JP2012509083A - ポリヌクレオチドのマッピング及び配列決定 - Google Patents

Abstract

【解決手段】 本発明はバイオポリマーサンプルについて構造的情報を得る方法を提供するものである。この方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡのようなバイオポリマーの一部を標識する工程、場合によっては、バイオポリマーを線形化する工程、及び、標識の間の距離を測定する工程を含む。使用者はそれにより、異なるサンプルの質的な比較及び側面領域におけるヌクレオチドの付加及び欠失のため与えられたサンプルの分析と、異なるサンプル間の距離を比較することができる。この方法はまた、バイオポリマーの配列決定も可能にする。
【選択図】 図２Ｃ

Description

この出願は、２００８年１１月１８日に出願された米国出願第６１／１１５，７０４に対して優先権の主張を行い、その全体の開示は、この参照により本明細書に完全に組み込まれる。

本発明は核酸配列決定及び分子イメージングの分野に関する。本発明はまた、ナノテクノロジーに関する。

分子生物学技術の進歩に伴って、解像度及び精度の絶え間ない進歩により、微小分析及び微小サンプルへの関心が高まった。このうちのいくつかは、母集団の不均一性が、多くの場合、サンプルの顕著な特徴をあいまいにすることもあるという認識に駆られたものである。限られたサンプル量もまた、適用によっては考慮に入れる。

既存の技術は、理論的には、物理的に小さなサンプルから重要な情報を抽出することができるが、このような技術の有効性は、このような小さなサンプルの構造的特徴に対する分解能によって制限される。したがって、当技術分野においては、単一分子または他の物理的に小さなサンプルに基づいてゲノム情報を得ることができる方法及び関連するデバイスが必要とされる。このような方法は、最新の技術により１０００ｂｐ（１ｋｂ）精度が向上させることができると、その方法の価値が高められる。

前述した課題を乗り越える方法として、本発明は、１またはそれ以上のエキソンの存在または相対位置を分析する方法であって、バイオポリマー上の第一及び第二の位置を、それぞれ、第一及び第二の標識が少なくとも一つの定常エキソンを含むバイオポリマーの第一の領域の側面に位置するように、前記第一及び第二の標識によって標識する工程と、バイオポリマーを線形化し、且つ、前記第一及び第二の標識の間の距離を前記バイオポリマーの前記第一の領域における選択的エキソンの存在、非存在、または相対位置と関連付ける工程とを有するものである方法を提供する。

第二の態様として、本発明は、ＤＮＡサンプルについての構造的情報を得る方法であって、第一の二本鎖ＤＮＡサンプルを配列特異的切断エンドヌクレアーゼにより切断する工程と、前記切断エンドヌクレアーゼにより切断された２またはそれ以上の切断部位に、１またはそれ以上の色素標識したヌクレオチドを組み込む工程と、少なくとも二つの色素標識されたヌクレオチドを含む第一の二本鎖ＤＮＡサンプルの一部を線形化する工程と、２またはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドの相対位置を記録する工程とを有するものである方法を提供する。

また、核酸バイオポリマーについて配列情報を得る方法であって、第一の結合配列を有する第一の蛍光標識された配列特異的プローブを一本鎖核酸バイオポリマーに結合する工程と、前記一本鎖核酸バイオポリマーを、第一の蛍光標識を有する第一のターミネーターヌクレオチド、第二の蛍光標識を有する第二のターミネーターヌクレオチド、第三の蛍光標識を有する第三のターミネーターヌクレオチド、及び第四の蛍光標識を有する第四のターミネーターヌクレオチドと接触させる工程と、前記核酸バイオポリマーを線形化及び照射する工程であって、これにより前記第一の標識された配列特異的プローブと隣接する、第一のターミネーターヌクレオチド、第二のターミネーターヌクレオチド、第三のターミネーターヌクレオチド、第四のターミネーターヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせの存在または相対位置を測定するものである、前記線形化及び照射する工程とを有するものである方法も提供する。

本発明はまた、核酸バイオポリマーについて構造的情報を得るための方法であって、第一の切断部位を生じさせるために二本鎖バイオポリマーを切断エンドヌクレアーゼに接触させる工程と、前記第一の切断部位を、蛍光標識Ａを有する第一のターミネーターヌクレオチド、蛍光標識Ｂを有する第二のターミネーターヌクレオチド、蛍光標識Ｃを有する第三のターミネーターヌクレオチド、蛍光標識Ｄを有する第四のターミネーターヌクレオチドと接触させる工程と、前記二本鎖バイオポリマーを線形化及び照射する工程であって、これにより第一のターミネーターヌクレオチド、第二のターミネーターヌクレオチド、第三のターミネーターヌクレオチド、第四のターミネーターヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせの相対位置を測定するものである、前記線形化及び照射する工程とを有するものである方法も提供する。

さらに、多重ハイブリダイゼーションを実行するためのキットであって、それぞれ異なる色の複数のハイブリダイゼーションプローブと、前記複数のハイブリダイゼーションプローブの少なくとも二つを核酸サンプルに適用するため、且つ少なくともひとつのハイブリダイズされた核酸を線形化及び画像化するための説明書とを有するキットも提供される。

概要は、以下の明細書と同様に、添付の図面とともに読むことでさらに理解される。本発明を説明する目的のために、本発明の実施例を図面に示した。しかし、本発明は、開示されたと特定の方法、組成物及びデバイスに限定されるものではない。加えて、図面は必ずしも一定の縮尺で描かれていない。
図１Ａは、１００ｂｐ光学解像度が劇的にマップの精度と被覆範囲を向上することを示すｔ．ＢｓｔＮＢＩ切断エンドヌクレアーゼの統計学的マッピングを図示するものである。 図ＩＢは、１００ｂｐ光学解像度がマップの精度と被覆範囲においてほとんど影響がないことを示すＮｔ．ＢｓｐＱＩ切断エンドヌクレアーゼの優れた統計学的マッピングを図示するものである。 図１Ｃは、比較的詳細なマップ（１．５ｋｂ）が、比較的粗いマップ（１６ｋｂ）よりも構造変化においてより良い検出力を有することを図示するものである。 図２ＡはＭＡＰＴ遺伝子構造を描写するものである。 図２Ｂは、ＭＡＰＴ遺伝子に存在する各エキソンの各エキソン（選択的エキソンは影で示されている）のサイズの表である。 図２Ｃは、ＲＮＡエキソンスプライシングに適用される超分解能イメージングのためのバーコーディングまたはマッピングスキームを図示するものである。 図２Ｄは、多重バーコーディングスキームを図示するものである。 図３は、配列決定のための出発物質を図示するものである。 図４は、配列決定反応の第一周期を描写するものである。 図５は、図４で始まった第二配列決定周期を描写するものである。 図６は、多重配列決定スキームが劇的に増大するスループットを説明するものである。 図７ＡはＳＨＲＩＭＰの解像度を示すのに用いられる７４１ｂｐのＰＣＲ生成物のモデルシステムを描写するものである。 図７Ｂは、標識されたＤＮＡ分子がガラス表面に線形化された後のイメージング結果を図示するものであり、３０ｎｍ及び６０ｎｍ離れた３つのＣｙ３色素分子を示し、これは３つのＣｙ３プローブの間の距離である９４ｂｐ及び１７２ｂｐに十分に一致するものである。 図８Ａは、ＳＨＲＩＭＰ及びＳＨＲＥＣの解像度を示すのに用いられる７４１ｂｐのＰＣＲ生成物のモデルシステムを描写するものである。 図８Ｂは、標識されたＤＮＡ分子がガラス表面において線形化された後のイメージング結果、Ｃｙ３−Ｃｙ５ペア間の距離が３７±５ｎｍ（３２ｎｍを除く）及び９１±５ｎｍ（８７ｎｍを除く）、及びＣｙ３−Ｃｙ３ペア間の距離が５６±３ｎｍ（５８ｎｍを除く）（図４）が優れた一致を示すことを図示するものである。 図９は、サンプルを図示し、遺伝物質に関する構造的情報を解明する本願発明に係る方法の限定されない実施形態を図示するものである。 図１０は、第二サンプルを図示し、遺伝物質に関する構造的情報を解明する本願発明に係る方法の限定されない実施形態を図示するものである。 図１１は、本願発明に係る方法の限定されない実施形態を図示するものである。 図１２は、本願発明に係る方法の限定されないさらなる実施形態を図示するものである。

