物
をゲル電気泳動で伸張フラグメントに分離し、それぞれ
の伸張フラグメントの塩基長を決定する工程を含む。続
いて、各プローブの所定の塩基配列を一筆書きアルゴリ
ズムに従い、前記伸張フラグメントの塩基長の順に整列
し、被検体核酸の塩基配列の一部を決定する。これは、
特開平７−２０３９９８号公報に開示されたシークエン
シング法と、原理的には全く同じである。当該公報によ
ると、具体的にはプライマー（すなわち、プローブ）の
5'から3'方向への伸張量を生化学的或いは酵素的に測定
して、伸張量に基づきプライマーを整列し、プライマー
の塩基配列から被検体核酸の塩基配列が決定されてい
る。本発明では、前記伸張フラグメントの塩基長に基づ
いて、プローブの配列を整列するので、電気泳動装置に
よるフラグメント塩基長の読み取りの誤差はあるもの
の、当該公報の方法よりも正確に、シークエンスが可能
となる。このようにして、実施例で例示されるように、
被検体核酸（１ｋｂ以上）の塩基配列の一部さらには、
全長をクローニングを伴わずに決定することが可能とな
る。
【００３５】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限され
るものではない。
説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限され
るものではない。
【００３６】製造例 １本鎖被検体核酸の調製 被検体核酸としてλＤＮＡ（約４８ｋｂ）の一部（約７
ｋｂ〜９ｋｂ）を非対称サイクルポリメラーゼ反応法に
より増幅した。使用したプライマーは、λ１（配列番号
１に記載）およびλ２（配列番号２に記載）であった。
サイクルポリメラーゼ反応の条件は、以下の組成の溶液
で、１サイクルを９４℃で１分、次ぎに９８℃で２０
秒、次ぎに６８℃で１分反応させることとし、３０サイ
クル行った。さらに、７２℃で１０分間伸長反応を行い
終了した。 λＤＮＡ ５０ｐｇ λ１（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ） ２μｌ λ２（０．１ｐｍｏｌｅ／μｌ） ２μｌ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏTMサイクルポリメラーゼ反応ミックス １錠 蒸留水 全量 ２５μｌ なお、使用したサイクルポリメラーゼ反応ミックスを２
５μｌの蒸留水に溶解したときの主な成分は、次ぎのと
おりであった。すなわち、１．５Ｕ Ｔａｑ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０、室温）、５０ｍＭ Ｋ
ＣＩ、Ｉ．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、および２００ μＭ ｄＮ
ＴＰである。
ｋｂ〜９ｋｂ）を非対称サイクルポリメラーゼ反応法に
より増幅した。使用したプライマーは、λ１（配列番号
１に記載）およびλ２（配列番号２に記載）であった。
サイクルポリメラーゼ反応の条件は、以下の組成の溶液
で、１サイクルを９４℃で１分、次ぎに９８℃で２０
秒、次ぎに６８℃で１分反応させることとし、３０サイ
クル行った。さらに、７２℃で１０分間伸長反応を行い
終了した。 λＤＮＡ ５０ｐｇ λ１（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ） ２μｌ λ２（０．１ｐｍｏｌｅ／μｌ） ２μｌ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏTMサイクルポリメラーゼ反応ミックス １錠 蒸留水 全量 ２５μｌ なお、使用したサイクルポリメラーゼ反応ミックスを２
５μｌの蒸留水に溶解したときの主な成分は、次ぎのと
おりであった。すなわち、１．５Ｕ Ｔａｑ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０、室温）、５０ｍＭ Ｋ
ＣＩ、Ｉ．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、および２００ μＭ ｄＮ
ＴＰである。
【００３７】サイクルポリメラーゼ反応増幅後、エタノ
ール沈殿およびスピンカラム（マイクロカラムＧ−５
０）で余分なプライマーやヌクレオチドを除き、サイク
ルポリメラーゼ反応産物を精製した。得られた１本鎖核
酸は、２００２塩基長であり、その塩基配列を配列表の
配列番号３に示す。この核酸を被検体核酸として、蒸留
水に溶解し、濃度は２６０ｎｍのＯＤ値（Ａ260）をも
とに約１００ｎｇ／μｌに調製し、下記の実験に使用し
た。
ール沈殿およびスピンカラム（マイクロカラムＧ−５
０）で余分なプライマーやヌクレオチドを除き、サイク
ルポリメラーゼ反応産物を精製した。得られた１本鎖核
酸は、２００２塩基長であり、その塩基配列を配列表の
配列番号３に示す。この核酸を被検体核酸として、蒸留
水に溶解し、濃度は２６０ｎｍのＯＤ値（Ａ260）をも
とに約１００ｎｇ／μｌに調製し、下記の実験に使用し
た。
【００３８】実施例１ サイクルポリメラーゼ反応およ
びその伸張反応産物の電気泳動 １．１ 実験方法 被検体核酸、下記の縮退プローブ、ポリメラーゼ酵素、
ヌクレオチド、緩衝液、蛍光ラベルｄＵＴＰを混合し
て、以下の温度サイクルおよび組成の溶液でサイクルポ
リメラーゼ反応を行った。 サイクル伸長反応ミックス（１サンプルあたり） 被検体核酸 １０μｌ 縮退プローブ（１００ｐｍｏｌ／２μｌ） ５μｌ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏTMサイクルポリメラーゼ反応ミックス １錠 サーモシークエナ‐ゼ ３．２Ｕ Ｒ６Ｇ−ｄＵＴＰ（１００μＭ） ０．５μｌ 蒸留水 全量 ２５μｌ 温度サイクルは、９６℃で１分アニールした後、９６℃
で３０秒、２０℃で１５秒、 ６０℃で４分のサイクル
を２０回繰り返した。各プローブからのサイクルポリメ
ラーゼ反応産物をさらにマイクロカラム（Ｇ−５０）で
精製し、変性条件で電気泳動してフラグメント解析を行
った。電気泳動はＡＢＩ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚ
ｅｒ３１０で標準プロトコールに従った。また、フラグ
メント解析にはＧｅｎｅＳｃａｎTMｖｅｒ２．１を用い
た。得られた電気泳動パターンの例を図１、図２に示
す。
びその伸張反応産物の電気泳動 １．１ 実験方法 被検体核酸、下記の縮退プローブ、ポリメラーゼ酵素、
ヌクレオチド、緩衝液、蛍光ラベルｄＵＴＰを混合し
て、以下の温度サイクルおよび組成の溶液でサイクルポ
