ITRM20130294A1 - Estratti di senna e loro usi - Google Patents

Estratti di senna e loro usi

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ITRM20130294A1
ITRM20130294A1 IT000294A ITRM20130294A ITRM20130294A1 IT RM20130294 A1 ITRM20130294 A1 IT RM20130294A1 IT 000294 A IT000294 A IT 000294A IT RM20130294 A ITRM20130294 A IT RM20130294A IT RM20130294 A1 ITRM20130294 A1 IT RM20130294A1
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mucosa
senna
sennosides
ethanol
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Valentino Mercati
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Aboca Spa Societa Agricola
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Description

"ESTRATTI DI SENNA E LORO USI"
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda estratti di senna impoveriti in sennosidi come mucoprotettori, gastroprotettori e/o dermoprotettori, metodi per la loro preparazione e composizioni comprendenti tali estratti.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE
La senna (Cassia acutifolia o Cassia angustifolia) Ã ̈ una pianta le cui foglie o i cui baccelli (follicoli) sono comunemente utilizzati come lassativi.
L’azione lassativa della senna à ̈ notoriamente un’azione lassativa fortemente irritante dovuta alla presenza nei baccelli e nelle foglie, di antrachinoni noti come sennosidi.
I principali costituenti attivi nella foglia sono i sennosidi A e B (più i sennosidi A1, C, D, G) il 2,5% circa espresso in contenuto di sennoside B (C42H38O20; Mr863 secondo la farmacopea europea), e nel baccello, comunemente chiamato anche follicolo, tali costituenti sono il 4% circa espresso in contenuto di sennoside B.
L’azione dei sennosidi à ̈ dovuto dalla loro conversione nell’intestino crasso nel metabolita attivo (reinantrone) che ha un effetto sulla motilità dell’intestino crasso (stimola le contrazioni peristaltiche e inibisce le contrazioni locali) con conseguente accelerazione del transito nel colon e riduzione dell’assorbimento dei liquidi e un effetto sui processi secretivi (stimolazione della secrezione di muco e secrezione attiva di cloruro) che provocano un aumento della secrezione di liquidi.
Il metodo standard per la titolazione di sennosidi in foglie e baccelli di senna à ̈ descritta nella farmacopea europea 7.0 nei capitoli intitolati Sennae folium (pagine 1236 e 1237 European Pharmacopoeia 7.0 ed. 2011, 01/2008:0206 corrected 6.0). Nella presente descrizione l’indicazione dei sennosidi totali presenti negli estratti indicata come “sennosidi totali SFM espressi come sennoside B†à ̈ quella ottenuta mediante il metodo sopra indicato, ovvero sennosidi determinati mediante metodo spettrofotometrico secondo quanto descritto nella farmacopea europea sopra citata.
Forme di quantificazione diversa saranno diversamente indicate.
È noto nell’arte quindi, l’uso come lassativo di foglie e/o follicoli di senna e dei loro estratti come lassativi ed à ̈ altresì noto l’effetto irritante sull’intestino di tale prodotto entrambi legati alla presenza dei sennosidi sia nelle foglie che nei baccelli della pianta di senna.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda un estratto di senna sostanzialmente impoverito nelle componenti farmacologicamente attive note rappresentate dai sennosidi totali, di cui restano solo tracce, e opzionalmente impoverito anche nelle resine e un metodo per ottenere tale estratto. L’estratto secondo l’invenzione, può essere utilizzato per un fine completamente diverso da quello per cui l’estratto di senna à ̈ utilizzato nello stato della tecnica, e cioà ̈ come protettore delle mucose o della cute. Tale utilizzo à ̈ realizzabile grazie alle attività protettive delle componenti rimanenti, di cui l’estratto à ̈ arricchito del 15-25% rispetto al prodotto iniziale grazie all’allontanamento dallo stesso dei sennosidi totali. L’estratto dell’invenzione fornisce quindi una nuova fonte di materiale di origine vegetale utilizzabile per la protezione delle mucose e della cute, in cui gli effetti farmacologici ascrivibili alle componenti note come principi attivi, sono sostanzialmente ridotti o eliminati.
Tale condizione à ̈ particolarmente desiderabile quando si vogliano utilizzare materiali di origine naturale o vegetale per azioni di tipo prevalentemente meccanico (e cioà ̈ non per azioni farmacologiche che abbiano, ad esempio effetto diretto sull’attivazione di vie recettoriali, immunitarie o processi metabolici). L’uso di sostanze ad effetto prevalentemente meccanico, come ad esempio sostanze che hanno un effetto barriera o mucoadesivo, sono desiderabili, ad esempio, per coadiuvare una terapia farmacologica. Riducendo al minimo la presenza di sostanze con attività farmacologica nel materiale di origine vegetale o naturale come nella presente invenzione, si ottiene materiale con effetto prevalentemente meccanico che si può usare in combinazione a farmaci, riducendo al minimo possibili interazioni non desiderate con i farmaci e sfruttando, al tempo stesso, la caratteristica tipica delle sostanze di origine vegetale di avere numerosissime componenti in grado di esercitare un effetto protettivo oltre a quelle farmacologicamente attive comunemente utilizzate.
L’utilizzo di estratti di sostanze complesse vegetali o naturali impoverite nei principi farmacologicamente attivi ha il duplice vantaggio di fornire materiale ad azione protettiva prevalentemente meccanica (muco protezione o dermo protezione) e di permettere un uso concreto e utile di materiali normalmente scartati in procedimenti estrattivi di principi attivi vegetali o naturali.
La presente invenzione riguarda quindi un estratto di senna impoverito in sennosidi totali, in cui detti sennosidi totali hanno una concentrazione percentuale in peso almeno ≤ 0,5%; il suo uso come protettore della cute o delle mucose; composizioni comprendenti tale estratto; il loro uso nella protezione della cute o delle mucose e metodi per la preparazione di tale estratto e di tali composizioni.
L’invenzione riguarda anche un metodo per la preparazione dell’estratto di senna come definito sopra comprendente i seguenti passaggi:
a. si prepara un estratto idroalcolico di foglie e/o baccelli (follicoli) di senna
b. si ottengono dall’estratto preparato in a. un estratto acquoso concentrato e un estratto resinoso privo di sennosidi
c. si decanta e/o filtra detto estratto acquoso raccogliendo il sovranatante o il filtrato d. il sovranatante o filtrato ottenuto in c. à ̈ sottoposto alternativamente ad uno o più passaggi di ultrafiltrazione o ad uno o più passaggi su resina adsorbente ad alta porosità e la frazione recuperata comprende sennosidi totali ad una concentrazione percentuale in peso ≤ 0,5%.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLE FIGURE
La figura 1 mostra uno schema a blocchi di una forma di realizzazione del procedimento dell’invenzione.
La figura 2a mostra uno schema a blocchi del passaggio d e la figura 2b mostra uno schema a blocchi del passaggio d’
La figura 3 mostra un grafico di mucoadesione su piano inclinato (saggio descritto sotto) in cui la sostanza saggiata à ̈ etanolo 50° nel pannello A (solvente dell’estratto), sodio alginato nel pannello B, l’estratto dell’invenzione nel pannello C, l’acqua nel pannello D (solvente del sodio alginato).
I rombi indicano i risultati ottenuti su piano inclinato con mucina ed il campione in esame, , mentre i quadrati quelli ottenuti sul controllo (bianco) in cui il campione in esame à ̈ saggiato su piano inclinato senza mucina.
La figura 3A mostra che per EtOH 50%, sostanza non muco adesiva, la misurazione dello scorrimento sul piano inclinato con e senza mucina à ̈ praticamente sovrapponibile.
I rombi indicano i risultati ottenuti su piano inclinato con mucina ed EtOH al 50% , mentre i quadrati quelli ottenuti sul controllo (bianco) in cui il campione in esame à ̈ saggiato su piano inclinato senza mucina.
La figura 3B mostra un grafico di mucoadesione su piano inclinato (saggio descritto sotto) in cui la sostanza saggiata à ̈ il sodio alginato, sostanza con note proprietà mucoadesive.
I rombi indicano i risultati ottenuti su piano inclinato con mucina e sodio alginato mentre i quadrati quelli ottenuti sul controllo (bianco) in cui il sodio alginato à ̈ saggiato su piano inclinato senza mucina.
Nel caso del campione costituito da sodio alginato si assiste ad una notevole differenza di comportamento in presenza ed assenza di mucina.
La figura 3C mostra un grafico di mucoadesione su piano inclinato (saggio descritto sotto) in cui la sostanza saggiata à ̈ l’estratto di senna impoverito in resine e sennosidi (ottenibile quindi al punto d. o d’ del procedimento) secondo la presente descrizione al fine di verificarne le proprietà mucoadesive.
I rombi indicano i risultati ottenuti su piano inclinato con mucina ed estratto di senna secondo la presente descrizione, mentre i quadrati quelli ottenuti sul controllo (bianco) in cui l’estratto di senna secondo la presente descrizione à ̈ saggiato su piano inclinato senza mucina.
La figura 3D mostra un grafico di mucoadesione su piano inclinato (saggio descritto sotto) in cui la sostanza saggiata à ̈ l’acqua.
I rombi indicano i risultati ottenuti su piano inclinato con mucina e acqua mentre i quadrati quelli ottenuti sul controllo (bianco) in cui l’acqua à ̈ saggiata su piano inclinato senza mucina.
Le figura mostra che per l’acqua, sostanza non mucoadesiva, la misurazione dello scorrimento sul piano inclinato con e senza mucina à ̈ praticamente sovrapponibile.
Come à ̈ possibile notare e l’estratto ha un comportamento simile al sodio alginato, si assiste ad una notevole differenza di comportamento in presenza ed assenza di mucina e risultando così con caratteristiche mucoadesive.
BREVE GLOSSARIO NMWCO=Nominal Molecular weight Cut-off, cutoff di peso molecolare nominale FILTRATO: estratto che à ̈ passato attraverso la membrana semipermeabile di ultrafiltrazione o attraverso il filtro a pannello
PERMEATO: estratto che à ̈ passato attraverso la membrane ultrafiltrazione . RITENUTO: estratto che non à ̈ passato attraverso la membrana di ultrafiltrazione o materiale adsorbito su resina
ELUATO: materiale non adsorbito su resina a seguito di passaggi adsorbimento sulla stessa.