本発明は、以下の詳細な説明を開示に添付した図面及び例とともに参照することにより、より容易に理解することができる。本発明は、明細書に記述され、及び／または示された特定のデバイス、方法、適用、条件またはパラメーターに限定されるものではなく、及び、明細書で使用される専門用語は、ここだけの例示のみの方法によって特定の実施形態を記述する目的のためのものであり、本発明を限定することを意図したものではないことが理解される。また、添付の特許請求の範囲を含む明細書において使用されている、単数形「ａ」、「ａｎ」及び複数を含む「ｔｈｅ」、及び特定の数値の参照は、文脈が明確に示さない限り、少なくとも特定の値を含むものである。明細書において使用される用語「複数」は、一つ以上であることを意味する。値の範囲が示されているとき、他の実施形態は、一つの特定の値から及び／または他の特定の値を含む。同様に、値が「約」という先行詞を用いて、近似値として表現される場合、特定の値が他の実施形態を形成すると理解される。全ての範囲は包括的及び結合的である。

本発明のある種の特徴は、それを明確にするために、分離した実施形態の文脈において明細書に記載され、また、単一の実施形態において組み合わされて提供されることもあると理解される。逆に、本発明の様々な特徴は、それを簡潔にするために、単一の実施形態の文脈において記載され、個々に、または任意のサブコンビネーションにおいて提供されることもある。また、範囲に記載されている値への参照は、それぞれ、その範囲内の全ての値が含まれている。

第一の実施形態において、本発明は１またはそれ以上のエキソンの存在または相対位置を分析する方法を提供する。これらの方法は、第一及び第二の標識がそれぞれ少なくとも一つ定常エキソンを含むバイオポリマーサンプルの第一の領域の側面に位置するように、第一及び第二の標識で、バイオポリマーサンプル上の第一及び第二の位置を標識する工程を含む。使用者は次に、第一及び第二の標識の間の距離と、前記バイオポリマーの前記第一の領域における選択的エキソン（例えば、全てのｍＲＮＡに出現するものではないエキソン）の存在または非存在（または相対位置）とを関連付ける（前記バイオポリマーは適切にｍＲＮＡと相補的なＤＮＡであり、このようなＤＮＡは当業者によって容易に合成される）。

一部の実施形態において、第一及び第二の標識は同じ蛍光色素分子である。多様な蛍光色素分子が本発明において適しており、蛍光色素分子であるＣｙファミリーを含む。他の蛍光色素分子は当業者によく知られており、蛍光色素分子のリストは例えば、 ｈｔｔｐ：／／ｉｎｆｏ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ｗａｒｄ／ｔａｖｉ／ＦＩＳＨｄｙｅｓ２．ｈｔｍｌで見られる。標識は、同じ蛍光色素分子でも異なる蛍光色素分子でもありうる。

使用者は、バイオポリマーサンプル上に存在する第一及び第二の標識の距離と、選択的エキソンを含まないことが知られているバイオポリマーの第一の領域の側面に位置する標識の間の距離を比較することにより、第一及び第二の標識の間の距離と、１またはそれ以上の選択的エキソンの存在、非存在、またはその両方（または選択的エキソンの相対位置でさえも）を適切に関連付ける。これは蛍光標識を含むバイオポリマーの領域を線形化することにより適切に達成される。バイオポリマーの線形化に関しては、米国出願番号１０／４８４，２９３（２００９年１１月９日に特許を付与）において詳細に述べられており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。

当該関連付けは、第一及び第二の標識の間の距離と、第一及び第二の位置の間における選択的エキソンが欠乏しているバイオポリマー上の当該第一及び第二の位置の間の距離とを比較する工程を適切に含む。

これは、例えば、図２Ｃによって図示されている。図２Ｃは選択的エキソンを有さないバイオポリマーを「ゼロ」に描写している。その図の実施形態「２」は、選択的エキソン「２」を有するバイオポリマーを描写している。その図の実施形態「２」は、選択的エキソンがＣｙ３及びＣｙ５色素間の増加した分離距離（３４２ｂｐ）において生じることを観察することにより検知され得ることを示している。図２Ｃ上部に示された選択的エキソンを有さないバイオポリマーにおいては、Ｃｙ３及びＣｙ５色素間の距離は、２５５ｂｐに分離されたのみである。

図２ＢはＭＡＰＴ遺伝子上に存在する各エキソン（選択的エキソンは影つきブロックで示されている）のサイズを示した表である。図２Ａは、一般的に、ＭＡＰＴ遺伝子内で可能である様々なスプライシング置換を図示している、その図で示したように、エキソン２、３及び１０は「選択的」エキソンとみなされ、ＭＡＰＴ ｍＲＮＡ内に存在することもしないこともある。

使用者は、バイオポリマー上に、第三、第四、またはさらなる追加の場所を、追加の標識により（例えば、標識されたヌクレオチドにより）、適切に標識することができる。このような追加の標識は、第一または第二の標識と同じ蛍光色素分子を含むことがあり、または、第一及び第二の標識と異なった蛍光色素分子を含むことがある。使用者は、次に、第三の標識及び第一の標識の間の距離、第三の標識及び第二の標識の間の距離、またはその両方を、第三の標識及び第一の標識の間、第三の標識及び第二の標識の間、またはその両方に配置された選択的エキソンの存在または非存在と関連付けることができる。この関連付けは１またはそれ以上の標識の相対位置も提供することもできる。

これは、図２によっても示されている。「２+１０」と標識された実施形態において、バイオポリマーは、選択的エキソン２及び１０を含み、これらのエキソンは、バイオポリマー上の第一及び第二の標識の間、及び、第二及び第三の標識の間（左から右に読みこみ）に配置されている。使用者は次に、これらのエキソンの存在（または相対位置）を、「２＋１０」実施形態の標識の間の距離と、図の上部に示された「ゼロ」実施形態の標識の間の距離とを比較することで測定することができる。

標識の間の距離から研究中のバイオポリマーの構造について情報を収集することに加えて、使用者は、２またはそれ以上のプローブの相対順に基づいて構造的な情報を得ることもできる。これは、異なる色の蛍光色素分子に標識されたプローブによって容易に行うことができる。例えば、３つのプローブ（赤、黄、及び緑）を使用する場合、プローブが赤−黄−緑の順で結合する配列は、プローブが黄−赤−緑の順で結合する配列とは構造的に異なるのである。従って、使用者は、プローブ間の相対距離と同様に、プローブがサンプル上で結合／配置されている相対順を観察することで、サンプルについての情報を収集することができる。

本発明を制限しない前述の例にもどると、２つのサンプルを比較する使用者は、プローブの相対順位及びプローブ間の距離を明らかにすることにより、２つのサンプルを測定することができる。これら２つのサンプルは（１）特定のヌクレオチド配列における順序（異なるサンプルにおける異なる順序であるプローブにより証明される）及び（２）与えられたサンプルにおける例えばコピー変異の数（他のサンプル上よりも一つのサンプル上を除いて距離が遠くなっているプローブにより証明される）の点で異なる。

標識は、互いに、適切には約３０ｂｐから約１０００ｂｐ離されるものであり、さらに適切には約３０ｂｐである。明細書の他の場所に記載したように、いくつかの技術（例えば、ＳＨＲＩＭＰ、ＦＩＯＮＡ、ＳＨＲＥＣまたは当業者に既に知られている他の技術）は塩基対のわずか約数百または約数十の少しの距離で互いに離された標識の分離を可能としている。

他の態様において、本発明はＤＮＡサンプルについて構造的情報を得る方法を提供する。これらの方法は、配列特異的の切断エンドヌクレアーゼで第一の二重らせん構造ＤＮＡサンプルを切断する工程を適切に含む。このような「ニッカーゼ」は当業者に知られており、及び、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ）で市販されている。

本発明に係る方法は、切断エンドヌクレアーゼによって生じた２またはそれ以上の切断部位に１またはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドを組み込む工程を適切に含む。エンドヌクレアーゼ及び分析対象のサンプルに依存して、切断は、サンプルの長さに沿って、１、２、または複数の切断部位を生じ得る。標識されたヌクレオチドは、ポリメラーゼを介してバイオポリメラーゼ内に適切に組み込まれる。適切な実施形態において、標識されたヌクレオチドは、ポリメラーゼの効果を打ち消し、且つ、さらなる鎖の伸長を促進しないターミネーターヌクレオチドである。ヌクレオチドは使用者の必要に応じて同じ蛍光色素分子標識、または異なった標識を有しても良い。

