JPH10502809A

JPH10502809A - 組換えｋａｔ酵素およびその調製方法

Info

Publication number: JPH10502809A
Application number: JP8504310A
Authority: JP
Inventors: ルーカベナッティ，; ジェロームブレトン，; カルメーラスペチィアーレ，; 悦生奥野; ロバートシュワルズ，; モニーカモスカ，
Original assignee: ユニバーシティオブメリーランドアットボルティモア; ファルマチーアアンドアップジョンエッセ．ピー．アー．
Priority date: 1994-07-07
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 1998-03-17
Also published as: WO1996001893A1; US5817496A; EP0775200A4; CA2194447A1; EP0775200A1; US6136572A

Abstract

(57)【要約】 (a)ラットKATをコードする単離されたDNA配列；(b)上記(a)の単離されたDNA配列にハイブリダイズし、そして哺乳動物KAT酵素をコードする、単離されたDNA配列；および(c)遺伝コードの縮重のため、コドン配列が上記(a)および(b)の単離されたDNA配列とは異なり、そしてKAT酵素をコードする、単離されたDNA配列：からなる群より選択されるキヌレニンアミノトランスフェラーゼをコードする単離されたDNA配列が開示される。これを含むベクターおよび宿主細胞、キヌレニンアミノトランスフェラーゼを同定するためのオリゴヌクレオチドプローブ、および単離かつ精製されたキヌレニンアミノトランスフェラーゼもまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】組換えKAT酵素およびその調製方法発明の分野本願発明は、キヌレニンアミノトランスフェラーゼをコードするDNA配列に関する。発明の背景酵素キヌレニンアミノトランスフェラーゼ(当業者にはKATとして知られている )はキヌレニン(KYN)からのキヌレン酸(KYNA)の生合成を触媒し、特異的に脳内の細胞外KYNA濃度の調節に関与している(J．Neurochem.，57:533-540(1991))。 KYNAは、有効な興奮性アミノ酸(EAA)レセプターアンタゴニストであり、N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)レセプター複合体のグリシン調節部位に特に高い親和性を有している(J．Neurochem.，52:1319-1328(1989))。天然に生じる脳の代謝物(J．Neurochem.，51:177-180(1988)；およびBrain Res.，454:164-169(19 88))として、KYNAは、おそらく、脳グルタミン酸作動性機能の負の内因性モジュレーターとして作用しているであろう(Ann．N.Y. Acad．Sci.，648:140-153(199 2))。 EAAレセプターおよび特にNMDAレセプターは、哺乳動物の脳の機能において中心的な役割を果たしていることが知られている(Watkinsら、The NMDA Receptor, 242頁,（1989）Oxford University Press編，Oxford)。例えば、NMDAレセプター活性化は、例えば、学習と記憶のような認知プロセス(Watkinsら、The NMDA Rec eptor ,137-151頁,（1989）Oxford University press編，Oxford)および脳の発達 (Trends Pharmacol．Sci.，11:290-296(1990))に必須である。 NMDAレセプター機能の減少が脳の生理機能に悪影響を与え、そして、その結果として、生物全体に悪影響を与える。例えば、高齢の脳で起こるNMDAレセプターの数の減少(Synapse，6:343-388(1990))は、高齢に伴う認知機能障害と関連するようである。脳においては、KYNA濃度およびKYNAの生合成酵素KATの活性は、年齢とともに顕著な増加を示す(Brain Res.，558:1-5(1992);およびNeurosci. Lett.，94:145 -150(1988))。KATインヒビターは、NMDAレセプターにおいてグルタミン酸作動性の正調(tone)を増加させることによって、NMDAレセプター機能が不十分な状況下で、および/またはKAT活性ならびにKYNAレベルが異常に増加した状況下で特に有用となり得る。従って、KATインヒビターは、脳の老化プロセスと関連する病的な結果、例えば、老齢個体における注意力欠損および記憶力欠損ならびに警戒障害を含む認知障害の処置において特に有用であり得る。 KATインヒビターはまた、周生期(perinatal)の脳障害の処置に有用であり得る。この障害は生後のKAT発達の特徴的な領域特異的パターンの不規則性に関連しているようである(Baranら、Dev．Brain Res.，74:283-286(1993))。細胞以下レベルの分画研究において、KAT活性は細胞質ゾルにおいて、あるいはミトコンドリアにおいてのいずれかで回収された(J．Neurochem.，前出)。核にコードされたミトコンドリアタンパク質のほとんどの前駆体は、アミノ末端にプレ配列を有している(Pfannerら、Current Topics in Bioenergetics，15: 177-219(1987); Lee編，New York Academic Press；およびNicholsonら、Protei n Transfer and Organelle Biogenesis，DasおよびRobins編，New York Academi c Press(1988))。これらのプレ配列は、この前駆体がミトコンドリアのマトリックスに入るのに必要とされ、そこで、タンパク質分解的に取り除かれる(Hurtら、FEBS Lett.，178:306(1984); Horwichら、EMBO J.，4:1129(1985))。この切断は移入を終了させるためには必須ではないが、新たに移入されたポリペプチドが機能的な複合体にさらに組み立てられるのに必要である。(Zwizinskiら、J.Biol ．Chem.，258:13340(1983); Lewinら、J．Biol．Chem.，258:6750(1983); Ouら、J．Biochem.，100:1287(1986))。前駆体ターゲティング配列はその構造が大きく異なる。少ない共通のテーマの一つは、正に帯電したアミノ酸とヒドロキシル化されたアミノ酸の含量が高いことである。プレ配列は、α-ヘリックスかβ-シートのいずれかの形態で、両親媒性の構造を形成し得る。(von Heijneら、EMBO J .，5:1335(1986); Roiseら、EMBO J.