リメラーゼ反応を行った。 サイクル伸長反応ミックス（１サンプルあたり） 被検体核酸 １０μｌ 縮退プローブ（１００ｐｍｏｌ／２μｌ） ５μｌ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏTMサイクルポリメラーゼ反応ミックス １錠 サーモシークエナ‐ゼ ３．２Ｕ Ｒ６Ｇ−ｄＵＴＰ（１００μＭ） ０．５μｌ 蒸留水 全量 ２５μｌ 温度サイクルは、９６℃で１分アニールした後、９６℃
で３０秒、２０℃で１５秒、 ６０℃で４分のサイクル
を２０回繰り返した。各プローブからのサイクルポリメ
ラーゼ反応産物をさらにマイクロカラム（Ｇ−５０）で
精製し、変性条件で電気泳動してフラグメント解析を行
った。電気泳動はＡＢＩ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚ
ｅｒ３１０で標準プロトコールに従った。また、フラグ
メント解析にはＧｅｎｅＳｃａｎTMｖｅｒ２．１を用い
た。得られた電気泳動パターンの例を図１、図２に示
す。
【００３９】１．２ 伸長反応の再現性 １．１に記載したプロトコールに従って、サイクルポリ
メラーゼ反応を行うときの伸長反応の再現性を調べるた
めに、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＡ（配列番号４）、Ｎ
1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＴ（配列番号５）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3
Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＧ（配列番号６）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ
6ＧＣＡＣ（配列番号７）の４種類の縮退プローブを使
用して、２回実験を繰り返した。実験結果を解析してみ
ると、被検体核酸の全ての相補配列において伸長反応が
起きているわけではなく、反応が実際に起こる相補配列
は起こりうる部位の凡そ３分の１から半分程度に留まっ
た。しかし、その箇所は殆ど決まっており、同一のプロ
ーブセットを同一の実験条件で同一の被検体核酸に対し
てハイブリダイズすれば、何回繰り返しても特徴的な電
気泳動パターンが得られ、これは殆ど変化しないことが
分かった（図１。例えば、図１ａと図１ｂを対比）。
メラーゼ反応を行うときの伸長反応の再現性を調べるた
めに、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＡ（配列番号４）、Ｎ
1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＴ（配列番号５）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3
Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＧ（配列番号６）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ
6ＧＣＡＣ（配列番号７）の４種類の縮退プローブを使
用して、２回実験を繰り返した。実験結果を解析してみ
ると、被検体核酸の全ての相補配列において伸長反応が
起きているわけではなく、反応が実際に起こる相補配列
は起こりうる部位の凡そ３分の１から半分程度に留まっ
た。しかし、その箇所は殆ど決まっており、同一のプロ
ーブセットを同一の実験条件で同一の被検体核酸に対し
てハイブリダイズすれば、何回繰り返しても特徴的な電
気泳動パターンが得られ、これは殆ど変化しないことが
分かった（図１。例えば、図１ａと図１ｂを対比）。
【００４０】１．３ Ｎ（縮退プローブの可変部分Ｎ1・
・・Ｎn）の数（ｎ）およびその位置関係 ハイブリダイゼーションにおいて、アニーリングの温度
等の実験条件を最適化して完全にミスマッチを防ぐこと
が出来るプローブの長さは、１２塩基長以上であると認
識されている。本発明に係る縮退プローブの場合、例え
ば識別能のある固定部分を４塩基とすると、ミスマッチ
を極力防ぐためには可変部分の長さを８塩基長以上に設
定する必要がある。しかしながら、既に考察したよう
に、実際には、このようなオリゴヌクレオチド・プロー
ブを用いるとき、Ｎの数が増えれば前記可変部分で完全
に被検体核酸の部位に一致する配列はプローブ混合物中
のごく一部に限られてくる。従って、遺伝子解析に用い
るための最適なプローブ長は実験的に確かめる必要があ
る。また、Ｎが連続していると、より高温で安定なプラ
イマー・ダイマーの形成が起きやすくなることも考えら
れる。これを防ぐためには固定部分Ｘ1・・・Ｘmを可変部
分Ｎ1・・・Ｎnの間に位置させ、出来るだけ運続したＮの
数を減らすことも有効と考えられる。
・・Ｎn）の数（ｎ）およびその位置関係 ハイブリダイゼーションにおいて、アニーリングの温度
等の実験条件を最適化して完全にミスマッチを防ぐこと
が出来るプローブの長さは、１２塩基長以上であると認
識されている。本発明に係る縮退プローブの場合、例え
ば識別能のある固定部分を４塩基とすると、ミスマッチ
を極力防ぐためには可変部分の長さを８塩基長以上に設
定する必要がある。しかしながら、既に考察したよう
に、実際には、このようなオリゴヌクレオチド・プロー
ブを用いるとき、Ｎの数が増えれば前記可変部分で完全
に被検体核酸の部位に一致する配列はプローブ混合物中
のごく一部に限られてくる。従って、遺伝子解析に用い
るための最適なプローブ長は実験的に確かめる必要があ
る。また、Ｎが連続していると、より高温で安定なプラ
イマー・ダイマーの形成が起きやすくなることも考えら
れる。これを防ぐためには固定部分Ｘ1・・・Ｘmを可変部
分Ｎ1・・・Ｎnの間に位置させ、出来るだけ運続したＮの
数を減らすことも有効と考えられる。
【００４１】そこで、まずＮの数を変えたＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4
Ｎ5Ｎ6Ｎ7Ｎ8ＡＴＧＣ（配列番号８）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ
5Ｎ6ＡＴＧＣ（配列番号９）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4ＡＴＧＣ
（配列番号１０）の３種類の縮退プローブを用意し、
１．１に記載したプロトコールに従って、サイクルポリ
メラーゼ反応を実施した。このセットの中では理論的に
予想される伸張フラグメント（３５３、３９３、１２５
４、１４０４、１４７８、および１６１６塩基長）の数
とピ−クの高さから判断して、余分な伸張フラグメント
が少なく理論的に予想される伸張フラグメントが多いと
いう点で、Ｎ1Ｎ2Ｎ 3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＡＴＧＣが最も優れてい
