ITMI941209A1 - Mutanti stabili dell'isoamilasi - Google Patents
Mutanti stabili dell'isoamilasi Download PDFInfo
- Publication number
- ITMI941209A1 ITMI941209A1 IT001209A ITMI941209A ITMI941209A1 IT MI941209 A1 ITMI941209 A1 IT MI941209A1 IT 001209 A IT001209 A IT 001209A IT MI941209 A ITMI941209 A IT MI941209A IT MI941209 A1 ITMI941209 A1 IT MI941209A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- isoamylase
- mutant
- plasmid
- bacillus
- nucleotide sequence
- Prior art date
Links
- 108010028688 Isoamylase Proteins 0.000 title claims description 66
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 64
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 56
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 20
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 19
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N L-Serine Natural products OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 11
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Natural products C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-Valine Natural products CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical class N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 claims description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical class [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 229910052500 inorganic mineral Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims 3
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 claims 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 55
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 50
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 16
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 8
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 3
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 3
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 2
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 235000015173 baked goods and baking mixes Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000589588 Myroides odoratus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241001453300 Pseudomonas amyloderamosa Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N sulfanyloxyethane Chemical compound CCOS FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Descrizione
La presente invenzione riguarda mutanti stabili dell'isoamilasi, mezzi e metodi per la loro preparazione e loro impiego nel settore alimentare.
In generale i fattori che limitano l'uso industriale di un enzima sono dovuti non solo ai possibili elevati costi di produzione e purificazione, ma anche al fatto che le caratteristiche degli enzimi presenti in natura (wild type), caratteristiche quali stabilità all'ossidazione, alla temperatura, al pH e simili, non sono necessariamente ottimizzate per la loro utilizzazione in un ambiente diverso da quello originale. Può essere quindi desiderabile alterare una o più caratteristiche naturali dell'enzima per uno specifico impiego o per un uso in uno specifico ambiente.
L'isoamilasi (glicogeno 6-glucano idrolasi) è un enzima che idrolizza i legami α-1,6 glucosidici dell'amilopectina, del glicogeno, delle destrine e degli oligo e polisaccaridi posizionati nei punti di ramificazione.
L'isoamilasi trova una utilizzazione nel settore alimentare nella produzione di prodotti da forno, in birrificazione e, soprattutto, nella preparazione di glucosio, maltosio ed altri dolcificanti a partire dall'amido, una miscela di polimeri del D(+) glucosio in forma lineare (amilosio) e ramificata (amilopectina, glicogeno).
Generalmente l'isoamilasi viene impiegata in combinazione con altre amilasi (a e &) che catalizzano l'idrolisi dei legami α-1,4-glucosidici dell'amilosio.
La bassa solubilità dell'amido e la necessità di evitare le contaminazioni microbiche, rende necessario che il processo di idrolisi enzimatica venga effettuato a temperature più elevate possibili. Di qui l'esigenza di disporre di enzimi termostabili.
Mentre sono state descritte amilasi (a e β) stabili ad alte temperature ed a pH compresi tra 5,5 e 7,5 {Antranikian, G., "Microbial degradation of naturai products", (1992), Ed. Winklemann, New York, 27-56), non sono note isoamilasi stabili in queste condizioni. Infatti, anche se nella tecnica sono state riportate isoamilasi con un optimum di attività a temperature di circa 60°C a pH 5,5-6,0, questi enzimi in tali condizioni vengono inattivati in tempi brevi.
In generale l'optimum di temperatura e di pH di un enzima è fortemente collegato alla sua stabilità. Infatti, se si misura l'attività enzimatica per tempi lunghi (16-20 ore), che sono i tempi richiesti nell'impiego industriale, le condizioni di temperatura e di pH ottimali possono variare notevolmente rispetto ai corrispondenti valori misurati in tempi brevi.
Così ad esempio l'isoamilasi prodotta da Flavobacterium odoratum (domanda di brevetto JP05227959), che mostra un optimum di attività a pH 5,5-6,0 ad una temperatura di 45°C, in queste condizioni viene inattivata dopo 15 minuti.
L'isoamilasi prodotta da Pseudomonas amyloderamosa presenta un optimum di attività a pH 3,0-4,5 e ad una temperatura di 58°C se incubata in presenza di substrato per 30 minuti a pH 4.
L'enzima a pH 6,0 ed a 50°C è completamente inattivo dopo 30 minuti.
E' stato ora trovato, secondo la presente invenzione, che è possibile migliorare la stabilità dell'isoamilasi senza alterare la sua attività enzimatica mediante sostituzione di uno o più residui amminoacidici della sequenza dell'enzima wild type con un residuo amminoacidico differente.
Ciò consente di disporre dir mutanti dell'isoamilasi sufficientemente termostabili da essere impiegati a 50°-53° C per periodi di tempo prolungati (16-20 ore) così da consentire l'idrolisi del substrato e sufficientemente stabili a valori di pH compresi tra 5,0-6,5 per consentire l'impiego simultaneo con altri enzimi (ad esempio β-amilasi) nelle condizioni operative.
In accordo con ciò in un suo primo aspetto la presente invenzione riguarda mutanti stabili dell'isoamilasi caratterizzati dal fatto che almeno uno dei residui amminoacidici Thr355, Ile367 e Asp507 della sequenza dell'enzima wild type è sostituito con un residuo amminoacidico differente scelto nel gruppo degli amminoacidi naturali.
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione una sequenza nucleotidica che codifica almeno un mutante dell'isoamilasi.
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione un vettore replicabile ad espressione e secrezione in Bacillus comprendente detta sequenza nucleotidica.
Costituisce inoltre uno scopo della presente invenzione un ceppo di Bacillus trasformato con detto vettore.
Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione un procedimento per la produzione di almeno un mutante dell'isoamilasi che comprende, il coltivare in un ambiente di coltura adatto un ceppo di Bacillus trasformato con un vettore replicabile ad espressione'comprendente la sequenza nucleotidica codificante per detto mutante, il separare e purificare dal mezzo di coltura l'enzima mutato così ottenuto.
Costituisce un ulteriore scopo della presente invenzione l'uso di detti mutanti dell'isoamilasi nel settore alimentare.
Ulteriori scopi della presente invenzione appariranno evidenti dalla lettura del testo e dagli esempi che seguono.
Breve descrizione delle figure:
Figura 1: si riporta la suddivisione del gene isoamilasi in 5 frammenti; sono indicati i siti di restrizione unici nel vettore pSM604
Figura 2: costruzione del doppio mutante pSM624. Figura 3: costruzione del doppio mutante pSM626. Figura 4: costruzione del triplo mutante pSM627.
