ITRM980293A1 - Esteri perfluorurati di alcanoil l-carnitine utilizzabili quali lipidi cationici per l'immissione intracellulare di composti - Google Patents

Esteri perfluorurati di alcanoil l-carnitine utilizzabili quali lipidi cationici per l'immissione intracellulare di composti Download PDF

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ITRM980293A1
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Claudio Pisano
Mose Santaniello
Lucia Critelli
Nazareno Scafetta
Maria Grazia Cima
Andrea Pucci
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Description

La presente invenzione riguarda una classe di nuovi esteri perfluorurati di alcanoil L-camitine ed il loro uso quali lipidi cationici atti a favorire l’immissione (“delivery”) intracellulare di composti farmacologicamente attivi facilitandone il trasporto transmembrana o a promuoverne l’interazione con specifici siti (recettori) delle membrane cellulari.
Con il termine “immissione (“delivery”) intracellulare” si intende qui comprendere la transfezione cellulare con polinucleotidi dotati di attività terapeutica e l’introduzione nelle cellule di farmaci antivirali o peptidi immunogenici.
Molte delle sostanze farmacologicamente attive, come ad esempio polipeptidi e proteine o farmaci in genere, per esercitare il loro effetto influenzando le funzioni cellulari a livello subcellulare o molecolare devono penetrare nell’interno delle cellule. Per queste molecole la membrana cellulare rappresenta una barriera selettivamente impermeabile. La membrana cellulare svolge infatti una funzione protettiva prevenendo l’ingresso di sostanze potenzialmente tossiche ma anche il passaggio di composti ad attività terapeutica. La complessa composizione delle membrane cellulari comprende fosfolipidi, glicolipidi e proteine; la sua funzione è influenzata da componenti citoplasmatici quali Ca<++ >ed altri ioni, anioni, ATP, microfilamenti, microtubuli, enzimi e proteine che legano il Ca<++>. L’interazione tra i componenti strutturali e citoplasmatici delle cellule e la risposta ai segnali esterni sono responsabili della selettività mostrata dai e tra i diversi tipi cellulari. L’effetto barriera delle membrane può essere superato dall’associazione di sostanze in complessi con formulazioni lipidiche che riproducono la composizione dei lipidi naturali delle membrane. Questi lipidi sono capaci di fondersi con le membrane e di rilasciare le sostanze ad essi associate all’interno delle cellule. I complessi lipidici possono non solo facilitare il trasferimento intracellulare mediante la fusione con le membrane ma anche diminuire la repulsione di carica tra la membrana e la molecola che deve penetrare nella cellula. I lipidi antipatici, come i fosfolipidi di membrana, formano vescicole lipidiche o liposomi nei sistemi acquosi.
I liposomi sono vescicole in cui un volume acquoso è interamente racchiuso da una o più membrane composte da molecole lipidiche, usualmente fosfolipidi. I fosfolipidi, che consistono di una testa idrofila e di una coppia di catene carboniose (coda idrofobica), rappresentano i maggiori componenti delle membrane biologiche. In soluzione acquosa le code idrofobiche si autoassociano ad escludere l’acqua, mentre le teste idrofiliche interagiscono con il mezzo formando spontaneamente popolazioni di vescicole con diametri che possono variare. I lipidi sono generalmente zwitterionici, neutri o anionici. Tali vescicole possono essere utilizzate come carrier di farmaci, di piccole molecole, proteine, nucleotidi e plasmidi.
Negli ultimi anni i liposomi cationici, una classe di vescicole cariche positivamente preparate da lipidi sintetici, sono ampiamente utilizzati per il trasferimento di materiale genetico all’interno delle cellule. La carica negativa del DNA può interagire con le cariche positive dei lipidi cationici formando un complesso stabile DNA-liposoma. La semplicità e la versatilità di questa tecnologia ha fatto dei liposomi un importante veicolo per il delivery di geni per la terapia genica nell’uomo. Attualmente la maggior parte dei vettori utilizzati per la terapia genica ed approvati dalla NIH Recombinant Advisory Commitee includono sistemi virali e sintetici.
L’infezione virale comporta una serie di meccanismi complessi per poter colpire una specifica cellula e portare il DNA nel nucleo. Il principio dell’utilizzo di vettori virali per la terapia genica è basato sulla possibilità di sostituire i geni virali con geni che codificano per una funzione terapeutica, senza eliminare la capacità della particella virale di infettare le cellule. I limiti della terapia virale riguardano quegli elementi virali che possono essere immunogenici, citopatici e ricombinogenici.
