ITMI20061502A1

ITMI20061502A1 - Procedimento ed apparecchiatura per la determinazione rapida di deossinivalenolo in una matrice a base di cereali.

Info

Publication number: ITMI20061502A1
Authority: IT
Inventors: Alessandro Alessandro D; Vincenzo Lippolis; Michelangelo Pascale; Roberto Ranieri; Marco Silvestri; Angelo Visconti
Original assignee: Barilla Flli G & R Spa; Consiglio Nazionale Ricerche
Priority date: 2006-07-28
Filing date: 2006-07-28
Publication date: 2008-01-29
Also published as: EP1882938A3; EP1882938A2

Description

BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio Albo n°S25 BM)

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo;

"Procedimento ed apparecchiatura per la determinazione rapida di deossinivalenolo in una matrice a base di cereali"

a nome: 1) BARJLLA G. e F. Fratelli S.p.A.

2) Consiglio Nazionale delle Ricerche

con sede in; 1) Parma

2) Roma

DESCRIZIONE

Campo di applicazione

Nel suo aspetto più generale la presente invenzione si riferisce al settore della sicurezza alimentare ed in particolare l’invenzione riguarda un procedimento ed un’apparecchiatura per la determinazione di micotossine in una matrice a base di cereali.

Più in particolare l’invenzione riguarda un procedimento del tipo suddetto basato sulla tecnica imm uno metrica a polarizzazione di fluorescenza (FPIA) per la determinazione di deossinivalenolo (DON) in tali matrici.

L’espressione matrice a base di cereali è qui impiegata per indicare un prodotto alimentare grezzo, semilavorato o finito a base di cereali tra i quali citiamo, a titolo di esempio, frumento, mais, orzo, avena, segale e cariossidi non processate in genere, crusca, semola e sfarinati, cereali per la prima colazione, pasta, biscotti, pane e simili prodotti da forno a base di cereali.

Arte nota

È noto che in alcuni tipi di derrate alimentari si possono BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (ISCT. Albo n°525 BM)

sviluppare miceti e muffe in grado a loro volta di generare mico tossine capaci di produrre effetti tossici sull’uomo e sugli animali.

In particolare, lo sviluppo fungino e la formazione di micotossine possono avvenire sia in campo sulla pianta, sia in una qualunque delle successive fasi di conservazione e trasformazione delle derrate alimentari.

La tossicità delle micotossine, che si presenta sotto diverse forme comprende effetti tossici acuti, cancerogeni, teratogeni, estrogeni, immunod e pressori e neurologici che si manifestano in dipendenza del tipo di micotossina, della dose, dell’organo interessato, dell’età, del sesso e della specie dell’organismo che assume la micotossina.

A causa della tossicità delle micotossine, le autorità sanitarie ne hanno imposto il controllo sistematico per alcune di esse, attraverso normative in ambito comunitario, per verificare che esse non superino predeterminati livelli di soglia in alimenti e mangimi.

Anche altre organizzazioni Intemazionali, come l’Organizzazione per l'Alimentazione e l'Agricoltura delle Nazioni Unite (FAO), la Food and Drug Administration (FDA) e l’Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO), sono impegnate in vari fronti tra i quali la valutazione del rischio per la salute umana ed animale derivante dall’esposizione alle micotossine.

Tra le micotossine più diffuse vi sono i tricoteceni ed in particolare il deossini valendo (DON), detto anche vomitossina, che causa tra l’altro vomito, rifiuto del cibo e immunosoppressione. Il DON è prodotto da F. graminearum e F. culmomm, funghi del genere Fusarium.

BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo n°525 BM)

La legislazione europea, con Regolamento (CE) N. 856/2005 della Commissione del 6 giugno 2005, ha fissato i valori massimi ammissibili di contaminazione da DON in cereali e derivati, con decorrenza 1 luglio 2006, compresi neirintervallo tra 0.20 pg/g (per alimenti destinati all'infanzia) e 1.75 pg/g (per frumento duro non processato).

Da quanto sopra esposto discende l’esigenza di disporre di metodi di analisi rapidi ed affidabili, in termini di accuratezza e precisione, per il controllo del tenore di DON in alimenti e mangimi.

La tecnica nota, per soddisfare tale esigenza, mette a disposizione vari metodi cromatografici, tra i quali quello basato sulla cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) è tra i più impiegati ed affidabili.

Senza entrare nel dettaglio di tale metodo, essendo il processo cromatografico ben noto, vi è da dire che esso, benché vantaggioso per certi aspetti, presenta alcuni inconvenienti tra i quali i lunghi tempi di esecuzione (alcune ore per un’analisi completa) che non lo rendono idoneo all’impiego in un ciclo di produzione e/o trasformazione di un prodotto alimentare a base di cereali.

Inoltre, tale metodo è caratterizzato da costi elevati imputabili alle complesse analisi da eseguire ed alla strumentazione utilizzata ed anche all’impiego di personale specializzato che deve essere adeguatamente addestrato.

Ancora, esso è attuato mediante apparecchiature ingombranti e difficilmente trasportabili anche perché particolarmente delicate.

BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo n°525 BM)

La domanda di brevetto WO 02/23196, qui incorporata come riferimento, divulga un metodo per la rivelazione del DON basato sulla tecnica della polarizzazione di fluorescenza che consente di studiare interazioni molecolari, monitorando le variazioni di dimensione molecolare di una molecola fluorescente.

In particolare, è impiegato il test immunometrico a polarizzazione di fluorescenza (FPIA), in cui le variazioni di dimensione molecolare di un tracciante fluorescente sono conseguenza di un’interazione antigene-anticorpo, dove l’antigene corrisponde alla tossina da quantificare o ad un tracciante costituito dalla tossina legata ad un particolare “probe” fluorescente.