Figura 5: gel SDS-PAGE degli enzimi wild type (1) doppi mutanti MR4.10-MR5A.3 (2) MR4.10-MR5B.2 (3) MR5A.3-MR5B.2 (4) e triplo mutante MR4.10-MR5B.2-MR5A.3 (5) dopo purificazione su gel di amilosio. In colonna 6 sono riportati gli standard di pesi molecolari.
Figura 6: stabilità al pH degli enzimi wild type ({3⁄4) e triplo mutante (3⁄4|).
Mutanti dell'isoamilasi secondo la presente invenzione sono caratterizzati dal fatto che almeno uno dei residui amminoacidici Thr355, Ile367 e Asp507 è sostituito con un residuo differente scelto tra L-alanina, L-serina, L-lisina, L-arginina, L-acido aspartico, L-acido glutammico, L-asparagina, L-glutamina, L-istidina, L-glicina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina, L-tirosina, L-treonina, L-triptofano, L-fenilalanina, L-metionina o L-prolina.
Preferiti secondo la presente invenzione sono mutanti dell'isoamilasi in cui il residuo Thr355 è sostituito con L-serina (Ser), il residuo Ile367 con L-treonina (Thr) o L-serina (Ser) ed il residuo Asp507 con L-valina (Val).
Particolarmente preferiti sono i mutanti dell’isoamilasi in cui tutti e tre i residui amminoacidici nelle posizioni 355, 367 e 507 sono sostituiti.
Mutanti dell'isoamilasi secondo la presente invenzione possono essere ottenuti mediante un procedimento che comprende:
a) l’introdurre una o più mutazioni nel gene che codifica l'isoamilasi;
b) il clonare il gene dell ' isoamilasi mutagenizzato in un vettore ad espressione e secrezione in Bacillus ed isolare un vettore ricombinante; c) il trasformare un ceppo di Bacillus con -detto vettore ricombinante;
d) il coltivare il ceppo di Bacillus trasformato in un opportuno terreno di coltura; ed infine e) l'isolare un mutante dell'isoamilasi dal.mezzo di crescita di detto ceppo.
Il gene dell'isoamilasi da mutagenizzare, può essere isolato da microorganismi differenti scelti ad esempio tra Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Escherichia coli, Xantomonas.
Secondo una forma di attuazione della presente invenzione il gene che codifica l'isoamilasi è quello di Pseudomonas sp. ATCC 55067. Un frammento di DNA contenente il gene dell'isoamilasi è stato isolato dal plasmide pSM257 ATCC 68018 e clonato nel plasmide pSM308 ATCC 68047 sotto il controllo del promotore della protessi neutra di B.subtilis e della sequenza di secrezione della subtilisina. Questo plasmide comprende un replicone di B.subtilis ed il gene che codifica per la resistenza al cloramfenicolo per la selezione dei trasformanti.
L'introduzione di una o più mutazioni nel gene dell ' isoamilasi può essere effettuata mediante una delle tecniche note di mutagenesi in vitro quale ad esempio mutagenesi sito specifica o, preferibilmente, mutagenesi random.
Allo scopo di introdurre nel modo più casuale possibile mutazioni puntiformi all’interno del gene, è stata adottata la strategia di eseguire il protocollo di mutagenesi random su frammenti di restrizione del gene stesso di dimensioni non superiori alle 600 coppie di basi (bp). Poiché all'interno del gene dell 'isoamilasi sono già presenti 3 siti di restrizione unici, Sphl, BssHII e KpnI (figura 1), sono stati inseriti, mediante mutagenesi sito-specifica secondo il metodo descritto da Zoller, M.J. e Smith, M.,(1982), Nucl.Acid.Res ., 10, 6487-6500, dei nuovi siti in modo da poter frammentare il gene in modo adeguato.
Un sito di restrizione potenzialmente utile allo scopo è rappresentato dal sito Avai. Questi, che è presente come sito unico nel gene dell'isoamilasi (CTC GAG), è tuttavia presente anche al 3' del gene stesso in una porzione non codificante (CCC GGG). Pertanto, questo secondo sito è stato eliminato mediante digestione del DNA plasmidico contenente il gene isoamilasi con l'enzima isoschizomero Xmal, che riconosce la sequenza CCC GGG, riempimento delle estremità coesive a singola elica con polimerasi ed infine circolarizzazione del plasmide mediante ligasi.
Tramite analisi al computer (programma MUTSITE, PC/GENE - Intelligenetics, California) sono state identificate due sostituzioni puntiformi che, se effettuate, avrebbero dato origine a nuovi siti di restrizione senza alterare la sequenza amminoacidica dell'enzima. Tali sostituzioni sono C al posto di G in posizione 1905, che consente di creare un sito ApaI (GGG CCC), e C al posto di G in posizione 1715 che crea un sito SacI (GAG CTC). Il plasmide contenente il gene dell'isoamilasi divisibile in 5 frammenti (MR1, MR4, MR5A, MR5B ed MR6) è stato denominato pSM604 (Figura 1).
Ciascun frammento, isolato da pSM604, è stato mutagenizzato mediante la tecnica della Polymerase Chain Reaction (PCR), secondo le indicazioni riportate da Leung et al. (Leung D.W., Chen E., Goeddel D.V., Technique - a journal of methods in celi and molecular biology, 1., n° 1 (1989): pp.
11-15) utilizzando per l’amplificazione oligonucleotidi che introducono nuovi siti di restrizione adatti al subclonaggio nel vettore pUC18 di E.coli
ti l ti
La reazione di amplificazione dei singoli frammenti è stata condotta in condizioni nelle quali l'enzima polimerasi inserisce con una frequenza intorno allo 0,5-1% basi non complementari al templato utilizzato.
Dopo taglio con gli enzimi di restrizione adatti al clonaggio nel vettore pUC18, i frammenti amplificati come sopra riportato sono stati purificati su gel low - melting (SeaPlaque, FMC BioProducts) e le bande eluite dal gel sono state trattate con GELase (Epicentre Technologies) e ligate al vettore pUC18 digerito con gli stessi enzimi di restrizione. La reazione di ligasi è stata condotta secondo tecniche note in presenza dell'enzima T4 DNA ligasi.
Le miscele di reazione sono state utilizzate per trasformare cellule di E.coli 71/18 competenti per elettroporazione (Dover W.J., Miller J.F. and Ragsdale C.W., N.A.R.(1988), 16, 6127). Dal pool dei cloni trasformati cresciuti in terreno liquido sono stati isolati i plasmidi, con il metodo della lisi alcalina (Sambrook - Fritsch - Maniatis, "Molecular Cloning - a Laboratory Manual (2nd Edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Tali plasmidi sono stati digeriti con gli enzimi di restrizione che delimitano i frammenti del gene dell'isoamilasi , ed i frammenti così isolati sono stati utilizzati per sostituire i corrispondenti frammenti del gene wild type previamente tagliato con gli stessi enzimi di restrizione e purificato su gradiente di saccarosio. Le miscele di ligasi sono state impiegate per trasformare cellule di B.subtills rese competenti come descritto da Bron, S. ("Molecular biological methods for Bacillus" ed. by C.R. Harwood and S.M. Cutting, John Wiley & Sons (1990)).