，5:1327(1986)；およびVassarottiら、EM BO J.，6:705(1987))。ミトコンドリアリーダーペプチド配列に大きな可変性があるにも係わらず、相対的に少さな改変により、プロセシングペプチダーゼによる切断が妨げられ得る(Hurtら、J．Biol．Chem.，262:1420(1987))。これは、別(しかし、現在まで未定義)の構造因子が切断に要求されることを示唆している。同様に、切断部位は、一つの生物の中の異なる前駆体の間でも、および異なる生物の前駆体の間でも大きな変化を示す。興味あることに、Gavelらに記載されたタンパク質のアルゴリズム(Protein En gineering，4:33-37(1990))を用いて、潜在的なミトコンドリアの遷移ペプチドが、本願発明に開示されているcDNA-2の推定タンパク質の１から24位にあるか、 cDNA-3の推定タンパク質の１から44位にあることが、予測される(図３〜４および実施例３を参照のこと)。最近、Perryらはラット腎臓細胞質ゾルシステイン結合β-リアーゼをコードするcDNAのクローニングを報告した(Mol．Pharm.，43:66 0-665(1993))。このcDNAが発現ベクターpVS1000に挿入され、COS-1組織培養細胞にトランスフェクトされたときに、細胞質ゾルのβ-リアーゼ活性およびグルタミントランスアミナーゼＫ活性の7〜10倍の増加が検出された。ラットβリアーゼの推定アミノ酸配列は、cDNA-1(ラットKAT)の推定アミノ酸配列と、２つの残基を除き、同一であった(図２を参照のこと)。さらに、cDNA-2およびcDNA-3の存在は、Perryら(Mol．Pharm.，前出)には報告されていなかった。さらに最近においてさえも、Perryら(FEBS Lett.，360:277-280(1995))は、ヒト腎臓システイン結合β-リアーゼのcDNAのクローニングを報告しているが、その配列は、この特許出願に記載されているヒトKATの配列と同一である。システイン結合β-リアーゼおよびグルタミントランスアミナーゼＫとの同一性が十分に文献に示されている(Abrahamら、Analytical Biochem.，197:421-427(1991)) にもかかわらず、キヌレニントランスアミナーゼが、β-リアーゼまたはグルタミントランスアミナーゼＫと同一であることを示す報告はない。発明の要約哺乳動物のキヌレニンアミノトランスフェラーゼのクローニングについて報告する。本願発明の第１の局面は、KAT酵素をコードする単離されたDNA配列に関する。このDNA配列は、(a)ラットKATをコードする単離されたDNA配列；(b)上記(a)の単離されたDNA配列とハイブリダイズし、そして哺乳動物KAT酵素をコードする単離されたDNA配列；および(c)上記(a)および(b)の単離されたDNA配列とは遺伝子コードの縮重のためにコドン配列が異なり、そしてKAT酵素をコードする単離されたDNA配列；からなる群から選択される。本願発明の第２の局面は、上記クローンされたDNA配列を含むベクターである。本願発明の第３の局面は、上記ベクターで形質転換された宿主細胞である。本願発明の第４の局面は、KAT酵素をコードする遺伝子の一部分を有するDNAと選択的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブである。本願発明の第５の局面は、単離され精製されたKAT酵素に関し、この酵素は、( a)ラットKATをコードする単離されたDNA配列；(b)上記(a)の単離されたDNA配列とハイブリダイズし、そして哺乳動物KAT酵素をコードする単離されたDNA配列；および(c)上記(a)および(b)の単離されたDNA配列とは遺伝子コードの縮重のためにコドン配列が異なり、そしてKAT酵素をコードする単離されたDNA配列；からなる群から選択されるDNA配列にコードされている。図面の簡単な説明図１はラットKATの部分アミノ酸配列を示す：成熟KATのN-末端(配列番号14)、 CNBrフラグメント(配列番号15)、KATのトリプシンフラグメント112(配列番号16) 、およびKATのトリプシンフラグメント130(配列番号17)。図2A〜2Cは、ラットのKAT(cDNA-1)のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列(配列番号18)を示す。想定されるピリドキサルホスフェート結合部位Ser-Ala- Gly-Lys-Ser-Pheを下線で示す。ラットのβ-リアーゼcDNA(Perryら、前出)とは異なるトリプレットを四角で囲った。図3A〜3Dは、ラットのKAT(cDNA-2)のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列(配列番号19)を示す。２つのタンパク質は合成され得る：一つはヌクレオチド 619から始まり、想定されるミトコンドリアターゲティング配列を含み、他方は、cDNA-1の場合と同じATG開始コドンで始まる。想定されるピリドキサルホスフェート結合部位Ser-Ala-Gly-Lys-Ser-Pheを下線で示す。ラットのβ-リアーゼcD NA (Perryら、前出)とは異なるトリプレットを四角で囲った。図4A〜4Dは、ラットのKAT(cDNA-3)のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列(配列番号５)を示す。cDNA-3の配列は、cDNA-1の配列と、5'非翻訳領域に208 塩基対の挿入があることを除いて同じであった。この挿入によって、cDNA-1の推定タンパク質配列にインフレームで34個のアミノ酸が付加的に伸長した。この20 8塩基対の挿入は、cDNA-1配列のヌクレオチド237と238の間で起こる。図5Aおよび5Bは、トランスフェクトされたCOS-1細胞中の細胞質ゾル酵素活性を示す：5A、グルタミントランスアミナーゼＫ活性；5B、キヌレニントランスアミナーゼ活性。センス：pSVL-KATでトランスフェクトされたCOS-1細胞は、cDNA- 1がセンス方向である。アンチセンス：pSVL-KATでトランスフェクトされたCOS-1 細胞は、cDNA-1が逆方向である。それぞれの値は、３つの別個の実験の平均である。図６はヒトKAT Iの部分アミノ酸配列を示す：ヒトKAT Iのトリプシンフラグメント、F11(配列番号２)；F13(配列番号３)；F14(配列番号４)。図7A-7CはヒトKAT Iのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列(配列番号１) を示す。発明の詳細な説明本願明細書で開示されるアミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向に、左から右に表されている。アミノ基およびカルボキシル基は配列中には示していない。本願明細書においてヌクレオチド配列は、5'から3'の方向に、左から右に一本鎖だけで表されている。