Per una molecola fluorescente piccola quale il tracciante impiegato si ha una bassa polarizzazione causata da una veloce rotazione, viceversa, molecole fluorescenti di grandi dimensioni, quali quelle formate da un complesso tracciante/anticorpo, determinano una elevata polarizzazione a causa della loro minore velocità di rotazione.

La presenza in soluzione di DON libero origina una competizione che riduce la quantità di anticorpo che lega il tracciante e di conseguenza riduce il valore della polarizzazione.

Il valore della polarizzazione è quindi inversamente proporzionale al contenuto di DON e ne consente la quantificazione.

In dettaglio, WO 02/23196 descrive quali anticorpi impiegati due anticorpi monoclonali specifici per il DON individuati con il numero di riferimento del clone #1 e #4, ed un derivato fluorescente del DON ottenuto legando il DON a 6-amminofluoresceina mediante 1,1BRL246BIT DT. RinaJdo Ferreecio {Iscr. Albo n°525 BM)

carbonildiimidazolo.

Sebbene tale metodo risulti per certi versi vantaggioso, esso non costituisce una valida alternativa al più consolidato metodo HPLC poiché i risultati ottenuti dal confronto dei due metodi non presentavano una buona correlazione, come confermato da prove condotte presso i laboratori della richiedente.

Inoltre tale metodo FPIA ha mostrato di soffrire di una non soddisfacente sensibilità, circa 0.50 pg/g deducibile dal brevetto WO 02/23196, che lo rende idoneo perlopiù all’impiego come metodo di screening per la determinazione di DON in campioni di frumento non processato, ma non correttamente applicabile airanalisi dei prodotti derivati (esempio semola, pasta e alimenti per infanzia) i cui livelli massimi ammissibili sono inferiori o prossimi al limite di rivelabilità del metodo stesso.

Sommario dell'invenzione

Un primo scopo della presente invenzione è pertanto quello di rendere disponibile un procedimento alternativo a quelli messi a disposizione dalla tecnica nota per la determinazione (rilevazione e quantificazione) di deossinivalenolo (DON) che consenta in particolare tale determinazione in una matrice a base di cereali.

Un secondo scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un procedimento del tipo suddetto che risulti particolarmente rapido consentendo di rilevare in tempo reale la presenza di DON in un processo di produzione e/o trasformazione di un prodotto alimentare a base di cereali.

BRL246BIT DT. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo n°525 BM)

Un terzo scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un procedimento del tipo suddetto che sia totalmente integrabile all 'interno di una filiera o di un ciclo di produzione e/o trasformazione di un prodotto alimentare a base di cereali.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un procedimento per la determinazione del DON che risulti particolarmente accurato, preciso e sensibile.

Un ulteriore scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un procedimento del tipo suddetto che risulti particolarmente semplice ed economicamente vantaggioso.

Tali scopi sono raggiunti, secondo l’invenzione, da un procedimento basato sulla tecnica immunometrica a polarizzazione di fluorescenza (FPIA) per la determinazione del DON in una matrice a base di cereali, comprendente le fasi dì:

a) mettere a disposizione una soluzione di un estratto filtrato ottenuto da una prefissata matrice a base di cereali;

b) mettere a disposizione un anticorpo ed un tracciante comprendente DON coniugato ad un prefissato fluoroforo;

c) miscelare predeterminate quantità di detta soluzione di estratto filtrato e di detto anticorpo per ottenere una soluzione corrispondente al bianco di lettura di una misura di polarizzazione di fluorescenza;

d) eseguire dopo un prefissato tempo di incubazione una misurazione di polarizzazione di fluorescenza di detta soluzione corrispondente al bianco di lettura;

BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (ISCT. Albo n°525 BM)

e) aggiungere a detta soluzione corrispondente al bianco di lettura una prefissata quantità di detto tracciante, il quale è in grado di legarsi a detto anticorpo per determinare una variazione di polarizzazione di fluorescenza rilevabile;

f) eseguire dopo un prefissato tempo di incubazione una misurazione di polarizzazione di fluorescenza di detta soluzione;

g) confrontare detta polarizzazione di fluorescenza misurata con un valore di polarizzazione di fluorescenza caratterizzato, detto valore dì polarizzazione di fluorescenza caratterizzato corrispondendo ad una concentrazione nota dì DON, ottenendo un primo valore di concentrazione di DON;

h) modificare di una prefissata quantità detto primo valore di concentrazione di DON ottenuto, detta prefissata quantità essendo correlata alla natura e tipo di detta matrice a base dì cereali.

In accordo con l’invenzione, detto primo valore di concentrazione di DON ottenuto è modificato di una quantità compresa tra 0.60 e 0.02 microgrammi di DON per grammi di matrice a base di cereali.

Così, ad esempio, in caso la matrice a base di cereali sia costituita da cariossidi non processate di frumento duro, detta prefissata quantità da sottrarre al suddetto primo valore di concentrazione di DON rilevato è compresa tra 0.35 e 0.04 pg/g, e più in particolare ancora, per frumento duro macinato con granulometria inferiore o uguale a 1 mm, è pari a 0.27±0.03 pg/g .

Vi è da notare che il suddetto valore risulta indipendente dalla BRL246BIT Dr, Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo π°525 BM)

varietà del frumento investigato ma, in accordo con l’invenzione, detta prefissata quantità varia al variare del tipo e della natura della matrice.

In caso di cariossidi non processate di frumento tenero detta quantità da sottrarre al primo valore di concentrazione di DON ottenuto è compresa tra 0.50 e 0.04 pg/g, e più in particolare per frumento macinato con granulometria inferiore o uguale a 1 mm è pari a 0.39±0.06 pg/g.

In caso di semola la quantità da sottrarre al primo valore di concentrazione di DON ottenuto è compresa tra 0.10 e 0.04 pg/g e più in particolare è pari a 0.08±0.01 pg/g, mentre ancora nel caso la matrice a base di cereali sia costituita da pasta la sovrastima è compresa tra 0.06 e 0.02 pg/g e più in particolare corrisponde a 0.04±0.01 pg/g.