た（図２Ａ）。
Ｎ5Ｎ6Ｎ7Ｎ8ＡＴＧＣ（配列番号８）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ
5Ｎ6ＡＴＧＣ（配列番号９）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4ＡＴＧＣ
（配列番号１０）の３種類の縮退プローブを用意し、
１．１に記載したプロトコールに従って、サイクルポリ
メラーゼ反応を実施した。このセットの中では理論的に
予想される伸張フラグメント（３５３、３９３、１２５
４、１４０４、１４７８、および１６１６塩基長）の数
とピ−クの高さから判断して、余分な伸張フラグメント
が少なく理論的に予想される伸張フラグメントが多いと
いう点で、Ｎ1Ｎ2Ｎ 3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＡＴＧＣが最も優れてい
た（図２Ａ）。
【００４２】さらに、可変部分の配置を変化させたＮ1
Ｎ2Ｎ3Ｎ4ＡＴＧＣＮ5Ｎ6Ｎ7Ｎ8（配列番号１１）、Ｎ1
Ｎ2Ｎ3ＡＴＧＣＮ4Ｎ5Ｎ6（配列番号１２）の２種類の
縮退プローブを用意し、１．１に記載したプロトコール
に従って、サイクルポリメラーゼ反応を実施した。これ
らとＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＡＴＧＣを比較すると、Ｎ1Ｎ2
Ｎ3ＡＴＧＣＮ4Ｎ5Ｎ6が最も伸張フラグメント数が多か
ったものの、理論的に予想される伸張フラグメントの数
と高さはＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＡＴＧＣとＮ1Ｎ2Ｎ 3ＡＴ
ＧＣＮ4Ｎ5Ｎ6とでは、ほぼ同様という結果になった。
Ｎ2Ｎ3Ｎ4ＡＴＧＣＮ5Ｎ6Ｎ7Ｎ8（配列番号１１）、Ｎ1
Ｎ2Ｎ3ＡＴＧＣＮ4Ｎ5Ｎ6（配列番号１２）の２種類の
縮退プローブを用意し、１．１に記載したプロトコール
に従って、サイクルポリメラーゼ反応を実施した。これ
らとＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＡＴＧＣを比較すると、Ｎ1Ｎ2
Ｎ3ＡＴＧＣＮ4Ｎ5Ｎ6が最も伸張フラグメント数が多か
ったものの、理論的に予想される伸張フラグメントの数
と高さはＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＡＴＧＣとＮ1Ｎ2Ｎ 3ＡＴ
ＧＣＮ4Ｎ5Ｎ6とでは、ほぼ同様という結果になった。
【００４３】−般に伸張フラグメントの数が多いと理論
値以外の伸張フラグメントも増える傾向が認められる
が、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4ＡＴＧＣ以外の前記４種類のプローブ
はいずれも特徴的な電気泳動パタ−ンを示すことが分か
った。従って、これらは遺伝子解析に使用可能であろ
う。
値以外の伸張フラグメントも増える傾向が認められる
が、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4ＡＴＧＣ以外の前記４種類のプローブ
はいずれも特徴的な電気泳動パタ−ンを示すことが分か
った。従って、これらは遺伝子解析に使用可能であろ
う。
【００４４】さらに、被検体核酸を全く別のものに変え
て、上記の実験を繰り返すと電気泳動パターンが変化す
ることが認められた。この結果から、塩基配列の異なる
遺伝子の特徴、或いは種類を割り出すにはそれぞれのプ
ローブの電気泳動パターンを比較することにより可能で
あることが分かった。
て、上記の実験を繰り返すと電気泳動パターンが変化す
ることが認められた。この結果から、塩基配列の異なる
遺伝子の特徴、或いは種類を割り出すにはそれぞれのプ
ローブの電気泳動パターンを比較することにより可能で
あることが分かった。
【００４５】実施例２ 被検体核酸のシークエンス 製造例で調製した一本鎖λＤＮＡの一部（２００２塩基
長）を被検体核酸として、さらに実施例１で用いたもの
と同様の４塩基縮退プローブ（固定部分４塩基で可変部
分６塩基のＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＡＴＧＣ等）２５６種類
の組み合わせを使用して、本発明のシークエンス法を適
用し、その塩基配列のシークエンスを試みた。まず、シ
ークエンスの精度すなわち信頼性を、シークエンスに先
立ち確かめる必要があった。本方法を含めて、ＳＢＨ法
には、ハイブリダイズする際のミスマッチの問題があ
り、完全に相補的でないプローブでも被検体核酸とハイ
ブリダイズする。これはシークエンス上の重大な問題と
なりえるからである。
長）を被検体核酸として、さらに実施例１で用いたもの
と同様の４塩基縮退プローブ（固定部分４塩基で可変部
分６塩基のＮ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＡＴＧＣ等）２５６種類
の組み合わせを使用して、本発明のシークエンス法を適
用し、その塩基配列のシークエンスを試みた。まず、シ
ークエンスの精度すなわち信頼性を、シークエンスに先
立ち確かめる必要があった。本方法を含めて、ＳＢＨ法
には、ハイブリダイズする際のミスマッチの問題があ
り、完全に相補的でないプローブでも被検体核酸とハイ
ブリダイズする。これはシークエンス上の重大な問題と
なりえるからである。
【００４６】２．１ ミスマッチの検証 実施例１の方法（１．１）と同様にして、被検体核酸と
縮退プローブとのハイブリダイゼーションそれに続くサ
イクルポリメラーゼ反応を行い、得られたサイクルポリ
メラーゼ反応産物を電気泳動してフラグメント解析を行
った。分離された全てのフラグメントについての解析の
結果、完全マッチ（５０．４％）、１塩基ミスマッチ
（３６．２％）、２塩基ミスマッチ（１２．０％）、そ
の他不明（１．３％）であった。従って、殆どの伸張フ
ラグメントは、完全マッチか、１塩基ミスマッチの上、
伸張反応を起こしており、これらのフラグメントを用い
て充分シークエンス可能であることが分かった。
縮退プローブとのハイブリダイゼーションそれに続くサ
イクルポリメラーゼ反応を行い、得られたサイクルポリ
メラーゼ反応産物を電気泳動してフラグメント解析を行
った。分離された全てのフラグメントについての解析の
結果、完全マッチ（５０．４％）、１塩基ミスマッチ
（３６．２％）、２塩基ミスマッチ（１２．０％）、そ
の他不明（１．３％）であった。従って、殆どの伸張フ
ラグメントは、完全マッチか、１塩基ミスマッチの上、
伸張反応を起こしており、これらのフラグメントを用い
て充分シークエンス可能であることが分かった。
【００４７】続いて、被検体核酸の１００塩基長から１
１００塩基長までの１０００カ所の伸長反応部位につい
てミスマッチの頻度を調べた。その結果、完全マッチの
