ITRM20120043A1 - Formulazione per ibs. - Google Patents

Description

"FORMULAZIONE PER IBS"

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda una formulazione efficace per il trattamento o la prevenzione della sindrome dell’intestino irritabile un metodo di trattamento degli stessi e procedimenti per la preparazione di tali formulazioni.

STATO DELLA TECNICA ANTERIORE

La sindrome dell’intestino irritabile (in inglese, Irritable Bowel Syndrome, IBS) à ̈ il prototipo dei disordini funzionali cronici dell’apparato gastrointestinale, molto comune in tutto il mondo, essa appartiene alla classe di malattie funzionali dell’apparato digerente, ovvero senza alterazioni patologiche strutturali e/o anomalie biochimiche. La fisiopatologia e l’eziologia di questa malattia non sono note, quindi la sua diagnosi non può essere effettuata mediante i comuni esami medici (alterazioni anatomiche o marker biochimici), ma mediante la valutazione di sintomi clinici, quali il riscontro di dolore o fastidio addominale ricorrente e di alterazioni delle funzioni intestinali, quali irregolarità dell’alvo, stipsi e/o diarrea e/o anomalia della consistenza delle feci.

Recenti dati epidemiologici indicano che nella popolazione adulta occidentale la IBS può arrivare ad una incidenza del 20%, mentre in Italia l’incidenza risulta addirittura superiore, pari al 30%. In base a statistiche mediche ufficiali il rapporto donna/uomo tra le persone che soffrono di IBS varia da 2:1 a 4:1. Le donne quindi sono circa 1,5 volte più colpite da IBS degli uomini, sono prevalentemente giovani e affette dalla forma stitica, mentre in generale i sottotipi di IBS con predominanza di diarrea e con alvo alterno sono più comuni rispetto alla forma con prevalenza di stipsi. La sindrome viene inoltre maggiormente diagnosticata nelle classi socioeconomiche più basse e nei soggetti di età inferiore ai 50 anni.

La IBS à ̈ una condizione generalmente persistente che può diventare recidivante o cronica; richiede quindi un frequente ricorso al medico, sia di medicina generale, sia di uno specialista e la quantità di lavoro generata dai pazienti con IBS costituisce approssimativamente un terzo di tutte le visite gastroenterologiche.

La IBS può fortemente condizionare la vita di chi ne soffre, che sente il problema come fastidioso, spesso doloroso e limitante. La persona vive sensazioni di disagio e inibizione; tale disturbo infatti influenza oltre che le funzioni fisiche, anche quelle emotive: ci si sente limitati ed emotivamente sofferenti. Soffrire di IBS significa convivere con dolore e gonfiore addominali variabili per frequenza e intensità, ma più frequentemente d’intensità elevata. La IBS quindi à ̈ un disturbo che influenza negativamente le attività quotidiane e peggiora notevolmente la qualità della vita, con ridotta produttività nel lavoro, ripetute visite mediche, perdita di giorni di scuola o di lavoro e conseguenti costi sanitari elevati in termini di assistenza sanitaria e produttività.

La sindrome dell’intestino irritabile rappresenta un disturbo eterogeneo, per il quale non à ̈ identificabile un fattore eziologico ben definito in quanto à ̈ data da un insieme articolato di cause ed effetti. La IBS presenta un quadro complesso di multifattorialità, in cui l’insorgenza dei sintomi può essere legata anche a ipersensibilità viscerale e alterazione della motilità gastrointestinale, oltre che a fattori genetici, psicologici, ambientali e comportamentali, tali da definirla anche come una disfunzione “biopsicosociale†.

Sembra che sia causata da una combinazione di alterazioni delle funzioni motorie e della sensibilità viscerali, spesso associate a disturbi affettivi. La alterazioni dell’alvo, che possono presentarsi sotto forma di stipsi, diarrea o di entrambe in tempi differenti, hanno portato alla classica interpretazione della IBS come “disturbo della motilità†, ma le alterazioni motorie non sono in grado di spiegare interamente il quadro clinico. Recentemente à ̈ stata posta un’enfasi maggiore sulla patogenesi del dolore accusato da questi pazienti, e vi sono considerevoli evidenze circa l’aumentata sensibilità viscerale agli stimoli, sia nocivi che fisiologici, nei soggetti affetti da tale sindrome. Un’ipotesi ampiamente accettata à ̈ che, nei soggetti geneticamente predisposti, un danno viscerale transitorio porti a una sensibilizzazione duratura del circuito neurale del dolore, nonostante la risoluzione completa dell’evento patologico iniziale.

Tra i fattori ambientali/comportamentali sembra che stress e alimentazione siano tra le principali cause della IBS, ma per quanto riguarda le abitudini alimentari, il rapporto tra alimentazione e IBS à ̈ complesso. In certi casi si verifica una relazione tra pasti e insorgenza del dolore/gonfiore addominale e in alcuni casi la comparsa dei sintomi à ̈ legata all’ingestione di determinati cibi, ma prima di arrivare a una dieta da esclusione à ̈ necessario individuare uno stretto ed evidente rapporto con una categoria particolare di cibi. Inoltre una parte significativa dei soggetti che vengono trattati solo con restrizioni dietetiche o supplementi di fibra continua a lamentare sintomi e viene sottoposta a continui e diversi tentativi terapeutici.

In conclusione, la fisiopatologia della IBS à ̈ tuttora molto dibattuta. Le ipotesi correnti sono svariate ed includono la dismotilità del tratto gastrointestinale, un’alterazione della sensibilità viscerale o centrale, funzioni autonomiche disordinate, rilascio di mediatori dell’infiammazione e disturbi psicosociali; ne deriva quindi che questi diversi meccanismi non riescono ad essere controllati adeguatamente con un unico trattamento farmacologico.

I trattamenti della IBS sono molto diversi ed oscillano dalla educazione comportamentale, all’impiego di nuovi modulatori selettivi dei recettori serotoninergici; ma ad oggi non esiste un farmaco di riferimento per una terapia efficace della IBS.

Poiché la IBS non presenta caratteristiche anatomiche specifiche da ricercare e non ci sono marcatori biologici di riferimento (come invece per il morbo di Chron o per la malattia celiaca), la diagnosi della IBS si basa su un’accurata valutazione dei sintomi clinici, quali dolore o fastidio addominale cronico e alterazioni delle funzioni intestinali (stipsi,diarrea e/o anomalia consistenza delle feci, anche se possono coesistere altri sintomi a carico di tutto il tratto gastrointestinale) e sull’esclusione di altre patologie.

La contemporanea presenza di sintomi addominali diversi, anche opposti, era nota già oltre un secolo fa, al punto che Cumming nel 1849 scrisse “L’intestino può essere stitico o diarroico nella stessa persona e io confesso di non saper spiegare il motivo di sintomi così opposti†. La prima descrizione della sindrome dell’intestino irritabile à ̈ attribuita a Powell nel 1818, ma fino a tempi recenti à ̈ stata identificata come una patologia diagnosticabile soltanto “per esclusione†di altre patologie e non tramite specifici criteri o parametri clinici.

Le prime valutazioni cliniche diagnostiche dell’IBS sono iniziate attraverso delle ricerche negli anni ’70 nel Regno Unito che portarono nel 1978 all’elaborazione dei criteri di Manning, in cui veniva impiegato un questionario di 15 domande, finalizzato a differenziare sulla base di sintomi, la IBS da disfunzioni che potevano essere interpretate come malattie addominali di tipo organico.

Gruppi internazionali di esperti, riuniti sul tema dei Disturbi Gastrointestinali Funzionali, hanno elaborato criteri diagnostici conosciuti col nome di Criteri di Roma I, II e III ed hanno definito la IBS come “un gruppo di disordini intestinali funzionali nei quali il dolore addominale à ̈ associato alla defecazione o a modificazione delle abitudini dell’intestino o a percezione soggettiva di alterata defecazione†. La IBS à ̈ definita indifferentemente come sindrome o come disfunzione.

L’attuale possibilità di realizzare una diagnosi di IBS “in positivo†, basandosi su definiti e specifici criteri di valutazione dei sintomi oltre che sull’esclusione di altre possibili patologie à ̈ di fondamentale rilevanza, contribuendo ad un corretto inquadramento dei pazienti e ad un adeguato supporto terapeutico, nonché ad una conoscenza più approfondita della IBS, compresa l’epidemiologia e i fattori di rischio .

Mediante i criteri di Roma III, sono state definite tipologia e frequenza dei sintomi, caratterizzando i pazienti affetti da IBS come quelli rispondenti alle caratteristiche elencate nel riquadro sottostante

CRITERI DIAGNOSTICI DI ROMA III PER LA IBS

Dolore o discomfort* addominale ricorrente per almeno 3 giorni al mese, negli ultimi 3 mesi, associato a due o più dei seguenti sintomi:

1. miglioramento con l’evacuazione

2. comparsa associata a variazioni nella frequenza delle evacuazioni

3. comparsa associata a variazioni nella consistenza delle feci

*discomfort indica una sensazione fastidiosa non descritta come dolore.

Nei casi di ricerche di patofisiologia e trial clinici, una frequenza di dolore/discomfort di almeno 2 giorni a settimana durante lo screening di valutazione per l’idoneità dei soggetti

Il dolore/fastidio addominale oltre ad essere associato ad alterazioni dell’alvo può comprendere anche altri sintomi, come la flatulenza o i crampi che sono comuni ad altri disordini dell’apparato digerente, come per esempio la dispepsia.

La predominanza di forme a diarrea o a stipsi ha portato alla divisione della sindrome dell’intestino irritabile in 2 sottotipi principali: IBS-D, a diarrea e IBS-C (constipation) a stipsi, mentre la forma mista, viene denominata con l’acronimo IBS-M.

Esiste inoltre la possibilità che la sindrome dell’intestino irritabile si manifesti in seguito ad un’infezione gastrointestinale, in questo caso viene classificata come PI-IBS (Post Infective) e rispetto alle altre forme si può presentare con un’alterazione della funzione immunitaria dell’intestino (infiltrato di linfociti e NO sintasi nelle feci).

L’attuale approccio farmacologico alla sindrome dell’intestino irritabile riflette la sua natura multifattoriale. La terapia à ̈ prevalentemente sintomatica e aspecifica.

Prima del trattamento farmacologico, ai pazienti con sintomi lievi, sono inizialmente consigliati: cambiamenti dello stile di vita (incremento dell’attività fisica e adeguato tempo per la defecazione sono di utilità soprattutto per gli stitici), restrizione dietetica (eccessivo consumo di caffeina, carboidrati indigeribili e elevata assunzione di lattosio favoriscono la forma di IBS a diarrea) e integrazione di fibre, utili, soprattutto le solubili, per tutti i tipi di IBS. Tali accorgimenti apportano solo benefici marginali o risultano in un fallimento per numerosi pazienti, che continuano a lamentare i sintomi e che in un secondo momento sono sottoposti a differenti alternative terapeutiche/farmacologiche.

