ITVA20100044A1 - Soluzione oftalmica per proteggere strutture interne del globo oculare da raggi uv-a o per il trattamento del cheratocono con tecnica di cross-linking trans-epiteliale - Google Patents

Description

CAMPO TECNICO

Questa invenzione concerne in generale le composizioni e le tecniche per la cura del cheratocono e più in particolare una nuova composizione adatta ad essere impiegata per proteggere strutture interne del globo oculare da raggi UV-A o in un trattamento di cross-linking corneale.

BACKGROUND

Il libro [18] fornisce una summa dei problemi e delle tecniche di somministrazione di soluzioni oftalmiche nell'occhio.

Il cross-linking corneale (C3) con riboflavina (vitamina B2), brevemente indicato con la dicitura riboflavina-C3, è una tecnica innovativa per il trattamento di pazienti affetti da cheratocono e da ectasia corneale e consiste nella somministrazione combinata di riboflavina ed irradiazione con raggi ultravioletti (UVA) per rafforzare il tessuto corneale [1] [2],

Il trattamento risulta tecnicamente semplice; la riboflavina viene instillata nell’ occhio ed una quantità attentamente dosata di raggi UVA viene applicata alla cornea per una durata di cinque minuti, la procedura viene quindi ripetuta per 6 volte in successione nella stessa seduta fino ad una esposizione totale di 30 minuti.

Il parametro clinico più importante che deve essere preso in esame per stabilire Tindicazione al trattamento di crosslinking è lo spessore corneale, che deve risultare non inferiore a 400 micron.

Lo scopo ultimo di questi trattamenti conservativi del cheratocono è di posticipare o possibilmente eliminare la necessità del trapianto di cornea, e di migliorare la performance visiva del paziente migliorandone la qualità della vita [6] [7],

La tecnica di cross-linking è stata applicata ai casi di cheratocono, patologia caratterizzata da un progressivo sfiancamento della cornea per una anomala lassità del parenchima corneale dovuta ad una minore coesione delle lamelle di collagene di cui è costituito. Mediante Γ utilizzo di luce UV-A e di riboflavina vengono creati nuovi legami tra le molecole di collagene corneali adiacenti in modo che la cornea acquisisce maggiore spessore e rigidità [3], La cornea presenta numerosi strati di fibre di collagene nello spessore del parenchima; resistenza di legami trasversali o cosiddetti “crosslinks” che saldano i vari strati di collagene tra loro contribuisce in maniera determinante al grado di resistenza corneale. Lo scopo del trattamento di crosslinking corneale è quello di aumentare il grado di rigidità del tessuto corneale mediante la formazione di un maggior numero di questi legami trasversali.

L’applicazione della riboflavina sulla cornea disepitelizzata con penetrazione di circa 200 pm e l’irradiazione delle molecole di riboflavina mediante UVA determinano la perdita dell’equilibrio chimico delle molecole di riboflavina con la conseguente produzione di radicali liberi. La molecola di riboflavina diventa instabile e si stabilizza legandosi con due fibrille di collagene. Una serie di ponti biochimici si creano tra le fibrille di collagene (vale a dire, cross-linking) in modo da produrre un rafforzamento generale della cornea [3],

Dal punto di vista tecnico, la procedura attualmente viene generalmente eseguita dopo aver rimosso lo strato più superficiale della cornea (epitelio corneale).

Tale modalità di trattamento di cross-linking (C3-R) del cheratocono e delle ectasie corneali prevede la preventiva rimozione dell’epitelio corneale per favorire la penetrazione della soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% (ad esempio quella commercializzata dalla SOOFT ITALIA S.r.l. con il marchio RICROLIN™) nello stroma sottostante e la procedura è stata standardizzata sulla base di tale presupposto.

Secondo i sostenitori di questa tecnica, la rimozione dello strato epiteliale sarebbe necessaria per garantire il miglior assorbimento della soluzione di riboflavina all’ interno dello stroma corneale e quindi la massima efficacia della terapia.

La rimozione dell’ epitelio corneale tuttavia può arrecare irritazione e bruciore oculare il giorno dopo il trattamento e in quelli immediatamente successivi ed un transitorio offuscamento della vista; questi sintomi sono previsti e persistono fino alla ricostituzione dell’ epitelio corneale e vengono abitualmente trattati utilizzando colliri antinfiammatori non steroidei (FANS), colliri a base di sostituti lacrimali e antidolorifici, e l’applicazione di una lente a contatto terapeutica sulla cornea per i primi giorni [4-7], Alcuni sostengono che sarebbe possibile effettuare il trattamento C3-R applicando la metodica standard senza preliminare rimozione dell’epitelio corneale, sostenendone l’efficacia e la sicurezza sulla base di dati clinici sull'osservazione. Secondo quest'altra modalità, si dovrebbe eseguire il trattamento senza effettuare la preliminare disepitelizzazione della cornea.

Lo scopo è quello di evitare ai pazienti i disagi conseguenti alla rimozione dell'epitelio, propri della prima metodica, di poterla svolgere in regime ambulatoriale e soprattutto di evitare il rischio di una infezione postchirurgica propria di una metodica che prevede la rimozione dell’epitelio con conseguente esposizione degli strati sottoepiteliali.

I sostenitori di questa modalità di trattamento raccomandano l applicazione della riboflavina sull’ occhio per un lasso di tempo maggiore per permettere il miglior assorbimento nello stroma prima dell’ applicazione dei raggi UVA [8],

Per quanto concerne la rimozione o meno dell’epitelio nel trattamento con cross-linking del cheratocono e delle ectasie corneali in generale esistono in letteratura opinioni contrastanti.

Inizialmente, il trattamento C3-R è stato studiato ed attuato dopo rimozione dell’epitelio corneale per favorire la penetrazione della riboflavina nello stroma. Non sono però noti studi che abbiano determinato con certezza se e quanta riboflavina penetri effettivamente nello stroma corneale [9] rimuovendo o meno l’epitelio.

L'esecuzione del cross-linking senza preventiva disepitelizzazione è criticata da numerosi autori, i quali sostengono che in questo modo la riboflavina non passerebbe per via trans-epiteliale e che non è stato sinora dimostrato se e quanta soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% penetri realmente nello stroma corneale senza rimozione dell’epitelio e se il trattamento mediante raggi UV-A per via trans-epiteliale risulti ugualmente efficace quanto quello effettuato dopo rimozione dell’epitelio.

Nel tentativo di fornire sostanze utili nella cura del cheratocono con tecnica cross-linking senza dover rimuovere l'epitelio corneale, in [17] è stato suggerito dal Doti. Spòri l'uso del benzalconio cloruro per aumentare la permeabilità dell'epitelio e dal Doti. Pinelli l'uso di tensioattivi mescolati a riboflavina.

Nella domanda di brevetto italiana MI2007A002162 [16] è divulgata una composizione per il trattamento del cheratocono con tecnica di crosslinking trans-epiteliale contenente riboflavina e benzalconio cloruro.

Sperimentazioni condotte dai richiedenti su cornee umane, i cui risultati sono illustrati più avanti, portano a concludere che la seconda tecnica, eseguita con la soluzione standard o con la composizione proposta dal Doti. Pinelli [16], non risolverebbe i problemi dovuti alla rimozione dell'epitelio corneale in quanto esso verrebbe distrutto, lasciando esposti gli strati sottostanti con il rischio d’insorgenza di infezione e di alterazione dei meccanismi riparativi.