Grandi speranze vengono poste nell’uso dei lipidi cationici per la terapia genica. Questi vettori hanno una grande potenzialità rispetto a quelli di origine biologica essendo molto più sicuri, meno tossici ed avendo inoltre la possibilità di incorporare geni di grandi dimensioni. Rispetto ai vettori di tipo biologico hanno però una basso rendimento di transcrizione genica intracellulare; tuttavia è da tener presente che l’utilizzo di tali sistemi di transfezione è in uno stadio iniziale di ricerca. I lipidi cationici giocano un ruolo molto importante nella formazione del complesso DNA-lipide, nell’interazione complesso- cellula, nella fusione con la membrana, nel rilascio del DNA all’in terno della cellula e nella trascrizione.
Ci sono importanti esempi di applicazioni in vivo dei liposomi cationici. Il primo trial clinico di terapia genica umana fu condotto mediante l’introduzione di un vettore di espressione contenente il gene umano HLA-B7 complessato a liposomi per la cura del melanoma. Un’altra importante applicazione riguarda la cura della fibrosi cistica polmonare mediante somministrazione per via polmonare o come spray nasale del vettore di espressione SV-40C-FTR complessato a liposomi. Altri trial clinici che prevedono l’utilizzo dei liposomi nella terapia genica del cancro sono attualmente in corso.
Nella struttura dei lipidi cationici si individuano generalmente quattro elementi costitutivi: la testa cationica carica positivamente, lo spaziatore, il lipide ancora e il legame linker.
La testa cationica è responsabile delle interazioni tra i liposomi cationici ed il DNA, tra il complesso DNA-liposomi e la membrana cellulare e gli altri componenti della cellula. Essa è costituita da gruppi mono o policationici (in funzione del numero delle cariche) che possono essere variamente sostituiti.
Lo spaziatore rappresenta la parte della molecola che separa la testa cationica dalla coda idrofobica ed è coinvolto nell’assicurare un contatto ottimale tra la testa cationica e le cariche negative dei fosfati del DNA.
Il lipide ancora costituisce la parte non polare, idrocarburica della molecola e determina le proprietà fisiche del doppio strato lipidico come la rigidità e la velocità di scambio con i lipidi di membrana.
Per legame “linker” si intende il legame tra le catene idrocarburiche e la parte restante della molecola. Tale legame determina la stabilità chimica e la biodegradabilità dei lipidi cationici.
La letteratura scientifica e brevettuale è ricca di riferimenti alla preparazione ed utilizzazione dei liposomi; tuttavia solo la domanda di brevetto EP 0 279 887 A2 descrive l’uso di un derivato della carnitina e cioè della fosfatidilcamitina eventualmente in miscele con altri fosfolipidi e lipidi (colesterolo, fosfatidilcolina, fosfatidilserina), per la preparazione di liposomi.
Nell’unico esempio fornito riguardante la preparazione di liposomi, vengono prodotti liposomi di fosfatidilcamitina che inglobano propranololo, farmaco, come noto, attivo quale antiipertensivo, antianginoso e antiaritmico. Il derivato della carnitina viene qui utilizzato per lo spiccato tropismo della carnitina nei riguardi del miocardio. Tale tropismo consente di evitare che i liposomi vengano metabolizzati dal fegato anziché raggiungere il sito-bersaglio desiderato.
La presenza della fosfatidilcamitina rende inoltre possibile la somministrazione di liposomi per via orale in quanto resistenti alle lipasi intestinali.
E’ stato ora trovato che lipidi cationici potentemente attivi nel favorire Timmissione (delivery) intracellulare di compositi bioattivi sono costituiti dagli esteri perfluorurati di alcanoil L-camitine di formula (I):
in cui:
Ri è alcanoile, lineare o ramificato, avente 2-20, preferibilmente 4-12, atomi di carbonio, eventualmente perfluorurato;
R2 è alchile perfluorurato, lineare 0 ramificato, avente 4-20, preferibilmente 5-12, atomi di carbonio; e
X<- >è l’anione di un acido farmacologicamente accettabile.
Esempi non limitativi di Ri sono: acetile, propionile, butirrile, valerile, isovalerile, undecanoile, lauroile, tridecafluoroeptanoile, eptadecafluorononanoile, eptacosafluoromiristoile, pentadecafluoroottanoile, 5H-ottafluoropentanoile.
Per alchile “perfluorurato” R2 si deve qui intendere un alchile in cui almeno il 40% degli atomi di idrogeno siano sostituiti da atomi di fluoro.
