ITMI20092071A1 - Analoghi chimerici - Google Patents

Description

Descrizione dell'Invenzione avente per TITOLO : "Analoghi chimerici"

Descrizione

L'invenzione riguarda una nuova classe di composti caratterizzati per mostrare un effetto inibitorio su virus dell'influenza di tipo A e B, resistenti e non ad altri farmaci, su altri tipi di virus quali i flavivìrus ed anche su protozoi ed altri microorganismi, loro metodi di preparazione, formulazioni farmaceutiche e loro utilizzo come prodotti medicinali per il trattamento di numerosi virus, microrganismi e protozoi che affliggono gli animali e l'uomo. Nonostante i virus dell'influenza di tipo A e B siano i più conosciuti dalla popolazione mondiale per il timore che possano dare origine a pandemie, non meno pericolosi sono altri tipi di virus meno noti quali i flavivirus, in particolare l'HCV, ed i retrovirus, in particolare l'HIV, ed i protozoi, in particolare il plasmodio della malaria e della tripanosomiasi, e molti altri microorganismi poco conosciuti, che però possono sviluppare ancor più gravi condizioni patologiche che ogni anno causano nel mondo una mortalità di milioni di vittime. Questa parte introduttiva riguarda quindi in particolare la specificità mostrata dagli enzimi virali emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA) di legarsi l'acido sialico (noto anche come acido N-acetil-neuramminico o più semplicemente acido neuramminico, anche identificato con gli acronimi NANA oppure Neu5Ac, qui contraddistinto dall'acronimo SA) che viene esposto dai glicani sialilati che sono situati sulla superficie della cellula ospite, e che consentono al virus di entrare all'interno oppure di uscire dalla stessa con complessi meccanismi ciclici e multifattoriali ancora oggi del tutto sconosciuti (1)(2)(3). Di fatto, quindi, a partire dal 1974 si é sviluppata una continua ricerca di trovare prìncipi attivi in grado di inibire questi enzimi e quindi anche la replicazione virale, già osservando una certa efficacia in alcuni analoghi dell'acido sialico, che viene di seguito rappresentato per maggiore comodità.

Ma anche i protozoi ed altri microrganismi utilizzano un analogo meccanismo che à ̈ sempre mediato dall'aggressione dell'acido sialico esposto dai glicani siali lati della superficie della cellula obiettivo d parte degli enzimi HA oppure NA di detti patogeni monocellulari. E' quindi logico pensare che anche questi micro-organismi possano essere inibiti con antagonisti dei riferiti enzimi.

I risultati ottenuti in questo ultimo decennio con alcuni farmaci antivirali, in particolari analoghi del SA, sono stati altrettanto rapidamente vanificati da nuove ed inaspettate resistenze, stante la sorprendente capacità dei virus ed dei microorganismi dì evolversi con una rapida sequenza per modificare ì loro meccanismi vitali e riproduttivi, che ne riducono l'efficacia, fino ad annullarla per completo. Infatti, da alcuni mesi viene da più parti segnalato il fenomeno della farmaco resistenza virale che si é sviluppata sia nei confronti dei derivati dell'adamantano (inibitori della proteina M2) che dell'oseltamivir. Alcuni ceppi di virus manifestano oggi giorno una resistenza verso i derivati dell'adamantano intorno al 40 %, mentre l'oseltamivir parrebbe non efficacie già intorno al 15-20 % dei casi dei virus di tipo A/H1N1. In effetti, la caratteristica più tipica dell'involucro virale é la presenza di proiezioni radiali che nel caso dei virus dell'influenza di tipo A e B corrispondono alla HA (4)(5)(6) ed a NA (7)(8)(9)(10).

Nell'involucro virale del solo ceppo di tipo A à ̈ anche inserita la proteina omotetrammerica M2che svolge un ruolo importante nella deplezione virale. Nel virus dell'influenza di tipo C à ̈ invece presente una glicoproteina detta fusione emoagglutinina-esterasi (HEF) responsabile di tre attività biologiche: legame al recettore (H), inattivazione del recettore (E) e fusione (F) (11)(12)(13).

I prodotti antivirali di prima generazione (per lo più derivati deH'adamantano, quali amantadina, rimantadina, memantina ed altri simili) agiscono bloccando la proteina M2 del canale ionico del virus tipo A dell'influenza. Il blocco del flusso in entrata di ioni H<+>attraverso il canale protonico M2inibisce la deplezione virale ed il rilascio nel citoplasma di ribonucleoproteine libere. Ciò avviene solo per il ceppo A del virus dell'influenza, e non per il ceppo B, notoriamente sprovvisto di proteina M2. Da un decennio circa la strategia antivirale à ̈ stata indirizzata quindi a sviluppare una seconda generazione di farmaci antivirali che fossero capaci di inibire in modo selettivo la neuramminidasi (NA) dell'involucro del virus dell'influenza di tipo A e B. L'enzima NA promuove infatti la deplezione virale ed il rilascio dei virus neoformati all'interno delle cellule infettate. Gli inibitori della neuramminidasi parrebbero quindi bloccare il sito attivo della neuramminidasi e quindi di non impegnare i residui di acido sialico sulle superfici delle cellule ospite e degli involucri virali.

Risale infatti al 1999 l'introduzione in clinica della seconda serie di inibitori selettivi della neuramminidasi costituiti da zanamivir e da oseltamivir; il primo somministrabile solo per via inalatoria e quindi privo di attività sistemica e pertanto utilizzabile quasi esclusivamente per la profilassi dell'influenza. Solo l'oseltamivir ha il pregio di possedere un'attività sistemica a seguito di somministrazione orale, ma come primo osservato, presenta un elevato grado di resistenza virale. Un altro nuovo inibitore della ΠΑ, identificato in letteratura con il codice CS 8958 (metabolita attivo del composto identificato con la sigla R-125489) (14), che é in fase finale di sperimentazione clinica, ha il vantaggio di una attività duratura dovuto alla difficoltà di essere inattivato dagli enzimi, ma presenta come lo zanamivir la limitazione di essere somministrabile solo per via inalatoria nasale e quindi di essere di fatto un farmaco da usare in via preventiva.

Inoltre, vi é un crescente allarme nel mondo scientifico, in quanto numerose pubblicazioni internazionali segnalano con crescente frequenza mutazioni e fusioni virali, in particolare del virus di tipo A, che danno luogo a varianti resistenti, molto patogene ed anche imprevedibili nella loro potenziale aggressività. A questo riguardo, negli ultimi anni il virus dell'influenza aviaria tipo A (H5N1) e quello tipo A (H1N1) del maiale sono stati descritti dagli scienziati come un serio rischio in quanto potrebbero generare pandemìe, molto pericolose in quante sostenute da virus in gran parte resistenti all'oseltamivir, di fatto l'unico prodotto disponibile per via orale. In effetti, per quanto riguarda la farmaco resistenza, come già osservato, é stata segnalata una crescente incidenza di ceppi virali resistenti ai derivati dell'adamantano (15)(16)(17)(18)(19). Fatto ancor più grave, questa resistenza parrebbe la conseguenza dell'uso cronico della memantina largamente impiegata nell'Alzheimer e dell'uso dell'amantadina nel morbo di Parkinson, ma a dosi di molto inferiori a quelle che inibiscono l'attività antivirale, così di fatto favorendo la selezione di ceppi dì virus influenzale dì tipo A resistenti.

Recentissime pubblicazioni hanno inoltre segnalato la presenza di ceppi di virus tipo A, isolati da recenti epidemie stagionali (influenza porcina tipo A/H1N1), che presentano delle mutazioni genetiche che li rendono resistenti all'oseltamivir, l'unico inibitore della neuramminidasi somministrabile per via orale (20)(21)(22)(23)(24)(25) risultante quindi estremamente difficile salvare quei pazienti portatori di tale ceppi resistenti all'oseltamivir.

Analizzando poi la sequenza con cui intervengono gli enzimi dei riferiti patogeni, é noto che HA interviene nella prima fase nel quale il virus oppure il microorganismo in genere (batterio oppure protozoo o altro) si aggancia alla parete cellulare per aggredire la cellula ospite. In effetti, HA lega i residui non impegnati di acido sialico dei glicoconiugati della parete cellulare, più o meno numerosi a seconda delle circostanze anche pH correlate. Un inibitore della HA potrebbe quindi portare al risultato di prevenire l'adesione (virale, batterica o protozoaria) sulla superficie della cellula ospite che porterebbe, nel caso specifico del virus influenzale di tipo A e B, ad una successiva riduzione del numero dei virus che entra, completa il ciclo riproduttivo e che viene rilasciato, così infettando altre cellule. Ad oggi parrebbe non sia stato trovato e non é quindi disponibile alcun inibitore della HA e quindi pare non vi sia modo di contrastare la fase iniziale in cui sono coinvolti i glicani sialilati che si trovano sulla superficie della membrana della cellula ospite. La letteratura descrive però una scarsa affinità della HA per SA, ma omette di citare che alcuni autori hanno da tempo descritto che variazioni di pH possono interferire sui meccanismi di fusione dei diversi ceppi di virus dell'influenza (26)(27).

Infine, non é disponibile oggi alcun prodotto in grado di inibire le glicoproteine e proteine responsabili di almeno due delle fasi dianzi descritte, ovvero in grado di ostacolare sequenzialmente o simultaneamente la HA e/o la proteina M2 e/o la neuramminidasi (NA), invero capace di interferire in sequenza e/o allo stesso tempo su almeno due dei tre meccanismi implicati nella replicazione virale, fattore che aumenterebbe la potenza del farmaco riducendo al minimo la possibilità dell'insorgenza di resistenze. Vi sono inoltre altre infezioni da flavivirus, quali l'epatite di tipo C, la febbre gialla e la febbre Dengue che sono molto comuni nel mondo, e rappresentano condizioni di grave patogenicità e che presentano un'elevata mortalità, alla quale segue un numero crescente di pazienti infetti e di decessi. Per queste patologie, non esiste ad oggi alcun farmaco in grado di garantire un trattamento efficacie. Anche l'attuale strategia contro il virus dell'epatite di tipo C (HVC) à ̈ quella di inibire con ribavirina (come monofosfato) la sintesi di guanosina monofosfato, riducendone i livelli intracellulari. In recenti protocolli clinici la ribavirina é stata associata ad interferone pegilato alfa-2a oppure interferone pegilato alfa-2b, disponibili da alcuni anni in commercio, ma con risultati modesti e poco stabili.

Per le altre infezioni virali sostenute da flavivirus di fatto non esistono sostanze medicinali attive con le quali si possano trattare in modo idoneo le fasi iniziali ed acute della malattia. Da qui l'elevato numero di decessi. Oggi à ̈ solo possibile instaurare una profilassi con vaccini, che, anche a seguito della scarsa disponibilità delle dosi necessarie, consentono al massimo di circoscrivere il focolaio epidemico, come accade per la febbre gialla. In effetti, la mancanza di farmaci specifici per trattare le malattie causate da flavivirus rendono queste infezioni estremamente pericolose, in quanto presentano un elevatissima incidenza di esiti mortali.