Sarebbe desiderabile una composizione a base di riboflavina per il cross-linking della cornea, che sia in grado di attraversare in tempi brevi e certi l'epitelio corneale e che non procuri danni all’epitelio corneale, responsabili di fastidiosi sintomi post-operatori.

SOMMARIO

I richiedenti hanno effettuato studi approfonditi tesi a determinare in che misura la riboflavina penetri da sola o mescolata con altri prodotti ("carriere") attraverso cornee umane con e senza preliminare rimozione dell’epitelio, nonché l’efficacia e la sicurezza del successivo trattamento con raggi UV-A.

Sono state identificate sostanze, scelte nell'insieme composto da amminoacidi essenziali e semi-essenziali, coenzima Q, vitamina E, L-prolina, glieina, lisina cloridrato, L-leucina, L-arginina e composti adatti a stimolare la produzione di metallo proteinasi MMP9, più precisamente identificati in seguito, che possono essere impiegate efficacemente come carrier ("permeation enhancer") in soluzioni oftalmiche idonee alla somministrazione di riboflavina, in particolare con la soluzione standard di riboflavina-destrano, attraverso l'epitelio corneale. Le soluzioni oftalmiche così ottenute, commercializzabili ad esempio in forma di collirio o di gel o soluzioni acquose o emulsioni o applicate su lenti a contatto terapeutiche, possono essere usate per il trattamento del cheratocono con tecnica di crosslinking trans-epiteliale preservando l'epitelio corneale.

Le soluzioni oftalmiche possono eventualmente contenere degli eccipienti, quali ad esempio l'acido acetico, oppure le sostanze indicate possono essere trattate con acido acetico o un altro eccipiente prima di essere mescolate con riboflavina.

Questa invenzione propone inoltre l'uso di almeno una sostanza scelta nell'insieme costituito da amminoacidi essenziali e semi-essenziali, coenzima Q, vitamina E, L-prolina, glieina, lisina cloridrato, L-leucina, L-arginina e composti adatti a stimolare la produzione di metallo proteinasi MMP9, più precisamente identificati in seguito, per la preparazione di una soluzione oftalmica contenente riboflavina per il trattamento del cheratocono con tecnica di cross-linking trans-epiteliale o per proteggere strutture interne del globo oculare da raggi UV-A e una relativa soluzione oftalmica contenente riboflavina, e come carrier ("permeation enhancer") in una composizione idonea alla somministrazione di riboflavina attraverso l'epitelio corneale.

Questa invenzione propone anche un metodo di preparazione di una tale soluzione oftalmica consistente nell'aggiungere ad una soluzione di riboflavina almeno uno dei carrier trovati.

Ognuna delle sostanze proposte come carrier può essere aggiunta da sola o in combinazione con altri carrier proposti ad una soluzione a base di riboflavina in concentrazioni scelte negli intervalli indicati nella seguente descrizione di forme di realizzazione esemplificative.

L'invenzione è definita nelle annesse rivendicazioni.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI

La FIG. 1 mostra una scala di valutazione visiva, fluorimetrica, colorimetrica adottata per la dimostrazione del passaggio di riboflavina 0,1 % attraverso la cornea dopo applicazione per via transepiteliale.

La FIG. 2a è un'immagine fluoroscopica di una sezione di cornea su cui è stata applicata in modo trans-epiteliale la quarta composizione di test per 15 minuti.

La FIG. 2b è un'immagine fluoroscopica di una sezione di cornea su cui è stata applicata in modo trans-epiteliale la quarta composizione di test per 30 minuti.

La FIG. 2c è un'immagine fluoroscopica di una sezione di cornea trattata con cross-linking trans-epiteliale usando la quarta nuova composizione, in cui si nota la fluorescenza per Γ avvenuto passaggio della quarta composizione e la notevole rigidità del tessuto dopo il trattamento.

La FIG. 3a mostra il grado di flessione di una cornea trattata con crosslinking trans-epiteliale usando la soluzione standard.

La FIG. 3b mostra il grado di flessione di una cornea trattata con crosslinking trans-epiteliale usando la quarta nuova composizione di test.

La FIG. 4 è una microscopia a scansione che mostra come si presentano le lamelle di una sezione di cornea affetta da cheratocono.

La FIG. 5 è una microscopia a scansione che riproduce con un maggior ingrandimento una parte della cornea di FIG. 4.

La FIG. 6 è una microscopia a scansione che illustra come si presentano le lamelle di una sezione di cornea affetta da cheratocono dopo il cross-linking trans-epiteliale effettuato utilizzando la quarta nuova composizione di test.

La FIG. 7 è una microscopia a scansione che mostra la morfologia dei microvilli e degli strati superficiali dell’epitelio in una cornea normale.

La FIG. 8 è una microscopia a scansione di una cornea trattata con UV-A a dosaggio standard dopo aver applicato per via trans-epiteliale la soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1%.

La FIG. 9 è una microscopia a scansione di una cornea trattata con UV-A a dosaggio standard dopo aver applicato per via trans-epiteliale la quarta nuova composizione di test.

La FIG. 10 è una microscopia a scansione di una cornea trattata con UV-A a dosaggio standard dopo aver applicato per via trans-epiteliale una soluzione fisiologica.

DESCRIZIONE DI FORME DI REALIZZAZIONE ESEMPLIFICATIVE

I test sono stati effettuati su cornee umane di donatori, provenienti dall’Azienda Ospedaliera Napoli 1 Banca Occhi Regione Campania Ospedale dei Pellegrini dopo consenso come previsto nel protocollo di espianto e con richiesta al Comitato Etico come da num. di prot.0009304/2009.

E stato verificato l'attraversamento delle composizioni attraverso cornee umane integre, cioè senza preventiva rimozione dell’epitelio, aventi spessore compreso tra 500 e 600 micron, sia della soluzione standard di riboflavina-destrano, sia della composizione a base di riboflavina-destrano benzalconio cloruro suggerita in [16] e [17], che di nuove composizioni di test ottenute miscelando la riboflavina con almeno una sostanza scelta nell'insieme comprendente vitamina E, coenzima Q (o vitamina Q), prolina (L-prolina), glieina, lisina cloridrato, leucina (L-leucina), a varie concentrazioni.

Le concentrazioni delle sostanze utilizzate per realizzare nuove composizioni di test sono comprese nei seguenti intervalli:

vitamina E: concentrazione da 0,0001 mg % mi a 2000 mg % mi. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione varia da 0,01 mg % mi a 1500 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 10 mg % mi a 1000 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 500 mg % mi;

vitamina Q: concentrazione da 0,0001 mg % mi a 2000 mg % mi. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione varia da 0,01 mg % mi a 1500 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 1 mg % mi a 1000 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 100 mg % mi;

L-prolina: concentrazione da 0,0001 mg % mi a 2000 mg % mi. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione varia da 0,001 mg % mi a 100 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 0,005 mg % mi a 10 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da circa 0,01 mg % mi a 1 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 0,1 mg % mi;

glieina: concentrazione da 0,0001 mg % mi a 2000 mg % mi. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione varia da 0,001 mg % mi a 100 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 0,005 mg % mi a 10 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da circa 0,01 mg % mi a 1 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 0,1 mg % mi;

lisina cloridrato: concentrazione da 0,0001 mg % mi a 2000 mg % mi. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione varia da 0,001 mg % mi a 100 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 0,005 mg % mi a 10 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da circa 0,01 mg % mi a 1 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 0,05 mg % mi;

L-leucina: concentrazione da 0,0001 mg % mi a 2000 mg % mi. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione varia da 0,001 mg % mi a 100 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 0,005 mg % mi a 10 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da circa 0,01 mg % mi a 1 mg % mi. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 0,08 mg % mi.