ULTRAFILTRAZIONE: tecnica di filtrazione su membrana semipermeabile caratterizzata da pori aventi dimensioni da 100000 dalton (circa 0.1 um) a 500 dalton (0.005um circa)
Per “NON SUPERIORE†, rispetto alle quantità di principi attivi nell’estratto, nella presente descrizione s’intende ≤.
Per sennosidi totali, nella presente invenzione s’intendono sennosidi totali SFM espressi come sennoside B come da riferimento nella descrizione dello stato della tecnica (European Pharmacopoeia 7.0 ed.2011).
Ai fini della presente invenzione le percentuali in peso indicate si riferiscono agli estratti essiccati e sono quindi percentuali in peso dell’estratto essiccato.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Come indicato sopra, à ̈ fornito nella presente descrizione un estratto di senna impoverito in sennosidi totali SFM espressi come sennoside B, in cui detti sennosidi totali hanno una concentrazione percentuale in peso circa ≤ 0,5%. Applicando il processo estrattivo oggetto dell’invenzione sotto descritto e tecniche separative su membrana semipermeabile o su resina à ̈ stato possibile ottenere un estratto resinoso di senna privo di sennosidi e un estratto di senna impoverito di resine, sennosidi totali ed allo stesso tempo sorprendentemente arricchito nelle rimanenti sostanze. Entrambi gli estratti hanno mostrato una efficace azione protettiva sulla cute e sulle mucose come evidente dai saggi di muco adesività e dai test barriera riportati nella parte sperimentale sotto.
Entrambi gli estratti sono utilizzabili come descritto nella presente invenzione e possono anche essere miscelati insieme in modo tale da ottenere un estratto di senna comprendente resine e impoverito in sennosidi totali.
Rispetto agli estratti secchi di senna foglie e/o baccelli di senna in quanto tali, che comprendono una quantità sennosidi totali di almeno il 4.6% in peso circa, l’estratto privo di resine così come l’estratto impoverito in resine ricostituito con l’estratto resinoso privo di sennosidi della presente invenzione presentano soltanto tracce di tali principi attivi, in quanto comprendono una quantità in peso di sennosidi totali almeno ≤ 0,5%.
È evidente che tali percentuali corrispondono, in pratica, a tracce di sennosidi totali che non possono essere responsabili delle proprietà muco adesive e di barriera presentate dall’estratto dell’invenzione e che non possono indurre le attività farmacologiche per cui senna o estratti di senna sono comunemente utilizzati.
Poiché in una forma di realizzazione l’estratto à ̈ parallelamente impoverito anche di resine, che sono anch’esse quasi completamente eliminate nel procedimento completo di estrazione come sopra descritto, l’effetto muco adesivo e l’effetto barriera osservati per l’estratto privato di resine secondo l’invenzione non sono ascrivibili neppure alle resine.
L’estratto dell’invenzione può quindi essere
a. estratto resinoso ottenuto al punto b. del procedimento,
b. estratto impoverito in resine e sennosidi ottenuto al punto d. del procedimento
c. miscela degli estratti a. e b. descritti sopra in qualsiasi proporzione desiderata, ad esempio 50% e 50% o altre proporzioni, ad esempio miscelando i quantitativi totali di entrambi gli estratti ottenuti dallo stesso materiale iniziale.
Ciascuno di tali estratti à ̈ quindi utilizzabile per le sue proprietà di muco adesione e di effetto barriera in tutti quei casi in cui à ̈ necessaria o auspicabile la protezione di cute o mucose, che possono essere casi in cui deve essere somministrato un farmaco che aggredisce le mucose o la cute, quindi allo scopo di prevenire l’azione dannosa del farmaco, oppure in quei casi in cui à ̈ preferibile o auspicabile la protezione di una cute o di una mucosa parzialmente compromessa in modo da permetterne una migliore e più rapida guarigione, difendendola da ulteriori aggressioni, oppure in quei casi in cui un individuo presenti un disturbo cronico in cui cute o mucose subiscono delle irritazioni o delle alterazioni per cui un effetto barriera può prevenire o limitare i danni sulla cute o sulla mucosa.
Indicando l’effetto di protezione delle mucose, nella presente descrizione si intende che tali mucose possono essere la mucosa orale, la mucosa gastrica, la mucosa intestinale, la mucosa nasale, la mucosa, la mucosa uterina, la mucosa rettale.
La presente invenzione fornisce anche un metodo per la preparazione dell’estratto come sopra descritto, tale metodo comprendendo i seguenti passaggi: a. si prepara un estratto idroalcolico di foglie e/o baccelli (follicoli) di senna
b. si ottengono dall’estratto preparato in a. un estratto acquoso concentrato e un estratto resinoso privo di sennosidi
c. si decanta e/o filtra detto estratto acquoso raccogliendo il sovranatante o il filtrato d. il sovranatante o filtrato ottenuto in c. à ̈ sottoposto alternativamente ad uno o più passaggi di ultrafiltrazione e/o ad uno o più passaggi su resina adsorbente ad alta porosità e la frazione recuperata comprende sennosidi totali ad una concentrazione percentuale in peso ≤ 0,5%.
L’estratto ottenuto al punto d. secondo il metodo sopra descritto avrà una concentrazione percentuale in peso di sennosidi totali ≤0,5%.
L’estratto resinoso ottenuto al punto b. secondo il metodo sopra descritto sarà privo di sennosidi che restano nell’estratto acquoso ottenuto sempre in b.
Come già detto entrambi gli estratti sono oggetto dell’invenzione così come una loro miscela.
Il procedimento qui descritto potrà essere realizzato partendo da foglie e/o baccelli (follicoli, o frutti) di senna.
Estratti alcolici di senna potranno essere trattati secondo il processo riportato a partire dal punto b.
Estratti secchi di senna potranno essere trattati secondo il processo riportato a partire dal punto a.
Secondo l’invenzione, il procedimento sopra descritto à ̈ realizzabile effettuando al punto a. almeno due, almeno tre, o almeno quattro passaggi in concentrazioni decrescenti di etanolo, in cui la concentrazione decrescente di etanolo passa da etanolo a circa l’96% ad etanolo a circa 0%.
Ad esempio, il punto a. del procedimento può essere realizzato effettuando un passaggio con etanolo a circa l’85%, un passaggio con etanolo a circa il 50%, e un passaggio in etanolo a circa il 20%.
Oppure, il punto a. del procedimento potrà essere realizzato effettuando un passaggio con etanolo a circa l’85%, un passaggio con etanolo a circa il 50%, un passaggio in etanolo a circa il 20% e un passaggio con etanolo a circa il 5%.
Gli estratti ottenuti come sopra descritto sono riuniti a formare un estratto idroalcolico. Questi possono essere riuniti a ad esempio in rapporti reciproci uguali, come 50:50 nel caso di due passaggi in etanolo, o come 33,3:33,3:33,3 nel caso di tre passaggi in etanolo o 25:25:25:25 nel caso di quattro passaggi in etanolo. È evidente che gli estratti ottenuti effettuando i vari passaggi in etanolo sopra descritti potranno essere riuniti secondo rapporti diversi secondo le conoscenze generali del tecnico del settore.
Come già indicato sopra, l’estratto idroalcolico ottenuto al punto a. sarà utilizzato per preparare un estratto acquoso concentrato al punto b.
Tale estratto acquoso concentrato si potrà preparare concentrando l’estratto idroalcolico ottenuto in a. mediante evaporazione dell’alcol e lo si decanta e/o centrifuga e/o filtra e si raccoglie la fase acquosa concentrata (ad esempio nel caso di decantazione e/o centrifuga) si raccoglie il sovranatante acquoso mentre nel caso della filtrazione si raccoglie il filtrato. Alternativamente, l’evaporazione dell’alcol potrà essere eseguita dopo la fase di centrifuga e/o decantazione e/o filtrazione.
La decantazione potrà essere effettuata ad esempio da 1 a 72 ore, e potrà essere seguita o sostituita da una o più centrifugazioni a circa 3000-4000 (es. circa 3500) giri al minuto per un periodo compreso tra 1 e 10 minuti, ad esempio circa 5 minuti. Per la filtrazione potranno essere utilizzati filtri a pannello con un cutoff da 10 a 50 micron. Il sovranatante ottenuto dopo questo o questi passaggi à ̈ quindi prelevato e sottoposto, in caso non si sia già proceduto prima, ad evaporazione dell’alcol mediante tecniche standard, come ad esempio mediante utilizzo di impianto di distillazione a strato sottile (thin film), o impianto di concentrazione a batch secondo protocolli standard comunemente utilizzati dal tecnico del settore.
Il risultato di questa evaporazione à ̈ un estratto acquoso concentrato che viene, nel punto c. del procedimento, sottoposto a decantazione e/o filtrato.
Il precipitato ottenuto dopo questi passaggi à ̈ un estratto resinoso privo di sennosidi, anch’esso oggetto dell’invenzione.
È quindi anche oggetto il procedimento dell’invenzione comprendente unicamente i passaggi a. e b. in cui si tiene l’estratto resinoso ottenuto mediante sedimentazione o precipitazione e cioà ̈ un metodo per la preparazione di un estratto di senna privo di sennosidi, che comprende i seguenti passaggi:
a. si prepara un estratto idroalcolico di foglie e/o baccelli (follicoli) di senna
b. si ottengono dall’estratto preparato in a. un estratto acquoso e un estratto resinoso privo di sennosidi, si raccoglie detto estratto resinoso.
In questo caso ovviamente non à ̈ necessario concentrare l’estratto acquoso. Nel metodo comprendente i passaggi a-d, l’estratto acquoso concentrato (che potrà essere indicato anche come soluzione acquosa concentrata) può essere sottoposto a decantazione per un periodo compreso tra 1 e 72ore, e il sovranatante à ̈ quindi recuperato ottenendo così una soluzione chiarificata. La decantazione potrà essere seguita o sostituita da una o più centrifugazioni a circa 3000-4000 (es. circa 3500) giri al minuto per un periodo compreso tra 1 e 10 minuti, ad esempio circa 5 minuti.