In base a quanto detto, esiste quindi un'urgente ed impellente necessità di disporre di nuovi composti antivirali che presentino in una sola ed unica molecola un meccanismo di azione multiplo e combinato, sequenziale o simultaneo, nei confronti della moltiplicazione virale in modo da ampliare lo spettro di attività estendendola ad una serie di altri virus patogeni per l'uomo e gli animali, ma che possano anche ostacolare i processi di farmaco resistenza del virus dell'influenza di tipo A e B e delle numerose varianti che si prevedono nei prossimi anni. Essendo il meccanismo di aggancio alla parete delle cellula ospite per entrarvi e moltiplicarsi all'interno é molto simile ad una serie di numerosi altri agenti patogeni per l'uomo e per i mammiferi, questi farmaci ad effetto multiplo potrebbero anche essere utili per queste infezioni. In effetti, anche batteri, plasmodi ed altri agenti infettanti monocellulari in un primo stato dell'aggressione alla cellula ospite si legano al SA che integra le glicoproteine superficiali usando analoghi enzimi HA ed NA. Quindi anche batteri ed infezioni miste virali e batteriche ed anche gli altri microorganismi patogeni, che producono un'elevata mortalità nella popolazione mondiale, potrebbero essere inibiti dagli stessi composti di cui vi é un crescente bisogno.

Razionale degli antivirali già esistenti e dell'invenzione Colman P.M. e al. nel WO 92/06691 (PCT/AU90/00501 pubblicato il 30 aprile 1992), Itzstein L.M. von e al. nel brevetto EP 0539204 Al (domanda di brevetto europea n. 92309684.6 pubblicata il 28 aprile 1993), ed ancora lo stesso Itzstein L.M. von e al. nel brevetto WO 91/16320 (PCT/AU91/00161 pubblicato il 31 ottobre 1991) descrivono dei composti che legano la NA e che sono quindi ritenuti inibitori in vitro dell'attività virale. Nel 1993. sempre von Itzstein nella nota pubblicazione "Nature" (28) spiega l'effetto razionale degli inibitori della sialidasi sulla moltiplicazione del virus dell'influenza Bischofberger N. W. et al. nel brevetto US 5,952,375 (domanda US 08/606,624 presentata il 26 febbraio 1996) presenta nuovi composti inibitori della NA. Gli autori Babu Y.S. et al. (29) e la Pubblicazione internazionale WO 99/33781 (domanda internazionale PCT/US98/26871, pubblicata l'8 luglio 1999) presentano una serie di altri composti definiti inibitori specifici della NA. Tutti i più recenti antivirali, inibitori della NA, quali ad esempio zanamivir, oseltamivir, peramivir, laninamivir sono composti analoghi dell'acido sialico e quindi possono competere con il solo meccanismo di inibizione della NA virale di alcuni ceppi del virus influenzale tipo A, ma non sono né possono essere impiegati per trattare il virus influenzale di tipo B né altre malattie virali. Così pure non pare che il loro impiego sia stato allargato ad altri microorganismi monocellulari.

Allo stesso modo, Ã ̈ oggi pratica medica comune, come descritto nella ben nota pubblicazione Martindale 33. ma Ed. (2002) pagine 639-43 (30), abbinare in soggetti umani affetti da altre patologie virali la simultanea somministrazione di analoghi di nucleosidi purinici, quali la ribavirina o la viramidina, con una citochina, quale ad esempio l'interferone alfa-2b (oppure l'interferone alfa-2 a oppure alfa-2b pegilato) nel trattamento dell'infezione cronica da HVC. Si ritiene, infatti, che la ribavirina monofosfato e simili derivati inibiscano la sintesi e la concentrazione intracellulare di guanosina monofosfato, mentre il sale trifosfato interferisce con mRNA-guanililtransferasi.

Come nei casi dianzi descritti, la trasmissione virale avviene in genere con l'interazione tra recettori di superficie presenti sulla superficie della cellula ospite, per lo più glicani contenenti SA e la glicoproteina HA, e su questo caratteristico meccanismo gli scienziati stanno concentrando i loro sforzi per modificare oppure interrompere il processo di trasmissione e di replicazione virale. Un analogo meccanismo sta anche alla base della replicazione dei flavivirus, con la differenza che parrebbe che i recettori di superficie delle cellule ospite sono molteplici e non compiutamente identificati. Invero, però, anche per i flavivirus l'interazione molecolare fra la superficie del vìrione ed il recettore della cellula ospite à ̈ il primo passo per l'aggressione. Questo fattore riguarda le specie virali e lo specifico tropismo cellulare, come pure la virulenza. Infatti i recettori cellulari per alcuni virus sono stati definiti e presentano diverse strategie di adesione virale, che vanno dal legame con specifiche proteine della superficie cellulare all'interazione con radicali di carboidrati largamente presenti nelle cellule ospiti, quali l'acido sialico e l'eparano solfato.

Per un gran numero di virus non sono stati identificati gli specifici recettori della cellula ospite. L'utilizzo di multipli recettori in cellule specifiche oppure topologicamente diverse potrebbe essere alla base di questa mancata conoscenza. Lo stesso meccanismo é stato infatti proposto per il sistema di attacco dei flavivirus (31). Molti flavivirus si riproducono nelle cellule dei vertebrati e degli artropodi e mostrano un gran numero di varietà e di tropismo tissutale. Numerose proteine, potenziale candidato recettore con massa molecolare da 40 a 80 kDa, sono state messe in relazione ai flavivirus nei saggi di interazione (32)(33)(34)(35)(36). Inoltre é stato dimostrato un importante ruolo dell'eparano solfato nell'aggancio del Dengue-2 virus alle cellule dei vertebrati (31).

E' molto interessante come i glucosaminoglicani (GAGs) sono utilizzati anche da altri virus come molecole di interazione in un processo che si ritiene concentri le particelle virali sulla superficie cellulare per il successivo legame a recettori ad alta affinità (37).

Ciò nonostante, al momento non esiste alcune prova sperimentale sulla funzione e sulla natura di un recettore ad alta affinità per ciascuno dei flavivirus.

L'aggancio dei flavivirus e l'entrata sono mediati dall'involucro della proteina E (~50 kDa), la maggiore particella glicoproteica del flavivirus (per la recensione, vedere pubblicazioni a cura di Chambers T. J. et al. (38) e di Monath T.P. et al. (39)

La proteina E forma un oligomero con la piccola proteina M (~8 kDa) della membrana e costituisce la maggior parte della superficie accessibile del virione. Ciò fa sì che la proteina E costituisca in prevalenza l'antigene bersaglio per neutralizzare il virus e degli anticorpi protettivi. Al riguardo vedere il dianzi citato articolo di Monath T.P. et al. "Flaviviruses." (39).

La definizione della struttura cristallina deH'ectodominio della proteina E del flavivirus dell'encefalite virale originata da zecca (TBE) (40) in combinazione con le analisi fenotipiche delle varianti della proteina E, ha fatto luce sui domini funzionali e sui meccanismi implicati nell'aggancio e nell'entrata dei flavivirus (ancora vedere il dianzi citato articolo di Monath T.P. et al. "Flaviviruses. "(39) .

Una ricerca sui cambi genotipici associati all'adattamento alla cellula ospite del flavivirus encefalitico Murray Valley encefalite virus (MVE) ha suggerito un ruolo importante del residuo 390 nella proteina E sul tropismo cellulare e sulla virulenza (41).

L'Asp 390 trovato nel virus prototipo era stato modificato nella His, Gly, Ala, oppure Asn dopo passaggio del MVE su di una linea cellulare di adenocarcinoma umano (SW13), portando ad un incremento di crescita nella linea cellulare umana e così pure una attenuazione della virulenza nel topo. Il residuo 390 nella proteina E del MVE é parte di una sequenza Arg-Gly-Asp (RGD), importante mezzo di aggancio della integrina nella matrice extra-cellulare esterna e nella adesione cellula-cellula (42).

Questa evidenza ha confortato la prima proposta per la locazione del sito del legame del recettore del flavivirus in un dominio ben protetto ed idrofilo, che comprende il residuo 390, con un possibile ruolo delle integrine nell'aggancio di alcuni flavivirus (42). Inoltre, il mezzo RDG non é riscontrabile all'interno della proteina E di tutti i flavivirus: é riscontrabile nel virus dell'encefalite giapponese (JEV) (43), virus della febbre gialla (YFV) ceppo 17D (44) e le relazionate sequenze RGE/T in altri membri del siero complesso JEV (45)(46)(47), ma i corrispondenti aminoacidi nella proteina E del virus Dengue non sono relazionati (48)(49)(50) e cancellati nella TBE (51). In modo intrigante, la sequenza RGD nel vaccino del ceppo 17D del YFV (46) é comparsa come conseguenza dell'adattamento della cellula ospite della varietà virulenta Asibi, che presenta i corrispondenti aminoacidi Thr-Gly-Asp (52).

Sulla scorta di questi raffronti delle sequenze, é inverosimile che le integrine costituiscano un recettore generale per l'aggancio dei flavivirus, in contrasto con il virus dell'afta epizootica (53)(54) e del coxakievirus (55), che mostra una stretta dipendenza dal legame integrina RGD-mediato per entrare nella cellula ospite.

La struttura cristallina della proteina E del TBE depone decisamente a favore di una funzione nel recettore legante della regione idrofila che protegge il mezzo RGD di alcuni flavivirus. Questa sequenza si trova in un anello esposto al solvente (FG) situato neN'immonoglobulina-simile dominio III della proteina E, e le mutazioni che interessano il tropismo della cellula ospite e la virulenza nei diversi flavivirus sono locate in questa regione (56). Alcuni autori hanno infatti osservato che introducendo sostituzioni alla porzione RDG in MVE con l'uso di un clone infettivo, il dominio che lega il recettore nel flavivirus putativo producendo effetti nella crescita virale, adesione ed entrata nelle cellule culturali e virulenza nel topo.

Per avere una migliore recensione bibliografica al riguardo, si possono consultare numerose altre pubblicazioni (56)(33)(57)(58)(59).

Oggetto dell'invenzione

Il principale oggetto dell'invenzione à ̈ di rendere disponibile una nuova classe di composti che presentano un notevole effetto inibitorio sui virus, in particolare sui virus dell'influenza, dell'epatite e di altre gravi patologie virali, in particolare anche quelle che implicano il coinvolgimento dell'acido sialico (SA), come ad esempio quelle sostenute da flavivirus. I nuovi composti esercitano un'inibizione combinata e selettiva delle proteine enzimatiche dell'involucro virale, quale la HA, e di proteine virali strutturali, come la proteina M2, e degli enzimi glicolitici, come la NA, più in particolare un'interferenza con le neuramminidasi virali, batteriche e di molti altri microorganismi che infettano l'uomo e gli animali. I nuovi composti dell'invenzione esercitano anche un'attività inibitoria sul virus dell'epatite di tipo C (HVC) e su vari tipi di flavivirus. Un altro aspetto desiderato dell'invenzione à ̈ quello di fornire inibitori migliori e meno costosi dei processi di moltiplicazione e di trasmissione dei più comuni virus responsabili di gravi infezioni, senza presentare una resistenza crociata verso gli antivirali abitualmente utilizzati. E' ancora un ulteriore obiettivo quello di fornire dei metodi migliori per la somministrazione dei nuovi inibitori dell'invenzione oppure delle loro combinazioni razionali con altri noti agenti antivirali. Un aspetto aggiuntivo à ̈ quello di fornire composizioni farmaceutiche utili a detti scopi. Questi ed altri obiettivi saranno più evidenti all'esperto del settore dalla valutazione dell'invenzione nel suo insieme.