本願明細書においてヌクレオチドおよびアミノ酸はIU PAC-IUB バイオケミカル命名委員会により推奨される方法で表されるか、(アミノ酸に関しては)３文字コードで表される。本発明のキヌレニンアミノトランスフェラーゼ酵素は、本願明細書に記載されたヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質と相同性があり、そして本質的に同じ生物学的性質を有するタンパク質を含む。この定義は、KAT配列の天然のアレル変異体を包含することを意図する。本発明のクローン化された遺伝子は、あらゆる起源の種のKATをコードし得るが、好ましくは哺乳動物起源の酵素をコードする。従って、図2A〜2C(配列番号1 8)、図3A〜3D(配列番号19)、図4A〜4D(配列番号５)および図7A〜7C(配列番号１) 中に示される配列とハイブリダイズし、KATの発現をコードするDNA配列もまた、本発明の一局面である。KATの発現をコードする他のDNA配列が、図2A〜2C(配列番号18)、図3A〜3D(配列番号19)、図4A〜4D(配列番号5)および図7A〜7C(配列番号１)中に示される配列とハイブリダイズすることを許容する条件は、通常の方法で決定され得る。さらに、図2A〜2C(配列番号18)、図3A〜3D(配列番号19)、図 4A〜4D(配列番号５)および図7A〜7C(配列番号１)に示される配列でコードされるポリペプチドをコードするDNA配列、またはこれらにハイブリダイズしKAT酵素をコードするが、遺伝子コードの縮重のためにこれらの配列とコドン配列が異なる配列もまた、本発明の一局面である。遺伝子コードの縮重は、同じタンパク質またはペプチドをコードする異なる核酸配列を許容し、文献で周知である。例えば、Tooleら、米国特許第4,757,006号の第２欄、表１を参照のこと。 KAT酵素をコードするDNAは、当該技術分野の専門家に周知の種々の方法により得られ得、例えば、Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第２版、Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)に記載されている。例えば、KAT酵素をコードするDNAは、本願明細書に開示されるKAT酵素遺伝子配列の情報から生じるオリゴヌクレオチドプローブを用いて、mRNAあるいはゲノムDNAをスクリーニングすることにより、得られ得る。プローブは、公知の手順に従って、例えば蛍光基、放射性原子、または化学発光基などの検出し得る基で標識され得、そして、例えば、Maniatisら(前出)に記載されるように、通常のハイブリダイゼーションアッセイに用いられ得る。 KAT遺伝子配列は、また、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)手順を用いて回収され得、これは本願明細書に記載のPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いるか、本願明細書で提供されるKAT酵素配列から生産されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行う。Mullisら、米国特許第4,683,195号；およびMullis、米国特許第4,683,202号を参照のこと。PCR反応は、特定の核酸配列が以前精製されたことがなく、そして特定のサンプル中でたった一つのコピーでしか存在しない場合でさえ、この核酸配列の濃度を選択的に増加させる方法を提供する。この方法は、一本鎖 DNAか二本鎖DNAのいずれかを増幅するのに用いられ得る。この方法の本質は、所望の核酸分子の鋳型依存性ポリメラーゼ仲介複製のためのプライマーとして働く２つのオリゴヌクレオチドプローブを使用することを含んでいる。本発明の組換えDNA分子は、当該技術分野の専門家に周知の種々の任意の方法、および、例えば、Maniatisら(前出)に記載されている方法により作成され得る。KAT酵素DNA配列を複製するために、このDNAは適切なベクターにクローン化されなければならない。ベクターは複製可能なDNA構築物である。ベクターは、KAT 酵素をコードするDNAを増幅するか、そして/またはKAT酵素をコードするDNAを発現するために本願発明で用いられる。発現ベクターは、複製可能なDNA構築物であって、そこでは、KAT酵素をコードするDNA配列が、適切な宿主細胞内でKAT酵素の発現をもたらすことができる適切な制御配列に作動可能に連結している。DN A領域は、互いに機能的に関連するとき、作動可能に連結している。例えば、プロモーターは、これがコード配列の転写を制御するときに、コード配列に作動可能に連結している。増幅ベクターは発現制御ドメインを必要としない。必要とするものは、宿主中で複製する能力(これは通常、複製開始点により与えられる)、および形質転換株の確認を容易にし得る選択遺伝子である。 KAT酵素をコードするDNA配列は、通常の技術に従って、ベクターDNAと組換えられ得るが、この通常の技術は、連結のための末端の平滑末端化またはずらせた (staggered)末端化、適切な末端を提供するための制限酵素切断、適切な粘着末端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および適切なリガーゼを用いる連結を含む。これらの操作の技術はManiatisら(前出) に記載されており、当該分野で周知である。クローン化された配列の発現は、発現ベクターが適切な宿主細胞に導入されたときに起こる。原核細胞の発現ベクターを用いたとき、適切な宿主細胞は、クローン化された配列を発現し得る任意の原核細胞、例えば、E.coliである。同様に、真核細胞の発現ベクターを用いたとき、適切な宿主細胞は、クローン化された配列を発現し得る任意の真核細胞である。酵母宿主、例えばS．cerevisiaeが用いられ得る。あるいは、昆虫細胞用いられ得、この場合バキュロウイルスベクター系が適切である。他の宿主は哺乳動物細胞株、例えば、COS-1細胞である。発現ベクターへの制御配列の必要性は、選択した宿主および選択した形質転換方法に依存して異なる。一般的に、制御配列は、転写プロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。本発明を実施するのに有用なベクターは、プラスミド、ウイルス(ファージを含む)、レトロウイルス、および組み込み可能なDNAフラグメント(すなわち、相同組換えにより宿主のゲノムに組み込み可能なフラグメント)を含む。ベクターは宿主のゲノムとは独立して複製および機能するか、または、ある場合は、ゲノム自体の中に組み込まれ得る。発現ベクターは、宿主生物により認識されるプロモーターを含むべきである。本発明のプロモーター配列は原核性、真核性またはウイルス性のいずれかであり得る。