JP2000050878A

JP2000050878A - 新規遺伝子とそれにコードされる蛋白質

Info

Publication number: JP2000050878A
Application number: JP10227718A
Authority: JP
Inventors: Osamu Obara; 收小▲原▼; Takahiro Nagase; 隆弘長瀬; Nobuo Nomura; 信夫野村; Kiyoshi Takayama; 喜好高山; Hitoshi Toyoda; 均豊田; Makoto Yoshimoto; 真吉本
Original assignee: Kazusa DNA Research Institute Foundation; Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Kazusa DNA Research Institute Foundation; Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-08-12
Filing date: 1998-08-12
Publication date: 2000-02-22
Also published as: AU5196799A; WO2000009688A1

Abstract

(57)【要約】【課題】オキシステロールとの結合活性を有する新規蛋
白質を提供する。【解決手段】ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリーからの
クローニングによって、オキシステロール結合活性を有
する新規蛋白質ＯＳＢＨをコードする遺伝子ｏｓｂｈが
得られ、該遺伝子を有する発現ベクターによる形質転換
体の培養により、ＯＳＢＨが得られる。該蛋白質はＯＳ
結合蛋白質として、医薬又は医薬の開発に用いることが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術】本発明は、オキシステロール結合
活性を有する、脳由来の新規蛋白質ＯＳＢＨ、該蛋白質
をコードする遺伝子ｏｓｂｈに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】心筋梗塞、脳梗塞の主要な原因は、粥状
の硬化巣が動脈壁に形成されることによる血管の閉塞で
ある。この動脈硬化発症の初期段階では、変成したＬＤ
Ｌ（低密度リポプロテイン）が重要な働きをする。すな
わち、正常ＬＤＬが血管内皮下に浸潤して酸化あるいは
糖化され変成ＬＤＬとなると、単球は血流より浸潤して
マクロファージに分化してこれら変成ＬＤＬを貪食し、
その細胞内に脂質をため込みいわゆる泡沫化する。この
マクロファージの泡沫化が動脈硬化発症の引き金とな
る。

【０００３】酸化による変性ＬＤＬ中には様々な酸化脂
質が含まれる。特にコレステロールが酸化したオキシス
テロール（以下ＯＳ）は多彩な生理活性を有し、動脈硬
化進展に影響を与える。ＯＳは、マクロファージや血管
平滑筋細胞に対しアポトーシスを誘導し、不安定な硬化
巣を形成する。また、acyl-CoA :Cholesterol acyltran
sferase(ＡＣＡＴ)を活性化することにより、コレステ
ロールの細胞内の蓄積を促進させ、コレステロールの細
胞外への放出を阻害する。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ＯＳは脂溶性が高いた
めに細胞内では遊離状態で存在出来ず、特別な蛋白質と
結合してその生理活性を発現している。これまでに、こ
の結合活性を有する蛋白質として、ＯＳ結合蛋白質（Ox
ySterol Binding Protein、以下ＯＳＢＰとする）が報
告されている。

【０００５】しかし、このＯＳＢＰはＯＳの有する全て
の生理活性の発現に関与するものではなく、ＯＳＢＰ以
外のＯＳ結合性蛋白質の存在も含め、ＯＳの詳細な機能
発現機構に関しては不明な点が多い。そのため、ＯＳＢ
Ｐとは異なる分子であって、ＯＳとの結合能を有し、Ｏ
Ｓの多彩な生理活性発現に関わる新たな分子を明らかに
することにより、かかる生体分子を直接的に医薬として
使用し、又は間接的に医薬化合物の探索に供することが
可能となると推察される。

【０００６】本発明は、この様な分子を同定し、医薬等
または医薬等の開発に利用することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒト全脳
で発現している遺伝子の中から、所望の蛋白質を把握す
るべく鋭意研究の結果、新規蛋白質ＯＳＢＨ（OxyStero
l Binding protein Homolog)の存在と、これをコードす
る遺伝子ｏｓｂｈの単離に成功し、本発明を完成するに
至った。

【０００８】即ち、本発明は、（ａ）配列番号：１に記
載のアミノ酸配列からなる蛋白質、または（ｂ）配列番
号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつＯＳ結合活性を有する蛋白質に関するものであ
る。さらに本発明は、（ｃ）配列番号：２に記載のＤＮ
Ａからなる遺伝子、または、（ｄ）配列番号：２のＤＮ
Ａとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ
ＯＳ結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡからな
る遺伝子に関するものである。

【０００９】本発明の遺伝子であるｏｓｂｈは、ヒト脳
由来のｃＤＮＡライブラリーから、該遺伝子を含んだｃ
ＤＮＡ断片として単離することができる。本発明者らが
使用したｃＤＮＡライブラリーは、クローンテック社か
ら市販されているヒト脳から抽出したｍＲＮＡをもとに
調製したものである上述のｃＤＮＡライブラリーにおいて、ＯＳ結合活性を
有する蛋白質をコードするｃＤＮＡを識別する方法とし
て、小▲原▼らの方法（DNA Research, Vol.4,p53,199
7）による、長鎖ｃＤＮＡライブラリーを用いた網羅的
ｃＤＮＡライブラリーの解析を用いた。小▲原▼らの方
法で作製した、ヒト脳由来の長鎖ｃＤＮＡライブラリー
から無作為に２５，０００個の組換え体を選択し、１
５，０００クローンのｃＤＮＡ部分の５’側ならびに
３’側の塩基配列を決定し、全クローンの５’側の配列
から既に報告されているＯＳＢＰをコードする遺伝子と
相同性のあるクローンを、ＤＮＡ解析プログラム（BLAS
T並びにFastA）を用いることで見出す事が出来る。