部位は７３６カ所、１塩基ミスマッチの部位は５２８カ
所、２塩基ミスマッチその他１９６カ所であった（それ
ぞれ重複している部位がある；例えば、ある部位は完全
マッチ１つのみ、また別な部位は、完全マッチ１つに１
塩基ミスマッチ１つ、等々）であった。完全マッチおよ
び１塩基ミスマッチで伸張反応が起こった部位は、全長
の約９６％であった。伸長反応が起き難い部位は、例え
ばＴＴＴＴＴＴおよびＡＡＡＡＡＡという部位であっ
た。従って、前記特定の塩基長部分については、完全マ
ッチか、１塩基ミスマッチの割合がさらに高く、かなり
正確なシークエンスが期待できることが分かった。
１００塩基長までの１０００カ所の伸長反応部位につい
てミスマッチの頻度を調べた。その結果、完全マッチの
部位は７３６カ所、１塩基ミスマッチの部位は５２８カ
所、２塩基ミスマッチその他１９６カ所であった（それ
ぞれ重複している部位がある；例えば、ある部位は完全
マッチ１つのみ、また別な部位は、完全マッチ１つに１
塩基ミスマッチ１つ、等々）であった。完全マッチおよ
び１塩基ミスマッチで伸張反応が起こった部位は、全長
の約９６％であった。伸長反応が起き難い部位は、例え
ばＴＴＴＴＴＴおよびＡＡＡＡＡＡという部位であっ
た。従って、前記特定の塩基長部分については、完全マ
ッチか、１塩基ミスマッチの割合がさらに高く、かなり
正確なシークエンスが期待できることが分かった。
【００４８】２．２ シークエンス ２．１でのミスマッチの検証から、被検体核酸のシーク
エンスが本方法によって実際可能なことが明らかとなっ
たので、前記被検体核酸の１００塩基長から１１００塩
基長の部分についてシークエンスを行った。これは、特
開平７−２０３９９８号公報に開示された「一筆書きの
アルゴリズム」の方法に基づく。すなわち、プローブ配
列を含む伸長フラグメントの長さを計測し（電気泳動で
の塩基長）、その伸長反応の長さの順（短いものから長
いものへ）に並べることによりシークエンスできる。
エンスが本方法によって実際可能なことが明らかとなっ
たので、前記被検体核酸の１００塩基長から１１００塩
基長の部分についてシークエンスを行った。これは、特
開平７−２０３９９８号公報に開示された「一筆書きの
アルゴリズム」の方法に基づく。すなわち、プローブ配
列を含む伸長フラグメントの長さを計測し（電気泳動で
の塩基長）、その伸長反応の長さの順（短いものから長
いものへ）に並べることによりシークエンスできる。
【００４９】しかしながら、現状の電気泳動法におい
て、フラグメントサイズは、数〜１０数塩基程度の誤差
があり、目視により確実にシークエンスできるのは３塩
基づつオーバーラップして繋げられる場合である。本例
の実験結果では、それぞれの４塩基配列（縮退プローブ
の固定部分４塩基に対応）が３塩基づつオーバーラップ
している部分は約７０％あった。このようなオーバーラ
ップの部分では１塩基ミスマッチが含まれていても塩基
配列が読め、シークエンスできる。但し、オーバーラッ
プがなくてもフラグメントのサイズ計測がより正確であ
れば３塩基オーバーラップ以外の部分でも配列を繋げら
れ、シークエンスが可能となる。
て、フラグメントサイズは、数〜１０数塩基程度の誤差
があり、目視により確実にシークエンスできるのは３塩
基づつオーバーラップして繋げられる場合である。本例
の実験結果では、それぞれの４塩基配列（縮退プローブ
の固定部分４塩基に対応）が３塩基づつオーバーラップ
している部分は約７０％あった。このようなオーバーラ
ップの部分では１塩基ミスマッチが含まれていても塩基
配列が読め、シークエンスできる。但し、オーバーラッ
プがなくてもフラグメントのサイズ計測がより正確であ
れば３塩基オーバーラップ以外の部分でも配列を繋げら
れ、シークエンスが可能となる。
【００５０】実際、一筆書きのアルゴリズムに従って、
被検体核酸の６５０塩基付近、および１０５０塩基付近
の塩基長に対応する伸張フラグメントを塩基長の短い順
に並べると、それぞれ図３、図４に示すようになる。こ
れらの例では、３塩基オーバーラップしないものを図の
右側に塩基整列群から除外して示してある。３塩基オー
バーラップの部分を繋げてゆき、オーバーラップした部
分を順に読み上げてゆく（５’末端から３’末端へ、す
なわち左側から右側へ）ことによりそれぞれ次のような
配列であることが予想される。 上記いずれの配列も被検体核酸に事実、含まれているの
で（配列表の配列番号３を参照）、本方法によりシーケ
ンスが可能であることが示された。なお、上記塩基配列
をそれぞれ配列表の配列番号１３〜１６に示す。１００
塩基から１１００塩基までの間で、同様の目視３塩基オ
ーバーラップのシーケンスを行い、塩基の決まったもの
は６６３塩基長（66.3%）であった。
被検体核酸の６５０塩基付近、および１０５０塩基付近
の塩基長に対応する伸張フラグメントを塩基長の短い順
に並べると、それぞれ図３、図４に示すようになる。こ
れらの例では、３塩基オーバーラップしないものを図の
右側に塩基整列群から除外して示してある。３塩基オー
バーラップの部分を繋げてゆき、オーバーラップした部
分を順に読み上げてゆく（５’末端から３’末端へ、す
なわち左側から右側へ）ことによりそれぞれ次のような
配列であることが予想される。 上記いずれの配列も被検体核酸に事実、含まれているの
で（配列表の配列番号３を参照）、本方法によりシーケ
ンスが可能であることが示された。なお、上記塩基配列
をそれぞれ配列表の配列番号１３〜１６に示す。１００
塩基から１１００塩基までの間で、同様の目視３塩基オ
ーバーラップのシーケンスを行い、塩基の決まったもの
は６６３塩基長（66.3%）であった。
【００５１】
【発明の効果】本発明の遺伝子解析法は、縮退プローブ
を用いて、前記遺伝子に由来する１本鎖の被検体核酸と
ハイブリダイズさせ、被検体核酸を鋳型として、プロー
ブをプライマーとしてサイクルポリメラーゼ反応を行わ
せ、各プローブから得られた反応産物をゲル電気泳動で
分離し、電気泳動パターンを比較するので、遺伝子の全
塩基配列をシークエンスをすることなしに、該塩基配列
の特徴を抽出することができる。
を用いて、前記遺伝子に由来する１本鎖の被検体核酸と
ハイブリダイズさせ、被検体核酸を鋳型として、プロー
ブをプライマーとしてサイクルポリメラーゼ反応を行わ
せ、各プローブから得られた反応産物をゲル電気泳動で
分離し、電気泳動パターンを比較するので、遺伝子の全
塩基配列をシークエンスをすることなしに、該塩基配列
の特徴を抽出することができる。
【００５２】また、本発明の遺伝子シークエンス法は、
縮退プローブを用いて、前記遺伝子に由来する１本鎖の
被検体核酸とハイブリダイズさせ、被検体核酸を鋳型と
して、プローブをプライマーとしてサイクルポリメラー
ゼ反応を行わせ、プライマーを伸張させ、各プローブか
ら得られる伸張反応産物をゲル電気泳動で伸張フラグメ