適切な原核性の配列の例は、バクテリオファージλのP_RおよびP_Lプロモーター(Hershey，The Bacteriophage Lambda，Cold Spring Harbor Press編，Cold Spring Harbor，NY(1973);およびHendrix，Lambda II，Cold Spring Harbor Pr ess編，Cold Spring Harbor，NY(1980)); E.coliのtrp、recA、熱ショック、およびLacZ プロモーターならびにSV40初期プロモーター(Benoistら、Nature，290 :304-310(1981))を含む。シャイン-ダルガルノ配列に関する限り、適切な調節配列の好ましい例は、MS- 2ファージのレプリカーゼ遺伝子のシャイン-ダルガルノ、およびバクテリオファージλのcII遺伝子のシャイン-ダルガルノに代表される。シャイン-ダルガルノ配列にはKATをコードするDNAが直接続き得、そして成熟KATタンパク質の発現が生じ得る。あるいは、KATをコードするDNAにはキャリアペプチド配列をコードするDNA配列が続き得る。この場合、KATのＮ末端がキャリアペプチドに融合された融合タンパク質が生成され、これによりタンパク質発現レベルおよび細胞内安定性の増加が促進され得、そして精製の簡易な手段を提供し得る。好ましいキャリアペプチドとしては、StaphylococcusのプロテインＡの１つ以上のIgG結合ドメインが挙げられる。プロテインＡのIgG結合ドメインを含む融合タンパク質は、例えばI gG結合セファロースでのアフィニティークロマトグラフィーにより容易に均質に精製される。エンテロキナーゼ、第Ｘ因子またはプロコラーゲナーゼのようなタンパク質分解酵素の認識部位をコードするDNA配列は、KATの配列のすぐ上流に配置されて、融合タンパク質の切断を可能にし、成熟KATタンパク質が得られ得る。さらに、適切な発現ベクターは、形質転換された宿主細胞のスクリーニングを可能にする適切なマーカーを含む。選択された宿主の形質転換は、当業者に周知であり、Maniatisら(前出)に記載の種々の技術のいずれかを用いて行われる。本発明のさらなる１つの実施態様は、上記発現ベクターで形質転換され、そして適切な培養条件下で本発明のKATを産生し得る原核生物宿主細胞である。多細胞生物由来の細胞培養物が組換えKAT合成のための望ましい宿主である。原則的に、脊椎動物培養物由来または昆虫細胞を包含する無脊椎動物培養物由来にかかわらず任意の真核細胞培養物が使用可能である。細胞培養におけるこのような細胞の増殖はルーチンな手順となっている。Kruseら編、Tissue Culture、A cademic Press(1973)を参照されたい。有用な宿主細胞株の例は、HeLa細胞、CHO およびCOS細胞株である。脊椎動物細胞および無脊椎動物細胞の形質転換の際に使用される発現ベクター中の転写および翻訳制御配列は、しばしばウイルス供給源から提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは２型アデノウイルス、ポリオーマおよびSV40に由来する。例えば、米国特許第4,599,308号を参照されたい。複製起点は、外因性起点を含むベクターの構築または宿主細胞染色体複製機構のいずれかにより提供され得る。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれる場合、後者で十分であり得る。ウイルスの複製起点を含むベクターを使用するのではなく、選択マーカーとKA T DNAとの同時形質転換方法により哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レグターゼ(DHFR)またはチミジンキナーゼである。米国特許第4,399,216号を参照されたい。本発明のクローン化遺伝子およびベクターは、通常KATを発現しない細胞を形質転換し、その後この酵素を発現させるのに有用である。このような細胞は、薬物スクリーニングに有用な組換えKAT調製物の製造のための中間体として有用である。さらに、本発明の遺伝子およびベクターは遺伝子治療において有用である。このような目的のために、Teminら、米国特許第4,650,764号およびMiller、米国特許第4,861,719号に記載されるようなアデノウイルスベクターならびにレトロウイルスベクターが使用され得る。本発明のクローン化遺伝子およびそれらに由来するオリゴヌクレオチドは、特定の疾患に関連する制限断片長多型(RFLP)のスクリーニングに有用である。本発明のオリゴヌクレオチドは、種々の組織中のKAT遺伝子発現をプローブするための診断ツールとして有用である。例えば組織は、この酵素の天然の発現またはこれに関連する病理学的状態を調査するために、従来のオートラジオグラフィー技術により検出基を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いてインサイチュでプローブされ得る。遺伝的に改変された(トランスフェクトされた)細胞は脳の移植に成功的に使用されている。KAT遺伝子でトランスフェクトされた細胞は、キヌレン酸(または他の任意のKAT産物；以下参照)を脳に送達するのに有用であり得る。これは、キヌレニン(またはKATの任意の適切な基質；以下参照)の末梢投与を介するキヌレン酸の血液−脳関門を回避する魅力的な手段であると判明し得る。大量のKATを発現するトランスフェクトされた細胞はまた、神経活性を有するキヌレン酸アナログの生成に有用である。例えば、KATは、強力なNMDAレセプターアンタゴニストであり神経保護物質(neuroprotectant)である7-クロロキヌレン酸をその生体前駆体(bioprecursor)L-4-クロロキヌレニンから形成し得る(J.M ed ．Chem. 、37:334-336(1994)。本発明は以下の実施例においてより詳細に説明される。これらの実施例は本発明の例示であることが意図されており、そして本発明を限定するものとして構成されるべきでない。実施例１ラットKATのトリプシンフラグメントのアミノ酸配列タンパク質精製ラットKATを本質的にOkunoら、Brain Res.、534:37-44(1990)に記載のように調製した。Sephacryl S-200カラムから溶出した酵素を逆相カラム(SC18、250×4 .6mm、Japan Spectro．Co．Ltd)のHPLCにより分離した。溶媒Ａ(0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)中70％(vol/vol)アセトニトリル)および溶媒Ｂ(0.1％ TFA)のグラジエントを１ml/分の流速で40分間適用して溶出を行った。トリプシンおよびCNBr消化ならびにフラグメント精製 500pmolのHPLC精製したラットKATサンプルを、Hugli編、Techniques In Prote in Chemistry 、Academic Press，Inc.