Nuove composizioni adatte per la cura del cheratocono mediante crosslinking trans-epiteliale o per proteggere l'occhio dai raggi UV-A sono state ottenute mescolando una o più delle sostanze summenzionate in concentrazioni comprese negli intervalli indicati con una soluzione di riboflavina, per esempio con una soluzione di riboflavina-destrano in una concentrazione scelta nell'intervallo da 0,0001% a 0,5%. Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione di riboflavina-destrano varia da 0,001% a 0,4%. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 0,005% a 0,3%. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da circa 0,01% a 0,2%. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione è di circa 0,1%.

I risultati dei test hanno dimostrato che ciascuna delle sostanze dell'insieme trovato è adatta a favorire la penetrazione della riboflavina, ed in particolare della soluzione standard di riboflavina-destrano, attraverso l'epitelio corneale e a proteggere l'epitelio dai raggi UV-A.

Le cornee prese in esame provengono dallo smaltimento della Banca degli occhi in quanto non utilizzabili, mantenute in adatte soluzioni di conservazione, e prima della sperimentazione rivalutate mediante microscopio ottico ed esame delle cellule endoteliali.

Sono state utilizzate soltanto cornee con buona trasparenza, con spessore compreso tra 500 e 600 micron e con mosaico endoteliale presente, secondo quanto consigliato in [10-15],

Le cornee sono state posizionate in modo da chiudere un contenitore cilindrico contenente una quantità predefinita di soluzione di sodio ialuronato xanthan gum 0,4 mi ed è stata applicato sulla superficie corneale un anelletto metallico a tenuta avente lo stesso diametro del contenitore cilindrico. Quindi le composizioni da testare sono state mescolate con una sostanza fluorescente e le miscele così ottenute sono state applicate sulle cornee. Misurando il grado di fluorescenza della soluzione all'interno del contenitore al trascorrere del tempo, si è potuto verificare in che quantità le nuove composizioni attraversano la cornea e in quanto tempo ciò accade.

L'efficacia delle sostanze indicate come carrier in composizioni per la somministrazione di riboflavina per via trans-epiteliale e delle composizioni che si possono ottenere mescolando riboflavina ad almeno una delle sostanze indicate viene descritta attraverso i seguenti esempi di test, a scopo meramente illustrativo e non limitativo.

Per brevità, si riportano solo i risultati di test ottenuti trattando le cornee con le seguenti composizioni :

1) Soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1%;

2) Soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% benzalconio cloruro 0,01%, conformemente a quanto proposto in [16];

3) Prima nuova composizione di test di riboflavina-destrano 0,1% vitamina E TPGS (D-alfa-tocoferil polietilenglicol 1000 succinato) alla concentrazione di 500 mg % mi;

4) Seconda nuova composizione di test di riboflavina-destrano 0,1% Vitamina Q 100 mg % mi;

5) Terza nuova composizione di test di riboflavina-destrano 0,1% L-prolina 0,1 mg % glieina 0,1 mg %, lisina cl oridrato 0,05 mg %, L-leucina 0,08 mg %;

6) Quarta nuova composizione di test di riboflavina-destrano 0,1% vitamina E TPGS (D-alfa-tocoferil polietilenglicol 1000 succinato) 500mg % mi Vitamina Q 100 mg % mi L-prolina 0,1 mg % glieina 0,1 mg % lisina cloridrato 0,05 mg % L-leucina 0,08 mg %.

Ciascuna delle sei composizioni menzionate è stata applicata sulla superficie delle cornee selezionate e sistemate come già descritto ed è stata valutata rispettivamente a distanza di 15 minuti e 30 minuti l'imbibizione dello stroma corneale e la presenza della sostanza fluorescente nella soluzione di sodio ialuronato xanthan gum 0,4 mi situata all’ interno del contenitore al di sotto della cornea trattata.

La valutazione della penetrazione di riboflavina nello stroma corneale è stata effettuata mediante sezione della cornea e successiva valutazione al microscopio a fluorescenza.

La presenza di riboflavina all’interno della soluzione di sodio ialuronato xanthan gum 0,4 mi, a dimostrazione dell’ avvenuto passaggio attraverso la cornea, è stata valutata sia qualitativamente mediante l’adozione di una scala visiva e fluoroscopica del tipo illustrato in FIG. 1, sia quantitativamente mediante l’impiego di una scala colorimetrica.

Il significato dei due numeri accanto ciascun campione di colore rappresenta rispettivamente il numero di parti di soluzione standard di riboflavina che dà luogo alla colorazione illustrata e il numero di parti di soluzione di xanthan gum e sodio ialuronato.

La scala di riferimento è stata predisposta effettuando diluizioni di riboflavina-destrano 0,1% con xanthan gum sodio ialuronato nelle seguenti proporzioni (unità/μΐ): 50/0, 40/10, 30/20, 20/30, 10/40, 0/50. E’ stata così predisposta una scala visiva ed una scala fluorometrica corrispondente ai valori di unità/μΐ definiti ed è stato attribuito un punteggio da 10 a 0 per ciascun rapporto di diluizione. Tale scala colorimetrica prevede un valore minimo di percentuale del giallo pari al 20% in assenza di riboflavina, corrispondente allo spettro colorimetrico della sostanza scelta quale diluente.

La valutazione mediante scala visiva è stata effettuata in condizioni di illuminazione standard per confronto diretto dei reperti ottenuti dalla sperimentazione con i campioni predefmiti e mediante tecnica fotografica digitalizzata. La valutazione fluorimetrica è stata eseguita utilizzando un microscopio a fluorescenza corredato di fotocamera digitale in camera oscura. L’attribuzione del punteggio relativo alla valutazione con scala visiva e fluorimetrica era effettuata da un terzo esaminatore, operando una media dei valori ottenuti con le due metodiche.

La valutazione colorimetrica è stata effettuata mediante l’inserimento del materiale presente al termine dell’esperimento all’interno del contenitore (e quindi al di sotto della cornea) in una bustina trasparente e successiva analisi computerizzata con scannerizzazione ad alta definizione delle diluizioni predefinite e valutazione delle percentuali di giallo utilizzando un programma software Photoshop™ 7.0 e un selettore monocromatico. E’ stato così possibile rapportare la percentuale del colore giallo, prevalente e caratterizzante, rilevato con tale metodica sui reperti della sperimentazione ad un preciso range di concentrazione in unità/μΐ della riboflavina 0,1 % come riportato nella FIG. 1.

La FIG. 2a è un'immagine fluoroscopica di una sezione di cornea trattata con cross-linking trans-epiteliale dopo aver applicato la quarta nuova composizione per 15 minuti, la FIG. 2b è un'immagine fluoroscopica di una sezione di cornea trattata con cross-linking trans-epiteliale dopo aver applicato la quarta nuova composizione per 30 minuti, e la FIG. 2c è un'immagine fluoroscopica di una sezione di cornea trattata con cross-linking trans-epiteliale con la quarta nuova composizione. In quest'ultima figura si nota come la riboflavina sia penetrata in tutta la cornea e la rigidità del tessuto dopo il trattamento di cross-linking.