【００１０】塩基配列中の蛋白質をコードする領域（Ｏ
ＲＦ、open reading frame）の存在は、塩基配列をコン
ピュータープログラムを用いて解析する汎用の方法によ
り確認することができる。該ｃＤＮＡ配列の中に目的と
する遺伝子の存在を確信した本発明者らは、コンピュー
ターを利用して該配列中に一つのＯＲＦを見いだし、こ
の遺伝子をｏｓｂｈ、該遺伝子にコードされる蛋白質を
ＯＳＢＨと命名した。本発明であるＯＳＢＨは、全４６
８アミノ酸残基からなる分子量約５０キロダルトン（ｋ
Ｄａ）の蛋白質である。

【００１１】

【発明の実施の形態】ｏｓｂｈは、配列番号：２に示さ
れる塩基対１４０７残基からなる遺伝子である。このｏ
ｓｂｈを用い、適当な宿主ベクター系による一般的な遺
伝子組み換え技術によって、組み換え遺伝子を調製する
ことができる。適当なベクターとしては、大腸菌由来の
プラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８その
他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐ
Ｃ１９４その他）、酵母由来のプラスミド（例、ｐＳＨ
１９その他）、さらにバクテリオファージやレトロウィ
ルスやワクシニアウィルス等の動物ウィルス等が利用で
きる。組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプタ
ーを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを付加する
ことも可能である。さらに該遺伝子を発現させるため
に、遺伝子の上流に適当な発現プロモーターを接続す
る。使用するプロモーターは、宿主に応じて適宜選択す
ればよい。例えば、宿主が大腸菌である場合には、Ｔ７
プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモータ
ー、λＰＬプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌で
ある場合にはＳＰＯ系プロモーター等が、宿主が酵母で
ある場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモータ
ー、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場
合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロ
モーター等が、それぞれ使用できる。

【００１２】また該遺伝子を他の蛋白質（例、グルタチ
オンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡその他）との
融合蛋白質として発現させることも可能である。このよ
うにして発現させた融合型ＯＳＢＨは、適当なプロテア
ーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すことが
可能である。

【００１３】ＯＳＢＨの発現の際に利用できる宿主とし
ては、エシェリヒア属菌であるEscherichia co liの各種
菌株、バチルス属菌であるBacillus subtilisの各種菌
株、酵母としてはSaccharomyces cerevisiaeの各種菌
株、動物細胞としてはＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞等が
利用できる。

【００１４】上記組み換えベクターを用いて宿主細胞を
形質転換する方法としては、常法または各宿主細胞に対
して一般に用いられる形質転換方法が適用できる。

【００１５】尚、本発明においては、配列番号：２に示
したＤＮＡ配列の他に、該ＤＮＡとハイブリダイズしか
つＯＳ結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡも、
本発明の範囲内である。

【００１６】すなわち、ｏｓｂｈの全長配列において、
種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤
処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断
片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が
変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体がｏｓｂ
ｈとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
つＯＳ結合活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであ
れば、配列番号：２に示したＤＮＡ配列との相違に関わ
らず、本発明の範囲内のものである。

【００１７】上記のＤＮＡ変異の程度は、ｏｓｂｈのＤ
ＮＡ配列と９０％以上の相同性を有するものであれば許
容範囲内である。また、ｏｓｂｈとハイブリダイズする
程度としては、通常の条件下、例えばDIG DNA Labeling
kit（ベーリンガー・マンハイム社製Cat No.1175033）
でプローブをラベルした場合に、３２℃のDIG Easy Hyb
溶液（ベーリンガー・マンハイム社製Cat No.1603558）
中でハイブリダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液
（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを
洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ、
０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザン
ハイブリダイゼーションで、ｏｓｂｈにハイブリダイズ
する程度であればよい。

【００１８】また、上記のごとくｏｓｂｈと相同性の高
い変異体遺伝子にコードされる蛋白質であって、ＯＳ結
合活性を有する蛋白質もまた、本発明の範囲内のもので
ある。すなわち、ＯＳＢＨのアミノ酸配列の１もしく
は複数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された変
異体であっても、該変異体がＯＳ結合活性を有する蛋白
質であれば、該変異体は本発明の範囲内のものである。

【００１９】蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖
は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なる
ものであるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体
構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の
高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測に
より知られている。例えば、アミノ酸残基の置換につい
ては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌ
ｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイ
シン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン
酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸
（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃ
ｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅ
ｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａ
ｒｇ）、等が挙げられる。

【００２０】従って、配列番号：１に示したＯＳＢＨの
アミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質
であっても、その変異がＯＳＢＨの３次元構造において
保存性が高い変異であって、その変異蛋白質がＯＳＢＨ
と同様にＯＳ結合活性を有する蛋白質であれば、これら
は本発明の範囲内にあるものと言うことができる。変異
の程度としては、配列番号：１に示したアミノ酸配列と
の相同性が９０％以上のものが許容し得る範囲である。

【００２１】

【発明の効果】ＯＳＢＨはＯＳ結合活性を有しているこ
とから、ｏｓｂｈの発現異常あるいはＯＳＢＨの機能不
全は、動脈硬化進展に重大な影響を及ぼすと推測され
る。

【００２２】従って、動脈硬化治療薬を目的として、ｏ
ｓｂｈやＯＳＢＨを用いることにより、ＯＳＢＨの機能
と同様の機能を有する物質や当該機能を促進する物質あ
るいは阻害する物質、あるいは遺伝子の発現を促進或い
は抑制する物質等の探索、評価を効率よく行うことがで
きる。

【００２３】

【実施例】以下実施例を挙げて詳述するが、本発明はこ
の実施例に限定されないことは言うまでもない。尚、特
に断らない限り、下記実施例において使用した実験操作
は、Molecular Cloning 2nd.ed.（Cold Spring Harbor
Lab.Press、 1989）に代表される各種の標準的実験書
や、市販キットの取扱説明書の記載、また制限酵素等の
各市販製品に対する推奨条件下で行うことができる。