、377-391頁(1989)に記載のようにトリプシンにより消化し、そしてCNBrにより消化した。これらのサンプルを消化後逆相 HPLCに供し、そして得られるピークを回収した。アミノ酸配列分析配列分析を、本質的にFabbriniら、FEBS Lett.、286:91-94(1991)に記載のように行った。図１はラットKATの部分的なアミノ酸配列を示す：成熟KATのＮ末端 (配列番号14)、CNBrフラグメント(配列番号15)、KATのトリプシンフラグメント1 12(配列番号16)およびKATのトリプシンフラグメント130(配列番号17)。実施例２ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)クローニング RNA 抽出ラット腎臓からの総RNAを、RNAzol^TM法(RNAzol-Cinna/Biotex Lab.、Texas、U .S.A.)の指示に従い少量の組織から抽出した。第１鎖cDNA合成第１鎖cDNAを、最終容量38.75ml中の２mgのオリゴポリdT(18pb)、４mlのdNTP (2.5mM)、８mlのAMV緩衝液(TrisHCl pH8.8 250mM/KCl 200mM/MgCl₂ 50mM/DTT 20 mM)を用いて３mgの総RNAから合成した。この溶液を65℃で３分間煮沸し、そして氷中に10分間置いた；0.75mlのRNAsin(40u/ml Promega)および0.5mlのAMV逆転写酵素(25u/ml Boehringer Mannheim、GmbH、Germany)を冷却溶液に加えた。反応を42℃で２時間行った。縮重オリゴヌクレオチドの設計および合成トリプシンフラグメント112および130のラットKAT一次構造における相対的位置は未知であったので、長さ26bpの４つの縮重オリゴヌクレオチドを設計し、そしてDNA/RNA合成機380B(Applied Biosystems)を用いて合成した。反応産物をSep hadex G50(Nap 25カラム、Pharmacia)で精製した。ペプチド配列Asn-Leu-Cys-Gln-Gln-His-Asp-Val-Val(フラグメント130(配列番号17)の残基７〜15)に基づく、センス方向オリゴヌクレオチド、OligoＡ：およびアンチセンス方向オリゴヌクレオチド、OligoＣ：ペプチド配列Asp-Gly-Ile-Asp-Gln-Asn-Leu-Ser-Val(フラグメント112(配列番号16)の残基３〜11)に基づく、センス方向オリゴヌクレオチド、OligoＢ：および対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド、OligoＤ：ポリメラーゼ連鎖反応条件第１鎖cDNAを２つのアリコートに分け以下に記載のようにPCRにより増幅した。２つのオリゴヌクレオチド混合物、PCR1：OligoＡおよびOligoＤ、ならびにPC R2：OligoＢおよびOligoＣをPCR反応のプライマーとして使用した。70ngのテンプレートcDNAを、10mgの各セットのプライマー、10mlの10×Taqポリメラーゼ緩衝液(500mM KCl/100mM Tris-HCl、pH8.3)、8mlの25mM MgCl₂、8mlのdNTP溶液(2.5m M dNTP)および0.5ml(2.5単位)のTaq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus)と合わせた。H₂Oで容量を100mlとし、そして混合物を鉱油で重層して蒸発を防止した。チューブを94℃で３分間加熱し、変性を94℃で３分間、アニーリングを60℃で２分間そしてポリメラーゼ反応を72℃で２分30秒間行った。このサイクルを30回繰り返した。特異的増幅産物はPCR１の場合でのみ観察された。この増幅産物は約550bpのDN A分子であった。このPCR1増幅産物を、SalIリンカーおよび５'側の余分のヌクレオチドを有する基本的にOligoＡおよびOligoＣと同一の配列の新たなオリゴのセットを用いて再増幅した。ペプチド130(配列番号17)をコードするヌクレオチドに相補的なOligoＥ：(GCTAGTCGACACNACRTCRTGYTGYTGRCANARRTT)(配列番号24)およびペプチド112(配列番号16)をコードするヌクレオチドに対応するOligoＦ： (GATCGTCGACGAYGGNATZGAYCARAAYYTNTCNGT)(配列番号25)。 PCR増幅の後、得られたDNAフラグメントを制限酵素Sal1で一晩消化し、そしてクローニングプラスミドpUC18(Yanisch-Perronら、Gene、33:103-119(1985))のS al1部位に連結した。組換えプラスミドを、Qiagen Plasmid Maxi Protocolの指示に従って抽出し、PEGで沈澱させ、そしてNaOH 2Nで変性させた。 Sequenase(United States Biochemicals Corp.、Cleveland、OH)を用い、ジデオキシチェーンターミネーション法(Sangerら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA、7 4 :5463-5467(1977))に従って、ユニバーサルおよび正方向プライマー、その後１連の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定を行った。挿入物の両鎖を配列決定したところ、196アミノ酸のオープンリーディングフレームが明らかになった。配列決定した２つのラットKATペプチドの一部は、対応する588bpのオープンリーディングフレームにコードされる。このオープンリーディングフレームを実施例３に記載するcDNAライブラリースクリーニングにおけるプローブとして用いる。実施例３ cDNA ライブラリースクリーニング λgt11ラット腎臓cDNAライブラリー(Clontec Laboratories、USA)の約500,000 の組換えファージを、E.coli Y1090細胞のローン上にプレートした。37℃で一晩増殖させた後、組換えファージを２連のニトロセルロースフィルターに移し、それらのDNAを、変性し、中和し、そして80℃で２時間、減圧下でベーキングした。プレハイブリダイゼーションを、６×SSC(１×SSC： )、５×デンハルト溶液(１×デンハルト： )、１％ SDS、200μg/mlサケ精子DNA中で60℃で４時間行った。次いで、フィルターを、約1.5×10⁶cpm/mlの標識プローブを加えた同じ混合物中で60℃で一晩ハイブリダイズした(実施例２を参照)。プローブを、Multiprime DNA標識システム(Amersham)により(³²P)dCTPで標識し、Nick Column(Pharmacia)で精製し、そしてハイブリダイズ溶液に加えた。フィルターを60℃で、２×SSC、0.1％SDS中で２回洗浄し、そして１×SSC、１％SDS中で1回洗浄した。