Alternativamente, l’estratto acquoso concentrato à ̈ filtrato ottenendo così una soluzione chiarificata. La filtrazione potrà essere effettuata, ad esempio, su filtro a pannello con un cutoff da 10 a 50 micron, come ad esempio un cutoff di 15-20 micron, oppure un cutoff di 25 micron o anche superiori.
In una ulteriore forma di realizzazione l’estratto acquoso concentrato potrà essere decantato come descritto sopra ed il sovranatante ottenuto potrà essere poi filtrato come descritto sopra.
Il sovranatante o il filtrato ottenuti come descritto sopra sono recuperati e sottoposti ad un passaggio d. di impoverimento in sennosidi totali.
Ulteriormente, il metodo comprende un passaggio d. di trattamento del sovranatante o del filtrato ottenuto al punto c. sopra descritto prima della raccolta dell’estratto desiderato.
Questo passaggio (d), potrà essere realizzato mediante ultrafiltrazione del sovranatante o filtrato ottenuto in c. e/oppure mediante passaggio su resina adsorbente ad alta porosità del sovranatante o filtrato ottenuto in c. o del permeato ottenuto dopo ultrafiltrazione.
Nel primo caso, il sovranatante o filtrato ottenuto in c. à ̈ sottoposto ad uno o più passaggi di ultrafiltrazione e il permeato à ̈ recuperato, in cui detto permeato comprende sennosidi totali ad una concentrazione percentuale in peso ≤0,5%.
In questo ulteriore passaggio, l’estratto acquoso (risultato della filtrazione o sovranatante della decantazione in c.) à ̈ sottoposto ad uno o più passaggi di su membrana semipermeabile di ultrafiltrazione con un cutoff di peso molecolare (NMCWO) da 500 a 50000 dalton ad esempio da, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 20000, 50000 dalton. L’estratto permeato così ottenuto à ̈ sostanzialmente privo di sennosidi totali di resine e di sostanze a struttura terpenoidica mentre à ̈ arricchito di sostanze ad azione protettiva e può essere utilizzato tal quale o sottoposto a processo di liofilizzazione per fornire un estratto liofilizzato utilizzabile per formulazioni aventi impiego terapeutico per uso interno e/o esterno.
Secondo l’invenzione, quindi, detto uno o più passaggio di ultrafiltrazione potrà essere effettuato su membrane aventi un cutoff di circa 500-50,000 dalton, ad esempio circa, 10.000 dalton, 5000 dalton e 2500 dalton (corretto).
La presente invenzione riguarda quindi anche un procedimento per la preparazione di un estratto di senna comprendente i seguenti passaggi:
a. si prepara un estratto idroalcolico di foglie e/o baccelli (follicoli) senna
b. si ottengono dall’estratto preparato in a. un estratto acquoso concentrato e un estratto resinoso privo di sennosidi
c. si decanta e/o filtra detto estratto acquoso raccogliendo il sovranatante o il filtrato d. il sovranatante o il filtrato ottenuto in c. à ̈ sottoposto ad uno o più passaggi di ultrafiltrazione e il permeato finale à ̈ recuperato (raccolto),
in cui detto permeato comprende sennosidi totali ad una concentrazione in peso non superiore allo 0,5% (≤0,5%).
Come già detto opzionalmente, l’estratto ottenuto in b e l’estratto ottenuto in d possono essere miscelati.
Secondo una ulteriore forma di realizzazione il metodo dell’invenzione potrà comprendere, in alternativa o in aggiunta al passaggio d. come sopra descritto, un passaggio d’. in cui il filtrato o il sovranatante ottenuto in c. o il permeato ottenuto dopo ultrafiltrazione à ̈ sottoposto ad uno o più passaggi su resina adsorbente ad alta porosità e l’eluato, costituito dalle sostanze non adsorbite alla resina, à ̈ raccolto, in cui detto eluato così ottenuto comprende sennosidi totali ad una concentrazione percentuale in peso ≤0,5%.
La presente invenzione riguarda quindi anche un procedimento per la preparazione di un estratto di senna comprendente i seguenti passaggi:
a. si prepara un estratto idroalcolico di foglie e/o baccelli (follicoli) senna
b. si ottengono dall’estratto preparato in a. un estratto acquoso concentrato e un estratto resinoso privo di sennosidi
c. si decanta e/o filtra detto estratto acquoso raccogliendo il sovranatante o il filtrato d’. il filtrato o il sovranatante ottenuto in c. o il permeato ottenuto da uno o più passaggi di ultrafiltrazione come descritti sopra, à ̈ sottoposto in aggiunta ad uno o più passaggi su resina adsorbente ad alta porosità.
in cui detto eluato così ottenuto comprende sennosidi totali ad una concentrazione percentuale in peso ≤0,5.
Come già detto opzionalmente, l’estratto ottenuto in b e l’estratto ottenuto in d possono essere miscelati.
Secondo la presente invenzione il passaggio in d’ può essere fatto su colonna o con resine in grado di adsorbire sostanze aromatiche o altamente apolari e lasciare eluire le sostanze non aromatiche polari. Il materiale adsorbito sulla resina se desiderato, potrà essere desorbito con un solvente idoneo, come ad esempio etanolo o solventi idroalcolici, per altri usi.
Resine da cromatografia idonee possono essere, ad esempio resine di adsorbimento ad alta porosità di stirene divinil benzene copolimero come ad esempio amberlite XAD-2, serdolit PAD-II, ADS TQ 318.
In particolare, la resina sarà una resina in grado di adsorbire sostanze aromatiche e/o apolari, come ad esempio una resina adsorbente idrofobica , la resina à ̈ costituita da microsfere di diametro 0,2 mm - 0,8 mm, con coefficiente di uniformità pari a massimo 1.5 ottenute mediante polimerizzazione di Stirene e DVB senza gruppi attivi, caratterizzate da una struttura fisica altamente porosa aventi il parametro relativo al volume del poro pari a circa 1.3 ml/g che permette l’adsorbimento e l’eluizione selettiva di sostanze organiche preferenzialmente di natura aromatica. Il passaggio su resine aventi caratteristiche adsorbenti del tipo sopra descritto, permette quindi di ottenere una frazione (estratto dell’invenzione) impoverita in sennosidi totali (≤0.5%).
L’estratto ottenuto con i metodi sopra indicati conterrà solo tracce anche delle altre sostanze a struttura terpenoidica presenti nel prodotto iniziale oltre ai sennosidi totali.
L’estratto ottenibile con il metodo dell’invenzione comprende sennosidi totali ad una concentrazione in peso non superiore allo 0,5% (≤0,5% dove questo valore à ̈ riferito al prodotto secco).
Gli estratti secondo la presente invenzione possono essere utilizzati come tali o possono essere lavorati, ad esempio sottoponendoli ad essiccamento mediante liofilizzazione.
L’estratto ottenuto al punto d o d’ ha le caratteristiche come ad esempio quelle riportate in tabella 1, dove à ̈ posto a confronto con il prodotto di partenza, permeato da ultrafiltrazione o eluato da resina ottenuti rispettivamente in d e d’.
Tabella 1
Frazione Resa sennosidi totali (SFM) %
Prodotto iniziale 4-6%
Estratto oggetto dell’invenzione
(permeato<10.000 dalton
ottenuto al punto d)
o eluato ottenuto al punto d’<55% ≤0,5%>
Estratto oggetto dell’invenzione
(resinoso)<10% ≤0,05%>
Il procedimento secondo la presente invenzione, in cui l’ordine dei passaggi come descritto sopra permette quindi di ottenere un estratto di senna impoverito in sennosidi totali e sorprendentemente ricco in sostanze ad azione protettiva. Il procedimento da a. a d. sopra descritto elimina anche le resine per via dei reagenti e dei passaggi utilizzati come evidente al tecnico del settore.
In una forma di realizzazione dell’invenzione l’estratto dell’invenzione sarà anche sostanzialmente privo di resine che si troveranno nell’estratto resinoso ottenuto in b. e nelle frazioni scartate in c. e d o d’.
Tuttavia, l’estratto resinoso privo in sennosidi à ̈ raccolto e può essere utilizzato in quanto tale o riunito all’estratto ottenuto in d. o d’.
La presente invenzione riguarda anche una composizione comprendente l’estratto in una qualsiasi delle forme di realizzazione sopra descritte utilizzabile nella protezione della cute o delle mucose.
Tale protezione, ovviamente con riferimento sia all’estratto in se che alla composizione, potrà essere una protezione preventiva o una protezione di cute o mucose parzialmente compromesse.
Ad esempio, la composizione o l’estratto possono, in virtù del loro effetto barriera, facilitare la riparazione del tessuto cutaneo leso con conseguente ripristino di una cute sana ed elastica.
Le lesioni cutanee secondo la presente invenzione sono, ad esempio, lesioni che possono interessare anche il tessuto sottostante la cute e in cui non sono presenti ferite aperte.
Per lesioni cutanee che non implicano la presenza di ferite aperte, secondo la presente descrizione, sono intese quelle lesioni in cui lo strato superficiale della cute, e gli strati sottostanti, pur non essendo feriti, sono particolarmente fragili, irritati e danneggiati.
Esempi non limitanti di questo tipo di lesioni sono rappresentati da ustioni di primo grado, lesioni da decubito di primo grado, lesioni da pressione, arrossamenti, ferite o ustioni neo cicatrizzate, irritazioni, eritemi.
La composizione o l’estratto dell’invenzione potranno quindi essere utilizzati per la cura o la prevenzione di lesioni cutanee che non implicano la presenza di ferite aperte o nella prevenzione o rallentamento di aggravamenti delle stesse.
Le composizioni secondo l’invenzione potranno vantaggiosamente comprendere ulteriori componenti, ad esempio di origine vegetale, aventi, ad esempio, proprietà emollienti, digestive, pro cinetiche, colagoghe, carminative, prebiotiche, rilassanti, eccipienti, conservanti, umidificanti.
Quando la composizione o l’estratto dell’invenzione sono utilizzati per la protezione della cute, l’applicazione degli stessi sarà per via topica. Le forme di realizzazione delle composizioni per uso topico sono riportate di seguito nella descrizione.
La composizione secondo l’invenzione potrà essere realizzata ad esempio come emulsione olio in acqua, emulsione acqua in olio, olio in gel o gel in olio, emulsioni multiple, spray, e formulazioni anidre (pomata, gel, pasta, crema, unguento) e comprenderà uno o più eccipienti idonei alla realizzazione della forma finale desiderata.