I trasformanti sono stati selezionati su terreno SS agarizzato (avente la composizione riportata nell'esempio 1) addizionato con amilopectina all'1%.
Le piastre sono state incubate per 20-24 ore a 45°C, temperatura alla quale l'isoamilasi wild type non è in grado di degradare l'amilopectina. Quindi, i cloni positivi che presentavano un alone di degradazione intorno alle colonie, indice di una isoamilasi mutata con una aumentata stabilità termica, sono stati trasferiti su piastre contenenti terreno SS e confrontati con un ceppo che produce l'isoamilasi wild type incubando a 45°C.
I cloni più stabili sono stati coltivati in terreno liquido SS a 37°C per 16 ore. Quindi il DNA plasmidico isolato dalla biomassa mediante il metodo della lisi alcalina (Birnboim H.C. & Doly D.J., N.A.R. (1979), 7 , 1313), è stato utilizzato per trasformare il ceppo B.subtilis IS240. La termostabilità dei trasformanti è stata nuovamente saggiata per verificare che tale fenotipo fosse effettivamente portato dai plasmidi.
Sono state ottenute colonie positive per i frammenti MR4, MR5A ed MR5B. I DNA plasmidici preparati da queste colonie sono stati sottoposti ad analisi di sequenza per identificare a livello di DNA le mutazioni introdotte mediante mutagenesi random. L'analisi è stata effettuata utilizzando il metodo fmolTM commercializzato dalla Promega e basato sul metodo enzimatico di Sanger (Sanger, F. & Coulson, A. R., (1975), J. Mol. Biol., 94, 441-443).
Per il frammento MR4 è stato identificato un clone (MR4A.10) dal quale è stato isolato un plasmide portante il gene dell’isoamilasi con una mutazione puntiforme in posizione 1292. Tale mutazione fa sì che la Thr355 sia sostituita con Ser ed introduce nel gene anche un nuovo sito di restrizione (SacI).
Il frammento MR5A mutagenizzato ha dato luogo a due tipi di cloni:
- MR5A.3, che presenta due mutazioni delle quali, una in posizione 1328 che sostituisce Ile367 in Thr, e l'altra in posizione 1649, mutazione silente per Gly474; e
- MR5A.5 che presenta due mutazioni delle quali, una in posizione 1328 che sostituisce Ile367 in Ser, e l'altra in posizione 1390, mutazione silente per la Tyr388.
Per quanto riguarda il frammento MR5B, tutti i cloni positivi (MR5B.2) presentavano la stessa mutazione in posizione 1748 che dava luogo alla sostituzione Asp507 in Val.
Una volta identificate le mutazioni, sono stati costruiti dei mutanti cumulativi che riunivano i frammenti mutati. In particolare sono stati ottenuti doppi e tripli mutanti derivanti dalla combinazione dei frammenti isolati dai cloni MR5A.3, MR4.10 ed MR5B.2.
In pratica detti frammenti sono stati miscelati in un rapporto 1:1 e sottoposti a reazione di ligasi. Quindi le miscele di ligasi sono state utilizzate per trasformare cellule di B.subtilis ed i trasformanti sono stati selezionati su terreno SS agarizzato addizionato con amilopectina all'1%, incubando a 45°C. L'analisi dei cloni positivi, che producevano l'isoamilasi con doppie e triple mutazioni, ha chiaramente mostrato una maggior stabilità di questi mutanti rispetto all 'isoamilasi wild type ed ai singoli mutanti. Tale stabilità aumentava passando dai doppi ai tripli mutanti (tabella II).
I mutanti della presente invenzione possono essere preparati mediante coltura di un ceppo di Bacillus trasformato con un vettore comprendente il gene dell'isoamilasi mutagenizzato come sopra riportato in un mezzo di coltura contenente sorgenti assimilabili di carbonio e di azoto e sali minerali ad una temperatura compresa tra 30° e 37°C e per il periodo di tempo necessario ad ottenere il prodotto desiderato.
Vettori adatti agli scopi della presente invenzione possono essere scelti tra plasmidi, cosmidi e fagi noti nella tecnica. Preferito secondo la presente invenzione è il plasmide ad espressione e secrezione pSM308 ATCC 68047.
Microorganismi ospiti sono scelti nel gruppo di Bacillus, preferibilmente B.subtilis.
Mutanti secondo la presente invenzione possono essere purificati dal mezzo di coltura impiegando una o più tecniche cromatografiche convenzionali.
La stabilità dei mutanti dell 'isoamilasi secondo la presente invenzione a differenti temperature e pH è stata studiata mediante dosaggio dell'attività enzimatica residua considerando come 100% l’attività di un'aliquota della stessa soluzione conservata a 4°C.
Il dosaggio dell'attività enzimatica consiste nell'incubare una miscela di reazione comprendente amilopectina e l'enzima mutato (o tampone nel caso del controllo) in tampone per 60 minuti, nel bloccare la reazione e nel rivelare la degradazione del substrato (amilopectina) mediante lettura allo spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 610 nm. Una unità enzimatica corrisponde ad una variazione di O.D. del campione di 0,01 rispetto al controllo.
I risultati hanno evidenziato una stabilità dei mutanti in un intervallo di pH compreso tra 5,0 e 6,5 superiore a quella dell'enzima wild type. Inoltre il valore di Τ50, definito come la temperatura alla quale il 50% dell'enzima risulta inattivato dopo riscaldamento per il tempo stabilito mostra chiaramente una termostabilità dei mutanti migliorata rispetto all'isoamilasi wild type. In particolare il triplo mutante incubato in presenza di maltosio per 16 ore, a pH 6,0 ed a 50°C mostra una attività enzimatica del 100% ed una T50 di 53°C.
I mutanti della presente invenzione, che esibiscono una stabilità migliorata rispetto all'enzima wild type, possono essere utilizzati nel settore alimentare nella produzione di prodotti da forno, in birrificazione e, soprattutto, nella preparazione di glucosio, maltosio ed altri dolcificanti a partire dall'amido. Detti mutanti possono essere utilizzati in soluzione o immobilizzati su un supporto solido scelto tra quelli noti nella tecnica.