I pazienti che soffrono di episodi di dolore addominale saltuario e di grado moderato sono spesso trattati con farmaci che riducono la contrattilità della muscolatura liscia intestinale, spasmolitici o antispastici. Questi farmaci hanno lo scopo di diminuire la motilità gastrointestinale per ridurre il dolore addominale e crampi in tutti le varie tipologie di IBS, ma necessitano una contemporanea terapia con pro cinetici o lassativi per aumentare la motilità intestinale nei casi di stipsi. Appartengono alle categorie degli anticolinerigici, antagonisti dei canali del Ca+2 e antagonisti dei recettori periferici degli oppiodi. Tipicamente sono somministrati al bisogno, quindi alla comparsa del dolore, o prima dei pasti per prevenire il dolore e l’urgenza dell’evacuazione tipica di alcuni pazienti con IBS. La maggior parte di questi agenti viene utilizzata da molti anni, ma il loro impiego à ̈ stato oggetto di critiche e i loro effetti collaterali sono spesso fastidiosi. Gli antispasmodici anticolinergici producono effetti avversi ben noti, di cui i pazienti devono essere informati in modo chiaro: bocca secca, visione confusa e vertigine.

In anni più recenti il trattamento si à ̈ focalizzato sul trattamento farmacologico della sensibilità viscerale e sebbene le basi farmacologiche di questa iperalgesia non sono note, à ̈ stato ipotizzato un coinvolgimento della serotonina sul suo ruolo nella sensibilizzazione dei neuroni nocicettivi in condizioni infiammatorie. Ciò ha portato allo sviluppo di modulatori selettivi di sottotipi recettoriali della serotonina, quali il tegaserod, agonista parziale 5-HT4, e l’alosetron, agonista dei recettori 5-HT3.

Il Tegaserod, l’unico procinetico che era stato autorizzato dall’FDA per il trattamento dell’ IBS con prevalenza di stipsi à ̈ stato ritirato dal mercato nel 2007 a causa dei rischi di gravi eventi cardiovascolari (ictus, infarto del miocardio, angina pectoris) per un uso a breve termine. Altri pro cinetici comunemente usati nella pratica clinica sono il domperidone, la metoclopramide, la cisapride e la renzapride, anche se non hanno specifiche indicazioni per l’intestino irritabile.

L’alosetron, primo farmaco ad essere stato approvato per la sindrome dell’intestino irritabile a impronta prevalentemente diarroica nelle donne, riduce la contrattilità gastroenterica, diminuendo il transito colico e aumentando l’assorbimento di liquidi. In generale farmaci di questa categoria producono effetti opposti rispetto agli agonisti 5-HT4 (tegaserod). L’alosetron poco dopo la sua immissione in commercio fu ritirato dal mercato negli Stati Uniti, a causa di un’elevata incidenza di casi di colite ischemica (3 ogni 1000 pazienti) che avevano reso necessario l’intervento chirurgico e persino condotto alla morte un numero ristretto di casi. Tuttavia l’FDA ha recentemente approvato l’impiego di questo farmaco, a distribuzione controllata, per la sindrome dell’intestino irritabile a impronta prevalentemente diarroica. Mentre classici farmaci 5-HT3 inibitori selettivi, come l’ondansetron, granisetron, cinansetron sono frequentemente prescritti per la IBS a diarrea, ma anche per molti altri differenti disturbi, quali per esempio nausea e vomito. Il preferito rimane l’alosetron per la specificità verso la sindrome dell’intestino irritabile con diarrea e per il numero di effetti collaterali più contenuto, nonostante Il suo utilizzo à ̈ comunque limitato a causa dei gravi effetti collaterali che potrebbe causare, tra cui la già citata ischemia del colon.

Gli agonisti dei recettori α2-adrenergici, come la clonidina sono anch’essi in grado di aumentare la compliance viscerale e il dolore associato alla distensione, mentre l’octreotide, analogo della somatostatina esercita effetti anti-inibitori selettivi sui nervi periferici afferenti cha dall’intestino proiettano al midollo spinale e riduce la percezione della distensione rettale nei pazienti affetti da IBS.

Altre terapie sono gli psicofarmaci, in particolare gli antidepressivi: inibitori selettivi della ricaptazione della Serotonina (SSRI) e triciclici (TCA), a dosi efficaci che sono significativamente minori rispetto a quelle usate per la terapia della depressione.

Gli SSRI hanno meno effetti collaterali rispetto ai TCA e vengono utilizzati in particolare nei pazienti che lamentano alterazioni dell’alvo a impronta stitica, dal momento che sono in grado di aumentare la peristalsi intestinale; ma non riducono il gonfiore addominale o viscerale.

Altri trattamenti sono le benzodiazepine (BDZ) che sono rivolte verso la componente eziologica ansiogena ed hanno un effetto confutabile nel trattamento dell’ IBS.

Per la componente diarroica à ̈ usato molto il loperamide ma per bevi periodi, per il rischio a lungo termine di sviluppare tolleranza all’effetto antidiarroico. Un altro oppiaceo che viene prescritto à ̈ la codeina, ma con rischi noti di sedazione e dipendenza.

La valutazione dei probiotici per trattare la IBS à ̈ stata riepilogata in studi di metanalisi che hanno mostrato un modesto miglioramento del gonfiore, dolore addominale e difficoltà di movimenti intestinali. Nessun ceppo probiotico specifico à ̈ stato trovato superiore agli altri e sono spesso usate combinazioni di batteri; rimangono quindi aperte numerose domande, quale tipo di probiotico, che quantità e che tempo di somministrazione.

Recentemente tra le terapie del trattamento dell’IBS, à ̈ spesso impiegata la psicoterapia (terapia del comportamento cognitivo, psicoterapia dinamica, ipnoterapia, tecniche di rilassamento), ma solo per le forme più gravi, associate a disturbi psicologici o a stati depressivi o ansiosi ma i suoi benefici sono solo parziali Attualmente sono spesso utilizzati farmaci sintomatici per aiutare le persone affette da IBS. Tali sintomatici sono soprattutto spasmolitici, antidiarroici e lassativi.

Esistono anche farmaci che influiscono farmacologicamente sull’ipersensibilità viscerale, mentre non esiste un coadiuvante specifico che agisca attraverso meccanismi protettivi non farmacologici.

È quindi evidente che il trattamento della IBS sia ancora privo di terapia utile e specifica, con effetti collaterali bassi, commisurati al basso pericolo della sindrome, ma una elevata efficacia, commisurata al grave disturbo che la IBS causa alla qualità della vita di chi ne à ̈ affetto.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione fornisce una composizione per la cura e/o la prevenzione della Sindrome dell’Intestino Irritabile (anche indicata come sindrome del colon irritabile) comprendente resine e/o loro estratti, polisaccaridi e/o estratti vegetali comprendenti polisaccaridi, antiossidanti e/o estratti vegetali comprendenti antiossidanti di origine vegetale, un metodo per la cura e/o la prevenzione dell’IBS e un metodo per la preparazione di detta composizione.

Date le controversie sulle cause della IBS e sulle terapie da attuare per la cura della malattia, lo sviluppo di nuove composizioni atte a prevenire o a curare la malattia à ̈ piuttosto complesso in quanto non esistono insegnamenti concordi nello stato dell’arte.

Gli autori della presente invenzione hanno selezionato delle componenti di origine vegetale/naturale ed hanno creato una miscela il cui effetto à ̈ stato saggiato in test in vitro e anche con pazienti affetti da IBS. La composizione realizzata dagli inventori e oggetto della presente descrizione, ha dato risultati efficaci paragonabili anche a quelli ottenibili con farmaci attualmente di elezione senza dare effetti indesiderati.

La composizione, pertanto, à ̈ utilizzabile anche a scopo preventivo, ad esempio, in quei pazienti che abbiano già sofferto di IBS e che siano a rischio di sviluppare nuovamente la malattia per motivi psicologici, abitudinali eccetera.

La composizione dell’invenzione quindi, comprende un insieme di componenti che agiscono nel controllo dei sintomi della IBS quali iperalgia intestinale e disagio e irregolarità intestinale, senza essere una composizione specificamente antispastica, antidiarroica o lassativa.

Oggetto dell’invenzione sono le varie forme di realizzazione della composizione, metodi di preparazione della stessa e anche un metodo di cura e/o prevenzione della IBS che comprende il somministrare la composizione dell’invenzione a pazienti che ne abbiano bisogno e un metodo per la preparazione di detta composizione. La composizione dell’invenzione potrà agire sul processo infiammatorio mediante un’azione protettiva ed antiinfiammatoria locale indiretta, derivante dalla protezione e si propone di agire nel controllo dei sintomi della IBS quali iperalgesia intestinale e disagio anche mediante un effetto protettivo della mucosa intestinale che ne riduce irritazione e irritabilità, preservando la mucosa intestinale da attacchi irritanti, ad esempio mediante un effetto barriera e antiossidante.

La composizione secondo l’invenzione, si à ̈ dimostrata utile nella regolarizzazione dell’alvo in virtù della minore infiammazione intestinale, senza essere un prodotto specifico antispastico, antidiarroico o lassativo.

Senza essere legati alla teoria si à ̈ ipotizzato che la composizione come qui descritta possa agire secondo lo schema sotto riportato bloccando il circolo vizioso ivi descritto:

Schema 1

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE

La figura 1 mostra i risultati del saggio di valutazione della muco adesione che dimostrano una buona mucoadesività della composizione dell’invenzione nei confronti delle cellule gastrointestinali Caco-2. Il grado di mucoadesività ottenuto per la composizione dell’invenzione diluita 1:5 à ̈ stato del 52% ± 4.6 % mostrando che anche una sostanziale diluizione della composizione non influisce molto sulla capacità muco adesiva della stessa verso le cellule gastrointestinali.

La figura 2 mostra la resistenza al lavaggio con succhi gastrici simulati (2ml/min). Per quanto concerne la seconda fase della sperimentazione e cioà ̈ quella relativa alla determinazione della resistenza dello strato mucoadesivo, formatosi per interazione tra i componenti resinosi e polisaccaridici della composizione e le cellule mucosali, i risultati ottenuti hanno evidenziato un’interessante capacità di questi componenti di rimanere bioadesi alle mucose, assicurando una buona mucoadesività per la prima ora di contatto pur rimanendo apprezzabile anche dopo la seconda ora.

Infatti, dopo 0.5 h, 1h e 2 h le percentuali di mucoadesione riscontrate sono state del 48.7 ± 4.1 % (0.5h), 40.9 ± 6.2 % (1h); 29.5 ± 4.6 % (2h).

La figura 3 mostra che la composizione dell’invenzione ha anche una buona attività scavenger nei confronti dello stress ossidativo paragonabile a quella dimostrata dalla vitamina C. Inoltre tale azione rimane pressoché costante a partire dalla seconda lettura (60 minuti) eseguita. La composizione dell’invenzione abbatte la formazione di radicali liberi del 39% (±0,5) a tutte le dosi analizzate evidenziando un'azione apparentemente “dose indipendente†.

La composizione dell’invenzione non favorisce la produzione di radicali liberi in maniera costitutiva e non mostra una significativa azione antiossidante di tipo costitutivo: si ottiene una leggera riduzione dei radicali di circa il 10% (±0,5) solo a partire dai 60 minuti di esposizione all'H2O2. Tuttavia, anche questi risultati mostrano lo stesso andamento “dose indipendente†trovato nell'azione scavenger se pure con percentuali meno importanti. Di seguito una tabella rappresentativa dell’attività.