フィルターを、増感スクリーンとともに−80℃でKodak Ｘ-ARフイルム(Eastman Kodak Company、Rochester、N.Y.、USA)に曝した。ポジティブファージプラークを単離し、そしてシングルクローンを単離するために再び２回スクリーニングした。組換えファージDNA抽出および配列決定法各ポジティブクローンの約50,000ファージをE.coli Y1090細胞のローン上にプレートした。37℃で一晩増殖させた後、ファージをSM緩衝液(100mM NaCl/８mM M gSO₄/50mM Tris-HCl、pH7.5/ゼラチン0.001％)およびクロロホルム0.3％中に再懸濁し、そして懸濁物を１mgのRNAseおよび１mgのDNAseで処理した。ファージDN AをPEG10％/１M NaClで沈澱させ、フェノールおよびフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出し、そして再びPEGで沈澱させた。ファージDNAをEcoRIて消化し、そして挿入物をpUC18のEcoRI部位に連結した。組換えプラスミドをQiagen Plasmid Maxi Protocolの指示に従って抽出し；PE Gで沈澱させ、そして2N NaOHで変性した。 Sequenase(United States Biochemicals Corp.、Cleveland、OH)を用い、ジデオキシチェーンターミネーション法(Sangerら、前出)に従ってユニバーサルおよび正方向プライマー、続いて一連の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定を行った。３つのポジティブクローンである、cDNA-1、cDNA-2およびcDNA-3を単離した。３つのcDNAの両鎖を配列決定した(図2A〜図2C、図3A〜図3Dおよび図4A〜図4Dを参照)。 cDNA-1は423アミノ酸残基の推定タンパク質を、cDNA-2は437アミノ酸残基の推定タンパク質を、そしてcDNA-3は457アミノ酸残基の推定タンパク質をコードする。３つの推定タンパク質はそれらのＮ末端のみで異なる。さらに、cDNA-2および cDNA-3クローンは同種でない。なぜなら、オルタナティブな５'配列が上流のATG 開始コドンを導入するからである。既に述べたように、cDNA-2およびcDNA-3クローンから推定されたより長いタンパク質は、推定ミトコンドリア遷移ペプチドを１位〜24位(cDNA-2)および１位〜 44位(cDNA-3)に示すが、これは423アミノ酸タンパク質に部分的に存在する。実施例４ヒトKATのクローニング λZapIIヒト脳cDNAライブラリー(Stratagene)を、アミノ酸残基11〜197の配列を含み、かつラット腎臓KATをコードするcDNA-1のＮ末端部分を代表するプローブを用いてスクリーニングした。約1,350,000の組換えファージをE.coli XL1 bl ue細胞のローン上にプレートし、そしてスクリーニングを実施例３に記載のように行った。ポジティブファージプラークを単離し、そしてシングルクローンを単離するために再び２回スクリーニングした。組換えファージDNA抽出および配列決定法 E.coli XL1 blue細胞を、選択されたポジティブクローンに対応する約10⁵のファージ粒子および１μlのEX Assistヘルパーファージ(10⁶pfu/ml)で同時感染させた。混合物を37℃で15分間インキュベートし、その後３mlのLBと３時間インキュベートした。細胞を遠心分離し、そして上清を70℃で15分間加熱し、OD600=1 のSORL細胞を、ファージミドpBluescriptを含む上清と混合し、そして37℃で15 分間インキュベートし、そしてLB-アンピシリンプレート(50μg/ml)上にプレートした。LB-アンピシリン中でシングルクローンを一晩インキュベートし、そしてDNAをQiagen Plasmid Maxi Protocolの指示に従って抽出し、PEGで沈澱させ、そしてNaOH 2Nで変性した。配列決定を、Sequenase(United States Biochemical s Corp.、Cleveland、OH)を用い、ジデオキシチェーンターミネーション法(Sang erら、前出)に従ってユニバーサルおよび正方向プライマー、続いて一連の合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。不運なことに、どのポジティブクローンも完全長配列を含んでいなかった。従って、５'の欠如配列を単離するために、RACEプロトコルを適用した。5 ’PCR Race ヒト脳由来の0.5μgのポリA+ RNAを、ヒト脳cDNAライブラリーから単離した最長のcDNAクローンのＮ末端部分に位置するプライマー(5'-CAGGGCCTGGAAGGCTGTGA -3')(配列番号６)を用いて逆転写した。反応を実施例２に記載のように行った。 20μlを沈澱させ、そしてdATP 0.2mM、テーリング緩衝液(buffer tailing)(0.1M カコジル酸カリウム pH 6.8、1mM CoCl₂、100mM DTT、100μg/ml BSA)および15 U TdT酵素(Gibco BRL)を含む混合液中で再懸濁した。37℃で10分間のインキュベーション後、水を最終反応容量が250μlになるまで添加した。cDNAを、25pmolのオリゴ(5'-ATAGCCACCAACAGTCACCA-3')(配列番号７)、10p/molのオリゴ(5'-GACTC GAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3')(配列番号８)および25pmolのオリゴ(5'-GA CTCGAGTCGACATCGA-3')(配列番号９)、10μlの10×Taqポリメラーゼ緩衝液(500mM KCl/100mM Tris.HCl、pH8.3)、８μlの25mM MgCl₂、８μlのdNTP溶液(2.5mM dN TP)と混合した。容量を水で100μlにした。チューブを95℃で７分間加熱し、そして0.5μl(2.5U)のTaqポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus)を加えた。アニーリングを58℃で２分間行い、そして重合化を72℃で2.5分間行った：サイクルを40 回繰り返した。PCR産物をニトロセルロースフィルターにブロットし、そして実施例３に記載のように、部分cDNAヒトクローンの公知の配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブ(5'-ACCACTGACGAAGATCCTGGCAAGTTTCTTTGGGGAGC-3')(配列番号10)とハイブリダイズさせた。プローブをT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Boeh ringer)により(γ³²P)dATPで標識し、そしてNap5カラム(Pharmacia)で精製した。