Nel caso particolare di matrice a base di cereali costituita da crusca, ed in altri casi come per esempio per il mais, la suddetta quantità da sottrarre al primo valore di concentrazione di DON ottenuto risulta particolarmente elevata, e fuori range, rispetto ai valori precedentemente indicati.

Tale apparente disaccordo è determinato dalla presenza di sostanze interferenti coestratte con il DON le quali tuttavia, in accordo con l’invenzione, possono essere rimosse dall’estratto filtrato attraverso uno stadio aggiuntivo di purificazione.

In questi casi in cui la sovrastima di DON è particolarmente elevata, e generalmente compresa tra 1.50 e oltre 2.00 microgrammi di DON per grammo di matrice, ma comunque in accordo con l’invenzione BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferrecclo (Iser. Albo n°52S BM)

anche quando la sovrastima di DON è compresa nel suddetto intervallo di valori tra 0.60 e 0.02 microgrammi di DON per grammi di matrice a base di cereali, è possibile minimizzare la sovrastima, o addirittura del tutto eliminarla, attraverso una purificazione con carbone attivo, o altri materiali adsorbenti, come meglio apparirà nel seguito della descrizione.

Preferibilmente, il suddetto fluoroforo è 4’-amminometilfluoresceina che reagisce con DON con formazione di detto tracciante individuato come DON-FL2, il quale reagisce con ranticorpo monoclonale avente numero di riferimento del clone #22, vantaggiosamente impiegato nel metodo secondo l’invenzione e che sarà nel seguito indicato semplicemente come anticorpo #22.

In particolare l’anticorpo #22, che si è rivelato essere particolarmente sensibile, è stato fornito direttamente dal Dr. C. Maragos (USDA, USA) e purificato come descritto in Maragos, C. M., and McCormick, S. P., 2000, Monoclonal antibodies for thè mycotoxins deoxynivalenol and 3-acetyl-deoxynivalenol. Food and Agrìcultu.ra.1 Immunologi ), 12, 181-192.

Vantaggiosamente, il DON-FL2 è ottenuto selettivamente come unico derivato fluorescente del DON mediante protezione dei gruppi ossidriiici in C7 e CI 5 del DON stesso tramite reazione con acido 1-butilboronico, anteriormente alla sua coniugazione con il fluoroforo.

Nel caso di matrice solida, quale ad esempio le cariossidi non processate, la semola e la pasta di cui sopra, ma anche in caso di farina, cereali per la prima colazione, pane, biscotti e simili, il suddetto estratto è ottenuto per estrazione della suddetta matrice con tampone BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo n°52S BM)

PBS e successiva filtrazione ripetuta almeno una volta.

In particolare, la matrice viene prima finemente suddivisa, quindi sottoposta ad energica agitazione in tale soluzione PBS per circa 2-5 minuti, quindi estratta.

In una forma preferita di realizzazione del presente procedimento sono previste due filtrazioni, una prima filtrazione su filtro di carta ed a una seconda filtrazione su filtro a micro fibra di vetro, senza che vi sia la necessità di ulteriori purificazioni dell’estratto filtrato così ottenuto,

Nel caso particolare di matrice solida costituita da crusca, come precedentemente descritto, è previsto che il suddetto stadio di purificazione sia successivo alle filtrazioni ed antecedente alla misurazione della polarizzazione di fluorescenza.

In pratica, in tale stadio, l’impiego di carbone attivo o di altri materiali adsorbenti consente l’abbattimento del segnale dovuto agli interferenti coestratti, ed in dipendenza della quantità di materiale adsorbente impiegato si ha la minimizzazione della sovrastima o l’eliminazione della stessa.

Così, ad esempio, per concentrazioni fino a circa 1.0-1. 5 mg di carbone attivo per mL di estratto filtrato si ha minimizzazione della sovrastima rilevata.

Nel caso dì purificazione dell’estratto filtrato con aggiunta di carbone attivo in quantità compresa 2 e 3 milligrammi per millilitro di estratto, la sovrastima viene invece sostanzialmente eliminata.

In tutti i casi, raggiunta dì materiale adsorbente è seguita da BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferrecclo (Iscr. Albo n°525 BM)

agitazione e successiva filtrazione che precedono la determinazione del valore di polarizzazione di fluorescenza, come precedentemente riportato con riferimento alle fasi a-g del presente procedimento.

Vi è da notare che, in un altro suo aspetto, la presente invenzione si riferisce ad un'apparecchiatura per l'esecuzione del procedimento sopra illustrato, qui individuata anche come autocampionatore, in grado di automatizzare il presente procedimento attraverso una gestione software.

In particolare tale apparecchiatura comprende:

almeno una siringa includente un raccordo laterale, una pompa per lavaggio attivo a flusso e un ago di prefissata lunghezza;

una unità motorizzata atta a movimentare detta siringa tramite un albero rotante ed un braccio meccanico;

almeno un pozzetto di scarico per il lavaggio di detto ago; una prima pluralità di alloggiamenti per rispettive provette e/o fiale destinate a contenere rispettivamente il tampone, l’anticorpo ed il tracciate in soluzione da prelevare in quantità prefissate tramite detta siringa;

una seconda pluralità di alloggiamenti per rispettive provette e/o fiale destinate ciascuna a contenere una soluzione di un estratto filtrato ottenuto da una o più matrici a base di cereali da analizzare, da prelevare in una quantità prefissata tramite detta siringa;

un lettore di polarizzazione di fluorescenza munito di una cella di lettura dotata di un coperchio di chiusura e di una cuvetta di lettura atta ad essere alloggiata in tale cella di lettura;

BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferrecclo (Iscr. Albo n°525 BM)

un motore atto a movimentare detto coperchio di chiusura; un software di gestione comandato tramite computer. Secondo una forma di realizzazione preferita l’apparecchiatura secondo l’invenzione comprende anche un sistema di cambio cuvetta automatico, per la rimozione della cuvetta di lettura successivamente ad una misurazione della quantità di DON contenuto in un primo campione, cioè una soluzione di un primo estratto filtrato, e sua sostituzione con una nuova cuvetta per l’esecuzione di una ulteriore lettura su un diverso campione quale una soluzione contenente un secondo estratto filtrato.