ントに分離し、それぞれの伸張フラグメントの塩基長を
決定し、伸張フラグメントの塩基長と各プローブの所定
の塩基配列とを関連させ、前記被検体核酸の塩基配列の
特徴付けを行うので、遺伝子の全塩基配列をシークエン
スをすることなしに一部分のみをシークエンスした上
で、該塩基配列の特徴を抽出することができる。
縮退プローブを用いて、前記遺伝子に由来する１本鎖の
被検体核酸とハイブリダイズさせ、被検体核酸を鋳型と
して、プローブをプライマーとしてサイクルポリメラー
ゼ反応を行わせ、プライマーを伸張させ、各プローブか
ら得られる伸張反応産物をゲル電気泳動で伸張フラグメ
ントに分離し、それぞれの伸張フラグメントの塩基長を
決定し、伸張フラグメントの塩基長と各プローブの所定
の塩基配列とを関連させ、前記被検体核酸の塩基配列の
特徴付けを行うので、遺伝子の全塩基配列をシークエン
スをすることなしに一部分のみをシークエンスした上
で、該塩基配列の特徴を抽出することができる。
【００５３】また、本発明の遺伝子シークエンス法は、
縮退プローブを用いて、前記遺伝子に由来する１本鎖の
被検体核酸とハイブリダイズさせ、被検体核酸を鋳型と
して、プローブをプライマーとしてサイクルポリメラー
ゼ反応を行わせ、プライマーを伸張させ、各プローブか
ら得られる伸張反応産物をゲル電気泳動で伸張フラグメ
ントに分離し、それぞれの伸張フラグメントの塩基長を
決定し、各プローブの所定の塩基配列を一筆書きアルゴ
リズムに従い、前記伸張フラグメントの塩基長の順に整
列し、前記被検体核酸の塩基配列の一部を決定するの
で、比較的簡単に目視で該塩基配列をシークエンスをす
ることが可能となる。さらに、本方法によれば、被検体
核酸の塩基配列の全長をクローニングすることなしに決
定しうる。
縮退プローブを用いて、前記遺伝子に由来する１本鎖の
被検体核酸とハイブリダイズさせ、被検体核酸を鋳型と
して、プローブをプライマーとしてサイクルポリメラー
ゼ反応を行わせ、プライマーを伸張させ、各プローブか
ら得られる伸張反応産物をゲル電気泳動で伸張フラグメ
ントに分離し、それぞれの伸張フラグメントの塩基長を
決定し、各プローブの所定の塩基配列を一筆書きアルゴ
リズムに従い、前記伸張フラグメントの塩基長の順に整
列し、前記被検体核酸の塩基配列の一部を決定するの
で、比較的簡単に目視で該塩基配列をシークエンスをす
ることが可能となる。さらに、本方法によれば、被検体
核酸の塩基配列の全長をクローニングすることなしに決
定しうる。
【００５４】従って、本発明の遺伝子解析法は、シーク
エンスを含めて遺伝子の同定、遺伝子の変異検出、その
他の遺伝子の塩基配列の情報を解析する目的に広く適用
可能であり、汎用性がある。より具体的には、遺伝子診
断（感染症、癌、遺伝病等）、遺伝子関連創薬への応用
（ドラツグディスカバリー、遺伝子スクリ‐ニング）、
その他、遺伝子検出関連全般（医薬、食品、農業、環
境、）で利用可能である。
エンスを含めて遺伝子の同定、遺伝子の変異検出、その
他の遺伝子の塩基配列の情報を解析する目的に広く適用
可能であり、汎用性がある。より具体的には、遺伝子診
断（感染症、癌、遺伝病等）、遺伝子関連創薬への応用
（ドラツグディスカバリー、遺伝子スクリ‐ニング）、
その他、遺伝子検出関連全般（医薬、食品、農業、環
境、）で利用可能である。
【００５５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Laboratory of Molecular Biophotonics <120> Method for gene analysis <130> MBP-159 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gatgagttcg tgtccgtaca actggcgtaa tcatg 35 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gatagctgtc gtcataggac tc 22 <210> 3 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> template <400> 3 gatgagttcg tgtccgtaca actggcgtaa tcatggccct tcggggccat ttgtttctct 60 gtggaggagt ccatgacgaa agatgaactg attgcccgtc tccgctcgct gggtgaacaa 120 ctgaaccgtg atgtcagcct gacggggacg aaagaagaac tggcgctccg tgtggcagag 180 ctgaaagagg agcttgatga cacggatgaa actgccggtc aggacacccc tctcagccgg 240 gaaaatgtgc tgaccggaca tgaaaatgag gtgggatcag cgcagccgga taccgtgatt 300 ctggatacgt ctgaactggt cacggtcgtg gcactggtga agctgcatac tgatgcactt 360 cacgccacgc gggatgaacc tgtggcattt gtgctgccgg gaacggcgtt tcgtgtctct 420 gccggtgtgg cagccgaaat gacagagcgc ggcctggcca gaatgcaata acgggaggcg 480 ctgtggctga tttcgataac ctgttcgatg ctgccattgc ccgcgccgat gaaacgatac 540 gcgggtacat gggaacgtca gacaccatta catccggtga gcagtcaggt gcggtgatac 600 gtggtgtttt tgatgaccct gaaaatatca gctatgccgg acagggcgtg cgcgttgaag 660 gctccagccc gtccctgttt gtccggactg atgaggtgcg gcagctgcgg cgtggagaca 720 cgctgaccat cggtgaggaa aatttctggg tagatcgggt ttcgccggat gatggcggaa 780 gttgtcatct ctggcttgga cggggcgtac cgcctgccgt taaccgtcgc cgctgaaagg 840 gggatgtatg gccataaaag gtcttgagca ggccgttgaa aacctcagcc gtatcagcaa 900 aacggcggtg cctggtgccg ccgcaatggc cattaaccgc gttgcttcat ccgcgatatc 960 gcagtcggcg tcacaggttg cccgtgagac aaaggtacgc