Breve descrizione dell'invenzione

In un aspetto principale l'invenzione riguarda un composto caratterizzato dalla formula generale (I), come di seguito indicata:

( I )

dove nella struttura chimica della formula generale ( I ) :

X raffigura un legame -O- oppure -CH2- ; e

R raffigura -H oppure un gruppo alchilico lineare o ramificato da 1

a 4 atomi di carbonio;

rappresenta -(NH)n-(CH2)m<_>(T), dove in modo indipendente n = l oppure 2 ed m = 0, 1, 2, 3 e 4, -NH-CO-NH-(T) oppure

-NH-C(NH)-NH-(T), dove la porzione -(T), é contraddistinta da un anello avente una qualsiasi delle strutture qui di seguito riportate:

(T-l)

• dove nella struttura chimica della porzione (T-l) :

- R<5>rappresenta -H , -CH3 , -C2H5 , -CH-(C2H5)2; e

- R<6>rappresenta -IMH-CO-CH3 , -IMH-CO-C2H5 ; e

- R<7>rappresenta -0-CH-(CH3)2, -0-CH-(C2H5)2 ; • dove nella struttura chimica della porzione (T-4) :

- Z rappresenta -H , -CH-(C2H5)2, -CO-(CH2)6~CH3

R<2>rappresenta -OH , -NH2, -0-CH-(C2H5)2, -NH-CO-CH3, -NH-CO-

CH2-OH , -NH-CO-C2H5, -NH-C(NH)NH2; e

R<3>rappresenta -OH , -NH2, -NH-CO-CH3, -NH-CO-CH2-OH , -NH-

CO-C2H5, oppure -NH-C(NH)NH2;

4

R rappresenta -CHOH-CHOH-CH2-OHf-(W) , -CHOH-CH2-( W)

oppure -CH2-(W), dove la porzione -(W), é

contraddistinta da un anello avente una qualsiasi delle strutture qui di seguito riportate:

(W-1)

dove nella struttura chimica della porzione (W-1) :

- R rappresenta un legame costituito da:

-NH- , -CH2-IMH- , -CH(CH3)-IMH- , -NH-CH(CH3)-NH- , -C(CH3)2-CH2-NH- ,

-NH-CO-CH2-O-CH2-CH2-NH- oppure da

N

oppure da

9

- R rappresenta -H , -CH3 or -C2H5 ; e

- R<10>rappresenta -H , -CH3 or -C2H5 ; oppure

(W-2)

D<1 1>

HO·

OH OH

• dove nella struttura chimica della porzione (W-2):

- R<11>rappresenta un legame costituito da :

-NH-, -CO-NH- oppure -C(NH)-NH- ;

ed i loro lineari o ramificati Ci-4carbossi-mono o poli-esteri, sali di addizione, solvati, enantiomeri separati e i diastereoisomeri purificati.

Un'altra realizzazione l'invenzione riguarda un composto oppure una composizione farmaceutica contenente un composto dell'invenzione, solo oppure in associazione con uno o più composti dell'invenzione stessa oppure con altri conosciuti, che include inoltre un veicolo accettabile per uso farmaceutico utile per la somministrazione della composizione.

In un'altra ulteriore realizzazione il composto dell'invenzione é in grado di inibire una o più fasi in cui l'emoagglutinina e/o il canale ionico M2e/o la neuramminidasi del microorganismo attaccano la cellula ospite, con un metodo che consiste nel passaggio di trattare un campione sospettato di contenere HA e/o INA e/o la proteina M2con un composto oppure con una composizione dell'invenzione.

Un ulteriore aspetto di questa invenzione à ̈ un metodo per trattare o prevenire i virus, in particolare il virus dell'influenza oppure le infezioni da epatite virale, in un ospite che consiste nella somministrazione all'ospite, mediante una qualsiasi via di somministrazione adatta allo scopo, di una dose terapeutica efficacie di un composto attivo antivirale qui descritto. Inoltre, in altra realizzazione il composto dell'invenzione possiede attività anche nei confronti di altri microorganismi, per cui é molto utile per trattate le infezioni miste sostenute da batteri e da virus, ma anche per trattare altre patologie virali di cui sono responsabili i flavivirus, e mostra una potenziale attività anche nei confronti di altri microrganismi monocellulari e protozoi che utilizzano analogo meccanismo per infettare la cellula ospite dei mammiferi.

In altre realizzazioni dell'invenzione, sono anche forniti nuovi metodi per la sintesi dei composti di codesta invenzione.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

I composti della presente invenzione escludono quei composti conosciuti alla data che potrebbero risultare da alcune sue combinazioni, anche se rientrano fra le realizzazioni e costituiscono scopo dell'invenzione quei metodi che usano come intermedi degli altri composti o porzioni dei medesimi già conosciuti oppure quei composti dell'invenzione che contengono modeste porzioni di molecole conosciute per possedere una certa attività virale.

In una realizzazione principale la presente invenzione riguarda composti di formula di struttura (I) avente la seguente configurazione:

( I )

dove X dell'anello principale della formula generale ( I ) rappresenta un

ponte di ossigeno -O- oppure metilenico -CH2- , essendo preferibile il legame -O- in quanto il risultante composto chimerico dell'invenzione presenta maggiore affinità con l'acido sialico dei glicani sialilati della membrana cellulare delle cellula ospite, con il quale interagisce la glicoproteina emoagglutinina (HA) e la neuramminidasi (NA) virale, batterica o protozoaria.

In un'altra realizzazione dell'invenzione é preferibile che R é -H in quanto é preferibile che il gruppo carbossilico sia libero di interagire con le glicoproteine tipiche della HA e della NA. In un'altra realizzazione alternativa é preferibile che il carbossile di R é protetto da un gruppo alchilico, metilico oppure meglio etilico, in quanto l'estere risultante é facilmente idrolizzabile ed in certe condizioni libera quindi il gruppo carbossilico.

In un'altra realizzazione dell'invenzione R<1>il gruppo alchilamminico -(NH)n-

(CH2)m-(T) é tipicamente caratterizzato da un semplice gruppo amminico

costituito dalla porzione -NH-(T), essendo preferibile un legame amminico secondario fra il carbonio in posizione 2 dell'anello principale (I) ed il carbonio in posizione 4 della porzione -(T). Inoltre questa porzione di R<1>é

rappresentata da un gruppo ammidico -NH-CO-NH-(T) oppure guanidinico

-NH-C(NH)-NH-(T), essendo la porzione -(T) contraddistinta da un anello avente una qualsiasi delle strutture qui di seguito meglio dettagliate.

Infatti, in una ulteriore realizzazione dell'invenzione (T), é un anello penta oppure esaciclico , che si lega al nucleo principale della formula generale (I), utilizzando appunto uno dei legami amminico, alchilamminico, ammidico o guanidinico dianzi descritti, tipicamente caratterizzato da una delle seguenti strutture chimiche (T-l), (T-2) , (T-3) e (T-4).

In una tipica realizzazione dell'invenzione (T) é costituito dalla porzione (T-l) che presenta la seguente formula di struttura e sostituenti:

(T-l)

nella quale in modo individuale, R é costituito da -H oppure da un gruppo alchilico costituito, in ordine di importanza scalare, da -H , -CH3, -CH-(C2H5)2 , oppure di preferenza da -C2H5, mentre tipicamente R<6>é -NH-CO-CH3 oppure -NH-CO-C2H5 ed R<7>é -0-CH-(C2H5)2oppure -O-CH-(CH3)2 ■ La realizzazione più tipica dell'invenzione é quando (T-l) presenta la combinazione nella quale R<5>é -C2H5tR<6>é -NH-CO-CH3 ed R<7>rappresenta -0-CH-(C2H5)2.

In una successiva realizzazione dell'invenzione (T) é costituito da (T-2), un anello esaciclico parzialmente sostituito tipicamente caratterizzato dalla seguente formula di struttura:

(T-2)

In una ulteriore preferita realizzazione la porzione (T) é costituita da (T-3) , un anello pentaciclico parzialmente sostituito caratterizzato dalla seguente formula di struttura:

(T-3)

In una ulteriore tipica realizzazione dell'invenzione la porzione (T) é costituta da un anello esaciclico (T-4) parzialmente sostituito caratterizzato dalla seguente formula di struttura e sostituenti:

nella quale Z rappresenta un atomo di idrogeno (-H) oppure -CH-(C2Hs)2oppure ancor più tipicamente il radicale -CO-(CH2)6~CH3 dando così origine ad un estere.

In un'altra realizzazione tipica dell'invenzione R é -OH, ma può essere anche un radicale amminico, come ad esempio -NH2, ma anche altri radicali fra i quali, a mero titolo di esempio e quindi on limitativo, sono preferibili -NH-CO-CH2-OH, -0-CH-(C2H5)2, -NH-CO-CH3 , -NH-CO-CH2-OH , -NH-CO-C2H5 oppure -NH-C(NH)NH2, ciò anche in relazione alle sostituzioni presenti negli altri carboni prossimali dell'anello.

In un'ulteriore tipica realizzazione R e costituito da -NH-CO-CH3,in quanto questo radicale é presente anche nello SA, essendo l'anello principale del composto dell'invenzione una copia chimerica. E' inoltre tipico dell'invenzione che R e un radicale amminico che, a titolo di esempio non limitativo, é -NH2, -NH-CO-CH2-OH, -IMH-CO-C2H5, -NH-C(NH)NH2oppure é un gruppo ossidrilico -OH.

In un'altra realizzazione tipica del'invenzione R<4>e -CHOH-CHOH-CH2-OH , ma in genere à ̈ tipicamente preferibile quando R rappresenta invece una porzione di maggiore peso molecolare, quale ad esempio non limitativo, la porzione -CHOH-CH2-W oppure -CH2- W o anche solo - W , dove W é tipicamente costituito da costituito da un legame di natura amminica oppure ammidica, che lega la struttura principale (I) al nucleo dell'adamantano (W-l), tipicamente sostituito nelle sue varie sue parti, oppure al nucleo ribofuranosil-l,2,4-triazolico (W-2). Una tipica realizzazione dell'invenzione prevede meglio che W sia di preferenza costituita dal nucleo W-l dell'adamantano, contraddistinta dalla seguente struttura e sostituenti

( W-l )

Q

dove R é tipicamente costituito da un legame amminico, come per esempio non limitativo, -NH- , -CH2-NH- , -CH(CH3)-NH- , -NH-CH(CH3)-NH- , -C(CH3)2-CH2-NH- , -IMH-C0-CH2-0-CH2-CH2-NH- oppure da ammine alifatiche cicliche quali, quali sono ad esempio gli anelli :

oppure

In una realizzazione tipicamente preferibile i sostituenti R<9>e R<10>di W-l sono simmetricamente uguali, costituiti da -H , -CH3or -C2H5.

La realizzazione più tipica dell'invenzione é quando (W-l) presenta la combinazione nella quale R<8>é costituita da -CH2-NH- ed R<9>e R<10>sono entrambe costituiti da un atomo di idrogeno (-H).

In una ulteriore realizzazione dell'invenzione W é tipicamente costituito da un nucleo ribofuranosil-l,2,4-triazolico (W-2), contraddistinta dalla seguente struttura e sostituenti:

OH OH

dove R<11>é tipicamente costituito da un legame amminico costituito di preferenza da -NH- oppure, per esempio non limitativo, da -CO-NH-oppure -C(NH)-NH- .

