ITMI980775A1 - Ceppi di lattobacilli capaci di inibire e/o avere azione microbicida nei confronti di microorganismi patogeni e metodo di induzione e - Google Patents
Ceppi di lattobacilli capaci di inibire e/o avere azione microbicida nei confronti di microorganismi patogeni e metodo di induzione eInfo
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "CEPPI DI LATTOBACILLI CAPACI DI INIBIRE E/O AVERE AZIONE MICROBICIDA NEI CONFRONTI DI MICROORGANISMI PATOGENI E METODO DI INDUZIONE E MANTENIMENTO DI TALE ATTIVITÀ' IN COLTURE DI LATTOBACILLI"
La presente invenzione fornisce lattobacilli capaci di inibire la crescita e/o di esplicare un'attività microbicida nei confronti di microorganismi patogeni (più in particolare 2 nuovi ceppi di Lactobacillus gasseri ed 1 ceppo di Lactobacillus crispatus)e un metodo di induzione e/o accrescimento e/o mantenimento di tale attività in colture di lattobacilli.
L'invenzione ha inoltre per oggetto un terreno di coltura per lattobacilli impiegabile in associazione a detto metodo di induzione.
STATO DELLA TECNICA
I batteri lattici sono molto diffusi in natura. Molte specie si ritrovano in prodotti alimentari (latte,yogurt, frutta,verdura e molti altri ancora), mentre solo alcuni ceppi sono abituali saprofiti eubiotici della flora intestinale e/o urogenitale.
In generale i lattobacilli noti somministrati per via orale o vaginale o per altra via, agiscono come ripristinanti della flora batterica naturale, ma non sono di per sé in grado di inibire la crescita di patogeni o di svolgere attività microbicida nei loro confronti.
E' noto che solo alcuni ceppi batterici hanno sviluppato questa capacità naturale di inibire la crescita di microorganismi patogeni quando posti nella stessa coltura.
Infatti il brevetto EP 0 353 581 riporta che un ceppo di Lactobacillus fermentimi, depositato al CNCM dell'Institute Pasteur, isolato da vagina umana, è in grado di contrastare in vitro la crescita di Candida albicans.
Inoltre, si è visto che anche qualche altro lattobacillo, in particolare un ceppo di Lactobacillus paracasei, isolato da intestino umano (Dom. di Brev. Ν° MI97A 000426 depositata il 27 febbraio 1997), oltre ad avere le particolari prerogative citate nella domanda di brevetto suddetta, provoca, in vitro, un alone di inibizione se seminato e fatto crescere in una piastra Petri agarizzata, in cui sia stata fatta crescere concomitantemente Candida albicans.
Nel complesso tali evidenze quindi indicano che l'attività verso i patogeni di lattobacilli, isolati da vari habitat umani, può essere ritrovata in natura.
E1 noto inoltre che l'attività antimicrobica dei lattobacilli è legata alla capacità di alcuni lattobacilli di produrre fisiologicamente batteriocine e/o altre sostanze simili e che la produzione di batteriocine a volte è correlata alla presenza di plasmidi.
E' noto inoltre che la stabilizzazione di un carattere fenotipico di rilevanza industriale in lattobacilli, mediante l'aggiunta di particolari sostanze, è stata descritta in GB 1560208 dove si induceva nei lattobacilli la capacità di produrre acido lattico.
Si è visto che, solo alcuni lattobacilli, isolati da habitat fisiologici umani, se seminati in piastre Petri contenenti terreno agarizzato, in cui preventivamente sono stati seminati e fatti crescere dei patogeni,esplicano azione inibente,o microbicida nei loro confronti Queste proprietà sono legate alla capacità,di alcuni lattobacilli, di produrre fisiologicamente batteriocine e/o altre sostanze simili a queste, ma non solo, ad azione battericida o microbicida. Tuttavia, affinché ceppi batterici con questi requisiti siano impiegati efficacemente in terapia, devono essere in grado di mantenere e/o aumentare nel tempo tali proprietà. E' inoltre desiderabile indurre l'attività di inibizione di patogeni in ceppi di lattobacilli che non siano in grado di per sé di esplicare tale attività.
La capacità di produzione di batteriocine e/o altre sostanze assimilabili a queste, ma non solo, da parte dei lattobacilli, è influenzata da diversi fattori tecnici quali ad esempio la conposizione del terreno colturale e le condizioni di incubazione (Temperatura, pH, Ossigeno).
Inoltre la rilevazione della produzione di sostanze anti-microbiche è generalmente effettuata in condizioni di laboratorio che sono molto diverse da quelle originali e che presuppongono la costitutività dell'espressione delle determinanti genetiche specifiche. Geni di tipo inducibile sono difficilmente rilevati dagli usuali tests di laboratorio.
DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE.
Si è ora trovato un procedimento che permette di ottenere ceppi di lattobacilli dotati di attività microbicida, utili per il trattamento terapeutico e/o profilattico di patologie del sistema gastrointestinale e/o urogenitale nell'uomo.
Tale metodo permette di mantenere o aumentare le capacità di produzione di sostanze anti-microbiche in quei ceppi di lattobacilli che già manifestano queste proprietà, e permette addirittura di indurre tali capacità in quei lattobacilli che,pur avendone la possibilità,non sono in grado di esplicarla
Preferibilmente, i ceppi di lattobacilli da sottoporre a questo trattamento provengono dalla normale flora batterica intestinale e/o vaginale di un soggetto umano sano, e sono tipicamente ottenuti da campioni biologici contenenti una molteplicità di specie batteriche, isolate mediante tecniche convenzionali.
Prima di essere sottoposti al procedimento secondo la presente invenzione, tali campioni sono in genere sottoposti ad opportuni pretrattamenti secondo metodi convenzionali che permettono la conservazione dei ceppi fino al momento dell'utilizzo.
E' oggetto della presente invenzione il metodo qui sotto riportato che permette di stimolare nelle colture, preparate nei modi convenzionali sopra descritti, la produzione di particolari sostanze anti-microbiche.
I ceppi di lattobacilli da trattare devono essere messi a contatto con il ceppo patogeno verso cui si vuole sviluppare l'azione antimicrobica, o con il suo supernatante (dove per supematante si intende il liquido, sterilizzato e conservato in frigorifero o freezer fino al momento dell'uso, ottenuto per separazione dal deposito cellulare mediante centrifugazione della coltura di un patogeno; coltura che si è ottenuta facendo crescere un ceppo dell'opportuno patogeno in un opportuno terreno colturale e nelle opportune condizioni di crescita).
Alternativamente è possibile aggiungere anche al terreno di coltura per lattobacilli cellule di microorganismi patogeni inattivate con trattamenti chimici o fisici.
Si procede quindi alla semina dei lattobacilli e del ceppo patogeno o del suo supematante e si fanno crescere in contemporanea nel medium di coltura opportuno. Questo passaggio di incubazione dei ceppi viene tipicamente effettuato su piastra, in un terreno nutriente addizionato di agar,preferibilmente su un terreno MRS agarizzato.
I ceppi di lattobacilli così ottenuti vengono poi centrifugati e risospesi in un mezzo contenente dei particolari additivi, quindi congelati in modo da assicurare il mantenimento della vitalità del ceppo.
Costituiscono inoltre oggetto della presente invenzione i ceppi di lattobacilli e le colture batteriche ottenute attraverso il presente procedimento, i preparati o formulazioni contenenti i presenti lattobacilli in associazione ad un veicolo farmaceuticamente o comunque fisiologicamente accettabile, quali composizioni farmaceutiche,Prodotti dietetici,Presidi Medico Chirurgici,diagnostici.
Il presente procedimento consente di ottenere ceppi di lattobacilli dotati della capacità di inibire e/o esplicare azione microbicida nei confronti di diversi patogeni, idonei ad essere formulati cane preparazioni farmaceutiche, che si sono rivelati estremamente efficaci e vantaggiosi nel trattamento di patologie legate alla presenza di agenti patogeni rivelatesi sensibili ad alcuni ceppi di lattobacilli.
Secondo una forma di realizzazione particolare della presente invenzione, i ceppi batterici da sottoporre al presente procedimento provengono dalla normale flora saprofita di soggetti sani.
Per indurre i lattobacilli a produrre sostanze antimicrobiche, si devono mettere in contatto le colture batteriche con colture di ceppi patogeni quali ad esempio Candida sp., Proteus sp., Escherichia coli, Trichomonas vaginalis, Streptcoccus β-emolitico, Enterococcus sp, o con il loro supernatante.
Per supernatante si intende il terreno colturale (ad esempio brodo LB per Escherichia coli, oppure Malt Broth per Candida sp.) in cui si è fatta sviluppare una coltura del ceppo patogeno nelle opportune condizioni di crescita (ad esempio 18 ore in condizioni aerobiche e 37°C per Escherichia coli, e 24 ore in condizioni aerobiche e 30°C per Candida). Alla fine del periodo di.sviluppo sopra descritto si centrifuga la coltura, prelevando il liquido separato dal deposito cellulare.Questo liquido viene quindi sterilizzato (ad esempio mediante : filtrazione su filtri di cellulosa con porosità non superiore a 0,45 micron)e conservato in frigorifero o freezer fino al momento dell'uso.
