JP2000093161A - フマル酸高生産酵母の育種およびそれを用いた清酒の製造方法 - Google Patents
フマル酸高生産酵母の育種およびそれを用いた清酒の製造方法Info
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- JP2000093161A JP2000093161A JP31159198A JP31159198A JP2000093161A JP 2000093161 A JP2000093161 A JP 2000093161A JP 31159198 A JP31159198 A JP 31159198A JP 31159198 A JP31159198 A JP 31159198A JP 2000093161 A JP2000093161 A JP 2000093161A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 フマル酸高生産性酵母の新たな育種方法を開
発し、それを用いることによってフマル酸含量の高い清
酒の製造方法を提供する。 【構成】 清酒酵母よりフマル酸モノエチルエステル耐
性株を分離し、この中からフマル酸高生産性変異株を分
離する。これを用いてフマル酸含量の高い清酒を製造す
る。
発し、それを用いることによってフマル酸含量の高い清
酒の製造方法を提供する。 【構成】 清酒酵母よりフマル酸モノエチルエステル耐
性株を分離し、この中からフマル酸高生産性変異株を分
離する。これを用いてフマル酸含量の高い清酒を製造す
る。
Description
【００１】
【産業上の利用分野】 本発明はフマル酸高生産株の育
種方法およびその菌株を用いたフマル酸含量の高い清酒
の製造方法に関するものである。
種方法およびその菌株を用いたフマル酸含量の高い清酒
の製造方法に関するものである。
【００２】
【背景】 一般に、清酒中に含まれる有機酸は酒質に大
きな影響を与え、例えばコハク酸は旨味を、リンゴ酸や
フマル酸は爽やかな酸味を与えることが知られている。
また昨今は清酒の差別化を図る上で有機酸の含量やバラ
ンスの異なる清酒というものが強く望まれている。この
ような現状から清酒のフマル酸含量を従来よりさらに高
くする技術が必要である。
きな影響を与え、例えばコハク酸は旨味を、リンゴ酸や
フマル酸は爽やかな酸味を与えることが知られている。
また昨今は清酒の差別化を図る上で有機酸の含量やバラ
ンスの異なる清酒というものが強く望まれている。この
ような現状から清酒のフマル酸含量を従来よりさらに高
くする技術が必要である。
【００３】
【従来の技術】 これまでに、フマル酸を高生産する酵
母として、ＴＣＡ回路の酵素のひとつであるフマラーゼ
の構造遺伝子ＦＵＭ１の欠損変異株がフマル Ｌｅｔｔｅｒｓ ９１（１９９２）１０１−１０６）、
あるいはＦＵＭ１の遺伝子破壊株においてフマル酸を高
生産するという報告（Ｔ．Ｍａｇａｒｉｆｕｃｈｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎ ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８０
（４）、３５５−３６１（１９９５））がある。さらに
フマル酸を高生産させることを目的とした場合におい
て、従来のものとは機作の異なる変異によってフマル酸
高生産性となった酵母を、効率よく分離する技術の開発
が望まれる。
母として、ＴＣＡ回路の酵素のひとつであるフマラーゼ
の構造遺伝子ＦＵＭ１の欠損変異株がフマル Ｌｅｔｔｅｒｓ ９１（１９９２）１０１−１０６）、
あるいはＦＵＭ１の遺伝子破壊株においてフマル酸を高
生産するという報告（Ｔ．Ｍａｇａｒｉｆｕｃｈｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎ ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８０
（４）、３５５−３６１（１９９５））がある。さらに
フマル酸を高生産させることを目的とした場合におい
て、従来のものとは機作の異なる変異によってフマル酸
高生産性となった酵母を、効率よく分離する技術の開発
が望まれる。
【００４】
【本発明が解決しようとする課題】 本発明は新たなフ
マル酸高生産酵母の育種方法の開発およびそれを用いた
フマル酸含量の高い清酒の製造方法の開発を目的とす
る。
マル酸高生産酵母の育種方法の開発およびそれを用いた
フマル酸含量の高い清酒の製造方法の開発を目的とす
る。
【００５】
【問題を解決するための手段】 本発明者は清酒酵母が
フマル酸モノエチルエステル（以下ＦＡＭと略す）を含
む培地において、著しく生育が阻害されることを見出し
た。ＦＡＭはフマル酸類似物質であり、ＦＡＭ耐性株に
おいてはフマル酸に関連する代謝系に何らかの変化を生
じ、その結果、親株とはフマル酸生成量に差が生じるこ