I valori indicati in legenda sono espressi in mg/ml

La figura riporta i seguenti dati

% riduzione radicali liberi

30 min 60 min 90 min 120 min

Comp. inv.0,5 mg/ml 31,9 35,4 38 36

Comp. inv.100,25

mg/ml 27,4 33 38,5 36

Comp. inv.100,125

mg/ml 28,3 39,4 41,5 39,4

Comp. inv.100,078

mg/ml 25 35,8 39,7 37,8

vitamina C 0,15 38 44,8 48 47

La figura 4 riporta l’andamento dei punteggi del dolore addominale in condizioni di base (B) e durante le settimane di trattamento (1-6) con la composizione dell’invenzione.

Si nota la riduzione progressiva dei punteggi del dolore che raggiungono un livello di significatività (* = p < 0,05 ) a partire dalla terza settimana di trattamento e continuano a diminuire sino alla fine.

La figura 5 mostra l’andamento dei punteggi del gonfiore addominale in condizioni di base (B) e durante le settimane di trattamento (1-6) con la composizione dell’invenzione.

Si nota la riduzione progressiva dei punteggi del gonfiore che raggiungono un livello di significatività (* = p < 0,05 ) a partire dalla quarta settimana di trattamento e continuano a diminuire sino alla fine.

La figura 6 mostra l’andamento dei punteggi del benessere in condizioni di base (B) e durante le settimane di trattamento (1-6) con Colilen-IBS.

Si noti l’aumento progressivo dei punteggi del benessere che raggiungono un livello di significatività (* = p < 0,05 ) a partire dalla seconda settimana di trattamento e continuano a diminuire sino alla fine.

La figura 7 mostra la diminuzione delle classi di dolore addominale/disagio legato all’IBS nel tempo a seguito di somministrazione della composizione dell’invenzione (numero di individui in ordinata e tempo espresso in settimane in ascissa).

Si osserva come da T0 a T6 le classi “grave†“moderato†e “leggero†diminuiscano con un forte aumento della classe “normale†.

La figura 8 mostra gli stessi risultati con l’aggregazione delle classi “grave†e “moderato†e delle classi “leggero†e “normale†(numero di individui in ordinata e tempo espresso in settimane in ascissa).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Secondo l’invenzione, à ̈ descritta una composizione per uso nella cura e/o la prevenzione della Sindrome dell’Intestino Irritabile comprendente resine e/o loro estratti, polisaccaridi e/o estratti vegetali comprendenti polisaccaridi, antiossidanti e/o estratti vegetali comprendenti antiossidanti ed oli essenziali di origine naturale o vegetale.

La composizione qui descritta, infatti, data la sua assenza di effetti indesiderati, à ̈ utilizzabile da sola o in combinazione con altri farmaci per la cura e/o la prevenzione della IBS. In una forma particolarmente vantaggiosa, la composizione, data l’assenza di effetti indesiderati, può essere utilizzata anche per la prevenzione della IBS, ad esempio in quei pazienti che ne soffrano in maniera ricorrente o per i quali il disturbo si ripresenti in associazione a particolari stati psicologici o fisici (ad esempio periodi di stress eccetera).

La composizione qui descritta comprende i principi attivi sopra elencati, tali principi attivi essendo di origine vegetale o comunque di origine naturale, ovvero non di sintesi chimica ma estratti da vegetali o da prodotti naturali come resine prodotte da piante, sali minerali eccetera.

In una forma di realizzazione i principi attivi saranno di origine vegetale (provenienti da parti di piante o da sostanze prodotte dalle piante) e, in una particolare forma di realizzazione la composizione o i prodotti che la comprendono saranno tutti di origine vegetale, fatta eccezione l’eventuale presenza di sali minerali di origine naturale e non vegetale.

In una forma di realizzazione dell’invenzione l’invenzione comprenderà unicamente componenti di origine vegetale (provenienti da parti di piante o da sostanze prodotte dalle piante).

Secondo la presente invenzione, in accordo con la letteratura scientifica, per resine di origine vegetale si intendono in particolare oleo-gommo-resine, essudati vegetali che possono essere secreti dalle piante fisiologicamente o, più spesso, in risposta a traumi meccanici (incisioni, tagli) o ad uno stress (attacco di patogeni) costituite da un gruppo complesso di sostanze solide, traslucide, occasionalmente liquide, insolubili in acqua, solubili in alcool, acetone, etere e cloroformio

Tali resine contengono miscele complesse di, alcoli o acidi alifatici, lignani, acidi resinici, resinotannoli, esteri e reseni (che traggono origine da processi di polimerizzazione e di ossidazione di terpeni degli oli essenziali) ed altro.

Dal punto di vista chimico nelle resine si trovano molti componenti diversi: alcoli o acidi alifatici a diversa lunghezza della catena carboniosa acidi aromatici liberi, acidi resinici, alcoli monoterpenici, alcoli, diterpenici, alcoli triterpenici, resinoli, composti fenolici appartenenti alla famiglai degli steroli, ecc.

Secondo la presente invenzione le resine possono essere ad esempio rappresentate da incenso, mirra, o loro miscele.

Il tecnico del settore saprà comunque identificare ulteriori resine oltre a quelle qui indicate semplicemente per analogia.

La composizione potrà contenere tali resine in forma polverizzata granulata, o in forma di estratto secco e/o di estratto liofilizzato e/o frazioni di tali estratti.

Le forme in cui queste resine o loro estratti possono essere utilizzati per la preparazione di composizioni ad uso orale sono note in letteratura ed il tecnico del settore non necessita di ulteriori insegnamenti in tal senso.

Come esempio non limitativo, in caso di preparazione di un estratto, la resina potrà essere trattata con soluzioni idroalcoliche 20%, o 30%, o 40%, o 50%, o 60%, o 70%, o 80%; gli alcoli potranno essere metanolo, etanolo, isopropanolo; in una forma di realizzazione particolare sarà utilizzato l’etanolo. L’estratto alcolico ottenuto sarà sottoposto a filtrazione, concentrazione ed essiccazione per fornire il corrispondente estratto secco.

Il prodotto secco ottenuto potrà essere polverizzato, granulato o comunque trattato per una opportuna miscelazione con le altre componenti.

Vantaggiosamente le resine, oltre a coadiuvare la realizzazione di un effetto barriera sulla mucosa da parte della composizione qui descritta come dimostrato nella sezione esperimenti, permettono anche alle altre componenti della composizione di rimanere adese più a lungo in contatto sull’epitelio irritato, impedendone un dilavamento veloce da parte di liquidi biologici, permettendo quindi alla composizione di esplicare più a lungo ed al meglio il suo effetto.

I polisaccaridi secondo l’invenzione sono polisaccaridi presenti in prodotti naturali, o in estratti vegetali o ottenibili da piante.

In una forma di realizzazione questi polisaccaridi sono di origine vegetale e sono rappresentati da macromolecole polisaccaridiche che a contatto con l’acqua formano soluzioni colloidali o gel e sono anche definibili come idrocolloidi vegetali.

Sono costituenti normali delle cellule vegetali conservate in strutture istologiche predefinite. Sono polimeri di zuccheri e sono caratterizzati da buona stabilità, non tossicità, idrofilia, biodegradabilità.

Un esempio non vincolante di polisaccaridi utilizzabili nella presente invenzione à ̈ dato da polisaccaridi estratti da Aloe vera, Camomilla, Altea ed altre piante ricche in polisaccaridi.

In una forma di realizzazione potranno essere direttamente utilizzati estratti vegetali comprendenti polisaccaridi come ad esempio (non limitante) estratti di Aloe vera, di camomilla di Altea e di altre piante ricche in polisaccaridi.

Senza essere legati alla teoria, si ritiene che i polisaccaridi nella composizione dell’invenzione riescano a coadiuvare l’effetto barriera e mucoadesivo della stessa. Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione la composizione comprenderà estratto di aloe vera.

In una forma di realizzazione tale estratto sarà un estratto di gel fogliare disidratato o altri estratti ricchi di polisaccaridi.

In una forma di realizzazione particolare dell’invenzione per l’aloe si utilizzeranno, come parti della pianta il gel fogliare disidratato, per la camomilla i fiori interi o ligulati, per l’altea la radice per la melissa le foglie. Per tutte le componenti sopra elencate à ̈ idoneo l’uso in forma di estratto secco e/o di estratto liofilizzato e/o frazioni di tali estratti.

La composizione comprenderà ulteriormente sostanze antiossidanti di origine naturale o vegetale come ad esempio polifenoli vegetali o estratti comprendenti gli stessi.

Secondo un esempio non limitante, nella presente composizione potranno essere utilizzati antiossidanti estratti da camomilla, melissa. In una forma di realizzazione potranno essere direttamente utilizzati estratti vegetali comprendenti anti ossidanti come estratti di camomilla, di melissa e simili.

In una particolare forma di realizzazione la composizione comprenderà resine e/o loro estratti scelte nel gruppo comprendente incenso, mirra; polisaccaridi scelti tra polisaccaridi estratti da Aloe vera, camomilla, Altea, e/o estratti vegetali comprendenti polisaccaridi scelti tra estratti di Aloe vera (gel fogliare), di camomilla (fiori), altea (radice); antiossidanti scelti tra antiossidanti estratti da camomilla, melissa foglie; estratti vegetali comprendenti antiossidanti scelti tra estratti di camomilla fiori, di melissa foglie.

In una forma di realizzazione la composizione comprenderà come principi attivi: estratto liofilizzato di incenso, estratto di Aloe vera (ad esempio gel fogliare disidratato), estratto di mucillagini di altea, estratto di fiori di camomilla, estratto di foglie di melissa. Inoltre, la composizione potrà comprendere una o più di ulteriori componenti vegetali o naturali scelte dal tecnico del settore, aventi attività adatte a coadiuvare ulteriormente l’effetto di sollievo della IBS come: sostanze naturali e/o vegetali emollienti, digestive, pro cinetiche, colagoghe, carminative, prebiotiche, rilassanti, eccipienti, conservanti, umidificanti. Un esempio non limitativo di tali sostanze potrà essere rappresentato da estratto, di genziana radice, boldo foglie, cardo mariano frutti, carciofo foglie, tarassaco radice, rosmarino foglie, anice frutti, menta foglie, maggiorana foglie, cumino frutti, carvi frutti, coriandolo frutti, carbone vegetale, zenzero radice, finocchio frutti, inulina. La composizione secondo l’invenzione potrà comprendere dette resine e/o loro estratti in una percentuale in peso compresa tra il 30 e il 60%

La composizione potrà comprendere detti polisaccaridi e/o estratti vegetali comprendenti polisaccaridi sono presenti in una percentuale in peso compresa tra il 12 e il 22 %

La composizione potrà comprendere detti antiossidanti e/o estratti vegetali comprendenti antiossidanti sono presenti in una percentuale in peso compresa tra il 35 e il 65%

Un esempio non vincolante della composizione secondo l’invenzione comprenderà Incenso polvere ca.50%

Aloe vera gel ca.15%

Camomilla fiori estratto liofilizzato ca.15%

Melissa foglie polvere ca.45%

Secondo un ulteriore esempio la composizione potrà comprendere:

Incenso estratto secco ca.30%

Aloe vera gel ca.20%

Camomilla fiori polvere ca.25%

Melissa foglie estratto liofilizzato ca.25%

In generale, la composizione potrà comprendere:

Incenso estratto secco ca.30-60%

Aloe vera gel ca.15-20%

Camomilla fiori polvere ca.15-25%

Melissa foglie estratto liofilizzato ca.25-45%

Qualsiasi numero intero compreso negli intervalli sopra descritti, à ̈ da considerarsi puntualmente descritto nella presente invenzione unitamente ai due numeri che limitano gli intervalli, ad esempio quando l’intervallo descritto à ̈ 15-20% si intendono puntualmente descritte nell’invenzione le forme di realizzazione che comprendono il 15, il 16, il 17, il 18, il 19, e il 20% dell’estratto.