In un'altra tipica realizzazione il composto dell'invenzione é bi sostituito dove la porzione (T) rappresenta la porzione (T-l) nella quale é presente

in modo simultaneo la combinazione secondo la quale R<5>é -C2H5R<6>é -

NH-CO-CH3 ed R<7>é -0-CH-(C2H5)2e la porzione (W) à ̈ rappresentata la

porzione (W-l) nella quale, in modo simultaneo, R<8>é -NH- ed R<9>ed R<10>sono entrambe costituiti da una atomo di idrogeno.

Sorprendentemente, in un'altra tipica realizzazione della presente invenzione l'attività della emoagglutinina ed anche quella della neuramminidasi e/o del canale ionico regolato dalla proteina M2à ̈ inibita o bloccata da un metodo che consiste nel trattare un campione virale sospettato di contenere neuramminidasi e/o la proteina M2con un composto oppure con una composizione dell'invenzione. Un'altra sorprendente realizzazione di questa invenzione riguarda un metodo di trattamento o di profilassi dei virus, in particolare i ceppi A e B del virus influenzale oppure del HVC, o di alcune affezioni dei mammiferi consistente nel somministrare all'ospite infettato attraverso un'idonea via di somministrazione una dose terapeutica efficace di un composto con l'amplia attività dianzi descrìtta. In modo inaspettato e sorprendente un composto oppure una composizione dell'invenzione parrebbe in grado di inibire o bloccare l'attività dell'enzima glicoproteico emoagglutinina ed anche della neuramminidasi di altri microorganismi, in particolare batteri e protozoi, che per aderire ed infettare la cellula ospite si legano all'acido sialico dei peptidoglicani che ricoprono la membrana della cellula bersaglio.

In un'altra realizzazione vengono altresì descritti alcuni dei metodi generali di produzione dei composti dell'invenzione. I composti sono preparati con una qualsiasi tecnica di sintesi organica, che sono già note agli esperti del settore. Per la preparazione generale dei composti preferiti dell'invenzione, oltre al metodo di cui all'esempio, sono in via di perfezionamento altri metodi di sintesi più specifici che dovrebbero permettere di migliorare la resa degli stessi e che saranno oggetto di una successiva domanda. Tuttavia, un esperto dell'arte deve ammettere che sono disponibili altre procedure standard per ottenere i medesimi materiali dell'invenzione di cui alla formula generale dianzi rivendicata.

Inoltre sono oggetto della presente invenzione le composizioni farmaceutiche, da somministrare nei mammiferi, contenenti un composto rivendicato solo od in associazione con un altro composto dell'invenzione o con uno od anche più prìncipi attivi in un veicolo accettabile per l'uso farmaceutico. Un'ulteriore caratteristica della presente invenzione riguarda un metodo per il trattamento delle suddette malattie aventi origine virale, batterica, oppure mista, e plasmodica, combinando un trattamento nei mammiferi con un composto o con una composizione farmaceutica comprendente detto composto dell'invenzione od una miscela degli stessi con un trattamento simultaneo od alternato con una dose terapeutica efficace di un altro principio attivo inibente anch'esso detta infezione virale, batterica e plasmodica.

I composti dell'invenzione riguardano anche gli isomeri ottici arricchiti o risolti in ogni singolo oppure in tutti gli atomi asimmetrici.

Entrambe le miscele racemiche che diasteromeriche, così come gli isomeri ottici isolati o sintetizzati, per lo più liberi dagli altri loro corrispondenti enantiomeri o diasteromeri, ricadono tutti entro lo scopo dell'invenzione. Le miscele racemiche sono separate nei loro singoli isomeri ottici, pressoché puri, attraverso le tecniche ben note, come per esempio, la separazione di sali diasteromerici che si formano con otticamente attivi, quali acidi oppure basi, con la successiva riconversione a sostanze otticamente attive. In molti casi, l'isomero ottico desiderato à ̈ sintetizzato mediante reazione stereospecifiche, che iniziano con appropriati stereoisomeri del materiale di partenza desiderato.

Le composizioni dell'invenzione comprendono in modo opzionale anche i sali dei composti descritti, specialmente sali atossici accettabili per uso farmaceutico, contenenti ad esempio acidi o basi organiche od inorganiche. La salificazione à ̈ una procedura preferibile quando sono richiesti sali idrosolubili dei composti oppure quando occorre migliorare la stabilità dei composti dell'invenzione.

Sorprendentemente, un altro aspetto dell'invenzione riguarda i metodi per inibire in particolare l'attività della emoagglutinina ed anche quella della neuramminidasi virale ed in minor misura quella anche della proteina M2 che comprende la fase di trattamento di un campione sospettato di contenere emoagglutinina e/o neuramminidasi e/o proteina M2 con un composto dell'invenzione. Si ritiene che i composti dell'invenzione agiscano come inibitori della emoagglutinina e/o neuramminidasi e/o proteina M2, come intermedi chimerici per questi inibitori oppure di possedere altre attività qui di seguito descritte. Infatti, gli inibitori si andranno a legare a quei siti sulla superficie oppure in una cavità della emoagglutinina e/o della neuramminidasi e/o della proteina M2in quanto hanno una struttura geometrica identica a dette glicoproteine infettanti. Inoltre, i composti che legano la emoagglutinina e/o la neuramminidasi e/o la proteina M2 possono legarsi con diversi gradi di reversibilità.

Quei composti che si legano in modo praticamente irreversibile sono candidati ideali per essere utilizzati in questo metodo dell'invenzione. Organismi che contengono la emoagglutinina e la neuramminidasi includono batteri (Haemophilus influentiae, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae, Clostridium perfringens, e Arthrobacter sialophilus) e virus , quali gli ortomixovirus oppure i paramixovirus come il virus dell'influenza A e B, il virus parainfluenzale, il rinovirus, i coronavirus, i flavivirus (HVC e quelli responsabili della febbre gialla e della febbre Dengue), i coronavirus mutanti e/o coronavirus modificati, i polyomavirus, il virus della parotite, il virus del morbo di Newcastle, il virus della peste aviaria, e virus di Sendai ed infine parassiti monocellulari, come quello della malaria e della tripanosomiasi. L'inibizione dell'attività della neuramminidasi ottenuta ed evidenziata in qualsiasi di questi organismi rientra negli obiettivi della presente invenzione. I composti dell'invenzione sono inoltre utili nel trattamento oppure nella profilassi di dette infezioni nei volatili, quali ad esempio uccelli, anitra ed oca, e nei mammiferi, quali roditori, maiale e uomo. In un'ulteriore realizzazione, i composti dell'invenzione vengono valutati per loro attività inibitoria nei confronti della emoagglutinina e/o neuramminidasi virale mediante tecniche convenzionali per valutare l'attività enzimatica. E' inoltre un obiettivo dell'invenzione che i composti, in primo luogo, siano valutati per l'inibizione della emoagglutinina e/o neuramminidasi in vitro Un altro aspetto dell'invenzione riguarda i metodi per bloccare il flusso all'interno di ioni H<+>attraverso il canale ionico della proteina M2, inibendo la formazione della copertura e il rilascio di ribonucleoproteine libere nel citoplasma che include anche la fase di trattamento con un composto dell'invenzione di un campione sospettato di contenere una proteina M2, come il ceppo A del virus dell'influenza. Infatti si ritiene che in composti dell'invenzione possano bloccare anche le funzioni della proteina M2virale.

Un ulteriore aspetto dell'invenzione riguarda metodi di inibizione della sintesi della guanosina monofosfato e della mRNA-guanililtransferasi, che blocca la sintesi di mRNA e della RIMA polimerasi del HVC, trattando un campione sospetto con un composto dell'invenzione. In un'altra realizzazione preferita, si ritiene che composti dell'invenzione, bi-sostituiti in modo differente, possano agire allo stesso tempo come inibitori della neuramminidasi e del canale ionico protonico M2.

Similarmente analogo effetto inibitorio si manifesta nei confronti dell'emoagglutinina e/o neuramminidasi che viene esposta da parassiti monocellulari, come il protozoo della malaria, della tripanosomiasi e della leishmaniosi.

A conferma della sorprendente attività antivirale vengono riportati i risultati di uno studio di valutazione in vitro dell'attività antivirale del composto dell'invenzione [amantadina-C7Neu 5Ac-C16H27N2C>4] , di cui all' Esempio 7, contraddistinto dal codice THE 08/01, nei confronti di ceppi di virus influenzali di tipo A e B.

Di seguito si riporta l'estratto dello studio di attività antivirale.

Disegno dello studio

Il disegno dello studio prevedeva la valutazione della attività antinfluenzale su un isolato di virus influenzale A/H1N1 e su un isolato virale A/H3IM2 ed uno di tipo B.

Materiali e Metodi

1. Propagazione e titolazione dei virus influenzali

I ceppi di virus influenzali A/H3IM2 (A/Panama/2007/99), A/H1N1 (A/New Caledonia/20/99) e B (B/Parma/1/07) sono stati propagati in linee cellulari permissive MDCK ( Madin-Darby Canine Kidney ). In breve, i virus influenzali sono stati inoculati su un monostrato confluente di cellule MDCK ed incubati a 37° C, 5 % CO 2, per 5 giorni. Il surnatante à ̈ stato quindi raccolto e titolato. La determinazione del titolo à ̈ stata condotta mediante saggio di formazione delle placche (Plaque Assay, PA ). In particolare, diluizioni seriali in base 10 di ciascun isolato virale sono state inoculate su un monostrato confluente di cellule MDCK in piastre a 12 pozzetti. Dopo incubazione per 1 h a 37° C, 5 % CO 2, l'inoculo virale à ̈ stato rimosso ed à ̈ stato aggiunto il medium d'infezione (MEM contenente 10 pg/ml tripsina, 2% agar). Dopo 3 giorni d'incubazione a 37° C, 5 % CO 2, i monostrati cellulari sono stati fissati con una soluzione di glutaraldeide 5 % e, in seguito alla rimozione dell'agar, sono stati colorati con una soluzione di carbol-fucsina 5 %. Le placche sono state contate visualmente e il titolo dell'isolato à ̈ stato espresso come numero di unità formanti placca ( Plaque Forming Unit, PFU ) per mi (PFU/ml).

2. Valutazione dell'attività antivirale dei composti in studio

2.1. Preparazione dei composti in analisi

Il composto THE 08/01 à ̈ stato opportunamente ricostituito in acqua sterile distillata ad una concentrazione di 100 mM. In seguito, sono state allestite diluizioni seriali, in base 10, di ciascun composto in un intervallo da 0,01 Î1⁄4Îœ a 100 pM.