Tali eccipienti potranno essere, ad esempio, emulsionanti (cetearil alcol, cetearil glucoside, olio di ricino idrogenato), additivi reologici, antiossidanti (come ad esempio vitamine, tocoferoli o altri antiossidanti noti nel settore).
L’agente emulsionante potrà essere un tensioattivo, che abbassando la tensione interfacciale diminuisce l'energia libera del sistema; in alternativa, si possono utilizzare anche sostanze non tensioattive, quali la gomma arabica, la gelatina, colloidi idrofili o polveri finemente suddivise (ad es., talco). In una forma di realizzazione gli eccipienti potranno essere presenti ad una concentrazione complessiva in peso compresa tra il 3 e l’8%, tale concentrazione essendo ovviamente indicativa, tenendo conto che comunque il tecnico del settore saprà adattare la concentrazione degli eccipienti necessari secondo la forma di realizzazione che intende preparare senza aggiunta di attività inventiva.
Inoltre la composizione potrà comprendere agenti profumanti e/o coloranti che ne rendano gradevole l’odore, come ad esempio uno o più oli essenziali come ad esempio olio essenziale di lavanda, olio essenziale di melaleuca, limone, menta, arancio, e/o agenti coloranti che permettano, ad esempio, di riconoscere facilmente le zone di applicazione della composizione, la colorazione essendo ad esempio temporanea in modo tale da non interferire con altre, successive, applicazioni della composizione.
In una forma di realizzazione detti agenti coloranti e/o profumanti sono compresi ad una concentrazione complessiva in peso tra lo 0,001 e il 3%.
Per “concentrazione complessiva in peso†s’intende la concentrazione in peso nella composizione della somma dei vari eccipienti o la concentrazione in peso nella composizione della somma dei vari agenti profumanti e/o coloranti presenti nella composizione.
Per quanto concerne l’uso della composizione nella protezione della cute, l’invenzione riguarda anche dispositivi medici ad come ad esempio cerotti medicati, garze medicate, bende medicate, salviette medicate, tamponi assorbenti medicati, pannolini medicati e cioà ̈ cerotti, garze, bende, salviette, tamponi o pannolini che comprendono la o siano coperti almeno in parte dalla o siano imbevuti almeno in parte della composizione dell’invenzione descritta nella forma più appropriata.
Le garze potranno essere realizzate come garze grasse, così le bende ed i cerotti utilizzando la composizione realizzata in forma di unguento, pasta o crema ad esempio. Le salviette potranno essere imbevute della composizione in forma di emulsione di olio con acqua o gel, e i pannolini o i tamponi assorbenti potranno essere realizzati inserendo la composizione negli appositi strati noti nel settore per l’inserimento di composizioni protettive o anti irritanti.
Tali prodotti come ad esempio pannolini per infanti, tamponi assorbenti o comunemente “assorbenti†per donne e pannolini per incontinenza dell’adulto, sono comunemente utilizzati ad esempio nel settore relativo all’infanzia, nel settore femminile e nel settore geriatrico e il tecnico del settore saprà dove inserire la composizione qui descritta e quale sua forma di realizzazione sia quella più idonea senza bisogno di particolari insegnamenti e basandosi unicamente su tecniche convenzionali nel settore.
Tali dispositivi saranno applicabili sulla parte da trattare e/o da proteggere a scopo preventivo.
Come già indicato sopra, la composizione dell’invenzione può essere composizione per uso topico che potrà essere realizzata in forma di emulsione olio in acqua, emulsione acqua in olio, emulsioni multiple, spray, e formulazioni anidre (pomata, unguento, gel, pasta, crema, spray,) secondo tecniche comunemente utilizzate nel settore. La formulazione qui indicata come “spray†potrà essere una formulazione anidra o anche una formulazione in emulsione, la forma con erogatore nebulizzante permettendo anche auto applicazioni in zone più difficili da raggiungere (come ad esempio la schiena), utile in tutti quei casi in cui la formulazione à ̈ utilizzata, ad esempio, per alleviare arrossamenti solari, eritemi, o irritazioni cutanee di vario genere.
Secondo un’altra forma di realizzazione, l’estratto o la composizione dell’invenzione potranno essere utilizzati, grazie al loro effetto muco adesivo e barriera, per la protezione delle mucose.
Anche in questo caso tale protezione potrà essere una protezione preventiva, ad esempio in tutti quei casi in cui si prevede la somministrazione di farmaci che hanno l’effetto collaterale di aggredire le mucose, oppure in quei pazienti che presentano condizioni di irritazione ricorrente delle stesse. In altri casi la protezione potrà essere invece una protezione a fini curativi oppure al fine di evitare il peggioramento di mucose irritate o parzialmente compromesse.
In questi casi la somministrazione dell’estratto o della composizione potrà essere topica per tutte quelle mucose su cui à ̈ possibile una somministrazione topica (ad esempio mucosa buccale, rettale, vaginale, nasale) o orale nei casi in cui si tratti ad esempio di mucose intestinali o gastriche.
Le composizioni per la protezione delle mucose potranno quindi essere realizzate in forma di capsula, compressa, pasticca, granulato, polvere, sciroppo, elisir, gelatina dura, gelatina morbida, sospensione, emulsione, soluzione, supposta, crema, gel, spray, unguento, pomata, pasta, emulsione olio in acqua, emulsione acqua in olio, emulsione olio in gel, emulsione gel in olio.
Nel caso di formulazioni ad uso topico potranno essere seguite le indicazioni relative alle composizioni per la protezione della cute sopra oppure potranno essere realizzati sciroppi, risciacqui, spray, ad esempio, per la protezione delle mucose della bocca, della gola, del naso.
Per l’applicazione sulla mucosa rettale potranno essere utilizzate supposte o clisteri o microclismi, con gli eccipienti noti al tecnico del settore per la realizzazione di tali composizioni.
Come già detto, la composizione dell’invenzione potrà essere in forma di capsula, compressa, pasticca, gelatina dura, gelatina morbida, granulato, polvere, sciroppo, elisir, sospensione, emulsione. Per la somministrazione orale la composizione potrà essere realizzata in forma di dosaggio unitario giornaliero o di frazioni di dosaggio unitario giornaliero (ad esempio 2, 3, 4, 5, 6, o più capsule, compresse, pasticche, monodosi di granulato o polvere, o gelatine potranno essere assunti nell’arco della giornata, secondo il giudizio del medico curante), e possono contenere eccipienti convenzionali inclusi, per esempio, agenti leganti, come gomma arabica, gelatina, sorbitolo, gomma adragante, e/o polivinilpirrolidone; riempitivi come lattosio, zucchero, amido di mais, amido di riso, fosfato di calcio, sorbitolo e/o glicina; lubrificanti di pastigliatura, come stearato di magnesio, talco, polietilenglicole e/o silice; disintegranti, per esempio amido di patata; e agenti umidificanti come sodio lauril solfato. Le compresse possono essere rivestite secondo metodi ben noti nella normale pratica farmaceutica.
La composizione potrà essere anche realizzata in forma liquida o semi liquida, sospensione, emulsione, soluzione per somministrazione orale e potrà opzionalmente contenere agenti naturali aromatizzanti che conferiscano alla stessa un gusto gradevole al palato.
La composizione in forma di polvere o granulato potrà essere pre-dosata in appositi contenitori e pronta all’uso o per ingestione in quanto tale o da risospendere in un opportuno liquido come acqua o tà ̈ o altro. Anche in questo caso la composizione potrà contenere agenti naturali aromatizzanti che conferiscano alla stessa un gusto gradevole al palato.
È evidente che tutti gli eccipienti sopra indicati potranno essere utilizzati in grado farmaceuticamente accettabile.
In una forma di realizzazione la composizione come qui descritta, in qualsiasi delle forme di realizzazione sopra indicate, potrà essere in forma di composizione farmaceutica, ovvero comprendere ingredienti di grado farmaceutico oppure potrà essere o essere inserita in, in un alimento a fini speciali o in un dispositivo medico.
La composizione secondo la presente descrizione potrà essere realizzata in forma di composizione farmaceutica oppure di dispositivo medico secondo una qualsiasi delle classi descritte nella Direttiva CEE 93/42 sui dispositivi medici (che comprende anche sostanze e non solo “dispositivi†nel senso meccanico del termine), o in forma di alimento a fini medici speciali, integratore alimentare o in qualsiasi forma secondo le disposizioni regolatorie del paese in cui tale composizione sarà prodotta.
Il dispositivo medico o l’alimento a fini medici speciali potranno contenere anche ingredienti altre componenti comprendenti ad esempio combinazioni di vitamine, sali minerali e altre sostanze volte all’integrazione della dieta.
L’estratto o la composizione dell’invenzione à ̈ quindi utilizzabile per le sue proprietà di muco adesione e di effetto barriera in tutti quei casi in cui à ̈ necessaria o auspicabile la protezione di cute o mucose, che possono essere casi in cui deve essere somministrato un farmaco che aggredisce le mucose o la cute, quindi allo scopo di prevenire o limitare l’azione dannosa del farmaco, oppure in quei casi in cui à ̈ preferibile o auspicabile la protezione di una cute o di una mucosa parzialmente compromessa in modo da permetterne una migliore e più rapida guarigione, difendendola da ulteriori aggressioni, oppure in quei casi in cui un individuo presenti un disturbo cronico in cui cute o mucose subiscono delle irritazioni o delle alterazioni per cui un effetto barriera può prevenire o limitare i danni sulla cute o sulla mucosa.
L’invenzione riguarda anche un metodo per la cura o per la prevenzione dell’insorgenza o dell’aggravamento di lesioni cutanee che non implichino la presenza di ferite aperte in cui tale metodo comprende una o più applicazioni della composizione dell’invenzione o del dispositivo medico che la comprende una o più volte al dì sulla parte interessata.
L’applicazione della composizione, ad esempio, potrà essere ripetuta ogni qualvolta se ne presenti la necessità (ad esempio ad ogni cambio di pannolino nel caso della prevenzione di arrossamenti legati all’incontinenza) o una, due, tre, quattro o più volte al giorno in generale.