Esempi non limitativi di siffatti alchili perfluorurati R2 sono:
Per anione di acido farmacologicamente accettabile si intende l’anione di un acido che non dia origine ad indesiderati effetti tossici o collaterali.
Tali acidi sono ben noti ai farmacologi ed agli esperti di tecnologia farmaceutica.
Esempi non limitativi di tali anioni sono ad esempio cloruro; bromuro; ioduro; aspartato; aspartato acido; citrato; citrato acido; tartrato; fosfato; fosfato acido; fumarato; fumarato acido; glicerofosfato; glucosiofosfato; lattato; maleato; maleato acido; orotato; ossalato; ossalato acido; solfato; solfato acido; tricloroacetato; trifluoroacetato e metansolfonato.
Vengono di seguito fomiti alcuni esempi non limitativi di preparazione di composti secondo la presente invenzione.
ESEMPIO 1
Preparazione di undecanoil-L-carnitina cloniro 1,1 H - 2.2 H -eptadecafluorodecil estere (ST 12231.
Undecanoil-L-carnitina cloruro (6,6 g; 0,018 moli) precedentemente essiccata sotto vuoto a 40°C, venne sciolta in 20 mL di CH2CI2 anidro.
Alla soluzione così ottenuta venne aggiunto goccia a goccia tionile cloruro (2,2 mL; 0,03 moli), a 0°C sotto agitazione.
La risultante miscela, la cui temperatura venne fatta salire a temperatura ambiente, venne mantenuta sotto agitazione per 3 ore. Successivamente la soluzione venne concentrata sotto vuoto, il residuo venne ripreso con CH2CI2 (50 mL x 3 volte) e la soluzione nuovamente concentrata sotto vuoto.
Il cloruro acido della undecanoil-L-carnitina così ottenuto venne solubilizzato in 20 mL di cloruro di metilene anidro e la risultante soluzione aggiunta goccia a goccia a 0°C al 1,1 H - 2,2 H -eptadecafluorodecan-l-olo (13,9 g; 0,03 moli).
La risultante miscela di reazione venne mantenuta per una notte a temperatura ambiente sotto agitazione.
Successivamente venne aggiunto etere di petrolio fino a completa precipitazione di un prodotto oleoso.
Il grezzo di reazione venne purificato per cromatografìa su gel di silice eluendo con CHCI3; CHCl3-MetOH 95-5
Si ottennero 4 g del prodotto del titolo. Resa: 27%
Analisi elementare per C28H39NO4F17CI
Calcolato
Trovato
Colonna pBondapak - C18 (10 pm) 3,9 mm X 300 mm
Temp.
Eluente
Flusso
Rt
ESEMPI 2-6
I seguenti composti:
Lauroil-L-camitina cloruro 1,1H - 2,2 H -tridecafluoroottil estere (ST 1221);
Lauroil-L-carnitina cloruro -pentafluoropentil estere (ST 1245);
Undecanoil-L-carnitina cloruro nonailuoroesil estere (ST 1246);
Isovaleril-L-camitina cloru
H - nonafluorodecil estere
Undecanoil-L-carnitina clo
6,6 H - nonafluorodecil estere
vennero preparati come descritto nell’esempio 1.
Nella tabella che segue vengono riportati alcuni dati chimico-fisici significativi di tali composti.
come nell’esempio 1, eluente CH3CH/NH4H2PO4 70/30
Colonna
Temperatura
Eluente
Flusso 0,75 mL/min
come nell’esempio 1, eluente
ESEMPIO 7
Preparazione dei liposomi di STI 223 utilizzati nei saggi di transfezione.
I liposomi furono preparati a partire da 200 mg di STI 223, sintetizzato secondo la procedura riportata nelTESEMPIO 1, solubilizzato in 50 mL di cloroformio (fase di solubilizzazione) . Il solvente fu poi eliminato sotto vuoto per una notte (t 30-40°C; 400-700 mm Hg). Il campione venne idratato con acqua deionizzata fino ad una concentrazione finale di 5mM (fase di idratazione). I liposomi furono quindi sottoposti a sonicazione per 1 ora con intervalli di 10 sec usando un sonicatore a bagno. I liposomi così preparati produssero vescicole unilamellari.