2.2. Saggio di riduzione di placca ( Plaque Reduction Assav, PRA) Monostrati confluenti di cellule MDCK, coltivate in piastre da 12 pozzetti (IO<5>cellule/ml), sono stati infettati con circa 50 PFU/ml di ogni isolato virale (A/H3N2, A/H1N1 e B). Dopo un'incubazione di 1 h a 37° C, 5 % C02, per permettere l'adsorbimento virale, l'inoculo virale à ̈ stato rimosso ed i monostrati cellulari sono stati lavati due volte con medium di coltura MEM. Ad ogni pozzetto à ̈ stato aggiunto un overlay-medium (10 pg/ml tripsina, 2% agar in MEM) contenente diluizioni seriali (intervallo: 0,01 Î1⁄4Îœ -100 mM) dei composti in analisi. La prova à ̈ stata condotta in duplicato e contemporaneamente à ̈ stato allestito un controllo di reazione non contenente il composto antivirale. Le colture sono state quindi incubate a 37° C, 5 % CO 2, per 3 giorni. In seguito, i monostrati cellulari sono stati fissati con una soluzione di glutaraldeide 5 %, ed incubati per almeno 3 h a temperatura ambiente per favorirne la penetrazione nell'agar. Dopo rimozione dell'agar, i monostrati cellulari sono stati colorati con una soluzione di carbol-fucsina 5 %. Le placche sono state contate visualmente e il grado dell'inibizione di placche à ̈ stato calcolato in relazione ai controlli non contenenti i composti in studio. È stata quindi determinata la concentrazione di composto necessaria per ridurre il numero di placche del 50 % rispetto al controllo senza composto (EC50). A tale scopo sono state costruite curve dose-risposta mediante il software bìostatistico GraphPad Prism.

3.0 Risultati

THE 08/01 ha presentato attività antivirale nei confronti dei virus influenzali sia di tipo A sia di tipo B analizzati. Le curva dose-risposta del composto THE 08/01 nei confronti dei tre virus influenzali analizzati sono descritte da funzioni sigmoidali rappresentate nelle Figure 1, 2 e 3. La costruzione di queste curve ha permesso di estrapolare gli EC50, ed i relativi intervalli di confidenza (95% CI).

In particolare:

EC50 THE 08/01 vs A/H1N1: 9,9 Î1⁄4Îœ (95% CI: 4,5-21,5 Î1⁄4Îœ);

EC50 THE 08/01 vs A/H3N2: 15,4 Î1⁄4Îœ (95% CI: 2,5-95,8 Î1⁄4Îœ);

EC50 THE 08/01 vs B: 125,5 Î1⁄4Îœ (95% CI: 7,8-2014 Î1⁄4Îœ),

come illustrato rispettivamente nella Figura 1, Figura 2 e Figura 3.

4.0 Conclusioni

I risultati ottenuti dalle prove effettuate permettono di trarre le seguenti considerazioni: THE 08/01 ha mostrato attività antivirale sia nei confronti dei virus influenzali di tipo A sia di quelli di tipo B. L'attività antivirale à ̈ risultata 10 volte più elevata nei confronti dei virus di tipo A rispetto a quelli di tipo B.

Sorprendentemente infatti il composto dell'invenzione oltre che essere molto attivo nei confronti di virus A e B, pare mostrare una buona attività anche sul ceppo A/H1N1-275Y resistente all'oseltamivir. I relativi test antivirali sono in corso ed i risultati saranno disponibili a breve.

I composti dell'invenzione sono formulati con veicoli ed eccipienti convenzionali, che verranno selezionati in accordo alla pratica ordinaria. Le compresse conterranno eccipienti, sostanze per aumentare la scorrevolezza, riempenti, leganti e simili. Le formulazioni acquose sono preparate in forma sterile e, quando destinate ad un uso diverso dalla somministrazione orale, saranno in generale isotoniche. Tutte le formulazioni conterranno in modo opzionale eccipienti come quelli descritti nella nota pubblicazione "Handbook of Pharmaceutical Excipients" , 4. a Edizione, Rowe R.C. et al, Pharmaceutical Press (2003). Gli eccipienti comprendono acido ascorbico e altri antiossidanti, agenti chelanti come EDTA, carboidrati come la destrina, idrossialchìcellulosa , l'idrossialchilmetilcel luiosa, l'acido stearico e simili.

Uno o più composti dell'invenzione (qui di seguito indicati come principi attivi) possono essere somministrati attraverso una qualsiasi via di somministrazione appropriata alla condizione che deve essere trattata. Adeguate vie di somministrazione comprendono la via orale, rettale, nasale, topica (che include la transbuccale e sottolinguale), vaginale e parenterale (che include la sottocutanea, intramuscolare, endovenosa, intradermica, intratecale ed epidurale), e simili. Sarà ancor più opportuno che la via di somministrazione prescelta sia selezionata ad esempio in base alla condizione di chi la riceve. Un vantaggio dei composti dell'invenzione à ̈ che essi sono biodisponibili per via orale e che possano essere dosati come forme farmaceutiche orali; à ̈ possibile, ma non à ̈ necessario, somministrare gli stessi per via polmonare o nasale.

Sebbene sia possibile somministrare i principi attivi tal quali, à ̈ preferìbile che siano resi disponibili come formulazioni farmaceutiche.

Entrambe le formulazioni dell'invenzione per uso veterinario e per uso umano, contengono almeno un principio attivo, come dianzi definito, assieme ad uno o più sostanze veicolanti accettabili e quindi eventualmente altri ingredienti terapeutici. La(e) sostanza(e) veicolante(i) deve(ono) essere "accettabile(i)" nel senso che deve(devono) essere compatibile(i) con gli altri ingredienti della formulazione e quindi fisiologicamente innocua(e) per il ricevente. Per formulazioni si intendono quelle adatte per le vie di somministrazione previste. Le formulazioni possono essere idoneamente presentate in unità di dosaggio e possono essere preparate per mezzo di qualsiasi metodo ben noto nell'arte della farmaceutica. Le tecniche e le formulazioni sono in genere descritte in " Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., U.S.A.. Questi metodi comprendono la fase di associare il principio attivo con il veicolo che costituisce uno o più ingredienti accessori. In genere, le formulazioni sono preparate in modo da associare in modo uniforme ed intimo il principio attivo con veicoli liquidi oppure veicoli solidi finemente polverizzati oppure entrambi, ed in seguito, se necessario, dare la forma desiderata al prodotto. Le formulazioni dell'invenzione adatte per la somministrazione orale sono preparate come unità solide, quali capsule, cachets oppure compresse, ciascuna contenente un quantitativo predeterminato di principio attivo; come polvere o granuli; come soluzione o sospensione in un liquido acquoso oppure in un liquido non-acquoso; oppure come emulsione liquida olio in acqua od anche come emulsione acqua in olio. Il principio attivo può anche essere presentato come bolo, come elettuario oppure pasta. Una compressa può essere ottenuta mediante compressione oppure estrusione, in modo opzionale con uno o più ingredienti accessori. Le compresse possono essere preparate per compressione del principio attivo con un idoneo macchinario in una forma scorrevole liberamente, come polvere oppure granulati, mescolate in modo opzionale ad un legante, lubrificante, diluente inerte, preservante, agente di superficie attivo oppure a un disperdente. Le compresse estruse possono essere prodotte modellando con un'idonea apparecchiatura una miscela di principio attivo in polvere umettato con un diluente liquido inerte. Le compresse possono essere indifferentemente rivestite oppure con una linea di prerottura oppure, in modo opzionale, sono formulate per ottenere un rilascio lento o controllato del principio attivo.

Per le infezioni all'occhio o di altri tessuti esterni, per esempio bocca e pelle, si preferisce che le formulazioni siano applicate come unguento oppure crema contenente il(i) principio(i) attivo(i) in una quantità variabile, per esempio, da 0,075 a 20 % w/w, che include il(i) principio(i) attivo(ì) in una percentuale tra 0,1 % ed il 20 % con aumenti di 0,1 % p/p come lo 0,6 % p/p, 0,7 % p/p, e così via, di preferenza da 0,2 al 15 % p/p ed in modo molto più preferibile da 0,5 al 10 % p/p. Quando formulato come unguento, i principi attivi possono essere usati sia con un base paraffinica sia con un base miscibile in acqua. Alternativamente, ii(i) principio(i) attivo(i) può(possono) essere formulato(i) come crema con una base olio in acqua. Se si desidera, la fase acquosa della base della crema può contenere, per esempio, almeno il 30 % p/p di un alcol poliolico, come un alcol con due o più gruppi ossidrilici come glicole propilenico, butan-l,3-diolo, mannitolo, sorbitolo, glicerolo e glicole polietilenico (che comprende il PEG 400) e le loro miscele.

Le composizioni topiche possono comprendere, se si desidera, un composto che aumenta l'assorbimento oppure la penetrazione del principio attivo attraverso la pelle o altre aree colpite Esempi di questi promotori della penetrazione dermica comprendono il dimetilsolfossido ed i corrispondenti analoghi. La fase oleosa delle emulsioni dell'invenzione può essere costituita da ingredienti conosciuti nel modo tradizionale. Mentre la fase può contenere solo un emulsionante (altrimenti conosciuto come un emulgente), à ̈ desiderabile che la miscela contenga almeno un emulsionante come un grasso oppure un olio oppure entrambi un grasso ed un olio. Di preferenza, un emulsionante idrofilo à ̈ mescolato assieme ad un emulsionante lipofilo che funziona da stabilizzante. E' quindi preferibile includere sia un olio che un grasso. Assieme, emusionante(i) con oppure senza stabilizzante(i) costituiscono quello che si chiama cera emulsione, e la cera assieme all'olio ed al grasso formano la così detta base dell'unguento emulsionante che forma la fase oleosa disperdente delle formulazioni in crema. Emulgenti e stabilizzanti dell'emulsione adatti per l'uso nella formulazione dell'invenzione includono Tween<®>60, Span<®>80, alcol cetostearilico, alcol benzilico, alcol miristico, gliceril monostearato e sodio lauril solfato. La scelta di oli oppure grassi adatti alla formulazione viene effettuata in base alle proprietà cosmetiche desiderate. La crema dovrebbe essere preferibilmente un prodotto non grasso, che non macchia e lavabile con una consistenza adatta ad evitare perdite dai tubi oppure da altri contenitori. Possono essere usati esteri alchilici mono oppure bibasici, a catena lineare o ramificate, quali diisoadipato, stearato isocetilico, di-estere glicole propilenico degli acidi grassi di noce di cocco, miristato isopropilenico, decile oleato, palpitato isopropilico, stearato di butile, il 2-etllesile palpitato oppure una miscela di esteri a catena ramificata quali Crodamol CAP, essendo gli ultimi tre gli esteri preferiti. Questi possono essere usati soli oppure associati, ciò dipendendo dalle proprietà richieste. In alternativa possono essere utilizzati lipidi ad alto punto di fusione come la paraffina molle e/o la paraffina liquida oppure altri oli minerali. Formulazioni idonee alla somministrazione topica nell'occhio comprendono anche gocce nelle quali il principio attivo viene sciolto oppure sospeso in un veicolo adatto, in modo speciale un solvente acquoso idoneo per il principio attivo. Il princìpio attivo à ̈ di preferenza presente nelle formulazioni ad una concentrazione compresa tra 0,5 e 20 %, in modo più vantaggioso tra 0,5 e 10 % e meglio se intorno al 2,0 % p/p.

Le formulazioni idonee alla somministrazione topica nella bocca includono losanghe che contengono il principio attivo in una base aromatica, di solito zucchero e gomma di acacia oppure gomma tragacanta; pastiglie che contengono il principio attivo in una base inerte come la gelatina e glicerina, oppure zucchero e gomma acacia; ed anche collutori che contengono il principio attivo in un idoneo veicolo liquido. Formulazioni per la somministrazione rettale si possono presentare come supposta con una base idonea che comprende, per esempio, burro di cacao oppure un salicilato.