L’invenzione riguarda anche un metodo per la preparazione di una composizione secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione sopra descritte in cui un estratto di senna impoverito in sennosidi totali in cui detti sennosidi totali hanno una concentrazione percentuale in peso ≤0,5%, à ̈ miscelato con almeno uno tra eccipienti e/o sostanze di origine naturale e/o vegetale aventi proprietà emollienti, digestive, pro cinetiche, colagoghe, carminative, prebiotiche, rilassanti, eccipienti, conservanti, umidificanti come sopra descritti.
Tra queste, ad esempio, potranno essere utilizzati uno o più di: estratto di genziana radici, estratto di boldo foglie, estratto di cardo mariano frutti, estratto di carciofo foglie, estratto di tarassaco radici, estratto di anice frutti, estratto rosmarino foglie, estratto di menta foglie, estratto di maggiorana foglie, estratto di cumino frutti, estratto di coriandolo frutti, estratto di zenzero radici, estratto di finocchio frutti, estratto di carvi frutti, carbone vegetale, inulina
È anche oggetto della presente invenzione un metodo per il trattamento protettivo (preventivo o curativo) della cute o delle mucose che prevede la somministrazione dell’estratto o della composizione della presente invenzione ad un paziente che lo necessiti. Tale somministrazione potrà essere anche in concomitanza con la somministrazione di altri farmaci.
L’assenza dei principi farmacologicamente attivi della senna nell’estratto o nella composizione rende tali prodotti particolarmente idonei alla somministrazione in concomitanza con altri farmaci in quanto à ̈ fortemente improbabile un effetto collaterale di interazione tra l’estratto o la composizione dell’invenzione e il farmaco co somministrato o somministrato in concomitanza.
Un esempio non limitativo del metodo di trattamento e/o di prevenzione della cute o delle mucose, potrà comprendere la somministrazione di un dosaggio giornaliero, suddiviso in una sola dose o in più dosi, descritta della miscela o della composizione secondo la presente descrizione, per un periodo di tempo compreso tra una e sei settimane, ad esempio compreso tra tre e sei settimane o anche per un periodo di tempo superiore alle sei settimane secondo il giudizio del medico curante.
Tale somministrazione potrà precedere la somministrazione del farmaco anche per un periodo prolungato in modo da ottimizzare lo stato di salute della cute o della mucosa da trattare.
Il medico curante saprà stabilire sia il dosaggio più opportuno che i tempi di somministrazione anche in base allo stato di salute, al peso, al sesso e all’età del paziente.
Una delle sostanziali differenze tra la struttura della pelle e quella delle mucose à ̈ rappresentata dall’assenza, nelle mucose, di una barriera selettiva come lo strato corneo. Il contatto delle mucose orali con sostanze nocive o irritanti presenti nell’ambiente (inquinanti, microrganismi patogeni, etc.) può provocare quindi una elevata penetrazione di queste sia all’interno delle mucose che nelle vie aeree collegate (bronchi, polmoni etc.) provocando patologie infiammatorie e/o allergiche.
L’effetto protettivo dell’estratto della presente invenzione à ̈ stato valutato mediante saggi di mucoadesione e mediante test di effetto barriera.
Il primo ha lo scopo di valutare la mucoadesività del prodotto in esame al fine di stabilire se tale prodotto ha la capacità di aderire alle mucose e conseguentemente di esercitare un’azione protettiva.
Sono ad esempio disponibili due semplici modelli di valutazione della mucoadesività del prodotto di interesse. Il primo ad esempio valuta la capacità muco adesiva del campione misurando la sua capacità di legarsi a mucina disposta su un piano inclinato, consentendo l’allontanamento per scivolamento del campione privo di capacità muco adesiva. Il secondo permette di valutare la capacità muco adesiva del campione mediante inibizione del legame tra lectina a glicoproteina espressa sulla membrana cellulare, di cellule provenienti da mucosa.
Per la valutazione dell’effetto barriera à ̈ disponibile un modello in vitro che permette di valutare l’impedimento del campione al passaggio di LPS, responsabile nel modello della liberazione di mediatori quali l’interleuchina 6 (IL-6) misurata in modo semiquantitativo mediante test ELISA.
Valutazione della percentuale di inibizione del legame lectinaglicoproteina
Nel primo modello la mucoadesività à ̈ determinata mediante la valutazione della percentuale di inibizione del legame lectina-glicoproteina. In questo modello possono essere utilizzate, ad esempio, cellule mucosali buccali o vaginali. Inizialmente le cellule sono trattate con lectinabiotinilata (Con-A), che presenta una elevata affinità per i residui glucosidici e mannosidici presenti nelle glicoproteine di membrana. In tal modo i siti delle glicoproteine delle membrane mucosali saranno occupati dalla lectinabiotinilata. La presenza della biotina (vitamina H) nella lectina à ̈ indispensabile per il successivo stadio. Alle cellule, già trattate con lectinabiotinilata, à ̈ aggiunta di streptavidinaperossidasi consentendo, grazie all’elevata affinità tra biotina e spreptavidina, di formare il complesso proteina-glucosio-lectina-biotinastreptavidinaperossidasi. A questo punto le cellule sono lavate ed il complesso proteina-glucosio-lectina-biotina-streptavidinaperossidasi à ̈ quantificato, grazie alla presenza della perossidasi, mediante la reazione di ossidazione dell’ortofenilendiammina.
Il complesso proteina-glucosio-lectina-biotina-streptavidina-perossidasi catalizza la reazione di polimerizzazione:
.
H2O2
O-fenildiamina 2,3-diaminofenazina (gialla).
Strep.perox
L’intensità della colorazione giallo-arancio della soluzione (misurata con spettrofotometro a λ=450 nm) à ̈ proporzionale alla quantità di legami glicoproteinalectina e quindi alla quantità di siti disponibili (glicoproteine) per la mucoadesione. Il valore di assorbanza così determinato costituisce il “controllo†.
Nel saggio di muco adesione sotto riportato le cellule mucosali sono trattate per circa 15 minuti a 30°C con il prodotto in esame prima del trattamento con lectina. In presenza di prodotti muco adesivi, questi inibiranno il legame della lectina diminuendo in maniera proporzionale alla loro capacità di muco adesione l’intensità di segnale nel campione rispetto al controllo come sopra descritto.
La percentuale di muco adesione del prodotto (%MA) potrà essere determinata come
%MA = (1 – abs campione/abs controllo) x 100
Valutazione della percentuale di adesione mediantepiano inclinato con mucina.
Le misure si effettuano mediante un’apparecchiatura costituita da un piano inclinato a 45°, termostatato a 37°C, al di sotto del quale à ̈ posta una microbilancia che esegue misure ad intervalli regolari di 1 secondo e stampa le misure registrate su carta. Le misure effettuate sono quindi trascritte e rielaborate su foglio di calcolo Excel.
Il piano inclinato funge da supporto per il substrato biologico, costituito da un film di mucina allestito deponendo, su di un piano di plexiglass mantenuto orizzontale, un volume pari a 3ml di una sospensione di mucina gastrica suina alla concentrazione dell’8% (p/p) in tampone fosfato pH 6.4.
La dispersione à ̈ quindi portata a secchezza alla temperatura di 44°C in modo da ottenere un film di area superficiale nota pari a 33.6 cm<2>.
Una quantità esattamente pesata dell’estratto secondo l’invenzione à ̈ sciolta in solvente. L’estratto à ̈ quindi deposto nel piano di misurazione con una pipetta multicanale a tempo e velocità costante durante 6 secondi.
La pipetta multicanale à ̈ tarata in modo da dosare la soluzione (o dispersione) sopra il piano di lavoro. La quantità totale à ̈ misurata ad ogni prova (il peso di tale volume viene misurato prima della prova e dipende dalla densità del campione in analisi).
Il campione, che andrà a cadere sulla microbilancia alla fine della corsa, si carica nella parte alta del piano inclinato, contenente il film di mucina, e si lascia scivolare su di esso. La quantità di campione caduto si misura registrando la variazione di peso in funzione del tempo. Il test come qui realizzato, ha la durata di 40 secondi, anche se normalmente dopo 20 secondi non si presenta alcuna variazione della pesata.
Si conducono anche misure in assenza del film di mucina sul piano inclinato (misure indicate come bianco) con le stesse quantità di campione e nelle medesime condizioni del test.
In tale modo à ̈ possibile valutare le proprietà di scorrimento intrinseche del campione indipendentemente dalla sua capacità di interagire con il substrato biologico.
Si calcola la % adesa: definita come la quantità di campione rimasta adesa al film di mucina o al piano inclinato (senza mucina, bianco) alla fine della misura, normalizzata rispetto alla quantità deposta sul piano inclinato.
Si determina inoltre la differenza percentuale tra quantità di campione adesa al piano con mucina e quantità di campione adesa al piano senza mucina. Il calcolo à ̈ effettuato in accordo con la seguente equazione:
Differenza % = (% adesa mucina - %adesa bianco)/ % adesa del bianco Dove:
• %adesa mucina= percentuale di campione rimasta adesa al film di mucina alla fine della misura
• %adesa bianco= percentuale di campione al piano inclinato alla fine delle misure di bianco.
Test effetto barriera
Il test effetto barriera à ̈ un test in vitro di tipo biologico impiegato per valutare la capacità di prodotti finiti e/o materie prime di proteggere, attraverso la formazione di un sottile strato “isolante†, mucose e cute dal contatto con contaminanti ambientali (polvere, pollini, microorganismi, ecc. )
Il test à ̈ stato sviluppato per simulare in Vitro l’azione esercitata da prodotti che vengono applicati su cute e/o mucose con la finalità di creare un film protettivo nei confronti di aggressori esterni.
Il modello sfrutta il principio per cui cellule sottoposte al contatto con un agente infiammatorio producono e secernono mediatori pro-infiammatori (citochine) nell’ambiente extracellulare in quantità correlata al grado di infiammazione provocato; entro un certo intervallo, esiste una diretta proporzionalità tra concentrazione e tempi di esposizione all’agente infiammatorio e quantità di citochine rilasciate.
Il modello sperimentale adottato prevede due camere fisicamente separate da una membrana semipermeabile (pori di 0.4µm). Nella camera inferiore vengono seminate le cellule mentre la camera superiore ospita l’agente infiammatorio; sulla membrana semipermeabile che separa le due camere viene stratificato un sottile film del campione in analisi per evidenziare, qualora presente, un effetto di barriera al libero passaggio dell’agente infiammatorio.