I test effettuati hanno dimostrato che:

a) dopo 15 minuti dall'applicazione della soluzione standard di riboflavinadestrano 0,1% per via trans-epiteliale si verifica parziale imbibizione dello stroma corneale e non risulta rilevabile la presenza della soluzione fluorescente nella sostanza posta all’interno del contenitore, con spettro colorimetrico sovrapponibile alla soluzione di sodio ialuronato xanthan gum 0,4 mi (punteggio 0 come da FIG. 1 e percentuale di giallo non superiore al 20%);

b) dopo 30 minuti dall'applicazione della soluzione standard di riboflavinadestrano 0,1% per via trans-epiteliale lo stroma corneale appare completamente imbibito di soluzione fluorescente; si osserva la presenza di fluorescenza all’interno della soluzione di sodio ialuronato xanthan gum 0,4 mi presente nel contenitore con punteggio 2-3 della FIG. 1 e percentuale di giallo rilevato con la sopraindicata tecnica computerizzata in un range 75%-80%;

c) dopo 15 minuti dall'applicazione per via trans-epiteliale della prima nuova composizione di test di riboflavina-destrano 0,1% vitamina E TPGS (D-alfa-tocoferil polietilenglicol 1000 succinato) alla concentrazione di 500 mg % mi, l’imbibizione della cornea è completa e la soluzione fluorescente risulta presente all’interno del contenitore (punteggio 2-3 della FIG. 1, con percentuale di giallo del 72-76%);

d) dopo 30 minuti dall'applicazione della prima nuova composizione di test, oltre alla completa imbibizione di tutti gli strati della cornea, si osserva un'elevata concentrazione del prodotto all’interno del contenitore, a testimonianza della buona permeabilità del tessuto corneale al prodotto stesso posto a contatto con la superficie epiteliale (punteggio 3-4 della FIG. 1, con percentuale di giallo del 79-84%);

e) la composizione proposta in [16] e le nuove composizioni di test seconda e terza, rispettivamente contenenti: benzalconio cloruro 0,01%; Vitamina Q 100 mg % mi; L-prolina 0,1 mg %, glieina 0,1 mg %, lisina cl oridrato 0,05 mg % ed L-leucina 0,08 mg %, hanno fatto rilevare con le medesime metodiche una migliore penetrazione della riboflavina sia in termini quantitativi che di rapidità, rispetto ai risultati ottenuti utilizzando la sola soluzione standard (riboflavina-destrano 0,1%) (punteggio della FIG. 1 di 3-4 a 15 minuti e 4-6 a 30 minuti, con percentuale di giallo del 70-79% a 15 minuti e del 78-86% a 30 minuti);

f) la quarta nuova composizione di test ha determinato risultati ancora migliori rispetto a tutte le altre composizioni sperimentate, soprattutto per quanto riguarda le diverse concentrazioni di colorante rilevate fluoroscopicamente ed l'analisi computerizzata di sostanza fluorescente all’interno del contenitore dopo 15 e dopo 30 minuti di applicazione del prodotto sulla superficie epiteliale (punteggio 5-6 della FIG. 1 a 15 minuti, con percentuale di giallo dell’88-91%; punteggio di 6-7 a 30 minuti, con percentuale di giallo superiore al 90%); la maggiore concentrazione di sostanza fluorescente nel materiale posto al di sotto della cornea ottenuta dopo applicazione trans-epiteliale della quarta nuova composizione di test risulta particolarmente evidente al test eseguito a distanza di 15 minuti, soprattutto se confrontata con i risultati ottenuti con la soluzione standard, che non risulta rilevabile nel materiale posto alfintemo del contenitore dopo questo lasso di tempo. Ciò sembra spiegabile solo ipotizzando un effetto sinergico tra i "permeation enhancer" usati nel favorire il passaggio della riboflavina.

I risultati illustrati mostrano che almeno le seguenti sostanze:

- vitamina E

R1=CH3O H R2=CH3O H R3=CH3; a scopo esemplificativo si cita in particolare la vitamina E TPGS (D-alfa-tocoferil polietilenglicol 1000 succinato);

- Coenzima Q

nella forma ossidata,

nella forma

semichinonica,

nella forma ridotta,

qualunque sia il numero di unità isopreniche del coenzima Q; a scopo esemplificativo, si cita in particolare il coenzima Q10;

- L-prolina

glieina

- lisina

oppure lisina cloridrato;

- L-leucina

singolarmente o in combinazione tra loro, eventualmente in combinazione con eccipienti come ad esempio l'acido acetico, e in concentrazioni scelte nei range indicati in precedenza favoriscono la penetrazione della riboflavina attraverso l'epitelio corneale in tempi minori rispetto alla soluzione standard di riboflavina-destrano e in quantità sufficienti per il successivo trattamento di cross-linking.

La combinazione di tutti i composti menzionati con la riboflavina ha mostrato un insospettabile effetto sinergico nel produrre risultati complessivamente migliori per quanto concerne le concentrazioni di prodotto che attraversa i tessuti corneali e per la rapidità con cui avviene tale passaggio.

I Richiedenti hanno verificato in vitro l'efficacia del trattamento di cross-linking per via trans-epiteliale su cornee umane mediante applicazione della quarta nuova composizione di test ed irradiazione UV-A 3mW/cm<2>, secondo i protocolli standard.

Le cornee sono state preparate come nel precedente esperimento, fissandole su apposito supporto e applicando la soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% e la quarta nuova composizione di test sulla superficie epiteliale di rispettive cornee (quindi somministrate per via transepiteliale) per trenta minuti. Successivamente è stato effettuato il trattamento UV-A standard per trenta minuti suddivisi in “step” di 5 minuti, preceduti da riapplicazione di ciascuna composizione sulla superficie della cornea.

Al termine dell’esperimento, è stato valutato il grado di rigidità del lembo corneale nel modo seguente: ciascuna cornea è stata agganciata all’estremità per una lunghezza di 2mm con una pinza corneale mantenuta lungo una linea orizzontale ed è stata effettuata misurazione gonioscopica dell’angolo formato dall’estremità opposta del lembo corneale rispetto alla stessa linea orizzontale.

La FIG. 3 a mostra una cornea dopo trattamento di cross-linking transepiteliale effettuato usando la soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1%, che si flette verso il basso di circa 40° e la FIG. 3b mostra un'altra cornea dopo il trattamento di cross-linking effettuato usando la quarta nuova composizione di test e senza aver preventivamente rimosso l'epitelio corneale. Dal confronto è evidente che il trattamento di cross-linking transepiteliale effettuato con la quarta nuova composizione di test ha irrigidito la cornea, come desiderato, che si flette verso il basso di soli 25°.