Lo stesso vale per gli intervalli 30-60, 12-22, 35-65, 15-25 e 25-45 sopra riportati.

In una particolare forma di realizzazione la composizione dell’invenzione comprenderà dette resine e/o loro estratti in una percentuale in peso dal 20 al 30%; detti polisaccaridi e/o estratti vegetali comprendenti polisaccaridi in una percentuale in peso dal 7 al 13%; detti antiossidanti e/o estratti vegetali comprendenti antiossidanti in una percentuale in peso dal 45 al 55%.

Come già indicato sopra, tutte le volte che la presente descrizione fornisce un intervallo numerico, si intendono puntualmente ed esplicitamente descritti tutti i numeri interi e tutti i numeri decimali fino a due cifre che esistono entro questo intervallo, estremi compresi. L’intervallo à ̈ indicato in quanto tale meramente per evitare lunghe liste numeriche che il tecnico del settore comunque sa contare in intervalli come quelli sopra indicati.

In una particolare forma di realizzazione una posologia giornaliera ad esempio divisa in almeno 3 unità di somministrazione di circa 2-3 g di principi attivi di composizione potrà comprendere:

- Incenso resina estratto liofilizzato, ca 500-800 mg,

- Aloe vera gel fogliare disidratato, 180-300 mg,

- Camomilla fiori estratto liofilizzato 70-170 mg,

- Melissa officinalis foglie 800-1250 mg

- Finocchio olio essenziale, 40-60 mg.

- Cumino frutti polvere 270-400 mg

Ulteriori esempi di composizione secondo l’invenzione sono sotto riportati: Esempio di composizione 1

Incenso resina estratto liofilizzato, ca 500-700 mg,

- Aloe vera gel fogliare disidratato, ca 180-300 mg,

- Camomilla fiori estratto liofilizzato ca 70-170 mg,

- Melissa officinalis foglie ca 900-1150 mg

- Finocchio olio essenziale ca 40-60 mg.

- Coriandolo frutti polvere ca 270-400 mg

Esempio di composizione 2

- Incenso resina polvere ca.680-750 mg,

- Aloe vera gel fogliare disidratato ca.440-520 mg,

- Camomilla fiori estratto liofilizzato ca.650-750 mg,

- Melissa officinalis foglie ca.450-510 mg

- Finocchio olio essenziale ca.15-25 mg.

Esempio di composizione 3

- Incenso resina estratto liofilizzato ca.440-520 mg,

- Aloe vera gel fogliare disidratato ca.900-1000 mg,

- Camomilla fiori estratto liofilizzato ca.520-620 mg,

- Melissa officinalis foglie ca.300-400 mg

- Maggiorana olio essenziale ca.15-25 mg.

Esempio di composizione 4

- Incenso resina estratto liofilizzato ca.80-140 mg,

- Incenso resina polvere ca.200-280 mg

- Aloe vera gel fogliare disidratato ca.80-140mg,

- Tarassaco polvere impalpabile ca.1600-2000 mg

- Camomilla fiori estratto liofilizzato ca.80-140mg,

- Melissa officinalis foglie ca.50-120 mg.

Esempio di composizione 5

- Incenso resina estratto liofilizzato ca.400-550 mg,

- Incenso resina polvere ca.200-300 mg

- Aloe vera gel fogliare disidratato ca.200-300 mg,

- Camomilla fiori estratto liofilizzato ca.100-160 mg,

- Melissa officinalis foglie ca.1000-1500 mg.

Le composizioni qui descritte potranno ulteriormente comprendere uno o più eccipienti farmaceuticamente accettabili o una o più delle componenti aggiuntive sopra elencate.

Le composizioni come qui descritte potranno essere anche diluite in opportuni eccipienti che ne consentano la realizzazione in forma liquida o semi liquida (come sospensioni, soluzioni, emulsioni), come ad esempio acqua, succo di frutta o qualsiasi altro eccipiente idoneo alla realizzazione di formulazioni farmaceutiche e non liquide o semi liquide per uso orale

E’ da intendere, nell’ambito della presente descrizione che, relativamente alle forme di realizzazione in cui sono indicate le componenti della composizione, il termine “comprende/comprendente†potrà essere anche sostituito dal termine “consiste/consistente in†.

Secondo la presente invenzione, la composizione potrà essere utilizzata in forma di capsula, compressa, pasticca, granulato, polvere, sciroppo, elisir, gelatina dura, gelatina morbida, sospensione, emulsione, soluzione, secondo le tecniche note all’esperto medio del settore.

In particolare, nelle forme di realizzazione solide, potranno essere utilizzati come eccipienti polveri delle stesse piante comprese sotto forma di estratti o “prodotti estratti da†nella composizione qui descritta.

In una particolare forma di realizzazione la composizione come qui descritta, in qualsiasi delle forme di realizzazione sopra indicate, potrà essere in forma di composizione farmaceutica, ovvero comprendere ingredienti di grado farmaceutico oppure potrà essere o essere inserita in, in un alimento a fini speciali o in un dispositivo medico.

La composizione secondo la presente descrizione potrà essere realizzata in forma di composizione farmaceutica oppure di dispositivo medico secondo una qualsiasi delle classi descritte nella Direttiva CEE 93/42 sui dispositivi medici (che comprende anche sostanze e non solo “dispositivi†nel senso meccanico del termine), o in forma di alimento a fini medici speciali, integratore alimentare o in qualsiasi forma secondo le disposizioni regolatorie del paese in cui tale composizione sarà prodotta.

Per la preparazione delle composizioni farmaceutiche la miscela degli estratti sarà formulata in idonee unità di dosaggio con uno o più eccipienti e/o additivi farmaceuticamente accettabili. Composizioni farmaceutiche in forma di capsula, compressa, pasticca, gelatina dura, gelatina morbida, per somministrazione orale possono essere in forma di dosaggio unitario giornaliero o di frazioni di dosaggio unitario giornaliero (ad esempio 2, 3, 4, 5, 6, o più capsule, compresse, pasticche o gelatine potranno essere assunte nell’arco della giornata, secondo il giudizio del medico curante), e possono contenere eccipienti convenzionali inclusi, per esempio, agenti leganti, per esempio, gomma arabica, gelatina, sorbitolo, gomma adragante, e/o polivinilpirrolidone; riempitivi, per esempio lattosio, zucchero, amido di mais, amido di riso, fosfato di calcio, sorbitolo e/o glicina; lubrificanti di pastigliatura, per esempio stearato di magnesio, talco, polietilenglicole e/o silice; disintegranti, per esempio amido di patata; e agenti umidificanti accettabili farmaceuticamente, per esempio sodio laurilsolfato o estratti granulati di dette piante. Le compresse possono essere rivestite secondo metodi ben noti nella normale pratica farmaceutica.

La composizione potrà essere anche realizzata in forma liquida o semi liquida, sospensione, emulsione, soluzione per somministrazione orale e potrà opzionalmente contenere agenti naturali aromatizzanti che conferiscano alla stessa un gusto gradevole al palato.

La composizione in forma di polvere o granulato potrà essere pre-dosata in appositi contenitori e pronta all’uso o per ingestione in quanto tale o da risospendere in un opportuno liquido come acqua o tà ̈ o altro. Anche in questo caso la composizione potrà contenere agenti naturali aromatizzanti che conferiscano alla stessa un gusto gradevole al palato.

La presente invenzione à ̈ stata fin qui descritta con riferimento ad alcune sue forme di realizzazione. È da intendersi che possono esistere altre forme di realizzazione che afferiscono al medesimo nucleo inventivo, tutte rientranti nell’ambito di protezione delle rivendicazioni qui di seguito riportate.

L’invenzione riguarda anche un metodo per la cura e/o la prevenzione della IBS comprendente la somministrazione della composizione qui descritta ad un individuo che ne abbia necessità.

Il metodo comprenderà la somministrazione di una o più dosi al giorno della composizione per un periodo variabile da una o più settimane, secondo la prescrizione del medico curante.

Data l’elevata tolleranza mostrata per dosaggi anche elevati della composizione (vedi esempi sotto) il medico curante potrà decidere la terapia senza correre rischi di sovradosaggio seguendo gli insegnamenti della presente descrizione e secondo le esigenze del paziente e della comune conoscenza medica.

In una forma di realizzazione, il metodo comprenderà la somministrazione di 2-3 grammi, ad esempio 2; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7; 2,8; 2,9; 3 grammi di principi attivi al giorno, ad esempio suddivisi in almeno 3 dosi unitarie per un periodo di almeno una settimana fino ad un periodo di 3-6 settimane o più.

È evidente che la somministrazione potrà comprendere dosaggi diversi secondo lo stato di salute generale, il peso, il sesso e l’età del paziente.

La composizione dell’invenzione potrà essere anche somministrata in combinazione con ulteriori farmaci comunemente utilizzati per la cura della IBS come coadiuvante della cura.

In una forma di realizzazione, ad esempio, potrà essere somministrata in combinazione con farmaci volti a curare un disturbo ritenuto causa di sintomatologia ISB.

Un esempio non limitativo del metodo di cura o di prevenzione della IBS qui descritto, potrà essere somministrato un dosaggio giornaliero che utilizzi una qualsiasi delle composizioni esemplificate sopra, con somministrazione di tali composizioni una o più volte al giorno per un periodo di tempo di 3, 6 settimane o oltre.

Tale dosaggio potrà essere suddiviso, come negli esempi su pazienti sotto, in 6 compresse (cp) somministrate 2 alla volta tre volte al dì circa un’ora prima dei pasti. Inoltre, l’invenzione riguarda un metodo per la preparazione di una composizione secondo l’invenzione in cui dette resine e/o loro estratti, detti polisaccaridi e/o estratti vegetali comprendenti polisaccaridi, in cui detti antiossidanti e/o estratti vegetali comprendenti antiossidanti sono miscelati insieme, opzionalmente unitamente ad una o più delle componenti aggiuntive sopra descritte e/o ad uno o più eccipienti e/o ad uno o più aromatizzanti in un unico passaggio o in passaggi successivi.

Le tecniche di miscelazione scelte saranno funzionali alla forma in cui si intende realizzare la composizione, nel caso in cui si vogliano realizzare compresse o pasticche sarà presente anche almeno un passaggio di pressatura, eccetera.