とが期待できる。そこで、ＦＡＭを、耐性株を分離する
手段として利用することにより、効率よくフマル酸高生
産変異株を取得できることを認め、本発明を完成させる
に至った。
フマル酸モノエチルエステル（以下ＦＡＭと略す）を含
む培地において、著しく生育が阻害されることを見出し
た。ＦＡＭはフマル酸類似物質であり、ＦＡＭ耐性株に
おいてはフマル酸に関連する代謝系に何らかの変化を生
じ、その結果、親株とはフマル酸生成量に差が生じるこ
とが期待できる。そこで、ＦＡＭを、耐性株を分離する
手段として利用することにより、効率よくフマル酸高生
産変異株を取得できることを認め、本発明を完成させる
に至った。
【００６】 本発明において、変異株はポジティブに得
られるものであり、ＦＡＭ耐性株は、自然変異あるいは
人工的な変異誘発によって取得できる。変異誘発剤は特
に限定するものではなく、エチルメタンスルホネートに
よる処理など公知の方法を利用できる。親株としては１
倍体あるいは２倍体いずれにおいても耐性株を容易に取
得可能であり、各種協会酵母に代表される実用株あるい
は野生酵母からも耐性株を取得可能であり、これらを種
酵母として使用すれば、フマル酸含量の高い清酒を製造
できる。
られるものであり、ＦＡＭ耐性株は、自然変異あるいは
人工的な変異誘発によって取得できる。変異誘発剤は特
に限定するものではなく、エチルメタンスルホネートに
よる処理など公知の方法を利用できる。親株としては１
倍体あるいは２倍体いずれにおいても耐性株を容易に取
得可能であり、各種協会酵母に代表される実用株あるい
は野生酵母からも耐性株を取得可能であり、これらを種
酵母として使用すれば、フマル酸含量の高い清酒を製造
できる。
【００７】 本発明によって取得したＦＡＭ耐性株の中
から、液体培養において親株の５倍近くのフマル酸生成
能を有する株が得られることが確認された。
から、液体培養において親株の５倍近くのフマル酸生成
能を有する株が得られることが確認された。
【００８】 本発明において取得した変異株によって製
造した清酒は親株の５倍のフマル酸を有し、官能的にも
爽やかな酸味を有するものであった。
造した清酒は親株の５倍のフマル酸を有し、官能的にも
爽やかな酸味を有するものであった。
【００９】
【実施例１】 当社保存酵母菌株Ｋｍ６０１株をＹＰＤ
培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２
％）１０ｍｌに３０℃で１日間培養後、集菌、洗浄し
た。洗浄菌体を２ｍＭ ＦＡＭを含む最小平板培地（２
％グルコース、０．６７％ディフコ社イーストナイトロ
ジェンベース、２％寒天）に塗沫した。これを３０℃で
４日間培養後、出現するコロニーをＦＡＭ耐性株として
単離した。
培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２
％）１０ｍｌに３０℃で１日間培養後、集菌、洗浄し
た。洗浄菌体を２ｍＭ ＦＡＭを含む最小平板培地（２
％グルコース、０．６７％ディフコ社イーストナイトロ
ジェンベース、２％寒天）に塗沫した。これを３０℃で
４日間培養後、出現するコロニーをＦＡＭ耐性株として
単離した。
【０１０】 耐性株をＢｒｉｘ１０の麹汁培地にて、１
５℃で１４日間静置培養し、培養上清のフマル酸濃度を
測定した結果を表１に示す。フマル酸の定量はベーリン
ガーマンハイム社製Ｆキットを用いて行なった。この中
からフマル酸高生産株としてＦ２４株を選択した。
５℃で１４日間静置培養し、培養上清のフマル酸濃度を
測定した結果を表１に示す。フマル酸の定量はベーリン
ガーマンハイム社製Ｆキットを用いて行なった。この中
からフマル酸高生産株としてＦ２４株を選択した。
【０１１】 Ｆ２４をＹＰＤ培地に３０℃で２日間培養
後、集菌、洗浄した。洗浄菌体をｐＨ７．５のリン酸緩
衝液に懸濁し、ガラスビーズを用いて破砕した。これを
３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を無細胞
抽出液とした。無細胞抽出液のフマラーゼ活性を、フマ
ル酸を基質とした以下のような反応系（０．０２Ｍフマ
ル酸、１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、４０％ｖ／ｖ無
細胞抽出液、２５℃、４時間反応後、熱処理）を用いて
生じたリンゴ酸を定量することによって測定した。リン
ゴ酸の定量はベーリンガーマンハイム社製Ｆキットを用
いて行なった。活性の定義はタンパク１ｍｇ当たり１時
間に１μｇのリンゴ酸を生成する酵素量を１Ｕｎｉｔと
した。表２に示すようにＦ２４株はフマラーゼ活性を有
しており、従来知られているフマラーゼ欠損株あるいは
遺伝子破壊株によるフマル酸の高生産性とは異なる機構
により、フマル酸高生産性を示すことが推定された。な
お、この菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所にＦ