Formulazioni idonee alla somministrazione polmonare o nasale presentano una dimensione delle particelle compresa in un intervallo da 0.1 a 500 microni (che comprende dimensioni di particelle in un intervallo tra 0.1 e 500 microni con incrementi di microni a partire da 0.5, 1, 30 microni, 35 microni, e così via), che vengono somministrate per mezzo di una rapida inalazione attraverso la cavità nasale oppure per inalazione attraverso la bocca , in modo da raggiungere i sacchi alveolari.

Formulazioni idonee comprendono anche soluzioni acquose od oleose di principio attivo. Formulazioni adatte per la somministrazione come aerosol oppure come polvere secca sono preparate con i metodi convenzionali e possono essere somministrati assieme ad altre sostanze terapeutiche, quali i composti fino ad ora utilizzati nel trattamento oppure nella profilassi di infezioni da influenza di tipo A o B come qui di seguito descritte.

Formulazioni adatte per la somministrazione vaginale possono presentarsi sottoforma di ovuli, tamponi, creme, geli, paste, spume oppure formulazioni spray che contengono oltre al principio attivo anche quei veicoli che sono conosciuti nell'arte come essere i più idonei allo scopo. Formulazioni idonee per la somministrazione parenterale comprendono soluzioni iniettabili sterili acquose e non-acquose, che possono contenere antiossidanti, tamponi, batteriostatici ed altre sostanze solubili che rendono la formulazione isotonica con il sangue del ricevente; ed anche sospensioni sterili acquose e non-acquose che possono comprendere agenti sospendenti e agenti ispessenti.

Le formulazioni sono presentate in dose unitaria oppure in contenitori multidose, come per esempio fiale oppure contenitori sigillati, e possono essere conservate in una forma di congelamento a secco (liofilizzate), che richiedono solo l'aggiunta del veicolo liquido sterile (solvente), come per esempio l'acqua per iniezione, immediatamente prima dell'uso. Le soluzioni o sospensioni estemporanee per iniezione sono preparate da polveri sterili, granuli e compresse del tipo dianzi descritto.

Le formulazioni di dosaggio unitario preferite sono quelle contenenti una dose giornaliera oppure una frazione di dose unitaria giornaliera, come qui di seguito descritto, oppure una frazione appropriata del principio attivo. E' chiaro che, in aggiunta agli ingredienti qui citati in modo dettagliato, le formulazioni dell'invenzione possono includere altri agenti convenzionali nell'arte aventi, che hanno relazione con il tipo di formulazione in questione, come per esempio quelli idonei alla somministrazione orale possono includere agenti aromatizzanti.

L'invenzione inoltre riguarda composizioni ad uso veterinario comprendenti almeno un principio attivo qui definito insieme ad un veicolo veterinario. I veicoli veterinari sono materiali utili allo scopo di somministrare la composizione e possono essere materiali solidi, liquidi o gassosi che d'altra parte sono inerti oppure accettabili nella pratica veterinaria e che sono compatibili con il principio attivo. Queste composizioni veterinarie possono essere somministrate per via orale, parenterale o per qualsiasi altra via di somministrazione desiderata.

I composti dell'invenzione sono usati per ottenere formulazioni farmaceutiche a rilascio controllato contenente come principio attivo uno o più composti dell'invenzione ("formulazioni a rilascio controllato") nelle quali il rilascio del principio attivo à ̈ controllato e regolato per permettere una minore frequenza di dosaggio oppure per migliorare il profilo farmacocinetico o tossicologico di un dato principio attivo.

La dose efficace di principio attivo dipende in gran parte dalla natura della condizione che deve essere trattata, dalla tossicità, se il composto viene utilizzato in profilassi (dosi più basse) o contro un'infezione attiva di influenza, dal metodo di somministrazione, e dalla formulazione farmaceutica, e sarà determinata dai clinici utilizzando studi convenzionali con dosi scalari. Ci si attende che sia da circa 0,0001 a circa 100 mg/kg peso corporeo al giorno. In generale, da circa 0,01 a circa 10 mg/kg peso corporeo al giorno. In modo più preciso, da circa 0,01 a circa 5 mg/kg peso corporeo al giorno. Ancora meglio, da circa 0,05 fino a circa 0,5 mg/kg peso corporeo al giorno. Per esempio, per inalazione la dose giornaliera prevedibile per un uomo adulto con un peso di circa 70 Kg potrebbe aggirarsi da 1 mg a 1000 mg, di preferenza tra 5 mg e meno di 500 mg, e può essere presa come dose singola o multipla. Quando le condizioni patologiche del soggetto lo richiedono, si possono utilizzare dei maggiori dosaggi terapeutici efficaci.

I prìncipi attivi dell'invenzione sono anche usati in associazione con altri principi attivi. Queste associazioni sono selezionate basandosi sulle condizioni che devono essere trattate, sulle reattività crociate degli ingredienti e le proprietà farmaceutiche dell'associazione. Per esempio, quando si deve trattare un'infezione virale del tratto respiratorio, in particolare un'infezione influenzale, le composizioni dell'invenzione sono associate con antivirali (quali amantadina, rimantadina e ribavirina), mucolitici, espettoranti, dilatatori bronchiali, antibiotici, antipiretici, oppure analgesici. Normalmente, antibiotici, antipiretici ed analgesici sono somministrati assieme ai composti dell'invenzione.

L'invenzione à ̈ stata descritta in modo sufficientemente dettagliato da permettere ad un esperto dell'arte di realizzare ed usare l'oggetto dei seguenti esempi. E' evidente che certe modifiche dei metodi e delle composizioni dei seguenti esempi possono essere realizzate dentro lo scopo e lo spirito dell'invenzione.

ESEMPI

Esempio 1

Preparazione del metil-beta-chetoside del metil estere di Neu5Ac

4,50 g di acido sialico (14,55 mmoli) vengono disciolti in 350 mi di etanolo assoluto e si aggiungono 10.0 g dì resina Dowex 50 (H<+>)* e la sospensione si mantiene in riflusso sotto costante agitazione durante 48 ore. Le determinazioni con resorcinolo-HCI e con acido barbiturico (TBA) provano che alle 24 ed alle 48 ore rispettivamente 85 % ed il 97 % di Neu5Ac é stato trasformato in metil-beta-chetoside. Il campione viene filtrato su carta da filtro e l'eluto si evapora a secco con un essiccatore rotatorio, ottenendosi un liquido oleoso leggermente giallastro, che viene ripreso con un piccolo volume di etere etilico : metanolo (3 : 1 / V/V) e si lascia riposare la soluzione a 4° C durante 24-48 ore. Recuperare la sostanza cristallina così ottenuta per mezzo di filtrazione ed essiccare il prodotto su P2O5. ;Resa: 2.90 g (P.M. 337,4). Il composto ottenuto é positivo alla reazione con resorcinolo-HCI (con la stessa intensità di acido sialico) e negativo alla reazione con TBA. ;;(*) Preventivamente attivare la resina Dovex 50 (H<+>) con 60 mi di una soluzione di acido cloridrico 1,0 M durante 60 minuti a temperatura ambiente. In seguito lavare la resina in modo esaustivo prima con acqua distillata ed in seguito con metanolo.

Esempio 2

Preparazione del metil-beta-chetoside di Neu5Ac per idrolisi alcalina blanda del metil-beta-chetoside del metil estere di Neu5Ac.

2,90 g di metil-beta-chetoside del metil estere di Nau5Ac (8,60 mmoli) vengono disciolti in 200 mi di NaOH 0,06 M e si tiene in incubazione il campione a temperatura ambiente durante 2,5 ore. In seguito si neutralizza y deionizza la soluzione passandola su di una colonna Dowex 50 (H<+>). L'eluto viene successivamente liofilizzato, ottenendosi una polvere biancastra.

Resa: 2,64 g (P.M. 332,4). Il composto ottenuto é positivo alla reazione cori resorcinolo-HCI e negativo alla reazione con TBA.

Esempio 3

Preparazione del metil-beta-chetoside C7-Neu5Ac

La polvere liofilizzata ottenuta nella fase precedente costituita da 2,90 g di metil-beta-chetoside dì Neu5Ac (8,20 mmoli) viene ripresa con 100 mi di acqua distillata aggiungendovi in seguito 214,0 mi di NaI04 (metaperiodato di sodio) 0,2 M (42,8 mmoli). Rapporto molare metilbeta-chetoside di Neu5Ac : NaI04 = 1 : 5,24. Incubare al buio a temperatura ambiente e sotto agitazione continua durante 2 ore. Aggiungere in seguito 260,0 ml di acetato di bario 0,1 M per precipitare lo iodato formatosi ed il periodato in eccesso. Filtrare su carta da filtro. L'eluto viene saturato facendo gorgogliare CO2 per precipitare l'eccesso di acetato di bario. Filtrare di nuovo su carta da filtro. Il filtrato viene liofilizzato, ottenendosi così un solido leggermente giallastro.

Resa: 1,806 g (P.M. 260,24). Il composto ottenuto é positivo alla reazione con resorcinolo-HCI e negativo alla reazione con TBA.

Esempio 4

Preparazione di C7-Neu5Ac

Si ottiene per mezzo di una idrolisi blanda del metil-beta-chetopside di C7-IMeu5Ac. La polvere liofilizzata ottenuta nell'esempio precedente, corrispondente a 7,0 mmoli, viene ripreso in 40 mi di acido formico 2,30 mM pH ~ 4.0 y riscaldato a 80° C durante 1 ora. Il campione viene in seguito liofilizzato.

Resa: 1,674 g (P.M. 246,21). Il composto ottenuto é positivo alla reazione con resorcinolo-HCI e negativo alla reazione con TBA.

Esempio 5

Assorbimento di C7-Neu5Ac a DEAE-Sephadex A-25

La polvere liofilizzata ottenuta nel passaggio precedente, corrispondente a 6,80 mmoli, viene ripreso con 200 mi di metanolo : acqua (1 : 1 , V/V). In seguito si aggiungono 20,0 g di DEAE-Sephadex A-25 e si lascia incubare il campione sotto agitazione continua a 4° C durante tutta notte. Trascorso questo tempo si lava il complesso che si é formato di C7-IMeu5A-DEAE-Sephadex A-25 in modo ripetuto con metanolo : acqua distillata (1 : 1, V/V). Il complesso viene in seguito ripreso con 600 mi di acqua distillata.

Esempio 6

Preparazione di amantadina-C7Neu5Ac

A 30,0 mi della sospensione ottenuta nell'esempio precedente, che contengono 0,34 mmoli di C7-Neu5Ac, si aggiunge amantadina in un eccesso pari a 1,5 volte in rapporto all'acido sialico (0,51 mmoli) ed anche 100 mg di boro idruro di sodio necessario per ridurre la imina che si forma durante la reazione trasformandola in ammina secondaria stabile. Il campione risultante viene incubato a 4° C sotto agitazione continua durante tutta la notte. Dopo di ciò si lava più volte il gel con metanolo : acqua distillata (1 : 1, V/V). Il derivato così ottenuto costituito da amantadina - C7-Neu5Ac viene eluito dalla DEAE-Sephadex A-25 con una miscela di 100 mi di cloroformio : metanolo : NH4OH 35 % (60 : 35 :

8, V/V/V). Mantenere in incubazione il gel con questa miscela di solvente durante 1 ora a temperatura ambiente. In seguito centrifugare il campione, scartare il residuo solido (DEAE-Sephadex A-25) e tirare a secco con un evaporatore rotatorio il sopranatante che contiene il derivato amantadina - C7-Neu5Ac. Il derivato viene in seguito ripreso con 100 mi di acqua distillata e liofilizzato. Il campione può essere conservato in forma liofilizzata.