【００２４】＜実施例１＞ｏｓｂｈのクローニング１）ヒト脳由来の長鎖ｃＤＮＡライブラリーの構築 NotIサイトを有するオリゴヌクレオチド（GACTAGTTCTAG
ATCGCGAGCGGCCGCCC(T)₁₅)（ギブコBRL社）をプライマー
として、ヒト脳由来のｍＲＮＡ（クローンテック社）を
鋳型にSuperScript II逆転転写酵素キット（ギブコBRL
社）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。この合成ｃＤＮＡ
と、SalI サイトを有するアダプター（ギブコBRL社）と
をライゲーションした後NotIで消化し、１％濃度の低融
解アガロース電気泳動により、３ｋｂ以上のｃＤＮＡ断
片を精製した。

【００２５】精製したｃＤＮＡ断片を、SalI−NotI制限
酵素処理を施したpBluescriptIISK+プラスミドとライゲ
ーションした後、大腸菌 ElectroMax DH10B株(ギブコBR
L社）に、エレクトロポーレーション法により組み換え
プラスミドを導入した。次いで、当該ライブラリーから
無作為に２５，０００個の組換え体を選択し、組換えＤ
ＮＡを抽出し、１５，０００クローンのｃＤＮＡ部分の
５’側ならびに３’側の塩基配列を決定した。配列決定
にはＰＥアプライドバイオシステムズ社製のＤＮＡシー
クエンサー（ABI PRISM377）と同社製反応キットを用い
た。

【００２６】２）ｏｓｂｈの配列を含むクローンの選別１）で決定した全クローンの５’側の配列を既に報告さ
れているｏｓｂｐとＤＮＡ解析プログラム（BLAST並び
にFastA）を用いて比較したところ、クローン名ＨＫ０
５１１９が有為な相同性を示した。

【００２７】３）ＤＮＡ断片の塩基配列の決定塩基配列決定にはＰＥアプライドバイオシステムズ社製
のＤＮＡシークエンサーを用いて、両鎖の全塩基配列を
決定した。大部分の配列はショットガンクローンをダイ
プライマー法を用いて、一部の塩基配列については、決
定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成
し、プライマーウォーキング法で塩基配列を決定した。
当該クローンのｃＤＮＡの全塩基配列を配列番号：３に
示す。

【００２８】当該ｃＤＮＡは４６８残基より成る蛋白質
（ＯＳＢＨ）をコードするＯＲＦを含んでいる（配列番
号：３）。該蛋白質の開始コドンであるメチオニン残基
の上流域に同じreading frameで終止コドンが出現した
ことから、当該ｃＤＮＡ断片がコードする蛋白質のアミ
ノ酸配列は、配列番号：３に示したものが唯一のもので
あることが確認された。

【００２９】既に報告されているＯＳＢＰと本発明であ
るＯＳＢＨのアミノ酸の相同性を時１に示す。両者は高
い相同性を示し、特にＯＳＢＨの１６２残基から１７２
残基はＯＳを結合する蛋白質が共通に保有する重要な領
域であると推察される。

【００３０】＜実施例２＞ｏｓｂｈのin vitroトランス
レーション法による蛋白質発現の確認実施例１で調製したｏｓｂｈを含むプラスミドを、（³⁵
S）メチオニン存在下でTNT T7 coupled reticulocyte l
ysateシステム（プロメガ社）を用いてin vitroトラン
スレーションを実施した。反応液の一部をＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）により分離
して、BAS-2000（富士写真工業製）で解析した。その結
果、図２に示すように、約５０ｋＤａの位置に主要なバ
ンドを確認した。

【００３１】＜実施例３＞動物細胞発現用ベクターの構
築１）ＯＲＦを含むｃＤＮＡの増幅配列番号：３の該蛋白質の開始コドンより上流の配列を
有するオリゴヌクレオチド（下記の配列−１）と、該蛋
白質の終止コドンより下流の一部分と逆相補鎖と配列を
有するオリゴヌクレオチド（下記の配列−２）をＤＮＡ
合成機（ABI社製380B）で合成した。

【００３２】配列−１ 5'-GGCAGTGGAGGCTGGCTGCTGAAGG-3' 配列−２ 5'-TCTGCTGTGACGAGGCTCACAATGG-3' 実施例１で単離した配列番号：３を含む組み換えｃＤＮ
Ａを鋳型とし、配列−１のオリゴヌクレオチドと配列−
２のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、タカラLA P
CR Kit Ver.2とＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ（いずれ
も宝酒造製）を用いて、以下のＰＣＲ操作を行った。

【００３３】 cDNA 5μl(10ng) 10×PCRバッファー(25mM Mg⁺⁺を含む) 5μl 2.5mM dNTP 8μl 10μM 配列−１ 2μl 10μM 配列−２ 2μl 水 27.5μlLA Taqホ゜リメラーセ゛ 0.5μl 総量 50 μl ＰＣＲサイクルは、９４℃で２分保持後、９８℃で２０
秒間反応させ、６８℃まで−１℃／２秒の速度で冷却
し、６８℃で３分保持し、更に７２℃で１０分間保持を
３０回繰り返して行った。

【００３４】上記方法により、配列番号：３の一部を有
するＤＮＡ断片（約１．５ｋｂ）を増幅させた。

【００３５】２）動物細胞用発現ベクターへのサブクロ
ーニング１）で増幅したＤＮＡ断片を、１％アガロースゲル電気
泳動で分画した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し
た後、紫外光照射して目的とするバンドを含むゲルを切
り出した。アガロースゲルからのＤＮＡ断片の抽出と精
製は、GENECLEAN II Kit（バイオ１０１社製）を用いて
行った。