cggaaactgg taaaggaaag 1020 ggccaggctg aaaagggcca cggtcaaaaa tccgcaggcc agaatcaaag ttaaccgggg 1080 ggatttgccc gtaatcaagc tgggtaatgc gcgggttgtc ctttcgcgcc gcaggcgtcg 1140 taaaaagggg cagcgttcat ccctgaaagg tggcggcagc gtgcttgtgg tgggtaaccg 1200 tcgtattccc ggcgcgttta ttcagcaact gaaaaatggc cggtggcatg tcatgcagcg 1260 tgtggctggg aaaaaccgtt accccattga tgtggtgaaa atcccgatgg cggtgccgct 1320 gaccacggcg ttaaacaaaa tattgagcgg atacggcgtg aacgtcttga aagagctggg 1380 ctatgcgctg cagcatcaac tgaggatggt aataaagcga tgaaacatac tgaactccgt 1440 gcagccgtac tggatgcact ggagaagcat gacaccgggg cgacgttttt tgatggtcgc 1500 cccgctgttt ttgatgaggc ggattttccg gcagttgccg tttatctcac cggcgctgaa 1560 tacacgggcg aagagctgga cagcgatacc tggcaggcgg agctgcatat cgaagttttc 1620 ctgcctgctc aggtgccgga ttcagagctg gatgcgtgga tggagtcccg gatttatccg 1680 gtgatgagcg atatcccggc actgtcagat ttgatcacca gtatggtggc cagcggctat 1740 gactaccggc gcgacgatga tgcgggcttg tggagttcag ccgatctgac ttatgtcatt 1800 acctatgaaa tgtgaggacg ctatgcctgt accaaatcct acaatgccgg tgaaaggtgc 1860 cgggaccacc ctgtgggttt ataaggggag cggtgaccct tacgcgaatc cgctttcaga 1920 cgttgactgg tcgcgtctgg caaaagttaa agacctgacg cccggcgaac tgaccgctga 1980 gtcctatgac gacagctatc 2000 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aacgnnnnnn 10 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tacgnnnnnn 10 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gacgnnnnnn 10 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cacgnnnnnn 10 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgtannnnnn nn 12 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgtannnnnn 10 <210> 10 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cgtannnn 8 <210> 11 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 nnnncgtann nn 12 <210> 12 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 nnncgtannn 10 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> part of the template <400> 13 agctatgccg gacagggcgt gcgcg 25 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> part of the template <400> 14 cgttgaaggc tccagcc 17 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> part of the template <400> 15 aagggccagg ctgaaaa 17 <210> 16 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> part of the template <400> 16 aagggccacg 10
【図１】本発明に係る各種縮退プローブを用いて被検体
核酸とのサイクルポリメラーゼ反応反応を反復して行わ
せた結果得られたサイクルポリメラーゼ反応産物の電気
泳動パターンを表すチャートである。図1ａは、Ｎ1Ｎ2
Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＡプローブ、図１ｂは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3
Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＴプローブ、図１ｃは、Ｎ1Ｎ2Ｎ 3Ｎ4
Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＧプローブ、図1ｄは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ
6ＧＣＡＣプ口−プに対応する。サイクルポリメラーゼ
反応反応を繰り返したときの結果を示すチャートが図１
e〜図１ｈであり、それぞれ図1eは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ
6ＧＣＡＡプローブ、図１fは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣ
ＡＴプローブ、図１gは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＧ
プローブ、図1hは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＣプ口−
プに対応する。各チャ‐ト上のピークは、分離されたフ