Ad ulteriore conferma dell’efficacia del trattamento di “cross-linking” per via trans-epiteliale mediante pretrattamento con la quarta nuova composizione di test, è stata realizzata tale metodica in vitro su lembi corneali umani, provenienti da pazienti affetti da cheratocono, sottoposti a cheratoplastica perforante; in questi casi la cornea espiantata al ricevente il trapianto corneale, anziché smaltirla, è stata utilizzata in laboratorio usando l’accorgimento di evitare il tempo chirurgico relativo alla diatermia per consentire in tal modo la conservazione ed il rispetto dei piani degli strati corneali (trapianto a tutto spessore). I lembi corneali sono stati fissati su un apposito supporto. Sulla prima cornea è stata applicata la soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% e sulla seconda la quarta nuova composizione di test, deponendole sulla superficie corneale senza rimozione dell’epitelio per trenta minuti.

Successivamente è stato effettuato solo sulla cornea trattata con la quarta nuova composizione di test il trattamento UV-A standard a 340 nm con potenza di 3mW/cm<2>per trenta minuti suddivisi in “step” di 5 minuti, preceduti dalla riapplicazione del composto sulla superficie della cornea. L’altro lembo con cheratocono, fissato su apposito supporto, è stato trattato solo mediante deposizione sulla cornea di soluzione standard di riboflavinadestrano 0.1%, senza successiva irradiazione con UV-A.

Al termine dell’ esperimento, è stata effettuata valutazione del parenchima corneale mediante microscopia elettronica a scansione.

La FIG. 4 mostra come si presentano ad una microscopia a scansione le lamelle di una sezione di cornea con cheratocono non trattata. La FIG. 5 è un ingrandimento di una parte della FIG. 4. Queste due figure mostrano una lassità delle lamelle nel lembo corneale, proveniente da un paziente affetto da cheratocono, sottoposto soltanto a contatto con soluzione standard a base di riboflavina-destrano 0,1% senza irradiazione.

La FIG. 6 è una microscopia a scansione che mostra come si presentano le lamelle di una sezione di cornea con cheratocono dopo trattamento di cross-linking trans-epiteliale con la quarta nuova composizione di test. Il lembo cheratoconi co, trattato con la quarta nuova soluzione per via transepiteliale ed irradiazione UV-A secondo il protocollo standard per complessivi trenta minuti, ha presentato lamelle corneali fortemente stipate e compatte, a testimonianza dell’ avvenuta formazione di nuovi legami biochimici di cross-linking.

Risultati analoghi a quelli mostrati per la quarta nuova composizione di test sono stati ottenuti anche con le nuove composizioni di test prima, seconda e terza.

I risultati ottenuti con le nuove composizioni di test superano anche i rilievi mossi da alcuni autori in merito ad un'ipotizzata riduzione degli effetti della procedura di cross-linking quando venga attuata per via trans-epiteliale, a causa di un possibile effetto di schermo dell’epitelio sui raggi UV-A. L’ipotesi di una riduzione dell’efficacia del trattamento di cross-linking trans-epiteliale risulta smentita dai reperti istologici riscontrati, se alla riboflavina si aggiunge almeno una delle sostanze qui proposte come "carrier" e si irradia seguendo il protocollo abituale.

E’ stato inoltre effettuato uno studio comparativo degli effetti del trattamento di cross-linking per via trans-epiteliale sulla integrità morfologica o meno degli strati epiteliali della cornea e dei microvilli presenti sulla superficie delle cellule epiteliali, utilizzando un microscopio elettronico a scansione (7500x). Ciò è stato fatto al fine di valutare la tollerabilità del trattamento di cross-linking eseguito con la quarta nuova composizione di test per via trans-epiteliale sull’epitelio corneale rispetto alla soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% e alla composizione di soluzione standard benzalconio cloruro 0,01% del tipo proposto in [16],

Questo test è stato effettuato perché le cellule epiteliali sono le prime strutture organiche ad essere irradiate dal fascio di UV-A e potrebbero riportare lesioni in seguito all’assorbimento di tali radiazioni. Nessuna delle pubblicazioni note in letteratura appare considerare tale aspetto, né sono noti dati in proposito.

Gli indici attualmente ritenuti più attendibili di vitalità delle cellule epiteliali sono l’esame citologico con tecnica ad impressione ed, in particolare, l’esame al microscopio elettronico dei microvilli dello strato delle cellule epiteliali superficiali della cornea. La presenza di estroflessioni della membrana (microvilli) degli elementi cellulari superficiali integri, contenenti una elevata concentrazione di mucine transmembrana ed un ricco glicocalice, consente di legare in modo ottimale la mucina libera che costituisce lo strato profondo del film lacrimale precorneale. La patologica perdita dei microvilli determina al contrario una difficoltosa aderenza dello strato di lacrime alla superficie oculare e fenomeni di sofferenza epiteliale indotta proprio dalla disfunzione del film lacrimale precorneale e dai conseguenti fenomeni infiammatori.

E’ stata effettuata la valutazione della morfologia dei microvilli con esame al microscopio elettronico a scansione dopo trattamento transepiteliale in vitro con UV-A secondo i dosaggi standard. Sono state prese in esame cornee umane di spessore compreso tra 500 e 600 micron, dopo incubazione per trenta minuti con una comune soluzione salina bilanciata (BSS), con la soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1%, con la composizione di soluzione standard benzalconio cloruro 0,01% e con la quarta nuova composizione di test.

Preliminarmente, è stato condotto anche lo studio della morfologia dei microvilli e degli strati superficiali dell’epitelio corneale di cornee non sottoposte ad alcun trattamento per evidenziare come debbano mostrarsi le cellule epiteliali ed i loro microvilli quando non sottoposte ad alcun procedimento fotochimico.

La FIG. 7 è una microscopia a scansione che mostra la morfologia dei microvilli e degli strati superficiali dell’epitelio in una cornea normale, e la FIG. 8 mostra una microscopia a scansione di una cornea trattate con UV-A dopo aver applicato la soluzione standard riboflavina-destrano 0,1% seguendo il protocollo standard. Dal confronto con la FIG. 7, è evidente la completa e totale perdita di tutti gli strati epiteliali e l’esposizione della membrana di Bowman.

Una situazione analoga è stata verificata anche in quelle cornee trattate con la composizione costituita dalla soluzione standard benzalconio cloruro 0,01% del tipo suggerito in [16],

La FIG. 9 è una microscopia a scansione di una cornea trattata con UV-A a dosaggio standard dopo trattamento con la quarta nuova composizione di test. Dal confronto con le FIGG. 7 e 8 si nota la conservazione degli strati epiteliali, dei nuclei cellulari e delle giunzioni intercellulari (gap-junction). Si rileva inoltre una significativa riduzione della densità dei microvilli, quelli restanti conservano però l'integrità morfologica, e nessuna compromissione dell’integrità della membrana cellulare citoplasmatica profonda. Risultati analoghi sono stati ottenuti con le nuove composizioni di test prima, seconda e terza.

La FIG. 10 è una microscopia a scansione di una cornea trattata con UV-A a dosaggio standard utilizzando, a scopo di confronto, solo una soluzione fisiologica. Si evidenzia uno scompaginamento degli strati epiteliali, la perdita in molte cellule del nucleo citoplasmatico e quasi totale perdita sia delle gap-junction sia dei microvilli.