La membrana semipermeabile consente il passaggio dell’agente infiammatorio nella camera inferiore e costituisce il supporto su cui viene stratificato il campione da testare. In funzione della capacità “isolante†del campione, si avrà una diminuzione della migrazione dell’LPS dalla camera superiore a quella inferiore quindi una minore stimolazione delle cellule alla produzione di citochine.)
ESEMPI
Esempio 1
Preparazione dell’estratto
Sono state frammentate foglie e/o baccelli (follicoli) senna e sono state sottoposte a quattro o passaggi di estrazione in etanolo a concentrazione decrescente; effettuando un passaggio con etanolo all’85%, un passaggio con etanolo al 50%, un passaggio in etanolo al 20% e un passaggio con etanolo al 5%.
Gli estratti alcolici ottenuti come descritto sono stati riuniti in rapporto 25:25:25:25 e sono sottoposti a centrifugazione per un tempo di 1-5 minuti alla velocità di rotazione pari a 3500 giri minuto ed à ̈ stato recuperato il sovranatante che à ̈ stato concentrato per evaporazione dell’etanolo mediante utilizzo di impianto di distillazione a strato sottile (thin film) secondo protocollo standard, che prevede l’alimentazione dell’estratto da concentrare ad una portata di circa 500 l/h; si opera impostando un vuoto residuo di 06-0.8bar e il fluido riscaldante le pareti di evaporazione à ̈ impostato a 140°C ottenendo in questo modo, dopo l’eliminazione dell’etanolo, un estratto acquoso concentrato.
Il precipitato, ovvero l’estratto resinoso, à ̈ stato raccolto ed à ̈ risultato essere privo di sennosidi.
L’estratto acquoso così ottenuto à ̈ stato filtrato su filtro a pannello con un cutoff da 25 micron.
Il filtrato così ottenuto, che comprendeva sennosidi totali ad una concentrazione in peso non superiore al5% à ̈ stato sottoposto a un passaggio di ultrafiltrazione su membrana con un cutoff di 10,000 dalton e/o 5000 dalton e/o 2500 dalton secondo metodologie standard.
Il permeato finale in questo modo ottenuto comprendeva sennosidi totali ad una concentrazione in peso non superiore al 0,5%.
L’estratto acquoso concentrato dopo sedimentazione e recupero del sovranatante o dopo filtrazione e recupero del permeato, à ̈ stato sottoposto, in alternativa o in aggiunta al procedimento di ultrafiltrazione sopra descritto, ad un trattamento con resina adsorbente ad alta porosità, in particolare à ̈ stata utilizzata una resina di stirene DVB copolimero tipo ADS TQ 318. à ̈ evidente che qualsiasi resina adsorbente con caratteristiche simili potrà essere utilizzata nella realizzazione della presente invenzione.
In questo caso un procedimento standard di ottenimento dell’estratto mediante trattamento su resina comporta l’introduzione dell’estratto acquoso concentrato in un colonna cromatografica contenente la resina di adsorbimento. Il fluido di alimentazione deve avere solidi sospesi indicativamente compresi tra 0.2 a 1° Bix, La portata di alimentazione à ̈ compresa tra 1 e 4BV/ora e preferibilmente 2 BV/ora. Il corrispondente eluato acquoso viene raccolto e sottoposto ad essiccazione mediante liofilizzazione o disseccamento, Le sostanze adsorbite alla resina sono eluite utilizzando alcol etilico 96%, o metanolo o Acetone, o miscele acquose con i solventi precedentemente riportati, preferibilmente alcol etilico 96%. In quest’ultimo caso, l’eluato alcolico à ̈ sottoposto a disseccamento o a liofilizzazione (dopo aver aggiunto in questo ultimo caso acqua in rapporto 1:1 v/v con l’eluato alcolico ed evaporato l’alcol etilico), utilizzabile per altri scopi.
I sennosidi rimanenti sono trattenuti dalla resina e l’eluato à ̈ raccolto. Si ottiene mediante questo procedimento un estratto comprendente sennosidi totali ad una concentrazione non superiore al 0,5% (titolo riferito al prodotto essiccato, ad esempio per liofilizzazione) e, quando si effettuano entrambi i passaggi d (ultrafiltrazione, e adsorbimento su resina), la concentrazione di sennosidi à ̈ ulteriormente abbassata.
I seguenti esempi riportano i dati sull’estratto impoverito in resine e sennosidi e sull’estratto resinoso impoverito in sennosidi secondo l’invenzione.
Esempio 2
Valutazione della capacità muco adesiva dell’estratto dell’invenzione mediante valutazione della percentuale di inibizione del legame lectinaglicoproteina
La cavità orale di 8-10 donatori maschi e femmine (età 20-35 anni), a digiuno da almeno 60 minuti, à ̈ stata delicatamente raschiata con una spatola di legno e le cellule immerse in TBS (Tris Buffer Saline) 0,05 M pH 7,6. Dopo la conta con Tripan blu 0.5% le cellule sono state diluite con NaCl 0.9% fino ad ottenere una concentrazione finale di 480.000 cellule per ogni campione da utilizzare nella sperimentazione. Le cellule sono state mantenute alla temperatura di 4°C. Le sospensioni cellulari sono state quindi centrifugate a 2000 rpm per 5 minuti ed incubate con 5 ml di una soluzione contenente l’estratto dell’invenzione allo 0,5%. Per il controllo, le sospensioni cellulari sono state invece incubate con 5 ml di NaCl 0.9%. L’incubazione à ̈ stata protratta per 15 minuti alla temperatura di 30 °C, agitando leggermente. Effettuati 3 lavaggi con TBS, le cellule buccali sono state incubate con 5 ml di 10 mg L-1 di Con-A a 30°C per 30 minuti, lavate 3 volte con TBS e quindi incubate a 30°C per 60 minuti con 5 ml di 5 mg L-1 di streptavidinaperossidasi.
Effettuati 3 lavaggi con TBS, 240.000 cellule per campione sono state aggiunte a 2,5 ml di o-fenilenediamina (o-pd) in fosfato citrato 0,05M e H2O2 e, dopo 5 minuti, la reazione à ̈ stata arrestata con H2SO41M.
Si à ̈ proceduto quindi alla lettura, mediante spettrofotometro, dei valori di assorbanza per le singole determinazioni (esperimento eseguito in triplicato). Poiché la composizione possiede una colorazione che potrebbe interferire con l’esatta determinazione del valore di assorbanza che si registra alla fine del protocollo, per la lettura dei campioni à ̈ stato utilizzato come bianco una soluzione di NaCl (0,9%) (per il controllo) oppure la soluzione del prodotto opportunamente diluito con la soluzione di NaCl 0.9%. I singoli campioni sono stati ripetuti 3 volte ed i risultati riportati rappresentano le medie ± SEM di tutti gli esperimenti effettuati.
Campione % mucoadesione % mucoadesione ESTRATTO SENNA OTTENUTO ESTRATTO SENNA RESINE IN D
A 48 31.5
B 50 34
C 53 28.9
Media ± S.D. 50± 2,50 31.5± 2,55
I risultati ottenuti dimostrano che l’estratto saggiato possiede una elevata capacità mucoadesiva nei confronti delle mucose della cavità orale. Alla luce dei risultati ottenuti, à ̈ possibile affermare che la composizione, dimostrando di possedere un’elevata e resistente mucoadesività, possa essere in grado di svolgere un interessante ruolo protettivo nei confronti delle cellule mucosali.
Esempio 3
Valutazione della capacità muco adesiva dell’estratto dell’invenzione su piano inclinato
Le misure sono state effettuate per mezzo di un’apparecchiatura costituita da un piano inclinato a 45°, termostatato a 37°C, al di sotto del quale à ̈ posta una microbilancia che esegue misure ad intervalli regolari di 1 secondo e stampa le misure registrate su carta. Le misure effettuate sono state trascritte e rielaborate su foglio di calcolo Excel.
Il piano inclinato funge da supporto per il substrato biologico, costituito da un film di mucina. Il film di mucina à ̈ stato allestito deponendo, sul piano costituito da plexiglass mantenuto orizzontale, un volume pari a 3ml di una sospensione di mucina gastrica suina alla concentrazione dell’8% (p/p) in tampone fosfato pH 6.4.
La dispersione à ̈ stata portata a secchezza alla temperatura di 44°C in modo da ottenere un film di aerea superficiale nota pari a 33.6 cm<2>. La quantità, la concentrazione e il piano di deposizione sono stati messi a punto in fase di sviluppo del metodo.
Una quantità esattamente pesata dell’estratto dell’invenzione à ̈ stata sciolta in solvente (etanolo 50°, successivamente diluito 1:2 in terreno tipo MEM Eagle con Earle's BSS; concentrazione del campione 10 mg/ml o 1%). L’estratto à ̈ stato deposto nel piano di misurazione con una pipetta multicanale a tempo e velocità costante durante 6 secondi.
La pipetta multicanale à ̈ stata tarata in modo da dosare 250 microlitri di soluzione (o dispersione) sopra il piano di lavoro. La quantità totale misurata ad ogni prova à ̈ di circa 1 ml a campione (il peso di tale volume viene misurato prima della prova e dipende dalla densità del campione in analisi).
Il campione, che andrà a cadere sulla microbilancia, à ̈ caricato sulla parte alta del piano inclinato, contenente il film di mucina, e lasciato scivolare su di esso.
La quantità di campione caduto à ̈ stata misurata registrando la variazione di peso in funzione del tempo.
Il test ha la durata di 40 secondi, tuttavia si mette in evidenza che dopo 20 secondi non si presenta alcuna variazione della pesata.
Sono state condotte anche misure in assenza del film di mucina (misure indicate come bianco) con le stesse quantità di campione e nelle medesime condizioni del test, ma senza lo strato di mucina depositato nel piano.
In tale modo à ̈ possibile valutare le proprietà di scorrimento intrinseche del campione indipendentemente dalla sua capacità di interagire con il substrato biologico.
Si calcola la % adesa: definita come la quantità di campione rimasta adesa al film di mucina o al piano inclinato (senza mucina, bianco) alla fine della misura, normalizzata rispetto alla quantità deposta sul piano inclinato.