本発明に係る方法はまた、少なくとも二つの色素標識されたヌクレオチドを含む第一の二本鎖ＤＮＡサンプルの一部を線形化する工程を適切に含んでも良い。標識されたＤＮＡが一度線形化されると、使用者は、さらなる分析において使用するために、２またはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドの相対位置を記録し、またはそうでなければ説明することができる。

このような分析の一つは、二つまたはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドの相対位置を、第一の二本鎖ＤＮＡサンプルの一つまたはそれ以上の構造的特徴と関連付ける。これは、図９に示したように、対象の領域の側面に位置することが知られている二つの標識の間の距離を測定することを必要とすることもある。対象領域とは、特定の変異株またはいくつかの個体におけるコピー数変異を含むことが知られているような領域を指す。サンプル上の標識の間の距離と制御サンプル上の標識の間の距離（または他の個体または複数の個体からとったサンプル上の標識の間の距離）を比較することで、使用者は、分析中の対象が、特定の変異を有するか（または有さないか）を測定できる。

実施形態によっては、バイオポリマーサンプル上に存在する標識の相対位置から生成された「バーコード」は、そこから第一の二本鎖ＤＮＡサンプルが生成される主要二本鎖ＤＮＡサンプル内の第一の二本鎖ＤＮＡサンプルの相対位置に関する情報を提供する。用語「バーコード」は、サンプルの構造的特徴（例えば、二つの標識の間の距離は、標識の間の領域において遺伝子の過剰コピーの存在と関連されることがある）を表す信号一式（例えば、蛍光標識が互いに距離をとっていることから）を意味する。「バーコード」は、サンプル上に配置された標識からの信号一式が、そのサンプルに特有である、または研究中の他のサンプルから識別できる特定のサンプルを識別するのに用いられることもある。

例えば、使用者は、「親」サンプルから取得された第一のサンプル上のバーコードの一部を、「親」サンプルから取得された第二サンプル上のバーコードと重複して測定することがあり、従って、ＤＮＡの領域を失った個体と共通なこれらの特徴を特定するためのさらに他の対象の結果と共通な領域を含む「親」サンプルを表示する。

これは図１３においても示されている。図１３は、ＤＮＡの親サンプルの消化ステップ、消化から生じる生成物上にバーコードを配置すること、及び、親サンプル及び親サンプルに効果的なバーコードを一緒に修復するよう類似のバーコードを有する生成物の調整−コンピュータの方法により適宜行われる−を示している（図示している）。この方法においては、使用者は親サンプル上のバーコードを、例えば、対象における生理学的条件と関連付けることができる。これは、親サンプルを消化するのに使用される制限酵素が、対象の領域上に配置された二つの標識の間の距離と、変異または対象のエキソンが欠失している（または存在している）ことがわかっている「制御された」または「らせん構造」上に配置された二つの標識の間の距離を比較することにより検出されるコピー数多型、エキソン、またはその他の変異を含むことがある遺伝子領域を単離させることが知られているところで行うことができる。

例を制限するのではないものとして、使用者は、ここに記された方法により、「親サンプル」の消化生成物上の標識のバーコードを配置し、及びそれにより、バーコードと「親」を再形成するためのこれらの生成物をコンピュータ的に再構築することができる。使用者は、コピー数多型、エキソンの付加または欠失などのような一つまたはそれ以上の親の特徴を検出するため、「親」のバーコードと他の既知のサンプルを比較することができる。この方法では、使用者は、有効的に、全ての消化生成物及びそのバーコードを「親」における適切な構成で配置することにより、「親」サンプルの定性的な評価を行うことができる。

この方法は、配列特異的切断エンドヌクレアーゼで第二の二重らせん構造ＤＮＡを切断すること、一つまたはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドを、切断エンドヌクレアーゼによって生じた二つまたはそれ以上の切断部位に挿入すること、少なくとも二つの色素標識されたヌクレオチドを含む第二の二重らせん構造ＤＮＡサンプルの一部を線形化すること、二つまたはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドの相対位置を登録すること（例えば、記録することまたは記録しない）を適宜含むことがある。

標識のこれらの相対位置、例えば、バーコードは、（前述したように）第一及び第二の二本鎖ＤＮＡサンプルを生じる主要二本鎖ＤＮＡサンプル内の第一及び第二の二本鎖ＤＮＡサンプル間の関係を測定するのに用いられることもある。

実施形態によっては、使用者は、二つまたはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドの相対位置と、同じ切断ヌクレアーゼと接触している第二の二本鎖ＤＮＡサンプル上にある同じ色素標識されたヌクレオチドの位置とを比較する。この方法では、使用者は、異なるソースから取得した異なるサンプル上の「バーコード」を比較することができる。これは、図１０に示したように、多重サンプル間の質的比較を可能とする。その図には、対象物Ａ、Ｂ及びＣからのサンプル、請求項に係る方法に従っての処理が書かれている。示したように、対象物Ｃのサンプルは、対象物Ａ及びＣからのサンプルと結合する標識が掛けており、対象ＣのＤＮＡに特定の領域が欠けていることを示唆している。使用者は次にこの欠損領域と対象Ｃの生理的な特徴を相関させる、ＤＮＡのその領域を失っている個体に共通な特徴を識別するため、または対象Ｃの結果物とさらに他の対象物の結果物を比較することがある。

核酸バイオポリマーについて配列情報を得る方法もまた提供されている。これらの方法は、第一の結合配列を有する第一の蛍光標識された配列特異的プローブを一本鎖核酸バイオポリマーに結合する工程を適切に含むことができる。これは図１１に示されている。使用者は次に、一本鎖核酸バイオポリマーと、蛍光標識Ａを有する第一のターミネーターヌクレオチド（例えばＣｙ５で標識されたアデニン）、蛍光標識Ｂを有する第二のターミネーターヌクレオチド（例えばＡｌｅｘａ ４０５で標識されたシトシン）、蛍光標識Ｃを有する第三のターミネーターヌクレオチド、及び蛍光標識Ｄを有する第四のターミネーターヌクレオチドと接触させる。使用者は次に、核酸バイオポリマーを照射し、第一の標識された配列特異的プローブに隣接する、第一のターミネーターヌクレオチド、第二のターミネーターヌクレオチド、第三のターミネーターヌクレオチド、第四のターミネーターヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせの存在（または相対位置）を測定する。

第一のプローブの結合配列は、適宜、４から６ヌクレオチドの間である。実施形態によっては、ヌクレオチドの蛍光標識は異なる励起波長を有する。その他の場合では、標識の二つまたはそれ以上は同じ励起波長をもつ。標識されたヌクレオチドの励起波長は、標識された配列特異的プローブの励起波長と同じまたは異なることがある。

本発明に係る方法はまた、第一、第二、第三及び第四の結合配列をそれぞれ有する、少なくとも４つの蛍光標識されたプローブを一本鎖核酸バイオポリマーに接触させる工程を適切に適宜含むことができる。第二の結合配列は、第一の結合配列の５’末端における塩基を除去し、且つ第一の置換塩基を第一の結合配列の３’末端に付加することによって構築される。

同様に、第三の結合配列は、第一の結合配列の５’末端で塩基を除去し、且つ第二置換塩基を第一の結合配列の３’末端に付加することによって構築される。第四の結合配列は第一の結合配列の５’末端で塩基を除去し、且つ第三の置換塩基を第一の結合配列の３’末端に付加することによって構築され、及び、第五の結合配列は、第一の結合配列の５’末端で塩基を除去し、且つ第四の置換塩基を第一の結合配列の３’末端に付加することによって構築される。これらのプローブは互いに異なる蛍光色素分子を適切に有し、且つ第一のプローブとは異なる蛍光色素分子を有しても良い。

例に限定されることはないが、第一のプローブは配列５’ＣＴＡＧＣ−３’からなることがある。プロービングの第二周期において、プローブの５’末端におけるＣは除去され、次に、Ｔがプローブの５’末端となり、プローブの３’末端は以下に続くものになる：５’ＴＡＧＣＡ−３’；５’−ＴＡＧＣＩ−３’；５’−ＴＡＧＣＧ−３’；５’−ＴＡＧＣＣ−３’。これらの標識されたプローブは次に、バイオポリマーと接触され、及び、プローブを適当な励起波長で照射することにより、使用者は新しいプローブの位置を測定し、それにより、検討中のバイオポリマーの配列に関する情報を得る。この例で示された結合配列が長さにして５ｂｐであるのに対し、結合配列は、１から１００ｂｐが長さとして適当であるが、さらに適当なのは、長さとして４ｂｐから６ｂｐである。