【００３６】この抽出精製したＤＮＡ断片を、動物細胞
用発現用ベクターpTARGET（プロメガ社製）にサブクロ
ーニングした。Ligation溶液はタカラDNA Ligation Kit
Ver.2（宝酒造製）を用い、以下の組成で１６℃で１．
５時間反応させた。

【００３７】抽出精製したＤＮＡ断片 1μl(50ng) pTARGET 1μl(10ng) 水 3μl Ligation溶液 5μl 総量 10μl 上記反応後の溶液を用いて、大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５の形
質転換を行った。形質転換体をアンピシリン（Ａｍｐ）
５０μｇ／ｍｌ、5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-ga
lactoside（Ｘ−ｇａｌ）４０μｇ／ｍｌ、Isopropyl-
β-D-Thio-Galactopyranoside（ＩＰＴＧ）１００μＭ
を含有するＬＢ寒天培地にプレーティングし、３７℃で
一晩培養した。

【００３８】上記プレートに出現したコロニーを５０μ
ｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し
て３７℃で一晩培養し、遠心分離によって菌体を集めた
後、QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit（キアゲン社
製）で組換えＤＮＡを精製し、pTARGETosbhを得た。

【００３９】３）導入ｃＤＮＡの塩基配列の決定塩基配列決定にはＤＮＡシークエンサー（ABI社製PRISM
377）を用い、ダイターミネーター法を用い、プライマ
ーウオーキング法で両鎖の全塩基配列を決定した。当該
クローンは配列番号：３の配列のうち、配列−１及び配
列−２に挟まれるすべての領域を含んでいたことから、
目的とする遺伝子pTARGETosbhがクローニングされたこ
とを確認した。

【００４０】＜実施例４＞ＣＨＯｋ１細胞への導入と安
定な形質転換体の取得＞実施例２で取得したpTARGETosbhはｏｓｂｈ断片の上流
にＣＭＶプロモーターを有しており、当該組換えＤＮＡ
を動物細胞中に導入すれば、ＯＳＢＨを発現させること
が可能である。

【００４１】ＣＨＯｋ１細胞を直径６０ｍｍのプラスチ
ックシャーレで培養した。培地としては１０％牛胎児血
清(大日本製薬）、５０ユニット／ｍｌペニシリン、５
０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むHamF-12（ギブ
コ社製、以下増殖培地とする）を使用し、３７℃、５％
ＣＯ₂存在下で培養した。細胞密度が５０％になった時
点で、実施例−２で取得したpTARGETosbhを含むLIPOFEC
TAMINE試薬（ギブコ社製）を、細胞上に重層して６時間
培養した後、増殖培地に置換して４８時間培養した。ト
リプシンで細胞を分散した後、細胞懸濁液を直径６０ｍ
ｍのプラスチックシャーレに分注してさらに２４時間培
養した。培地を除いた後、G418試薬（ギブコ社製；終濃
度５００μｇ／ｍｌ）を含有する増殖培地に置換した。
G418試薬（Ｂ添加培地を３日毎に交換してして２週間培
養した。細胞のコロニーが肉眼で確認できるようになっ
た時点で、ステンレスカップを用いてコロニーを３個単
離した。対照として用いるためにＣＨＯｋ１細胞にpTAR
GETベクター（プロメガ社製）のみを上記と同様にして
導入し、安定な形質転換体を単離した。

【００４２】２）形質転換体中の遺伝子発現の確認単離した各形質転換体を、６穴のプレートでG418添加培
地（終濃度５００μｇ／ｍｌ）で培養し、細胞密度が再
度８０％コンフルエントになった時点で培地を除去し、
ＰＢＳを添加し洗浄後、Trizol（ギブコ社製）を用いて
細胞からtotalＲＮＡを精製した。２μｇの全ＲＮＡ鋳
型に、Superscript 逆転転写酵素（ギブコ社製）を用い
てｃＤＮＡを合成した。

【００４３】合成したｃＤＮＡを鋳型に、実施例２−
１）と同じオリゴヌクレオチド（配列−１、配列−２）
を用いて、ＰＣＲ反応を実施した。

【００４４】 cDNA 5μl(100ng) 10×PCRバッファー(25mM Mg⁺⁺を含む) 5μl 2.5mM dNTP 8μl 10μM 配列−１ 2μl 10μM 配列−２ 2μl 水 27.5μlLA Taqホ゜リメラーセ゛ 0.5μl 総量 50 μl ＰＣＲサイクルは、９４℃で２分保持後、９８℃で２０
秒間反応させ、６８℃まで−１℃／２秒の速度で冷却
し、６８℃で３分保持し、更に７２℃で１０分間保持を
３０回繰り返して行った。

【００４５】増幅したＤＮＡ断片を、１％アガロースゲ
ル電気泳動で分画し、エチジウムブロマイドで染色した
後、紫外光照射して目的とするバンドが増幅されるか否
か調べた。

【００４６】その結果、pTARGETosbhを導入したＣＨＯ
ｋ１細胞でのみ、目的のバンドが増幅され、コントロー
ルベクターを導入したＣＨＯｋ１細胞では、増幅は確認
できなかった。