Sebbene l'invenzione venga descritta relativamente alla produzione di mutanti dell'isoamilasi isolata da Pseudomonas sp., è evidente che essa può essere applicata alla modifica di isoamilasi omologhe ottenute da altri microorganismi.
In accordo con la presente invenzione il plasmide pSM627 contenente la combinazione di tutte le mutazioni è stato depositato presso il Central Bureau Voor Schimmelcultures, SK Baarn (Olanda) come B.subtilis SMS368 dove ha ricevuto il numero di deposito CBS 124.94.
Gli esempi sperimentali che seguono hanno lo scopo di illustrare meglio la presente invenzione senza volerla limitare.
Esempio 1
Costruzione del plasmide pSM406
5 μg del plasmide pSM308 (ATCC 68047) sono stati digeriti con 10 U degli enzimi di restrizione EcoRI e HindiII (Boehringer) a 37°C per 1 ora. Parallelamente, 5 μg del plasmide pSM257 ATCC 68018 contenente il gene dell 'isoamilasi sono stati linearizzati con 10 U dell'enzima HindlII per 1 ora a 37°C e poi digeriti parzialmente con HindiII (4 U per 15 minuti). Le reazioni enzimatiche sono state inattivate scaldando a 65°C per 10 minuti.
9 μl del plasmide pSM308 e 90 μl del plasmide pSM278 digeriti come sopra riportato sono stati miscelati, trattati con fenolo/cloroformio (1:1) e precipitati con NaCl (1/10 vol/vol)/EtOH (2 volumi). Il pellet è stato risospeso in 15 μl di H2O ed addizionato con 2 μl di tampone per ligasi 10X (Boehringer), 2 μl di ATP 10 mM ed 1 μl di T4 DNA ligasi (Boehringer). La reazione è stata condotta a 16°C per circa 16 ore.
Una aliquota (3 μl) della miscela di ligasi è stata utilizzata per trasformare 300 μl di cellule di B .subtilis IS240 (rec<+ >, trp, α-amy ) rese competenti secondo il metodo di S. Bron ( "Molecular biological methods for Bacillus" ed. by C.R. Harwood and S.M. Cutting, John Wiley & Sons (1990)).
I trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno SS (M91X = 6 g/l Ν32ΗPO4, 3g/l KH2PO4, 0.5 g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, addizionato con maltosio (5 g/l), estratto di lievito (1 g/l), CaCl2 (11 mg/l), MgSO4 (170 mg/l), FeSO4 x 7H2O (5 mg/l), ZnSO4 x 7H2O (2.5 mg/l), Trp (20 mg/l), Cloramfenicolo (5 μg/l)) ed amilopectina (1%). L'amilopectina consente di rilevare l'attività dell'enzima secreto mediante la formazione di un alone di degradazione intorno alle colonie produttrici, alone che si colora di blù quando esposto ai vapori di iodio.
Da uno dei cloni positivi è stato estratto il DNA plasmidico che, dopo analisi di restrizione con gli enzimi EcoRI e HindlII, generava due frammenti di circa 750 bp e 1650 bp dei quali, il primo codificava per la sequenza segnale di secrezione della subtilisina fusa al terminale amminico dell 'isoamilasi, ed il secondo per la porzione C-terminale dell'isoamilasi stessa (un sito EcoRI è infatti presente nel gene dell'isoamilasi).
Il nuovo plasmide è stato denominato pSM406.
Esempio 2
Suddivisione del gene dell’isoamilasi in frammenti e mutagenesi dei frammenti.
A) Inserimento di nuovi Biti di restrizione nel gene dell'isoamilasi.
Allo scopo di eliminare il sito Avai presente in una zona non codificante al 3' terminale del gene isoamilasi, il plasmide pSM406 (5 μg) è stato digerito in 50 μl di tampone di reazione con 7 U dell'enzima Xmal (NEB) per 2 ore a 37°C. Dopo aver inattivato l'enzima a 65°C per 10 minuti, il DNA è stato trattato con fenolo-cloroformio e precipitato da etanolo. 1 μg del DNA linearizzato è stato sottoposto a fill-in in 20 μl di miscela di reazione utilizzando 2 U dell'enzima Polimerasi (frammento di Klenow) (Boehringer) per 30 minuti a 22°C. Quindi 10 μl di questa miscela sono stati circolarizzati con 1 U di T4 DNA ligasi a 16°C per 16 ore e poi utilizzati per trasformare cellule competenti di B.subtilis IS240.
Da uno dei cloni positivi selezionati come sopra riportato è stato estratto un plasmide contenente la mutazione desiderata. Detto plasmide, denominato pSM603, quando sottoposto a digestione enzimatica con Avai anziché dare luogo a due frammenti, uno di 5075 e l'altro di 1300 bp, veniva linearizzato.
Per l'inserimento dei siti ApaI e SacI nelle posizioni 1905 e 1715 del gene isoamilasi è stata seguita la seguente strategia.
Il frammento Sphl-HindiII del gene dell'isoamilasi è stato isolato dal plasmide pSM603 e subclonato nella forma replicativa a doppia elica del fago M13. Quindi è stata effettuata la mutagenesi sito-specifica mediante il sistema "Oligonucleotide - directed in vitro mutagenesis, version 2" (Amersham) utilizzando i seguenti oligonucleotidi:
Gli oligonucleotidi sono stati sintetizzati utilizzando il sintetizzatore di DNA "OLIGO 1000" (Beckman) e fosforilati al 5' terminale in 30 μl di reazione contenente 100 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,1 mM ATP e 2 U di polinucleotide kinase (Boehringer) a 37°C per 30 minuti. Il frammento con i nuovi siti di restrizione è stato poi riintrodotto nel plasmide pSM603 digerito con gli enzimi di restrizione Sphl e HindlII.
Il plasmide risultante (pSM604) conteneva il gene dell'isoamilasi divisibile in 5 frammenti denominati MR1, MR4, MR5A, MR5B ed MR6 (Figura 1). Il ceppo di B.subtilis portante detto plasmide è stato contrassegnato con la sigla SMS361.
B) Mutagenesi random dei frammenti dell'isoamilasi.
Per l'amplificazione dei diversi frammenti sono stati sintetizzati gli oligonucleotidi aventi le seguenti sequenze:
Il plasmide pSM604 (1 μg) è stato linearizzato con l'enzima di restrizione StuI (1 U) in 50 μl di miscela di reazione, diluito ad una concentrazione di 0,1 ng/ml con TE (10 mM Tris-HCl pH 8,1 mM EDTA pH 8) e poi aliquote di tale diluizione sono state amplificate utilizzando la coppia di oligonucleotidi specifica per ciascun frammento.