本発明に係る方法はまた、核酸バイオポリマーを照射し、第二標識された配列特異的プローブに隣接する、第一のターミネーターヌクレオチド、第二のターミネーターヌクレオチド、第三のターミネーターヌクレオチド、第四のターミネーターヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせの存在（または相対位置）を測定することを適宜含む。

図１１は、これらの方法の実施形態を制限しないものの一つである。図１１に示したように、使用者は、異なる結合配列を有する第一及び第二の結合プローブと、バイオポリマーサンプルを結合することがある。次に使用者は、バウンドプローブに隣接する一本鎖ＤＮＡに単一ヌクレオチドのみを結合する条件下で、サンプルと標識されたヌクレオチドを接触させる。これは、二つの標識を表示する与えられたプローブ−ヌクレオチド対を生じる。これらの標識は、図に示したように互いに異なるものである。使用者はそれによりプローブ−ヌクレオチド対を視覚化または、そうでなければ場所を特定するための必要に応じて、サンプルを照射することができる。プローブ及びヌクレオチドはリガーゼによって結合されることもある。実施形態によっては、プローブとヌクレオチド間にギャップ（１＋ｂｐｓ）が生じることがある。このギャップはポリメラーゼ及びヌクレオチドからの供給により塞ぐことができる。なお、そのヌクレオチドはヌクレオチド自体が標識され得る。リガーゼもプローブを結合するのに用いられることがあり、ギャップは標識されたヌクレオチドにより塞がれる。非蛍光プローブが使用されることもある。

使用者は、プローブ結合、続いて標識されたヌクレオチドの結合の第入サイクルが完了した後に、第一サイクルにおいて得られた配列情報を考慮に入れるプローブを使用する第二サイクルを始める。例えば、第一のプローブはＡＡＧＧの配列を有し、及び、プローブに隣接して結合する標識されたヌクレオチドはＴである。次のサイクルで、使用者は、この情報を利用し、前述したように、付加的配列情報を得るためにＡＧＧＴの配列を有するプローブを使用する。

他の態様においては、本発明は核酸バイオポリマーについて構造的情報を得る方法も提供している。これらの方法は（ａ）少なくとも二つの切断部位を生じるように二本鎖バイオポリマーと切断エンドヌクレアーゼを接触させる工程と、（ｂ）少なくとも二つの切断部位を、蛍光標識Ａ（例えばＣｙ３）を有する第一のヌクレオチドに接触させる工程と、（ｃ）余剰の第一のヌクレオチドを除去する工程と、（ｄ）第一のヌクレオチドの存在または相対位置を測定するために二本鎖バイオポリマーを照射する工程と、（ｅ）少なくとも二つの切断部位を、蛍光標識Ｂ（例えばＣｙ５）を有する第二のヌクレオチドと接触させる工程と、（ｆ）余剰の第二のヌクレオチドを除去する工程とを含む。使用者は、二本鎖バイオポリマーを照射し、第二のヌクレオチドの存在または相対位置を適宜測定する。

使用者は、少なくとも二つの切断部位を、蛍光標識Ｃ（例えばＡｌｅｘａ４０５）を有する第三のヌクレオチドと接触させ、余剰の第三のヌクレオチドを除去し、（ｊ）二重らせん構造バイオポリマーを照射して第三のヌクレオチドの存在または相対位置を測定する。この方法はまた、（ｋ）少なくとも二つの切断部位を、蛍光標識Ｄを有する第四のヌクレオチドと接触させる工程と、（ｌ）余剰の第四のヌクレオチドを除去する工程と、（ｍ）第四のヌクレオチドの存在または相対位置を測定するために二重らせん構造バイオポリマーを照射する工程とを含む。

この方法では、ヌクレオチドがニッカーゼの結合する場所に隣接するように、ニッカーゼが二本鎖サンプルを「開く」。使用者は次に、第一の標識されたヌクレオチド（例えばシトシン）を導入し、及び、バイオポリマーが終結するかどうか及びヌクレオチドが結合を有するのがどこかについてアッセイ分析をする。これは他のヌクレオチド（グアニン、チロシン、アデノシン）についても繰り返され、続いて、各導入した新しいヌクレオチドを結合させるために使用者がアッセイ分析する（照射を介して）それぞれの導入を行う。

上述の工程（（ｂ）から（ｍ）に分類された工程）を繰り返すことで、使用者は、それぞれ連続した標識されたヌクレオチドの付加と追加の配列情報とを得ることができる。

照射もまた、標識されたヌクレオチドの一つまたはそれ以上の相対位置を適宜確立する。二つまたはそれ以上の標識で標識されたサンプルの少なくとも一部は、分析のために適宜線形化される。次に使用者は、二本鎖バイオポリマーの線形化された部分内に存在する二つまたはそれ以上の標識されたヌクレオチド間の距離を測定する。これらの距離は、分析中のサンプルのため、バーコードに達して用いられる。

一部の変形例において、使用者は、第一の切断部位に存在するターミネーターヌクレオチドに隣接する第二の切断部位を誘導することがある。使用者は、第二の切断部位を、蛍光標識Ａを有する第一のヌクレオチド、蛍光標識Ｂを有する第二のヌクレオチド、蛍光標識Ｃを有する第三のヌクレオチド、及び蛍光標識Ｄを有する第四のヌクレオチドと適宜接触させ、第二の切断部位に組み込まれた標識されたヌクレオチドを測定するために、二本鎖バイオポリマーを照射する。

これは図１２に示されている。図にも示されているように、二つのニッカーゼ分子は二本鎖ＤＮＡサンプルと結合され、図中の四角で囲った「Ｎ」で示したように、切断部位を生じる。使用者は、標識されたヌクレオチドを配列に導入する。図に示したように、アデノシンは最初に導入され、及び、左手側のプローブと反対方向のＤＮＡらせん構造に位置するＴに結合する。アデノシンが左手側のプローブと反対方向に位置するので、標識されたアデノシンはその場所には結合せず、及び、「Ｘ」は第一の標識塩基の導入時に結合は存在しないことを示す。付加的なニッカーゼ及び標識された塩基が導入され、使用者は、標識されたサンプルの照射に従って、標識塩基の順次付加により、標識されたバイオポリマーターゲットを配列することができる。この方法から得られた配列情報は、したがって、特定の配列に結合するプローブを設計するのに用いられる。プローブは、異なるサンプルまたは制御されたサンプル上の標識されたプローブに対応する距離と、第一のサンプル上の二つまたはそれ以上の標識されたプローブ間の相対的距離の比較といったさらなる特徴付けのため与えられたサンプルに「バーコード付け」するのに用いられる。

本発明は多重ハイブリダイゼーションの実行のためのキットも提供している。各プローブは、適宜異なる色であり、異なる励起波長に対応する。このキットは、これらの核酸サンプルにハイブリダイズされたこれらのプローブの少なくとも二つに適用するため、標識されたサンプルを線形化するため、及びハイブリダイズされた核酸の少なくとも一つを画像化するための使用説明書も適宜含まれる。一部の実施形態において、二つのプローブの距離または二つのプローブの相対位置を測定するために、使用者は２またはそれ以上のハイブリダイズされたプローブを画像化する。

条件によっては、使用者は隣接切断部位と標識されたヌクレオチド間にバイオポリマー領域全体を位置させることがある。これは、切断部位が比較的互いに近い場合において、適宜行われる。照射下で、少なくともいくつかの標識されたヌクレオチドが存在するバイオポリマー領域は比較的明るく、標識されたヌクレオチドが欠けている領域は比較的暗い。しかしながら、使用者は、明るい領域と暗い領域の両方から情報を収集することができる。

使用者が、領域内に配置された様々な標識されたヌクレオチドに対応する励起波長で領域を照射している際に、いわゆる明るい領域は、配列情報を提供する。他の実施形態においては、使用者は、暗い領域の側面に位置する明るい領域（またはヌクレオチドでさえも）間の距離を検出することにより、コピー数多型、エキソンまたは対象物の他の構想的特徴からなる暗い領域も、そのサイズのおかげで、評価することができる。したがって、構造的情報は、明るい領域及び暗い領域の両方から収集されうる。

実施形態によっては、使用者は、ニッカーゼを利用することを選択する。この方法では、使用者は、最も興味のあるまたは重要と思われる一つの領域（または複数の領域）のみの配列情報を効果的に得ることができる。

使用者はまた、照射下の可視蛍光色素分子の順を、蛍光色素分子の一つまたはそれ以上に対応するヌクレオチドと相関させることで、バイオポリマーサンプルの少なくとも一部の配列を適宜測定することができる。