Esempio 7

Preparazione del Composto [amantadina-C7-Neu5Ac-C16H27N204]

avente la seguente formula di struttura:

Il complesso ottenuto nella fase precedente (amantadina-C7-l\leu5Ac) viene ripreso con 100,0 mi di acqua distillata. In seguito si aggiunge alla soluzione il composto C16H28N2O4 „ P04H3 {CAS [204255-11-8] ; P.M.

410,4} in eccesso molare di 1,5 volte rispetto al contenuto di acido sìalico del complesso (0,51 immoli). Il campione viene incubata a 60° C durante 2 ore. In seguito si aggiunge NaBHsCN (sodiocianoboroidruro) nella

proporzione di C16H28N2O4 : NaBH3CN (1 : 0,5, W/W) e la miscela risultante viene incubata a 60° C durante tutta la notte.

In seguito si aggiungono 10,0 g di DEAE-Sephadex A-25 y si mette ad incubare la miscela sotto agitazione continua a 4° C durante tutta la notte e trascorso questo tempo sì lava ripetutamente il complesso che si é formato amantadina-C7-Neu5Ac-Ci6H27l\l204-DEAE-Sephadex A-25 con una miscela di metanolo : acqua distillata (1 : 1, V/V). Il derivato così ottenuto costituito da amantadina-C7-l\leu5Ac-Ci6H27N204 viene eluito da DEAE-Sephadex A-25 con una miscela di 200,0 mi di cloroformio : metanolo : NH4OH 35 % (60 : 35 : 8, V/V/V).

Si mette ad incubare il gel con questa miscela di solventi durante 1 ora a temperatura ambiente. In seguito si centrifuga il campione, si scarta il residuo solido (DEAE-Sephadex A-25) e si tira a secco il sopranatante con un evaporatore rotatorio, ottenendosi il composto amantadina-C7-l\leu5Ac-Ci6H27N204,Il composto viene poi ripreso con un volume adeguato di acqua bidistillata fino alla dissoluzione completa e quindi viene liofilizzato. Conservare il campione preferìbilmente in freezer.

RIFERIMENTI

1. Das P. et al. "Free energy simulations reveal a doublé mutant aviari H5N1 virus hemagglutinin with altered ceptor binding specificity.", J. Comput. Chem. 2009, 30 (11): p. 1654-63.

2. Iwata T. el al. "Theoretical analysis of binding specificity of influenza virai hemagglutinin to avian and human receptors based on the fragment molecular orbitai method." , Comput. Biol. Chem. 2008, 32 (3) :p. 198-211.

3. Xu D. el al. "Distinct glycan topology for avian and human sialopentasaccharide receptor analogues upon binding different hemoagglutinings: a molecular dynamics perspective.†, J. Mol. Biol. Epub. 2009 Feb. 5, 2009, 387 (2): p. 465-91.

4. Wilson I. A. et al. "Structure of the heamoagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution", Nature 1981, 289: p.

366-73.

5. Schriver Z. et al. "Context-specific target definition in influenza a virus hemagglutinin-glycan receptor interactions", Chem. Biol. 2009 Aug.

28, 16 (8): p. 803-814.

6. Wang C.C. et al. "Giycans on influenza hemagglutinin effect receptor binding and immune response.", Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 2009, Oct. 12.

7. Varghese J. N. et al. "Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neuraminidase at 2.9 A resolution", Nature 1983, 303: p. 35-40.

8. Colman P. M. et al. "Structure of the catalytic and antigenic sites in influenza virus neuraminidase", Nature 1983, 303: p. 41-44.

9. Taylor N.R., von Itzstein M. "Molecular modeling studies on ligand binding to sialidase from influenza virus and the mechanisms of catalysis.", J. Med. Chem. 1994, 37 (5): p. 616-24.

10. D'Ursi P. et al "Virtual screening pipeline and ligand model ling for H5N1 neuraminidase", Biochem. Biophys. Res. Comm. 209 Jun. 12,, 383 (4): p. 445-9.

11. Herrier Georg, et al., "A synthetic sialic acid analogue is recognized by influenza C virus as a receptor but is resistant to thà ̈ receptordestroying enzyme", J. Biol. Chem. 1992, 2567 (8): p. 12501-12505.

12. Herrier G. et al. " 9-O-acetylated sialic acid, a receptor determinant for influenza C virus and coronavirus" Behring Inst. Mitt. 1991, 89: p.

177-84.

13. Schwegmann-Wessels C. et al. " Sialic acids as receptors determinants for coronavirus" Glycoconj. J. 2006, 23 (1-2): p. 51-8.

14. Yamashita M. et al., "CS-8958, a prodrug of thà ̈ new neuraminidase Inhibitor R-125489, shows long-acting anti-influenza virus activity", Antimicrob. Agents Chemother. 2009, 53(1): p. 186-92.

15. Moscona A. "Medicai management of influenza infection" , Annu. Rev.

Med. 2008, 59: p. 397-413.

16. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) "High levels of adamantine resista nce among influenza A (H3N2) viruses and interim guidelines for use of antiviral agents-United States, 2005-06 influenza seasonJ, MMWR Morb. Mortai Wkly Rep. 2006, 55 (2): p. 44-6.

17. Stephenson I., et al. "Antiviral treatment and prevention of seasonal influenza: a comparative review of recommendations in thà ̈ Europea n Union", J. Clin. Virol. 2008, 42 (3): p. 244-8.

18. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) "Oseltamivirresistant 2009 pandemie influenza A (H1N1) virus infection in two summer campers receiving prophyiaxis-North Carotina, 2009" , MMWR morb. Mortai Wkly Rep. 2009 Sep. 11, 58 (35): p. 969-72.

19. Collins P.J. et al. "Structural basis for oseltamivir resistance of influenza viruses", Vaccine 2009 Oct. 23, 27 (45): p. 6317-23.

20. Carr M.J. et. al. "Rapid molecular detection of thà ̈ H275Y oseltamivir resistance gene mutation in circulating influenza A (HI NI) viruses." J. Virol. Methods 2008, 153 (2): p. 257-262.

21. Stephenson I. et al. "Neuraminidase Inhibitor Resistance adfter Oseltamivir Treatment of Acute Influenza A and B in Children" Clin. Infect. Dis. 2009, Gen. 9, in stampa;

22. Guo L. et al. "Rapid Identification of oseltamivir-resistant influenza A(H1N1) viruses with H274Y mutation by RT-PCR/restriction fragment length potymorphism assay." Antiviral Res. Epub 2009 Gen. 31, 2009 Apr., 82 (1): p. 29-33.

23. Gooskens J. et al. "Morbidity and mortality associated with nosocomial transmission of oseltamivir-resistant influenza A(H1N1) virus." JAMA Epub 2009 Mar. 2, 2009 Mar. 11, 301 (10): p. 1042-6.

24. Bolotin S. et al. "Development of a novel real-time reversetranscriptase PCR method for thà ̈ detection of H275Y positive influenza A H1N1 isolates." J Virol Methods. Epub 2009 Gen. 30, 2009 Giu.,158 (1-2): p . 190-194.

25. Dharan N.J. et al. Oseltamivir-Resistance Working Group "Infections with oseltamivir-resistant influenza A(H1N1) virus in thà ̈ United States." JAMA Epub 2009 Mar. 2, 2009 Mar. 11, 301 (10), p.1034-41.

26. Doms R.W. et al. "Variant influenza virus hemagglutinin that induces fusion at elevated pH†, J. Virol. 1986, 57 (2): p. 603-613.

27. Takahashi T. el al. "Duck and animai pandemia influenza A viruses retain sialidase activity under low pH conditions" J. Biochem. 2001, 130: p. 279-283.

28. Itzstein L.M. von el al. " Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication", Nature 1993, 363 (6428): p.

418-423.

29. Babu Y.S. et al. : "Discovery of a novel, highly potent, orally active, and selective influenza neuraminidase inhibitor through structurebased drug design.†, J. Med. Chem. 2000, 43 (19): 3482-86.

30. Martindale 33. ma Ed. (2002) p. 639-43.

31. Chen Y. et al. "Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target celi heparan sulfate.", Nat. Med. 1997, 3: p.866-71.

32. Kimura T. et al. "Analysis of virus-cell binding characteristics on thà ̈ determination of Japanese encephalitis virus susceptibility." , Arch, Virol. 1994, 139: p. 239-251.

33. Kopecky J. et al. "A putative host celi receptor for tick-borne encephalitis virus identified by anti-idiotypic antibodies and virus affinobiotting.", Intervirology 1999, 42: 9-16.

34. Maldov D.G. et al. "Tick-borne encephalitis virus interaction with thà ̈ target celi s." Arch. Virol. 1992, 127: p. 321-325.

35. Ramos-Castaneda J. et al. "A 65-kDa trypsin-sensible membrane celi protein as a possi b le receptor for dengue virus in cultured neuroblastoma cells." J. Neurovirol. 1997, 3: p. 435-440.

36. Salas-Benito J.S. et al. "Identification of two surface proteins from C6/36 cells that bind dengue type 4 virus." J. Virol. 1997, 71: p. 7246-7252.

37. Bernfield M- et al. "Functions of celi surface heparan sulfate proteoglycans." Annu. Rev. Biochem. 1999, 68: p. 729-777.

38 Chambers T. J. et al. "Flavivirus genome organization, expression, and replication." , Annu. Rev. Microbiol. 1990, 4: p. 649-688.

39. Monath T.P. et al. "Flaviviruses.", in Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M., Editors. Fields Virology, 3rd ed., Voi. 1, 1996, Philadelphia, Pa, Lippincott-Raven Publishers, p. 961-1034.

40. Rey F.A. et al. , "The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 angstrom resolution.", Nature 1995, 375: p.

291-298.

41. Lobigs M. et al. "Host celi selection of Murray Valley encephalitis virus variants altered at an RGD sequence in thà ̈ envelope protein and in mouse virulence.", Virology 1990, 176: p. 587-595.

42. Ruoslahti E. et al. "New perspectives in celi adhesion: RGD and integrìns.", Science 1987, 238: p. 491-497.

43. McAda P.C. et al. "Partial nucleotide sequence of thà ̈ Japanese encephalitis virus genome.", Virology 1987, 158: p. 348-360.

44. Rice C.M. et. al. "Nucleotide sequence of yellow fever virus:

implications for flavivirus gene expression and evoiution." Science 1985, 229: p. 726-733.

45. Castle E. et al. "Sequence analysis of thà ̈ virai core protein and thà ̈ membrane-associated proteins VI and NV2 of thà ̈ flavivirus West Nile virus and of thà ̈ genome sequence for these proteins.", Virology 1985, 145: p. 227-236.

46. Coia G. et al. "Nudeotide and complete amino acid sequences of Kunjin virus: definitive gene order and characteristics of thà ̈ virusspecified proteins." J. Gen. Virol. 1988, 699: p. 1-21.

47. Trent D.W. et. al. "Partial nudeotide sequence of St. Louis encephaiitis virus RNA: structural proteins, NS1, ns2a, and ns2b.", Virology 1987, 156: p. 293-304.

48. Hahn Y.S. et al "Nudeotide sequence of dengue 2 RNA and comparison of thà ̈ encoded proteins with those of other flaviviruses." , Virology 1988, 162: p. 167-180.