ＥＲＭ Ｐ−１７００１として寄託されている。
後、集菌、洗浄した。洗浄菌体をｐＨ７．５のリン酸緩
衝液に懸濁し、ガラスビーズを用いて破砕した。これを
３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を無細胞
抽出液とした。無細胞抽出液のフマラーゼ活性を、フマ
ル酸を基質とした以下のような反応系（０．０２Ｍフマ
ル酸、１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．５、４０％ｖ／ｖ無
細胞抽出液、２５℃、４時間反応後、熱処理）を用いて
生じたリンゴ酸を定量することによって測定した。リン
ゴ酸の定量はベーリンガーマンハイム社製Ｆキットを用
いて行なった。活性の定義はタンパク１ｍｇ当たり１時
間に１μｇのリンゴ酸を生成する酵素量を１Ｕｎｉｔと
した。表２に示すようにＦ２４株はフマラーゼ活性を有
しており、従来知られているフマラーゼ欠損株あるいは
遺伝子破壊株によるフマル酸の高生産性とは異なる機構
により、フマル酸高生産性を示すことが推定された。な
お、この菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所にＦ
ＥＲＭ Ｐ−１７００１として寄託されている。
【０１２】
【実施例２】 Ｆ２４を用いて表３に示す配合で清酒の
仕込み試験を行なった。麹汁培地に３０℃、２日間静置
培養した酵母を初添の水麹時に添加した。品温は１５℃
一定とし、留仕込後の炭酸ガス減量が５８ｇを越えた時
点で上槽した。製成酒の分析結果を表４に示す。
仕込み試験を行なった。麹汁培地に３０℃、２日間静置
培養した酵母を初添の水麹時に添加した。品温は１５℃
一定とし、留仕込後の炭酸ガス減量が５８ｇを越えた時
点で上槽した。製成酒の分析結果を表４に示す。
【０１３】 Ｆ２４は親株と同程度の醗酵速度を示し、
１５日目で上槽した。Ｆ２４は清酒醪においてもフマル
酸を高生産し、製成酒中に親株の５倍以上の含量を示
し、官能的にも爽やかな酸味のある清酒の製造が可能で
あった。このような特徴から、新たに取得した菌株の清
酒醸造の利用は、清酒の多様化に対応するための有効な
手段として期待できる。
１５日目で上槽した。Ｆ２４は清酒醪においてもフマル
酸を高生産し、製成酒中に親株の５倍以上の含量を示
し、官能的にも爽やかな酸味のある清酒の製造が可能で
あった。このような特徴から、新たに取得した菌株の清
酒醸造の利用は、清酒の多様化に対応するための有効な
手段として期待できる。
【０１４】
【表１】
【０１５】
【表２】
【０１６】
【表３】
【０１７】
【表４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 原 昌道 兵庫県神戸市東灘区魚崎西町１丁目８番６ 号 菊正宗酒造株式会社総合研究所内 Ｆターム(参考） 4B065 AA72X AC20 BA24 CA42
Claims (2)
- 【請求項１】 清酒酵母からフマル酸モノエチルエステ
ル耐性株を分離し、その中から、フマル酸を高生産する
株を分離する酵母の育種方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載する方法により取得した
酵母を用いたフマル酸含量の高い清酒の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31159198A JP2000093161A (ja) | 1998-09-28 | 1998-09-28 | フマル酸高生産酵母の育種およびそれを用いた清酒の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31159198A JP2000093161A (ja) | 1998-09-28 | 1998-09-28 | フマル酸高生産酵母の育種およびそれを用いた清酒の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000093161A true JP2000093161A (ja) | 2000-04-04 |
Family
ID=18019094
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31159198A Pending JP2000093161A (ja) | 1998-09-28 | 1998-09-28 | フマル酸高生産酵母の育種およびそれを用いた清酒の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000093161A (ja) |
-
1998
- 1998-09-28 JP JP31159198A patent/JP2000093161A/ja active Pending
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