I risultati ottenuti possono essere così sintetizzati:

1) le cornee trattate con UV-A previa incubazione con la soluzione standard di riboflavina-destrano 0,1% o con la composizione contenente la soluzione standard benzalconio cloruro 0,01% seguendo il protocollo standard, hanno subito la totale perdita di tutti gli strati epiteliali e la conseguente esposizione della membrana di Bowman (FIG. 8). In pratica, usando solo la soluzione standard eventualmente addizionata di benzalconio cloruro, l'epitelio viene distrutto dalla radiazione UV-A. Ciò induce a ritenere che il cross-linking effettuato senza rimuovere l'epitelio usando la soluzione standard oppure la composizione riboflavina-destrano benzalconio cloruro non risparmierebbe ai pazienti i fastidiosi sintomi post-operatori causati dalla tecnica che invece prevede la rimozione chirurgica dell'epitelio;

2) le cornee trattate con UVA a dosaggio standard dopo incubazione con composizioni comprendenti la riboflavina-destrano e almeno un "carrier" tra quelli indicati in precedenza, ed in particolare la quarta nuova composizione di test, hanno evidenziato la conservazione degli strati epiteliali, dei nuclei cellulari e delle giunzioni intercellulari (gap-junction). E stata rilevata una significativa riduzione della densità dei microvilli, ma quelli restanti però mostrano integrità morfologica. Non si è verificata alcuna compromissione dell’integrità della membrana cellulare citoplasmatica profonda delle cornee;

3) le cornee trattate con UVA a dosaggio standard dopo incubazione con il solo composto di soluzione fisiologica (BSS) hanno evidenziato uno scompaginamento degli strati epiteliali, perdita in molte cellule del nucleo citoplasmatico e quasi totale perdita sia delle gap-junction sia dei microvilli.

Sono state effettuate microscopie a scansione anche sulle cornee trattate con le nuove composizioni di test prima, seconda e terza, ma non sono state riportate perché esse appaiono sostanzialmente come quelle trattate usando la quarta nuova composizione di test.

Questi risultati inducono a ritenere che almeno la vitamina E, la vitamina Q o coenzima Q, gli amminoacidi testati quali la L-prolina, la glieina, la lisina cloridrato e la L-leucina, aiutino a proteggere l'epitelio corneale e a favorire l'attraversamento dell'epitelio corneale da parte della riboflavina. Tra le nuove composizioni proposte, la quarta composizione ha mostrato le migliori performance sia in termini di tempo di attraversamento che di conservazione dell'epitelio corneale.

Le ragioni del perché le sostanze proposte consentano di ottenere questi straordinari risultati e del perché le sostanze usate nella quarta composizione di test mostrano un effetto sinergico, non sono attualmente completamente definite. Senza alcuna intenzione di limitare l'invenzione ad una teoria, i Richiedenti ipotizzano che la limitata capacità lesiva sull’ epitelio rilevata dopo pretrattamento con la quarta nuova composizione di test potrebbe essere dovuta all'azione citoprotettiva esercitata dalla vitamina E, ad esempio la vitamina E-TPGS, e/o alla presenza nella soluzione di almeno un amminoacido essenziale o semi-essenziale. La vitamina E agirebbe sul glutadione ossidasi e sulla peroxide dismutasi, che sono gli enzimi coinvolti nella azione riparativa dell’ epitelio, mentre gli amminoacidi essenziali o semi-essenziali ("conditionally essential") avrebbero una funzione citoriparativa e probabilmente favorirebbero anche l effetto di cross-linking. Inoltre è possibile che la maggiore imbibizione del tessuto da parte della quarta nuova composizione determini non solo un aumento dell’effetto di cross-linking, ma anche una migliore protezione degli strati epiteliali corneali dagli effetti nocivi della radiazione UV-A.

Con le nuove composizioni a base di riboflavina-destrano ed almeno un "carrier" ("permeation enhancer") scelto tra quelli qui proposti, è possibile effettuare il trattamento di cross-linking, ad esempio per la cura del cheratocono, senza preventiva rimozione dell’epitelio corneale. L'assenza di disepitelizzazione evita:

1) i disturbi dovuti ad irritazione che tipicamente si verificano nei primi giorni dopo il trattamento di cross-linking con protocollo standard;

2) la necessità di applicare una lente a contatto terapeutica in tale periodo e, soprattutto,

3) l’insorgenza dei rischi di infezioni corneali post-chirurgiche dovuti alla rimozione dell’epitelio.

Si evitano inoltre manovre chirurgiche sulla cornea, per cui diventa possibile effettuare il trattamento in regime ambulatoriale, senza necessità di sala operatoria e di microscopio operatorio.

Le nuove composizioni potrebbero essere somministrate anche sotto forma di collirio o di gel o applicate su lenti a contatto terapeutiche prima dell’esposizione ai raggi solari, soprattutto nel periodo estivo, in modo da potenziare l’effetto cross-linking naturale dovuto ad irraggiamento con luce solare.

Le nuove composizioni potrebbero inoltre esercitare un effetto protettivo dai raggi UV-A sulle strutture interne del globo oculare e quindi essere utilizzate ad esempio per la protezione della macula e/o per la prevenzione della cataratta in soggetti a rischio esposti per molte ore alla luce solare.

Al solo scopo di conservare più a lungo le nuove composizioni in contenitori non monodose, è possibile aggiungere del benzalconio cloruro, in concentrazione da 0,0001% a 0,02%, preferibilmente in concentrazione pari allo 0,01%. Qualora le nuove composizioni dovessero essere prodotte e vendute in contenitori monodose, non è indispensabile che contengano benzalconio cloruro.

Le composizioni possono essere inoltre addizionate di conservanti, antimicrobici, antimicotici, eccipienti (a titolo di esempio si cita l'acido acetico) e in generale di tutte quelle sostanze utilizzate in campo oftalmico per rendere stabili e sterili nel tempo soluzioni oftalmiche e/o per favorirne l'assunzione.

Come detto in precedenza, i Richiedenti ipotizzano che le buone performance delle composizioni ottenute aggiungendo alla riboflavina almeno una sostanza scelta tra vitamina Q, L-prolina, glieina, lisina cloridrato, L-leucina siano in parte dovute al fatto che queste ultime sono amminoacidi essenziali o semi-essenziali ("conditi onally essential"), che svolgerebbero una funzione citoriparativa attraverso un incremento delle metallo proteinasi MMP9.

Ciò induce a ritenere che sia possibile ottenere risultati analoghi a quelli delle nuove composizioni di test prima, seconda, terza e quarta aggiungendo, ad una soluzione di riboflavina, per esempio ad una soluzione di riboflavina-destrano, almeno una sostanza idonea ad aumentare la metallo proteinasi MMP9 verosimilmente in una concentrazione compresa tra 0,00001% e 0,5%.