Si determina inoltre la differenza percentuale tra quantità di campione adesa al piano con mucina e quantità di campione adesa al piano senza mucina. Il calcolo à ̈ effettuato in accordo con la seguente equazione:
Differenza % = (% adesa mucina - %adesa bianco)/ % adesa del bianco.
Dove:
• %adesa mucina= percentuale di campione rimasta adesa al film di mucina alla fine della misura
• %adesa bianco= percentuale di campione al piano inclinato alla fine delle misure di bianco.
Campioni analizzati:
Le misurazioni sono state eseguite per i seguenti campioni:
• EtOH al 50% in acqua: utilizzato come controllo negativo ovvero come una soluzione priva di muco adesione
• Sodio alginato allo 0.7% in acqua utilizzata come controllo positivo ovvero come una sostanza con note proprietà muco adesive
• Campione di senna: frazioni di senna liofilizzata, solubilizzate in EtOH al 50% in allo 1%.
Risultati
Nei grafici riportati nella figura 3 (pannelli A, B, C, D) sono rappresentati, rispettivamente, i profili di scivolata ottenuti con il controllo negativo (EtOH al 50% in acqua), il controllo positivo (sodio alginato allo 0.7%), il campione in analisi (senna frazione solubile in EtOH al 50% 1%) e il campione in analisi (senna frazione non solubile in EtOH al 50% 1%).
E’ evidente dalle figure, come la quantità scivolata di sostanze mucoadesive in presenza di mucina sia a ciascun tempo decisamente inferiore rispetto a quella caduta nelle misure di bianco, ad indicare l’avvenuta interazione tra la formulazione ed il substrato biologico. Tale differenza si mantiene alla fine della misura.
Le figure dimostrano anche che, nonostante l’eliminazione delle resine (eliminate insieme ad sennosidi totali, l’estratto di senna secondo la presente invenzione mantiene una buona capacità muco adesiva .
Nella tabella sottostante si riportano i parametri di muco adesione misurati come descritto nella parte sperimentale.
à ̈ stata valutata la percentuale di campione adeso al piano inclinato senza mucina e con mucina ed à ̈ stata calcolata la differenza percentuale tra i due valori, per l’estratto ottenuto con il metodo secondo la rivendicazione 1, passaggi a-d, per il sodio alginato, che à ̈ una sostanza con attività mucoadesiva nota, e per il solvente.
Tabella 2 A
DIFFERENZA %
(tra percentuale adesa al piano inclinato con mucina e senza mucina
Estratto dell’invenzione
(% di campione adesa al film di
mucina- % di campione adesa al piano 117%
senza mucina)/ % di campione adesa
al piano senza mucina
SODIO ALG 0.7%,
(% di campione adesa al film di
mucina- % di campione adesa al piano 127%
senza mucina)/ % di campione adesa
al piano senza mucina
Etanolo 50%
(% di campione adesa al film di
mucina- % di campione adesa al piano 23%
senza mucina)/ % di campione adesa
al piano senza mucina
Tabella 2 B
DIFFERENZA %
(tra percentuale adesa al piano inclinato con mucina e senza mucina
Estratto dell’invenzione - RESINE
(% di campione adesa al film di
mucina- % di campione adesa al piano 25%
senza mucina)/ % di campione adesa
al piano senza mucina
SODIO ALG 0.7%,
(% di campione adesa al film di
mucina- % di campione adesa al piano 127%
senza mucina)/ % di campione adesa
al piano senza mucina
Etanolo 50%
(% di campione adesa al film di 23%
mucina- % di campione adesa al piano
senza mucina)/ % di campione adesa
al piano senza mucina
Anche in questo caso, i risultati mostrano in modo evidente come l’estratto oggetto
dell’invenzione ha proprietà mucoadesive e di scorrimento simili a quelle di una nota
sostanza muco adesiva come il sodio alginato.
Esempio 4.
Test effetto barriera
(Per il test effetto barriera sono state utilizzate due camere fisicamente separate
da una membrana semipermeabile (pori di 0.4µm). Nella camera inferiore sono state
seminate cellule di fibroblasti umani mentre nella camera superiore à ̈ stato inserito
l’agente infiammatorio l’LPS (Lipo polisaccaride purificato di E. Coli); sulla membrana semipermeabile che separa le due camere à ̈ stato stratificato un sottile film di estratto di senna come descritto nella presente invenzione.
La reazione infiammatoria indotta à ̈ stimata attraverso il dosaggio semiquantitativo della citochina Interleuchina 6 (IL6) rilasciate nel terreno di coltura della camera inferiore: La valutazione dell’effetto barriera à ̈ stato ricavato per confronto con il controllo positivo in cui le due camere sono separate dallo stesso tipo di membrana semipermeabile priva però di qualsiasi barriera.)
Per quanto riguarda il valore soglia sopra il quale si può dire che una sostanza provoca un effetto barriera nel test qui riportato à ̈ stato identificato dagli inventori, durante la messa a punto del test, un valore pari al 15% di inibizione rispetto al controllo sulla base di test effettuati su sostanze note per avere un effetto barriera.
E’ stato quindi valutato l’effetto barriera dell’estratto come qui descritto.
I dati sotto riportati dimostrano come l’estratto presenti un notevole effetto barriera.
Il test per la valutazione à ̈ stato realizzato come segue mediante un metodo sviluppato per simulare In Vitro l’azione protettiva di sostanze e formulazioni che, applicate su cute e mucose In Vivo, formano un film “isolante†nei confronti degli agenti ambientali.
Il modello sfrutta il principio per cui cellule sottoposte al contatto con un agente infiammatorio producono e secernono mediatori pro-infiammatori (citochine) nell’ambiente extracellulare in quantità correlata al grado di infiammazione provocato. Tanto maggiore à ̈ l’agente infiammatorio che raggiunge le cellule e tanto maggiore à ̈ la quantità di citochine rilasciate.
Il modello prevede l’allestimento di due camere fisicamente separate da una membrana semipermeabile che consente il passaggio di soluti sufficientemente piccoli.
Nella camera inferiore, costituita da un pozzetto contenente piastre per colture cellulari, sono coltivate le cellule HuDe (numero BS PRC 41 Acquistate dall’Istituto Zooprofilattico di Brescia)mentre nella camera superiore, costituita da un inserto per colture cellulari complesse (trans-wells), ospita l’agente infiammatorio.
Sulla superficie della membrana semipermeabile dell’inserto che separa le due camere, prima dell’immissione dell’agente infiammatorio nella camera superiore, viene stratificato un sottile film del campione in analisi per valutarne l’eventuale EB al libero passaggio dell’agente infiammatorio.
In funzione delle capacità isolanti del campione, si avrà una diminuzione della migrazione dell’agente infiammatorio dalla camera superiore e, di conseguenza, una minore stimolazione delle cellule alla produzione di citochine. L’entità della reazione infiammatoria à ̈ stimata attraverso il dosaggio semiquantitativo delle citochine rilasciate nel terreno di coltura della camera inferiore, in particolare dell’ interleuchina 6 (IL-6).
Come controllo si utilizza un analogo esperimento in cui non si stratifica alcun campione sulla membrana, permettendo quindi di misurare l’effetto dell’agente infiammatorio senza alcuna barriera oltre la membrana semipermeabile.
Inoltre, si utilizza un controllo interno in cui le cellule in coltura sono pretrattate con la sostanza atta a indurre il rilascio del marcatore e il campione à ̈ collocato sulla membrana semipermeabile in assenza di detta sostanza, si effettuano quindi una o più misure nel tempo della quantità di marcatore nel terreno di coltura di detto controllo interno. Nel controllo interno quindi vengono prima stimolate le cellule con la sostanza induttrice e poi si va a verificare se il campione che eventualmente attraversa la membrana e passa nelle cellule spinto dal terreno soprastante ha un qualche effetto di riduzione del rilascio del marcatore non legato all’effetto barriera. Ad esempio quando à ̈ usato come sostanza induttrice un agente infiammatorio il controllo interno permette di capire se la diminuzione della concentrazione di citochine nel terreno di coltura à ̈ dovuto all’effetto barriera o se il campione che eventualmente passa nelle cellule spinto dal terreno sovrastante ha un qualche effetto di riduzione della risposta infiammatoria indipendentemente dall’effetto barriera.
L’effetto barriera (EB) à ̈ espresso come percentuale di riduzione del rilascio delle IL-6 e si ricava mediante confronto con il controllo positivo in cui le due camere sono separate dallo stesso tipo di membrana semipermeabile senza la barriera creata dal campione.
4.1 PREPARAZIONE DELLA COLTURA CELLULARE:
Per ciascun campione saggiato, cellule della linea HuDe sono state seminate nei pozzetti di una piastra per colture cellulari, una per il Test Barriera (T.B.) e un’altra per il controllo interno alla densità di 40.000 cellule /ml in terreno MEM completato con il 10% di siero bovino (FBS); 1 ml di sospensione cellulare per pozzetto.
Si trattano le cellule con il CAMPIONE CAM, con il CONTROLLO POSITIVO (C+) (agente infiammatorio senza campione), e con il CONTROLLO NEGATIVO (C-) (solo terreno). e si effettua ciascuna prova in triplicato.
Le piastre sono incubate a 37 °C overnight (22-24 ore).
4.2 PREPARAZIONE DEGLI INSERTI PER COLTURE CELLULARI COMPLESSE Su altre piastre si posizionano inserti per colture cellulari complesse Cell Culture Inserts (Becton Dickinson) e si dispensano su ciascuno una quantità fissa di collagene 0,1mg/ml. Le piastre sono incubate a 37 °C overnight (22-24 ore).