【００４７】＜実施例５＞ｏｓｂｈ導入ＣＨＯｋ１の
オキシステロール結合活性実施例３で調製したｏｓｂｈを導入したＣＨＯｋ１細胞
と、コントロールベクターを導入したＣＨＯｋ１細胞
の、それぞれのＯＳ結合活性の比較を行った。１×１０
⁶個のｏｓｂｈを導入したＣＨＯｋ１細胞と、コントロ
ールベクターを導入したＣＨＯｋ１細胞の細胞質分画を
それぞれ調製し、メンブレンにそれぞれの蛋白質を吸着
させた。牛血清アルブミンを含む適切な緩衝液でメンブ
レンを洗浄後、（³H）放射標識２５−ハイドロキシコレ
ステロールあるいは７−ケトコレステロール（アマシャ
ム社製）を含む緩衝液で更に２０分反応させた。メンブ
レンを洗浄後、取り込まれた放射活性を測定した。そ
の結果、統計学的に有意に、ｏｓｂｈを導入したＣＨＯ
ｋ１では、コントロール細胞と比較してＯＳ結合活性が
高い値を示した。

【００４８】

【配列表】配列の数：１配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１配列の長さ：468残基配列の型：アミノ酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：蛋白質配列： Met Asn Gly Glu Glu Glu Phe Phe Asp Ala Val Thr Glu Ala Asn 5 10 15 Gln Lys Val Thr Gly Met Ile Asp Leu Asp Thr Ser Lys Asn Asn 20 25 30 Arg Ile Gly Lys Thr Gly Glu Arg Pro Ser Gln Glu Asn Gly Ile 35 40 45 Gln Lys His Arg Thr Ser Leu Pro Ala Pro Met Phe Ser Arg Ser 50 55 60 Asp Phe Ser Val Trp Thr Ile Leu Lys Lys Cys Val Gly Leu Glu 65 70 75 Leu Ser Lys Ile Thr Met Pro Ile Ala Phe Asn Glu Pro Leu Ser 80 85 90 Phe Leu Gln Arg Ile Thr Glu Tyr Met Glu His Val Tyr Leu Ile 95 100 105 His Arg Ala Ser Cys Gln Pro Gln Pro Leu Glu Arg Met Gln Ser 110 115 120 Val Ala Ala Phe Ala Val Ser Ala Val Ala Ser Gln Trp Glu Arg 125 130 135 Thr Gly Lys Pro Phe Asn Pro Leu Leu Gly Glu Thr Tyr Glu Leu 140 145 150 Ile Arg Glu Asp Leu Gly Phe Arg Phe Ile Ser Glu Gln Val Ser 155 160 165 His His Pro Pro Ile Ser Ala Phe His Ser Glu Gly Leu Asn His 170 175 180 Asp Phe Leu Phe His Gly Ser Ile Tyr Pro Lys Leu Lys Phe Trp 185 190 195 Gly Lys Ser Val Glu Ala Glu Pro Arg Gly Thr Ile Thr Leu Glu 200 205 210 Leu Leu Lys His Asn Glu Ala Tyr Thr Trp Thr Asn Pro Thr Cys 215 220 225 Cys Val His Asn Val Ile Ile Gly Lys Leu Trp Ile Glu Gln Tyr 230 235 240 Gly Thr Val Glu Ile Leu Asn His Arg Thr Gly His Lys Cys Val 245 250 255 Leu His Phe Lys Pro Cys Gly Leu Phe Gly Lys Glu Leu His Lys 260 265 270 Val Glu Gly His Ile Gln Asp Lys Asn Lys Lys Lys Leu Phe Met 275 280 285 Ile Tyr Gly Lys Trp Thr Glu Cys Leu Trp Gly Ile Asp Pro Val 290 295 300 Ser Tyr Glu Ser Phe Lys Lys Gln Glu Arg Arg Gly Asp His Leu 305 310 315 Arg Lys Ala Lys Leu Asp Glu Asp Ser Gly Lys Ala Asp Ser Asp 320 325 330 Val Ala Asp Asp Val Pro Val Ala Gln Glu Thr Val Gln Val Ile 335 340 345 Pro Gly Ser Lys Leu Leu Trp Arg Ile Asn Thr Arg Pro Pro Asn 350 355 360 Ser Ala Gln Met Tyr Asn Phe Thr Ser Phe Thr Val Ser Leu Asn 365 370 375 Glu Leu Glu Thr Gly Met Glu Lys Thr Leu Pro Pro Thr Asp Cys 380 385 390 Arg Leu Arg Pro Asp Ile Arg Gly Met Glu Asn Gly Asn Met Asp 395 400 405 Leu Ala Ser Gln Glu Lys Glu Arg Leu Glu Glu Lys Gln Arg Glu 410 415 420 Ala Arg Arg Glu Arg Ala Lys Glu Glu Ala Glu Trp Gln Thr Arg 425 430 435 Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Pro Tyr Thr Gly Thr Pro Asp Trp 440 445 450 Leu Tyr Ala Gly Asp Tyr Phe Glu Arg Asn Phe Ser Asp Cys Pro 455 460 465 Asp Ile Tyr 468 配列の数：１配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２配列の長さ：１４０７塩基配列の型：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：核酸配列 ATGAACGGAG AGGAAGAATT CTTTGATGCC GTCACAGAGG CAAATCAGAA AGTCACGGGA 60 ATGATTGACT TAGACACCAG CAAAAATAAT AGGATTGGGA AAACTGGGGA GAGGCCCTCT 120 CAAGAGAACG GAATTCAGAA ACACAGGACA TCGCTGCCGG CTCCCATGTT CAGCAGAAGC 180 GACTTCAGCG TGTGGACCAT CCTGAAGAAG TGTGTTGGCC TGGAGCTGTC CAAGATCACG 240 ATGCCAATCG CCTTCAACGA GCCTCTGAGC TTCTTGCAGC GGATCACGGA GTACATGGAG 300 CACGTGTACC TCATCCACAG GGCCTCCTGC CAGCCCCAGC CCCTGGAGAG GATGCAGTCT 360 GTGGCTGCTT TTGCTGTTTC GGCTGTGGCT TCCCAGTGGG AGAGGACCGG CAAACCATTT 420 AATCCACTCT TGGGAGAAAC GTATGAATTA ATCAGGGAAG ATTTAGGATT CAGATTTATA 480 TCGGAACAGG TCAGTCACCA CCCCCCCATC AGTGCGTTCC ACTCGGAAGG TCTCAACCAT 540 GACTTCCTGT TCCATGGCTC CATCTACCCC AAGCTCAAGT TCTGGGGCAA AAGCGTGGAG 600 GCGGAGCCCC GAGGCACCAT CACCCTGGAG CTGCTCAAAC ATAATGAAGC CTACACCTGG 660 ACCAACCCCA CCTGCTGCGT CCACAACGTC ATCATCGGGA AGCTGTGGAT AGAGCAGTAT 720 GGGACAGTGG AGATTTTAAA CCACAGAACT GGACATAAGT GTGTGCTTCA CTTTAAACCG 780 TGTGGATTAT