In alternativa all'aggiunta di colture di patogeni o di supernatante si possono addizionare al terreno di coltura dei lattobacilli anche cellule di microorganismi patogeni inattivate con trattamenti chimici (cloroformio, formalina) o fisici (calore o radiazioni)
Secondo una forma di realizzazione tipica della presente invenzione, il ceppo di lattobacilli che si vuole trattare viene fatto crescere, contemporaneamente al ceppo di patogeno, in un terreno per lattobacilli, preferibilmente terreno MRS (de Man J. C., Rogosa, M. e M.E.Sharpe, Journal of Applied Bacteriology, 23, 130-135, 1960) la cui conposizione è riportata nella successiva tabella
Successivamente, i ceppi inoculati nelle provette contenenti il terreno MRS sopra descritto, vengono incubati in termostato a 37 “C, in condizioni di anaerobiosi.
I ceppi di lattobacilli vengono fatti crescere in queste condizioni ottimali di sviluppo per 24 ore in MRS liquido, quindi vengono centrifugati e risospesi, preferibilmente in 0,5 mi di MRS liquido, contenente una concentrazione variabile di glicerolo, preferibilmente compresa tra il 20 ed il 50%. Questa procedura serve ad assicurare il mantenimento della vitalità del ceppo trattato.
Prove sperimentali dimostrano come 1'aggiunta di liquido supematante in ragione di (0,01% fino a 5,00% V/V) o del ceppo di patogeno al terreno di coltura dei lattobacilli induca una maggiore produzione delle sostanze inibenti.
I seguenti esempi illustrano ulteriormente l'invenzione.
ESEMPIO 1
Un ceppo selezionato liofilizzato di lattobacilli con carica di circa 10<10 >UFC/g viene prelevato nella misura di circa 100 mg, fatto crescere a 37 "C per una notte in 10 mi di MRS brodo. 100 μl della predetta sospensione vengono quindi posti in 9,9 mi di MRS brodo ed incubati per 5 h a 37*C.
Lo stesso ceppo di lattobacilli viene precedentemente trattato, secondo la metodica oggetto della presente invenzione, facendolo crescere in presenza del supernatante di Candida.
Un campione di patogeno (Candida), viene preparato da coltura su becco di clarino facendolo crescere per una notte a 37 “C in circa 50 mi di Sabouraud.
Su piastre Petri agarizzate viene seminato 1 mi di Candida albicane (IMcF) e fatto essiccare. In ogni piastra vengono poi seminati circa 30 μΐ dei diversi campioni di lattobacilli.La piastra viene incubata a 37 “C per 24 h in anaerobiosi e per 24 h in aerobiosi.
Si notano aloni di inibizione nei punti in cui è stato seminato <'>il campione di lattobacilli non trattato, ma si nota anche un aumento di tali aloni, nelle piastre in cui è stato seminato il campione di lattobacilli trattato secondo la metodica oggetto del presente brevetto.
ESEMPIO 2
Per l'esecuzione di un saggio destinato a valutare l'attività specifica verso Streptococcus iβ-emolitico di un ceppo selezionato di lattobacilli, si è utilizzato il terreno Bacto-Lattobacillo-MRS-Broth {Difco codice 0881)reso solido mediante l'aggiunta del 2% di agar.Tale terreno, dopo sterilizzazione in autoclave, è stato distribuito in capsule Petri in ragione di 20 mi per piastra e lasciato solidificare.
L'inoculo per ogni saggio è stato preparato allestendo opportune diluizioni di una sospensione di torbidità 1 McF del ceppo da saggiare.
Una quantità di 0,1 mi della sospensione dell'inoculo è stata spatolata uniformemente sulla superficie del terreno MRS agarizzato distribuito come sopra; successivamente sulla stessa superficie è stato praticato uno striscio di ciascun ceppo di lattobacilli da valutare; infine le piastre così predisposte sono state incubate alla temperatura di 37 "C per 48 ore prima della lettura dei risultati.
L'attività antagonista è stata considerata solo in presenza di un chiaro alone di inibizione nella crescita del ceppo di Streptococcus attorno allo striscio del Lactobacillus indagato.
I risultati ottenuti hanno permesso di osservare che 1'attività antagonista presentata dal ceppo di riferimento risultava nettamente inferiore rispetto a quella dello stesso ceppo trattato preventivamente secondo la metodica oggetto di questo brevetto.
Si sono così trovati ceppi di lattobacilli, ed in particolare 2 ceppi di Lactobacillus gasseri ed 1 ceppo di Lactobacillus crispatus che fisiologicamente già presentano attività di inibizione nei confronti di agenti patogeni quali ad esempio Candida albicane e Streptococcus βemolitico.