GIORNO2
4.3 VERIFICA STATO E LIVELLO DI CONFLUENZA DELLE CELLULE
Per poter procedere all’esperimento à ̈ necessaria una confluenza non inferiore al 95% 4.4 ESSICCAMENTO STRATO DI COLLAGENE
Dalle due piastre (T.B e C.I.) con gli inserti viene rimosso il collagene e gli inserti sono lasciati sotto il flusso della cappa il tempo necessario a farli asciugare completamente (10÷15 minuti)
4.5 TEST BARRIERA (T.B.)
I passaggi di seguito descritti sono effettuati nella piastra di coltura per il TB
Allestimento dello strato di campione nel T.B.:
Sulla membrana semipermeabile del campione sono stati inoculati 100µl di una composizione a base di alginato 0,5% e lasciati a stratificare per 20 minuti mentre negli inserti dei C+ e C – non viene aggiunto niente. Trascorsi i 20 minuti si elimina il campione in eccesso e si effettua un lavaggio delle membrane con PBS secondo modalità specificate dal protocollo
Aggiunta dell’LPS (agente infiammatorio) agli inserti del TB
Una volta asciutti lo strato di campione, nei primi tre inserti del CAM e nei tre del C+, vengono inoculati 300µl della soluzione di LPS (lipopolisaccaride di membrana) alla concentrazione di 1µg/ml mentre nei rimanenti tre del C- vengono aggiunti 300 µl di terreno MEM al 5% di FBS. Gli inserti vengono inseriti nei rispettivi pozzetti con le cellule e le piastre messe ad incubare per 1h a 37 °C e atmosfera arricchita al 5% di CO2overnight (22-24 ore).
Trascorsa l’ora di incubazione gli inserti vengono tolti e gettati e le piastre rimesse ad incubare overnight (22-24 ore).
4.6 TEST CONTROLLO INTERNO (C.I.):
Il test di controllo interno à ̈ effettuato contemporaneamente al TB
Esposizione cellule del C.I. all’LPS:
Una volta asciutti, nei primi sei inserti del C.I., tre per il campione da analizzare CAM e tre per il C+, vengono inoculati 300µl della soluzione di LPS mentre nei restanti tre del C- vengono aggiunti 300 µl di terreno
Gli inserti con l’LPS e il MEM vengono quindi inseriti nei pozzetti con le cellule del C.I. e il tutto riposto ad incubare per 1h.
Rimozione LPS e asciugatura membrane del C.I.:
Trascorsa 1 ora di incubazione, gli inserti vengono rimossi dai pozzetti con le cellule e trasferiti nella piastra vuota mentre la piastra con le cellule riposta in incubatore.
La soluzione di LPS ancora presente viene rimossa dagli inserti, questi vengono sottoposti ad un rapido lavaggio con acqua ultra-pura sterile e lasciati ad asciugare
Allestimento strato di campione nel C.I.:
Sulla membrana semipermeabile dei tre inserti per il campione sono stati inoculati 100µl di una composizione a base di alginato 0,5% e lasciati a stratificare per 20 minuti mentre negli inserti dei C+ e C – non viene aggiunto niente. Trascorsi i 20 minuti si elimina il campione in eccesso e si effettua un lavaggio delle membrane con PBS secondo modalità specificate dal protocollo.
Aggiunta dell’LPS agli inserti del C.I.
Una volta pronti gli inserti con il campione, in tutti gli inserti ( CAM , C+ C-) vengono aggiunti 300 µl di terreno. Gli inserti vengono inseriti nei rispettivi pozzetti con le cellule e le piastre messe ad incubare per 1h a 37 °C.
Trascorsa l’ora di incubazione, gli inserti vengono tolti e gettati e le piastre rimesse ad incubare overnight (22-24 ore).
GIORNO3
4.7PRELIEVO DEI SURNATANTI E IMMUNOENZIMATICA
Trascorse le 22-24h si prelevano i surnatanti dalle piastre del T.B. e del C.I. per l'esecuzione del test ELISA e dosaggio semi quantitativo delle IL-6.
VALUTAZIONE EFFETTO BARRIERA (EB)
L’ EB di una sostanza o composto à ̈ espresso come % di riduzione del rilascio della citochina IL-6 da parte delle cellule esposte all’LPS in cui à ̈ stato testato il campione rispetto al controllo positivo (C+) in cui le cellule sono state esposte soltanto all’LPS.
EB = % di riduzione rilascio citochina IL-6 = 100 - [ (pg/µL citochina rilasciate dal campione / pg/µL citochina rilasciate dal C ) x 100]
La tabella 1 sotto riportata mostra che l’estratto di senna ottenuto secondo la presente invenzione crea una barriera al passaggio di LPS.
CAMPIONE % INIBIZIONE IL-6
Controllo interno 0
SENNA, ESTRATTO IMPOVERITO IN RESINE E 47
SENNOSIDISECONDO LA PRESENTE INVENZIONE
SENNA, ESTRATTO RESINOSO IMPOVERITO IN 60
SENNOSIDI SECONDO LA PRESENTE INVENZIONE
Come si può vedere dai risultati sopra, l’estratto impoverito in sennosidi e resine presenta ottime proprietà mucoadesive ed un elevato effetto barriera, l’estratto resinoso impoverito in sennosidi, pur avendo, sorprendentemente, ridotte proprietà mucoadesive, ha un effetto barriera molto elevato.
Appare quindi evidente che entrambi gli estratti sono idonei agli utilizzi descritti e rivendicati così come miscele dei due permettono di aumentare l’effetto barriera mantenendo elevate proprietà mucoadesive.

Claims (1)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Estratto di senna impoverito in totali sennosidi totali, in cui detti sennosidi totali hanno una concentrazione percentuale in peso ≤0,5% 2. Estratto secondo la rivendicazione 1per uso nella protezione della cute o delle mucose. 3. Estratto secondo le rivendicazioni 1 o 2 in cui dette mucose sono la mucosa orale, la mucosa gastrica, la mucosa intestinale, la mucosa nasale, la mucosa vaginale, la mucosa uterina, la mucosa rettale. 4. Estratto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 ulteriormente impoverito in resine. 5. Procedimento per la preparazione di un estratto di senna comprendente i seguenti passaggi: a. si prepara un estratto idroalcolico di foglie e/o baccelli senna b. si ottengono dall’estratto preparato in a. un estratto alcolico chiarificato ed un estratto resinoso c. si concentra, mediante decantazione e/o centrifugazione e/o filtrazione detto estratto alcolico raccogliendo il filtrato o il sovranatante d. detto sovranatante o filtrato à ̈ sottoposto ad un ulteriore passaggio di impoverimento in sennosidi totali 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5 in cui l’estratto resinoso ottenuto in b. e l’estratto impoverito in sennosidi ottenuto in d. sono miscelati. 7. Procedimento secondo la rivendicazione 5 o 6 in cui nel passaggio d il sovranatante o filtrato ottenuto in c. à ̈ sottoposto ad uno o più passaggi di ultrafiltrazione raccogliendo il permeato in cui detto permeato comprende sennosidi totali ad una concentrazione percentuale in peso ≤0,5% . 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7 in cui detto uno o più passaggi di ultrafiltrazione à ̈ effettuato su membrana semipermeabile avente un cutoff di circa 500-15,000 dalton. 9. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 8 in cui nel passaggio d. il filtrato o il sovranatante ottenuto al punto c. o il permeato ottenuto dopo ultrafiltrazione à ̈ sottoposto ad uno o più passaggi su resina adsorbente ad alta porosità ed à ̈ raccolto l’eluato in cui detto eluato così ottenuto comprende sennosidi totali ad una concentrazione percentuale in peso ≤0,5. 10. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 9 in cui detto estratto idroalcolico al punto a. à ̈ preparato sottoponendo foglie e/o baccelli senna, opzionalmente frammentate, a due o più passaggi di estrazione in etanolo a concentrazione decrescente. 11. Procedimento secondo la rivendicazione 10 in cui detta concentrazione decrescente di etanolo al punto a. passa da etanolo a circa 96% ad etanolo a circa 0%. 12. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 o 11 in cui detti due o più passaggi in a. comprendono un passaggio con etanolo a circa l’85%, un passaggio con etanolo a circa il 50%, e un passaggio in etanolo a circa il 20%. 13. Procedimento secondo la rivendicazione 12 ulteriormente comprendente un passaggio in etanolo a circa il 5%. 14. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 5 a 13 in cui detta filtrazione al punto c. à ̈ realizzata con un filtro avente una porosità di circa 25 micrometri. 15. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5, 6,9-13 in cui detto passaggio su resina à ̈ effettuato su una resina adsorbente ad alta porosità di stirene e copolimero DVB. 16. Procedimento per la preparazione di un estratto di senna privo di sennosidi totali comprendente i seguenti passaggi: a. si prepara un estratto idroalcolico di foglie e/o baccelli (follicoli) senna b. si ottengono dall’estratto preparato in a. un estratto alcolico chiarificato ed un estratto resinoso precipitato e si raccoglie detto estratto resinoso. 17. Composizione comprendente l’estratto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4. 18. Composizione secondo la rivendicazione 17 per uso nella protezione della cute o delle mucose. 19. Composizione secondo la rivendicazione 18 in cui dette mucose sono la mucosa orale, la mucosa gastrica, la mucosa intestinale, la mucosa nasale, la mucosa vaginale, la mucosa uterina, la mucosa rettale. 20. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 17 a 19 ulteriormente comprendente sostanze di origine naturale e/o vegetale aventi proprietà emollienti, digestive, pro cinetiche, colagoghe, carminative, prebiotiche, rilassanti, eccipienti, conservanti, umidificanti. 21. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 17 a 21 in forma di capsula, compressa, pasticca, granulato, polvere, sciroppo, elisir, gelatina dura, gelatina morbida, sospensione, emulsione, soluzione, supposta, crema, gel, spray, unguento, pomata, pasta, emulsione olio in acqua, emulsione acqua in olio, emulsione olio in gel , emulsione gel in olio. 22. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 17 a 21 in cui detta composizione à ̈ una composizione farmaceutica, à ̈ compresa in o consiste in un dispositivo medico, o à ̈ compresa in un alimento a fini medici speciali. 23. Dispositivo medico, farmaco, integratore alimentare o alimento a fini medici speciali comprendente una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 17 a 21. 24. Metodo per la preparazione di una composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 17 a 23in cui un estratto di senna impoverito in sennosidi totali in cui detti sennosidi totali hanno una concentrazione percentuale in peso ≤0,5% , à ̈ miscelato con almeno uno tra eccipienti e/o sostanze di origine naturale e/o vegetale aventi proprietà emollienti, digestive, pro cinetiche, colagoghe, carminative, prebiotiche, rilassanti, eccipienti, conservanti, umidificanti.
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