Tra le suddette sostanze idonee ad aumentare la metallo proteinasi MMP9 sono da citare la genisteina (5,7-Dihydroxy-3-(4hydroxyphenyl)chromen-4-one), i fitoestrogeni, le citochine e i cosiddetti FANS (farmaci antodolorifici non steroidei - NSAID). Tra i FANS adatti ad essere usati per realizzare una soluzione oftalmica a base di riboflavina, sono in particolare da citare:

acido acetilsalicilico (acido 2-(acetilossi)benzoico), acido flufenamico (2-{[3-(Trifluoromethyl)phenyl]amino}benzoic acid), acido meclofenamico (2-[(2,6-dichloro-3-methylphenyl)amino]benzoic acid), acido mefenamico (2-(2,3-dimethylphenyl)aminobenzoic acid), acido nifiumico (2-{[3-(trifluoromethyl)phenyl]amino}nicotinic acid), acido tolfenamico (2-[(3-chloro-2-methylphenyl)amino]benzoic acid), benorilato (4-(acetylamino)phenyl 2-(acetyloxy)benzoate), carprofen ((73⁄4S)-2-(6-chloro-9//-carb azol -2-yl)propanoi c acid), celecoxib (4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)pyrazol- 1 -yl]benzenesulfonamide), cinnoxicam (Piroxicam cinnamate o [9-methyl- 10,10-dioxo-8-(pyridin-2-ylcarbamoyl)- 10$1<Λ>{ 6 } -thia-9-azabic yclo[4.4.0]deca-l,3,5,7-tetraen-7-yl] (E)-3-phenylprop-2-enoate;piroxicam cinnamate), diflunisal (2',4'-difluoro-4-hydroxybiphenyl-3-carboxylic acid), diclofenac (2-[2-[(2,6-dichlorophenyl)amino]phenyl]acetic acid), droxicam (277, 577-1, 3-Oxazino(5,6-c)(l,2)benzothiazine-2, 4(377)-dione, 5-methyl-3-(2-pyridinyl)-, 6,6-dioxide) etodolac ((73⁄4S)-2-(l,8-Diethyl-4,9-dihydro-377-pyrano[3,4-b]indol-l-yl)acetic acid), etoricoxib (5-chloro-6'-methyl-3-[4-(methylsulfonyl)phenyl]-2,3'-bipyridine), fenoprofene (2-(3-phenoxyphenyl)propanoic acid), flurbiprofene ((73⁄4S)-2-(2-fluorobiphenyl-4-yl)propanoic acid), ibufenac (4-isobutylphenyl acetic acid), ibuprofene ((RS)-2-(4-(2-methylpropyl)phenyl)propanoic acid), indometacina (2-{l-[(4-chlorophenyl)carbonyl]-5-methoxy-2-methyl-177-indol-3-yl}acetic acid), ketoprofene ((i3⁄4S)-2-(3-benzoylphenyl)propanoic acid), ketorolac ((±)-5-benzoyl-2,3-dihydro-lH-pyrrolizine-l-carboxylic acid, 2-amino-2-(hydroxymethyl)-l,3-propanediol), lornoxicam ((3£)-6-chloro-3-[hydroxy(pyridin-2-ylamino)methylene]-2-methyl-2,3-dihydro-4//-thieno[2,3-e][l,2]thiazin-4-one 1,1-dioxide), lumiracoxib ({2-[(2-chloro-6-fluorophenyl)amino]-5-methylphenyl}acetic acid), meloxicam (4-hydroxy-2-methyl-N-(5-methyl-2-thiazolyl)-2H- 1 ,2-benzothiazine-3 -carboxamide- 1,1-dioxide), metamizolo (Sodium [(2,3-dihydro- 1,5-dimethyl- 3-oxo- 2-phenyl-1 H- pyrazol- 4-yl) methylamino] methanesulfonate), naprossene ((+)-(S)-2-(6-methoxynaphthalen-2-yl)propanoic acid), nimesulide (N-(4-Nitro-2-phenoxyphenyl)methanesulfonamide), oxaprozin (3-(4,5-diphenyl-l,3-oxazol-2-yl)propanoic acid) parecoxib (W-{[4-(5-methyl-3-phenylisoxazol-4-yl)phenyl]sulfonyl}propanamide) piroxicam ((8£)-8-[hydroxy-(pyridin-2-ylamino)methylidene]-9-methyl- 10,10-dioxo- 10λ<6>-ΰι^-9-azabicyclo[4.4.0]deca-l,3,5-trien-7-one), rofecoxib (4-(4-methyl sulfonylphenyl)-3 -phenyl-5H-furan-2-one), sulindac ( { ( 1 Z)-5-fluoro-2-methyl-l-[4-(methylsulfmyl)benzylidene]-lH-indene-3-yl}acetic acid), sudoxicam (4-hydroxy-2-methyl-N(2)-thiazolyl-2H-l,2-benzothiazine-3-carboxamide 1,1-dioxide), tenoxicam ((3£)-3-[hydroxy(pyridin-2-ylamino)methylene] -2-methyl-2,3-dihydro-4//-thieno[2,3-e] [l,2]thiazin-4-one 1,1-dioxide), valdecoxib (4-(5-methyl-3-phenylisoxazol-4-yl )b enzenesulfonami de) .

Si ritiene inoltre che sia possibile ottenere risultati analoghi a quelli delle nuove composizioni di test prima, seconda, terza e quarta aggiungendo, ad una soluzione di riboflavina, per esempio ad una soluzione di riboflavinadestrano, almeno un amminoacido essenziale o semi-essenziale.

Tra tutte le sostanze potenzialmente utili, la più promettente sembra essere la L-arginina. Essa può essere mescolata con una soluzione a base di riboflavina, per esempio la soluzione standard di riboflavina-destrano, ed eventualmente in aggiunta ad una o più delle sostanze indicate in precedenza per ottenere le nuove composizioni.

Anche se non sono stati ancora tutti testati, appare ragionevole ritenere che tutti gli amminoacidi essenziali possano essere validamente utilizzati per facilitare l'attraversamento della riboflavina attraverso l'epitelio corneale e proteggere quest'ultimo dalla radiazione UV-A. In particolare, appare ragionevole ritenere che la L-arginina possa dimostrarsi un "carrier" valido quanto le altre sostanze proposte in precedenza perché appare ragionevole presumere che la L-arginina, che è un amminoacido precursore dell'ossido di azoto, possa fornire ossido di azoto (NO) a livello periferico. L'uso dell'ossido di azoto (NO) per curare pazienti affetti da cheratocono mediante applicazione sull'epitelio di una sostanza nella quale sia disciolto è attualmente ostacolato dalla sua scarsa solubilità.

Resta da verificare se la L-arginina e gli altri amminoacidi essenziali siano in grado o meno di proteggere i microvilli dell'epitelio dai raggi UV-A usati nel cross-linking. Se gli altri amminoacidi essenziali o semi-essenziali e in particolare la L-arginina dovessero risultare utili per realizzare soluzioni che permettano il cross-linking trans-epiteliale preservando l'epitelio corneale, cosa che al momento ai Richiedenti appare ragionevole, verosimilmente essi dovranno essere presente in una concentrazione compresa tra 0,00001% e 0,5% in aggiunta ad una soluzione di riboflavina, ad esempio una soluzione di riboflavina-destrano.

Secondo una forma di realizzazione alternativa, la concentrazione di L-arginina o di altro amminoacido essenziale varia da 0,001% a 0,4%. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da 0,005% a 0,3%. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione varia da circa 0,01% a 0,2%. Secondo ancora un'altra forma di realizzazione, la concentrazione di L-arginina o di altro amminoacido essenziale o semiessenziale è di circa 0,1%.

Opzionalmente, si potrebbe aggiungere la L-arginina e/o qualsiasi altro amminoacido essenziale ad una qualsiasi delle nuove composizioni proposte.

La posologia delle nuove soluzioni oftalmiche dipenderà dalla patologia diagnosticata e dalla sua gravità. Indicativamente, si ritiene che la posologia possa variare tra una goccia al giorno fino ad un massimo di una goccia ogni ora.

Le rivendicazioni così come depositate sono parte integrale di questa descrizione e sono qui incorporate per espresso riferimento.