In particolare, il sistema di cambio cuvetta comprende mezzi di presa, preferibilmente a pinza, posizionati sulla suddetta siringa in prossimità dell’ago, o comunque associati al braccio meccanico in corrispondenza di una sua porzione guida-ago.

Più in particolare ancora, tali mezzi di presa sono atti alla presa diretta di una cuvetta oppure, come viene preferito, sono atti alla presa di un tappo forato associabile alla cuvetta e che ne consente la presa ed il trasporto.

In una ulteriore forma di realizzazione preferita dell’apparecchiatura secondo l’invenzione, il presente autocampionatore comprende anche un sistema automatico di filtraggio, per ottenere il suddetto estratto filtrato da una soluzione contenente la matrice a base di cereali da investigare finemente suddivisa.

Vi è da dire che, vantaggiosamente, il presente procedimento ha fornito risultati in ottimo accordo con quelli ottenuti da una analisi BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreecio (Iscr. Albo n°525 BMj

HPLC comparativa, in particolare per matrici a base di frumento.

Inoltre, il procedimento secondo l’invenzione si è dimostrato particolarmente rapido e più accurato rispetto ai metodo HPLC, con precisione paragonabile e talvolta migliore di quella del metodo comparativo HPLC.

Ulteriori vantaggi e caratteristiche di questa invenzione risulteranno maggiormente dalla descrizione di alcuni esempi di attuazione di un procedimento secondo rinvenzione, fatta qui di seguito con riferimento ai disegni allegato, forniti a titolo iLlustrativo e non limitativo.

Breve descrizione dei disegni

In tali disegni:

- la figura 1 rappresenta la formula di struttura di un derivato fluorescente del DON impiegato come tracciante nel procedimento secondo Tinvenzione;

- la figura 2 rappresenta l’effetto matrice sul contenuto di DON determinato mediante FPIA in cui la spezzata 1) è ottenuta per un estratto da cariossidi di frumento duro non processate e non contaminate da DON, mentre le spezzate 2)-5) sono ottenute per estratti da cariossidi di frumento duro contaminato a livelli rispettivamente di 7.5, 10, 30, 60 ng di DON.

- la figura 3 rappresenta l’effetto matrice sul contenuto di DON determinato mediante FPIA in cui le spezzate rappresentano la regressione lineare rispettivamente ottenuta per a) cariossidi di frumento tenero; b) cariossidi di frumento duro; c) semola; d) pasta non BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo n°525 BM)

contaminate da DON.

- la figura 4 rappresenta graficamente la correlazione tra il contenuto di DON in campioni di matrici naturalmente contaminati, analizzati con il procedimento secondo rìnvenzione e con il metodo comparativo HPLC, rispettivamente per: A) 35 campioni di cariossidi di frumento duro non processato; B) 32 campioni di cariossidi di frumento tenero non processato; C) 22 campioni di semola; D) 26 campioni di pasta.

- la figura 5 rappresenta graficamente l’accuratezza (espressa come concentrazione percentuale di DON) ottenuta utilizzando diverse concentrazioni di carbone attivo nella determinazione di DON nel medesimo campione di crusca mediante i metodi FPIA ed HPLC.

la figura 6 rappresenta schematicamente un apparecchiatura per l’attuazione automatizzata del procedimento secondo l’invenzione.

Descrizione dettagliata

Con riferimento alla figura 6, un apparecchiatura per l’attuazione automatizzata del procedimento secondo la presente invenzione è globalmente indicata con A e definita anche come autocampionatore.

L’auto -campionatore A comprende almeno una siringa 1 con capacità preferibilmente > lmL, dotata di un raccordo laterale, di una pompa per lavaggio attivo a flusso ed un ago 2 preferibilmente di lunghezza ≥ 80 mm.

L’auto-campionatore A comprende inoltre una unità BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferrecclo (Iscr. Albo n°525 BM)

motorizzata 3, atta a movimentare detta siringa 1 tramite un albero rotante ed un braccio meccanico schematizzati nella figura e rappresentati complessivamente con 3a.

Per la pulizia in automatico dell’ago 2, l’auto-campionatore A è dotato di almeno un pozzetto di scarico 4 nel quale avviene il lavaggio sia dentro sia fuori Pago.

L’auto-campionatore A comprende ancora una prima pluralità di alloggiamenti 5 per rispettive provette e/o fiale destinate a contenere una soluzione tampone, una soluzione con l’anticorpo ed una con il tracciante, dalle quali vengono prelevate rispettive prefissate quantità tramite la siringa 1, come meglio apparirà nel seguito della descrizione.

Una seconda pluralità di alloggiamenti 6, prevista nell’autocampionatore A secondo l’invenzione, è invece destinata all’alloggiamento di provette e/o fiale contenenti ciascuna un campione da analizzare ovvero una soluzione di un estratto filtrato ottenuto da una o più matrici di cereali da analizzare.

Per la determinazione della quantità di DON contenuto nel o nei campioni, l’auto-campionatore A è dotato di un lettore di polarizzazione di fluorescenza 7, quale ad esempio un fluorimetro o uno spettrofluorimetro munito di filtri polarizzatori, munito di una cella di lettura dotata dì un coperchio di chiusura e di almeno una cuvetta di lettura atta ad essere alloggiata nella cella di lettura.

11 coperchio di chiusura è movimentato da un rispettivo motore, che movimenta tale coperchio da una posizione di apertura, consentendo l’alloggiamento e la rimozione della cuvetta di lettura nella BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccìo (Iscr. Albo n°525 BM)

rispettiva cella, ad una posizione di chiusura delle cella di lettura.