Ad esempio, gli estratti come sopra descritti potranno essere miscelati insieme mediante la nota tecnologia high shear mixer che consente una perfetta omogeneizzazione degli ingredienti anche nei casi di aggiunta di piccole percentuali di ingredienti in forma liquida (per ed. oli essenziali) che vengono nebulizzati sulla massa di polvere in movimento. Si procede poi all’incapsulazione o ad uleriori lavorazioni con tecnologia convenzionale.

ESEMPI

1. Test pre-clinici di efficacia sull’intestino irritabile

Valutazione in vivo dell’efficacia della composizione dell’invenzione nel proteggere la mucosa intestinale

Per saggiare in vivo l’efficacia della composizione dell’invenzione, questa à ̈ stata formulata in capsule ed à ̈ stata valutata nella sua capacità di proteggere la suscettibilità della mucosa intestinale agli stimoli irritanti. In base al presunto meccanismo del prodotto, di agire sulla componente infiammatoria della IBS (che la letteratura sta supportando solo recentemente) mediante un’azione protettiva ed antiinfiammatoria locale indiretta, derivante anche dalla muco adesione à ̈ stato scelto un modello sperimentale di colite infiammatoria e non specifico per l’IBS.

Lo studio à ̈ stato realizzato su di un modello di colite indotta da acido acetico, come descritto da McPherson BR, Pfeiffer CJ (1978) Experimental Production of Diffuse Colitis in Rats. Digestion;17:135-150; Mousavizadeh K, Rahimian R, Fakhfouri G, Aslani FS, Ghafourifar P. (2009) Anti-inflammatory effects of 5-HT receptor antagonist, tropisetron on experimental colitis in rats. Eur J Clin Invest.;39(5):375-83; Noronha-Blob L, Lowe VC, Muhlahauser RO, Burch RM. (1993) NPC 15669, an inhibitor of neutrophil recruitment, is efficacious in acetic acid-induced colitis in rats. Gastroenterology, 104:1021–9.

Gli animali sono stati trattati in modo da indurre un’infiammazione intestinale (acido acetico al 4% insufflato per via rettale) e dopo un’ora sono stati trattati con la composizione dell’invenzione oppure desametasone (farmaco di riferimento).

Ogni gruppo era costituito da 10 ratti, secondo lo schema sottostante.

1. Ratti senza colite, trattati con veicolo 10 ml/kg (p.o.)

2. Ratti con colite, trattati con veicolo 10 ml/kg, (p.o.);

3. Ratti con colite, trattati con la composizione dell’invenzione, (p.o.);

4. Ratti con colite, trattati con desametasone, (p.o.) come riferimento.

Sono stati misurati parametri macroscopici e microscopici.

Tabella 1

I valori rappresentano le medie ± S.E.M di 8-12 animali. Differenza significativa: °°p<0.01 in confronto al gruppo di controllo; **p<0 ,01 in confronto al gruppo trattato con ac. acetico. Quando non indicato la differenza non à ̈ statisticamente significativa.

Di seguito sono riassunti i risultati, che mostrano come la composizione dell’invenzione sia efficace per la riduzione dell’infiammazione e delle lesioni intestinali legate all’IBS.

I parametri macroscopici sono il peso e l’escrezione fecale, riportati nella tabella seguente.

Si vede che la composizione dell’invenzione riduce il malessere generale dovuto all’acido acetico e il peso corporeo rimane simile ai controlli.

Oltre ai dati macroscopici sopra riportati sono stati osservati degli elementi specifici indice del danno all’intestino riportati nella tabella seguente, dai quali si nota l’effetto protettivo del prodotto nei confronti dei processi irritativi dovuti ad acido acetico.

In particolare à ̈ stato visto il danno macroscopico al colon, l’indice colico (mg di colon / grammi di ratto) e la attività della mieloperossidasi, un enzima contenuto nei granuli azzurofili intracellulari dei polimorfonucleati (PMNs), che può essere quindi utilizzato come indicatore dell’accumulo dei neutrofili migrati nei tessuti durante un processo infiammatorio.

Tabella 2

I valori rappresentano le medie ± S.E.M di 8-12 animali. Differenza significativa: °°p<0.01 in confronto al gruppo di controllo; **p<0 ,01 in confronto al gruppo trattato con ac. acetico. Quando non indicato la differenza non à ̈ statisticamente significativa.

I risultati mostrano una attività protettiva forte della composizione dell’invenzione.

La mieloperossidasi à ̈ meno attiva dopo 24 ore, quindi l’attività infiammatoria à ̈ limitata, rispetto al controllo. La composizione qui descritta, pur non essendo un antinfiammatorio quale il desametasone, mostra una potente efficacia nel ridurre l’infiammazione dovuta ad agenti esterni e interni (quali radicali liberi).

2. Test pre-clinici di meccanismo d’azione

Test di mucoadesione

Il test di muco adesione à ̈ stato eseguito secondo un modello, che deriva dalla ottimizzazione di precedenti protocolli sperimentali e lavori scientifici sull’argomento (D. Patel, A.W. Smith, N. Crist, P. Barnett, J.D. Smart, An in vitro mucosal model predictive of bioadhesive agents in the oral cavity, J. Controlled Release (1999) 175-183.), la mucoadesività del prodotto à ̈ stata determinata mediante la valutazione della percentuale di inibizione del legame lectina-glicoproteina. In questo modello sono state utilizzate linee cellulari Caco2 per simulare le cellule dell’intestino.

Le cellule intestinali della linea Caco2 sono state scelte come modello di cellule epiteliali, in quanto presentano caratteristiche morfologiche e biochimiche tipiche dell’enterocita assorbente presente nel tratto gastrointestinale e sono state ampiamente utilizzate per studiare sia la funzionalità delle cellule gastrointestinali che per valutare il trasporto e/o l’interazione di faramci attraverso la membrana gastrointestinale.

Inizialmente le cellule sono state trattate con lectina biotinilata (Con-A), proteina contenuta in alcune leguminacee (Canavalia ensiformis) che presenta una elevata affinità per i residui glucosidici e mannosidici presenti nelle glicoproteine di membrana. In tal modo i siti delle glicoproteine delle membrane mucosali risultano impegnati con la lectina biotinilata. La presenza della biotina (vitamina H) nella lectina risulta indispensabile per il successivo stadio. Le cellule, già trattate con lectina biotinilata, sono infatti addizionate di streptavidina perossidasi consentendo, grazie all’elevata affinità tra biotina e spreptavidina, di formare il complesso proteina-glucosio-lectinabiotina-streptavidina perossidasi.

A questo punto le cellule sono state lavate ed il complesso proteina-glucosiolectina-biotina-streptavidina perossidasi quantificato, grazie alla presenza della perossidasi, mediante la reazione di ossidazione dell’orto-fenilendiammina.

Infatti il complesso proteina-glucosio-lectina-biotina-streptavidina-perossidasi catalizza la reazione di polimerizzazione:

H2O2

O-fenildiamina 2,3-diaminofenazina (gialla)

Strep.perox.

L’intensità della colorazione giallo-arancio della soluzione (misurata con spettrofotometro a λ=450 nm) risulta proporzionale alla quantità di legami glicoproteina-lectina e quindi alla quantità di siti disponibili (glicoproteine) per la mucoadesione.

Il valore di assorbanza così determinato costituisce il “controllo†.

Nella determinazione della mucoadesività del prodotto le cellule mucosali vengono preliminarmente trattate con questo prodotto, mediante incubazione a 30°C per 15 minuti, prima del trattamento con lectina. In questo modo le sostanze mucoadesive, contenute nel prodotto in esame, sono in grado di legarsi ai siti glucosidici e mannosidici presenti nelle glicoproteine delle membrane mucosali.

Nella fase successiva, aggiungendo la sequenza di lectina biotinilata, streptavidina perossidasi e orto-fenilendiammina à ̈ possibile ottenere, rispetto al controllo (ottenuto senza pretrattamento con il prodotto da testare), una colorazione di minore intensità e ciò in quanto una parte dei siti glucosidici disponibili per il legame con la Con-A erano già impegnati dalle sostanze mucoadesive presenti nel prodotto. Infatti il legame iniziale tra le sostanze mucoadesive, contenute nel prodotto da testare, ed i siti glucosidici pregiudica in parte la successiva coniugazione della Con-A con il complesso streptavidinaperossidasi ed il conseguente sviluppo di colore dopo l’aggiunta di acqua ossigenata.

La diminuzione del valore di assorbanza risulta infatti proporzionale alla capacità delle sostanze in esame di “mucoaderire†alle cellule CaCo2.

La capacità mucoadesiva à ̈ espressa come percentuale di inibizione del legame glicoproteina-lectina e rappresenta la percentuale di siti mucosali occupati dal prodotto rispetto a quelli captati dalle lectine nel test di controllo. Questo parametro può anche essere definito come “percentuale di mucoadesione del prodotto†secondo l’equazione:

Percentuale di mucoadesione del prodotto = (1 – abs campione/abs controllo) x 100

Inoltre, oltre alla capacità mucoadesiva, un requisito essenziale di un prodotto, destinato al trattamento protettivo di una superficie mucosale, à ̈ rappresentato dalla resistenza dello strato di mucoadesione (formatosi per interazione del prodotto con le cellule mucosali) all’azione della soluzione con cui esso viene a contatto e, nel caso di trattamento nasale, con il muco.

A tale scopo, in una seconda fase della sperimentazione, à ̈ stata valutata la resistenza nel tempo (0,5-2h) della mucoadesività prodotta dalla formulazione, dopo trattamento delle cellule mucosali. Per questa determinazione le cellule mucosali trattate con la formulazione in esame sono state sottoposte ad un flusso continuo di una soluzione isotonica contenente mucina al 2%, in grado di mimare il fluido mucosale presente nel naso.

Per espletare questo secondo protocollo à ̈ stato impiegato un sistema di Franz cells, in genere utilizzate nella valutazione del processo di assorbimento percutaneo di una sostanza o per lo studio di altri processi di permeazione attraverso membrane naturali o artificiali.

Materiali e metodi

La composizione dell’invenzione à ̈ stata diluita 1:2 e 1:5 in soluzione fisiologica salina (NaCl 0,9%) contenente tampone fosfato (pH 6.8). La sospensione à ̈ stata sottoposta a sonicazione e la soluzione ottenuta à ̈ stata opportunamente filtrata. Le cellule Caco-2 sono state mantenute in MEM con l’aggiunta del 10% di siero fetale di vitello, 100 U/ml di penicillina e 100 µg/ml di streptomicina e tenute a 37°C in un incubatore in un atmosfera umidificata al 95% di aria e 5% di CO2. Il terreno di coltura à ̈ stato cambiato ogni 2-3 giorni. Ventiquattro ore prima dell’esperimento, le cellule sono state tripsinizzate, contate in un emocitometro, centrifugate e risospese in TBS. La sospensione cellulare à ̈ quindi stata divisa in 2 provette: nella prima à ̈ stato aggiunto il solo veicolo, nella seconda provetta sono stati aggiunti 5 ml della soluzione contente il granulato alla opportuna diluizione. Le 2 provette sono state lasciate in agitazione a 30°C per 15 minuti. Successivamente, l e cellule sono state lavate per 3 volte in TBS. Sono stati quindi aggiunti in entrambe le provette 5 ml di TBS 0,05M contenenti CaCl21mM e lectina biotinilata, per 30 minuti a 30°C in agitazione lenta. Dopo 3 lavaggi, la sospensione cellulare à ̈ stata incubata con 5 ml di TBS 0,125M contenente streptavidina perossidasi e lasciata ad incubare per 60 minuti a 30°C in agitazione lenta. Le cellule sono state quindi lavate per 3 volte, e infine risospese in 1 ml di soluzione di o-pd (contenente 0,4 mg di o-pd in buffer citrato e 0,4 µl di H2O2). L’ossidazione dell’o-pd ha prodotto una colorazione gialla e la reazione à ̈ stata bloccata dopo 1 minuto con l’aggiunta di HCl 1N. La densità ottica à ̈ stata misurata a 492 nm mediante lettura allo spettrofotometro. L’esperimento à ̈ stato condotto in triplicato.