追加の開示
画像化技術
いくつかの技術は、少なくとも一つの大きさの順により、蛍光画像化において、光学解像度を向上させる。単分子ＤＮＡ及びＲＮＡ分析へのこれらの画像化技術の適用は、前述した分析を非常に加速させる。

このような技術の一つ、いわゆるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｏｎｅ Ｎａｎｏｍｅｔｅｒ Ａｃｃｕｒａｃｙ（ＦＩＯＮＡ）は、蛍光色素分子から集められた光に分布関数を適合することにより単一有機蛍光色素分子の位置を特定することを含む。この分布の中心は１．５ｎｍの精度で局在化させることができる。ＦＩＯＮＡは分子モーターの転移の研究または微小距離の測定に用いられている。

この技術の拡張は、約１０ｎｍの解像度により、同色の隣接する蛍光色素分子の解像をすることができるフォトブリーチングによる単分子高解像度イメージング（ＳＨＲＩＭＰ）を含む。ＦＩＯＮＡは２色まで拡張され、単分子高解像度共局在化（ＳＨＲＥＣ）と呼ばれる方法を発展させた。使用者は、例えば、互いに１０ｎｍで近接しているＣｙ３及びＣｙ５色素を共局在化することができ、それらの色素は短いＤＮＡの末端に結合される。多色確率的光学再構成顕微鏡（ＳＴＯＲＭ）による方法も有用であり、この方法は、レポーター及び活性因子の連結対を与える。反復して、これらのプローブのわずかなサブセットの特定色活性化は、ナノメーターの精度で局在確認を可能とする。

遺伝子マッピング方法
構造的変異はヒトの健康及び一般的な疾患において重要な役割を果たしている。これらの変異は１ｋｂよりも長いものとして定義される。しかしその重要性にもかかわらず、コピー数多型（ＣＮＶｓ）を検出するための最も多くの遺伝子の幅広いアプローチは間接的であり、信号強度への依存は、サンプル間で異なり、及び、変異体の領域を予測することを制御する。したがって、このようなアプローチは、信号及び位置情報の定量化には限度があり、逆位及び転座のような平衡した事象を検出することはできない。例えば、ＳＮＰアレイ、オリゴ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）アレイ、及びＢＡＣＣＧＨアレイを含むプラットフォームに基づいたマイクロアレイは、構造的変異を発見するための主要な技術である。感度、特異度及びこれらのプラットフォームのプローブ濃度の不均一性は、同一サンプル間ですら矛盾した結果をしばしば導く。この定性測定は、ＰＣＲ及びＦＩＳＨのような低スループット検出方法による立証がさらに必要とされる。

光学的マッピング
上述の単一分子技術は構造的変異の研究に適している。しかしながら、マッピングの光学的性質により、約１ｋｂｐよりも厳密な解像には限界がある。有意に高いマッピングの効率は、１００ｂｐ未満で特徴を解像することによって達成されうる。同様に、これは、生来の構造的変異体、長い遺伝子ＤＮＡ分子を同定する能力を実質的に含む。

適当なマッピングスキームは切断エンドヌクレアーゼによって生じた部位の標識化に基づいている。５塩基認識配列と切断エンドヌクレアーゼは、平均して１ｋｂの遺伝子全体に渡る物理的マップを作り出す。インシリカでの遺伝子全体のマッピングに基づいて、このような切断部位の大部分は、互いに１０００ｂｐ以内に収まる。従来の光学では、この距離は光学分割することができない。これはマップ分解能を減少させ、マップの組み立てをより困難にする。

例として、５塩基から７塩基認識部位の２つの市販切断エンドヌクレアーゼのための認識配列（モチーフ）が挙げられる。ヒトリファレンス遺伝子に対して全ての切断部位を解読するアルゴリズムが設計された。

酵素Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（５塩基モチーフＧＡＣＴＣ）において、ヒト遺伝子全体にわたって２．１×１０^６切断部位があり、切断部位間は平均して１．５ｋｂである。酵素Ｎｔ．ＢｓｐＱｌ（７塩基モチーフＧＣＴＣＴＴＣ）においては、平均して１５ｋｂｐに分離された２．２×１０^５切断部位がある。原則として、５塩基モチーフを使用する切断部位は従来の光学技術（〜１ｋｂｐ）により解決できるが、ほぼ半分の切断部位が互いの１ｋｂｐ内に含まれ、よって互いに区別ができないことがインシリコ分析により明らかにされている。７塩基モチーフを使用すると、より多くの数の部位を解像することが可能である。以下に述べるように、これはＤＮＡフラグメントの一意的なマッピングにおける課題へとつながる。

ＤＮＡマッピングにおける改善された解像度
インシリカマッピングは、現在使用可能な切断酵素及び我々の現存の光学検知システムに基づいて独自にマップされ得るＤＮＡフラグメントの割合を測定するのに用いられる。

図１Ａは、切断エンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（５塩基モチーフ）においての結果を示している。１０００ｂｐ光学解像度において、フラグメントの約１２％のみが８切断部位により独自に同定されうる。他方では、１００ｂｐの解像度を達成するため、フラグメントの９７％以上が独自のものである。しっかりとクラスター化された切断部位は配列情報をさらにまとめ、及び、その分布は独自である。さらに、８つの切断部位のみにより、遺伝子を参照するためのフラグメントの独自のマッピングを可能にするのにたった１２ｋｂフラグメントが（平均して）必要となる。

酵素Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ（７塩基モチーフ）による切断マップ（図ＩＢ）は、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ切断部位が互いの１ｋｂｐ内に含まれることが少ないために、１００ｂｐに解像度を改善したことにより得たものはごくわずかである。平均して８つの連続したＮｔ．ＢｓｐＱＩ切断部位は、この酵素を使用するＤＮＡフラグメントを独自に同定することが必要であるが、フラグメントの平均サイズは１２０ｋｂである。既存の方法により合理的に抽出できるＤＮＡの長さ内の連続した切断部位の欠失によりマップすることのできない遺伝子（〜３０％）の重要な領域が存在する。

任意の単一理論への結合を除いて、請求項に係る発明のいくつかの利点は、特定されうる。第一に、緊密に配置された切断部位を解像する際に、ＤＮＡフラグメントについてのより多くの情報が得られる。遺伝子にフラグメントを独自にマップする能力は大幅に改善された。

第二に、改善された解像度により、今までの光学的方法により可能であったものよりさらに小さな構造的変異体を解像することができる。最後に、改善された解像度はまた、大きなスケールの構造的変異体を同定するのにも役立つ。

図面の付加的背景
図１Ｃにおいて、１５０ｋｂｐの挿入を有するフラグメントの例が示されている。フラグメントの上手いマッピング（ひいては遺伝子内の挿入位置の同定）は、挿入位置に隣接する８つの切断部位の連続的なセットを使用することができる。光学的解像度の限界により、これは大きな（>３００ｋｂｐ）遺伝子フラグメントが必要となる。これらはＤＮＡらせん構造抽出プロトコルにより生成することは困難である。反対に、１００ｂｐ解像度により、フラグメントを独自にマップする挿入よりも一回り大きいのみのフラグメントを使用する高い密度の切断部位分布が使われることもある。

選択的トランスクリプトームの高スループットデジタルプロファイリングの必要性
改善されたマッピングの性能により多大な恩恵を受けうる他の核酸分析はＲＮＡの選択的スプライシングである。ＲＮＡスプライシングの間に、イントロンが除去され、及び、エキソンが成熟ＲＮＡに一緒に結合される。選択的スプライシングは、単一の一次転写が異なる成熟ＲＮＡを生成するによるプロセスである。これは、様々な及び拮抗する機能によりタンパク質アイソフォームの生成を導く。最近の研究は、大きなプロテオミクスの複雑性及び多様性が限られた数の遺伝子により達成されることを示した。ヒト遺伝子においては、ヒト遺伝子の〜７５％が選択的スプライシングを示す。２５，０００遺伝子を含むヒト遺伝子に対して、選択的スプライシングによって、タンパク質の数十万の異なるタイプを生成することができる。