In accordo con l’invenzione, l’auto- campionato re A è programmabile attraverso un computer 8, o attraverso via seriale, e viene gestito per l’attuajzione del metodo secondo l’invenzione tramite un software.

Secondo una forma di realizzazione preferita l’autocampionatore A comprende anche un sistema di cambio cuvetta automatico, per la rimozione della cuvetta di lettura successivamente ad una misurazione della quantità di DON contenuto nella soluzione campione, e sua sostituzione con una nuova cuvetta di lettura per l’esecuzione di una successiva analisi su un ulteriore estratto nitrato.

In particolare, il sistema di cambio cuvetta comprende mezzi dì presa, ad esempio a pinza, posizionati sulla siringa 1 in prossimità dell’ago 2, o comunque associati al braccio meccanico in corrispondenza di una sua porzione guida- ago.

Più in particolare ancora, i mezzi di presa sono atti alla presa diretta di una cuvetta oppure, come è preferito, sono atti alla presa dì un tappo forato associabile alla cuvetta e che ne consente la presa ed il trasporto.

In tal caso, nell’auto-campionatore A una pluralità di cuvette di lettura viene alloggiata nelle suddette sedi di alloggiamento per provette e/o Fiale, ad esempio nella seconda pluralità dì sedi di alloggiamento 6 per le provette contenenti i campioni.

In una ulteriore forma di realizzazione preferita dell’apparecchiatura secondo l’invenzione, il presente autoBRL246BIT DT. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo n°525 BM)

campionatore comprende anche un sistema automatico di filtraggio, per ottenere il suddetto estratto filtrato da una soluzione contenente la matrice a base di cereali da investigare finemente suddivisa.

In accordo con 1 invenzione, il suddetto auto-campionatore A consente 1 automazione del presente procedimento per la determinazione del DON in una matrice a base di cereali, come di seguito descritto.

In pratica, messe a disposizione le soluzioni contenenti il o i campioni, il tampone, l’anticorpo ed il tracciante e posizionate le provette contenenti tali soluzioni nei rispettivi alloggiamenti, e posizionata una cuvetta di lettura nell’apposita cella del lettore di polarizzazione di fluorescenza, l’auto-campionatore procederà, in seguito ad un comando di start, ad eseguire in automatico le seguenti fasi:

- prelievo tramite la siringa 1 di una prefissata quantità della soluzione tampone e sua iniezione nella cuvetta dì lettura;

- prelievo tramite la siringa 1 di una prefissata quantità della soluzione con anticorpo e sua iniezione nella cuvetta di lettura;

- prelievo tramite la siringa 1 di una prefissata quantità della soluzione contenente l’estratto filtrato e sua iniezione nella cuvetta di lettura;

- lavaggio della siringa con soluzione tampone;

- incubazione con agitazione per circa 2 minuti della soluzione ottenuta corrispondente al bianco di lettura;

- chiusura mediante il rispettivo coperchio della cella di BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferraccio (Iscr. Albo n°525 BM)

lettura e misurazione di polarizzazione di fluorescenza su tale soluzione corrispondente al bianco di lettura;

- apertura del coperchio di chiusura della cella di lettura; - prelievo tramite la siringa 1 di una prefissata quantità della soluzione contenente il tracciante e sua iniezione nella cuvetta di lettura contenente la soluzione corrispondente al bianco

- lavaggio della siringa con soluzione tampone;

- incubazione con agitazione per circa 2 minuti della soluzione ottenuta contenuta nella cuvetta di lettura;

- chiusura mediante il rispettivo coperchio della cella di lettura e misurazione di polarizzazione di fluorescenza su tale soluzione ottenuta;

- acquisizione elaborazione ed archiviazione dei dati ottenuti.

Preferibilmente, la misurazione di polarizzazione di fluorescenza sulla soluzione ottenuta è ripetuta in triplicato al fine di migliorare la precisione del dato, il quale conseguentemente è elaborato come valore medio di tre misurazioni effettuate sulla medesima soluzione. In pratica, terminata una prima misurazione di DON, l’autocampionatore potrà avviare successive misurazioni sia in seguito ad un nuovo comando di start sia in caso sia stato programmato per effettuare misurazioni in serie, eventualmente con sostituzione in automatico della cuvetta di lettura come precedentemente descritto.

Senza voler limitare l'ambito della presente invenzione, gli esempi che seguono illustrano in che modo la presente invenzione BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo n°525 BM)

può essere attuata e usata.

In particolare negli esempi di seguito riportati si fa riferimento a:

- Esempio I : quattro matrici a base di frumento corrispondenti a cariossidi di frumento duro non processate, cariossidi di frumento tenero non processate, semola e pasta ma deve essere inteso che altre matrici, quali ad esempio, ma non soltanto, il pane, anche di diversi cereali, possono essere impiegate nel procedimento secondo la presente invenzione per determinarne il contenuto di DON;

- Esempio 2: crusca, ma deve essere inteso che altre matrici, quali ad esempio mais possono essere impiegate nel procedimento secondo la presente invenzione per determinarne il contenuto di DON.

ESEMPIO 1 (prevede la sottrazione diretta della sovrastima) Innanzitutto, per ottenere l’estratto filtrato di una matrice a base di frumento, una quantità pari a 25 g di matrice (di cariossidi, di semola e di pasta) viene finemente macinata con un molino Buehler MLI 204 della Buehler S.p.A., Milano; Italia e setacciata con un vaglio a maglie da 1 mm, quindi sottoposta ad una fase di energica agitazione (blending) in 100 mL di tampone PBS per tre minuti.

È ottenuto quindi un estratto che viene sottoposto in sequenza ad una prima filtrazione su filtro di carta Whatman N. 4, ed ad una seconda filtrazione su filtro a microfibra di vetro Whatman GF/A.

BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferraccio (Iscr. Albo n‘525 BM)

L’estratto nitrato ottenuto è poi sottoposto all’analisi per la misurazione del DON mediante la tecnica immunometrica a polarizzazione di fluorescenza (FPIA) impiegando uno spettrofluorimetro PerkinElmer LS 55.

La misurazione di polarizzazione di fluorescenza è effettuata impiegando il tracciante DON-FL2 ottenuto per reazione del DON con 4’-amminometilfluoresceina e l’anticoipo monoclonale avente numero di riferimento del clone #22.

Mentre il tracciante DON-FL2 è stato ottenuto apportando alcune vantaggiose variazioni al metodo descritto dallo stesso Dr. C. Maragos in “Maragos, C. M.; Plattner, R, D. Rapid fluorescence polarization immunoassay for thè mycotoxin deoxynivalenol in wheat. J. Agric. and Food Chem. 2002 , 50, 1827-1832”.

In dettaglio, al suddetto metodo sono aggiunte le fasi di proteggere gli ossidrili in C7 e CI 5 del DON tramite reazione con acido butilboronico per formare un estere boronato ciclico.

Quindi si ha l’attivazione del gruppo ossidrilico in C-3 con l,l’-carbonildiimidazolo e la successiva deprotezione in C7 e CI 5.

Il DON attivato è poi fatto reagire con 4’ aminometilfluoresceina cloridrato per formare il DON-FL2.

Lo schema di seguito riportato illustrata le reazioni attraverso le quali è ottenuto il DON-FL2.

BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (Iser. Albo n°525 BM)

0) pili dira

agitazione

T.A

DON acido 1 -butilboronico

7, 15-0~(butilboroni<]>)-DON 1 , 1 ’-carbonildiimidazolo -0-(imidazolcarbonii)-DON

- Per la valutazione di come il tipo di matrice influenza i risultati della quantità di DON rilevata con il metodo FPIA si è quindi proceduto come segue.

Sono stati ottenuti nel modo suddetto estratti filtrati da dieci campioni di matrici di cariossidi di frumento duro di diverse varietà, risultati esenti da contaminazione di DON mediante analisi HPLC, e contaminati con quantità note di DON a diversi valori dì contaminazione .

La misura FPIA delle soluzioni ha fornito sempre una sovrastima del contenuto di DON in soluzione (effetto matrice) che si è rivelata essere pressoché costante ai diversi livelli di contaminazione ed al variare della varietà di frumento presa in considerazione.

Lo stesso studio è stato condotto su campioni dì matrici di semola e di pasta e sono stati quantificati i diversi effetti matrice BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (Iscr, Albo n<i>'S25 BM)

(Tabella 1).

Tabella 1. Sovrastime medie ottenute su 10 diverse varietà di campioni di matrice di cariossidi non processate, di semola e di pasta.

Sovrastima Matrice

Cariossidi di frumento duro non processate 0.27 ± 0.03 Cariossidi dì frumento tenero non processate 0.39 ± 0.06 Semola 0.08 ± 0.01 Pasta 0.04 ± 0.01 Poiché nell’ambito della stessa matrice (cariosside, semola e pasta) tale effetto matrice è risultato essere costante, è possibile correggere i valori della concentrazione di DON rilevati in una analisi FPIA su un campione di una prefissata matrice, ed espressi in pg/g, mediante sottrazione della sovrastima ottenuta.

Se consideriamo la quantità di matrice impiegata nella misurazione, nel caso particolare descritto pari a 60 mg, si può definire il range di linearità dell’analisi FPIA tra 0.10 e 2.0 pg/g, espresso come quantità di DON per grammi di campione.

- Per quanto riguarda il confronto del risultato della polarizzazione di fluorescenza misurata di una soluzione campione ottenuto tramite FPIA con un valore di polarizzazione di fluorescenza caratterizzato corrispondente ad una concentrazione nota di DON, vi è da dire che la concentrazione nota è determinata attraverso il metodo HPLC.

In particolare, per valutare i valori dì recupero del metodo BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio

(Iscr. Albo n°525 BM)

FPIA sono state analizzate matrici campione (di cariossidi, di semola e

di pasta) contaminate artificialmente con quantità note di DON, in

triplicato, a tre diversi livelli (0.25; 0.75; 1.25; 1.75 gg/g).

Da tali matrici, dopo la suddetta contaminazione, sono stati

ottenuti rispettivi estratti Filtrati come sopra descritto, ed ogni estratto

filtrato ottenuto è stato sottoposto in parallelo sia ad analisi FPIA che ad

analisi HPLC.

I risultati ottenuti dall’analisi FPIA (Tabella 2) hanno

mostrato, per le differenti matrici analizzate, un recupero medio del

metodo prossimo al 100% (98-102%) e una bassa variabilità mentre il

recupero medio ottenuto dall’analisi HPLC è risultato essere più basso

(82-87%) e con una più alta variabilità.

Tabella 2. Valori di recupero di DON da cariossidi non

processate di frumento duro e frumento tenero, semola e pasta sia per il

metodo FPIA che per HPLC.

Media* SO 82.2* 7.6 97.8*4,0 86.2*3.7 102.014.7 87.4* 1.5 101.2* 3.3 91.6*3.0 101.0*6.3

- Per valutare invece la correlazione tra i due metodi messi a BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferrecclo (Iscr. Albo n°525 BM)

confronto sono stati analizzati 35 matrici di cariossidi di frumento duro non processato, 32 matrici di cariossidi di frumento tenero non processato, 22 matrici di semola e 26 matrici di pasta naturalmente contaminate.

Le matrici sono state estratte con PBS e l’estratto filtrato è stato sottoposto in parallelo sia ad analisi FPIA che ad analisi HPLC.