L'amplificazione è stata condotta in una apparecchiatura DNA Thermal Cycler 480 (Perkin -Elmer Cetus) utilizzando una miscela di reazione (100 μl) contenente:
- 10 μl di DNA linearizzato (0,1 ng/ml);
10 μl 10X Taq Polymerase buffer (0,166 M
NH4)2SO4, 0.67 M Tris - HCl pH 8.8, 61 mM MgCl2, 67 mM EDTA pH 8, 1,7 mg/ml BSA);
- 1 μl (3-mercaptoetanolo 1 M preparato al momento; - 10 μl DMSO;
- 10 μl 5 mM MnCl2;
- 1,5 μl forward primer (0,4 μg/ml) e 1,5 μl reverse primer (0,4 μg/ml);
- 10 μl 10 mM dGTP, 10 μl 10 mM dATP, 10 μl 10 mM dTTP, 10 μl 10 mM dCTP; e
- 12 μl H2O
Si aggiunge una goccia di olio minerale e si denatura per 7 minuti a 94 °C, quindi si favorisce l'annealing dei primers a 50 °C per 1 minuto. Si aggiunge poi l'enzima Taq DNA polimerasi (Boehringer, 1 U/ml) e si fa partire il programma ciclico, che comprende :
1 minuto a 94°C (denaturazione)
1 minuto a 50°C (annealing)
4 minuti a 70°C (allungamento)
per 25 cicli complessivi.
I frammenti così amplificati sono stati trattati con fenolo - cloroformio (1:1), precipitati con NaCl (1/10 volume/volume) ed EtOH (2 volumi) e risospesi in 20 ml di H2O. Dopo taglio con gli enzimi di restrizione adatti al clonaggio nel vettore pUC18, i frammenti sono stati purificati su gel low - melting (SeaPlaque, FMC Bio-Products) allo 0,6% e le bande eluite dal gel sono state trattate con GELase (Epicentre Technologies) (1 U ogni 300 μg di gel pesato) per 1,5 ore a 45°C. Parallelamente, 500 ng di vettore pUC18 sono stati tagliati con gli stessi enzimi di restrizione e poi purificati su gel low - melting.
Dopo trattamento con GELase il vettore ed i frammenti sono stati ligati in 20 μl di miscela di reazione (DNA 20 ng/ml) ed 1 μl di ciascuna miscela è stato utilizzato per trasformare cellule di E.coli 71/18 (BRL) competenti per elettroporazione (Dover W.J., Miller J.F. and Ragsdale C.W., N.A.R.(1988), 16, 6127). Sono stati utilizzati 100 μl di cellule in una cuvetta da 0,2 cm, dando un pulse a 2,5 V, con resistenza settata a 200 Ohm e capacità a 25 μFarad. Le cellule sono state sospese in terreno SOC (1 ml, 20 g/l Bacto Tryptone, 5 g/l Yeast Extract, 0,5 g/l NaCl, 50 ml KCl 0,5 M, 100 ml NaOH 10 N, 5 mi MgCl2 2 M, 20 ml 1 M Glucose) e mantenute per 1 ora a 37°C.
Quindi le cellule recuperate per centrifugazione sono state trasferite in 250 μl di terreno LB (10 g/l Bacto - Tryptone (DIFCO), 5 g/l Yeast Extract, 5 g/l NaCl, 300 μl NaOH 10 N, 100 μg/ml Ampicillina) e coltivate a 37°C per circa 16 ore. Da ciascuna coltura è stato preparato mediante il metodo della lisi alcalina (Sambrook - Fritsch -Maniatis, "Molecular Cloning - a Laboratory Manual (2nd Edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) il DNA plasmidico che viene poi utilizzato come banca dei frammenti mutagenizzati da trasferire in B.subtilis per lo screening.
Esempio 3
Clonaggio dei frammenti mutagenizzati in B.subtilis.
Allo scopo di analizzare solo i cloni ricombinanti derivanti dall'amplificazione, il plasmide pSM604, contenente il gene wild type dell'isoamilasi, è stato tagliato con gli enzimi di restrizione necessari per il clonaggio dei vari frammenti mutagenizzati e quindi i corrispondenti frammenti wild type sono stati eliminati mediante purificazione su gradiente di saccarosio.
30 vg del plasmide pSM604 sono stati tagliati separatamente con i seguenti enzimi di restrizione: SphI e BssHII per il frammento MR1, BssHII e Avai per il frammento MR4, AvaI e SacI per il frammento MR5A, SacI e ApaI per il frammento MR5B ed ApaI e KpnI per il frammento MR6. Quindi i DNA plasmidici digeriti sono stati trattati con fenolo - cloroformio (1:1), precipitati da EtOH come già descritto precedentemente e poi risospesi in 200 μl del tampone di corsa per i gradienti di saccarosio (30 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA ed 1 M NaCl). I gradienti sono stati preparati utilizzando soluzioni al 5% ed al 20% di saccarosio nel tampone di corsa, utilizzando un formatore di gradienti (Buchler Auto Densi - Flow IIC). Il volume totale del gradiente era di 16 μl. I campioni sono stati applicati sulla superficie dei gradienti e corsi per 20 ore nel rotore SW28 a 25000 rpm ad una temperatura di 20°C in una ultracentrifuga L8 - M (Beckman). Dopo la corsa, il gradiente è stato frazionato manualmente prelevando dalla superficie 40 frazioni da 400 μl; 1/10 del volume di ogni frazione è stato caricato su gel di agarosio e le frazioni contenenti il plasmide privo dello specifico frammento wild type sono state riunite, diluite 1:1 con H2O e precipitate da EtOH. I DNA sono stati risospesi in 50 pi di H2O. Contemporaneamente le banche dei frammenti contenuti nel vettore pUC18 sono state tagliate con gli stessi enzimi di restrizione (generalmente 20 pg di DNA in una reazione da 50 μl) e ligate ai DNA ottenuti come sopra riportato.
Le reazioni di ligasi sono state condotte in 50 μl di miscela di reazione utilizzando un rapporto molare tra plasmide purificato da saccarosio e frammento isolato dal pUC18 pari a 1:1, alla concentrazione di 20 ng/ml.
20 μl di ligasi sono stati utilizzati per trasformare cellule competenti di B.subtilis IS240.
Le cellule trasformate sono state diluite a 2 mi con il terreno di coltura prima di essere piastrate su terreno SS agarizzato (1,5%) addizionato con amilopectina all'1% (200 ml ogni piastra di diametro di 16 cm). Le piastre sono state incubate per 20-24 ore a 45°C. Quindi, i cloni positivi, che presentavano un alone di degradazione intorno alle colonie sono stati trasferiti su piastre contenenti terreno SS e confrontati con un clone che produceva l'isoamilasi wild type incubando a 45°C.