多くの遺伝子の変異体の選択的スプライシングは、細胞周期制御、アポトーシス、及びその他を含む細胞生物学の全ての主な態様に重大な影響を与える。異常スプライシングは癌を含む様々な疾患に関連しているとの発見がなされており、及び、最近の研究は、ｍＲＮＡは癌組織において通常よりも高い頻度で選択的スプライシングされていることを示唆している。他の例は、異常エキソンの包含及び嚢胞性線維症の非定型を生じる包含による膜コンダクタンス制御因子の全長の重要な削減を含む。他の例は、タウタンパク質（ＭＡＰＴ遺伝子）に関連する微小管である。ＭＡＰＴは、神経におけるアキソナル輸送と同様に、ポリメリゼーション及び微小管の安定性のために必要とされる。タウエキソン１０の異常スプライシングは、神経変性疾患、神経認知症ＦＴＤＰ−１７の進行を導く。

技術のいくつかはＲＮＡスプライシング変異体を定量化するために発展した。第一に、オリゴミクロアレイ及び光ファイバーアレイは、全世界的に遺伝子スプライシング変異体を検知するために使用されている。しかしながら、全ＲＮＡ転写産物の小さなフラグメントは、アレイ技術において一度に検索されるため、一つのみのスプライシング事象（同時に二つのエキソン）が同時に検出されうる。したがって、一つの特定変異体スプライシングにおいていくつのエキソンが含まれているか、または排除されているか定量化することは困難である。さらに、非特異的ハイブリダイゼーションは、さらに立証が必要な多くの偽陽性となることがある。

第二に、リアルタイムＰＣＲは、一度にエキソンジャンクションを定量化することによりスプライシング情報を得ることができるが、厳しい反応条件、低スループット及びコストの高さにより限度がある。第三に、次世代シークエンシングはデジタル遺伝子発現プロファイリングに使われ、選択的スプライシング変異体をプロファイリングするのにも用いられ得る。しかしながら、それらは、大部分が短い配列読み込みに基づいており、全長ＲＮＡサンプルに関連するマイクロアレイと同様の限界を有する。

技術に焦点を合わせた既存のトランスクリプトームに共通な不利益は、個々の転写物内で生じる選択的にスプライシングされたエキソンの組み合わせを監視できないことである。既存の方法のもとでは、エキソン除外は確認が難しく、特定エキソンの偽の除外につながる可能性がある。

哺乳類の生物学における選択的スプライシングの非常な重要性にもかかわらず、この問題を解析する現在の解決策は、課題に直面している。たしかに、選択的スプライシングが、ＲＮＡスプライス変異体を定量化するロバスト法が欠如していることによる発達段階を経て、どのように調整され、どのように適合されているかについてわかっていることはわずかである。

従来の光学的限界を超えた分解能向上
分解能向上を可能にする利点の例として、一つは、タウタンパク質（ＭＡＰＴ）遺伝子する微小管のための光学バーコーディングアプローチを検討できることにある。タウタンパク質（ＭＡＰＴ）遺伝子はポリメリゼーション及び神経におけるアキソナル輸送と同様にマイクロチューブの安定性のために必要とされる。タウエキソン１０の異常スプライシングは認知症ＦＴＤＰ−１７のような神経変性疾患の進行を先導する。

典型的なＲＮＡバーコーディングスキームが図２に示されている。ＭＡＲＴ転写産物内の３つのエキソン（２、３及び１０）は、選択的スプライシングを経ることがあり、エキソン２及びエキソン３は常に一緒にスプライシングされる。したがって、６つの異なったＭＡＰＴ転写産物が選択的スプライシングにより発生することがある。ＭＡＰＴ遺伝子構造は、図２Ａに示されている。

６つ全ての選択的スプライシングアイソフォームが示され（ゼロ、２、１０２＋１０、など）及びそれぞれのエキソンの長さが図２Ｂに示されている。従来の光学解像度では、
異なるエキソンに関する標識を識別することができない。エキソンの位置が解決されると、測定された標識の間の距離は、バーコードを読み取るのと同様に、各スプライシング変異体を識別する。

この実施例において、バーコードを形成するため、４つのエキソン特定オリゴプローブは、それぞれ図２Ｃにおいて緑及び赤い矢印で示されているように、エキソン１（Ｃｙ３−緑）、エキソン７（Ｃｙ５−赤）、エキソン１１（Ｃｙ５−赤）、エキソン１３（Ｃｙ３−緑）を特別にハイブリダイズして設計されることがある。標識の間の距離は、変異が存在するかどうか、及び色の配列（例えば、緑−赤−赤−緑）が完全に標識された転写の存在を示すかどうか識別するのに使用されることがある。さらに、開示されたバーコーディングスキームは、容易に多重化される。

例えば、４つの異なったプローブと同じ二つの色（例えば緑及び赤）が、異なる遺伝子を識別するのに用いられると、色のついた配列は、ＭＡＰＴ遺伝子とは異なる特定の遺伝子のために設計されうる。着色された配列は、したがって、特異的遺伝子及びそれらの特異的遺伝子の個々のスプライシング変異体を測定する着色された配列の標識の間の距離を定義するのに使用されることがある。この二色では、４つのアプローチ、スプライシング変異体のための無限の力により１６の異なる遺伝子を同時に検索する２４＝１６の異なる色の配列がある。８つの異なるプローブの４色が用いられる場合、４６＝６５５３６の異なる遺伝子を同時に調べることができ、それはヒトトランスクリプトーム全体よりも多い（図２Ｃ）。

このアプローチは、ＲＮＡスプライシングを検索するための技術をプロファイリングする現在の発現を超える三つの重要な利点がある：（ｉ）単一転写産物内でエキソンの分布をマッピングすることにより、同一の転写産物内の多重選択的スプライシングされたエキソン間の関係を測定が可能である。（ｉｉ）バーコーディングスキームのデジタルネイチャーは個々のスプライシング変異体を定量化できるだけではなく、全てのスプライシング変異体を集計することにより、前遺伝子の発現を定量化することができる。（ｉｉｉ）バーコーディングスキームは、最大多重検出機能も提供しうる。これらの優位性の実現は、既存の光学アプローチをはるかに超える画像化技術を必要とする。

低コスト、高スループット
ヒトゲノムプロジェクト（ＨＧＰ）の成功は、並列化、自動化、小型化、化学的及び情報的精度を高めることを経た、サンガーシークエンシング法の絶え間ない進歩によるところが大きい。ヒトゲノムプロジェクトの立役者として、サンガーシークエンシング法は、３０年近くＤＮＡシークエンシングの分野において卓越し、その８００ Ｑ２０塩基を読める長さは重要なものである。

これらの新しいシークエンシング技術は、その検出方法、集団検出か単一分子検出かに基づいて二つのカテゴリーに分類される。集団検出において多重ＤＮＡコピーが必要とされて以来、ハプロタイプ及びＲＮＡスプライシングパターンのような遺伝子情報が、処理行程中に失われる。単一分子検出によるシークエンシングがハプロタイプ情報の回復が可能であるのに対して、最近の単一分子シークエンシング方法（例えばＨｅｌｉｃｏｓ ｔＳＭＳ）のリード長は、二つのＳＮＰの間の１ｋｂｐの平均距離よりもはるかに少ない５０ｂｐまたはそれより少ないものである。したがって、ハプロタイプ及びＲＮＡスプライシングパターンのような分類が曖昧な遺伝子情報をサンガーシークエンシング法に先行する技術により、また、これらの「次世代」シークエンシング技術により得るのは未だに困難である。本発明は、とりわけ、１０ｋｂ以上のＤＮＡシークエンシング長さをもたらす。

ハイブリダイゼーションによるシークエンシングは、核酸分子の配列を測定するハイブリダイゼーションアッセイに基づいたマイクロアレイを使用する方法がよく知られている。通常、マイクロアレイからなる既知の配列（<１００ｍｅｒ）と短いオリゴはターゲット分子を記録する（例えばハイブリダイズする）及び調べるのに使用される。マイクロアレイアッセイは、ターゲット分子において少なくとも一度は発見されるハイブリダイズされたオリゴの全てのサブ配列のリストを作り出す。しかしながら、そのリストはハイブリダイズされたオリゴの配列の位置を明らかにせず、または、オリゴがターゲット分子上に存在する時間数も提供しない。本発明は、しかしながら、そのような情報を得ることができる。

図３は、シークエンシングのためのスタート剤を示す。異なる色の蛍光色素分子で標識された５’末端と５ｍｅｒ（例えば５ヌクレオチド長）オリゴのセット、異なる色の蛍光色素分子で標識された４ヌクレオチドターミネーター、線形化された一本鎖ＤＮＡ分子または部分的なｓｓＤＮＡギャップと二本鎖ＤＮＡ分子のアレイ、である。