Per tutte le matrici in cui la concentrazione di DON risultava superiore a 2,00 pg/g è stato necessario ripetere la misura FPIA previa opportuna diluizione dell’estratto per riportare il valore della concentrazione neH’intervallo di linearità del metodo. Si è verificata una buona correlazione tra ranalisi FPIA e quella HPLC, le due metodiche messe a confronto nell’analisi dei campioni di matrice naturalmente contaminati (Figura 4), ad eccezione della pendenza delle rette che non risulta essere unitaria e che comporterebbe una sovrastima al contenuto di DON soprattutto ad alti livelli di contaminazione..

Questo apparente disaccordo è giustificato però dal diverso recupero medio percentuale mostrato dalle due differenti tecniche di analisi messe a confronto.

Infatti correggendo i risultati per i rispettivi recuperi si ottiene un coefficiente angolare delle rette di correlazione praticamente unitario e rispettivamente di 1.0381 per le cariossidi di frumento duro, di 1. 1538 per le cariossidi di frumento tenero, di 0.9900 per la semola, e di 1.0042 per la pasta, che esprime l’ottima corrispondenza tra i risultati ottenuti con le due tecniche analitiche.

ESEMPIO 2 (prevede l’utilizzo di carbone attivo per BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo n°525 BM)

minimizzare o eliminare la sovrastima)

Innanzitutto, per ottenere l’estratto filtrato della matrice crusca, una quantità pari a 25 g viene finemente macinata con un molino Buehler MLU 202 della Buehler S.p.A., Milano; Italia, quindi sottoposta ad una fase di energica agitazione (blending) in 200 mL di tampone PBS per tre minuti.

L’estratto filtrato ottenuto è addizionato di una determinata quantità di carbone attivo, sottoposto ad agitazione e a successiva filtrazione. La soluzione purificata viene sottoposta alla procedura di determinazione della polarizzazione come riportato precedentemente.

- Per la valutazione di come eliminare o minimizzare il segnale dovuto a interferenti coestratti che comporta una notevole sovrastima del contenuto di DON nella crusca, si è quindi proceduto come segue.

Sono stati ottenuti nel modo suddetto estratti filtrati dal medesimo campione di crusca naturalmente contaminato con DON e opportunamente trattati con quantità variabili di carbone attivo. La concentrazione di carbone attivo nell’estratto filtrato varia nell’intervallo 0-20 mg/mL.

Gli estratti purificati ottenuti sono stati sottoposti alla determinazione del contenuto di DON mediante analisi FPLA ed HPLC.

I risultati ottenuti (Tabella 3) hanno mostrato che la BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferrecclo (Iscr. Albo n’525 BM)

concentrazione di DON nella crusca, determinata mediante il metodo FPIA, è sovrastimata nelFintervallo 0-1.5 mg di carbone attivo per mL di estratto filtrato, rispetto ai valori ottenuti mediante analisi HPLC che risultano non significativamente differenti tra di loro. NelFintervallo di concentrazione di carbone attivo 2-3 mg/mL si è verificata una buona corrispondenza tra i valori di DON ottenuti con analisi FPIA ed HPLC e quello determinato mediante analisi HPLC in assenza di carbone attivo. A concentrazioni di carbone attivo superiori a 3 mg/mL si è verificato un abbattimento del valore di DON determinato mediante analisi FPIA ed HPLC e quello determinato mediante analisi HPLC in assenza di carbone attivo.

Tabella 3. Effetto della concentrazione di carbone attivo sui valori di DON (pg/g) determinati mediante analisi FPIA e HPLC nel medesimo campione di crusca.

4.0 1.15 1.07 BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo n“525 BM)

Pertanto, vantaggiosamente, nel caso di matrice a base di crusca la sovrastima nella determinazione di DON può essere eliminata direttamente mediante il suddetto stadio di purificazione aggiungendo al suddetto estratto filtrato una quantità di carbone attivo compresa tra 2 e 3 milligrammi per millilitro di estratto, con successiva agitazione e filtrazione.

Vantaggi

Un primo vantaggio del procedimento FPIA per la determinazione di DON secondo l’invenzione risulta quindi essere la maggiore accuratezza mostrata rispetto al metodo HPLC standard preso come riferimento.

Un secondo vantaggio risiede nella sua sensibilità, pari a 0.1 pg/g, migliore di almeno 5 volte rispetto alla sensibilità deducibile dal brevetto WO 02/23196.

Vi e da dire inoltre che la precisione del presente procedimento è comparabile se non in alcuni casi migliore del suddetto metodo HPLC.

Un ulteriore primario vantaggio del procedimento secondo rìnvenzione risiede nella sua rapidità di esecuzione, circa 10-15 minuti, a costi di attuazione contenuti.

Particolarmente vantaggiosa poi è l’attuazione del presente procedimento mediante l’auto-campionatore secondo l’invenzione, il quale consente di integrare il procedimento per la determinazione rapida del DON in una matrice a base di cereali, particolarmente BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo π‘525 BM)

frumento, all’intemo di una qualsiasi filiera o di un ciclo di produzione e/o trasformazione di un prodotto alimentare grezzo, semilavorato o finito a base di cereali, garantendo così un monitoraggio rapido e costante sul prodotto alimentare ed una migliorata sicurezza alimentare.

Per tutti i suddetti vantaggi, il procedimento secondo la presente invenzione costituisce una valida alternativa ai metodi messi a disposizione dalla tecnica nota per la determinazione del DON, ed in particolare un’alternativa al metodo HPLC per la determinazione del DON in prodotti alimentari a base di grano.