TTGGAAAAGA ACTTCACAAG GTGGAAGGAC ACATTCAAGA CAAAAACAAA 840 AAGAAGCTCT TTATGATCTA TGGCAAATGG ACGGAATGTT TGTGGGGCAT AGATCCTGTT 900 TCGTATGAAT CCTTCAAGAA GCAGGAGAGG AGAGGTGACC ACCTGAGAAA GGCCAAGCTG 960 GATGAAGACT CCGGGAAGGC TGACAGCGAC GTGGCTGACG ACGTGCCTGT GGCCCAGGAG 1020 ACCGTGCAGG TCATTCCTGG CAGCAAGCTG CTCTGGAGGA TCAACACCCG GCCCCCCAAC 1080 TCTGCCCAGA TGTATAATTT CACCAGTTTC ACTGTGAGCC TCAACGAGCT GGAGACAGGC 1140 ATGGAGAAGA CCCTGCCACC CACGGACTGC CGCCTGCGCC CTGACATCCG CGGCATGGAG 1200 AATGGCAACA TGGATCTGGC CAGCCAGGAG AAGGAGCGGC TGGAGGAGAA GCAGAGAGAA 1260 GCACGGAGGG AGCGGGCCAA GGAGGAGGCA GAGTGGCAGA CGAGGTGGTT CTACCCAGGC 1320 AATAACCCCT ACACTGGGAC CCCCGACTGG TTGTATGCAG GGGATTACTT TGAGCGGAAT 1380 TTCTCCGACT GCCCAGATAT CTACTGA 1407 配列の数：１配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３配列の長さ：3879塩基配列の型：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：核酸配列 CCGAGGGACC CGCGTCCAGA TCTTCAGTGT CTATTGGATT TTTCCAAGAG AAAGTTTGTA 60 AAATTCCTTA CACTGTAGAT GTGGATCAGA TACGATGATT CAGTAGAAGA GCACATGTCA 120 GGGGCAGTGG AGGCT 135 GGC TGC TGA AGG ATG AAC GGA GAG GAA GAA TTC TTT GAT GCC GTC 180 Met Asn Gly Glu Glu Glu Phe Phe Asp Ala Val ACA GAG GCA AAT CAG AAA GTC ACG GGA ATG ATT GAC TTA GAC ACC 225 Thr Glu Ala Asn Gln Lys Val Thr Gly Met Ile Asp Leu Asp Thr AGC AAA AAT AAT AGG ATT GGG AAA ACT GGG GAG AGG CCC TCT CAA 270 Ser Lys Asn Asn Arg Ile Gly Lys Thr Gly Glu Arg Pro Ser Gln GAG AAC GGA ATT CAG AAA CAC AGG ACA TCG CTG CCG GCT CCC ATG 315 Glu Asn Gly Ile Gln Lys His Arg Thr Ser Leu Pro Ala Pro Met TTC AGC AGA AGC GAC TTC AGC GTG TGG ACC ATC CTG AAG AAG TGT 360 Phe Ser Arg Ser Asp Phe Ser Val Trp Thr Ile Leu Lys Lys Cys GTT GGC CTG GAG CTG TCC AAG ATC ACG ATG CCA ATC GCC TTC AAC 405 Val Gly Leu Glu Leu Ser Lys Ile Thr Met Pro Ile Ala Phe Asn GAG CCT CTG AGC TTC TTG CAG CGG ATC ACG GAG TAC ATG GAG CAC 450 Glu Pro Leu Ser Phe Leu Gln Arg Ile Thr Glu Tyr Met Glu His GTG TAC CTC ATC CAC AGG GCC TCC TGC CAG CCC CAG CCC CTG GAG 495 Val Tyr Leu Ile His Arg Ala Ser Cys Gln Pro Gln Pro Leu Glu AGG ATG CAG TCT GTG GCT GCT TTT GCT GTT TCG GCT GTG GCT TCC 540 Arg Met Gln Ser Val Ala Ala Phe Ala Val Ser Ala Val Ala Ser CAG TGG GAG AGG ACC GGC AAA CCA TTT AAT CCA CTC TTG GGA GAA 585 Gln Trp Glu Arg Thr Gly Lys Pro Phe Asn Pro Leu Leu Gly Glu ACG TAT GAA TTA ATC AGG GAA GAT TTA GGA TTC AGA TTT ATA TCG 630 Thr Tyr Glu Leu Ile Arg Glu Asp Leu Gly Phe Arg Phe Ile Ser GAA CAG GTC AGT CAC CAC CCC CCC ATC AGT GCG TTC CAC TCG GAA 675 Glu Gln Val Ser His His Pro Pro Ile Ser Ala Phe His Ser Glu GGT CTC AAC CAT GAC TTC CTG TTC CAT GGC TCC ATC TAC CCC AAG 720 Gly Leu Asn His Asp Phe Leu Phe His Gly Ser Ile Tyr Pro Lys CTC AAG TTC TGG GGC AAA AGC GTG GAG GCG GAG CCC CGA GGC ACC 765 Leu Lys Phe Trp Gly Lys Ser Val Glu Ala Glu Pro Arg Gly Thr ATC ACC CTG GAG CTG CTC AAA CAT AAT GAA GCC TAC ACC TGG ACC 810 Ile Thr Leu Glu Leu Leu Lys His Asn Glu Ala Tyr Thr Trp Thr AAC CCC ACC TGC TGC GTC CAC AAC GTC ATC ATC GGG AAG CTG TGG 855 Asn Pro Thr Cys Cys Val His Asn Val Ile Ile Gly Lys Leu Trp ATA GAG CAG TAT GGG ACA GTG GAG ATT TTA AAC CAC AGA ACT GGA 900 Ile Glu Gln Tyr Gly Thr Val Glu Ile Leu Asn His Arg Thr Gly CAT AAG TGT GTG CTT CAC TTT AAA CCG TGT GGA TTA TTT GGA AAA 945 His Lys Cys Val Leu His Phe Lys Pro Cys Gly Leu Phe Gly Lys GAA CTT CAC AAG GTG GAA GGA CAC ATT CAA GAC AAA AAC AAA AAG 990 Glu Leu His Lys Val Glu Gly His Ile Gln Asp Lys Asn Lys Lys AAG CTC TTT ATG ATC TAT GGC AAA TGG ACG GAA TGT TTG TGG GGC 1035 Lys Leu Phe Met Ile Tyr Gly Lys Trp Thr Glu Cys Leu Trp Gly ATA GAT CCT GTT TCG TAT GAA TCC TTC AAG AAG CAG GAG AGG AGA 1080 Ile Asp Pro Val Ser Tyr Glu Ser Phe Lys Lys Gln Glu Arg Arg GGT GAC CAC CTG AGA AAG GCC AAG CTG GAT GAA GAC TCC GGG AAG 1125 Gly Asp His Leu Arg Lys Ala Lys Leu Asp Glu Asp Ser Gly Lys GCT GAC AGC GAC GTG GCT GAC GAC GTG CCT GTG GCC CAG GAG ACC 1170 Ala Asp Ser Asp Val Ala Asp Asp Val