図４は、典型的な配列決定反応の第一周期を描写している。第一周期後、各ハイブリダイゼーション及び組み込みが記録され、ＳＴＯＲＭイメージング技術により、線形化されたＤＮＡ分子のみが局在される。プローブはその後流される。次の周期において、４、５ ｍｅｒ 以上のプローブＡＧＴＣＡ、ＡＧＴＣＴ、ＡＧＴＣＧ及びＡＧＴＣＴが導入され、以前のプローブと同じ配列を共有するように、以前のプローブと同じ場所でハイブリダイズされる。その次にポリメラーゼはヌクレオチドターミネーターを組み込む（図５）。

この課程は、多重化（異なる色のラベルの使用）及び一周期に読みこまれる配列を大量に生成するのに適している（図６）。５ｍｅｒプローブの配列的付加を優先させるアルゴリズムもまた発展した。本明細書で使用されているスーパーイメージング技術には、ＳＨＲＩＭＰ、ＳＨＲＥＣ、ＳＴＯＲＭが含まれる。

単分子高解像度共局在化（ＳＨＲＥＣ）及び光退色（ＳＨＲＩｍＰ）方法による単分子高解像度イメージングは、二つの蛍光色素分子間の距離を測定するのに開発され、これはレイリー限界（〜２５０ｎｍ、可視励起）よりも精密である。

二つの技術の組み合わせは、位置を特定する方法論の検出力に他の側面を加え、及び
１０の距離が、多重メンバーを有するそれぞれ異なる色の各蛍光色素分子を使用することにより、潜在的に解像され得る。ＤＮＡにこれを適用するために、二本鎖ＤＮＡは、表面をコーティングされたポリアクリル酸及びポリアリルアミン上で引き伸ばされる。ポリアクリル酸及びポリアリルアミンはＤＮＡを比較的真っ直ぐにする。ＳＨＲＩＭＰをテストするために、ＤＮＡ構成は３２ｎｍ、５８ｎｍ及び９０ｎｍの間の距離に対応する４７５ｂｐ、１７２ｂｐ、及び９４ｂｐに位置する３つのＣｙ３に続いてビオチンから作られる（図７Ｂ）。

追加的な詳細は図７Ａに提供されている。一つのＰＣＲプライマーはＣｙ３によって５’末端において標識され、他のプライマーは５’末端において蛍光標識されている。ＰＣＲ反応後、ｃｙ３の５’末端は、一本鎖ＤＮＡにおいて生じるラムダエキソヌクレアーゼによる消化から、そのらせん構造を保護する。一度一本鎖ＤＮＡ分子が生成すると、プライマー伸長反応は、それぞれの特定配列位置に蛍光色素を導入することで行われる。この場合において、５’末端のｃｙ３と二つの短いオリゴは、一端から９４ｂｐと２５６ｂｐでそれぞれハイブリダイズされる。他の短いオリゴは５’末端のビオチンと、一本鎖テンプレートの３’末端でハイブリダイズされる。ポリメラーゼによる伸長後、一本鎖テンプレートは二本鎖ＤＮＡ分子に転換され、二つのｃｙ３色素分子は特定の場所に導入される。

予想された距離と素晴らしく一致する場合、２７ｎｍ、６１ｎｍ及び９５ｎｍの距離が測定される。ＳＨＲＩＭＰ及びＳＨＲＥＣを同時にテストするために、Ｃｙ５はゼロ位置に配置され、及び２つのＣｙ３は９４ｂｐ位置及び１７２ｂｐ位置に配置され、それらの位置はデュアルビューイメージングシステムを用いて測定される。Ｃｙ３−Ｃｙ５対の間の距離は、３７±５ｎｍ（３２ｎｍを除く）及び９１±５ｎｍ（８７ｎｍを除く）であり、及びＣｙ３−Ｃｙ３対の間の距離は、５６±３ｎｍ（５８ｎｍを除く）となる（図８）。この一致は優れている。

Claims (46)