49. Mackow E. et al. "The nudeotide sequence of dengue type 4 virus:

anaiysis of genes coding for nonstructural proteins.", Virology 1987, 159: p. 217-228.

50. Mason P.W. et al. "Sequence of thà ̈ dengue-1 virus genome in thà ̈ region encoding thà ̈ three structural proteins and thà ̈ major nonstructural protein NS1.†, Virology 1987, 161: p. 262-267.

51. Mandi C.W. et al. "Sequence of thà ̈ structural proteins of tick-borne encephaiitis virus (western subtype) and comparative anaiysis with other flaviviruses.", Virology 1988, 166: p. 197-205.

52. Hahn C.S. et al. " Comparison of thà ̈ virulent Asibi strain of yellow fever virus with thà ̈ 17D vaccine strain derived from it.", Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1984, 84: p. 2019-2023.

53. Jackson T. et al. "Arginine-glycine-aspartic acid-specific binding by footand-mouth disease viruses to thà ̈ purified integrin alpha(v)beta3 in vitro.", J. Virol. 1997, 71: p. 8357-8361.

54. Neff S. et al. "Foot-and-mouth disease virus virulent for cattle utilizes thà ̈ integrin alpha(v)beta3 as its receptor." J. Virol., 72: p. 3587-3594.

55. Roivainen M. et al. "Entry of coxsackievirus A9 into host cells: specific interactions with alpha v beta 3 integrin, thà ̈ vitronectin receptor." Virology 1994, 203: p. 357-365.

56. Tyler K.L. et al "Pathogenesis of virai infection.†Fields Virology. 3rd ed., Fields B.N., Knipe D.M, Howley P.M. Editors. Philadelphia 1996, Pa. Lippincott-Raven, p. 173-218.

57. Kimura, T. et al. "Analysis of virus-cell binding characteristics on thà ̈ determìnation of Japanese encephalitis virus susceptibiiity." Arch. Virol.

1994, 139, p. 239-251.

58. Maldov D.G. et al. "Tick-borne encephalitis virus interaction wìth thà ̈ target cells." Arch. Virol. 1992, 127: p.321-325.

59. Salas-Benito J.S.; del Angel R.M. "Identification of two surface proteins from C6/36 cells that bind dengue type 4 virus.†J. Virol. 1997, 71: p.

7246-7252.

Claims (1)

1. Rivendicazioni 1.) Un composto con formula generale di struttura chimica ( I ): ( I ) dove: X raffigura un legame -O- oppure -CH2- ; e R raffigura -H oppure un gruppo alchilico lineare o ramificato da 1 a 4 atomi di carbonio; 4 R<1>rappresenta , in modo indipendente da R , la porzione -(NH)n- (CH2) m (T), dove in modo indipendente n = l oppure 2 ed m=0, 1, 2, 3 e 4, oppure -NH-CO-NH-(T), oppure -NH-C(NH)-NH-(T), dove la porzione -(T) é caratterizzata da un anello penta- oppure esa- omo oppure eterociclico parzialmente sostituito avente una qualsiasi delle strutture chimiche -(T-l), -(T-2), - (T-2) oppure -(T-4) e relative sostituenti; R rappresenta -OH , -NH2, -0-CH-(C2H5)2, -NH-CO-CH3, -NH-CO-CH2-OH , -NH-CO-C2H5, -NH-C(NH)NH2; e R<3>rappresenta -OH , -NH2, -NH-CO-CH3, -IMH-CO-CH2-OH , -IMH-CO-C2H5 , oppure -IMH-C(IMH)NH2; 4 1 R rappresenta7in modo indipendente da R7la porzione -CHOH-CHOH-CH2-OH, oppure -(W) , -CHOH-CH2-(W) oppure -CH2-(W), dove la porzione -(W) é caratterizzata da un anello parzialmente sostituito avente una qualsiasi porzione avente la struttura chimica (W- l) oppure (W-2) e relativi sostituenti; ed i loro lineari o ramificati C1-4 carbossi-mono o poli-esteri, sali di addizione, solvati, enantiomeri separati e i diasteromeri purificati. 2.) Il composto di cui alla Rivendicazione 1. dove la porzione -(T) di R<1>, in modo indipendente da -(W) di R<4>, é caratterizzata dall'anello omoesaciclico -(T-i) contraddistinto dalla struttura chimica: (T-l) nella quale, in modo indipendente: - R<5>rappresenta -H , -CH3 , -C2H5, -CH-(C2H5)2; e - R<6>rappresenta -NH-CO-CH3 , -NH-CO-C2H5; e - R<7>rappresenta -0-CH-(CH3)2, -0-CH-(C2H5)2. 3.) Il composto di cui alla Rivendicazione 2. nel quale la porzione -(T-l) é caratterizzata dalla combinazione nella quale simultaneamente R<5>é -C2H5, R<6>é -NH-CO-CH3 ed R<7>é -0-CH-(C2H5)2. 4.) Il composto di cui alla Rivendicazione 1. dove la porzione -(T) di R<1>, in modo indipendente da -(W) di R<4>, é caratterizzata dall'anello esaeterociclico -(T-2) contraddistinto dalla struttura chimica: (T-2) 5.) Il composto di cui alla Rivendicazione 1. dove la porzione -(T) di R<1>, in modo indipendente da -(W) di R<4>, é caratterizzata dall'anello omopentaciclico -(T-3) contraddistinto dalla struttura chimica: (T-3) 6.) Il composto di cui alla Rivendicazione 1. dove la porzione -(T) di R<1>, in modo indipendente da -(W) di R<4>, é caratterizzata dall'anello eteroesaciclico parzialmente sostituito -(T-4) contraddistinto dalla struttura chimica: nella quale - Z rappresenta -H , -CH-(C2H5)2oppure -CO-(CH2)6~CH3. 7.) Il composto di cui alla Rivendicazione 6. nel quale la porzione -(T-4) é caratterizzata per essere il sostituente - Z rappresentato dal radicale -CO-(CH2)6-CH3. 8.) Il composto di cui alla Rivendicazioni da 1. a 7, dove la porzione -(W) di R<4>, in modo indipendente da -(T) di R<1>, é caratterizzata da un nucleo amantadinico diversamente sostituito -(W-l) contraddistinto dalla struttura chimica: nella quale, in modo indipendente: g - R rappresenta un legame costituito da: -NH- , -CH2-NH- , -CH(CH3)-NH- , -NH-CH(CH3)-NH- , -C(CH3)2-CH2-I\IH- , -NH-C0-CH2-0-CH2-CH2-l\IH- oppure da N oppure da - R rappresenta -H , -CH3 or -C2H5 ; e - R<10>rappresenta -H , -CH3 or -C2H5 . 9.) Il composto di cui alla Rivendicazione 8. nel quale la porzione -(W-1) é caratterizzata dalla combinazione nella quale simultaneamente R<8>é -9 10 NH- ed R ed R rappresentano entrambe -H. 10.) Il composto di cui alla Rivendicazioni da 1. a 7, dove la porzione -(W) di R<4>, in modo indipendente da -(T) di R<1>, é caratterizzata da un nucleo triazolico diversamente sostituito -(W-2) contraddistinto dalla struttura chimica: OH OH nella quale R<11>rappresenta un legame costituito da: -NH-, -CO-NH- oppure da -C(NH)-NH- . 11.) Il composto di cui alla Rivendicazione 10. nel quale la porzione -(W-2) é caratterizzata per essere R<11>rappresentato dal radicale -CO-NH- . 12.) Il composto di cui a ciascuna delle precedenti Rivendicazioni caratterizzato in modo tipico per essere un composto bi-sostituito in C2 con la porzione (T) ed in C7 con la porzione (W). 13.) Il composto di cui a ciascuna delle precedenti Rivendicazioni caratterizzato in modo tipico per essere un composto bi sostituito dove la porzione (T) à ̈ selezionata in modo indipendente entro il gruppo delle riferite porzioni (T-l), (T-2), (T-3) oppure (T-4), parzialmente sostituite e non, mentre la porzione (W) à ̈ selezionata in modo indipendente entro il gruppo delle riferite porzioni (W-l) e (W-2), parzialmente sostituite e non. 14.) Il composto di cui a ciascuna delle precedenti Rivendicazioni caratterizzato in modo tipico per essere un composto bi sostituito dove la porzione (T) à ̈ la porzione (T-l) dove é presente in modo simultaneo la combinazione nella quale R<5>é -C2H5 R<6>é -NH-CO-CH3 ed R<7>é -O-CH-(C2H5)2 e la porzione (W) à ̈ rappresentata dalla porzione (W-l) dove in modo simultaneo R<8>é -NH- ed R<9>ed R<10>sono entrambe un atomo di idrogeno. 15.) Una composizione farmaceutica che comprende un solo composto di cui alla Rivendicazione 1. oppure una miscela degli stessi in un veicolo accettabile dal punto di vista farmaceutico. 16.) Un metodo per trattare un campione virale, batterico o protozoario oppure un'infezione che contiene emoagglutinina (HA) e/o neuramminidasi (NA) e/o la proteina M2che consiste nella somministrazione attraverso una via adeguata all'ospite, che necessita di tale trattamento, di una quantità terapeutica efficace di un composto di cui alla Rivendicazione 1., inibente HA oppure NA o la proteina M2. 17.) Il metodo di cui alla Rivendicazione 16. nel quale detto campione virale oppure infezione che contiene emoagglutinina (HA) e/o neuramminidasi (NA) e/o la proteina M2à ̈ costituito dai virus dell'influenza tipo A e B oppure da mutazioni degli stessi. 18.) Un metodo per trattare un campione virale oppure un'infezione contenente mRNA ed RNA polimerasi che consiste nella somministrazione attraverso una via adeguata all'ospite, che necessita di tale trattamento, di una quantità terapeutica efficace di un composto di cui alla Rivendicazione 1., inibente l'enzima mRNA-guanililtransferasi. 19.) Il metodo di cui alla Rivendicazione 16. nel quale detto campione virale oppure infezione che contiene mRNA, RNA polimerasi e l'enzima mRNA-guaniltransferasi à ̈ costituito dal virus dell'epatite tipo C (HVC). 20.) Il metodo di cui alla Rivendicazione 17. associato ad una quantità terapeutica efficace di un altro composto attivo contro i virus dell'influenza tipo A e B oppure loro mutazioni resistenti. 21.) Il metodo di cui alla Rivendicazione 19. associato ad una quantità terapeutica efficace di un altro composto attivo contro il virus dell'epatite tipo C (HVC) oppure loro mutazioni. 22.) Uso di un composto di cui a ciascuna delle precedenti Rivendicazioni per il trattamento in un mammifero di un'infezione virale sostenuta da HA oppure NA oppure proteina M2dipendente. 23.) Uso di un composto di cui a ciascuna delle precedenti Rivendicazioni per il trattamento in un mammifero di un'infezione HVC dipendente da mRNA, RNA polimerasi ed enzima mRNA-guanililtransferasi dipendente. 24.) Uso di un composto di cui a ciascuna delle precedenti Rivendicazioni per la produzione di un medicinale per il trattamento in un mammifero di un'infezioni sostenuta da virus HA o NA oppure proteina M2dipendente. 25.) Uso di un composto di cui a ciascuna delle precedenti Rivendicazioni per la produzione di un medicinale per il trattamento in un mammifero di un'infezioni sostenuta da virus mRNA, RIMA polimerasi ed enzima mRIMA-guanililtransferasi dipendente.