Pro Val Ala Gln Glu Thr GTG CAG GTC ATT CCT GGC AGC AAG CTG CTC TGG AGG ATC AAC ACC 1215 Val Gln Val Ile Pro Gly Ser Lys Leu Leu Trp Arg Ile Asn Thr CGG CCC CCC AAC TCT GCC CAG ATG TAT AAT TTC ACC AGT TTC ACT 1260 Arg Pro Pro Asn Ser Ala Gln Met Tyr Asn Phe Thr Ser Phe Thr GTG AGC CTC AAC GAG CTG GAG ACA GGC ATG GAG AAG ACC CTG CCA 1305 Val Ser Leu Asn Glu Leu Glu Thr Gly Met Glu Lys Thr Leu Pro CCC ACG GAC TGC CGC CTG CGC CCT GAC ATC CGC GGC ATG GAG AAT 1350 Pro Thr Asp Cys Arg Leu Arg Pro Asp Ile Arg Gly Met Glu Asn GGC AAC ATG GAT CTG GCC AGC CAG GAG AAG GAG CGG CTG GAG GAG 1395 Gly Asn Met Asp Leu Ala Ser Gln Glu Lys Glu Arg Leu Glu Glu AAG CAG AGA GAA GCA CGG AGG GAG CGG GCC AAG GAG GAG GCA GAG 1440 Lys Gln Arg Glu Ala Arg Arg Glu Arg Ala Lys Glu Glu Ala Glu TGG CAG ACG AGG TGG TTC TAC CCA GGC AAT AAC CCC TAC ACT GGG 1485 Trp Gln Thr Arg Trp Phe Tyr Pro Gly Asn Asn Pro Tyr Thr Gly ACC CCC GAC TGG TTG TAT GCA GGG GAT TAC TTT GAG CGG AAT TTC 1530 Thr Pro Asp Trp Leu Tyr Ala Gly Asp Tyr Phe Glu Arg Asn Phe TCC GAC TGC CCA GAT ATC TAC TGA GGG CCT GGA GGG GCC TGG GGC 1575 Ser Asp Cys Pro Asp Ile Tyr CCGGGACCGG AGGCTGACGA GGCTGGACTT CCTCGAGTGG CCATTGTGAG CCTCGTCACA 1635 GCAGAAACCA ACTTTTCTAA CGACTGAGTT CGCGGAGATA GCATCATCCC TGATCAAGGA 1695 TGTAATTCTA ATTAACTGTT GATTGCCAAA CATTTCACTC TGCTGTGCCG TCTCTTCATA 1755 AAGCTTCACT TGGGATCATC GTCTTCATTA AGGTTTCAAC AGGGAAATTC TTCACGGCGC 1815 CCTTTTATGT GGCAGAAATC AGCTGGGGCT TGTTTAGCTT CCAGCACACT CTCAGTCATA 1875 GCATGTGTAG CTAAAGGAAG TAATGGGAAG GGGTTCATGT TCTCTTTATA ATGCAGTGGC 1935 AAAAGGTTCT GAAAGCCTTT TAAACTCGAA CCAGTGGGGG AAAGATGGAT CTTGAAGCTA 1995 ATCCTGCAGA GAGTTTTATA GAGGCCAGGG ATTGCCTTCT AAATTATGAT AAAACAGAAG 2055 TGAAGAGTTT CAGAGCATCA GATTGAGTGA AAAGTTGTCA GATTCTGTAT TTTTTAACAA 2115 TCTTCAATAA TGTAAAGATT ACTTTTAAAA TATTTAAGTT AAAACTACTT GAATAGTATT 2175 TTGCTGAAGA GCAAGATATG CATTAATCAC CGGTTTTATA CTGTCCAAAA TGAAGCATCC 2235 CCGTGACAAA CCAGAGTGGG CAGAAGCATC GAGAGCGTGA CAGGAAATCC CAAGACTGCT 2295 TCCGCCTCAG AGGCGTCCCG GCTGCGATTC GCTGCCCTGT TGTCAGTGAG GCCTGGCTGT 2355 CACCGCACAC CGCGTCCGTG TCTCCAGGGG GTTCCTTTCT TCTCACACGT CGCGTGTACC 2415 CATAGCACTC TTGTGTTTCT GTTTTTCCCA GTATGCATGT TTAAAATAGA AGTGACAAGA 2475 ATCACATCCG GTTGTGTCCT GTGGGAGGGT CAGAGGCAGA ATCTACTTAC AGTGGTGTAA 2535 TTAAAGTTAT TTAACCAAAA ATAGGTATGT GTCCATCTCA GCATTCACCT TTATCAAGTG 2595 ACTGATTTTT TTTTCTTTTC TTTCCTTTTT TTTTTTTTTT TGAGACGGAG TTTCACTCTT 2655 GTTGCCCAGG CTGGAGTGCA ATGGCATGAT CTCGGCTCAC CGCAACCTCC GCCTCCCGGG 2715 TTCAAGCGAT TCTCCTGCCT CAGCCTCCCA AGTAGCTGGG ATTACAGGCA CGCGCCACCA 2775 CGCCTGGCTG ATTTTGTATT TTTAGTAGAC ACGGGTTTTC ACCATGTTGG TCAGGCTGGT 2835 CTCAAACTCC CGACCTCAAG TAGTCTGCCT GCCTCAACCT CCCAAAGTGC TGGGATTACA 2895 GGCGTGAGCC ACTGCGCCTG GCCGTGACTG ATTTTTTTTC ATGTAGAATT GTCAACACGA 2955 GAGATCACAG TGGAGCACTT TGAAAGACCG TCGGTTGTGT GCACGCACGC ACACACTCAT 3015 GCACACGCTG ACACGCGGTT GCATGGAGTC CAGGTTACTC AGGCCGGCAC TTCTGAGTGA 3075 CAGGTGCCAC CTGCGTGTGT CTTGGCGTCC ACATCACACC TGTGACGGAA GCACTTCTGG 3135 AAGTGAACAC TCGTTTTGAA AGCTTGATTT TGTAGCTTTG GAAGCTGGAA GCGATGGTGT 3195 TTGGTGCCGA GTCCTGTGTC ATCCTCGGGG CCTATGAGCT CCGTACCAGC CACTCAAAAG 3255 TGTCTGAACA GAACCGCTCC GTGACTGGTA GCTGGGTCTG AGGATTCAGG ATTGTGGCGT 3315 TATTCAAAGA GGAGACTTTG AAATTCCCCG ATGGCTGGAA TGTGGAGCCC AGGTGCCTCT 3375 GGTGGAGGGT CATCTGCTTT TCCAGACTGT GGTTGTGAAC CGGCTCCTTC TCCAAGAAAG 3435 GTTGCAAGCT AGAACATCCA GAGGTGAGAC TCAGACACAT TGAAAGTGAC TGCATTTAGG 3495 GAGGTTTAAC GAGTTCTTAC TGATCATTCC ACTTGTTACT GGTTAAGATA ATTTGCCCAC 3555 GGGTTTGTTT CCAAGTCCTC TTCTAGGACC AGGCTCCTGG TATTTCAGGG GCTGGTTGGC 3615 TGCACAGACA GCCCCTCTTC TGCTGTCCTT GAGGACAGAC ACCAAACCAG AGGTGGAGGA 3675 AGAACGGTAG GAAGGCTGAT GGCAAAAGCG GCTGTGTGTC GAGGTTATTT TAACTTTTTA 3735 CTACTTTTTG TTACTGTTTC TGCAAATGCT AACACATAAA CCATGACCTA ACTTTTGTCA 3795 CCTTGGATAT CTATTGAATG TTAAACATCT CTAATAAAGA TGGCCACCAC TTAATGTGTG 3855 GAAAGTGATG GCCTTCTCGT GGGC 3879