Protocolli sperimentali

Valutazione della ritenzione della mucoadesività.

Per questa sperimentazione à ̈ stato utilizzato un sistema costituito da sei celle di Franz. Le celle di Franz sono ampiamente utilizzate in letteratura per studiare il processo di assorbimento di un composto attraverso la pelle o altre membrane (artificiali o biologiche).

La cella di Franz à ̈ costituita da un donor e da un receptor (schema2).

Cella di Franz utilizzata per la determinazione della resistenza della strato mucoadesivo (formato dalla applicazione della formulazione sulle cellule mucosali) sottoposto ad un flusso di una soluzione di mucina, simulante la soluzione mucosale presente nel naso:

Schema 2

Negli studi di assorbimento percutaneo tra questi due compartimenti viene posta una membrana costituita da pelle intera (full skin, epidermide-derma) oppure da membrane strato corneo epidermide (SCE), ottenute quasi sempre da interventi riduttivi di chirurgia estetica. Quindi la formulazione, contenente il prodotto, del quale si vuole valutare il processo di permeazione cutanea, viene posta nel donor mentre il receptor viene riempito di una soluzione fisiologica. Il receptor viene termostatato mediante circolazione di acqua in una camicia esterna ed i prelievi della soluzione di receptor, nel quale verranno determinate le quantità di sostanza penetrate nel tempo attraverso la pelle, vengono effettuate dal braccio laterale mediante una siringa a gambo lungo.

Nell’esperimento condotto per la valutazione della ritenzione della mucoadesività della composizione oggetto dell’invenzione, sono state poste nel donor colture cellulari Caco-2, trattate con il prodotto ABO/INT-10, diluito 1: 5

Il principale obiettivo di questa ricerca à ̈ stato quello di valutare la mucoadesione in vitro della composizione dell’invenzione, I risultati ottenuti in questa sperimentazione dimostrano che la formulazione oggetto dell’invenzione possiede una interessante capacità mucoadesiva nei confronti delle cellule mucosali Caco-2, utilizzate come modello delle cellule mucosali gastrointestinali.

Inoltre la valutazione della resistenza alla soluzione simulante il succo intestinale dello strato mucoadesivo e protettivo, formatosi in seguito al trattamento delle cellule mucosali con la formulazione dell’invenzione (diluita 1:5), consente di evidenziare una buona capacità di ritenzione della mucoadesività, soprattutto nella prima ora, ma anche oltre, successiva all’applicazione del prodotto diluito sulle cellule.

Alla luce dei risultati ottenuti, à ̈ possibile affermare che il prodotto, dimostrando una buona e resistente mucoadesività alle cellule mucosali gastrointestinali, possa svolgere un efficiente ruolo protettivo sulla mucosa del tratto gastrointestinale.

Tabella 3

I risultati dei saggi di mucoadesione sono riportati anche nelle figure 1 e 2 dove à ̈ dimostrata la mucoadesività della composizione (Figura 1) e la sua resistenza al lavaggio simulato con succhi gastrici (Figura 2).

3 Valutazione in vitro dell’effetto protettivo di della composizione dell’invenzione a seguito di infiammazione causata da LPS

Su CaCO2la composizione dell’invenzione ha dimostrato attività protettiva, e cioà ̈ antinfiammatoria indiretta, da infiammazione causata da LPS, un noto sensibilizzante e infiammante.

Sono state eseguite tre diverse tipologie di esperimenti.

- cellule esposte al trattamento di LPS e monitorate per determinare le citochine prodotte dopo 24 ore; (controllo negativo)

- cellule esposte al trattamento di LPS e, dopo 30 minuti, addizionate del prodotto dell’invenzione (due concentrazioni) e quindi monitorate per determinare le citochine prodotte dopo 24 ore (attività protettiva postesposizione);

- cellule addizionate del prodotto dell’invenzione (due concentrazioni), dopo 30 minuti addizionate di LPS e quindi monitorate per determinare le citochine prodotte dopo 24 ore (attività protettiva preventiva).

Il potere protettivo à ̈ stato verificato misurando la IL8 secreta dalle CaCO2 successivamente all’esposizione.

Tabella 4

% di inibizione di IL-8

Pre- Posttrattamento trattamento

con ABO/INT con ABO/INT

Conc 10µg/ml 62.4 ± 5.8 32.6 ± 4.5

Conc.100µg/ml 82.2 ± 6.1 45.8 ± 7.2

Dalla tabella si nota bene come l’effetto di riduzione dell’infiammazione sembri esplicato dalla composizione qui descritta attraverso un meccanismo protettivo di barriera. Il pre-trattamento à ̈ nettamente superiore al post trattamento. L’effetto antinfiammatorio visto nel post trattamento à ̈ probabilmente dovuto sempre all’effetto protettivo il quale agisce meno efficientemente dal momento che l’agente nocivo ha già potuto entrare in contatto con la mucosa.

I dati sono conformi ai risultati ottenuti sulla mucoadesione in quanto concentrazioni maggiori danno effetti maggiori ma non profondamente diversi.

.4. Test attività antiossidante

Al fine di verificare il potere antiossidante della composizione dell’invenzione in un sistema biologico simile all’epitelio intestinale (CaCo-2), sono stati eseguiti i seguenti test:

Valutazione dell'attività antiossidante del campione su cellule umane esposte a stress ossidativo progressivo di tipo chimico. La valutazione dell'azione antiossidante à ̈ ricavata dalla quantificazione della formazione di radicali liberi in cellule esposte al campione ed a stress ossidativo. L’attività antiossidante del campione in analisi à ̈ stata valutata mediante confronto con quella di un sicuro antiossidante idrosolubile come la vitamina C.

Test di vitalità cellulare Neutral Red Up-take (NRU).

Al termine del test di attività antiossidante, per verificare che l'abbattimento della formazione dei radicali liberi fosse dovuto ad una reale efficacia e non ad un effetto citotossico del prodotto in esame à ̈ stato eseguito il test di vitalità cellulare MTT.

Il protocollo si basa sull’utilizzazione di una sonda fluorescente chiamata 2',7'-dichlorofluorescina diacetato (DCFH-DA) molecola stabile non fluorescente che entra nelle cellule, si lega alle macromolecole di membrana dove viene idrolizzata dalle esterasi citoplasmatiche a 2',7'-dichlorofluorescina (DCFH), molecola ancora non fluorescente. La DCFH, in presenza di radicali liberi, viene ossidata formando una molecola altamente fluorescente: DCF.

Lo stress ossidativo à ̈ indotto tramite acqua ossigenata.

Come controllo negativo (assenza di attività ossidante della composizione dell’invenzione) sono stati monitorati anche i radicali prodotti costitutivamente dalle cellule con l’aggiunta del campione, ma senza l’aggiunta dell’agente ossidante.

Come mostrato in figura 3 la composizione ha mostrato una buona attività di scavenger dei radicali liberi, paragonabile a quella mostrata dalla vitamina C. Inoltre il prodotto non favorisce la produzione di radicali liberi e non ha quindi di per sé un effetto ossidante.

La composizione si à ̈ dimostrata essere un ottimo scavenger: la sua presenza garantisce un’ottima azione neutralizzante dei radicali liberi provenienti dal metabolismo endogeno paragonabile a quella della vitamina C, ed una buona azione tamponante anche in presenza di importanti stress ambientali e comportamentali. tale azione potrebbe contribuire significativamente non solo al mantenimento dello stato di benessere dell'epitelio intestinale, ma essere un ottimo coadiuvante per ristabilirlo in quegli individui che soffrono di intestino irritabile.

5. Tossicità

Quale conferma sperimentale della sicurezza riscontrata in letteratura la biocompatibilità eseguita sulla composizione dell’invenzione, secondo ISO-10993, à ̈ sta confermata la sicurezza del prodotto, in quanto oltre a quanto noto dalla letteratura, i test mostrano un prodotto:

• non irritante per la mucosa intestinale,

• non sensibilizzante,

• non citotossico

• non tossico per somministrazione orale in acuto a concentrazioni > 2000 mg/kg.

6. Esperienza clinica raccolta su pazienti informati affetti da IBS

Con la collaborazione di medici specialistici sono stati raccolti dei case studies su pazienti affetti da sindrome del colon irritabile ai quali à ̈ stato somministrata la composizione dell’invenzione secondo il giudizio e la pratica medica dei medici collaboratori per persone afferenti al loro studio affetti da intestino irritabile.

Senza interferire nella pratica medica, ma chiedendo la collaborazione del paziente nella diligenza del rispetto della terapia, ai pazienti à ̈ stato chiesto di riempire i questionari validati (Francis, 1997) per poter valutare la loro risposta al prodotto, oltre all’autorizzazione al trattamento dei dati.

I case studies riportati si riferiscono a 6 settimane di trattamento secondo le indicazioni seguenti: 6 cp al dì, suddivise in 2 cp 1 ora prima di colazione, 2 cp 1 ora prima di pranzo e 2 cp un’ora prima di cena. Dopo la prima visita, sono state eseguite due visite di controllo dopo 3 e 6 settimane. Hanno partecipato allo studio 44 pazienti di cui 6 non hanno completato il periodo di trattamento.

Questi sono stati effettuati con composizioni come quelle sopra descritte,

tipo:

Dose totale giornaliera compresa tra 2000 e 3000 mg della composizione come descritta nella parte dettagliata dell’invenzione comprendente incenso resina estratto liofilizzato, Aloe vera gel fogliare disidratato, Camomilla fiori estratto liofilizzato e Melissa officinalis, più coadiuvanti tecnologici q.b. a 2000-3000 mg

6.1 Metodi di valutazione degli effetti clinici della composizione dell’invenzione

Le variazioni della sintomatologia gastrointestinale in seguito alla somministrazione della composizione sono state esaminate in due modi:

1) mediante un diario giornaliero che à ̈ stato compilato dai pazienti sia durante il giorno precedente l’inizio del trattamento, che, in seguito, per tutta la durata dello studio, relativamente al dolore e gonfiore addominali, valutati mediante scala ordinale da 1 a 5 punti, ed all’alvo, riportando il numero di scariche giornaliere. Inoltre ai pazienti à ̈ stato richiesto anche di valutare giorno per giorno il grado di benessere relativo all’apparato gastrointestinale durante la giornata trascorsa con un punteggio da 1 a 5.