I cloni più stabili sono stati trasferiti in terreno liquido VY (Veal infusion broth 10 g/l, Yeast extract 5 g/l, Cm 5 μg/ml) e coltivati a 37°C per 16 ore. Quindi il DNA plasmidico isolato dalla biomassa mediante il metodo della lisi alcalina (Birnboim H.C. & Doly D.J., N.A.R. (1979), 7, 1313), è stato utilizzato per trasformare il ceppo B.subtilis IS240. La termostabilità dei trasformanti è stata nuovamente saggiata per verificare che tale fenotipo fosse effettivamente portato dal plasmide.
Sono stati analizzati 85.000 cloni provenienti dalla mutagenesi del frammento MR4 e tra questi è stato identificato un clone (MR4.10) che mostrava un alone di attività a 45°C. Per quanto riguarda il frammento MR5A sono state analizzate 60.000 colonie di cui 30 positive. Per il frammento MR5B tra le 90.000 colonie analizzate sono stati identificati 9 cloni positivi.
Esempio 5
Sequenziamento dei DNA mutati.
I DNA preparati dalle colonie positive sono stati sottoposti ad analisi di sequenza utilizzando il metodo fmolTM commercializzato dalla Promega e basato sul metodo enzimatico di Sanger (Sanger, F. & Coulson, A. R., (1975), J. Mol. Biol., 94, 441-443). Il metodo fmol sfrutta le caratteristiche intrinseche della DNA polimerasi isolata dal microorganismo Thermus aquaticus (Taq DNA polimerasi) in una serie di reazioni condotte nel thermal cycler, in modo molto simile ad una PCR. Inoltre il metodo prevede l'utilizzo di una miscela contenente 7 - deaza dGTP al posto del dGTP, in modo da risolvere eventuali compressioni dovute alla presenza di regioni ricche in G-C. Gli oligonuceleotidi utilizzati per sequenziare i frammenti mutati sono i seguenti:
Il frammento MR4 (isolato dal clone MR4.10) ha mostrato avere una mutazione puntiforme nella posizione 1292 (C-->G) che muta la Thr355 in Ser; questa mutazione, inoltre, introduce un nuovo sito SacI nel gene.
Il frammento MR5A, isolato da uno dei 30 cloni positivi (MR5A.3) presenta due mutazioni puntiformi nelle posizioni:
- 1328 (T-->C) che muta la Ile367 in Thr,
- 1649 (A-->T) mutazione silente (Gly 474 in Gly).
Il frammento MR5A isolato dal clone positivo MR5A5 presenta due sostituzioni puntiformi nelle posizioni:
- 1328 (T— >G) che muta la Ile367 in Ser, - 1390 (T-->C) mutazione silente per Tyr 388.
Il frammento MR5B (isolato da clone MR5B.2) ha mostrato una sola mutazione in posizione 1748 (A-->T) che cambia Asp507 in Val.
Nella tabella I che segue si riportano i nomi dei plasmidi portanti i frammenti mutati:
Costruzione dei doppi e dei tripli mutanti.
Sono stati costruiti i mutanti cumulativi che riuniscono i frammenti mutati: in particolare, sono stati ottenuti i doppi mutanti derivanti dai plasmidi pSM621 e pSM622, pSM621 e pSM623, pSM622 e pSM623, ed il triplo mutante derivante da pSM621, pSM622 e pSM623.
Per la costruzione del doppio mutante derivante da MR4.10 e MR5A.3, circa 1 μg dei plasmidi pSM261 e pSM262 sono stati tagliati in 20 μl di miscela di reazione con gli enzimi AvaI e KpnI, miscelati in rapporto 1:1 e sottoposti a reazione di ligasi incubando a 16 °C per 16 ore. La miscela di ligasi è stata quindi utilizzata per trasformare cellule competenti di B.subtilis IS240. La selezione dei trasformanti è stata effettuata su terreno SS addizionato con amilopectina.
Le colonie ottenute sono state sottoposte a verifica del DNA plasmidico mediante taglio con gli enzimi di restrizione SacI e KpnI. Mentre il taglio del plasmide pSM621 dà luogo a due frammenti, uno di 5075 e l'altro di circa 1300 bp, e quello del plasmide pSM622 ad una banda di 5475 e ad una di circa 900 bp, il doppio mutante, come atteso, è tagliato in tre frammenti rispettivamente di circa 900, 420 e 5075 bp. Il doppio mutante così identificato (pSM624) è stato sottoposto ad analisi di termostabilità su piastra a 45°C in parallelo al ceppo wild type ed ai singoli mutanti. L'analisi ha chiaramente mostrato una maggior stabilità dell’enzima portante le due mutazioni rispetto all'enzima wild type e agli enzimi mutati singolarmente .
Per la costruzione del doppio mutante derivante da MR5A.3 e MR5B.2 i plasmidi pSM622 e pSM623, per i quali non è possibile effettuare uno screening tramite analisi di restrizione in quanto le mutazioni non hanno introdotto nuovi siti, è stato necessario distruggere selettivamente l'inserto wild type ed il vettore, in modo che la maggior parte dei cloni ottenuti fossero i ricombinanti desiderati. Quindi, circa 1 μg dei plasmidi pSM622 e pSM623 è stato digerito con gli enzimi di restrizione Avai e SacI più Nael (per pSM622) o EcoNI (per pSM623) in 20 μl di tampone di reazione. La reazione di ligasi e la trasformazione sono state condotte come descritto sopra, ottenendo così il doppio mutante pSM626, che è stato saggiato su piastra in parallelo ai singoli mutanti, risultando più stabile di entrambi.
Infine, per la costruzione del mutante triplo (MR4A.10, MR5A.3 e MR5B.2) è stata adottata la stessa strategia utilizzata per costruire il mutante pSM626, ovvero il plasmide pSM622 (1 μg) è stato tagliato con gli enzimi di restrizione Avai, KpnI ed EcoNI ed il plasmide pSM624 (1 μg) è stato tagliato con gli enzimi di restrizione Avai, KpnI e Nael. La miscela di ligasi, ottenuta come sopra descritto, è stata impiegata per trasformare cellule competenti di B.subtilis IS240. Dalle colonie ottenute selezionando i trasformanti su piastra, è stato preparato il DNA per l'analisi di restrizione con gli enzimi SacI e KpnI in modo da verificare l'introduzione del frammento MR4.10.
Tutte le costruzioni sono state poi verificate tramite analisi di sequenza del DNA.
I cloni portanti sia i singoli frammenti mutati che le loro combinazioni sono stati caratterizzati mediante studi di termostabilità su piastra e in liquido dei corrispondenti enzimi purificati.