ポジティブバンド(330bp)を5'-hKATと命名し、SalIリンカーとともにオリゴを用いて再増幅し、そしてpUC18にクローン化した。DNA配列決定を両鎖で行い、PC RフラグメントとヒトKATクローンの欠失5'部分との間の対応を確認した。実施例５哺乳動物細胞における発現ラットKATをコードする発現プラスミドを以下のように構築した：ａ)５'および３'非翻訳配列、ならびに推定ミトコンドリアターゲティングペプチドを除去するために、PCR増幅を、２つの特定のオリゴヌクレオチドをXhoIリンカーとともに用いて行った。センス配向オリゴヌクレオチド(5'-TGTCCTCGAGACCATGACCAAA CGGCTGCAGGCTCGGA-3')(配列番号26)は、cDNA-1の+241で始まるが、アンチセンス配向オリゴヌクレオチド(5'-GTACCTCGAGTCAGGGTTGGAGCTCTTTCCACTTG-3')(配列番号27)は、コード配列の末端から始まる配列を相補する。配列決定により制御された後、XhoI切断フラグメントをpSVL発現ベクター(Pharmacia Biotechnology) のXhoI部位にクローン化した。ヒトKATをコードする発現プラスミドを以下のように構築した。ヒトKATの完全長配列に対応する２つのcDNAフラグメントを連結させるために、２つの異なるPC R反応を行った：ａ)5'hKATを２つの特定のオリゴヌクレオチドを用いるPCRにより増幅した：XhoIリンカーを有するセンスプライマー(TGTCCTCGAGACCATGGCCAAAC AGCTC)(配列番号11)および逆プライマー(CAGGGCCTGGAAGGCTGTGA)(配列番号６)としてRaceの逆転写に用いられるオリゴヌクレオチド(実施例４を参照のこと)；ｂ )cDNAライブラリースクリーニング(実施例４)後に得られるヒトKATをコードする部分cDNA配列を、クローニング部位に隣接する２つのプライマーを用いてPCR増幅した：センスプライマー(GTAATACGACTCACTATAGGGC)(配列番号12)および逆プライマー(TGTCCTCGAGCGCTCTAGAACTAGTGGATC)(配列番号13)。２つのPCR産物をApa Iで切断し、一緒に連結し、XhoIで切断し、そしてpSVLベクターにクローン化した。COS-1細胞を、リン酸カルシウム法(Maniatisら、前出)により、10μgのpSVL -ratKATプラスミドまたはpSVL-humanKATでトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、細胞を凍結および融解により破砕し、そして遠心分離後、上清を、KAT活性、グルタミントランスアミナーゼＫ活性およびシステイン結合 βリアーゼ活性について用いた。実施例６キヌレニンアミノトランスフェラーゼ活性、グルタミンアミノトランスフェラーゼＫ活性、およびシステイン結合βリアーゼ活性キヌレニントランスアミナーゼアッセイ反応混合物(100μl)は、0.17M リン酸カリウム緩衝液、pH 8.1中に、70μM リン酸ピリドキサル、５mM ピルビン酸、３mM キヌレニン、およびKATサンプルを含んでおり、そしてこれを37℃で30分間および１時間インキュベートした。反応を、20μl TCA 50%を添加することにより停止し、そして沈澱を遠心分離により除去した。上清を、５mM 酢酸、５％メタノール、0.1％ヘプタンスルホン酸、pH 3.0で平衡化されたC18カラム(Vydac 201TP54、25×4.6 cm×mm)を用いるHPLCにより 1ml/分で分析し、そしてキヌレン酸を50mM 酢酸、５％メタノール、0.5％ヘプタンスルホン酸、pH 4.5で溶出した。243nmでの吸光度を測定した。グルタミントランスアミナーゼＫアッセイグルタミントランスアミナーゼＫ活性を、CooperおよびMeister(Methods Enzy mol .、113:344-349(1985))に記載されるように測定した。システイン結合βリアーゼアッセイ βリアーゼアッセイは、AbrahamおよびCooper(1991)により記載された結合アッセイであった。βリアーゼ反応の産物(ピルベート)を、アラニンデヒドロゲナーゼにより触媒されるピルベートのラクテートへの変換の間のNADHの酸化を測定することによりアッセイした。反応混合物(マイクロタイタープレート中に200m l)は、100mM Tris緩衝液 pH 8.8中に２mM S-(1,2-ジクロロビニル)-L-システイン(DCVC)、0.5mM MTB、0.1mM PLPおよび酵素を含んでおり、そして0.3mM NADH、 7.3 U/ml アラニンデヒドロゲナーゼ、および酢酸アンモニウム0.1Mの添加前に、37℃で５、10、15分間インキュベートした。340nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー(Cerves uv900)を用いて測定し、そしてNADH濃度をεl＝4200M^-1を用いて算出した。実施例７ヒトKATのトリプシンフラグメントのアミノ酸配列ヒトKATを、本質的にBaranら、J ．Neurochem.、62:730-738(1994)に記載されたように調製した。 500pmoleの精製ヒトKATサンプルを、記載されたようにトリプシンにより消化した(Hugli、Techniques in Protein Chem.、377-391頁、Academic Press，Inc. 編、(1989))。簡単にいうと、ヒトKATを、10mM 炭酸水素アンモニウムで平衡化したFast脱塩カラムを装着したSMARTシステムを用いて脱塩した。クロマトグラフィー工程の後、サンプルを最終容量５mlまで濃縮した。分子中のシステイン残基を８Ｍ尿素、10mM DTT中50℃で15分間還元し、次いて、アルキル化を20mMヨード酢酸を用いて室温で15分間行った。この後、サンプル溶液を２Ｍの最終尿素濃度を有するように希釈し、そしてサンプルを酵素：基質比１：25でトリプシン(B oehringer)を用いて一晩消化した。消化から生じるペプチドを、Vydac C18カラムおよび５〜65％溶出液Ｂの60分間の直線グラジエントを用いるRP-HPLCにより分析した。ここで溶出液Ａは0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液であり、そして溶出液Ｂは0.07％TFA、95％アセトニトリルであった。溶出されたピークを手動で収集し、vacuum speedvac(Savant)を用いて濃縮し、次いでタンパク質配列決定のために477 Ｎ末端タンパク質配列決定機(ABI、Perkin Elmer)にロードした。配列分析を、本質的に記載されたように行った(Fabbriniら、FEBS Lett.、前出)。