Tale metodo consente di seguire passo passo l’evolversi della sintomatologia durante il trattamento ed à ̈ stato considerato molto adeguato per questo tipo di valutazione da importanti riviste internazionali di Medicina Interna e Gastroenterologia in occasione di precedenti lavori sulla terapia di malattie funzionali gastrointestinali (New England Journal of Medicine, Gastroenterology, Alimentary Pharmachology and Therapeutics)

2) mediante il questionario di Francis (Francis CY, Morris J, Whorwell PJ. The irritable bowel severity scoring system: a simple method of monitoring irritable bowel syndrome and its progress. Aliment Pharmacol Ther 1997;11:395-402) che à ̈ stato compilato 3 volte: prima dell’ inizio del trattamento, dopo un intervallo di tre settimane circa ed alla fine del trattamento dopo 6 settimane e mediante il questionario sulla qualità della vita IBS 36 compilato all’inizio ed alla fine del trattamento.

Inoltre a tutti i pazienti à ̈ stato richiesto anche di esprimere alla visita finale (V3) un giudizio soggettivo sull’efficacia della terapia, sull’eventuale miglioramento della qualità della vita, sulla difficoltà ad assumere il prodotto e sulla comparsa di effetti collaterali ed infine di dichiarare il loro desiderio di proseguire o no con la terapia appena conclusa

I questionari di Francis e di Qualità della vita compilati durante questo studio sono stati oggetto di una valutazione statistica.

Valutazione mediante diario giornaliero

Le osservazioni sono state condotte su 20 pazienti affetti da colon irritabile ai quali il prodotto à ̈ stato somministrato in modo aperto e non controllato, valutando la sintomatologia prima e dopo la somministrazione mediante la compilazione di un diario giornaliero con valutazione finale da parte del paziente.

I pazienti osservati per i case studies sono pazienti senza complicanze fisiche o psichiche o aventi altre patologie rilevanti, o che siano sotto terapia antibiotica o abbiano appena intrapreso una nuova terapia.

Valutazione dei sintomi

I pazienti hanno compilato un diario giornaliero sia settimanale dal giorno precedente l’inizio del trattamento, che, in seguito, per tutta la durata dello studio:

- valutando il dolore e la distensione addominali, mediante scala ordinale a 5 punti, dove:

1= sintomo assente, 2= sintomo lieve, 3= sintomo di intensità media, 4= sintomo forte, 5= sintomo fortissimo

- e riportando il numero di scariche giornaliere.

Inoltre ai pazienti à ̈ stato richiesto anche di valutare giorno per giorno il grado di benessere gastrointestinale circa la giornata trascorsa, con un punteggio da 1 a 5 (1 = pessimo, 5= ottimo;) e di esprimere alla visita finale (V6 ) un giudizio finale sull’efficacia della terapia, sull’eventuale miglioramento della qualità della vita, sulla difficoltà ad assumere il prodotto e sulla comparsa di effetti collaterali, nonché sulla disponibilità a ripetere il trattamento.

Analisi statistica

Sono stati calcolati i punteggi medi settimanali per ogni parametro e confrontati rispetto ai valori del periodo di base, utilizzando il test t di Student per dati appaiati.

Risultati

Dei 44 pazienti analizzati, 16 hanno compilato dei diari.

L’analisi dei risultati ha dimostrato che sia il dolore addominale, che il gonfiore addominale sono significativamente diminuiti rispetto al periodo basale di controllo a partire dalla quarta settimana di trattamento fino alla fine (Figure 5 e 6).

La valutazione soggettiva giornaliera dello stato di benessere gastrointestinale à ̈ significativamente migliorata rispetto al periodo di controllo di base a partire dalla seconda settimana fino alla sesta settimana (Figura 4).

L’effetto sul numero delle defecazioni non à ̈ risultato mai significativo. Infatti il numero delle defecazioni à ̈ passato da 1,86±1,14 (media±SD) del periodo di base a 2±1,09, dopo 3 settimane ed a 1,78±1,13, dopo 6 settimane.

Poiché il numero dei pazienti trattati à ̈ stato basso, non à ̈ stato possibile stabilire con certezza se vi sono differenze tra i vari tipi di colon irritabile, a prevalente stipsi, a prevalente diarrea e misto.

Valutazione mediante questionario di Francis e questionario della qualità della vita IBS-36.

I pazienti sono gli stessi che hanno completato il diario più altri, scelti secondo gli stessi criteri sopra descritti, e cioà ̈ affetti da IBS senza ulteriori complicazioni.

Lo studio di Francis ha dimostrato che il dolore addominale à ̈ significativamente (valutato mediante test del chi quadro di Pearson) diminuito sia dopo 3 settimane (-36,7%) che dopo 6 settimane (-60,3%). Infatti, la popolazione si sposta gradualmente da punteggi che corrispondono ad un fastidio moderato o grave (97% all’inizio contro i 32% dopo 6 settimane) a punteggi che denotano nessun fastidio o fastidio minimo (3% all’inizio contro i 68% dopo 6 settimane) Questi dati sono riportati nelle figure 7 e 8, in cui sono evidenti le variazioni dei sintomi relativi al dolore addominale e al disagio legato all’IBS nell’arco del tempo (T0, T3 e T6 che stanno, rispettivamente per inizio, 3, e 6 settimane di terapia) per sintomatologia con intensità “grave†“media†“leggera†“normale†nella figura 7 e “grave media†“leggera normale†nella figura 8.

Le definizioni di grave, media, leggera e normale sono state assegnate secondo il questionario di Francis 1997 sopra indicato.

Inoltre anche i sintomi IBS-specifici quali fastidio legato all’evacuazione e caratteristiche delle feci sono passati da intensità “moderata o severa†a intensità “lieve†. Le feci sono divenute più “normali†ed in particolare sono risultate meno “dure†, con riduzione della “urgenza†defecatoria..

Non c’à ̈ variazione significativa relativamente alla settimane lavorative perdute ed alle settimane con dolore sul posto di lavoro.

I pazienti segnalano una buona accettazione del prodotto che hanno giudicato moltissimo o molto efficace nel 57,9% dei casi con notevole miglioramento della qualità della vita nel 57,9 % dei casi e nessuna comparsa di fastidi o intolleranza nel 91,2 % dei casi.

Il 90% dei pazienti ha desiderato continuare ad assumere il prodotto.

Per quanto riguarda il punteggio osservato nel questionario sulla qualità della vita appositamente sviluppato per l’IBS, i risultati sono stati molto positivi. Infatti, il punteggio globale del questionario à ̈ diminuito in maniera statisticamente significativa nelle 6 settimane di trattamento dimostrando un miglioramento nella qualità della vita.

Test di mucoadesività della composizione dell’invenzione e del il suo effetto di protezione sulla mucosa intestinale rispetta a danno indotto da idrocloruro in camera di Ussing.

L’esperimento à ̈ stato realizzato per verificare gli effetti delle sostanze saggiate sulla mucosa intestinale danneggiata artificialmente ex vivo (es. acido cloridrico).

Sono stati utilizzati per il test 40 ratti maschi Sprague Dawley di circa 200-250g. I ratti sono stati stabulati in gabbie di 160x270x440 mm (altezza, larghezza, lunghezza) con temperatura e umidità controllata e un ciclo luce-buio con variazione ogni 12 ore.

Le gabbie sono state pulite e disinfettate prima dell’uso e gli animali sono stati sottoposti ad una dieta standard con pellet e acqua purificata à ̈ stata distribuita ad libitum.

Sono stati utilizzati come reagenti il tampone di Kreb: 115 mM NaCl della VWR International Ltd (BDH), 8

mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4(7H2O), 2 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glucosio e

225 mM NaHCO3 della Merck. Il pH della soluzione à ̈ stato regolato con 1.0 N HCl o con 1.0 N NaOH della Merck, la misura del pH à ̈ stata fatta con elettrodo (Radiometer Copenhagen PHM82 Standard pH Meter).

Il sistema Ussing Chamber system EVC-4000 era della World Precision Instrument Inc.

La soluzione anestetica conteneva 10% Imalgene 1000 (cloridrato di chetammina 100

mg/ml) e 2.5% Rompun (cloridrato di xilazina 23.32 mg), entrambi della Bayer.

Razionale e trattamento

Sono stati fatti 4 gruppi di 8 ratti ciascuno A,B,C,D rispettivamente non trattati, trattati con soluzione salina 1,0 ml per via intragastrica, trattati con 1,0 ml (500mg/kg di peso corporeo) di composizione dell’invenzione per via intragastrica e trattati con 1,0 ml di desametasone (1mg/kg di peso corporeo) per via intragastrica.

Il gruppo non trattato non à ̈ stato bloccato per evitare danni alla mucosa legati allo stress mentre negli altri casi gli animali sono stati bloccati per valutare i danni alla mucosa evitando la variabile “cibo†.

Gli animali dei gruppi A, B, C e D sono stati privati del cibo per 18 ore.

Quattro ratti per gruppo sono stati anestetizzati 30 minuti dopo la somministrazione sopra indicata mediante iniezione intraperitoneo e sono stati tenuti in ambiente riscaldato.

È stato quindi dissezionato un campione di duodeno da questi ratti e montato tra le due emi-camere della camera di Ussing ed à ̈ stato indotto danno con idrocloruro (pH 8,0; pH5,5).

Quattro ratti per gruppo sono stati anestetizzati 50 minuti dopo la somministrazione sopra indicata mediante iniezione intraperitoneo e sono stati tenuti in ambiente riscaldato.

È stato quindi dissezionato un campione di ileo da questi ratti e montato tra le due emi-camere della camera di Ussing ed à ̈ stato indotto danno con idrocloruro (pH 8,0; pH6,5).

I pH per il danno sono stati scelti secondo saggi realizzati per la valutazione di danni mucosali poiché il pH fisiologico del duodeno à ̈ di ca.7,35 nel duodeno e di ca.8 nell’ileo, il tempo di transito della composizione dell’invenzione era stato verificato precedentemente e si trovava ca. 30 minuti dopo la somministrazione nel duodeno e ca. 50 minuti dopo la somministrazione nell’ileo.

Preparazione del tessuto

Gli espianti di duodeno o ileo sugli animali anestetizzati sono stati effettuati mediante incisione addominale di animali anestetizzati ed immediatamente messi in tampone di Krebs ai rispettivi pH ottimali sopra indicati pre riscldato ed ossigenato. È stato quindi prelevato un campione di ca.0,25 cm2.

I segmenti prelevati sono stati montati nelle due emicamere del sistema di Ussing (apertura 0.125 cm2). Sono stati connessi due elettrodi sensibili al voltaggio e due elettrodi Ag-AgCl passanti corrente alla camera di Ussing mediante ponti di agar.

La camera così assemblata à ̈ stata posta in un blocco contente un bagno d’acqua circolante a 28°C e le emicamere sono state riempite con tampone di Krebs ossigenato da ambo i lati del tessuto.