Nella tabella II sono riportati i nomi dei mutanti, dei nuovi ceppi, dei plasmidi da essi portati e gli aloni di idrolisi su piastra a 45°C:
Esempio 9
Caratterizzazione delle isoamilasi modificate.
1) Produzione e secrezione dell'isoamilasi
I ceppi B.subtilis SMS362, SMS363, SMS364, SMS365, SMS366, SMS367 e SMS368 sono stati coltivati in 4 litri di terreno SS (suddivisi (500 ml) in 8 beute da 2 litri), per 20 ore a 37°C. Successivamente le colture sono state centrifugate a 5000 rpm per 20 minuti (rotore JA14, Beckman). Aliquote dei surnatanti acellulari sono state saggiate per dosare l' attività enzimatica.
II dosaggio dell'isoamilasi consiste nell'incubare 100 μl di soluzione enzimatica contenente 0,1 μg di proteina (o di tampone nel caso del bianco) in presenza di 1,25 ml di amilopectina di mais (SIGMA) allo 0,83% in tampone 33 mM CH3COONa, pH 4 per 60 minuti a 40°C. A 40 μl di questa miscela vengono aggiunti 50 μl di una soluzione contenente 2% KI, 0.2% I2 e 0,2 % H2SO4 allo scopo di bloccare la reazione. Quindi si aggiungono 2 mi di H2O, si centrifuga per 1 minuto a 13000 rpm e si legge allo spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 610 nm. Una unità enzimatica secondo questo metodo corrisponde alla quantità di enzima che determina una variazione di O.D. di 0,01 del campione rispetto al bianco.
Il valore dell'attività specifica degli enzimi purificati è la stessa sia per l'enzima wild type che per i mutanti. Il dosaggio ha evidenziato una resa di circa 2 mg/l per il wild type e per i mutanti.
2 ) Purificazione dell ' isoamilasi
L' enzima wild type ed i mutanti sono stati purificati per affinità su gel di amilosio preparato come descritto da Kato e coll. (Kato,K. et al. (1977) Agric. Biol. Chem., 41 (10), 2077-2080) equilibrato in tampone 20 mM CH3C00Na pH 4. Il surnatante proveniente dalla fermentazione dei ceppi produttori (41) è stato incubato con 100 ml di gel di amilosio per 16 ore a 4°C sotto blanda agitazione. Dopo successivi lavaggi su filtro poroso con 2 litri di tampone 20 mM CH3COONa pH 4, il gel è stato incubato per 1 ora in 1 litro dello stesso tampone addizionato con NaCl 0,5 M e lavato con un ulteriore litro della stessa soluzione ed un litro del tampone privo di sale. L'enzima è stato eluito incubando per 16 ore a 4°C sotto blanda agitazione con 200 ml di maltosio al 30% in tampone CH3COONa 20 mM pH 4. La Figura 5 mostra un gel SDS-PAGE delle proteine purificate.
Esempio 10
Effetto del pH sulla stabilità del triplo mutante.
L’effetto del pH sulla stabilità è stato determinato scaldando a 50°C per 30 minuti soluzioni enzimatiche a differenti pH e determinando l'attività residua su amilopectina.
Il tampone utilizzato per l'intervallo di pH compreso tra 2,3 e 7,8 è il tampone di McIlvaine contenente 0,1 M di acido citrico e 0,2 M Na2HPO4.2H2O in varie proporzioni. Per questo esperimento 500 μl del triplo mutante e dell'enzima wild type alla concentrazione di 3,5 μg/ml sono stati scaldati a 50°C per 30 minuti.
L'attività residua è stata calcolata utilizzando il saggio descritto precedentemente, considerando come 100% l'attività di un'aliquota della stessa soluzione enzimatica conservata a 4°C. In figura 6 si riporta in ordinata la percentuale di attività residua del triplo mutante (3⁄4[) scaldato a diversi valori di pH (ascissa), confrontata con i dati relativi all'enzima wild type (0 ).
I risultati evidenziano per l'enzima mutato una stabilità superiore a quella dell'enzima wild type nell'intervallo di pH compreso tra 5,0 e 6,5.
Esempio 11
Studi sulla termostabilità degli enzimi mutati La termostabilità del triplo mutante è stata studiata utilizzando la tecnica che prevede il riscaldamento di varie aliquote (500 μl) dell'enzima mutato a diverse temperature e successivo calcolo dell'attività residua su amilopectina. Il riscaldamento degli enzimi è stato effettuato, in presenza ed assenza di maltosio (20%), per tempi determinati (30 minuti, 3 e 16 ore). La concentrazione delle soluzioni enzimatiche utilizzate è compresa tra 1 e 8 μg/ml in tampone fosfato a pH 6,0.
Dalle curve di inattivazione così ottenute è stato calcolato il valore di Τ50 definita come la temperatura alla quale il 50% dell'enzima risulta inattivato dopo riscaldamento per il tempo stabilito. I risultati sono riportati in tabella III
Dai risultati riportati in tabella III si osserva una differenza di T50 tra il triplo mutante rispetto e l'enzima wild type di circa 5°C per tempi di riscaldamento superiori a 3 ore.
La tabella IV mostra le percentuali di attività residua dell'enzima wild type e del triplo mutante dopo vari tempi di esposizione degli stessi a 50°C e pH 6 in presenza di 20% maltosio.
Esperimenti paralleli effettuati a temperature crescenti (46°C-54,5°C), pH 4,0 per circa 3 ore mostrano che la stabilità dei mutanti è identica a quella dell'enzima wild type. Il valore di T50 in queste condizioni è di 51,5°C sia per i mutanti che per l'enzima wild type.
Inoltre, in un saggio effettuato per 24 ore a 45°C e a pH 6,0, la conversione del substrato (amilopectina) corrisponde ad una attività enzimatica degli enzimi wild type e triplo mutante del 10 e del 55% rispetto a quella ottenuta per entrambi gli enzimi a pH 4,0.
Claims (22)
- RIVENDICAZIONI 1. Mutanti stabili dell 'isoamilasi caratterizzati dal fatto che almeno uno dei residui amminoacidici Thr355, Ile367 e Asp507 della sequenza dell'enzima wild type è sostituito con un residuo diverso scelto nel gruppo degli amminoacidi naturali.
- 2. Un mutante stabile dell'isoamilasi in accordo alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il residuo amminoacidico Thr355 è sostituito con L-serina.
- 3. Un mutante stabile dell'isoamilasi in accordo alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il residuo amminoacidico Ile367 è sostituito con L-treonina o L-serina.
- 4 Un mutante stabile dell ' isoamilasi in accordo alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il residuo amminoacidico Asp507 è sostituito con L-valina.