Claims

BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo n°525 BM) RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la determinazione di DON in una matrice a base di cereali, comprendente le fasi di: a) mettere a disposizione una soluzione di un estratto filtrato ottenuto da una prefissata matrice a base di cereali; b) mettere a disposizione un anticorpo ed un tracciante comprendente DON coniugato ad un prefissato fiuoroforo; c) miscelare predeterminate quantità di detta soluzione di estratto filtrato e di detto anticorpo per ottenere una soluzione corrispondente al bianco di lettura di una misura di polarizzazione di fluorescenza; d) eseguire dopo un prefissato tempo di incubazione una misurazione di polarizzazione di fluorescenza di detta soluzione corrispondente al bianco di lettura; e) aggiungere a detta soluzione corrispondente al bianco di lettura una prefissata quantità di detto tracciante, il quale è in grado di legarsi a detto an ti corpo per determinare una variazione di polarizzazione di fluorescenza rilevabile; f) eseguire dopo un prefissato tempo di incubazione una misurazione di polarizzazione di fluorescenza di detta soluzione; g) confrontare detta polarizzazione di fluorescenza misurata con un valore di polarizzazione di fluorescenza caratterizzato, detto valore di polarizzazione di fluorescenza caratterizzato corrispondendo ad una concentrazione nota di DON, ottenendo un primo valore di concentrazione di DON; BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreceio (Iscr. Albo n°525 BM) h) modificare di una prefissata quantità detto primo valore di concentrazione di DON ottenuto, detta prefissata quantità essendo correlata alla natura e al tipo di detta matrice a base di cereali.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detto primo valore di concentrazione di DON ottenuto è modificato di una quantità compresa tra 0.60 e 0.02 microgrammi di DON per grammi di matrice a base di cereali.
3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta matrice a base di cereali è costituita da cariossidi di frumento duro e detta prefissata quantità è compresa tra 0.35 e 0.04 pg/g.
4. Procedimento secondo La rivendicazione 3, in cui detta prefissata quantità è pari a 0.27±0.03 pg/g.
5. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta matrice a base di cereali è costituita da cariossidi di frumento tenero e detta prefissata quantità è compresa tra 0.50 e 0.04 pg/g .
6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui detta prefissata quantità è pari a 0.39±0.06 pg/g.
7. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta matrice a base di cereali è costituita da semola di grano e detta prefissata quantità è compresa tra 0.10 e 0.04 pg/g .
8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, in cui detta prefissata quantità è pari a 0.08+0.01 pg/g.
9. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta matrice a base di cereali è costituita da pasta e detta prefissata quantità è compresa tra 0.06 e 0.02 pg/g . BRL246BIT D r. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo η°525 BM)
10. Procedimento secondo la rivendicazione 9, in cui detta prefissata quantità è pari a 0.04+0.01 pg/g.
11. Procedimento secondo la rivendicazione 1 , in cui è ulteriormente previsto uno stadio di purificazione mediante aggiunta di un materiale adsorbente a detto estratto Filtrato prima della sua miscelazione con detto anticorpo
12. Procedimento secondo la rivendicazione 11, in cui detta matrice a base di cereali è costituita da crusca o mais.
13. Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui detto prefissato materiale adsorbente è carbone attivo.
14. Procedimento secondo le rivendicazioni 13, in cui detto carbone attivo è aggiunto a detto estratto filtrato in quantità compresa tra 2 e 3 mg per mL di estratto filtrato e detta prefissata quantità correlata alla natura e al tipo di detta matrice a base di cereali è pari a zero.
15. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto fluoro foro è 4’-amminometilfluoresceina .
16. Procedimento secondo la rivendicazione 15, in cui anteriormente alla coniugazione del DON con 4’-amminometilfluoresceina , i gruppi ossidrilici in C7 e C15 del DON sono protetd tramite reazione del DON con acido 1-butilboronico.
17. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto anticorpo è l’anticorpo monoclonale avente numero di riferimento del clone #22 purificato come descritto in Maragos, C. M., and McCormick, S. P., 2000, Monoclonal antibodies for BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo n°525 BM) thè mycotoxins deoxynivalenol and 3-acetyl-deoxynivalenol. Food and Agricultural Immunologi}, 12, 181-192.
18. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto estratto filtrato è ottenuto per estrazione di detta matrice con tampone PBS e successiva filtrazione ripetuta almeno una volta.
19. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detto estratto filtrato è stato sottoposto ad una prima filtrazione su filtro di carta e ad una seconda filtrazione su filtro a microfibra di vetro.
20. Apparecchiatura (A) per l’esecuzione del procedimento secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni comprendente: - almeno una siringa (1) includente un raccordo laterale, una pompa per lavaggio attivo a flusso e un ago (2) di prefissata lunghezza; - una unità motorizzata (3) atta a movimentare detta siringa tramite un albero rotante ed un braccio meccanico (3a); - almeno un pozzetto di scarico (4) per il lavaggio di detto ago (4); - una prima pluralità di alloggiamenti (5) per rispettive provette e/o fiale atte a contenere rispettivamente il tampone, ranticorpo ed il tracciate in soluzione; - una seconda pluralità di alloggiamenti (6) per rispettive provette e/o fiale ciascuna atta a contenere una rispettiva soluzione di un estratto filtrato ottenuto da una o più matrici a base di cereali; - un lettore di polarizzazione di fluorescenza (7) munito di BRL246BIT Dr. Rinaldo Ferreccio (Iscr. Albo n°525 BM) almeno una cella di lettura dotata di un coperchio di chiusura e di almeno una cuvetta di lettura atta ad essere alloggiata in tale cella di lettura; - un motore atto a movimentare detto coperchio di chiusura; - un software di gestione programmabile comandato tramite computer (8).
21. Apparecchiatura secondo la rivendicazione 18, comprendente inoltre mezzi di presa associati a detto braccio meccanico per la rimozione e la sostituzione in automatico di detta cuvetta di lettura.
22. Apparecchiatura secondo la rivendicazione 21, in cui detti mezzi di presa sono atti alla presa diretta di detta cuvetta di lettura o atti alla presa di un tappo associabile a detta cuvetta dì lettura, detto tappo essendo munito di un foro per il passaggio dì detto ago (2).
23. Apparecchiatura secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 18 a 22, comprendente inoltre un sistema automatico di filtraggio per ottenere un estratto filtrato da una soluzione contenente una prefissata quantità di una matrice a base di cereali.