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Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Soluzione oftalmica comprendente riboflavina e almeno una sostanza scelta nell'insieme costituito da amminoacidi essenziali e semiessenziali, coenzima Q, L-prolina, glieina, lisina cloridrato, L-leucina, L-arginina e composti adatti a stimolare la produzione di metallo proteinasi MMP9 come genisteina, fitoestrogeni, citochine e farmaci antodolorifici non steroidei tra cui acido acetilsalicilico, acido flufenamico, acido meclofenamico, acido mefenamico, acido nifiumico, acido tolfenamico, benorilato, carprofen, celecoxib, cinnoxicam, diflunisal, diclofenac, droxicam, etodolac, etoricoxib, fenoprofene, flurbiprofene, ibufenac, ibuprofene, indometacina, ketoprofene, ketorolac, lornoxicam, lumiracoxib, meloxicam, metamizolo, naprossene, nimesulide, oxaprozin, parecoxib, piroxicam, rofecoxib, sulindac, sudoxicam, tenoxicam, valdecoxib, per proteggere strutture interne del globo oculare da raggi UV-A o per il trattamento del cheratocono con tecnica di cross-linking trans-epiteliale.
2. 2. Soluzione oftalmica secondo la rivendicazione 1, comprendente vitamina E e almeno un composto scelto nel gruppo costituito da amminoacidi essenziali e semi-essenziali, coenzima Q, L-prolina, glieina, lisina cloridrato, L-leucina e L-arginina.
3. 3. Soluzione oftalmica secondo la rivendicazione 1 o 2, comprendente una soluzione di riboflavina-destrano in concentrazione da 0,0001% a 0,5% e almeno una delle seguenti sostanze: vitamina E in concentrazione da 0,0001 mg % mi a 2000mg % mi; coenzima Q in concentrazione da 0,0001 mg % mi a 2000 mg % mi; L-prolina in concentrazione da 0,0001 mg % mi a 2000 mg % mi; glicina in concentrazione da 0,0001 mg % mi a 2000 mg % mi; lisina cl oridrato in concentrazione da 0,0001 mg % mi a 2000 mg % mi; L-leucina in concentrazione da 0,0001 mg % mi a 2000 mg % mi; L-arginina o un altro amminoacido essenziale o semi-essenziale in concentrazione da 0,00001% a 0,5%.
4. 4. Soluzione oftalmica secondo una delle rivendicazioni da 1 a 3, comprendente una soluzione di riboflavina-destrano in concentrazione pari a circa 0,1% e almeno una delle seguenti sostanze: vitamina E in concentrazione pari a circa 500 mg % mi; coenzima Q in concentrazione pari a circa 100 mg % mi; L-prolina in concentrazione pari a circa 0, 1 mg % mi; glicina in concentrazione pari a circa 0, 1 mg % mi; lisina cloridrato in concentrazione pari a circa 0,05 mg % mi; L-leucina in concentrazione pari a circa 0,08 mg % mi; L-arginina o un altro amminoacido essenziale o semi-essenziale in concentrazione pari a circa 0,1%.
5. 5. Soluzione oftalmica secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4, comprendente riboflavina-destrano 0,1%, vitamina E TPGS (D-alfa-tocoferil polietilenglicol 1000 succinato) 500 mg % mi, Coenzima Q 100 mg.% mi, L-prolina 0,1 mg %, glicina 0,1 mg %, lisina cloridrato 0,05 mg % e L-leucina 0,08 mg %.
6. 6. Soluzione oftalmica secondo una delle rivendicazioni da 1 a 5, in forma di collirio o gel o in forma idonea ad essere applicata su lenti a contatto terapeutiche.
7. 7. Uso di almeno una sostanza scelta nell'insieme costituito da amminoacidi essenziali e semi-essenziali, coenzima Q, L-prolina, glieina, lisina cloridrato, L-leucina, L-arginina e composti adatti a stimolare la produzione di metallo proteinasi MMP9 come genisteina, fitoestrogeni, citochine e farmaci antodolorifici non steroidei tra cui acido acetilsalicilico, acido flufenamico, acido meclofenamico, acido mefenamico, acido nifiumico, acido tolfenamico, benorilato, carprofen, celecoxib, cinnoxicam, diflunisal, diclofenac, droxicam, etodolac, etoricoxib, fenoprofene, flurbiprofene, ibufenac, ibuprofene, indometacina, ketoprofene, ketorolac, lornoxicam, lumiracoxib, meloxicam, metamizolo, naprossene, nimesulide, oxaprozin, parecoxib, piroxicam, rofecoxib, sulindac, sudoxicam, tenoxicam, valdecoxib, per la preparazione di una soluzione oftalmica contenente riboflavina per proteggere strutture interne del globo oculare da raggi UV-A o per il trattamento del cheratocono con tecnica di cross-linking transepiteliale.
8. 8. Uso secondo la rivendicazione 7, in cui detta soluzione oftalmica comprende vitamina E e almeno un composto scelto nell'insieme costituito da amminoacidi essenziali e semi-essenziali, coenzima Q, L-prolina, glieina, lisina cloridrato, L-leucina e L-arginina.
9. 9. Metodo di preparazione di una soluzione oftalmica secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6, comprendente le operazioni di aggiungere almeno una sostanza scelta nell'insieme costituito da amminoacidi essenziali e semi-essenziali, coenzima Q, L-prolina, glieina, lisina cloridrato, L-leucina, L-arginina e composti adatti a stimolare la produzione di metallo proteinasi MMP9 come genisteina, fitoestrogeni, citochine e farmaci antodolorifici non steroidei tra cui acido acetilsalicilico, acido flufenamico, acido meclofenamico, acido mefenamico, acido nifiumico, acido tolfenamico, benorilato, carprofen, celecoxib, cinnoxicam, diflunisal, diclofenac, droxicam, etodolac, etoricoxib, fenoprofene, flurbiprofene, ibufenac, ibuprofene, indometacina, ketoprofene, ketorolac, lomoxicam, lumiracoxib, meloxicam, metamizolo, naprossene, nimesulide, oxaprozin, parecoxib, piroxicam, rofecoxib, sulindac, sudoxicam, tenoxicam, valdecoxib, ad una soluzione a base di riboflavina.
10. 10. Uso di una sostanza scelta nell'insieme costituito da amminoacidi essenziali e semi-essenziali, coenzima Q, L-prolina, glieina, lisina cloridrato, L-leucina, L-arginina e composti adatti a stimolare la produzione di metallo proteinasi MMP9 come genisteina, fìtoestrogeni, citochine e farmaci antodolorifici non steroidei tra cui acido acetilsalicilico, acido flufenamico, acido meclofenamico, acido mefenamico, acido nifiumico, acido tolfenamico, benorilato, carprofen, celecoxib, cinnoxicam, diflunisal, diclofenac, droxicam, etodolac, etoricoxib, fenoprofene, flurbiprofene, ibufenac, ibuprofene, indometacina, ketoprofene, ketorolac, lomoxicam, lumiracoxib, meloxicam, metamizolo, naprossene, nimesulide, oxaprozin, parecoxib, piroxicam, rofecoxib, sulindac, sudoxicam, tenoxicam, valdecoxib, come permeation enhancer per la preparazione di una soluzione oftalmica contenente riboflavina.