ESEMPIO 8
Formazione del complesso liposoma di ST1223-DNA
Il complesso tra liposoma e DNA fu preparato miscelando le due soluzioni A e B riportate di seguito:
Soluzione A: 2.5 μg di DNA plasmidico (pCMV/β -Gal, 7200 paia di basi utilizzato per l'espressione dell enzima β-Galattosidasi) furono diluiti sterilmente in 50 μΐ di HBS (HEPES 20mM; NaCl 150mM, pH 7.4)
Soluzione B: il liposoma, preparato secondo l 'ESEMPIO 7, fu diluito in H2O distillata fino ad una concentrazione di 1.29 mM e 15 μΐ di questa soluzione fu diluita in 50 μ 1 di H2O distillata.
Le due soluzioni furono miscelate agitando gentilmente ed incubate per 10-30 minuti a temperatura ambiente.
Questa procedura permette di far complessare il DNA che possiede una carica negativa netta con i liposomi che sono invece carichi positivamente formando così il complesso liposoma-DNA.
ESEMPIO 9
Protocollo di transfezione
L'efficienza di transfezione mediata dai liposoma cationici è influenzata da diversi parametri quali presenza o meno di siero nel mezzo di incubazione, dalla linea e dalla densità cellulare. La transfezione di DNA fu eseguita in accordo ai seguenti parametri:
Presenza di siero:
E' noto in letteratura che la presenza di siero nel mezzo di incubazione potrebbe inibire la transfezione mediata da liposomi cationici. I nostri esperimenti furono effettuati in presenza di siero (siero fetale di vitello) mostrando comunque attività.
Scelta delle linee cellulari:
La transfezione del DNA plasmidico pCMV-P-Gal fu condotta in 4 differenti linee cellulari:
HeLa carcinoma uterino umano
MCF-7 adenocarcinoma mammario umano
Caco2 adenocarcinoma colon umano
T98-G glioblastoma umano
Densità cellulare:
La transfezione del DNA plasmidico pCMV- β-Gal mediata da liposomi cationici nelle diverse linee cellulari Hela, MCF-7, Caco2, T98-G fu effettuata a diverse densità cellulari: 100.000/piastra 200.000/piastra 300. 000/ piastra. La maggiore efficienza di transfezione fu osservata a densità 100.000/piastra per CaCo2, 200.000/piastra per HeLa e MCF-7, 300. 000 /piastra per T98-G.
La procedura di transfezione viene descritta di seguito:
le cellule Hela, MCF-7, Caco2, T98-G, vennero fatte crescere 48 ore (37°C, 5% C02) nei seguenti terreni di crescita:
cellule HeLa RPMI-1640 (catalogo HyQ), 10% siero fetale di vitello,
L-glutammina 1%, streptomicina 1%, penicillina 1%. cellule MCF-7 DMEM (terreno di Eagle modificato da Dulbecco, catalogo SIGMA ), 10% siero fetale di vitello, L-glutammina streptomicina 1%, 1% penicillina 1%
cellule Caco2 EMEM (minimo terreno essenziale di Eagle, catalogo SIGMA), 15% siero fetale di vitello, L-glutammina 1%, streptomicina 1%, penicillina 1%
cellule T98-G EMEM (minimo terreno essenziale di Eagle, catalogo SIGMA), 10% siero fetale di vitello, L-glutammina 1%, streptomicina 1%, penicillina 1%
Le cellule furono piastrate a diverse densità (100.000/piastra, 200. 000/ piastra, 300. 000 /piastra) in piastre di Petri (Corning o Falcon) di circa 3 cm di diametro e incubate in 2 mL di terreno per 18 ore prima di essere trattate.
Dopo aver sostituito il terreno con 2 mL di terreno fresco, furono aggiunti a ciascuna piastra 100 pL del complesso liposoma-DN preparato come descritto nell'ESEMPIO 8 e, dopo averle agitate delicatamente, le piastre furono poste in termostato per. 5 ore (37°C, 5% C02). Successivamente le cellule furono lavate tre volte con 5 mL di tampone PBS (catalogo Gibco) per ogni piastra e incubate per 16 ore (37°C, 5% C02).
Dopo aver lavato le cellule tre volte con tampone PBS (catalogo Gibco) per ogni piastra, le proteine totali furono estratte e 50 pg di esse furono caricate per ogni pozzetto per determinare la produzione di β-Galattosidasi mediante "immunoassay" (β-Gal ELISA Kit, Boehringer).
ESEMPIO 10
In tabella 1 e in figura 1 sono riportati i dati di espressione dell'enzima β -Gaiatto ssidasi (β-Gal) in funzione della densità cellulare in cellule HeLa. La procedura di transfezione è descritta nell'ESEMPIO 9.