ラグメントを示す。また、チャートの横スケ−ルはフラ
グメントの塩基長を表し、縦スケールはフラグメントの
強度（任意単位）を表す。
核酸とのサイクルポリメラーゼ反応反応を反復して行わ
せた結果得られたサイクルポリメラーゼ反応産物の電気
泳動パターンを表すチャートである。図1ａは、Ｎ1Ｎ2
Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＡプローブ、図１ｂは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3
Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＴプローブ、図１ｃは、Ｎ1Ｎ2Ｎ 3Ｎ4
Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＧプローブ、図1ｄは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ
6ＧＣＡＣプ口−プに対応する。サイクルポリメラーゼ
反応反応を繰り返したときの結果を示すチャートが図１
e〜図１ｈであり、それぞれ図1eは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ
6ＧＣＡＡプローブ、図１fは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣ
ＡＴプローブ、図１gは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＧ
プローブ、図1hは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6ＧＣＡＣプ口−
プに対応する。各チャ‐ト上のピークは、分離されたフ
ラグメントを示す。また、チャートの横スケ−ルはフラ
グメントの塩基長を表し、縦スケールはフラグメントの
強度（任意単位）を表す。
【図２】本発明に係る各種縮退プローブを用いて被検体
核酸とのサイクルポリメラーゼ反応反応を行わせた結果
得られたサイクルポリメラーゼ反応産物の電気泳動パタ
ーンを表すチャートである。図２ａは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ
5Ｎ6Ｎ7Ｎ8ＡＴＧＣ、図２ｂは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6Ａ
ＴＧＣ、図２ｃは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4ＡＴＧＣ、図２ｄは、
Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4ＡＴＧＣＮ5Ｎ6Ｎ7Ｎ8、図２ｅは、Ｎ1Ｎ2
Ｎ3ＡＴＧＣＮ4Ｎ 5Ｎ6にそれぞれ対応する。各チャート
上のピークは、分離されたフラグメントを示す。また、
チャートの横スケ−ルはフラグメントの塩基長を表し、
縦スケールはフラグメントの強度（任意単位）を表す。
核酸とのサイクルポリメラーゼ反応反応を行わせた結果
得られたサイクルポリメラーゼ反応産物の電気泳動パタ
ーンを表すチャートである。図２ａは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ
5Ｎ6Ｎ7Ｎ8ＡＴＧＣ、図２ｂは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4Ｎ5Ｎ6Ａ
ＴＧＣ、図２ｃは、Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4ＡＴＧＣ、図２ｄは、
Ｎ1Ｎ2Ｎ3Ｎ4ＡＴＧＣＮ5Ｎ6Ｎ7Ｎ8、図２ｅは、Ｎ1Ｎ2
Ｎ3ＡＴＧＣＮ4Ｎ 5Ｎ6にそれぞれ対応する。各チャート
上のピークは、分離されたフラグメントを示す。また、
チャートの横スケ−ルはフラグメントの塩基長を表し、
縦スケールはフラグメントの強度（任意単位）を表す。
【図３】本発明のシークエンス方法に従って、被検体核
酸の塩基番号６５０付近をシークエンスする手法を模式
的に説明する図である。シークエンスは、図中、左側か
ら右側へ順に塩基を読み上げてゆく。図中の数字は、各
プローブによる伸張反応産物から得られた伸張フラグメ
ントの塩基長の実測値を表す。
酸の塩基番号６５０付近をシークエンスする手法を模式
的に説明する図である。シークエンスは、図中、左側か
ら右側へ順に塩基を読み上げてゆく。図中の数字は、各
プローブによる伸張反応産物から得られた伸張フラグメ
ントの塩基長の実測値を表す。
【図４】本発明のシークエンス方法に従って、被検体核
酸の塩基番号１０５０付近をシークエンスする手法を模
式的に説明する図である。シークエンスは、図中、左側
から右側へ順に塩基を読み上げてゆく。図中の数字は、
各プローブによる伸張反応産物から得られた伸張フラグ
メントの塩基長の実測値を表す。
酸の塩基番号１０５０付近をシークエンスする手法を模
式的に説明する図である。シークエンスは、図中、左側
から右側へ順に塩基を読み上げてゆく。図中の数字は、
各プローブによる伸張反応産物から得られた伸張フラグ
メントの塩基長の実測値を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 CA20 HA08 HA11 HA12 HA14 HA19 4B063 QA13 QA19 QQ42 QR08 QR55 QR62 QR82 QS16 QS24 QS34 QX01
Claims (13)
- 【請求項１】 ハイブリダイゼーションによる遺伝子解
析方法であって、１組の縮退プローブを用意する第１の
工程と、前記遺伝子に由来する１本鎖の被検体核酸を前
記１組の縮退プローブの各プローブにハイブリダイズさ
せる第２の工程と、前記ハイブリダイズさせた被検体核
酸を鋳型とし、前記各プローブをプライマーとしてサイ
クルポリメラーゼ反応を行う第３の工程と、前記各プロ
ーブから得られた反応産物をゲル電気泳動で分離し、電
気泳動パターンを取得する第４の工程と、前記電気泳動
パターンを前記各プローブについて比較する第５の工程
と、を含む遺伝子解析方法。 - 【請求項２】 ハイブリダイゼーションによる遺伝子解
析方法であって、各プローブが所定の塩基配列を有す
る、１組の縮退プローブを用意する第１の工程と、前記
遺伝子に由来する１本鎖の被検体核酸を前記１組の縮退
プローブの各プローブにハイブリダイズさせる第２の工
程と、前記ハイブリダイズさせた被検体核酸を鋳型と
し、前記各プローブをプライマーとしてサイクルポリメ
ラーゼ反応を行わせ、該プライマーを伸張させる第３の
工程と、前記各プローブから得られた伸張反応産物をゲ
ル電気泳動で伸張フラグメントに分離し、該伸張フラグ
メントのそれぞれの塩基長を決定する第４の工程と、前