図６は、ヒトKATの３つのペプチド、すなわちF11(配列番号２)、F13(配列番号３)およびF14(配列番号４)のアミノ酸配列を示す。本発明は、その特定の実施態様を参照として詳細に記載されているが、種々の変更および改変が本発明の意図および範囲から逸脱することなく行われ得ることは、当業者には明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｄ 215/48 9359−4ＢＣ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 5/10 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/10 9735−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｑ 1/68 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/52 //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ブレトン，ジェロームイタリア国アイ−20136 ミラノ，ヴィアアー．スフォルツェ， 61 (72)発明者スペチィアーレ，カルメーライタリア国アイ−20124 ネルヴィアーノ，ヴィアジョバンニ 23，21 (72)発明者奥野悦生和歌山市木ノ本1675−２ (72)発明者シュワルズ，ロバートアメリカ合衆国メリーランド 21209, ボルティモア，テンティンバーズレーン 6936 (72)発明者モスカ，モニーカイタリア国アイ−20100 ミラノ，ヴィアディグラッキ，26

Claims

【特許請求の範囲】１．以下からなる群より選択されるKAT酵素をコードする単離されたDNA配列： (a) ラットKAT酵素をコードする単離されたDNA配列； (b) 上記(a)の単離されたDNA配列にハイブリダイズし、そして哺乳動物KAT酵素をコードする、単離されたDNA配列；および (c) 遺伝コードの縮重のため、コドン配列が上記(a)および(b)の該単離された DNA配列とは異なり、そしてKAT酵素をコードする、単離されたDNA配列。２．ラットKAT酵素をコードする、請求項１に記載の単離されたDNA配列。３．クローンcDNA-1の配列(配列番号18)をさらに含む、ラットKAT酵素をコードする、請求項１に記載の単離されたDNA配列。４．クローンcDNA-2の配列(配列番号19)をさらに含む、ラットKAT酵素をコードする、請求項１に記載の単離されたDNA配列。５．クローンcDNA-3の配列(配列番号５)をさらに含む、ラットKAT酵素をコードする、請求項１に記載の単離されたDNA配列。６．請求項１〜５のいずれかに定義されるクローン化DNA配列を含むベクター。７．プラスミドである、請求項１〜５のいずれかに定義されるクローン化DNA 配列を含むベクター。８．ウイルスである、請求項１〜５のいずれかに定義されるクローン化DNA配列を含むベクター。９．レトロウイルスである、請求項１〜５のいずれかに定義されるクローン化 DNA配列を含むベクター。１０．請求項１〜５のいずれかに定義されるクローン化DNA配列を含むベクターで形質転換された宿主細胞。１１．哺乳動物細胞である、請求項１〜５のいずれかに定義されるクローン化 DNA配列を含むベクターで形質転換された宿主細胞。１２．KAT酵素をコードする遺伝子の一部分を含むDNA配列に選択的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブ。１３．KAT酵素をコードする遺伝子の一部分を含むDNA配列に選択的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブであって、ポリメラーゼ連鎖反応伸長プライマーとして作用し得る、プローブ。１４．KAT酵素をコードする遺伝子の一部分を含むDNA配列に選択的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブであって、検出可能な基で標識される、プローブ。１５．KAT酵素をコードする遺伝子の一部分を含むDNA配列に選択的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブであって、該プローブが検出可能な基で標識され、該検出可能な基が放射活性原子である、プローブ。１６．請求項１〜５のいずれかに記載のDNA配列によりコードされる、単離かつ精製されたKAT酵素。１７．請求項１〜５のいずれかに定義されるクローン化DNA配列を含むベクターで薬物スクリーニングに有用な細胞を形質転換する工程を包含する、薬物のスクリーニング方法。１８．薬物をスクリーニングするために、請求項１０または１１のいずれかに記載の宿主細胞を使用する工程を包含する、薬物のスクリーニング方法。１９．遺伝子治療に有用なベクターをクローニングする工程を包含する遺伝子治療の方法であって、該ベクターが請求項１〜５のいずれかに定義されるクローン化DNA配列を含む、方法。２０．遺伝子治療のために請求項１０または１１のいずれかに記載の宿主細胞を使用する工程を包含する、遺伝子治療の方法。２１．脳移植のために請求項１０または１１のいずれかに記載の宿主細胞を使用する工程を包含する、遺伝子治療の方法。２２．脳にキヌレン酸を送達するために請求項１０または１１のいずれかに記載の宿主細胞を使用する工程を包含する、遺伝子治療の方法。２３．遺伝子治療に有用なアデノウイルスベクターをクローニングする工程を包含する、遺伝子治療の方法であって、該ベクターが請求項１〜５のいずれかに定義されるクローン化DNA配列を含む、方法。２４．請求項１〜５のいずれかに定義されるDNA配列を単離する工程を包含する、遺伝子治療の方法であって、該DNA配列が遺伝子治療に有用である、方法。２５．請求項１〜５のいずれかに定義されるDNA配列をクローニングする工程を包含する、制限断片長多型をスクリーニングする方法であって、該クローンが RFLPスクリーニングに有用である、方法。２６．RFLPスクリーニングのために請求項１２〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブを使用する工程を包含する、RFLPをスクリーニングする方法。２７．KAT遺伝子発現をプローブするために請求項１２〜１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブを使用する工程を包含する、KAT遺伝子発現をプローブする方法。２８．請求項１〜５のいずれかに定義されるクローン化DNA配列を含むベクターで、神経活性キヌレン酸アナログを産生するために有用な細胞を形質転換する工程を包含する、神経活性キヌレン酸アナログの産生方法。２９．神経活性キヌレン酸アナログを産生するために請求項１０または１１のいずれかに記載の宿主細胞を使用する工程を包含する、神経活性キヌレン酸アナログの産生方法。