In tabella 2 e in figura 1 sono riportati i dati di espressione dell'enzima β- Gaiatto ssidasi (β-Gal) in funzione della densità cellulare in cellule MCF-7. La procedura di transfezione è descritta nell’ESEMPIO 9.
In tabella 3 e in figura 1 sono riportati i dati di espressione deH’enzima β-Galattossidasi (β-Gal) in funzione della densità cellulare in cellule T98-G. La procedura di transfezione è descritta nell'ESEMPIO 9.
In tabella 4 e in figura 1 sono riportati i dati di espressione dell'enzima β-Galattossidasi (β-Gal) in funzione delta densità cellulare in cellule Caco2. La procedura di transfezione è descritta nell'ESEMPIO 9.

Claims (13)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Estere perfluorurato di alcanoil L-camitina di formula (I)
  2. m cui: Ri è alcanoile, lineare o ramificato, avente 2-20 atomi di carbonio, eventualmente perfluorurato; R2 è alchile perfluorurato, lineare o ramificato, avente 4-20 atomi di carbonio; e ΧΓ è l’anione di un acido farmacologicamente accettabile.· Estere secondo la rivendicazione 1 in cui Ri è scelto nel grupp comprendente acetile, propionile, butirrile, valerile, isova undecanoile, lauroile, tridecafluoroeptanoile, eptadecafluororoma noile, eptacosafluoromiristoile, pentadecafluoro-ottanoile, ottafluoropentanoile .
  3. decile; 1,1H-2,2H enicosafluorododecile; e l,lH-tricosafluorododecile.
  4. 4. Estere secondo la rivendicazione 1, in cui Ri ha 4-12 atomi di carbonio e R2 ha 5-12 atomi di carbonio.
  5. 5. Estere secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui X<- >è scelto nel gruppo comprendente cloruro; bromuro; ioduro; aspartato; aspartato acido; citrato; citrato acido; tartrato; fosfato, fosfato acido; fumarato; fumarato acido; glicerofosfato; glucosiofosfato; lattato; maleato; maleato acido; orotato; ossalato; ossalato acido; solfato; solfato acido; tricloroacetato; trifluoroacetato e metansolfonato.
  6. 6. Undecanoil-L-camitina cloruro 1,1H - 2,2H - eptadecafluorodecil estere.
  7. 7. Lauroil-L-carnitina cloruro 1,1H - 2,2H - tridecafluoroottil estere.
  8. 8. Lauroil-L-carnitina cloruro 1,1H - 2,2H - 3,3H -pentafluoropentil estere.
  9. 9. Undecanoil-L-carnitina cloruro 1, 1H - 2,2H - nonafluoroesil estere.
  10. 10. Isovaleril-L-carnitina cloruro 1,1H - 2,2H - 3,3H - 4,4H - 5,5H 6,6H - nonafluorodecil estere.
  11. 11. Undecanoil-L-carnitina cloruro 1, IH - 2,2H - 3,3H - 4,4H - 5,5H 6,6 H - nonafluorodecil estere.
  12. 12. Uso di un estere secondo una qualsiasi rivendicazione 1-11 per la produzione di liposomi.
  13. 13. Liposoma comprendente un estere perfluorurato di alcanoil L-camitina di formula (I) in cui:
    Ri è alcanoile, lineare o ramificato, avente 2-20 atomi di carbonio, eventualmente fluorurato; R2 è alchile perfluorurato, lineare o ramificato, avente 4-20 atomi di carbonio; e ΧΓ è l’anione di un acido farmacologicamente accettabile. 4.' Liposoma secondo la rivendicazione 13 in cui Ri è scelto nel gruppo comprendente acetile, propionile, butirrile, valerile, isovalerile, undecanoile, lauroile, tridecafluoroeptanoile, eptadecafluorononanoile, eptacosafluoromiristoile, pentadecafluoroottanoile, 5H-ottafluoropentanoile, R2 è scelto nel gruppo comprendente decafluoroottile; pentafluoropenti -nonafluoroesile;
    4,4H-5,5H-6,6H-nonafluorodecile, eptadecafluorodecile; 1,1H-2,2H enicosailuorododecile; e l,lH-tricosafluorododecile e X<- >è scelto nel gruppo comprendente cloruro; bromuro; ioduro; aspartato; aspartato acido; citrato; citrato acido; tartrato; fosfato; fosfato acido; fumarato; fumarato acido; glicerofosfato; glucosiofosfato; lattato; maleato; maleato acido; orotato; ossalato; ossalato acido; solfato; solfato acido; tricloroacetato; trifluoroacetato e metansolfonato.
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