記伸張フラグメントの塩基長と前記各プローブの所定の
塩基配列とを関連させ、前記被検体核酸の塩基配列の特
徴付けを行う第５の工程と、を含む遺伝子解析方法。 - 【請求項３】 ハイブリダイゼーションによる遺伝子解
析方法であって、各プローブが所定の塩基配列を有す
る、１組の縮退プローブを用意する第１の工程と、前記
遺伝子に由来する１本鎖の被検体核酸を前記１組の縮退
プローブの各プローブにハイブリダイズさせる第２の工
程と、前記ハイブリダイズされた被検体核酸を鋳型と
し、前記各プローブをプライマーとしてサイクルポリメ
ラーゼ反応を行わせ、該プライマーを伸張させる第３の
工程と、前記各プローブから得られた伸張反応産物をゲ
ル電気泳動で伸張フラグメントに分離し、該伸張フラグ
メントのそれぞれの塩基長を決定する第４の工程と、前
記各プローブの所定の塩基配列を一筆書きアルゴリズム
に従い、前記伸張フラグメントの塩基長の順に整列し、
前記被検体核酸の塩基配列の一部を決定する第５の工程
と、を含む遺伝子の解析方法。 - 【請求項４】 前記第５の工程において、前記被検体核
酸の塩基配列の全長を決定することを特徴とする、請求
項３に記載の遺伝子解析方法。 - 【請求項５】 前記プローブがＮ1Ｎ2Ｎ3・・ＮnＸ1Ｘ2
・・Ｘm（式１）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn（式
２）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn-1Ｎ n（式３）、
‐‐‐‐‐またはＸ1Ｘ2・・ＸmＮ1Ｎ2Ｎ3・・・Ｎn-1
Ｎn（式ｎ）（式中、Ｎ1〜Ｎnは、４種類の塩基Ａ、
Ｔ、Ｇ、およびＣのいずれかを指すが、ランダムであ
り、一方Ｘ1〜Ｘmは、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣのいずれか
を指すが予め定められており、ｍおよびｎは、それぞれ
自然数である）で表わされるオリゴヌクレオチドである
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載
の遺伝子解析方法。 - 【請求項６】 １組の縮退プローブが４m個の前記各プ
ローブからなる全ての組合せのセット、若しくはその一
部のサブセットであることを特徴とする、請求項５に記
載の遺伝子解析方法。 - 【請求項７】 ｍが３、４、または５であることを特徴
とする、請求項５または６に記載の遺伝子解析方法。 - 【請求項８】 ｎが５、６、７または８であることを特
徴とする、請求項７に記載の遺伝子解析方法。 - 【請求項９】 ｍが４であり、ｎが６であることを特徴
とする、請求項５または６に記載の遺伝子解析方法。 - 【請求項１０】 第１の工程において、１組の縮退プロ
ーブの総数に相当する数のウエル部を有するアレイ型容
器を用意し、該ウエル部の各々に、該１組の縮退プロー
ブの各プローブを分注することを特徴とする、請求項１
〜５のいずれか一項に記載の遺伝子解析方法。 - 【請求項１１】 前記各プローブが請求項５で定義され
るものであり、前記１組の縮退プローブの総数が４m個
であることを特徴とする、請求項１０に記載の遺伝子解
析方法。 - 【請求項１２】 遺伝子解析用キットであって、各プ
ローブがＮ1Ｎ2Ｎ3・・・ＮnＸ1Ｘ2・・Ｘm（式１）、
Ｎ1Ｎ2Ｎ3・・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn（式２）、Ｎ1Ｎ2Ｎ3
・・Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮn-1Ｎn（式３）、‐‐‐‐または
Ｘ1Ｘ2・・ＸmＮ1Ｎ2Ｎ3・・・Ｎn-1Ｎn（式ｎ）（式
中、Ｎ1〜Ｎnは、４種類の塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣの
いずれかを指すが、ランダムであり、一方Ｘ1〜Ｘmは、
Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣのいずれかを指すが予め定められ
ており、ｍおよびｎは、それぞれ自然数である）で表さ
れるオリゴヌクレオチドである１組の縮退プローブと、
該１組の縮退プローブの総数に相当する数のウエル部を
有するアレイ型容器と、さらに緩衝液およびＤＮＡポリ
メラ―ゼとを含み、かつ前記各プローブが前記アレイ型
容器の各ウエル部に分注されていることを特徴とする遺
伝子解析用キット。 - 【請求項１３】 前記分注された各プローブが前記ア
レイ型容器の各ウエル部に固定化されていることを特徴
とする、請求項１２に記載の遺伝子解析用キット。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000022630A JP3499795B2 (ja) | 2000-01-31 | 2000-01-31 | 遺伝子解析法 |
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|---|---|
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ID=18548906
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000022630A Expired - Fee Related JP3499795B2 (ja) | 2000-01-13 | 2000-01-31 | 遺伝子解析法 |
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| JP (1) | JP3499795B2 (ja) |
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| CA2649725A1 (en) * | 2006-04-19 | 2007-10-25 | Applera Corporation | Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPH07203998A (ja) | 1994-01-26 | 1995-08-08 | Hamamatsu Photonics Kk | 核酸塩基配列決定方法 |
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| WO1999022025A1 (en) * | 1997-10-24 | 1999-05-06 | Trustees Of Boston University | Inference sequencing by hybridization |
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