Tali ceppi costituiscono un secondo oggetto dell'invenzione e sono stati depositati ai sensi del trattato di Budapest presso la Belgian Coordinated Collection of Microorganisms - BCCM LMG Collection ai seguenti numeri di accesso:
L. gasseri, isolato da intestino umano:LMG-P-17632 del 29.11.1996 L. gasseri,isolato da vagina umana:LMG-P-18137 del 26.09.1997 L. crispatus, isolato da vagina umana:LMG-P-17631 del 29.11.1996 La caratteristica tassonomica è stata effettuata utilizzando metodi convenzionali quali le prove di fermentazione di carboidrati (API 50 , Biomerieux), l'analisi della morfologia cellulare, le reazioni di Gram, ossidasi e catalasi, l'analisi all<'>SDS-PAGE e la "Cluster analisi".
Si riportano qui di seguito alcune caratteristiche dei ceppi dell'invenzione.
Lactobacillus casseri F-18137
- Morfologia cellulare: bastoncini singoli, coppie, catene, immobili, asporigeni
- Colorazione Gram: positiva
Il ceppo di L. gasseri P-18137, vaginale è risultato attivo nell'inibire la crescita di ceppi di Streptococcus β-eroolitico di gruppo B di isolamento clinico in modo statisticamente significativo con marcati aloni di inibizione compresi fra 2 e 10 mm su terreno Bacto-Lactobacillo MRS-Broth (DIFCO 0881 = al 2% di agar).
Il ceppo di L. gasseri P-17632, intestinale, è invece risultato attivo nell'inibire la crescita di ceppi di Candida DSM 70163 e 2361, in terreno MRS con aloni di inibizione variabili da 2 a 8 mm.
Il ceppo di L. crispatus P-17631 vaginale si è dimostrato attivo nell'inibire la crescita di ceppi di Candida in terreno MRS con aloni di inibizione variabili.
I risultati ottenuti in vitro possono essere riprodotti in vivo somministrando colture liofilizzate dei suddetti lattobacilli,'ottenuti secondo il metodo oggetto del presente brevetto, come tali o adeguatamente inseriti in formulazioni farmaceutiche, dietetiche o alimentari.
Dipendentemente dall'habitat di isolamento i vari ceppi possono essere eventualmente inglobati in formulazioni destinate all'habitat stesso, ma non solo.
I lattobacilli, secondo la presente invenzione, possono essere somministrati come tali, oppure aggiunti ad un veicolo farmaceuticamente o comunque fisiologicamente accettabile, ottenendo vari tipi di preparati o formulazioni, quali composizioni farmaceutiche, integratori dietetici o prodotti alimentari, che costituiscono ulteriori oggetti della presente invenzione.
Così, ad esempio, i ceppi vaginali rivendicati possono essere somministrati anche, ma non solo, in formulazioni ginecologiche (es. capsule vaginali,conpresse vaginali, lavande etc.).
I presenti preparati o formulazioni contengono almeno un ceppò di lattobacilli secondo la presente invenzione, preferibilmente miscele di almeno un ceppo di lattobacilli dell'invenzione, in particolare in quantità efficace per il trattamento terapeutico, profilattico o probiotico che si vuole effettuare, e possono essere ad esempio preparati secondo tecniche convenzionali.
II veicolo può contenere eccipienti, additivi, diluenti o altre sostanze utili, purché farmacologicamente o fisiologicamente accettabili.
I ceppi di lattobacilli rivendicati, se somministrati nelle suddette formulazioni, si dimostrano utili nel trattamento locale delle patologie derivanti dalla proliferazione abnorme dei patogeni rivelatisi sensibili ai ceppi stessi.
Claims (9)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo di trattamento di colture di lattobacilli caratterizzato dal fatto che alle stesse viene aggiunta una certa quantità di microorganismo patogeno, un'aliquota di supernatante di coltura di microorganismi patogeni, o gli stessi microorganismi patogeni opportunamente inattivati.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta aliquota di supernatante viene aggiunta in quantità compresa tra 0,01% e 5,00% in volume rispetto al terreno di coltura dei lattobacilli.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detti germi patogeni sono scelti dal gruppo conprendente Candida, Streptococco β-emolitico,Proteus,Escherichia,Tricomonas.
- 4. Colture di lattobacilli trattati con il metodo delle rivendicazioni 1-3.
- 5. Terreno di coltura per lattobacilli addizionato di un'aliquota di supernatante di coltura di microorganismi patogeni verso i quali si desidera indurre nei lattobacilli attività di inibizione.
- 6. Lactobacillus gasseri LMG-P-17632.
- 7. Lactobacillus gasseri LMG-P-18137.
- 8. Lactobacillus crispatus LMG-P-17631.
- 9. Conposizioni farmaceutiche o dietetiche contenenti un ceppo delle rivendicazioni 6-8 in miscela con opportuni eccipienti.
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