【図面の簡単な説明】

【図１】ＯＳＢＰと、本発明であるＯＳＢＨとのアミノ
酸配列の相同性の比較を示す。

【図２】ｏｓｂｈを用いてin vitroトランスレーション
法により発現させたＯＳＢＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者長瀬隆弘千葉県木更津市矢那1532番３号財団法人かずさディー・エヌ・エー研究所内 (72)発明者野村信夫千葉県木更津市矢那1532番３号財団法人かずさディー・エヌ・エー研究所内 (72)発明者高山喜好東京都豊島区高田３丁目24番１号大正製薬株式会社内 (72)発明者豊田均東京都豊島区高田３丁目24番１号大正製薬株式会社内 (72)発明者吉本真東京都豊島区高田３丁目24番１号大正製薬株式会社内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA50 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 GA18 HA01 4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 4C084 AA07 BA01 BA08 BA22 CA28 CA53 DC50 NA14 ZA362 ZA402 ZA452 ZC412 4H045 AA10 BA10 CA45 EA23 FA74 HA05 HA06

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
質；（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつオキシステロール結合活性を有す
る蛋白質。
【請求項２】以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ（ａ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）配列番号：２のＤＮＡとストリンジェントな条件
でハイブリダイズし、かつオキシステロール結合活性を
有する蛋白質をコードするＤＮＡ。