- 5. Un mutante stabile dell'isoamilasi in accordo alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che i residui Thr355, Ile367 e Asp507 sono contemporaneamente sostituiti con L-serina, L-treonina o L-serina e L-valina.
- 6. Sequenza nucleotidica che codifica almeno un mutante dell'isoamilasi in accordo con la rivendicazione 1.
- 7. Sequenza nucleotidica che codifica almeno un mutante dell'isoamilasi in accordo con la rivendicazione 2.
- 8. Sequenza nucleotidica che codifica almeno un mutante dell'isoamilasi in accordo con la rivendicazione 3.
- 9. Sequenza nucleotidica che codifica almeno un mutante dell'isoamilasi in accordo con la rivendicazione 4.
- 10. Sequenza nucleotidica che codifica almeno un mutante dell'isoamilasi in accordo con la rivendicazione 5.
- 11. Un plasmide ad espressione e secrezione in Bacillus comprendente la sequenza nucleotidica in accordo alla rivendicazione 6.
- 12. Un plasmide ad espressione e secrezione in Bacillus comprendente la sequenza nucleotidica in accordo alla rivendicazione 7.
- 13. Un plasmide ad espressione e secrezione in Bacillus comprendente la sequenza nucleotidica in accordo alla rivendicazione 8.
- 14. Un plasmide ad espressione e secrezione in Bacillus comprendente la sequenza nucleotidica in accordo alla rivendicazione 9.
- 15. Un plasmide ad espressione e secrezione in Bacillus comprendente la sequenza nucleotidica in accordo alla rivendicazione 10.
- 16. Il plasmide in accordo alla rivendicazione 15, depositato presso il Centralbureau Voor Schimmelcultures con il numero di deposito CBS 124.94.
- 17. Un microorganismo scelto nel gruppo di Bacillus trasformato con un plasmide in accordo alle rivendicazioni da 11 a 16.
- 18. Il microorganismo in accordo alla rivendicazione 17, in cui Bacillus è Bacillus subtilis.
- 19. Bacillus subtilis SMS368 CBS 124.94.
- 20. Procedimento per la preparazione di un mutante stabile dell'isoamilasi caratterizzato dal fatto di: a) coltivare un ceppo di Bacillus trasformato con un plasmide in accordo alle rivendicazioni da 11 a 15, in terreno di coltura adatto contenente fonti di carbonio, di azoto e sali minerali; e b) separare e purificare dal mezzo di coltura acellulare il mutante così ottenuto.
- 21. Il procedimento secondo la rivendicazione 20, caratterizzato dal fatto che Bacillus è Bacillus subtilis SMS369 CBS 124.94.
- 22. Mutanti stabili dell ' isoamilasi in accordo alle rivendicazioni da 1 a 5 per l'impiego nel settore alimentare.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITMI941209A IT1270197B (it) | 1994-06-09 | 1994-06-09 | Mutanti stabili dell'isoamilasi |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITMI941209A IT1270197B (it) | 1994-06-09 | 1994-06-09 | Mutanti stabili dell'isoamilasi |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITMI941209A0 ITMI941209A0 (it) | 1994-06-09 |
| ITMI941209A1 true ITMI941209A1 (it) | 1995-12-09 |
| IT1270197B IT1270197B (it) | 1997-04-29 |
Family
ID=11369089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ITMI941209A IT1270197B (it) | 1994-06-09 | 1994-06-09 | Mutanti stabili dell'isoamilasi |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | IT1270197B (it) |
-
1994
- 1994-06-09 IT ITMI941209A patent/IT1270197B/it active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1270197B (it) | 1997-04-29 |
| ITMI941209A0 (it) | 1994-06-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3086249B2 (ja) | 熱、酸及び／またはアルカリに高い安定性を有する細菌由来突然変異体α―アミラーゼ | |
| HU195533B (en) | Process for producing microorganisms modificated with genetical engineering for producing amilase | |
| JPH04507346A (ja) | アルカリ性タンパク質分解酵素およびその製造方法 | |
| WO1998056926A1 (fr) | Systeme pour exprimer une proteine hyperthermostable | |
| Hadj-Taieb et al. | Hyperproduction of pectinase activities by a fully constitutive mutant (CT1) of Penicillium occitanis | |
| EP4006149A1 (en) | Mutant glucose oxidase (god) having improved thermal stability and gene and application thereof | |
| US5418156A (en) | Agarase enzyme system from alteromonas strain 2-40 | |
| KR20100107591A (ko) | 류코노스톡 락티스로부터 유래된 글루칸수크라제 및 그 제조방법 | |
| FI111552B (fi) | Menetelmä rekombinanttisen isäntäsolukannan tuottamiseksi ja näin saatu rekombinanttinen isäntäsolu | |
| Lebbink et al. | β-Glucosidase CelB from Pyrococcus furiosus: production by Escherichia coli, purification, and in vitro evolution | |
| Wang et al. | Cloning and expression of L-asparaginase gene in Escherichia coli | |
| JP2007189905A (ja) | 好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素遺伝子を含有するｄｎａ、組み換え体ｄｎａ、および好アルカリ性サイクロデキストラン合成酵素の製造法 | |
| IL118714A (en) | Isolated cell which contains at least one dna sequence coding for a protein with a sucrose isomerase activity and processes for the preparation thereof | |
| ITMI941209A1 (it) | Mutanti stabili dell'isoamilasi | |
| KR102358538B1 (ko) | 유전자 총법을 이용한 미세조류의 교정 방법 | |
| AU667689B2 (en) | Expression of polypeptides in E.coli under control of the E.coli MDH-gene promoter | |
| Chagnaud et al. | Construction of a new shuttle vector for Lactobacillus | |
| US5830692A (en) | Expression system which can be regulated | |
| JP2003230384A (ja) | γ−ポリグルタミン酸分解酵素欠損変異株、その取得方法及び該変異株を用いたγ−ポリグルタミン酸の製造法 | |
| US6509183B1 (en) | DNA fragment containing gene for alkaline pullulanase | |
| JP2001231569A (ja) | アルカリセルラーゼ遺伝子 | |
| JP7352929B2 (ja) | 固体培養時の糖質分解酵素生産能が高いアスペルギルス属菌株の作出方法 | |
| US10829744B2 (en) | Microorganism having enhanced cellulose synthase gene stability and method of producing cellulose by using the same | |
| JP3790318B2 (ja) | 新規遺伝子および該遺伝子を含有する新規酵母 | |
| JP3557271B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 0001 | Granted | ||
| TA | Fee payment date (situation as of event date), data collected since 19931001 |
Effective date: 19970613 |