1. １またはそれ以上のエキソンの相対位置を分析する方法であって、
   バイオポリマーサンプル上の第一及び第二の位置を、それぞれ、第一及び第二の標識が少なくとも一つの定常エキソンを含むバイオポリマーサンプルの第一の領域の側面に位置するように、前記第一及び第二の標識によって標識する工程と、
   前記第一及び第二の標識の間の距離を、バイオポリマーの前記第一の領域における選択的エキソンの存在または相対位置と関連付ける工程と
   を有する、方法。
2. 請求項１記載の方法において、前記バイオポリマーは、ｍＲＮＡと相補的相補的なＤＮＡを有するものである、方法。
3. 請求項１記載の方法において、前記第一及び第二の標識は、同じ蛍光色素分子を有するものである、方法。
4. 請求項１記載の方法において、前記第一及び第二の標識は、異なる蛍光色素分子を有するものである、方法。
5. 請求項１記載の方法において、前記第一及び第二の標識の間の距離を、１またはそれ以上の選択的エキソンの存在、非存在、または相対位置と関連付ける工程は、前記バイオポリマーサンプル上に存在する前記第一及び第二の標識の間の距離と、選択的エキソンを含まないことが知られているバイオポリマーの第一の領域の側面に位置する標識の間の距離とを比較する工程を有するものである、方法。
6. 請求項１記載の方法において、前記関連付ける工程は、前記第一及び第二の標識の間の距離と、第一及び第二の位置の間の選択的エキソンが欠乏するバイオポリマー上の前記第一及び第二の位置の間の距離とを比較する工程を有するものである、方法。
7. 請求項１記載の方法であって、この方法は、さらに、前記バイオポリマーサンプル上の少なくとも第三の位置を第三の標識で標識する工程を有するものである、方法。
8. 請求項７記載の方法において、前記第三の標識は、前記第一の標識、前記第二の標識、またはその両方と同じ蛍光色素分子を有するものである、方法。
9. 請求項８記載の方法であって、この方法は、さらに、前記第三の標識と前記第一の標識との間、前記第三の標識と前記第二の標識との間、またはその両方の距離と、前記第三の標識と前記第一の標識との間、前記第三の標識と前記第二の標識との間、またはその両方に配置された選択的エキソンの存在、非存在、または相対位置とを関連付ける工程を有するものである、方法。
10. 請求項９記載の方法において、前記関連付ける工程は、前記第三及び第一の標識、前記第三及び第二の標識の間、またはその両方の距離と、前記第三及び第一の位置の間、前記第三及び第二の位置の間、またはその両方の選択的エキソンが欠乏するバイオポリマー上の前記第三及び第一の標識の間、前記第三及び第二の標識の間、またはその両方の距離とを比較する工程を有するものである、方法。
11. 請求項１記載の方法であって、この方法は、さらに、前記バイオポリマーサンプルの少なくとも一部を線形化する工程を有するものである、方法。
12. 請求項１１記載の方法において、前記バイオポリマーサンプルの線形化された部分は、少なくとも二つの標識を有するものである、方法。
13. 請求項１記載の方法において、前記二つの標識は、互いに約３０ｂｐ離れているものである、方法。
14. 請求項１記載の方法であって、この方法は、さらに、２またはそれ以上のプローブの相対的順序を、前記バイオポリマーサンプルの１またはそれ以上の構造的特徴と関連付ける工程を有するものである、方法。
15. ＤＮＡサンプルについて構造的情報を得るための方法であって、
    第一の二本鎖ＤＮＡサンプルを配列特異的切断エンドヌクレアーゼで切断する工程と、
    前記切断エンドヌクレアーゼで生じた２またはそれ以上の切断部位に、１またはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドを組み込む工程と、
    少なくとも二つの色素標識されたヌクレオチドを含む前記第一の二本鎖ＤＮＡサンプルの一部を線形化する工程と、
    ２またはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドの相対位置を記録する工程と
    を有するものである、方法。
16. 請求項１５記載の方法において、１またはそれ以上の前記標識されたヌクレオチドは、ターミネーターヌクレオチドを有するものである、方法。
17. 請求項１５記載の方法において、２またはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドは、同じ蛍光色素分子を有するものである、方法。
18. 請求項１５記載の方法であって、この方法は、さらに、２またはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドの相対位置と、前記第一の二本鎖ＤＮＡサンプルの１またはそれ以上の構造的特徴とを関連付ける工程を有するものである、方法。
19. 請求項１５記載の方法であって、この方法は、さらに、第一の二本鎖ＤＮＡサンプルの由来する主要な二本鎖ＤＮＡサンプルにおける前記第一の二本鎖ＤＮＡサンプルの相対位置を測定する工程を有するものである、方法。
20. 請求項１９記載の方法において、前記第一の二本鎖ＤＮＡサンプルは、主要な二本鎖ＤＮＡを消化することによって得られるものである、方法。
21. 請求項１５記載の方法であって、この方法は、さらに、第二の二本鎖ＤＮＡサンプルを配列特異的切断エンドヌクレアーゼで切断する工程と、前記切断エンドヌクレアーゼで生じた２またはそれ以上の切断部位に１またはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドを組み込む工程と、少なくとも二つの色素標識されたヌクレオチドを含む前記第二の二本鎖ＤＮＡサンプルの一部を線形化する工程と、２またはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドの相対位置を記録する工程とを有するものである、方法。
22. 請求項２１記載の方法であって、この方法は、さらに、第一及び第二の二本鎖ＤＮＡサンプルの由来する主要な二本鎖ＤＮＡサンプルにおける前記第一及び第二の二本鎖ＤＮＡサンプル間の関係を測定する工程を有するものである、方法。
23. 請求項１５記載の方法であって、この方法は、さらに、２またはそれ以上の色素標識されたヌクレオチドの相対位置と、同じ切断エンドヌクレアーゼと接触した第二の二本鎖ＤＮＡサンプル上における同一の色素標識されたヌクレオチドの位置とを比較する工程を有するものである、方法。
24. 請求項１５記載の方法において、二つの標識は、互いに約３０ｂｐ離れているものである、方法。
25. 核酸バイオポリマーについて配列情報を得る方法であって、
    第一の結合配列を有する蛍光標識された配列特異的プローブと一本鎖核酸バイオポリマーとを結合する工程と、
    前記一本鎖核酸バイオポリマーを、蛍光標識Ａを有する第一のターミネーターヌクレオチド、蛍光標識Ｂを有する第二のターミネーターヌクレオチド、蛍光標識Ｃを有する第三のターミネーターヌクレオチド、及び蛍光標識Ｄを有する第四のターミネーターヌクレオチドと接触させる工程と、
    前記核酸バイオポリマーを照射する工程であって、これにより前記第一の標識された配列特異的プローブと隣接する、前記第一のターミネーターヌクレオチド、前記第二のターミネーターヌクレオチド、前記第三のターミネーターヌクレオチド、前記第四のターミネーターヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせの存在、相対位置、またはその両方を測定するものである、前記照射する工程と
    を有するものである、方法。
26. 請求項２５記載の方法において、前記第一の結合配列は４〜６ヌクレオチドを有するものである、方法。
27. 請求項２５記載の方法において、蛍光標識Ａ、蛍光標識Ｂ、蛍光標識Ｃまたは蛍光標識Ｄの少なくとも二つは、異なる励起波長を有するものである、方法。
28. 請求項２７記載の方法において、蛍光標識Ａ、蛍光標識Ｂ、蛍光標識Ｃまたは蛍光標識Ｄの少なくとも一つは、前記第一の蛍光標識された配列特異的プローブの励起波長とは異なる励起波長を有するものである、方法。
29. 請求項２５記載の方法であって、この方法は、さらに、第二、第三、第四、及び第五の結合配列をそれぞれ有する少なくとも四つの蛍光標識されたプローブを、前記一本鎖核酸バイオポリマーに接触させる工程を有するものである、方法。
30. 請求項２９記載の方法において、前記第二の結合配列は、前記第一の結合配列の５’末端における塩基を除去し、且つ、前記第一の結合配列の３’末端に第一の置換塩基を付加することによって構築されるものである、方法。
31. 請求項２９記載の方法において、前記第三の結合配列は、前記第一の結合配列の５’末端における塩基を除去し、且つ、前記第一の結合配列の３’末端に第ニの置換塩基を付加することによって構築されるものである、方法。
32. 請求項２９記載の方法において、前記第四の結合配列は、前記第一の結合配列の５’末端における塩基を除去し、且つ、前記第一の結合配列の３’末端に第三の置換塩基を付加することによって構築されるものである、方法。
33. 請求項２９記載の方法において、前記第五の結合配列は、前記第一の結合配列の５’末端における塩基を除去し、且つ、前記第一の結合配列の３’末端に第四の置換塩基を付加することによって構築されるものである、方法。
34. 請求項２９記載の方法において、前記第二の蛍光標識された配列特異的プローブは、前記第一の蛍光標識された配列特異的プローブとは異なる励起波長を有するものである、方法。
35. 請求項２９記載の方法において、前記第二の結合配列は、前記第一の配列とは異なるものである、方法。
36. 請求項３５記載の方法において、前記第二の結合配列は、４〜６ヌクレオチドを有するものである、方法。
37. 請求項２９記載の方法であって、この方法は、さらに、前記核酸バイオポリマーを照射する工程であって、これにより前記第二の標識された配列特異的プローブに隣接する、前記第一のターミネーターヌクレオチド、前記第二のターミネーターヌクレオチド、前記第三のターミネーターヌクレオチド、前記第四のターミネーターヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせの存在または相対位置を測定するものである、前記照射する工程を有するものである、方法。
38. 核酸バイオポリマーについて構造的情報を得るための方法であって、
    （ａ）少なくとも二つの切断部位を生じさせるために、二本鎖バイオポリマーを、切断エンドヌクレアーゼと接触させる工程と、
    （ｂ）前記少なくとも二つの切断部位を、蛍光標識Ａを有する第一のヌクレオチドと接触させる工程と、
    （ｃ）余剰の第一のヌクレオチドを除去する工程と、
    （ｄ）前記第一のヌクレオチドの存在または相対位置を測定するために、前記二本鎖バイオポリマーを照射する工程と、
    （ｅ）前記少なくとも二つの切断部位を、蛍光標識Ｂを有する第二のヌクレオチドと接触させる工程と、
    （ｆ）余剰の第二のヌクレオチドを除去する工程と、
    （ｇ）前記第二のヌクレオチドの存在または相対位置を測定するために、前記二本鎖バイオポリマーを照射する工程と、
    （ｈ）前記少なくとも二つの切断部位を、蛍光標識Ｃを有する第三のヌクレオチドと接触させる工程と、
    （ｉ）余剰の第三のヌクレオチドを除去する工程と、
    （ｊ）前記第三のヌクレオチドの存在または相対位置を測定するために、前記二本鎖バイオポリマーを照射する工程と、
    （ｋ）前記少なくとも二つの切断部位を、蛍光標識Ｄを有する第四のヌクレオチドと接触させる工程と、
    （ｌ）余剰の第四のヌクレオチドを除去する工程と、
    （ｍ）前記第四のヌクレオチドの存在または相対位置を測定するために、前記二本鎖バイオポリマーを照射する工程と
    を有するものである、方法。
39. 請求項３８記載の方法であって、この方法は、さらに、工程（ｂ）〜工程（ｍ）を繰り返す工程を有するものである、方法。
40. 請求項３８記載の方法であって、この方法は、さらに、少なくとも二つの標識されたヌクレオチドを含む二本鎖バイオポリマーの一部を線形化する工程を有するものである、方法。
41. 請求項４０記載の方法であって、この方法は、さらに、前記二本鎖バイオポリマーの線形化部分に存在する２またはそれ以上の標識されたヌクレオチド間の距離を測定する工程を有するものである、方法。
42. 請求項３８記載の方法であって、この方法は、さらに、前記第一の切断部位に存在するヌクレオチドに隣接する第二の切断部位を誘導する工程を有するものである、方法。
43. 請求項３８記載の方法において、標識されたヌクレオチドは、少なくとも一つのバイオポリマー領域を、隣接する切断部位間に完全に密集させるものである、方法。
44. 請求項３８記載の方法において、前記隣接する切断部位間の少なくとも一つのバイオポリマー領域の少なくとも一部は、標識されたヌクレオチドで完全には密集されていないものである、方法。
45. 請求項３８記載の方法であって、この方法は、さらに、前記ヌクレオチドへの照射下で見ることのできる蛍光色素分子の順番と、対応する１またはそれ以上の蛍光色素分子とを関連付けることによって、前記バイオポリマーサンプルの少なくとも一部の配列を決定する工程を有するものである、方法。
46. 多重ハイブリダイゼーションを実行するためのキットであって、
    それぞれ異なる色の複数のハイブリダイゼーションプローブと、
    前記複数のハイブリダイゼーションプローブの少なくとも二つを核酸サンプルに適用するため、且つ少なくとも一つのハイブリダイズされた核酸を線形化及び画像化するための説明書と
    を有するものである、キット。

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