I lati mucosale e sieroso della camera sono stati entrambi collegati a serbatoi sterili contenenti 10 ml di tampone di Krebs ossigenato e sono stati mantenuti a 28° e sottoposti a flusso di gas contentente ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5%.

È stato aggiunto ad entrambi i lati D-glucosio 5,5mM.

Una volta montata la membrana intestinale nella camera di Ussing il sistema à ̈ stato fatto stabilizzare per 10 minuti per saggiare la funzionalità dello stesso e l’integrità delle membrane intestinali.

Sono state misurate direttamente la ddp in mV attraverso la membrana mucosale e la corrente di corto circuito e sono stati monitorati per 15 minuti mentre la resistenza transmembrana à ̈ stata calcolata in ohm x cm2, usando la legge di Ohm.

I serbatoi sono successivamente stati svuotati e riempiti di tampone di Krebs a pH 5,5 per il duodeno e a pH 6,5 per l’ileo.

Il sistema à ̈ stato fatto stabilizzare per 10 minuti e gli stessi parametri indicati sopra sono stati misurati poi per 15 minuti.

Il pH Ã ̈ stato regolato come descritto sopra.

Poiché l’acido cloridrico danneggia in modo meccanico l’integrità della mucosa, il mantenimento di una integrità mucosale in condizioni acide à ̈ direttamente proporzionale all’effetto protettivo meccanico del prodotto saggiato (per meccanico s’intende un effetto che non sia farmacologico, non farmacologico, immunologico o metabolico).

I dati sono riportati come media ±SD. La comparazione à ̈ stata fatta utilizzando il test Student T la significatività era *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.

I gruppi sono stati paragonati come segue:

Il gruppo di controllo B à ̈ stato analizzato in relazione al gruppo non stressato A per verificare se il solo stress fosse già di per se responsabile di un danneggiamento o di una maggiore sensibilità al danno indotto della mucosa.

I gruppi C e D sono stati confrontati con il gruppo B per verificare se il prodotto somministrato era protettivo o meno della mucosa nel ratto stressato e con danno indotto rispetto al gruppo di controllo solamente stressato.

RISULTATI

Gruppo A (non trattati, alimentati e non bloccati – NO STRESS) L’esperimento descritto sopra nella camera di Ussing à ̈ stato effettuato per valutare la resistenza della mucosa intestinale di ratti non trattati, senza bloccaggio, usando il protocollo sopra.

I risultati ottenuti mostrano che il valore medio di resistenza del duodeno in condizioni fisiologiche con tampone di Krebs al pH fisiologico sopra indicato era 87,0 ± 23,9 ohm x cm2.

Dopo induzione del danno con tampone di Krebs a pH 5,5 la resistenza mostrava un valore medio di 71,4 ± 20,7 ohm x cm2.

Il valore medio di resistenza dell’ileo in condizioni fisiologiche con tampone di Krebs al pH fisiologico sopra indicato era 68,1 ± 20,9 ohm x cm2.

Dopo induzione del danno con tampone di Krebs a pH 6,5 la resistenza mostrava un valore medio di 58,7 ± 22,7 ohm x cm2.

La protezione massima à ̈ quindi a pH fisiologico e la mucosa non trattata sembra avere anche un potenziale di protezione probabilmente dovuto al cibo e al muco protettivo presente nella mucosa non stressata.

Gruppo B (ratti bloccati – STRESS - trattati con sola fisiologica, controllo) Effettuando l’esperimento descritto sopra nella camera di Ussing i risultati ottenuti mostrano che:

il valore medio di resistenza del duodeno in condizioni fisiologiche con tampone di Krebs al pH fisiologico sopra indicato era 73,0 ± 8,7 ohm x cm2.

Dopo induzione del danno con tampone di Krebs a pH 5,5 la resistenza mostrava un valore medio di 62,0± 8,8 ohm x cm2.

Il valore medio di resistenza dell’ileo in condizioni fisiologiche con tampone di Krebs al pH fisiologico sopra indicato era 51,5 ± 4,3 ohm x cm2.

Dopo induzione del danno con tampone di Krebs a pH 6,5 la resistenza mostrava un valore medio di 44,9 ± 4,7 ohm x cm2.

Questi dati mostrano quindi che la sola presenza di stress, fattore presente anche nell’IBS, à ̈ sufficiente ad abbattere notevolmente la protezione naturale presentata da una mucosa intestinale sana (valori prima del trattamento a pH acido) e che la resistenza della mucosa cala di ben 9 punti nel duodeno e di 7 nell’ileo a seguito di trattamento con acido con una significatività statistica, rispetto al gruppo A, non stressato, di **p<0,01 per i valori osservati nel duodeno e di ***p<0,001 per i valori osservati nell’ileo dopo l’induzione del danno.

Gruppo C (ratti bloccati – STRESS - trattati con la composizione secondo l’invenzione)

Effettuando l’esperimento descritto sopra nella camera di Ussing i risultati ottenuti mostrano che:

il valore medio di resistenza del duodeno in condizioni fisiologiche con tampone di Krebs al pH fisiologico sopra indicato era 79,1 ± 6,9 ohm x cm2.

Dopo induzione del danno con tampone di Krebs a pH 5,5 la resistenza mostrava un valore medio di 69,0± 4,1 ohm x cm2.

Il valore medio di resistenza dell’ileo in condizioni fisiologiche con tampone di Krebs al pH fisiologico sopra indicato era 51,4 ± 7,9 ohm x cm2.

Dopo induzione del danno con tampone di Krebs a pH 6,5 la resistenza mostrava un valore medio di 46,1 ± 7,7 ohm x cm2 il che indicava che l’attività di barriera fisiologica del tessuto era preservata.

Questo gruppo mostra una resistenza pre-danno in allineamento con il gruppo di controllo B, la resistenza duodenale à ̈ significativamente maggiore in questo gruppo rispetto al gruppo di controllo B ***p<0,001 mentre la maggiore resistenza osservata nell’ileo non à ̈ comunque statisticamente significativa.

Gruppo D (ratti bloccati – STRESS - trattati con la Desametasone)

Effettuando l’esperimento descritto sopra nella camera di Ussing i risultati ottenuti mostrano che:

il valore medio di resistenza del duodeno in condizioni fisiologiche con tampone di Krebs al pH fisiologico sopra indicato era 50,4 ± 13,9 ohm x cm2.

Dopo induzione del danno con tampone di Krebs a pH 5,5 la resistenza mostrava un valore medio di 48,0± 12,7 ohm x cm2.

Il valore medio di resistenza dell’ileo in condizioni fisiologiche con tampone di Krebs al pH fisiologico sopra indicato era 50,6 ± 13,4 ohm x cm2.

Dopo induzione del danno con tampone di Krebs a pH 6,5 la resistenza mostrava un valore medio di 39,7 ± 8,1 ohm x cm2 il che indicava che l’attività di barriera fisiologica del tessuto era diminuita.

Il gruppo con desametasone mostra un’integrità duodenale ridotta anche a pH fisiologico, probabilmente dovuta al danno gastrico causato dai cortisonici, l’integrità mucosale però non diminuisce in maniera drastica dopo il trattamento con acido poiché la mucosa à ̈ già molto danneggiata.

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composizione per la cura e/o la prevenzione della Sindrome dell’Intestino Irritabile comprendente resine e/o loro estratti, polisaccaridi e/o estratti vegetali comprendenti polisaccaridi, antiossidanti e/o estratti vegetali comprendenti antiossidanti.
2. 2. Composizione secondo la rivendicazione 1 in cui dette resine o loro estratti sono scelte nel gruppo comprendente incenso, mirra.
3. 3. Composizione secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui detti polisaccaridi sono scelti tra polisaccaridi estratti da Aloe vera, camomilla, altea e detti estratti vegetali comprendenti polisaccaridi sono scelti tra estratti di Aloe vera, di camomilla, di altea.
4. 4. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui detti antiossidanti sono scelti tra antiossidanti estratti da camomilla, melissa, e detti estratti vegetali comprendenti anti ossidanti sono scelti tra estratti di camomilla, di melissa.
5. 5. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 in cui dette resine o loro estratti sono scelte nel gruppo comprendente incenso, mirra, detti polisaccaridi sono scelti tra polisaccaridi estratti da Aloe vera, camomilla, altea, detti estratti vegetali comprendenti polisaccaridi sono scelti tra estratti di Aloe vera, di camomilla, detti antiossidanti sono scelti tra antiossidanti estratti da camomilla, melissa, e detti estratti vegetali comprendenti anti ossidanti sono scelti tra estratti di camomilla, di melissa.
6. 6. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 in cui dette resine e/o loro estratti sono presenti in una percentuale in peso dal 30 al 60%.
7. 7. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 in cui detti polisaccaridi e/o estratti vegetali comprendenti polisaccaridi sono presenti in una percentuale in peso dal 12 al 22%.
8. 8. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 in cui detti antiossidanti e/o estratti vegetali comprendenti antiossidanti sono presenti in una percentuale in peso dal 35 al 65%.
9. 9. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8 in cui dette resine e/o loro estratti sono presenti in una percentuale in peso dal 30 al 60%, in cui detti polisaccaridi e/o estratti vegetali comprendenti polisaccaridi sono presenti in una percentuale in peso dal 12 al 22% e in cui detti antiossidanti e/o estratti vegetali comprendenti antiossidanti sono presenti in una percentuale in peso dal 35 al 65%.
10. 10. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11 ulteriormente comprendente sostanze di origine naturale e/o vegetale aventi proprietà emollienti, digestive, pro cinetiche, colagoghe, carminative, prebiotiche, rilassanti, eccipienti, conservanti, umidificanti.
11. 11. Composizione secondo la rivendicazione 10 in cui dette sostanze di origine naturale e/o vegetale sono selezionate tra una o più tra: estratto di genziana radice, estratto di boldo foglie, estratto di cardo mariano frutti, estratto di carciofo foglie, estratto di tarassaco radice, estratto di anice frutti, estratto rosmarino foglie, estratto di menta foglie, estratto di maggiorana foglie, estratto di cumino frutti, estratto di coriandolo frutti, estratto di zenzero radice, estratto di finocchio frutti, estratto di carvi frutti, carbone vegetale, inulina.
12. 12. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11 in forma di capsula, compressa, pasticca, granulato, polvere, sciroppo, elisir, gelatina dura, gelatina morbida, sospensione, emulsione, soluzione.
13. 13. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12 in cui detta composizione à ̈ una composizione farmaceutica, à ̈ compresa in o consiste in un dispositivo medico, à ̈ compresa in o consiste in un integratore alimentare o à ̈ compresa in un alimento a fini medici speciali.
14. 14. Dispositivo medico, farmaco, integratore alimentare o alimento a fini medici speciali comprendente una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13.
15. 15. Metodo per la preparazione di una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13 in cui dette resine e/o loro estratti, detti polisaccaridi e/o estratti vegetali comprendenti polisaccaridi e detti antiossidanti e/o estratti vegetali comprendenti antiossidanti sono miscelati insieme, opzionalmente con ulteriori eccipienti e/o una o più sostanze di origine naturale e/o vegetale aventi proprietà emollienti, digestive, pro cinetiche, colagoghe, carminative, prebiotiche, rilassanti, eccipienti, conservanti, umidificanti.